JP2001524489A - 核レセプターのリガンドおよびリガンド結合ドメイン - Google Patents

核レセプターのリガンドおよびリガンド結合ドメイン

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、核レセプター、特に甲状腺レセプター（ＴＲと称する）の三次元構造に基いて核レセプター合成リガンドの生成のための、新規な方法、特にコンピューターを用いる方法、及び組成物を提供する。さらに、結晶、核レセプター合成リガンド、及び関連する方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 謝辞 本発明は、一部分ナショナル・インスチチュート・オブ・ヘルス（National I
nstitutes of Health ）許可番号1 R01 DK 43787および5 R01 DK 41842からの保
証により支持された。米国政府は本発明においてある種の権利を有することがで
きる。 関係する出願に対する相互参照 この出願は下記の仮出願の利益を請求する：米国特許出願第60/008,540号およ
び第60/008,543号 (1995年12月13日）および米国特許出願第60/008,606号 (1995
年12月14日）。この出願は下記の米国特許出願の利益を請求する：米国特許出願
第08/764,870号 (1996年12月13日）。
【０００２】 序論 技術分野 本発明は、核レセプターに結合するリガンド、核レセプターの結晶、核レセプ
ターの合成リガンドおよび合成リガンドを使用する方法に関する。
【０００３】背景 核レセプターは、生理学的に関係する小さい分子、例えば、ホルモンまたはビ
タミンに特異的に結合するタンパク質のスーパーファミリーを表す。ある分子が
核レセプターに結合する結果、核レセプターはDNA を転写する細胞の能力を変化
させ、核レセプターはDNA の転写をモジュレートするが、転写独立の作用を有す
る。一体的膜レセプターおよび膜関連レセプターと異なり、核レセプターは真核
細胞の細胞質または核の中に存在する。こうして、核レセプターは１クラスの細
胞内の、可溶性リガンド調節転写因子からなる。
【０００４】 核レセプターは下記の因子のレセプターを包含する：グルココルチコイド(GRs
）、アンドロゲン(ARs）、ミネラロコルチコイド(MRs）、プロゲスチン(PRs）、
エストロゲン(ERs）、甲状腺ホルモン(TRs）、ビタミンD(VDRs）、レチノイド(R
ARs およびRXRs）、ペルオキシイソマー(XPARsおよびPPARs)およびイコサノイド
(IRs）。また、いわゆる「オーファンレセプター」は、古典的核レセプター、例
えば、ステロイドおよび甲状腺のレセプターに構造的に相同性であるので、核レ
セプターのスーパーファミリーの一部分である。
【０００５】 今日まで、オーファンレセプターを使用してリガンドは同定されてきていない
が、小さい分子のリガンドが近い将来このクラスの転写レセプターについて発見
される可能性が存在する。一般に、核レセプターは高いアフィニティーで生理学
的に関係する小さい分子に特異的に結合し、そして見掛けのKdは核レセプター／
リガンドの対に依存して0.01〜20nMの範囲である。
【０００６】 核レセプターに特異的に結合する合成リガンドの開発は、無数の生理学的プロ
セスおよび医学的症状、例えば、高血圧症、炎症、ホルモン依存性癌（例えば、
乳癌および前立腺癌）、生殖器官の機能の変調、甲状腺機能亢進症、高コレステ
ロール症および肥満症における核レセプターの重要性にかかわらず、手探りの薬
剤の設計法により、大きく誘導されてきている。
【０００７】 従来、結合したリガンドを有する核レセプターの三次元構造についての情報の
不存在において、核レセプターに対して特異的な新しいリガンドが発見された。
本発明の以前において、研究者らは、本質的に核レセプターのアミノ酸配列がリ
ガンドの把握部位に保持される方法を可視化する能力の非存在において、暗所で
プロービングすることによって、核レセプターのリガンドを発見してきた。 結局、核レセプターに対するリガンドを発見し、このような化合物を合成し、
そしてこのような化合物を生物に投与して、核レセプターにより調節される生理
学的プロセスをモジュレートするために要求される時間を減少する方法および組
成物を案出することは有利であろう。
【０００８】 発明の要約 本発明は、リガンド結合ドメイン(LBD）に結合したリガンドを有する核レセプ
ターのリガンド結合ドメインの結晶を提供する。本発明の結晶は、核レセプター
のリガンド、特に甲状腺レセプターのリガンドと相互作用するアミノ酸配列のき
わめてすぐれた原子の分解能を提供する。結合したリガンドを有する核レセプタ
ーのLBD の三次元のモデルは、核レセプターの従来未知の構造を明らかにし、そ
のリガンドが核レセプターのリガンド結合ドメインの水接近不能結合腔に結合し
ていることを示す。
【０００９】 本発明は、また、核レセプターのLBD の結晶をベースとする核レセプターの三
次元のモデルを使用する、コンピューター的方法を提供する。一般に、核レセプ
ターのリガンドを設計するコンピューター的方法は、核レセプターのLBD のどの
１またはそれ以上のアミノ酸がリガンドの（少なくとも１つの）化学的部分と相
互作用するかを決定する。この方法において、結合したリガンドを有する核レセ
プターのLBD からなる結晶化タンパク質の三次元のモデルを使用し、そして（少
なくとも１つの）化学的部分の化学的修飾を選択して、相互作用するアミノ酸と
天然のホルモン上の対応する化学的部分との間の相互作用に比較して、相互作用
するアミノ酸と第２化学的部分との間の相互作用を減少または増加する構造を有
する第２化学的部分を生成する。 また、核レセプターの活性をモジュレートする方法が提供される。この方法は
in vitroまたはin vivo であることができる。この方法は、十分な量の下記式の
化合物をin vitroまたはin vivo で投与することからなる：
【００１０】
【化４】 式Ｉ
【００１１】 ここでこの化合物は問題の核ホルモンレセプターのLBD の中に特異的かつ優先
的に適合する。この方法は、甲状腺レセプター（TR）の活性をモジュレートする
ことによって例示される。TR活性をモジュレートするために、問題のTR LBDイソ
型に対して特異的な化合物を包含する、TRリガンド結合ドメイン(TR LBD)の中に
特異的かつ優先的に適合する、式Ｉの化合物を使用する。TR LBDイソ型α（TR−
α）およびβ（TR−β）は特に重要である。問題の追加の化合物は、式Ｉの誘導
体、例えば、式Ｉのビフェニル（φ-X- φ）核または単一のフェニル（φ-Xまた
はX-φ）核および本明細書に記載する、その対応する置換基を有する化合物であ
る。これらの化合物から収集された構造的情報を使用して設計されかつ核ホルモ
ンレセプターの活性をモジュレートする化合物も、また、重要である。
【００１２】 本発明は、また、核レセプターの活性を選択的にモジュレートすることができ
る化合物を同定する方法を包含する。本発明のこの面は、TRイソ型の活性を選択
的にモジュレートすることができる化合物を同定する方法により例示される。こ
の方法は、被験化合物に結合したTR LBDイソ型の原子構造モデルを使用して、問
題のTR LBDイソ型の中に特異的かつ優先的に適合する被験化合物をモデリングし
、バイオアッセイにおいて、TR LBDイソ型への被験化合物の結合により特徴づけ
られるTRイソ型の活性について被験化合物をスクリーニングし、そしてTRイソ型
の活性を選択的にモジュレートする被験化合物を同定することからなる。これら
の化合物は、式Ｉの化合物またはそれらの誘導体であることができ、式Ｉのビフ
ェニル核または単一のフェニル核を有する化合物を包含する。
【００１３】 さらに、コンピューター化モデリングシステムと組み合わせてLBD の原子配位
を使用して、核レセプターのアゴニストまたはアンタゴニストのリガンドを同定
する方法が包含される。本発明のこの面は、コンピューター化モデリングシステ
ムに対するTR LBDの原子配位を形成し、TR LBDの中に特異的に適合するリガンド
をモデリングし、そしてバイオアッセイにおいて、TR活性を増加または減少する
リガンドをTR活性について同定することによって、TRのアゴニストまたはアンタ
ゴニストを同定する方法により例示される。これらの化合物は、式Ｉの化合物ま
たはそれらの誘導体であることができ、式Ｉのビフェニル核または単一のフェニ
ル核を有する化合物を包含する。
【００１４】 また、他のホルモンレセプターに比較して，核レセプターの１つの型の活性を
選択的にモジュレートする化合物を同定する方法が提供される。この方法は、TR
LBDの原子構造モデルを使用してTR LBDの中に特異的に適合する被験化合物をモ
デリングし、TR LBDのコンフォメーション的に拘束された残基と相互作用するコ
ンフォメーション的に拘束された構造的特徴を含む化合物を選択し、そしてバイ
オアッセイにおいて、他の核レセプターに比較してTR LBDに特異的に結合する化
学的部分をTR活性について同定することによって例示される。
【００１５】 レセプター選択的リガンドの結合に関係するコンフォメーション的に拘束され
た特徴は、同一リガンドおよび／または異なるリガンドに結合したレセプターイ
ソ型の原子モデルを比較することによって同定することができる。これらの方法
は、特定の核レセプターに対する選択性を増加した化合物の設計および選択を促
進する。これらの化合物は、式Ｉの化合物またはそれらの誘導体であることがで
き、式Ｉのビフェニル核または単一のフェニル核を有する化合物を包含する。
【００１６】 本発明の他の面は、特定の型の核レセプターに対する化合物のレセプターの選
択性を増加する方法が提供される。この方法は、式Ｉの化合物の置換基を化学的
に修飾して、１つの型のレセプターに対する選択的が増加した化合物を発生させ
ることを包含する。例えば、式Ｉの化合物の置換基の化学的修飾を使用して、TR
活性をモジュレートする化合物の中に追加の拘束を導入して、TR型レセプターに
対するそのin vivo 選択性を増加させることができる。追加の拘束をまた安定性
のために添加することができる。
【００１７】 修飾された基は、好ましくは、TRイソ型の中に保存されたTR LBDのコンフォメ
ーション的に拘束された構造的特徴と相互作用するであろう。より好ましい方法
は、TRイソ型の中に保存されたコンフォメーション的に拘束された残基と相互作
用するコンフォメーション的に拘束された基を有する化合物を選択することから
なる。これらの化合物は、式Ｉの化合物またはそれらの誘導体であることができ
、式Ｉのビフェニル核または単一のフェニル核を有する化合物を包含する。
【００１８】 本発明の方法により同定されたペプチド、ペプチド模倣物または合成の化合物
、TRに関係する障害を包含する、核レセプターに基づく欠乏症に関係する障害の
治療において有用な新規な主要な化合物、の選択および特性決定における使用を
本発明は見出す。TRに関係する障害のために、本発明の化合物および方法を使用
して、TR LBDの中に特異的かつ優先的に適合する式Ｉの化合物またはそれらの誘
導体を十分な量でそれを必要とする哺乳動物に投与することによって、TR活性を
モジュレートすることができる。
【００１９】 付録１は、参考文献の付録である。 付録２は、Dimit 、Triac 、IpBR2 、T3およびGC-1と複合化したTRについての
、TRリガンドと相互作用するアミノ酸のチャートである。 付録３は、Dimit と複合化したラットTR−α LBDの結晶についての原子配位の
チャートである。 付録４は、Triac と複合化したラットTR−α LBDの結晶についての原子配位の
チャートである。
【００２０】 付録５は、IpBR2 と複合化したラットTR−α LBDの結晶についての原子配位の
チャートである。 付録６は、T3と複合化したラットTR−α LBDの結晶についての原子配位のチャ
ートである。 付録７は、Triac と複合化したラットTR−β LBDの結晶についての原子配位の
チャートである。 付録８は、GC-1と複合化したラットTR−β LBDの結晶についての原子配位のチ
ャートである。
【００２１】 発明の詳細な説明 序論 本発明は、核レセプター、特に甲状腺レセプター（以後「TR」と呼ぶ）の三次
元構造をベースとする核レセプターの合成リガンドを発生するための新規な方法
、特にコンピューター的方法、および組成物を提供する。従来、核レセプターの
リガンド結合ドメインについての三次元構造の情報の欠如、特に結合したリガン
ドをもつ核レセプターに関する三次元構造の情報の非存在は、核レセプターの薬
剤の発見の分野を妨害した。
【００２２】 結合したリガンドをもつ核レセプターのリガンド結合ドメイン(LBD）からの結
晶および三次元構造の情報は、最初に本明細書に記載される。3,5,3'−トリヨー
ドサイロニン(T3)、3,5-ジブロモ-3'-イソプロピルサイロニン（IpBR2 ）、3,5-
ジメチル-3'-イソプロピルサイロニン（Dimit ）、および3,5,3'−トリヨードサ
イロ酢酸(Triac）、3,5-ジメチル-4-(4'−ヒドロキシ-3'-イソプロピルベンジル
）−フェノキシ酢酸（GC１）と複合化されたTR LBDの構造が例示される。このよ
うな結晶は、原子レベルにおいてよりすぐれた分解能およびLBD からなるアミノ
酸による核レセプターのリガンドの配位を可視化する能力を提供する。
【００２３】 本発明は、また、このような結晶および三次元構造の情報を使用して核レセプ
ターの合成リガンドを設計して、核レセプターのLBD のクロロホルメートの変化
をモジュレートする合成リガンドを発生させるコンピューター的方法を提供する
。このような合成リガンドは、本明細書に記載しかつ、一部分、第１図に示すコ
ンピューター的方法を使用して設計することができる。
【００２４】 これらのコンピューター的方法は、核レセプターに対するアンタゴニストまた
は部分的アゴニストの設計において有用であり、ここでアンタゴニストまたは部
分的アゴニストは拡張部分を有し、この拡張部分は遺伝子の発現の調節に対する
レセプターの影響を変更する、多数のリガンド誘導分子の事象を防止する、例え
ば、天然に存在するリガンド、または天然に存在するリガンドを模擬する他のリ
ガンド、例えば、アゴニストについて観測される活性化ドメインの通常の配位を
防止する。本明細書に記載するように、核レセプターのリガンドは種々の医学的
症状において核レセプターの活性をモジュレートするとき有用であろう。 十分な量の式Ｉの化合物をそれを必要とする哺乳動物に投与することによって
TR活性をモジュレートする方法において、このようなリガンドを使用することは
特に重要である。
【００２５】
【化５】
【００２６】 ここでこの化合物はTR LBDの中に特異的かつ優先的に適合する。「特異的に適
合する」とは、化合物の三次元構造がTR LBDのキャビティまたはポケットにより
幾何学的に収容されることを意図する。「TR LBD」とは、リガンドの結合のため
に適切な形状寸法およびアミノ酸残基のコンフォメーションを与えるような方法
で折りたたまれた、甲状腺ホルモンレセプターのポリペプチド鎖の１またはそれ
以上の構造的セグメントを意図する。これはリガンドの結合のポケットまたはキ
ャビティを形成する三次元空間における、タンパク質原子の物理的配置である。
「特異的かつ優先的に適合する」とは，化合物がTR LBDと選択的に相互作用する
ための三次元構造およびコンフォメーションを有することを意図する。問題の化
合物は、また、式Ｉの誘導体を包含する。
【００２７】 「式Ｉの誘導体」とは、本明細書に記載する式Ｉの対応する置換基を含む式Ｉ
のビフェニル（φ-X- φ）の少なくとも単一のフェニルのスカホールド（φ-Xま
たはX-φ）を含む化合物を意図する。これらの化合物から収集した構造の情報を
使用して設計されかつ核ホルモンレセプターの活性をモジュレートする化合物は
、また、重要である。TR LBDの中に特異的かつ優先的に適合する、式Ｉの好まし
い化合物およびその誘導体は、下記の置換基を含む：
【００２８】 (i） R1置換基はヒトTR−αのArg228、Arg262およびArg266、およびヒトTR−
βのArg282、Arg316およびArg320から成る群より選択される残基に対応するアル
ギニンの側鎖窒素原子と相互作用するアニオン基からなり、そしてアニオン基は
窒素原子から1.7 〜4.0 Åに存在する； (ii) R2置換基はTR LBDの中に特異的に適合する疎水性基または親水性基から
なり、
【００２９】 (iii）R3置換基はヒトTR−αのSer260、Ala263およびIle299、およびヒトTR−
βのSer314、Ala317およびIle352から成る群より選択される残基に対応するセリ
ン、アラニンおよびイソロイシンの側鎖原子と相互作用する疎水性基または親水
性基からなり、そして疎水性基または親水性基は側鎖原子から1.7 〜4.0 Åに存
在する； (iv) R5置換基はヒトTR−αのPhe218、Ile221およびIle222、およびヒトTR−
βのPhe272、Ile275およびIle276から成る群より選択される残基に対応するフェ
ニルアラニンおよびイソロイシンの側鎖原子と相互作用する疎水性基または親水
性基からなり、そして疎水性基または親水性基は側鎖原子から1.7 〜4.0 Åに存
在する；
【００３０】 (v） R6置換基はTR LBDの中に特異的に適合する疎水性基または親水性基から
なり、 (vi) Ｘ置換基はヒトTR−αのLeu276およびLeu292、およびヒトTR−βのLeu3
30およびLeu346から成る群より選択される残基に対応するロイシンの側鎖原子と
相互作用する疎水性基または親水性基からなり、そして疎水性基または親水性基
は側鎖原子から1.7 〜4.0 Åに存在する； (vii）R2' 置換基はTR LBDの中に特異的に適合する疎水性基または親水性基か
らなる；
【００３１】 (viii) R3' 置換基はヒトTR−αのPhe215、Gly290およびMet388、およびヒト
