JP3815137B2 - L−リボースの製造方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、L−リボースの製造方法に関し、より詳細には微生物を用いてL−リブロースを異性化して、L−リボースを製造する方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
近年、非天然型の糖類が、立体異性体の制御が必要な医薬及び農薬を合成する際の中間原料として注目されている。非天然型の糖類であるL−リボースの主な生産方法としては、L−アラビノースを原料としたコバルト触媒による化学合成法と、微生物を用いてL−リボースを生産する方法としてアシネトバクター カルコアセティカス(Acinetobacter calcoaceticus )LR7C株又はその突然変異株であるDL−28株を用いる方法(特開平10−155480)等が知られている。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
しかし実際に工業的規模でL−リボースの生産を行う場合、従来の方法では種々の問題が生じる。上記した合成法では原料のL−アラビノースも、触媒であるコバルトも非常に高価であると同時に、この反応により合成されるL−リボースの収率も決して満足のいくものではなかった。また、微生物を用いてL−リボースを製造する方法では、上記したアシネトバクター属の微生物を利用することが報告されているのみであり、L−リブロースを異性化してL−リボースを生産する能力のより高い微生物が望まれていた。
【0004】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上述の問題を解決すべく鋭意検討した結果、ミクロバクテリウム(Microbacterium)属またはステノトロフォモナス(Stenotrophomonas)属に属する微生物がL−リブロースを異性化して、L−リボースを生産する能力を有しており、これらの微生物を用いてL−リブロースからL−リボースを生成させることによりL−リボースが工業的に有利に製造可能なことを見いだし、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、L−リブロースを異性化してL−リボースを生産する能力を有するミクロバクテリウム(Microbacterium)属またはステノトロフォモナス(Stenotrophomonas)属に属する微生物の菌体および/または該菌体処理物の存在下、L−リブロースからL−リボースを生成蓄積させてL−リボースを採取することを特徴とするL−リボースの製造方法である。
【0005】
【発明の実施の形態】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明の製造方法で用いるミクロバクテリウム(Microbacterium)属またはステノトロフォモナス(Stenotrophomonas)属に属する微生物としては、L−リブロースを異性化してL−リボースを生産する能力を有する微生物であれば、特に限定されない。本発明に用いられるミクロバクテリウム(Microbacterium)属に属する微生物としては、例えばミクロバクテリウム ラティクム(Microbacterium laticum)種等、具体的菌株としては、例えばミクロバクテリウム ラティクム(Microbacterium laticum)IAM1640が挙げられる。また、ステノトロフォモナス(Stenotrophomonas)属に属する微生物としては、例えばステノトロフォモナス マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophilia)種等、具体的な菌株としては、例えばステノトロフォモナス マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophilia)IAM12423が挙げられる。これらの菌株はInstitute of Applicated Micobiology(IAM)に保管されており、容易に入手することができる。
【0006】
なお上記微生物は、野生株以外に変異株、あるいは細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝的手法により誘導される組換え株などいずれの株であってもよい。また本微生物は、L−リブロースを異性化してL−リボースを生産する時にL−アラビノースを副生する場合があるが、この性質に対して、例えば紫外線照射などの物理的処理やN−メチル−N'-ニトロ−N−ニトロソグアニジン(NTG)処理、エチルメタンスルホネート(EMS)処理、亜硝酸処理、アクリジン処理などの化学処理などにより取得した、L−リボースの生産比率がよく、さらにL−アラビノースの生産性の低い変異株であってもよい。また同様の変異処理により取得される、培養時にL−リブロースあるいはL−リボースによる酵素の誘導を行わなくとも十分な活性を生じる変異株を用いることもできる。これらの変異株を用いればL−リボースの生産性をより向上させることができ、工業的にL−リボースを生産する場合特に有効である。
【0007】
本発明の方法において上記微生物は、1種あるいは2種以上を同時に用いることができる。
本発明で用いる微生物の培養に用いられる培地は、上記微生物が生育でき、かつL−リブロースを異性化してL−リボースを生成する能力を誘導できるものであればいかなるものでもよいし、通常用いられる炭素源、窒素源、無機イオン、また必要に応じてビタミン類を含有するそれ自体既知の培地が用いられる。それらの培地成分は1種類あるいは複数種類を適宜用いることができ、また培養中必要に応じて追補添加することもできる。
【0008】