TR−βのPhe269、Gly344およびMet442から成る群より選択される残基に対応する
フェニルアラニン、グリシンおよびメチオニンの側鎖原子と相互作用する疎水性
基からなり、そして疎水性基は側鎖原子から1.7 〜4.0 Åに存在する； (ix) R4' 置換基はヒトTR−αのHis381、およびヒトTR−βのHis435から成る
群より選択される残基に対応するヒスチジンの側鎖の炭素または窒素原子と相互
作用する水素結合のドナーまたはアクセプターの基からなり、そして水素結合の
ドナーまたはアクセプターの基は側鎖原子から1.7 〜4.0 Åに存在する；
【００３２】 (x） R5' 置換基はTR LBDの中に特異的に適合する疎水性基または親水性基か
らなる；および (xi) R6' 置換基はTR LBDの中に特異的に適合する疎水性基または親水性基か
らなる；そして 前記化合物は従来知られておりかつTR処理法において使用されているサイロニ
ン（T3）、トリヨードサイロニン(T4)またはサイロニン様化合物、例えば、付録
１の中に言及されている化合物以外である。
【００３３】 このような置換基の例は、下記のものを包含する： R1は-O-CH2CO2H、-NHCH2CO2H、-CO2H 、-CH2CO2H、-CH2CH2CO2H 、-CH2CH2CH2 CO2H、-CH2CH(NH2)CO2H 、 -CH2CH[NHCOCHφ2]CO2H、-CH2CH[NHCO(CH2)15CH3]CO 2 H、-CH2CH[NH-FMOC]CO2H 、-CH2CH[NH-tBOC]CO2H 、または０〜３個の炭素原子
のリンカーをもつ環に接続したカルボキシレート、-PO3H2、-CH2PO3H2 、-CH2CH 2 PO3H2、-CH2CHNH2PO3H2、 -CH2CH[NHCOCHφ2]PO3H2 、-CH2CH[NHCO(CH2)15CH3]
PO3H2 、-CH2CH[NH-FMOC]PO3H2、-CH2CH[NH-tBOC]PO3H2、または０〜３個の炭素
原子のリンカーをもつ環に接続したホスフェートまたはホスホネート、-SO3H 、
-CH2SO3H、-CH2CH2SO3H 、-CH2CHNH2SO3H 、 -CH2CH[NHCOCHφ2]SO3H、-CH2CH[N
HCO(CH2)15CH3]SO3H、-CH2CH[NH-FMOC]SO3H 、-CH2CH[NH-tBOC]SO3H 、または０
〜３個の炭素原子のリンカーをもつ環に接続したサルフェートまたはサルファイ
トであるか、あるいはTRに結合したとき、分子の認識ドメインにおいてCH2CH(NH 2 )CO2Hの機能的同等物として作用し、前記R1がアミンで必要に応じて置換するこ
とができ、
【００３４】 R2は-H、ハロゲン、-CF3、-OH 、-NH2、-SH 、-CH3、-Et であるか、あるいは
TRに結合したとき、分子の認識ドメインにおいてＨの機能的同等物として作用し
、 R3は-H、ハロゲン、-CF3、-OH 、-NH2、-N3 、-SH 、-CH3、-Et であるか、あ
るいはTRに結合したとき、分子の認識ドメインにおいてＩの機能的同等物として
作用し、 R5は-H、ハロゲン、-CF3、-OH 、-NH2、-N3 、-SH 、-CH3、-Et であるか、あ
るいはTRに結合したとき、分子の認識ドメインにおいてＩの機能的同等物として
作用し、そしてR3はR5と同一であることができ、
【００３５】 R6は-H、ハロゲン、-CF3、-OH 、-NH2、-SH 、-CH3であるか、あるいはTRに結
合したとき、分子の認識ドメインにおいてＨの機能的同等物として作用し、そし
てR2はR6と同一であることができ、 R2' は-H、ハロゲン、-CF3、-OH 、-NH2、-N3 、-SH 、-CH3、-Et であるか、
あるいはTRに結合したとき、分子の認識ドメインにおいてＨの機能的同等物とし
て作用し、 R3' は任意の疎水性基であり、ハロゲン、-CF3、-SH 、アルキル、アリール、
５または６員のヘテロサイクル、シアノを包含するか、あるいはTRに結合したと
き、分子の認識ドメインにおいてＩの機能的同等物として作用し、
【００３６】 R4' は-H、ハロゲン、-CF3、-OH 、-NH2、-NH3、-N(CH3)3、カルボキシレート
、ホスホネート、ホスフェートまたはサルフェート、-SH 、-CH3、-Et 、または
アルキル、アリールであるか、あるいはR4' 位においてＯまたはＮまたはＳに尿
素またはカルバメート結合を通して結合した５または６員の複素環式芳香族基で
あるか、あるいはTRに結合したとき、分子の認識ドメインにおいてOHの機能的同
等物として作用し、
【００３７】 R5' は-H、-OH 、-NH2、-N(CH3)2、-SH 、-NH3、-N(CH3)3、カルボキシレート
、ホスホネート、ホスフェート、サルフェート、１〜９個の炭素原子を有する分
枝鎖状もしくは直鎖状アルキル、置換もしくは非置換のアリール（前記置換アリ
ールはハロゲンまたは１〜５個の炭素原子のアルキルで置換されており、そして
前記アリールは-CH2- により環に接続されていてもよい）、５〜６個の原子を有
する芳香族ヘテロサイクル（前記ヘテロサイクルは-OH 、-NH2、-SH 、-NH3、-N
(CH3)3、カルボキシレート、ホスホネート、ホスフェートまたはサルフェートか
ら選択される１または２以上の基で置換されることができる）、ヘテロアルキル
、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ポリ芳香族、またはポリヘテロ
芳香族であり、前記R5' は極性または帯電した基で置換されることができ、
【００３８】 R6' は-H、ハロゲン、-CF3、-OH 、-NH2、-SH 、-CH3、-Et であるか、あるい
はTRに結合したとき、分子の認識ドメインにおいてＨの機能的同等物として作用
し、 ＸはＯ、Ｓ、SO2 、NH、NR7 、CH2 、CHR7、CR7R7 であり、ここでR7はアルキ
ル、アリールまたは５または６員の複素環式芳香族であり、そして 前記TR LBDリガンドが１またはそれより小さい結合するTR LBDについての見掛
けのKdを有する。
【００３９】 下記の置換基を有する式Ｉの化合物のクラスは特に重要である：R1はカルボキ
シレート、ホスフェート、ホスホネートまたはサルファイトであり、そして０〜
３個の炭素原子のリンカーをもつ環に接続しており、R2は-Hであり、R3は-I、-B
r 、または-CH3であり、R5は-I、-Br 、または-CH3であり、R6は-Hであり、R2'
は-Hであり、R3' は-I、-Br 、-CH3、-iPr、−フェニル、ベンジル、または５ま
たは６員のヘテロサイクルであり、R4' は-OH 、-NH2、および-SH であり、R5'
は-H、-OH 、-NH2、-N(CH3)2、-SH 、-NH3、-N(CH3)3、カルボキシレート、ホス
ホネート、ホスフェート、サルフェート、１〜９個の炭素原子を有する分枝鎖状
もしくは直鎖状アルキル、置換もしくは非置換のアリール（前記置換アリールは
ハロゲンまたは１〜５個の炭素原子のアルキルで置換されており、そして前記ア
リールは-CH2- により環に接続されていてもよい）、５〜６個の原子を有する芳
香族ヘテロサイクル（前記ヘテロサイクルは-OH 、-NH2、-SH 、-NH3、-N(CH3)3 、カルボキシレート、ホスホネート、ホスフェートまたはサルフェートから選択
される１または２以上の基で置換されることができる）、ヘテロアルキル、アリ
ールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ポリ芳香族、またはポリヘテロ芳香族
であり、前記R5' は極性または帯電した基で置換されることができ、そしてR6'
は-Hである。
【００４０】 本発明は、また、TRイソ型の活性を選択的にモジュレートすることができる化
合物を同定する方法を包含する。「モジュレートする」とは、TRの活性をを増加
または減少することを意味する。「TRイソ型」とは、サブタイプまたは変異型の
TR遺伝子によりコードされるTRタンパク質を意味する。これは異なる遺伝子（例
えば、thraおよびthrb）および同一遺伝子の変異型（例えば、thrb１およびthrb
２）によりコードされるTR−αおよびTR−βのイソ型を包含する。この方法は下
記の工程からなる：被験化合物に結合したTR LBDイソ型の原子構造モデルを使用
して問題のTR LBDイソ型の中に特異的かつ優先的に適合する被験化合物をモデリ
ングし、バイオアッセイにおいて、TR LBDイソ型に被験化合物を結合することに
よって特徴づけられるTRイソ型の活性について、被験化合物をスクリーニングし
、そしてTRイソ型の活性を選択的にモジュレートする被験化合物を同定する。
【００４１】 「モデリング」とは、三次元構造の情報およびレセプター−リガンドの相互作
用モデルに基づく、レセプター−リガンドの構造／機能の定量的および定性的分
析を意味する。これは慣用の数値に基づく動的およびエネルギー的最小化のモデ
ル、相互作用のコンピューターグラフィックモデル、修飾された分子の機械的モ
デル、距離の幾何学および他の構造に基づく拘束のモデルを包含する。モデリン
グはコンピューターを使用して実施することが好ましく、そしてさらに既知の方
法を使用して最適化することができる。
【００４２】 TRイソ型、例えば、TR−αまたはTR−βの活性を選択的にモジュレートするた
めに、十分な量のTR LBDイソ型の中に特異的かつ優先的に適合する化合物をin v
itroまたはin vivo において準備して、所望の最終結果を達成する。TR−αイソ
型の選択性は、ヒトTR−αのSer277に対応するセリン残基の側鎖の酸素または炭
素と相互作用するアニオン基からなり、アニオン基が側鎖原子から1.7 〜4.0 Å
に存在する、化合物を使用して達成することができる。TR−βの選択性は、ヒト
TR−βのAsn331に対応するアスパラギンの側鎖の窒素原子と相互作用するアニオ
ン基からなり、アニオン基が側鎖原子から1.7 〜4.0 Åに存在する、化合物を使
用して達成することができる。
【００４３】 本発明は、さらに、TR LBDの中に特異的に適合するリガンドをモデリングし、
そしてバイオアッセイにおいて、TR活性を増加または減少するリガンドをTR活性
について同定することによって、TRのアゴニストまたはアンタゴニストのリガン
ドを同定する方法を包含する。 本発明は、また、TRイソ型の中に保存されるTR LBDのコンフォメーション的に
拘束された残基と相互作用する化合物を選択することによって、他の核レセプタ
ーに対してTR型レセプターに対する式Ｉの化合物またはその誘導体のレセプター
の選択性を増加する方法を包含する。
【００４４】 「コンフォメーション的に拘束された」は、種々の局所の幾何学的および物理
的−化学的拘束により固定された、その結合の回りのある種の回転を有する化学
または部分の三次元構造を意味する。他の核レセプターに比較してTRに対して特
異性が増加した化合物の設計および選択において、下記の本発明の方法を使用す
ることができる。１つの方法は、ある化合物に結合した第１TR LBDイソ型の原子
モデルを同一化合物に結合した第２TR LBDイソ型と比較し、相互作用するTR LBD
および化合物の原子を同定し、そしてTR LBDイソ型の間に保存されたコンフォメ
ーション的に拘束された構造的特徴を含むTR LBD残基と相互作用する化合物を設
計または選択することを包含する。
【００４５】 他の方法は、第１化合物と複合化した第1TR LBD を、第１化合物に比較して１
またはそれ以上の異なる置換基を有する第２化合物と複合化した第2TR LBD と比
較し、相互作用するTR LBDおよび化合物の原子を同定し、そしてTR LBDイソ型の
間に保存されたコンフォメーション的に拘束された構造的特徴を含むTR LBD残基
と相互作用する化合物を設計または選択することに関する。これらの方法は、ま
た、TR LBDに結合する化合物の間に保存された構造的、コンフォメーション的に
拘束された相互作用の同定を促進する。
【００４６】 これらの方法は、式Ｉの第１化合物と複合化した第１TR LBDの原子モデルを、
第１化合物と複合化した第２TR LBDイソ型、または第１化合物と異なる置換基を
有する式Ｉの第２化合物と比較することによって例示される。例えば、天然のホ
ルモン、例えば、T3に結合したTR−α LBDを、有機サイロニン様化合物、例えば
、GC-1に結合したTR−β LBDと比較する。異なる化合物の原子とTR LBDの原子と
の間で形成された、保存された接触を同定し、そして基準の、調節可能な成分を
同定する。他の核レセプターに比較してTRおよび／またはTR LBDに対する選択性
結合についてアッセイする、TR活性についての生物学的アッセイにおいて、TRに
対する化合物の選択性を同定する。
【００４７】 TRおよび他の核レセプターについての慣用のアッセイ、例えば、本明細書に記
載するアッセイを平行または系統的に実施することができる。自動化可能な方法
が好ましい。これらの方法は、TR LBD残基の拘束された側鎖および／または主鎖
の原子と相互作用する環炭素原子および置換基の原子を含む化合物の設計および
選択を促進する。
【００４８】 本発明の他の面において、本明細書に記載する方法は、TR活性をモジュレート
するペプチド、ペプチド模倣物または合成の分子を選択するために有用である。
本発明の方法は、また、天然および合成のTRリガンドの構造／機能の関係を特性
決定するとき使用される。特に重要な分子は、従来知られておりかつTR関係する
障害の治療に使用されるT3、T4および他のサイロニン様化合物以外の新規なサイ
ロニン様化合物である。本発明の新規な化合物は、T3またはT4およびイソ型特異
的結合活性を示すものよりも大きいアフィニティーでTR LBDイソ型に結合する化
合物を包含する。
【００４９】核レセプターに対する適用可能性 本発明、特にコンピューター的方法は、種々の核レセプター、例えば、下記の
因子のレセプターのための薬剤を設計するために使用することができる：グルコ
コルチコイド(GRs）、アンドロゲン(ARs）、ミネラロコルチコイド(MRs）、プロ
ゲスチン(PRs）、エストロゲン(ERs）、甲状腺ホルモン(TRs）、ビタミンD(VDRs
）、レチノイド(RARs およびRXRs）、イコサノイド(IRs）およびペルオキシイソ
マー(XPARsおよびPPARs 。また、本発明は、「オーファンレセプター」に適用す
ることができる。なぜなら、それらは古典的核レセプター、例えば、ステロイド
および甲状腺のレセプターに構造的に相同性であるからである。
【００５０】 他の核レセプターとのオーファンレセプターのアミノ酸の相同性は、非常に低
い率（＜15％）から、例えば、ラットRARIおよびヒトTR−βレセプターと比較し
たときの35％の範囲である。さらに、本明細書に開示するTRのＸ線結晶学の構造
および構造分析により明らかにされるように、リガンデッドスーパーファミリー
のメンバーの全体のフォルディングは類似するようである。リガンドはオーファ
ンレセプターを使用して同定されてきていないが、いったんこのようなリガンド
が同定されると、当業者は本発明をこのようなリガンドの設計および使用に適用
することができるであろう。なぜなら、それらの全体の構造のモジュールのモチ
ーフは本明細書に記載する他の核レセプターに類似するであろうからである。
【００５１】核レセプターのモジュール機能 本発明は、ここに開示する、すべての核レセプターに適用可能であり、一部分
、結合した異なるリガンドをもつ核レセプターの三次元構造、顕著にはTR−αお
よびTR−βのためのリガンド結合ドメインの三次元構造または結晶化タンパク質
構造の決定の結果として出現した、核レセプターの活性化、構造およびモジュレ
ーションに適用可能であろう。核レセプターのスーパーファミリーのタンパク質
は、ここに記載しかつこの分野において知られているように、アミノ酸の相同性
の実質的な領域を表示する（図２参照）。
【００５２】 このファミリーのメンバーは３モジュールのドメインの全体の構造的モチーフ
を表示する（これはTRの３モジュールのドメインのモチーフに類似する）： 1) 可変のアミノ末端のドメイン； 3) 高度に保存されたDNA 結合ドメイン(DBD）；および 3) 程度に保存されたカルボキシル末端のLBD 。 このスーパーファミリーのモジュラリティは各タンパク質の異なるドメインが別
々に異なる機能を達成できるようにするが、ドメインは互いに影響を与えること
ができる。
【００５３】 特定のドメインがタンパク質の残部から分離されているとき、ドメインの別々
の機能は通常保存される。普通のタンパク質化学の技術を使用して、モジュール
のドメインは時には親タンパク質から分離することができる。普通の分子生物学
の技術を使用して、そのもとの機能を完全なままにして各ドメインを通常別々に
発現させることができるか、あるいは２つの異なる核レセプターのキメラを構築
することができ、ここでキメラを発生させた、それぞれの核レセプターの個々の
機能的ドメインの性質をキメラは保持する。 第２図はファミリーのメンバーの構造の概略的表示であり、ファミリーのメン
バー内の相同性の領域および種々のドメインの機能を示す。
【００５４】アミノ末端のドメイン アミノ末端のドメインは３つのドメインのうちで最も低く保存されたドメイン
であり、そして核レセプターのスーパーファミリーのメンバーの中で大きさが著
しく変化する。例えば、このドメインはVDR において24アミノ酸を含有し、そし
てMRにおいて603 アミノ酸を含有する。このドメインは転写活性化に関係し、あ
る場合において、そのユニークネスは選択性レセプター−DNA の結合および特定
のレセプターイソ型によるターゲット遺伝子の活性化を支配することができる。
【００５５】 このドメインはLBD のドメインとの相乗的な、アンタゴニストの相互作用を表
示することができる。例えば、突然変異したおよび／または欠失したレセプター
を使用する研究は、アミノおよびカルボキシ末端のドメインの積極的共同性を示
す。ある場合において、これらのドメインのいずれかの欠失はレセプターの転写
活性化機能を壊滅するであろう。
【００５６】DNA 結合ドメイン DBD は核レセプターのスーパーファミリーにおいて最も保存された構造である
。それは通常約70アミノ酸を含有し、これらのアミノ酸は２つの亜鉛フィンガー
のモチーフに折りたたまれ、ここで亜鉛イオンは４つのシステインを配位する。
DBD は、第１および第２の亜鉛フィンガーの基部から延びる、２つの垂直に向い
たI-らせんを含有する。２つの亜鉛フィンガーは協力して非亜鉛フィンガー残基
に沿って機能して、核レセプターをDNA 上の特定のターゲット部位に向け、そし
てレセプターのホモダイマーまたはヘテロダイマーの界面を整列させる。
【００５７】 DBD 中の種々のアミノ酸は、レセプターの二量体の結合のために２つのハーフ
サイト（通常６つのヌクレオチドから構成されている）の間の間隔に影響を及ぼ
す。例えば、GRサブファミリーおよびERホモダイマーは３ヌクレオチドだけ間隔
を置いて位置するハーフサイトに結合し、そしてパリンドロームとして配向され
る。最適な間隔はDBD の間の共同的相互作用を促進し、そしてＤボックス残基は
二量体化界面の一部分である。DBD の他の領域は、直接的反復因子上のRXR のホ
モダイマー化およびヘテロダイマー化に必要なDNA −タンパク質およびタンパク
質−タンパク質の相互作用を促進する。
【００５８】 LBD はDBD のDNA 結合に影響を及ぼすことがあり、そしてこの影響はまたリガ
ンドの結合により調節することができる。例えば、TRリガンドの結合は、TRがモ
ノマーまたは二量体としてDNA に結合する程度に影響を及ぼす。このような二量
体化は、また、DNA ハーフサイトの間隔および向きに依存する。レセプターは、
また、他のタンパク質と相互作用し、遺伝子の発現を調節するように機能するこ
とができる。
【００５９】 核レセプターのスーパーファミリーは、DBD の構造、熱ショックタンパク質（
hsp)、およびヘテロダイマーを形成する能力に基づいて、２つのサブファミリー
に再分割された：1) GR（GR、AR、MRおよびPR）および2) TR（TR、VDR 、RAR
および大部分のオーファンレセプター）。GRサブグループのメンバーはリガンド
の非存在下にhsp により堅固に結合されており、リガンドの結合およびhsp の解
離後に二量体化し、そしてそれらが結合するDNA ハーフサイトにおいて相同性を
示す。これらのハーフサイトは、また、パリンドロームとして配置される傾向が
ある。
【００６０】 サブグループのメンバーは、アンリガンドされるとき、DNA または他のクロマ
チン分子に結合する傾向があり、DNA にモノマーおよび二量体として結合するこ
とができるが、ヘテロダイマーを形成しかつハーフサイトの種々の向きおよび間
隔でDNA 因子に結合する傾向があり、また、ハーフサイトのヌクレオチド配列に
関して相同性を示す。この分類により、ERはいずれのサブファミリーにも属さな
い。なぜなら、それはhsp 相互作用においてGRサブファミリーに類似し、そして
核の局在化およびDNA 結合性質においてTRサブファミリーに類似するからである
。
【００６１】リガンド結合ドメイン LBD はこれらのレセプターにおいて第２の最も高度に保存されたドメインであ
る。いくつかの異なるLBD サブドメインの統合はリガンドの結合のために重要で
あるが、LBD のみを含有するトランケート分子は正常のリガンド結合活性を保持
する。このドメインは、また、ここに記載するように、二量体化、核転位および
転写活性を包含する、他の機能に参加する。重要なことには、このドメインはリ
ガンドに結合し、ここに詳細に説明するように，リガンド誘導コンフォメーショ
ン変化を行う。
【００６２】 オーファンレセプターを包含する、スーパーファミリーの大部分のメンバーは
少なくとも２つの転写活性化サブドメインを有し、それらの１つは構成的であり
かつアミノ末端のドメインの中に存在し（AF-1）、そしてそれらの他のもの（AF
-2（また、TAU 4)）はリガンド結合ドメインの中に存在し、その活性はアゴニス
トリガンドの結合により調節される。AF-2の機能は、レセプターのサブファミリ
ーの中に高度に保存される活性化ドメイン（また、トランス活性化ドメインと呼
ばれる）を必要とする（付録アミノ酸1005〜1022）。大部分のLBD は活性化ドメ
インを含有する。
【００６３】 このドメインにおけるいくつかの突然変異はAF-2の機能を壊滅させるが、リガ
ンドの結合および他の機能を影響を受けないままに残す。リガンドの結合は、転
写を刺激する（あるいは、ある場合において、阻害する）機能をする必須のコア
クチベータータンパク質のための相互作用部位として、活性化ドメインを働かせ
る。
【００６４】 例えば、Shibata, H. et al.(Recent Progress in Hormone Res.52:141-164(1
997)) は、ステロイド／甲状腺ホルモンのレセプター系におけるコアクチベータ
ーおよびコリプレッサーの役割を概説した。ステロイドレセプターコアクチベー
ター-1(SRC-1）は、試験したAF-2ドメイン含有レセプターのすべてのための、一
般的コアクチベーターであるように見える。SRC-１はステロイドホルモン依存性
ターゲット遺伝子のトランス活性化を増強する。他の推定上のコアクチベーター
が報告されてきており、これらはSRC-１関係タンパク質、TIF-２およびGRIP-1、
および他の推定上の無関係のコアクチベーター、例えば、ARA-70、Trip 1、RIP-
140 、およびTIF-１を包含する。
【００６５】 さらに、他のコアクチベーターCREB結合タンパク質（CBP ）はレセプター依存
性ターゲット遺伝子の転写を増強することが示された。CBP およびSRC-１は相互
作用し、ERおよびPRによる転写活性化を相乗的に増強する。CBP 、SRC-１、およ
びリガンデッドレセプターの三重複合体を形成させて、ホルモン応答性遺伝子の
転写速度を増加させることができる。TRおよびRAR のためのコリプレッサー、例
えば、SMRTおよびN-CoR が同定され、これらはまたアンリガンドTRのサイレンシ
ング機能に寄与する。アンリガンドTRおよびRAR は基底プロモーター活性を阻害
することが示された；アンリガンデッドレセプターのターゲット遺伝子転写のこ
のサイレンシングは、これらのコリプレッサーにより仲介される。
【００６６】 総合すると、データが示唆するにより、レセプターはリガンド結合ドメインに
おけるそのコンフォメーションを変化させ、これによりコアクチベーターのレク
ルートメントを可能とし、レセプターを基底の転写機構といっそう効率よく相互
作用させ、そしてレセプターが転写を活性化するようにさせる。対照的に、アン
タゴニストの結合はレセプターにおける異なるコンフォメーションの変化を誘導
する。あるアンタゴニスト結合レセプターは二量体化し、それらの同族DNA 因子
に結合することができるが、それらはアソシエートしたコリプレッサーを除去す
ることができず、これにより基底転写機構との非産生的相互作用を生じさせる。
【００６７】 同様に、TRおよびRAR はリガンドの非存在下にコリプレッサーとアソシエート
し、これによりターゲット遺伝子の発現をサイレンスする、転写機構との陰性の
相互作用を生ずる。混合アゴニスト／アンタゴニスト、例えば、4-ヒドロキシタ
モキシフェンの場合において、遺伝子転写の活性化は、異なる化合物の相対的ア
ゴニストまたはアンタゴニストのポテンシャルを決定する、細胞または細胞特異
的因子におけるコアクチベーターおよびコリプレッサーの相対比に依存すること
がある。これらのコアクチベーターおよびコリプレッサーは、ホルモン応答性タ
ーゲット遺伝子の発現の転写調節をモジュレートする、アクセラレーターおよび
／またはブレーキとして作用するように思われる。
【００６８】 カルボキシ末端の活性化サブドメインは、ここに記載するように、リガンドに
対して密接した三次元の近接性にあるので、LBD に結合したリガンドは活性化サ
ブドメインにおいて１またはそれ以上のアミノ酸と配位（または相互作用）する
ことができる。ここに記載するように、核レセプターのLBD を発現させ、結晶化
させ、結合したリガンドを使用して（同一レセプターまたは異なるレセプターま
たはそれらの組合わせを使用して）三次元構造を決定することができ、そしてコ
ンピューター的方法を使用して、核レセプターの活性化ドメインを配位する拡張
部分を含有するリガンドを包含する、そのLBD に対するリガンドを設計すること
ができる。
【００６９】 いったんコンピューター的に設計されたリガンド（CDL ）をここに記載しかつ
この分野において知られているするようにして合成し、それを、ここに記載する
ように、アッセイを使用して試験して、アゴニスト、部分的アゴニストまたはア
ンタゴニストとしてのその活性、およびアフィニティーを確立することができる
。このような試験後、LBD に結合したCDL を使用してLBD 結晶を発生させること
によって、CDL をさらに精製することができる。次いで、三次元のモデルについ
てここに記載する化学的修飾法を使用して、CDL の構造をさらに精製して、CDL
の活性またはアフィニティーを改良し、そして改良された性質、例えば、ここに
記載する超アゴニストまたはアンタゴニストの性質、を有する第２世代のCDL を
作ることができる。
【００７０】 また、コアクチベーターおよびコリプレッサーとそれらの同族核ホルモンレセ
プターとの相互作用を変更することによって、核レセプター応答性遺伝子転写を
モジュレートする、アゴニストおよびアンタゴニストのリガンドを選択すること
ができる。例えば、レセプターとの相互作用からコリプレッサーをブロックまた
は解離し、および／またはコアクチベーターの結合またはアソシエーションを促
進する、CDL アゴニストを選択することができる。コアクチベーターの相互作用
をブロックし、および／またはターゲットレセプターとのコレセプターの相互作
用を促進する、CDL アンタゴニストを選択することができる。所望のアゴニスト
またはアンタゴニストの性質を有するCDL についてスクリーニングする、結合ア
ッセイにおいて、選択を実施することができる。
【００７１】 このようなスクリーニングのために適当なこのようなアッセイは、本明細書お
よび下記の文献に記載されている：Shibata, H., et al.(Recent Prog.Horm.Res
.52:141-164(1997) ）；Tagami, T., et al.(Mol.Cell.Biol.17(5):2642-2648(1
997));Zhu, XG., et al.(J.Biol.Chem.272(14):9048-9054(1997));Lin, B.C., e
t al.(Mol.Cell.Biol.17(10):6131-6138(1997));Kakizawa, T., et al.(J.Biol.
Chem.272(38):23799-23804(1997));およびChang, K.H., et al.(Proc.Natl.Acad
.Sci.USA 94(17):9040-9045(1995) ）、これらの参考文献は引用することによっ
て本明細書の一部とされる。
【００７２】核レセプターイソ型 本発明は、また、新規な合成リガンドを発生させて核レセプターイソ型を区別
するために適用可能である。ここに記載するように、結合性イソ型を区別し、こ
れにより組織特異的または機能特異的リガンドを発生させる、CDL を発生させる
ことができる。例えば、GRサブファミリーのメンバーは通常単一の遺伝子により
コードされる１つのレセプターを有するが、例外が存在する。
【００７３】 例えば、異なるAUG コドンからのオールタネイト開始により同一mRNAから翻訳
された、２つのPRイソ型、ＡおよびＢ、が存在する。２つのGR型が存在し、それ
らの１つはリガンドに結合しない。この方法は特にTRサブファミリーに適用可能
であり、このサブファミリーは、通常、少なくとも２つ（TR：α、β）または３
つ（RAR 、RXR 、およびPPAR：α、β、γ）の遺伝子をコードされるか、あるい
はオールタネイトRNA スプライシングを有するいくつかのレセプターを有し、そ
してTRについてこのような例は本明細書に記載される。
【００７４】核レセプターの結晶 本発明は、レセプターに結合したリガンドを有する核レセプターのリガンド結
合ドメインから作られた結晶を提供する。実施例において例示されているように
、TRはそれに結合したリガンドを使用して結晶化される。通常、細胞培養物、例
えば、大腸菌(E.coli)により発現される、精製された核レセプターのLBD から結
晶は作られる。好ましくは、異なるリガンド、例えば、天然に存在するリガンド
および天然に存在するリガンドのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用す
る、少なくとも１つのブロモ−またはヨード−置換合成リガンドを使用して、同
一核レセプターについて異なる結晶（共結晶）を別々に作る。
【００７５】 このようなブロモ−またはヨード−置換は、核レセプターのリガンドおよび核
レセプターのタンパク質の結晶において、重い原子の置換として作用する。この
方法は、伝統的重い金属誘導体を得るための必要性をバイパスということにおい
て、結晶のフェージングについて利点を有する。その結合したリガンドを有する
核レセプターのLBD について三次元構造が決定された後、三次元構造をコンピュ
ーター的方法において使用して核レセプターのための合成リガンドを設計するこ
とができ、そしてさらに本明細書に記載しかつこの分野において知られているア
ッセイを使用する日常的試験により、活性構造の関係を決定することができる。
【００７６】他の核レセプターのLBD の構造の発現および精製 本明細書に記載する技術ならびに文献に記載されている他の技術により、核レ
セプターのLBD を高いレベルで発現させることができる。TRおよび他の核レセプ
ター、例えば、ステロイド／甲状腺レセプターのサブファミリーのメンバー、例
えば、レセプターER、AR、MR、PR、RAR 、RXR およびVDR のリガンド結合ドメイ
ンを、また、大腸菌(E.coli)中で高いレベルで発現させることができる。熱ショ
ックタンパク質に結合する核レセプターとともに、酵母および他の真核生物の発
現系を使用することができる。
【００７７】 なぜなら、細菌中で発現させることができるERを除外して、これらの核レセプ
ターは細菌中で発現させることが一般にいっそう困難であるからである。代表的
な核レセプターまたはそれらのリガンド結合ドメインはクローニングされ、配列
決定されてきている：ヒトRAR-α、ヒトRAR-γ、ヒトRXR-α、ヒトRXR-β、ヒト
PPAR−α、ヒトPPAR−β、ヒトPPAR−γ、ヒトVDR 、ヒトER（下記の文献に記載
されている：Seielstad et al.，Molecular Endocrinology, vol 9:647-658(199
5 ）、引用することによって本明細書の一部とされる）、ヒトGR、ヒトPR、ヒト
MR、およびヒトAR。これらの核レセプターの各々のリガンド結合ドメインを同定
し、そして図３に示す。
【００７８】 図３の情報を本明細書に記載しかつこの分野において知られている方法と組み
合わせて使用して、当業者は、図３に例示されているものを包含する、任意の核
レセプターのLBD を発現させ、精製し、それを適当なリガンドに結合させ、そし
て結合したリガンドを有する核レセプターのLBD を結晶化させることができる。 図３はステロイド／甲状腺ホルモンレセプターのいくつかのメンバーの整列で
あり、適当な発現ベクターの中に含めるべきアミノ酸を示す。
【００７９】 発現する細胞の抽出物は、選択したレセプターの精製および製造の適当な源で
ある。このような発現を得るために、TRアルファの発現について使用されている
方法に類似する方法においてベクターを構築する（Apriletti et al.，Protein
Expression and Purification, 6:363-370(1995 ）、引用することによって本明
細書の一部とされる）。発現すべきレセプターのリガンド結合ドメインを包含す
るアミノ酸をコードするヌクレオチド、例えば、エストロゲンレセプターのリガ
ンド結合ドメイン（hER-LBD)（図３に示すように標準的に整列された位置725 に
おけるＲ〜位置1025におけるＬに対応する）を発現ベクター、例えば、Aprilett
i et al.(1995)が使用した発現ベクターの中に挿入する。
【００８０】 すぐれた結晶を生ずる材料を得る目的で、少なくともヒトTR−βの位置725 〜
1025に対応するアミノ酸を含めることが好ましい。より多くの構造的情報を望む
場合、隣接するアミノ酸配列のストレッチを含めることができる。こうして、位
置700 から位置1071におけるＣ末端までのアミノ酸をコードするヌクレオチドを
挿入することによって、ヒトエストロゲンレセプターのための発現ベクターを作
ることができる。
【００８１】 このようなベクターは、大腸菌(E.coli)中でホルモンを結合することができる
レセプターを高い収率で与える（Seielstad et al.，Molecular Endocrinology
9:647-658(1995))。しかしながら、位置1025を越えたＣ末端の領域を可変タンパ
ク質分解に付し、構築物から好都合に排除することができ、可変タンパク質分解
を回避するこの技術をまた他の核レセプターに適用することができる。
【００８２】核レセプターのLBD 構造および機能の例としてTR−αおよびTR−β TRの発現、精製および結晶化 リガンド結合ドメインの核レセプターの構造の例として、発現構築物、好まし
くは大腸菌(E.coli)中で発現させることができる構築物から発現したタンパク質
から、TRのα−およびβ−イソ型を結晶化させる。他の発現系、例えば、酵母ま
たは他の真核発現系を使用することができる。TRについて、DBD またはアミノ末