炭素源としては、上記微生物が資化しうるものなら特に制限はなく、例えばグルコース、スクロースなどの炭水化物、グリセロールなどのアルコール類、有機酸などが挙げられる。これらの中でグルコース、グリセロール、スクロースを用いるのが好ましく、特にスクロースを用いるのが好ましい。また窒素源としては、本微生物が資化しうるものなら特に制限はなく、例えば、アミノ酸類、酵母エキス、大豆ペプチド、大豆粉末、コーンスティープリカー、NZアミン、トリプトース、ペプトン、ポリペプトン、肉エキス、魚肉エキスその他の有機窒素源、あるいは硝酸ナトリウム、その他の無機窒素源が挙げられる。これらの中で、酵母エキスや大豆ペプチド、ポリペプトンを用いるのが好ましい。無機イオンとしては、例えばリン酸イオン、マグネシウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、モリブデンイオンなどが用いられる。またビタミン類としては、例えばチアミン、イノシトール、パントテン酸、ニコチン酸アミドなどが挙げられる。
【0009】
培養は、温度が20〜37℃、好ましくは27〜32℃で、12時間から48時間、好気的条件下で行う。L−リブロースを異性化してL−リボースを生成させる能力を高く発現させるには、十分な通気を行いながら培養することが重要である。通気は通常0.1〜3.0vvm、好ましくは0.5〜2.0vvmが適当である。
得られた培養物はそのままで、あるいは培養液から遠心分離等の公知の方法で菌体を回収して、L−リブロースの異性化反応に用いられる。また回収した菌体は、そのままでも、あるいは公知の手法で化学的、物理的、酵素的に処理して用いてもよい。微生物菌体の処理方法としては、トルエン処理、アセトン処理、リゾチーム処理、凍結乾燥処理、超音波破砕等が挙げられる。この内、トルエン処理は、異性化反応液中に、菌体と共にトルエンを加える方法で行うこともできる。また、これらの菌体または菌体処理物から、L−リブロースを異性化してL−リボースを生産する能力を有する酵素を、粗製物あるいは精製物として取り出して用いることもできる。上記菌体の処理方法の中では、培養物から菌体を回収し、トルエン処理を行うのが望ましい。
【0010】
上述のようにして得られた菌体、菌体処理物および酵素画分等は、そのままで、あるいはポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等の担体に固定化して用いてもよい。ここで本明細書において「菌体および/または該菌体処理物」とは、上述の菌体、菌体処理物、酵素画分、およびそれらの固定化物等の全てを意味するものである
本発明の方法においては、上記微生物菌体および/または該菌体処理物の存在下、L−リブロースを異性化させて、L−リボースを生成蓄積させてL−リボースが採取される。
【0011】
上記L−リブロースの異性化は、通常、酢酸緩衝液、グリシン−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液等の適当な緩衝液あるいは水等の水性反応液中で行われる。反応液に用いる緩衝液の濃度は、通常1〜1000mM、好ましくは、10〜200mM程度であり、また反応液のpHは通常4.0〜9.5、好ましくは8.5〜9.0M程度である。
原料として用いられるL−リブロースは、分離、精製されたものでもよく、微生物を用いて製造されたL−リブロースを含有する未精製の反応液または該反応液を部分精製したものでもよい。反応液の部分精製は、L−リブロースを含有する反応液を遠心分離など公知の方法で除菌した後、必要により濃縮し、Lーリブロースを、晶析やカラムクロマトグラフィーなどにより分離精製する方法で行えばよい。また発酵液を未精製のまま用いる場合は、上記した適当な緩衝液、例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、あるいは水等を用いて希釈して用いることもできる。
【0012】
かくして得られるL−リブロース含有液に、上記した微生物の菌体および/または該菌体処理物を添加し、L−リブロースの異性化反応が行われる。反応液中のL−リブロースの初期濃度は、通常0.1〜30重量%、好ましくは1〜15重量%である。反応液にL−リブロースを逐次添加して反応を行ってもよい。反応は、温度20℃〜40℃、好ましくは27℃〜32℃で、攪拌しつつ行う。反応が進行するにつれ、反応液のpHが低下するため、水酸化ナトリウム等のアルカリ溶液を用いて発酵液のpHを上記した範囲に制御することが好ましい。L−リブロースからL−リボースへの異性化反応は可逆反応あるため、通常L−リブロースの異性化反応はL−リブロースとL−リボースが平衡に達して終了する。
【0013】
かくして得られた反応液中には、生成したL−リボース以外にL−リブロースや、微生物の菌体および/または該菌体処理物、微生物由来のタンパク質などの高分子物質、塩類、副反応により生成する有機塩類、ジヒドロキシアセトン、L−アラビノースなどの糖類、着色成分などの夾雑物が多く含まれる。従って生成したL−リボースをこの反応液中から分離精製する必要がある。L−リボースの分離精製は、それ自体既知の方法である遠心分離、濾過、濃縮、カラムクロマトグラフィー、脱色、脱塩、晶析などを適当な順序や条件にしたがって組み合わせることにより行うことができる。
反応終了後、まず遠心分離などの既存の方法で微生物の菌体等を反応液から除去する。反応液に熱を加え、酵素失活および澱下げを行ってからこの除菌を行ってもよい。さらに除菌前または除菌後に炭酸飽充を行うと、その後の精製に有効である。
【0014】
除菌された反応液は、L−リボース以外に未だ上述の夾雑物が多く含まれる。これらは、通常、カラムクロマトグラフィーや晶析等により除去できる。特に夾雑物が多い場合は、晶析に先立ってゲル型濾過材を担体として用いるクロマトグラフィーで精製するのが好ましい。ゲル型濾過材としては、L−リボースと他の夾雑物とを効率よく分離することができるものであれば特に限定されないが、好ましくはカチオン系イオン交換体が挙げられ、さらに好ましくは架橋度4〜8%のアルカリ金属またはアルカリ土類金属型のカチオン系イオン交換体が挙げられる。かかるイオン交換体の具体例としては、UBK−530、UBK−535、UBK−550、UBK−555(いずれも三菱化学社製)等が挙げられる。具体的には、予め脱塩水にてスラリー化し、十分に気泡を除去したゲル型濾過材を分離カラムに充填する。該カラムに充填した濾過材容量の1/2〜1/100、好ましくは1/5〜1/20量の除菌後の発酵液を送入し、次いで水で溶出させてL−リボース画分を分画する。
【0015】
このL−リボース画分は、必要であれば、通常知られた方法により脱塩脱色後、晶析をを行うことにより高純度のL−リボースを得ることができる。
晶析の方法としては、L−リボースのみが析出する方法であれば特に制限はないが、上記L−リボース画分には未反応のL−リブロースが残存しており、この混合液からL−リボース結晶を得るには、このL−リボース分画液に有機溶媒を添加し、反応液中に残存するL−リブロースを析出させずにL−リボースを単独で析出させる方法が好ましい。具体的には、L−リボース分画液について充分に濃縮を行った後、この濃縮シロップに有機溶剤を加え充分に攪拌する。さらにここに微量のL−リボース結晶を加え、4℃で24時間放置する。L−リボース分画液の濃縮は60ブリックス以上、好ましくは85ブリックス以上、さらに好ましくは90ブリックス以上まで行う。また、添加する有機溶媒としては、例えばメタノール、エタノール等の低級アルコール類、アセトン、ヘキサン、アセトニトリル、トルエンなどが挙げられ、好ましくはエタノール、1−プロパノール、2−プロパノール、さらに好ましくはエタノールが用いられる。これら有機溶媒の添加量は、Lーリボース分画濃縮液に対し、1/2〜10倍量、好ましくは1〜3倍量である。この晶析に先だって、上述したクロマトグラフィーによる精製を再度行い、L−リボース分画中からL−リブロースをより完全に除いておくと、L−リボースの晶析率がさらに上昇するため、より精製度の高いL−リボースを採取することができる。
【0016】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
実施例1および2
(a)使用微生物
Microbacterium lacticum IAM1640(菌株A)およびStenotrophomonas maltophilia IAM12423(菌株B)を用いて以下の実験を行った。
【0017】
(b)微生物培養方法
スクロース 2.0g/L、酵母エキス(アサヒビール食品社製:ミーストP1G)5.0g/L、大豆ペプチド(不二製油社製)5.0g/L、NaCl 5g/L、K2 HPO4 3g/L、KH2 PO4 1g/L、L−リボース(シグマ社製)15g/L(pH7.0)よりなる培地を20mLずつ200mL容量のバッフルフラスコに分注し、上記(a)記載の菌株A及びBをそれぞれ接種した。これらのバッフル付きフラスコを160rpmで回転する振とう培養機にセットし、30℃で18時間培養をを行った。
【0018】
(c)異性化反応方法
上記(b)記載の培養にて得られた培養終了液を各々遠心分離し、集菌した。各菌体ペレットにグリシン−塩酸緩衝液(50mM、pH9.0)を2mLずつ加え均一に懸濁した後、トルエンを60μLずつ加え、15分間激しく混合した。このように調整したトルエン処理菌体を10g/LのL−リブロース(アルドリッチ社製)含有液5mLに加え、均一になるよう緩やかに撹拌しつつ30℃で15時間反応を行った。途中、1N NaOHによってpH9.0に制御した。
【0019】
(d)L−リボースの生成の確認
上記(c)記載の反応終了液を各々遠心分離し、微生物菌体を除去した。得られた上清に含まれるL−リボースの含量を高速液体クロマトグラフィーにより下記の条件で測定した。L−リボースの保持時間は下記分析条件において、24.0分である。
【0020】
【表1】
【0021】
その結果、上清中のL−リボース含有量は、菌株Aで6.5g/L、菌株Bで4.0g/Lであった。
【0022】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、従来入手困難であったL−リボースを効率的に製造することができる。
Claims (3)
- L−リブロースを異性化してL−リボースを生産する能力を有するミクロバクテリウム(Microbacterium)属またはステノトロフォモナス(Stenotrophomonas)属に属する微生物の菌体および/または該菌体処理物の存在下、L−リブロースからL−リボースを生成蓄積させてL−リボースを採取することを特徴とするL−リボースの製造方法。
- ミクロバクテリウム(Microbacterium)属に属する微生物がミクロバクテリウム ラティクム(Microbacterium laticum)であり、ステノトロフォモナス(Stenotrophomonas)属に属する微生物がステノトロフォモナス マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophilia)であることを特徴とする請求項1記載の方法。
- ミクロバクテリウム属に属する微生物が、ミクロバクテリウム ラティクム(Microbacterium laticum)IAM1640であり、ステノトロフォモナスに属する微生物が、ステノトロフォモナス マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophilia)IAM12423であることを特徴とする請求項1記載の方法。
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