端のドメインのいかなる部分をも使用しないで、LBD を発現させることができる
。
【００８３】 LBD に隣接するアミノ酸とともに、それ以上の構造の情報を望む場合、DBD の
部分またはアミノ末端を含めることができる。一般に、TRについて、結晶のため
の使用したLBD は300 アミノ酸より短い長さである。好ましくは、TR LBDは少な
くとも150 アミノ酸の長さ、より好ましくは少なくとも200 アミノ酸の長さ、最
も好ましくは少なくとも250 アミノ酸の長さであろう。例えば、結晶化のために
使用するLBD はラットTR−αのMet122からVal410まで、ヒトTR−βのGlu202から
Asp461までスパニングするアミノ酸からなることができる。
【００８４】 典型的には、TR LBDを結晶化のために均質まで精製する。TR LBDの純度はドデ
シル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルの電気泳動（SDS-PAGE）、質量分析
（MS）および疎水性高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）により測定される。
結晶化のために精製されたTRは少なくとも97.5％の純度または97.5％の純度、好
ましくは少なくとも99.0％の純度または99.0％の純度、より好ましくは少なくと
も99.5％の純度または99.5％の純度であるべきである。 最初に、アンリガンデッドレセプターを慣用技術、例えば、疎水性相互作用ク
ロマトグラフィー（HPLC）、イオン交換クロマトグラフィー（HPLC）、およびヘ
パリンアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
【００８５】 核レセプター、特にTRのサブファミリーおよびTRの改良された結晶をより高度
に精製するために、レセプターを電荷に従い分離するカラム、例えば、イオン交
換カラムまたは疎水性相互作用カラムを使用して核レセプターをリガンドシフト
精製し、次いで溶離されたレセプターをリガンド、特にアゴニストと結合させる
ことが望ましいであろう。リガンドはレセプターの表面電荷の変化を誘導し、こ
うして同一カラム上で再クロマトグラフィーにかけるとき、レセプターはリガン
デッドレセプターの位置において溶出し、アンリガンデッドレセプターとともに
もとのカラムの展開により除去される。通常、リガンドの飽和濃度をカラムにお
いて使用し、タンパク質をリガンドと前インキュベートした後、カラムに通過さ
せる。ここに詳述する構造の研究において、結晶化用の超純粋な核レセプターの
LBD を得るために、この技術を一般的に適用できることが示される。
【００８６】 より最近に開発された方法は、「標識」、例えば、タンパク質の末端、例えば
、アミノ末端上に配置されたヒスチジンを使用して操作し、次いで精製について
ニッケルキレート化カラムを使用してことを含む、Janknecht R., Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA, 88:8972-8976(1991)、引用することによって本明細書の一部とされ
る。
【００８７】 TR LBD、または核レセプターのスーパーファミリーの他のメンバーからのLBD
の三次元構造を決定するために、LBD を対応するLBD リガンドとともに共結晶化
することが望ましい。TR LBDの場合において、それをリガンド、例えば、T3、Ip
BRおよびDimit （それらが含有する重い原子において異なる）と別々に共結晶化
することが好ましい。他のTRリガンド、例えば、本明細書に記載する式Ｉに包含
されるリガンドをまたTR LBDおよびTRリガンドの共結晶の発生のために使用する
ことができる。
【００８８】 式Ｉに包含される化合物のうちで、一般に、R3、R5、R3' またはR5' 位に少な
くとも１つのブロモまたはヨードを有する少なくとも１つのリガンドを使用する
ことが好ましく、好ましくはこのような化合物は少なくとも２つのこのような置
換基、より好ましくは少なくとも３つのこのような置換基を有するであろう。こ
こに記載するように、このような置換基は好都合には重い原子として使用して、
TR LBDの三次元構造についての相の問題の解決を促進し、そしてハロゲン（例え
ば、ＩまたはBr) 置換リガンドを、特に核レセプターのために、使用するフェー
ジングの一般化された方法として使用することができる。
【００８９】 典型的には、タンパク質の完全性を保存する温度でリガンドの飽和濃度におい
て、精製されたLBD 、例えば、TR LBDを平衡化する。リガンドの平衡化は２〜37
℃において確立することができるが、レセプターは２〜20℃の範囲においていっ
そう安定である傾向がある。 好ましくは、本明細書において詳述するハンギングドロップ法により結晶を作
る。調節された温度コントロールは結晶の安定性および品質を改良するために好
ましい。４〜25℃の温度を一般に使用し、そしてある温度範囲にわたって結晶化
を試験することがしばしば好ましい。TRの場合において、18〜25℃、より好まし
くは20〜23℃、最も好ましくは22℃の結晶化を使用することが好ましい。
【００９０】 種々のアゴニスト、例えば、T3、IpBR2 、Dimit 、およびTriac とのTR−α L
BDの複合体を本明細書に記載する方法により製造する。例えば、前もって結合し
たリガンドを有するrTR-α LBDの結晶は周囲温度において15％の2-メチル-2,4−
ペンタンジオール（MPD)から製造される。結晶は放射線感受性であり、そして完
全な回折データを測定するために凍結を必要とする。回転アノードのＸ線源上で
、結晶は約３Åに回折する；シンクロトロン放射線はT3共結晶について分解限界
を2.0 Å程度に高く有意に延長する。
【００９１】 甲状腺ホルモンの組成は、種々のアナローグと複合化したレセプターを製造し
かつ共結晶化する能力と組み合わせて、異常なフェージング戦略を可能とした。
このフェージング戦略は、このようなリガンドのＩおよびBr置換を発生させるこ
とによって、本明細書に記載する核レセプターのリガンドに適用可能である。こ
の戦略において、３、５および3'位において異なる４つのホルモンアナローグ（
T3、IpBR2 、Dimit およびTriac ）を含有するTR LBDの共結晶は同形誘導体を提
供した。この組のアナローグについて、ハロゲン置換基（2Br および3I原子）は
重い原子として機能するが、Dimit 共結晶（３アルキル基）は親として作用する
。
【００９２】 初期の2.5 Å多重同形置換／異常散乱／密度の修飾された電子密度の地図は、
分子グラフィックスプログラムO5においてつくられた骨格からのLBD のトレース
を可能とした（Jones, T.A. et al., ACTA Cryst，47:110-119(1991)、引用する
ことによって本明細書の一部とされる）。LBD のモデルは４つのフラグメント、
Arg157-Gly184 、Trp186-Gly197 、Ser199-Pro205 、およびVal210-Phe405 で構
成され、そして位置の精製およびシミュレートされたアニーリングプロトコール
によりXPLOR 中の精製された。欠けている残基を異なる密度の助けにより構成さ
れた。
【００９３】 最終モデルは15.0〜2.2 ÅのデータについてRcryst=21.8 ％およびRfree=24.4
％に精製された、表６参照。ヒトTR−β LBDモデルはTR−α LBD配位の分子置換
により分解された。構造はＮ末端にhis-標識をもつE202〜D461に基づく。最終モ
デルは30.0〜2.4 Å＋のデータについてRcryst=25.3 ％およびRfree=28.9％に精
製された、表７参照。 このフェージング戦略は、このようなリガンドのＩおよびBr置換を発生させる
ことによって、本明細書に記載する核レセプターのリガンドに適用可能である。
【００９４】TR LBDの三次元構造 TR LBDの構築 核レセプターの三次元構造の１例として、TR−α LBDのフォルディングを図４
に示す。TR−α LBDは３層で充填された単一の構造ドメインから成り、これらの
層は12のα−らせん、H1-12 、および４つの短いβ−鎖、S1-4から構成され、混
合β−シートを形成する。埋もれたホルモンおよび３つの逆平行のα−らせん、
H5-6、H9、およびH10 は、図４に示すように、ドメインの中心の層を形成する。
【００９５】 H1、H2、H3およびS1はLBD の１つの面を形成し、反対の面はH7、H8、H11 、お
よびH12 により形成されている。Ｎ末端の最初の35アミノ酸（Met122-Gln156 ）
は電子地図において可視ではない。DNA に結合したヘテロダイマーのRXR ：TR D
NA−結合ドメインの三次元構造、TR DBDのアミノ酸Met122-Gln151 は、DNA8の小
さいグルーブと広範な接触を作る。５つの無秩序のアミノ酸（Arg152-Gln156 ）
はは、TR DBDの最後の可視の残基とLBD の最初の可視の残基との間に存在し、無
傷のレセプター中のｌｄｂおよびDBD を結合する有効な「ヒンジ」を表すようで
ある。
【００９６】 主としてらせんの組成および二次構造の層状の配置はアンリガンデッドhRXRα
のそれと同一であり、２つの核レセプターの間の共通した核レセプターの折りた
たみの存在を確証する。 TR LBDはArg157において開始して可視であり、そして拡張したコイルのコンフ
ォメーションでH1の開始まで続く。α−らせんの回転、H2、はホルモンの結合キ
ャビティをカバーし、そのすぐ後に短いβ−鎖、S1、が存在し、これは逆平行の
鎖の最も外部であるS4に対して平行な混合β−シートのへりを形成する。H1に対
して逆平行にH1が開始するまで、鎖はほとんど不規則である。H3はリガンドに接
触するIle221およびIle222において湾曲する。
【００９７】 鎖はH3の末端においてほとんど90°で回転して、不完全なα−らせん、H4、を
形成する。第１の埋もれたコアのらせん、H5-6、が引き続いて存在し、その軸Gl
y253におけるリガンド付近のキンクにより変更されている。らせんは、２つの顕
著な例外により中断された、主として疎水性の側鎖から構成されている：Arg262
は溶媒アクセス不可能であり、そしてリガンドカルボキシレート（1-置換基）と
相互作用し、そしてGlu256は極性折りたたみにおいてH9からのArg329およびH11
からのArg375と直面する。S3およびS4は左回りの回転を通して結合され、さらに
Lys284とAsp272との間の塩架橋により結合されている。
【００９８】 S4後、H7およびH8はＬを形成し、Lys268とAsp277との間の塩架橋により安定化
されている。H7とH8との間の回転は、リガンドとの相互作用およびそのグリシン
に富んだ配列の結果、異常なコンフォメーションを採用する。H9は第２コアらせ
んであり、隣接するH5-6に対して逆平行である。再び、２つの埋もれた極性側鎖
が見出される、Glu315およびGln320。Glu315はHis358およびArg356と埋もれた塩
架橋を形成する。Gln320の酸素はHis175の埋もれた側鎖と水素結合を形成する。
次いでこの鎖は再びスイッチバックして、またH9に対して逆平行である、H10 を
形成する。H11 は分子の全長を対角線的に横切って延びる。H11 の直後に、鎖は
H11 に対してほぼ90°のII型の回転を形成する。
【００９９】 次いで鎖は再び回転してH12 を形成し、これはホルモンまたはリガンドの結合
キャビティの一部分としてH3およびH11 に対してゆるく充填する。Ｃ末端におけ
る最終の５つのアミノ酸、Glu406-Val410 、は無秩序である。TR−β LBDの構成
は、２つの有意差を除外して、TR−α LBDのそれと同一である。追加のらせんが
Ｎ末端に存在し（残基Glu202-Ile208)、これはDBD の一部分であり、そしてH10
に対して逆平行に充填する。
【０１００】 このらせんの後に、２つの残基の回転（Gly209-His210)が存在し、TR−α LBD
において見られるように、これらは延長したコイルでH1の開始まで連続する。そ
れ以上の差は、H2とH3との間に採用された不規則のコンフォメーションで起こる
。TR−α LBDにおいて、残基Gly197-Asp211 は、らせんH7、H8、H11 と接触する
、レセプターに対して充填するループ、およびH11 とH12 との間のループを形成
する。TR−β LBDにおいて、ループの末端のみが規則的であり、ストレッチAla2
53-Lys263 は無秩序である。これらの残基に加えて、Ｎ末端におけるHis-標識の
残基、およびＣ末端における最終の残基Asp461は無秩序である。
【０１０１】核レセプターの埋もれたリガンドキャビティの１例としてLBD のリガンド結合キ ャビティ TR LBDの三次元構造は、T3またはそのアイソスターがLBD に結合するとき、LB
D のリガンド結合キャビティが溶媒アクセス不可能であるという驚くべき発見に
導く。この驚くべき結果は、核レセプターの三次元構造および機能の新しいモデ
ルに導く。これは本明細書において、特にリガンドの設計のコンピューター的方
法、および活性化ドメインの通常の活性化を防止する拡張された位置を含有する
核レセプターの合成リガンドを設計するための、このような方法の適用を解明す
る節において、さらに説明される。
【０１０２】 レセプターに結合したリガンドDimit は、T3および甲状腺ホルモンのアゴニス
トのアイソスターである。したがって、Dimit の結合はT3の結合を反映し、そし
てDimit が結合したレセプターはTRの活性コンフォメーションであることが期待
される。このリガンドは、図５ａおよび図５ｂに示すように、レセプター内に埋
もれ、タンパク質のサブドメインの疎水性コアを提供する。H5-6およびH9は、レ
セプターの残部のための疎水性コアからなる。
【０１０３】 広範な結合キャビティはいくつかの構造因子から構築される。このキャビティ
は上からH5-6（Met256-Arg266)により、下からH7およびH8および介在ループ（Le
u287-Ile299)により、そして側面に沿ってH2（185-187)、S3とS4との間の回転（
Leu276-Ser277 ）、H3（Phe215-Arg228)、H11 （His381-Met388)およびH12 （Ph
e401-Phe405)により取り囲まれている。これらの因子により定められ、GRASP(コ
ロンビア大学、米国）により計算されたキャビティの体積(600Å3)は、本質的に
ホルモンの体積(530Å) である。本明細書において記載するように、体積の変化
はリガンドの設計に利用することができる。残りの体積は、アミノ−ピロピオン
酸置換基を取り囲む水分子により占有されている。TRのLBD とリガンドとの間の
種々の接触（または相互作用）は図６に描写されている。
【０１０４】 リガンドの内側および外側の（プライムリング）リングの平面は、互いに関し
て約60°で平面から回転し、3'−遠位のコンフォメーションを採用している（外
側のリングの3'置換基は下方に、内側のリングから離れる方向に突起する）。ア
ミノ−ピロピオン酸および外側フェノールリングはトランソイド（transoid）の
コンフォメーションを取り、各々は内側のリングの対向する側面に存在する。ア
ミノ−ピロピオン酸についての捩れ角度χ1 は300 °である。
【０１０５】 アミノ−ピロピオン酸置換基は、H2、H4およびS3からの側鎖により形成された
極性ポケットの中にゆるく充填されている。カルボキシレート基は、Arg228のグ
アニジニウム基およびSer277のアミノＮと直接の水素結合を形成する。さらに、
Arg262、Arg266およびAsn179は、水仲介水素結合を通してカルボキシレートと相
互作用する。３つのアルギニン基は有意に正の局所的静電電位をつくり、これは
カルボキシレートの負の電荷を安定化することができる。水素結合はアミノ窒素
により形成されない。アミノ−ピロピオン酸置換基の相互作用は、アミノ窒素を
欠如するTriac がT3のそれに等しい結合アフィニティーを有するという事実と一
致し、T3のアミノ窒素およびより長い脂肪族鎖が結合アフィニティーに大きく寄
与しないことを示す。
【０１０６】 ビフェニルエーテルは、対照的に、疎水性コア内埋もれている。内側リングは
、H3、H5-6、およびS3により形成された疎水性ポケット中に充填されている。3-
および5-メチル置換基のためのポケットは、期待されるように、完全には充填さ
れない。なぜなら、Dimit のメチル置換基のファン・デル・ワールス半径は甲状
腺ホルモンT3により提供されるヨウ素置換基より小さいからである。このような
ポケットは典型的には25〜100 立方オングストロームであり（しかし、置換基の
ためのより小さいポケットは40〜80立方オングストロームの範囲であると考えら
れる）ここに記載するように、よりすぐれた適合の化学的置換基でいっそう密に
充填されることができる。
【０１０７】 外側リングは、H3、H5-6、H7、H8、H11 およびH12 、およびH7とH8との間のル
ープにより形成されたポケットの中に緊密に充填されている。エーテル酸素は、
Phe218、Leu287、Leu276、およびLeu292により定められた疎水性環境の中に見出
される。エーテル酸素への水素結合の非存在は、減少したまたは無視できる水素
結合能力を有する構造的に類似する結合によるホルモンアナローグの潜在的結合
が示唆するように、フェニルリングの正しい立体化学の確立における、その役割
と一致する。
【０１０８】 3'−イソプロピル置換基はGly290および291 と接触する。ポケット中のこの位
置におけるグリシンの存在により、観測された3'−置換基の活性と大きさとの間
の関係を説明することができる。活性は3'−イソプロピルについて最高であり、
そして嵩の付加とともに減少する。疎水性キャビティ中の唯一の水素結合は、フ
ェノールヒドロキシルとHis381 Nε２との間で形成される。His381のコンフォメ
ーションは、Phe405およびMet256により提供される充填接触により安定化される
。
【０１０９】 水素より大きい5'置換基の存在は、ホルモンに対する結合アフィニティーに影
響を与える。いっそう豊富な甲状腺ホルモン、3,5,3',5'-テトラヨード−Ｌ−サ
イロニン（T4）は、この位置にヨウ素を含有し、そしてT3のアフィニティーの２
％でレセプターに結合する。この構造により示唆されるように、Met256による立
体的矛盾および多分His381からフェノールヒドロキシルへの水素結合のジオメト
リーにより付与される拘束の組合わせにより、T4に対する判別は達成される。5'
位は、ここに記載するように、T3および／またはTRアゴニストの5'にC-H の化学
的修飾を導入するために好ましい位置であり、これはプライムリングからエクス
テンションを生成し、そしてアンタゴニストまたは部分的アゴニストを発生させ
る。
【０１１０】 欠失および抗体競合の研究は、リガンドの結合における残基Pro162-Val202 の
掛かり合いを示唆する。この領域は結合した構造においてホルモンに直接接触し
ないが、H2は残基に対して充填して極性ポケットを形成し、このポケットはアミ
ノ−ピロピオン酸基と相互作用する。それゆえ、H2についての役割は、これらの
残基を結合した状態で安定化することであり、リガンドのアミノ−ピロピオン酸
はこの領域に向いているので、H2はβ−鎖S3およびS4とともにリガンドのための
優勢なエントリー点をまた表すことができる。
【０１１１】 T3アフィニティーマトリックスに結合するレセプターの研究は、アミノ−ピロ
ピオン酸への結合のみが許容されることを証明し、他の結合の中に存在する立体
障害性が結合を妨害することを示唆する。さらに、結晶学的温度ファクターはコ
イルを示唆し、そしてβ−鎖領域はドメインの最も柔軟な部分である、第７図。
ホルモンの結合における、この領域、すなわち、DBD とLBD との間のヒンジドメ
インの部分、の参加は、DNA の結合に影響を及ぼすリガンドの結合の構造的手段
を提供することができる。なぜなら、ヒンジドメインの部分はDNA と接触するか
らである。
【０１１２】核レセプターの活性化ドメインの１例としてTR LBD転写活性化らせん リガンドを負荷したとき、リガンド結合キャビティが溶媒アクセス不可能であ
るという驚くべき発見に加えて、TR LBDの活性化らせんは少なくとも１つのアミ
ノ酸と結合したリガンドとの間の相互作用のための表面をリガンドキャビティに
提供する。活性化らせんまたはAF-2（LBD 活性化ドメインの１例）と呼ぶ、TRの
Ｃ末端の17アミノ酸は、仲介するホルモン依存的転写活性化関係づけられる。こ
のドメイン内の主要な残基の突然変異はリガンド依存的活性化を減少させるが、
本発明まで、このような突然変異がリガンドの配位に影響を与えるかどうかは不
明瞭であった。このドメインのいくつかの突然変異はリガンドの結合を減少また
は壊滅させることが認められたが、LBD のいっそう遠い部位における他の突然変
異は同様な作用を有する。
【０１１３】 核レセプターの間の活性化ドメインは結合キャビティに対して類似の三次元の
関係を表し、これはリガンドの分子認識ドメインに結合する領域である、すなわ
ち、活性化ドメインはそれ自体の一部分を結合キャビティに提供する（しかし必
然的にリガンドの分子認識ドメイン）。多数の核レセプターはこのようなドメイ
ンを有することが期待され、レチノイドレセプター、RAR およびRXR 、グルココ
ルチコイドレセプターGR、およびエストロゲンレセプターERを包含する。TRの配
列をベースとして、このドメインは両親媒性らせん構造を採用することが提案さ
れる。β−シートまたは混合二次構造は、関係が少ない核レセプターにおいて活
性化ドメインとして存在することができるであろう。
【０１１４】 活性化ドメイン内で、高度に保存されたモチーフΦΦXEΦΦ（ここでΦは疎水
性残基を表す）はレセプターと転写コアクチベーターとの間の相互作用を仲介す
ることが提案される。ホルモン依存的方式でTRに結合する、いくつかのタンパク
質が同定されてきている。これらの１つのTrip１は推定上の酵母コアクチベータ
ーSug1に関係し、また、Ｃ末端の活性化ドメインおよび基底転写機構のサブセッ
トの双方と相互作用し、TRによりトランス活性化における役割を示唆する。
【０１１５】 他のタンパク質、例えば、RIP140、SRC1(Onate，S.A. et al., Science 270:1
354-1357(1995)) およびTF-1（また、Ledouarim, B. et al., EMBO J.14:2020-2
033(1995))、およびGRIP-1(Heery，E.，et al.，Nature 387:733-736(1997)）も
またＣ末端のドメインを通してリガンド依存的方法で他の核レセプターと相互作
用する。これらのタンパク質の結合は、本明細書に記載するTR、特に高度に保存
されたモチーフと他のタンパク質との間の相互作用を立体障害するエクステンシ
ョンをもつTRリガンドを使用してモジュレートすることができる。
【０１１６】 TRのＣ末端の活性化ドメインは両親媒性らせん、H12 、を形成し、このらせん
はレセプターに対してゆるく接触してホルモン結合キャビティの部分を形成する
。図８に示すように、らせんは充填し、ここで疎水性残基は内方にホルモン結合
キャビティに向かって面し、そして高度に保存されたグルタメートを包含する帯
電した残基は溶媒の中に延びる。TR LBDの活性化らせんはPhe401をリガンド結合
キャビティに提供し、そしてホルモンとの配位を可能とする、すなわち、このよ
うなアミノ酸はリガンドと相互作用して、外側フェニルリングの平面とファン・
デル・ワールス接触を形成する。また、Phe405はHis381と相互作用し、多分その
水素結合のコンフォメーション、すなわち、好適な水素結合の相互作用、を安定
化する。
【０１１７】 ホルモンの結合におけるPhe401およびPhe405の参加は、これらの残基の突然変
異がホルモン結合アフィニティーを減少する方法を説明する。さらに、活性化に
対するこれらの突然変異の衝撃は、ダイポール相互作用の水素結合の相互作用の
増加により、結合した構造中のドメインを安定化する役割から誘導されるようで
ある。Glu403は溶媒の中に延び、トランス活性化におけるその決定的な役割を強
調する。主として疎水性表面のバックグラウンドに対して、規則的残基として表
面上に提示された、その観測されたコンフォメーションにおいて、図９に示すよ
うに、Glu403はここに記載するアクチベータータンパク質との相互作用に利用さ
れる。らせんはPhe405においてほぐれるので、他の帯電した残基、Glu405および
Asp406は無秩序である。
【０１１８】 TR中の２つの他の配列、τ２およびτ３、は、DNA 結合ドメインとの融合タン
パク質として発現されるとき、転写を活性化する。TRB において発見された配列
は、H1（τ２）中のTR−α残基Pro158-Ile168 、およびH8およびH9（τ３）中の
Gly290-Leu319 に対応する。Ｃ末端の活性化ドメインと異なり、τ２およびτ３
はラットTR-I LBD中のモジュール構造を表すように見えず、また、タンパク質−
タンパク質の相互作用のための表面を表すように見えない：τ３の決定的なアス
パルテート／グルタメートの残基は２つの別々のらせん上に位置し、そして単一
の表面を形成しない；τ２の帯電した残基はLBD の残基とのイオン対の相互作用
においてかみ合わされる。こうして、τ２およびτ３はレセプター全体の関係に
おいて活性化ドメインとして機能しないであろう。
【０１１９】核レセプターのLBD リガンドを設計するコンピューター的方法 核レセプターのリガンド結合ドメインの三次元構造の解明は、本明細書に記載
するコンピューター的方法を使用する核レセプターに対するリガンドを設計する
ための、重要かつ有用なアプローチを提供する。図面を検査することによって、
核レセプターのリガンドはLBD 中の水アクセス不可能な結合キャビティ中で結合
され、そして化学的部分をリガンド上の選択した位置に添加することができるこ
とを決定することができる。
【０１２０】 このような化学的修飾、通常エクステンションは、より緊密な適合（またはよ
り少ない水）のために図面に表されている結合キャビティを充填することができ
るか、あるいは化学的修飾をLBD の三次元のモデルの図面の中に導入するか、あ
るいは表すの前に、リガンドと接触しないアミノ酸との接触を崩壊または作るた
めに使用することができる。核スーパーファミリーのメンバーと相互作用するリ
ガンドは、どのようなリガンド誘導コンフォメーションの変化が起こるかに基づ
いて、アゴニスト、アンタゴニストおよび部分的アゴニストとして作用すること
ができる。
【０１２１】 アゴニストはレセプターにおいて変化を誘導し、このような変化は活性なコン
フォメーションにレセプターを配置し、このような活性なコンフォメーションに
より、レセプターは、積極的または消極的に、転写に影響を及ぼすることができ
る。レセプターのコンフォメーションにおいて、いくつかの異なるリガンド誘導
変化が存在することができる。 アンタゴニストはレセプターに結合することができるが、レセプターの転写の
調節性質または生理学的に関係するコンフォメーションを変更するコンフォメー
ションの変化を誘導することができない。アンタゴニストの結合は、また、結合
をブロックし、したがってアゴニストの作用をブロックすることができる。
【０１２２】 部分的アゴニストはレセプターに結合し、アゴニストにより誘導されるレセプ
ター中の変化の一部分のみを誘導する。差は定性的または定量的であることがで
きる。こうして、部分的アゴニストはアゴニストにより誘導されるコンフォメー
ションの変化の一部分を誘導することができるが、他の変化を誘導することがで
きないか、あるいは部分的アゴニストはある種の変化を制限された程度に誘導す
ることができる。
【０１２３】リガンド誘導コンフォメーション変化 ここに記載するように、アンリガンデッドレセプターは、不活性化であるか、
あるいは多少の活性を有するか、あるいはリプレッサー活性を有する、立体配置
にある。アゴニストリガンドの結合は、レセプターがいっそう活性となって、遺
伝子の発現を刺激または抑制するように、レセプターにおいてコンフォメーショ
ン変化を誘導する。レセプターは、また、非ゲノム作用を有することができる。
これらの既知の型の変化および／または結果のいくつかを本明細書において列挙
する。
【０１２４】熱ショックタンパク質の結合 核レセプターの多数について、リガンドの結合は熱ショックタンパク質の解離
を誘導し、こうしてレセプターはほとんどの場合において二量体を形成すること
ができ、その後レセプターはDNA に結合し、転写を調節する。 核レセプターは通常LBD に結合するための領域を表す熱ショックタンパク質の
結合ドメインを有し、そしてLBD へのリガンドの結合によりモジュレートするこ
とができる。結局、LBD との熱ショックタンパク質の結合ドメインの結合または
接触を安定化する、リガンドから拡張した化学的部分（またはより多く）を、本
明細書に記載するコンピューター的方法により設計して、部分的アゴニストまた
はアンタゴニストを生成することができる。典型的には、このような拡張された
化学的部分は、リガンド上の分子認識ドメインを過ぎてかつそれから離れる方向
に、通常リガンドの埋もれた結合キャビティを過ぎて、拡張するであろう。
【０１２５】二量体化およびヘテロダイマー化 リガンドの非存在下にhsp とアソシエートしたレセプターでは、hsp の解離は
レセプターの二量体化を生ずる。二量体化はDBD およびLBD の双方におけるレセ
プタードメインのためである。二量体化の主要な刺激はhsp の解離であるが、レ
セプターにおけるリガンド誘導コンフォメーション変化は追加の促進的影響を有
することがある。リガンドの非存在下にhsp とアソシエートしないレセプターで
は、特にTRでは、リガンドの結合は二量体化／ヘテロダイマー化のパターンに影
響を与えることができる。この影響はDNA 結合部位の関係に依存し、また、レセ
プターと相互作用することができる他のタンパク質に関してプロモーターの関係
に依存することがある。共通のパターンはモノマーの形成を不能化し、その結果
DNA 上の二量体の形成よりもヘテロダイマーの形成を優勢とする。
【０１２６】 核レセプターのLBD は通常他の核レセプターに結合するための領域を表す二量
体化ドメインを有し、そしてLBD へのリガンドの結合によりモジュレートするこ
とができる。結局、二量体化ドメインの結合または接触を崩壊するリガンドから
拡張した化学的部分（またはより多く）を、本明細書に記載するコンピューター
的方法により設計して、部分的アゴニストまたはアンタゴニストを生成すること
ができる。典型的には、このような拡張された化学的部分は、リガンド上の分子
認識ドメインを過ぎてかつそれから離れる方向に、通常リガンドの埋もれた結合
キャビティを過ぎて拡張するであろう。
【０１２７】DNA の結合 hsp に結合する核レセプターにおいて、hsp のリガンド誘導解離、その結果の
局二量体の形成は、DNA の結合を可能とし、したがって、促進する。アソシエー
トしない（リガンドの非存在下におけるように）レセプターでは、リガンドの結
合はヘテロダイマーのDNA の結合を刺激し、DNA へのモノマーの結合を不能化す
る傾向がある。しかしながら、TRへのリガンドの結合は、例えば、ある種のDNA
因子上の二量体の結合を減少させる傾向があり、そしてヘテロダイマーの結合を
増加する作用をほとんど、あるいはまったくもたない。単一のハーフサイトのみ
を含有するDNA では、リガンドはDNA へのレセプターの結合を刺激する傾向があ
る。
【０１２８】 これらの作用は適度であり、そしてDNA 部位の特質および多分レセプターと相
互作用することができる他のタンパク質の存在に依存する。核レセプターは通常
DNA への結合のための領域を提示するDBD を有し、そしてこの結合はLBD へのリ
ガンドの結合によりモジュレートすることができる。結局、DBD の結合または接
触を崩壊するリガンドから拡張した化学的部分（またはより多く）を、本明細書
に記載するコンピューター的方法により設計して、部分的アゴニストまたはアン
タゴニストを生成することができる。典型的には、このような拡張された化学的
部分は、リガンド上の分子認識ドメインを過ぎてかつそれから離れる方向に、通
常リガンドの埋もれた結合キャビティを過ぎて拡張するであろう。
【０１２９】リプレッサーの結合 リガンドの非存在下にhsp とアソシエートしないレセプターは、リガンドの非
存在下に転写リプレッサーとして、しばしば作用する。これは、一部分、レセプ
ターのLBD に結合する転写リプレッサーのタンパク質のためであるように思われ
る。アゴニストの結合は、レセプターからのこれらのタンパク質の解離を誘導す
る。これは転写の阻害を緩和し、そしてレセプターの転写のトランス活性化機能
を発現させる。
【０１３０】転写トランス活性化機能 リガンドの結合は、２つの基本的方法において、転写活性化機能を誘導する。
第１はレセプターからのhsp の解離による。この解離、その結果のレセプターの
二量体化およびDNA または核クロマチン中の他のタンパク質へのそれらの結合は
、レセプターの転写調節性質を発現させる。これはレセプターのアミノ末端上の
このような機能について特に真実であることがある。
【０１３１】 第２の方法は、レセプターを変更して、転写に関係する他のタンパク質と相互
作用させることである。これらは、近接プロモーターの因子または近接プロモー
ターのタンパク質と直接的または間接的に相互作用するタンパク質であることが
できるであろう。あるいは、相互作用は、近接プロモーターのタンパク質とそれ
ら自体直接的または間接的に相互作用させる、他の転写因子によることができる
。リガンド依存的方法においてレセプターに結合する、いくつかの異なるタンパ
ク質が記載されてきている。さらに、ある場合において、リガンド誘導コンフォ
メーション変化はレセプターへの他のタンパク質の結合に影響を与えないが、転
写を調節するそれらの能力に事実影響を与える。
【０１３２】 核レセプターまたは核レセプターのLBD は、通常、一部分調和的にDNA に対す
る結合のための領域を提示するように機能するコアクチベーター／コリプレッサ
ーによりモジュレートされた活性化ドメインを有し、そしてLBD へのリガンドの
結合によりモジュレートすることができる。結局、コアクチベーター／コリプレ
ッサーを有する活性化ドメインの結合または接触を崩壊するリガンドから拡張し
た化学的部分（またはより多く）を、本明細書に記載するコンピューター的方法
により設計して、部分的アゴニストまたはアンタゴニストを生成することができ
る。
【０１３３】 例えば、(1) 結合をブロックしおよび／またはコリプレッサーを解離する、お
よび／または(2) コアクチベーターの結合および／または解離を促進する、アゴ
ニストを設計することができる。(1) コリプレッサーの結合および／または解離
を促進する、および／または(2) コアクチベーターの結合および／または解離を
促進する、アンタゴニストを設計することができる。アゴニストおよびアンタゴ
ニストの比を使用して、問題の遺伝子の転写をモジュレートすることができる。
【０１３４】 後述するように、結合アッセイにおいて選択を達成することができ、このよう
なアッセイにおいて、コンフォメーション変化を誘導する、このようなリガンド
を包含する、所望のアゴニストまたはアンタゴニストの性質を有するリガンドに
ついてスクリーニングする。このようなスクリーニングのために適当なアッセイ
ハ、本明細書および下記の文献に記載されている：
【０１３５】 Shibata, H., et al.(Recent Prog.Horm.Res.52:141-164(1997) ）；Tagami,
T., et al.(Mol.Cell.Biol.17(5):2642-2648(1997));Zhu, XG., et al.(J.Biol.
Chem.272(14):9048-9054(1997));Lin, B.C., et al.(Mol.Cell.Biol.17(10):613
1-6138(1997));Kakizawa,T., et al.(J.Biol.Chem.272(38):23799-23804(1997))
; およびChang, K.H., et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA94(17):9040-9045(1995)
) 。
【０１３６】 典型的には、このような拡張された化学的部分は、リガンド上の分子認識ドメ
インを過ぎてかつそれから離れる方向に、通常リガンドの埋もれた結合キャビテ
ィを過ぎて、活性化ドメインの方向に拡張し、これはしばしば紙上で、あるいは
より好都合にはコンピュータースクリーン上で、二次元で図面に示されている三
次元のモデルにおいて見られるようならせんである。
【０１３７】リガンド誘導コンフォメーション変化 血漿タンパク質は、コンフォメーション変化を行わないで、モノマーまたはド
メインの間で形成された静的結合ポケットを通してホルモンに結合する。例えば
、四量体の甲状腺結合血漿タンパク質のトラスチレチンは、オリゴマー界面にお
いて溶媒アクセス可能なホルモン結合チャンネルを形成する。このタンパク質の
構造は、結合したリガンドをもつ埋もれた結合キャビティの出現に関して、ホル
モンに結合するとき非変化である。
【０１３８】 しかしながら、核レセプターLBD 、例えば、TR−α LBDに結合したリガンドに
ついての構造的役割により、レセプターが結合および非結合の状態において異な
るであろうことが予測される。ホルモンの非存在下に、レセプターはそのコアに
キャビティを有し、球状タンパク質はこの特色を示さない。リガンド（例えば、
ホルモン）は、核レセプターに結合した後、活性レセプターの疎水性コアを完結
する。レセプターによるリガンドの結合は動力学的プロセスであり、これはコン
フォメーションの変更を誘導することによってレセプターの機能を調節する。
【０１３９】 ホルモン誘導コンフォメーション変化を正確に説明するには、リガンデッドTR
およびアンリガンデッドTRの構造を比較することが必要である。ラットTR−α
LBD およびヒトRXR α LBDは同様な折りたたみを採用し、そして構造的類似性は
リガンド結合後のコンフォメーション変化に拡張されるようである。 ２つの構造の間に３つの主要な差が存在し、これらは事実リガンドの結合の結
果であるように思われる。第１に、結合したラットTR−α LBD 構造はいっそう
コンパクトであり、ホルモンはレセプターの疎水性コア内に緊密に充填されてい
る。
【０１４０】 対照的に、アンリガンデッドヒトRXR α LBDはいくつかの疎水性キャビティを
含有する。このようなキャビティの存在は折りたたまれたタンパク質において異
常であり、そしてレセプターのアンリガンデッド状態の反映であるようである。
これらのキャビティのうちの２つは9-シスレチノイン酸について可能な結合部位
として提案されたが、これらの多重部位はリガンデッドラットTR−α LBD にお
いて観測された、単一の埋もれた結合キャビティと部分的にのみオーバーラップ
する。
【０１４１】 第２の差は、ホルモン結合キャビティの一部分に寄与する、ラットTR−α LBD
におけるH11 を包含する。H11 はラットTR−α LBD中で連続的であり、RXR 中の
Cys432において破壊し、hRXRα中でH10 とH11 との間でループを形成する。この
残基はTR中のHis381に対応し、これはリガンドの外側リングのヒドロキシルに対
する水素結合を提供する。さらに、ラットTR−α LBDにおいてリガンドにより占
有されるホルモン結合キャビティはhRXRαにおいて同一ループにより中断されて
おり、H6およびH7をもつRXR において分離された疎水性ポケットを形成する。結
合したラットTR−α LBDにおいて、対応するらせんH7およびH8は結合ポケットに
隣接し、そしてホルモン結合キャビティを下から取り囲む。
【０１４２】 ２つのレセプターの第３の差は、Ｃ末端の活性化ドメインの位置である。Ｃ末
端の活性化ドメインは双方のレセプターにおいてα−らせんを形成するが、ラッ
トTR−α LBD中のドメインはプロリンに富んだ回転に続き、そしてレセプターに
対して横たわって結合活性の一部分に寄与する。対照的に、アンリガンデッドhR
XRα中の活性化ドメインは、溶媒の中に突起する、より大きいらせんの一部分で
ある。
【０１４３】 これらの差はリガンドの非存在下に組立てられたTR LBDの別のコンフォメーシ
ョンのモデルに導く。アンリガンデッドTRにおいて、ホルモン結合キャビティを
取り囲むレセプターのサブドメインはゆるく充填されており、結合キャビティは
部分的に組織化されていないH11 により占有されていて、レセプターの部分的コ
アを提供する。 ホルモンに結合すると、非結合レセプター中でコイルを形成する残基はリガン
ドとかみ合い、H11 を続ける。H11 の規則性は疎水性キャビティをアンブロック
し、H7およびH8をホルモンと相互作用させる。拡張した疎水性キャビティは次い
でホルモンの回りでつぶれ、コンパクトな結合した構造を発生させる。
【０１４４】 リガンドが結合するとき再充填するアンリガンデッドTR中の拡張した構造に一
部分頼る、Ｃ末端の活性化ドメインにおけるリガンド誘導コンフォメーション変
化を予測することが可能である。回転中のラットTR−αのアミノ酸配列（393-PT
ELFPP-399)はラットTR−αのペプチド鎖がα−らせんを形成する傾向を有意に減
少し、したがって再充填を小さい体積変化で達成することができるので、リガン
ド誘導コンフォメーション変化は微妙であることができる。
【０１４５】 リガンド誘導コンフォメーション変化が起こった後、結合した構造中のＣ末端
の活性化ドメインのコンフォメーションは、非結合の形態のレセプターに比較し
て、充填を変化させるようである。リガンドの結合は活性化ドメインの安定性を
改良する。LBD 全体についての充填の相互作用の分布により測定して、活性化ド
メインは結合した構造においてさえゆるく充填する。活性化ドメインについての
充填密度は、4.5 Å内の原子の数として規定して、平均よりも1.5 標準偏差だけ
低い。
【０１４６】 比較のため、他の表面のらせんH1は平均よりも0.5 標準偏差だけ低く、そして
構造の最も低度に充填された部分は平均よりも2.0 標準偏差だけ低い。そのうえ
、結合したレセプター中のＣ末端のドメインについての充填接触の大部分は、リ
ガンドと相互作用する残基、例えば、His381によるか、あるいはリガンドそれ自
体により提供される。これらの残基のコンフォメーションは結合したレセプター
および非結合のレセプターにおいて、そしてこれらの相互作用に頼るＣ末端の活
性化ドメインのコンフォメーションにより、異なることを期待することができる
。結合したリガンドにより安定性されない場合、Ｃ末端の活性化ドメインはホル
モンの結合の前に無秩序であるようである。
【０１４７】 リガンド誘導コンフォメーション変化の相関は、本明細書において記載するよ
うに明らかである。例えば、H11 からのHis381およびH12 からのPhe405は結合し
た構造において相互作用して、フェノールヒドロキシルに対する特異的水素結合
を提供する。H11 およびH12 に影響を与えるリガンド誘導変化は増強され、そし
てコンパクトな、結合状態の形成に導く。 TR−αおよびTR−β LBDの構造を比較すると、リガンドTriac と複合化したと
き、らせんの同様な充填が示される。
【０１４８】三次元のモデルおよびリガンドのエクステンションを使用するコンピューター的 方法 リガンデッドTRレセプターの三次元構造は先例がなく、そして新規な核レセプ
ターの合成リガンド、例えば、甲状腺レセプターのアンタゴニストおよび改良さ
れたアゴニスト、特に２つのTRイソ型（αまたはβ）の１つに選択的に結合する
ものの開発を大きく促進するであろう。さらに、このレセプターのスーパーファ
ミリーは、三次元構造の解明および化学の組合わせ、例えば、EP335,628 号、米
国特許第5,463,564 号（これらは引用することによって本明細書の一部とされる
）に開示されているものを包含する現代的方法に全体的によく適合する。
【０１４９】 レセプターの溶解性のために、Ｘ線結晶学を使用する構造の決定が可能である
。本発明を実施するとき結晶学を使用するコンピュータープログラムは、これら
のレセプターに対するリガンドの合理的設計を可能とするであろう。プログラム
、例えば、RASMOLは、本発明の実施により発生させた細胞からの原子配位ととも
に使用することができるか、あるいは三次元構造を発生させおよび／またはリガ
ンドの結合に関係する構造を決定することによって本発明を実施するために使用
することができる。
【０１５０】 コンピュータープログラム、例えば、INSIGHT およびGRASP はそれ以上の操作
を可能としかつ新規な構造の導入を可能とする。さらに、精製された組換えタン
パク質および本明細書に記載しかつこの分野において知られている現代的遺伝子
転写アッセイを使用して、CDL の活性を精製するために、高い処理量の結合およ
びバイオアッセイを案出することができる。
【０１５１】 一般に、核レセプターの合成リガンドを設計するコンピューター的方法は２工
程からなる： 1) 結合したリガンドを有する核レセプターのLBD からなる結晶化タンパク質
の三次元のモデルを使用して、核レセプターのLBD のどの１またはそれ以上のア
ミノ酸が、リガンドの第１化学的部分（少なくとも１つ）と相互作用するかを決
定し、そして 2) 相互作用するアミノ酸と第１化学的部分との間の相互作用に比較して、相
互作用するアミノ酸と第２化学的部分との間の相互作用を減少または増加する構
造を有する第２化学的部分を生成する、第１化学的部分の化学的修飾（少なくと
も１つ）を選択する。
【０１５２】 ここにおいて示すように、相互作用するアミノ酸はリガンドとの接触を形成し
、そして相互作用するアミノ酸の原子の中心はリガンドの原子の中心から通常２
〜４オングストロームだけ離れている。一般に、これらの距離はここに記載しか
つMcRee 1993に記載されているように測定されるが、いったん三次元のモデルが
作られたとき、これらの距離はマニュアル的に測定することができる。相互作用
するアミノ酸の例は付録２に記載されている。三次元のモデルの立体化学的図面
については、また、Wagner et al., Nature 378(6558):670-697(1995) 参照。よ
り普通には、リガンドの原子および相互作用するアミノ酸の原子は３〜４オング
ストロームだけ離れている。
【０１５３】 本発明は、工程１および２を反復してLBD へのリガンドの適合を洗練し、かつ
よりすぐれたリガンド、例えば、アゴニストを決定する。図面に示すように、TR
の三次元構造を二次元で表して、どのアミノ酸がリガンドと接触するかを決定し
かつ化学的修飾のためのリガンド上の位置を選択しかつ化学的修飾の前の相互作
用に比較して、特定のアミノ酸との相互作用を変化させるリガンド上の位置を選
択することができる。同一または類似するリガンドと複合化されたLBD イソ型の
構造を比較することによって、化学的修飾によりイソ型特異的リガンドを設計す
るとき利用できる、基準のアミノ酸および調節可能なアミノ酸を同定することが
できる。
【０１５４】 「基準の」は、リガンド結合キャビティの剛性の特徴を形成するアミノ酸を意
味する。「調節可能な」は、リガンド結合キャビティの低い剛性の特徴を形成す
るアミノ酸を意味する。コンピューターを使用して、三次元のモデルの二次元の
表示を使用してマニュアル的に、あるいはリガンドを化学的に合成することによ
って、化学的修飾を実施することができる。付録２および図面を使用して、三次
元のモデルを作ることができる。追加の工程として、この分野において知られて
いるように結晶化タンパク質から核レセプターのLBD の原子配位を使用して、三
次元のモデルを作ることができる、ここにおいて言及したMcRee 1993参照。
【０１５５】 リガンドは、また、化学的修飾により新規なリガンドを作った後、遠いアミノ
酸と相互作用することができる。化学的修飾前に、遠いアミノ酸は一般にリガン
ドと接触していない。化学的修飾はリガンドの構造を変化させて、遠い、通常リ
ガンドから少なくとも4.5 オングストロームだけ離れているアミノ酸と相互作用
する、新規なリガンドを作ることができる。しばしば遠いアミノ酸は、結合キャ
ビティのポケットまたは表面の一部分であるためにはリガンドから遠過ぎるので
、結合キャビティの表面をライニングしないであろう。
【０１５６】 LBD アミノ酸の原子とLBD リガンドの原子とを、事実記載する任意の力または
誘引により、相互作用させることができる。通常、アミノ酸の原子とリガンドの
原子との間の相互作用は、水素結合の相互作用、疎水性相互作用、ファン・デル
・ワールスの相互作用またはダイポール相互作用の結果であろう。疎水性相互作
用の場合において、これはそれ自体アミノ酸とリガンドとの間の相互作用ではな
く、むしろ、一部分、水または疎水性表面からの親水性基の反発の通常の結果で
あることが認識される。LBD とリガンドの相互作用の減少または増強は、この分
野において知られているように、標準的結合手順、結合エネルギーの計算または
試験、コンピューター的に、あるいは熱力学的または動力学的方法により測定す
ることができる。
【０１５７】 化学的修飾は、LBD アミノ酸の原子およびLBD リガンドの原子の相互作用をし
ばしば増強または減少させるであろう。立体障害性は、LBD 結合キャビティと活
性化ドメインとの相互作用を変化させる普通の手段であろう。化学的修飾は好ま
しくはリガンド中のC-H 、C-およびC-OH位に導入され、ここで炭素は、修飾が完
結した後、同一に止まるリガンド構造の部分である。C-H の場合において、Ｃは
1,2 または3-水素を有することができるであろうが、通常ただ１つの水素が複製
されるであろう。ＨまたはOHは、修飾が完結した後、除去され、所望の化学的部
分と置換される。
【０１５８】 甲状腺レセプターはホルモン結合核レセプターのより大きいスーパーファミリ
ーの１メンバーであるので、アゴニストおよびアンタゴニストの開発のためのル
ールはスーパーファミリー全体に対するリガンドを設計するとき有用であるとし
て、当業者は認識するであろう。エストロゲンおよびアンドロゲンのレセプター
の既知のアゴニストおよびアンタゴニストの構造の検査は、第10図に示すように
、アンタゴニストの作用機構の一般性を支持する。
【０１５９】 アンリガンデッドRXR の報告された構造および他のスーパーファミリーのメン
バーのアミノ酸配列の比較をベースとするレセプターの全体のフォルディングは
、スーパーファミリーのレセプターの全体のフォルディングが類似することを明
らかにする。こうして、アゴニストまたはアンタゴニストのリガンドの回りに核
レセプターのフォルディングの一般的パターンが存在することが、構造から予測
される。
【０１６０】 結合したリガンドをもつ核レセプターの三次元構造は下記の明らかでない観測
に導く。すなわち、結合キャビティはアゴニスト、特にアゴニストの分子認識ド
メインを勘合し、そしてアンタゴニストは普通にリガンド、特にアゴニストを越
えて延びる化学的構造を有し、そしてリガンドの回りのフォルディングを禁止し
て、埋もれた結合キャビティまたは同一作用を有する他の基を形成するので、核
レセプターはアゴニストのリガンドの回りでフォルディングする。エクステンシ
ョンの位置は、構造により示されるように、種々の方法でフォルディングに影響
を与えることができるであろう。アンタゴニスト上のこのようなエクステンショ
ンは種々のレセプターについて図10に示されており、そして対応するアゴニスト
と比較されている。
【０１６１】 例えば、カルボキシ末端の活性化らせんに向かうエクステンションは、レセプ
ターの本体の中へのこのらせんの充填／フォルディングに影響を与える。引き続
いて、これは、核レセプターがこの部分が他のタンパク質またはレセプターの他
の部分、例えば、線状レセプターの反対の末端、またはカルボキシ末端のトラン
ス活性化ドメイン（らせん12を包含する）と直接的または間接的に相互作用する
ことができるレセプターのアミノ末端、と相互作用する核レセプターのこの部分
の能力に影響を与える。
【０１６２】 この方向におけるエクステンションは、また、レセプターの本体の中へのTRの
らせん11（または核レセプター中のその類似するらせん）の充填に影響を与え、
そしてレセプターの二量体化およびヘテロダイマー化に選択的に影響を与えるこ
とができる。らせん１に向くエクステンションは、DNA の結合ドメインおよびリ
ガンド結合ドメインをもつレセプターのヒンジ領域の関係に影響を与え、そして
DNA のレセプターの結合および／またはレセプターのこの領域と相互作用するタ
ンパク質とのレセプターの相互作用に選択的に、または付加的に影響を与えるこ
とができる。
【０１６３】 らせん11に向く他のエクステンションを作って、このらせんおよびらせん１お
よび10の充填に影響を与え、これによりホモ二量体化およびヘテロ二量体化に影
響を与えることができる。このような化学的修飾をここに記載するコンピュータ
ー的方法により評価することができる。また、ある場合において、そうでなけれ
ばリガンドの回りに完全にまたは不完全に折りたたまれるレセプターを通してエ
クステンションを突起させることができる。このような突起するエクステンショ
ンは、コアクチベーターまたは他のタンパク質との相互作用に対する立体的遮断
を提示することができる。
【０１６４】 結合キャビティの中に埋もれたリガンドを有する三次元構造は、１またはそれ
以上の構造的因子から構成され、リガンドを収容しかつ取り囲むヒンジおよび蓋
を含有する結合キャビティを有する核レセプターの簡単な記載を直ちに提供する
であろう。TRに対するリガンドは、化学的基の特別のクラスで特別の部位上で修
飾することができる。このような化学的基は、蓋およびヒンジ領域を解放した、
部分的に解放した、または閉じた状態で残して、部分的アゴニストまたはアンタ
ゴニストの機能を達成する働きをするであろう。これらの状態において、TRの生
物学的応答は異なるので、この構造を使用して、所望の作用を有する特定の化合
物を設計することができる。
【０１６５】 TR-T3 複合体の三次元構造の知識は、アゴニストおよびアンタゴニストの設計
のための一般的モデルに導く。構造のデータの重要な新規な特徴は、T3リガンド
がタンパク質の中心の疎水性コア内に完全に埋もれているという事実である。核
レセプターのスーパーファミリーに属する他のリガンド−レセプター複合体は同
様に埋もれたリガンド結合部位を有し、したがってこのモデルはスーパーファミ
リー全体のためのアゴニスト／アンタゴニストの設計に有用であろう。
【０１６６】 アンタゴニストの設計を望むとき、天然のホルモンのアゴニストの重要な結合
の接触を保存すると同時にリガンド−レセプター複合体の通常の操作と相互作用
する「エクステンション基」を組込むか、あるいはレセプターのドメインとのエ
クステンションの相互作用により要求される結合アフィニティーを発生させるこ
とが必要である。
【０１６７】 アンタゴニストの設計に適用しかつここに記載する温和なを「エクステンショ
ンモデル」と呼ぶ。核レセプターのためのアンタゴニスト化合物はレセプターへ
の高いアフィニティーの結合を促進する同一または類似する基を含有し、そして
さらに、このような化合物は大きいおよび／または極性であることができる側鎖
を含有すべきである。この側鎖は実際のエクステンションであり、それに嵩を与
えるか、あるいはそれはアゴニストのリガンドと異なる電荷の機能をもつ側鎖の
基であることができる。
【０１６８】 例えば、21−位におけるＣＨ3 のＣＨ2 ＯＨによる置換、および11−位におけ
るＯＨ基のコルチゾールのケト基への変更はグルココルチコイドのアンタゴニス
ト活性を発生させる（Robsseau, G.G., et al., J.Mol.Biol.67:99-115(1992)）
。しかしながら、ほとんどの場合において、有効アンタゴニストはいっそう嵩高
のエクステンションを有する。こうして、抗グルココルチコイド（およびアンタ
ゴニスト）RU486 は11−位に嵩高の側鎖の基を含有する（Horwitz, K.B., Endoc
rine Rev.13:146-163(1992) ）。
【０１６９】 次いでアンタゴニスト化合物はレセプターの埋もれたリガンド結合部位内に合
理的に高いアフィニティーで結合する（100nM)が、エクステンションの機能はレ
セプター−リガンド複合体が転写因子の機能に要求される必要なコンフォメーシ
ョンを採用するのを防止するであろう。拮抗作用（これはアゴニストまたはアン
タゴニストにおいてであることができる）は、多数の方法で、例えば、HRE にお
けるレセプターのホモ／ヘテロダイマーの形成の防止、レセプターのモノマー、
ホモダイマーまたはホモ／ヘテロダイマーへのコアクチベーターの結合の防止、
またはそうでなければHRE に対するリガンド誘導作用により仲介されるホルモン
応答性遺伝子の転写を防止するこれらの作用の組合わせにより、分子レベルにお
いてそれ自体発現することができる。
【０１７０】 先行技術において核レセプターのためのいくつかのアンタゴニスト化合物が存
在し（また、Horwitz, K.B., Endocrine Rev.13:146-163(1992);Raunnaud J.P.
et al., J.Steroid Biochem.25:811-833(1986);Keiel S. et al., Mol.Cell.Bio
l.14:287-298(1994)これらのアンタゴニストの機能はエクステンションの仮説に
より説明することができる。これらの化合物は第10図にそれらのアゴニストの対
応物と一緒に示されている。これらのアンタゴニストの各々は、アゴニストまた
はアゴニストのアナローグのコア構造に結合された、大きいエクステンション基
を含有する。重要なことには、これらのアンタゴニスト化合物は偶然に発見され
、そして構造−機能の仮説、例えば、エクステンションの原理を使用して設計さ
れなかった。
【０１７１】 エクステンションの原理を使用する甲状腺アンタゴニストを設計する１つの方
法は、教示する例として下記において提供される。先行技術において、特に本明
細書における参考文献において発表された構造−活性のデータと組合わせて、TR
−αDimit 複合体の三次元構造を使用して、高いアフィニティーのリガンドの結
合のために最も重大である、下記のリガンド−レセプターの相互作用を確立する
ことができる。これらの相互作用の物理的描写は第６図に示されている。
【０１７２】 この図面には、リガンドの結合のための分離された必須の接触が記載されてい
る。リガンドはレセプターの中心に埋もれているので、これらの分離された相互
作用の間の構造的間隔もまた重要である。こうして、このシステムの我々の現在
の知識によれば、この例について、レセプターのための新しく設計されたリガン
ドはサイロニンの構造的骨格、または１原子のスペーサーにより結合された２つ
の置換されたアリール基を含有しなくてはならない。
【０１７３】 エクステンションの仮説により設計されたアンタゴニストの一般的構造は、TR
アンタゴニストの置換基の下記の一般的説明において例示される（式Ｉ参照）：
R1はアニオン基、例えば、カルボキシレート、ホスホネート、ホスフェート、サ
ルフェートまたはサルファイトを有することができ、そして０〜３個の原子を有
し、１または２以上のＣ、Ｏ、Ｎ、Ｓ原子からなるリンカー、好ましくは２原子
のリンカーで環に接続されている。このようなR1は必要に応じてアミン（例えば
、-NH2）で置換されることができる。R3およびR5は小さい疎水性基、例えば、-B
r 、-I、または-CH3である。
【０１７４】 R3およびR5は同一の置換基であるか、あるいは異なることができる。R3はR3お
よびR5のそれよりも大きいことができる疎水性基、例えば、-I、-CH3、−イソプ
ロピル、−フェニル、−ベンジル、５および６員のヘテロサイクルであることが
できる。R4' は水素結合にドナーまたはアクセプターとして参加することができ
る基である。このような基は-OH 、-NH2、および-SH を包含する。R5' はこの化
合物をアンタゴニストとする重要なエクステンション基である。
【０１７５】 R5' は長鎖アルキル（例えば、１〜９個の炭素、直鎖状もしくは分枝鎖状）、
アリール（ベンジル、フェニルおよび置換ベンジルおよびフェニル環（例えば、
ハロゲン、アルキル（１および５個の炭素）を有しそして必要に応じて環に-CH2 - により接続されている）、ヘテロサイクル（例えば、５または６個の原子、好
ましくは５個の炭素および１個の窒素、または５個の炭素）であることができ、
これらは必要に応じて極性（例えば、-OH 、-NH2、および-SH)、カチオン（例え
ば、-NH3、N(CH)3) 、またはアニオン（カルボキシレート、ホスホネート、ホス
フェートまたはサルフェート）基を含むことができる。
【０１７６】 R5' はまた極性（例えば、-OH 、-NH2、および-SH)、またはカチオン（例えば
、-NH3、-N(CH3)3）、そしてアニオン（カルボキシレート、ホスホネート、ホス
フェートまたはサルフェート）基であることができる。Ｘは２つの芳香族環を適
当に位置決定するスペーサー基である。この基は通常１原子のスペーサー、例え
ば、Ｏ、Ｓ、SO、SO2 、NH、NZ（ここでＺはアルキルである）、CH2 、CHOH、CO
、C(CH3)OH、およびC(CH3)(CH3）である。ＸはまたNR7 、CHR7、CR7 、R7である
ことができ、ここでR7はアルキル、アリールまたは５または６員の複素環式芳香
族である。R2、R6、R2' およびR6' は-F、および-Cl であることができ、好まし
くはＨである。
【０１７７】 TRリガンドは、また、置換R5' およびR3' 基を有する置換フェニル化３，５ジ
ヨードチロシンとして記載することができる。R5' は長鎖アルキル（例えば、４
〜９個の炭素、直鎖状もしくは分枝鎖状）、アリール（ベンジル、フェニルおよ
び置換ベンジルおよびフェニル環（例えば、ハロゲン、アルキル（１および５個
の炭素）を有しそして必要に応じて環に-CH2- により接続されている）、ヘテロ
サイクル（例えば、５または６個の原子、好ましくは５個の炭素および１個の窒
素、または５個の炭素）であることができ、これらは必要に応じて極性（例えば
、-OH 、-NH2、および-SH)、カチオン（例えば、-NH3、N(CH)3) 、またはアニオ
ン（カルボキシレート、ホスホネート、ホスフェートまたはサルフェート）基を
含むことができる。
【０１７８】 R5' はまた極性（例えば、-OH 、-NH2、および-SH)、またはカチオン（例えば
、-NH3、-N(CH3)3）、そしてアニオン（カルボキシレート、ホスホネート、ホス
フェートまたはサルフェート）基であることができる。R3' は-IsoPr、ハロゲン
、-CH3、アルキル（１〜６個の炭素）またはアリール（ベンジル、フェニルおよ
び置換ベンジルおよびフェニル環（例えば、ハロゲン、アルキル（１および５個
の炭素）を有しそして必要に応じて環に-CH2- により接続されている）、ヘテロ
サイクル（例えば、５または６個の原子、好ましくは５個の炭素および１個の窒
素、または５個の炭素）であることができ、これらは必要に応じて極性（例えば
、-OH 、-NH2、および-SH)、カチオン（例えば、-NH3、N(CH)3）、またはアニオ
ン（カルボキシレート、ホスホネート、ホスフェートまたはサルフェート）基を
含むことができる。
【０１７９】 TRアンタゴニストは、また、修飾されたT3アゴニスト（ビフェニル構造を有す
る）であることができ、ここでR5' はアルキル、アリール、５または６員の複素
環式芳香族、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、アリールアルキル、アルキル、
ポリ芳香族、ポリヘテロ芳香族、極性または帯電した基であり、ここでR5' は極
性または帯電した基で置換されることができる。R5' はここに記載するように定
義される。
【０１８０】 これらの方法を使用すると、この例のリガンドは好ましくは下記の性質を有す
る： 1. 化合物は高いアフィニティー（例えば、100nM)でTRに結合すべきである。 2. 化合物は天然のホルモンと同一の基本的向きでレセプターに結合すべきで
ある。 3. エクステンション基R5' はレセプターの活性化らせん（Ｃ末端のらせん）
に向かって突起すべきである。 4. R5' における適当な置換基は、転写を仲介するために要求されるその最適
な局所的構造から活性化らせんを混乱させるべきである。 アンタゴニストは、また、任意の時間におけるフォルディングの２以上の面を
ブロックするために、複数のエクステンションを使用して設計することができる
。
【０１８１】 リガンドの分子認識ドメイン上の少なくとも１つの化学的部分との少なくとも
１つのアミノ酸の相互作用を増強するように、TRリガンド（例えば、超アゴニス
ト）を設計することができる。１つの方法は、T3のカルボキシレート（R1位置）
をホスホネート、ホスフェート、サルフェートまたはサルファイトで置換するこ
とによって、電荷および極性相互作用を増強することである。これはArg262、Ar
g266およびArg228との相互作用を増強する。また、Dimit が結合しているとき、
R1基の大きさを増加して、水が占有する空間を充填することによって、リガンド
の分子認識ドメイン上の少なくとも１つの化学的部分との少なくとも１つのアミ
ノ酸の相互作用を増強することができる。好ましくは、この基は相補的電荷およ
び結合キャビティに対する疎水性を有する。
【０１８２】 リガンドの分子認識ドメイン上の少なくとも１つの化学的部分との少なくとも
１つのアミノ酸の相互作用を増強する他の方法は、溶液中のサイロニンリガンド
の２つのフェニル環の間の二面角のコンフォメーションを制限することである。
溶液中において、２つのフェニル環の平面は直交し、ここで二面角は90°である
。TR Dimit構造において、二面角は60°に近い。２つのフェニル環の間の角度を
固定するTRリガンドの設計は、より堅固な結合に導くであろう。サイロニンまた
は置換サイロニン様ビフェニルのR6' およびR5の位置を接続することによって、
このようなリガンドを作ることができる。
【０１８３】 環状接続の大きさは２つのフェニル環の間の角度を固定することができる。式
Ｉに対して特に言及すると、下記の環の修飾が好ましい：1) R5 をR6' に接続す
る、2) R3 をR2' に接続するか、あるいは3) R5 をR6' に接続しかつR3をR2' に
接続する。１〜６個の原子、好ましくは２〜４個の炭素原子または他の原子を有
するアルキルまたはヘテロアルキルにより、接続を作ることができる。ヘテロア
ルキルの任意の位置は、Ｎ、Ｏ、ＰまたはＳであることができる。
【０１８４】 前記ヘテロアルキル鎖に沿ったＳおよびＰヘテロ原子は、任意のそれらの酸化
的状態にある。アルキルまたはヘテロアルキル鎖に沿ったＮヘテロ原子または任
意の炭素は１またはそれ以上のＺ置換基を有することができ、ここでＺはアルキ
ル、ヘテロアルキル、アリール、ヘテロアリール、５または６員の複素環式芳香
族である。式Ｉはこの出願の優先権主張日以前の先行技術の化合物を包含しない
という但し書きで、これらの化合物は特許請求することができる。
【０１８５】 また、架橋する酸素の領域における（例えば、T3、Triac またはDimit におけ
る）TRリガンドとLBD との間の未充填空間を充填する化学的修飾を選択すること
によって、リガンドの分子認識ドメイン上の少なくとも１つの化学的部分との少
なくとも１つのアミノ酸の相互作用を増強することができる。こうして、エーテ
ル酸素を置換する、わずかにより大きい部分は結合を増強することができる。こ
のようなリンカーはモノ−またはジェム−二置換炭素基であることができる。酸
素とほぼ同一であるが、より大きい疎水性を有する基、ならびに二置換炭素につ
いて、小さい疎水性の基は好ましい。
【０１８６】 また、TR特異的選択性を増加するようにTR LBDイソ型の間に保存されたTR LBD
のコンフォメーション的に拘束された構造的特徴と相互作用するように、TR活性
をモジュレートする式Ｉの化合物またはその誘導体を設計し、選択することがで
きる。式Ｉのビフェニルスカホールド（φ-X- φ）または単一のフェニルスカホ
ールド（φ-XまたはX-φ）からなる化合物の保存された構造的特徴と相互作用す
る、TR LBDイソ型の等しい位置の中に見出される残基を、TR LBDの保存された構
造的特徴は含む。TR LBDのコンフォメーション的に拘束された構造的特徴は、種
々の幾何学的および物理的−化学的拘束、例えば、局所的バックボーン、局所的
側鎖、およびトポロジー的拘束により固定された、それらの天然の柔軟なコンフ
ォメーションを有する残基を有する。
【０１８７】 レセプター−リガンドの認識および結合に関係する原子の位置決定を制限する
ために、これらの型の拘束を利用する。例えば、サイロニンおよびサイロニン様
リガンドに結合したTR LBDイソ型の原子モデルを比較すると、リガンドと接触す
るある種の残基は特定のトポロジー的形状および結合の回りの回転角に制限され
ることが明らかになる。これらはMet259、Leu276、Leu292、His381、Gly290、Il
e221、およびPhe401を包含する。TR−βにおける対応する位置は、それぞれ、Me
t313、Leu330、Leu346、His435、Gly344、Ile275およびPhe455を包含する。
【０１８８】 双方のレセプターのコンフォメーション的に拘束された特徴により付与される
選択性は特に重要である。例えば、結合の特異性をさらに増加すると同時に他の
レセプターとの交差相互作用の可能性を減少させるために、拘束された環炭素お
よびTR LBDと相互作用する置換基を含む式Ｉの化合物を利用することができる。
これらはTR LBDの拘束された残基と、式Ｉに関する化合物の下記の構成成分の原
子基との間の疎水性および／または親水性接触を包含する：(i）ビフェニル環；
(ii)R3置換基；(iii)R3'置換基；および(iv)R4' 置換基。
【０１８９】 例えば、R1、R2、R3、R5およびR6置換基を含むフェニル部分、すなわち、極性
ポケットに近接する環（「内側環」）への接触は、TR LBDの疎水性残基の原子、
例えば、TR−αのMet259の炭素および酸素原子およびLeu276、またはTR−βのMe
t313およびLeu330の炭素原子と相互作用する環炭素原子を包含し、ここで環原子
は疎水性基の原子から約3.0 〜4.0 Åに存在する。例えば、T3と複合化したTR−
αおよびGC-1と複合化したTR−βを比較すると、下記の保存された内側環の接触
が明らかになる：
【０１９０】
【表１】
【０１９１】 R2' 、R3' 、R4' 、R5' およびR6' 置換基を含むフェニル部分、すなわち、極
性ポケットに対して遠位の環（「外側環」）への接触は、TR LBDの疎水性残基の
原子、例えば、TR−αのLeu292、またはTR−βのLeu346の炭素原子と相互作用す
る環炭素原子を包含し、ここで環原子は疎水性基の原子から約3.0 〜4.0 Åに存
在する。例えば、T3と複合化したTR−αおよびGC-1と複合化したTR−βを比較す
ると、下記の保存された外側環の接触が明らかになる：
【０１９２】
【表２】
【０１９３】 R3置換基への接触は、TR LBDの疎水性残基、例えば、TR−αのIle221、または
TR−βのIle275、の炭素原子と相互作用する原子を包含し、ここでR3置換基の原
子は疎水性残基の炭素原子から約3.0 〜4.0 Åに存在する。例えば、T3と複合化
したTR−αおよびGC-1と複合化したTR−βを比較すると、下記の保存されたR3置
換基の接触が明らかになる：
【０１９４】
【表３】
【０１９５】 R3' 置換基への接触は、TR LBDの疎水性または親水性の残基の原子、例えば、
TR−αのGly290、またはTR−βのGly344の酸素原子と相互作用する原子を包含し
、ここでR3' 置換基の原子は疎水性または親水性の残基の原子から約3.0 〜4.0
Åに存在する。例えば、T3と複合化したTR−αおよびGC-1と複合化したTR−βを
比較すると、下記の保存されたR3' 置換基、フェノールのヒドロキシルの接触が
明らかになる：
【０１９６】
【表４】
【０１９７】 フェノールのヒドロキシルを含むR4' 置換基への接触は、TR LBDの疎水性また
は親水性の残基、例えば、TR−αのHis381、またはTR−βのHis435の炭素および
窒素原子と相互作用する炭素および酸素原子を包含し、ここでR4' 置換基の原子
は疎水性または親水性の残基の原子から約2.0 〜4.0 Åに存在する。例えば、T3
と複合化したTR−αおよびGC-1と複合化したTR−βを比較すると、下記の保存さ
れたR4' 置換基、フェノールのヒドロキシルの接触が明らかになる：
【０１９８】
【表５】
【０１９９】 R4' 置換基への接触は、また、アゴニストの活性、すなわち、リガンドの結合
後のTR LBDのらせん-12(H12)の適切な提示を定めるために、TR LBDの疎水性残基
、例えば、TR−αのPhe401、またはTR−βのPhe455、の炭素原子を包含すること
ができる。R4' 置換基の原子は疎水性基の炭素原子から約3.0 〜4.0 Åに存在す
る。例えば、T3と複合化したTR−αおよびGC-1と複合化したTR−βを比較すると
、下記の保存されたR4' 置換基、フェノールのヒドロキシルの接触が明らかにな
る：
【０２００】
【表６】
【０２０１】 したがって、同一および／または異なるリガンドと複合化したTR LBDイソ型の
原子モデルを比較すると、TR LBDの中に特異的にかつ優先的に適合する新規な化
合物の同定が促進される。モデリング、TR−リガンドのオーバーレイの比較、お
よびTR LBDイソ型の比較により、また、TR LBD／リガンドの接触のコンフォメー
ション的に拘束された構造的特徴の同定が可能となる。したがって、このような
方法により同定されたTR LBD−リガンドの相互作用のコンフォメーション的拘束
を利用すると、核レセプターの特定の型、例えば、TRに結合する特異性が増加し
た新規な化合物の設計および同定が改良される。
【０２０２】甲状腺ホルモンレセプターに対するTR−αおよびTR−βの選択性 ここに記載する方法を使用して、ベータTRよりもアルファに選択的に結合する
か、あるいはその逆であるリガンドを設計することができる。ラットTR−α LBD
のＸ線結晶学の構造は、このようなリガンドの設計の洞察を提供する。
【０２０３】 リガンド結合キャビティにおけるTR−αとTR−βとの間の主要な差はラットTR
−αにおけるアミノ酸Ser277（側面の基-CH2OHをもつ）にあり、そして対応する
残基はヒトTR−βにおいて331 、アスパラギン（側面の基-CH2CONH2 をもつ）で
あることが、三次元構造から明らかになる。ヒトTR−βにおける側鎖はより大き
く、帯電しており、そしてこの差を判別する化合物の合成を可能とする、異なる
水素結合のポテンシャルを有する。Ser277（TR−βにおいてAsn331）はTR LBDの
極性ポケットの一部分を形成し、TR−α／TR−βの判別のために、この差を利用
する式ＩのR1置換基の化学的修飾を含有するように、リガンドを設計することが
できる。
【０２０４】 例えば、TR−αとTriac との複合体において、Ser277はリガンドの結合に参加
しない。Ser277（ベータにおいてAsn331）の役割の非存在は、アルファおよびベ
ータのイソ型についてTriac の等しいアフィニティーと一致し、そしてアルファ
／ベータの選択性がアミノ酸置換Ser277→Asn331およびArg228との相互作用にあ
るという主張を間接的に支持する。GC-1またはTriac と複合化したTR−β LBDの
構造中のAsn331およびArg282の相互作用をTR−α LBD中のSer277およびArg228の
相互作用と比較するとき、アミノ酸置換の効果はさらに明らかである。
【０２０５】 GC-1との複合体において、Asn331はArg282に対する水素結合を形成し、引き続
いてArg282はGC-1のカルボキシレートと水素結合を形成し、これはT3またはTria
c と複合化したTR−α LBDの複合体におけるSer277およびArg228の相互作用に類
似するパターンである。しかしながら、Triac とのTR−βの複合体において、H3
の残基Thr287およびAsp291に対して水素結合を形成する代わりに、Arg282はAsn3
31およびリガンドから離れる方向に回転する。したがって、リガンドのR1置換基
の特質に依存して、極性ポケットのコンフォメーションにおいて２つのイソ型の
間に差が存在し、ある種の置換基が所定のイソ型のコンフォメーションと優先的
に相互作用することができることが示される。
【０２０６】 TR−α／TR−β LBDに結合した種々のリガンドのオーバーレイを比較すると、
リガンドの位置決定が非常に類似することが示される。驚くべきことには、同一
であるか、あるいは異なるリガンドが結合したTR−αおよびTR−β LBDについて
体積および面積を比較すると、TR−β LBDによるリガンドの結合を収容するため
に利用可能な立方体の空間または体積（645 ±28.28 Å3)はTR−α LBDのそれ（
596.25±7.97Å3)より大きくかついっそう柔軟性であることが予期せざることに
は示される（表1)。TR−αについてのリガンド結合キャビティの体積は約8+の狭
い範囲にわたって変化し、最大の差は約16+ である。
【０２０７】 対照的に、TR−βについてのリガンド結合キャビティの体積はGC-1およびTria
c との複合体の間でほぼ40+ だけ異なる。また、TR−αおよびTR−βに結合した
同一リガンドを比較するとき、リガンド結合キャビティの体積において差が存在
する。例えば、Triac と複合化したTR−αおよびTR−βはLBD の体積が約36Å3 だけ異なる。それぞれ、Dimit およびCG-1（これらのリガンドは同様な体積／面
積および重ね合わせた構築を有する）に結合したTR−αおよびTR−βを比較する
と、LBD 体積の差が約75Å3 であることが示される。これらの差は、側鎖の基お
よび極性ポケットに近接して位置するビフェニルスカホールド（φ-X- φ）のフ
ェニル部分（φ）のリガンドの置換基、例えば、式Ｉ中のR1置換基の可変の運動
および相互作用に主として帰属される。
【０２０８】 対照的に、TR−αおよびTR−β LBDの双方についての疎水性ポケットにおける
有効体積は実質的に同一である。例えば、TR−β LBDへのTriac の結合は、Arg2
82の側鎖を変位させ、極性ポケットのキャビティにおいてほぼ60Å3 を提供し、
極性ポケットを大量の溶媒の交換に暴露させる。TR−β LBDに結合したGC-1につ
いて、ほぼ14Å3 はMet310の側鎖の運動のためであり、そしてほぼ44Å3 はArg3
20の側鎖の運動のためであり、それらの組合わせはTR−β LBDにおける極性ポケ
ットの大きさを増加させる。この余分のしなやかさは、また、Triac またはGC-1
に結合したTR−β LBDの極性ポケット中の規則的水の非存在を説明することがで
き、これはDimit 、IpBr2 またはT3に結合したTR−α LBDの極性ポケットの中に
見出される規則的水と対照的である。
【０２０９】
【表７】
【０２１０】 TR−α中の残基Ser277およびTR−βの対応する残基Asn331は、また２つのTRイ
ソ型の極性ポケットにおいて観測される体積の差に寄与する。そしてhTR-βのAs
n331のセリンによる置換はTR−βのリガンドの結合アフィニティーを修飾すると
いう効果を有するので、それはTR−αのそれに類似する（実施例５参照）。総合
すると、これらのTR LBDおよびTR−α LBDのいっそう制限された極性ポケット中
の等しいバックボーンの位置から延びる、TR−α中のSer277およびTR−β中のAs
n331の側鎖の基の原子の水素結合における差は、TR−αまたはTR−βのLBD の極
性ポケットの中に特別にかつ優先的に適合する置換基を有するTR LBDイソ型特異
的リガンドを設計するとう概念をさらに支持する。この差を利用すると、イソ型
特異的TRアゴニストおよびアンタゴニストのコンピューター的設計のための追加
の手段が得られる。
【０２１１】 リガンドの設計に関して、これらの差は、β−選択的リガンドについて、下記
の差のいくつかまたはすべてを利用すべきことを意味する。 1. より大きい側鎖のアスパラギンの存在。 2. 強い水素結合のアクセプターを提供する側鎖上のカルボニル基の能力。 3. ２つの水素結合のドナーを提供する側鎖上のアミド基の能力。 4. T3ポケット中の捕捉された水を認識する極性の調節。 5. 極性ポケットのより大きい大きさおよび柔軟性。 薬剤の設計に関して、これらの差は、α−選択的リガンドについて、下記の差
のいくつかまたはすべてを利用すべきことを意味する。
【０２１２】 1. より小さい側鎖基の存在。 2. 弱い水素ドナーを提供する-CH2OHの側鎖基のカルボニル基上のヒドロキシ
ルの能力。 3. T3ポケット中の捕捉された水を認識する極性の調節。 4. 極性ポケットのより小さい大きさおよび制限された柔軟性。
【０２１３】 双方の場合において、これらの差は多数の方法で利用することができる。例え
ば、それらをまたソフトウェアとともに使用して、新規な有機分子、例えば、LU
DI（Biosym-MSIから）を構築することができる。TR−β選択的リガンドを設計す
る１例は、LBD の極性ポケット中の基のフォーマル正電荷および／または正ダイ
ポール電荷と相互作用するフォーマル負電荷および／または負ダイポール電荷を
有する１またはそれ以上のリガンド基の添加により、TR LBDの極性ポケットの中
に位置するリガンド置換基の極性を増加することである。
【０２１４】 これは優先的相互作用、例えば、TR−β中のAsn331により寄与される追加の正
電荷との相互作用を利用する。TR−β選択的リガンドの他の例は、TR−β LBDの
極性ポケットの中に特別に適合する１またはそれ以上の基を含むものである。こ
れはTR LBDイソ型の間の特別のｄｒｃ、例えば、TR−βのより大きくかついっそ
う柔軟性の極性ポケットを利用する。
【０２１５】治療方法 式Ｉの化合物は、医学的治療において有用であり、そして下記の試験において
証明することができる生物学的活性を示すことができる： (i） ミトコンドリアのα−グリセロホスフェートデヒドロゲナーゼ(GPDH:EC
1.1.99.5)の誘導。このアッセイは特に有用である。なぜなら、ある種、例えば
、ラットにおいて、それは応答性組織、例えば、肝臓、腎臓および心臓において
密接に関係する方法において甲状腺ホルモンおよび甲状腺類似物により特異的に
誘導されるからである（Westerfield, W.W., Richert, D.A.およびRuegamer, W.
R., Endocrinology(1965)77:802)。このアッセイは化合物の甲状腺ホルモン様作
用の速度の直接的測定を可能とし、特に心臓に対する直接的甲状腺ホルモン様作
用の測定を可能とする。他の測定は、心拍数および心臓酵素、例えば、Ca++ATP
アーゼ、Na++/K+ ATP アーゼ、ミオシンイソ型および特異的肝臓酵素のようなパ
ラメーターを包含した；
【０２１６】 (ii) 体全体の酸素消費の増加により測定した基本代謝速度の増強（例えば、
Barker et al., Ann.N.Y.Acad.Sci.(1960)86:545-562参照）； (iii）甲状腺類似物を前に投与された動物から分離した心房の拍動速度の刺激
（例えば、Stephan et al., Biochem.Pharmacol.(1992)13:1969-1974;Yokoyama
et al., J.Med.Chem.(1995)38:695-707 参照）； (iv) コレステロールオキシダーゼキットを使用して測定した、総血漿コレス
テロールレベルの変化（例えば、Merck CHODヨウ素比色キット。また、Stephan
et al.(1992)参照）；
【０２１７】 (v） 超遠心により分離されたリポタンパク質画分中のLDL(低密度リポタンパ
ク質）およびHDL(高密度リポタンパク質）コレステロールの測定；およびp(vi）
酵素色試験、例えば、Merck System GPO-PAP法を使用して測定した、総血漿トリ
グリセリドレベルの変化。
【０２１８】 式Ｉの化合物は、これらの試験において、 (a）被験動物の代謝速度を増加させ、そして心臓GPDHレベルを有意に変更しな
い投与量において肝臓のGPDHレベルを上昇させることによって、 (b）血漿コレステロールおよびトリグリセリドのレベル、および心臓GPDHレベ
ルを有意に変更しない投与量においてLDL ／HDL の比を低下することによって、
選択的甲状腺類似活性を示すことが見出された。
【０２１９】 したがって、式Ｉの化合物は、療法において、ある種の組織における甲状腺ホ
ルモンの作用を選択的にまねると同時に心臓に対する直接的甲状腺類似作用をほ
とんど、あるいはまったくもたない化合物により軽減することができる症状の治
療において使用することができる。例えば、心臓GPDHレベルを有意に変更しない
投与量において肝臓のGPDHレベルおよび代謝速度を上昇させる式Ｉの化合物は、
肥満症の治療において適用される。
【０２２０】 式Ｉのアゴニストは、心臓GPDHレベルを有意に変更しない投与量において総血
漿コレステロール、LDL −コレステロール／HDL −コレステロールおよびトリグ
リセリドのレベルの比を低下し、一般的抗高脂血症（抗高リポタンパク質血症）
剤として、すなわち、血漿脂質（コレステロールおよびトリグリセリド）レベル
が増加した患者の治療において適用される。さらに、血漿コレステロールおよび
トリグリセリドに対するこの作用にかんがみて、式Ｉの化合物は、また、特異的
抗高コレステロール症剤および抗高トリグリセリド血症剤として使用するために
適用される。
【０２２１】 血漿脂質レベルが増加した患者は、血漿コレステロールおよび／またはトリグ
リセリド濃度が高い結果、冠状心臓疾患の発生またはアテローム性動脈硬化症の
他の発現の危険にあると考えられる。さらに、LDL −コレステロールはアテロー
ム性動脈硬化症を誘導すると考えられ、かつHDL −コレステロールは血管壁から
肝臓にコレステロールを輸送し、そしてアテローム性動脈硬化症のプラークを蓄
積を防止すると考えられるので、LDL −コレステロール／HDL −コレステロール
の回転を低下させる抗高脂血症剤は抗アテローム性動脈硬化症剤として適用され
る、米国特許第4,826,876 号および米国特許第5,466,861 号（引用することによ
って本明細書の一部とされる）。
【０２２２】 本発明は、また、心臓を除外するある種の組織において選択的甲状腺類似活性
を産生する方法を提供し、この方法は式Ｉの化合物またはその薬学上許容される
塩の前記活性を産生するために有効な量をそれを必要とする動物に投与すること
からなる。 本発明は、また、本発明の化合物またはその薬学上許容される塩を適当に投与
することによって、血漿脂質レベルを低下する方法およびLDL −コレステロール
／HDL −コレステロールのレベルの比を低下する方法を提供する。 さらに、式Ｉの化合物は心臓機能が弱体化した患者における甲状腺ホルモンの
置換において適用することができる。
【０２２３】 治療的使用において、本発明の化合物は通常標準的医薬組成物で投与される。 したがって、本発明は、それ以上の面において、式Ｉの化合物またはその薬学
上許容される塩と、薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物を提供する
。このような組成物は、経口、非経口または経直腸投与に適当な組成物を包含す
る。
【０２２４】医薬組成物 経口的に投与したとき、活性である式Ｉの化合物およびそれらの薬学上許容さ
れる塩は、液体、例えば、シロップ、懸濁液または乳濁液、錠剤、カプセル剤お
よびロゼンジとして処方することができる。 液状組成物は、一般に、１種または２種以上の適当な液状担体、例えば、エタ
ノール、グリセリン、ソルビトール、非水性溶媒、例えば、ポリエチレングリコ
ール、油または水中の化合物または薬学上許容される塩の懸濁液または溶液から
成り、懸濁剤、保存剤、界面活性剤、湿潤剤、香味剤または着色剤を含む。ある
いは、液状処方物は再構成可能な粉末から調製することができる。
【０２２５】 例えば、活性化合物、懸濁剤、スクロースおよび甘味剤を含有する粉末を水で
再構成して懸濁液を形成することができる；そして活性化合物、スクロースおよ
び甘味剤を含有する粉末からシロップを調製することができる。 錠剤の形態の組成物は、固体組成物の製造に日常的に使用されている、任意の
１または２以上の適当な薬学上許容される担体を使用して、製造することができ
る。このような担体の例は、ステアリン酸マグネシウム、澱粉、ラクトース、ス
クロース、微結晶質セルロースおよび結合剤、例えば、ポリビニルピロリドンを
包含する。錠剤は、また、カラーフィルムのコーティングを有することができる
か、あるいは１または２以上の担体の一部分として着色剤を添加することができ
る。さらに、活性化合物は、親水性または疎水性のマトリックスを含む錠剤とし
て、調節放出性投与形態で処方することができる。
【０２２６】 カプセルの形態の組成物は、日常的カプセル化手順、例えば、活性化合物およ
び賦形剤を硬質ゼラチンカプセルの中に組込むことによって、製造することがで
きる。あるいは、活性化合物および高分子量のポリエチレングリコールの半固体
状マトリックスを製造し、硬質ゼラチンカプセルの中に充填するか、あるいはポ
リエチレングリコール中の活性化合物の溶液または食用油、例えば、液状パラフ
ィンまたは精留ヤシ油中の懸濁液を調製し、軟質ゼラチンカプセルの中に充填す
ることができる。非経口的に投与したとき、活性である式Ｉの化合物およびそれ
らの薬学上許容される塩を筋肉内または静脈内投与のために処方することができ
る。
【０２２７】 筋肉内投与のための典型的な組成物は、油、例えば、落花生油またはゴマ油中
の活性成分の懸濁液または溶液から成るであろう。静脈内投与のための典型的な
組成物は、例えば、活性成分、デキストロース、塩化ナトリウム、補助溶媒、例
えば、ポリエチレングリコールおよび、必要に応じて、キレート化剤、例えば、
エチレンジアミン四酢酸および酸化防止剤、例えば、重亜硫酸ナトリウムを含有
する無菌の等張水溶液から成るであろう。あるいは、溶液を凍結乾燥し、次いで
投与直前に適当な溶媒で再構成することができる。
【０２２８】 経直腸投与のとき活性である、式Ｉの化合物およびそれらの薬学上許容される
塩を坐剤として処方することができる。典型的な坐剤処方物は、一般に、活性成
分および結合剤および／または滑剤、例えば、ゼラチンまたはカカオバターまた
は他の低融点の植物または合成のワックスまたは脂肪から成るであろう。 局所的投与のとき活性である、式Ｉの化合物およびそれらの薬学上許容される
塩を経皮組成物として処方することができる。このような組成物は、例えば、裏
装、活性化合物の溜、コントロール膜、ライナーおよび接触接着剤を含む。
【０２２９】 式Ｉの化合物の典型的な１日量は、個々の必要性、治療すべき症状に従い、投
与経路とともに変化する。適当な投与量は一般に0.001 〜10mg/kg 受容体の体重
／日の範囲である。 この一般的投与量の範囲内で、式Ｉの化合物が、心臓に直接的作用をほとんど
、あるいはまったく示さないで、血漿コレステロールレベルを低下しかつ代謝速
度を上昇させる投与量を選択することができる。一般に、しかし排除的ではなが
、このような投与量は低い投与量（0.001 〜0.5mg/kg) からより高い投与量（0.
5 〜10mg/kg)の範囲であろう。
【０２３０】 さらに、一般的投与量の範囲内で、式Ｉの化合物が、代謝速度を上昇させない
で、血漿コレステロールレベルを低下しかつ心臓に直接的作用をほとんど、ある
いはまったくもたない、投与量を選択することができる。一般に、しかし排除的
ではなが、このような投与量は0.001 〜0.5mg/kgの範囲であろう。 前述の２つの細分範囲は相互に排除的ではなく、そして特定の投与量において
直面する特定の活性は使用する式Ｉの化合物の特質に依存するであろうことを理
解すべきである。
【０２３１】 好ましくは、式Ｉの化合物は、患者が単一投与量で自己投与できるように、単
位投与形態、例えば、錠剤またはカプセル剤の形態である。一般に、単位投与量
は0.05〜100mg の範囲の式Ｉの化合物を含有する。好ましい単位投与量は0.05〜
10mgの範囲の式Ｉの化合物を含有する。 活性成分は１〜６回／日で投与することができる。こうして、１日量は一般に
0.05〜600mg ／日の範囲である。好ましくは、１日量は0.05〜１0mg ／日の範囲
である。最も好ましくは、１日量は0.05〜5mg ／日である。
【０２３２】 実施例 実施例１−TRリガンドの合 多数のTRリガンドはこの分野において知られており、T4（サイロキシン）、T3
、T2およびTS-9を包含する。下記の文献を参照のこと：Jorgensen 、Thyroid Ho
rmones and Analogs、in Hormonal Proteins and Peptides 、Thyroid Hormones
107-204(Choh Hao Li編、1987）、引用することによって本明細書の一部とされ
る。 いくつかのTRリガンドの合成を後述する。
【０２３３】TS１、TS２、TS３、TS４、TS５の合成 TS１、TS２、TS３、TS４およびTS５およびそれらのアナローグのすべては、任
意のサイロニン、例えば、T3（3,5,3'−トリヨードサイロニン）、T4（サイロキ
シン）および3,5-ジヨードサイロニンの窒素原子の簡単なアシル化により製造す
ることができる。TS１およびTS２は、T3を、それぞれ、Ph2CHCO2NHS(N-ヒドロキ
シスクシンイミド-2,2−ジフェニルアセテート）およびC16H33CO2NHSと反応させ
ることによって合成される。TS３はT3をFMOC-Cl(フルオレニルメチルオキシカル
ボニルクロライド）と反応させることによって合成される。
【０２３４】 TS４はT3をtBOC2O(tBOC 無水物またはジ-t−ブチルジカーボネート）と反応さ
せることによって合成される。TS５は、R3' 位に-Iの代わりに-Hを有することに
よってTS１〜TS４と異なり、3,5-ジヨードサイロニンをtBOC2Oと反応させること
によって合成される。TS１、TS２、TS３、TS４およびTS５についての一般的反応
のスキームは第11図に描写されている。反応のスキームにおいて、TS５およびそ
の前駆体の双方はR3' 位にヨウ素の代わりに水素を有することに注意すべきであ
る。
【０２３５】TS６およびTS７の合成 TS６はTS５をパラニトロフェニルイソシアネートと反応させることによって合
成される。TS７はTS６をTFA （トリフルオロ酢酸）（これはtBOC基を切り放す）
と反応させることによって合成される。これらの反応は、当業者が実施すること
ができる、簡単な有機合成反応である。TS６およびTS７の合成スキームは第12図
においてダイアグラムで示されている。
【０２３６】TS８の合成 TS８はTS５をPh2CHNH2（ジフェニルメチルアミン）とトリエチルアミンおよび
任意のアミド形成縮合剤、例えば、TBTU（ヒドロキシベンズトリアゾールウロニ
ウムテトラフルオロボレート）またはHBTU（ヒドロキシベンズトリアゾールウロ
ニウムヘキサフルオロホスフェート）の存在において反応させることによって合
成される。TS８の合成スキームは第13図においてダイアグラムで示されている。
【０２３７】3,5-ジヨード-3'-イソプロピルサイロニン誘導体の合成 １クラスのアンタゴニストを設計するために、3'位における疎水性基ならびに
5'位におけるエクステンションを有することが重要である。3'位における疎水性
基は、メチル、ベンジル、フェニル、ヨード、およびヘテロサイクル構造を包含
する。3,5-ジヨード-3'-イソプロピル-5'-置換サイロニンの合成を後述する。
【０２３８】 提供される実施例には、TS10化合物を合成する特定の工程が記載されているが
、この一般的スキームを使用して多数の5'位にエクステンションを有する3,5-ジ
ヨード-3'-イソプロピル-5'-置換サイロニン誘導体を合成することができる。こ
のクラスの追加の化合物は既知の有機合成技術に従い合成することができる。 TS10の合成は後述され、そして第14図に描写されている。各工程について反応
生成物を示すTS10の反応スキームにおいて使用されている番号は括弧内に存在す
る。
【０２３９】 2-ホルミル-6- イソプロピルアニソール（1): 2-ホルミル-6- イソプロピルア
ニソール(10.0g、61mmol) (Casiraghi, et al., JCS Perkin I, 1862(1980)（引
用することによって本明細書の一部とされる）に記載するように製造された）を
、丸底フラスコ内の50mlのテトラヒドロフランおよび50mlのジメチルホルムアミ
ド中の水素化ナトリウム (3.7g、153mmol)の懸濁液に滴下した。添加により、発
熱反応が起こり、灰色固体が形成する。次いでヨウ化メチル(26.0g、183mmol)を
滴下し、反応混合物を室温において５時間撹拌する。反応混合物を20mlの水で急
冷し、次いで500ml の水中に注ぎ、エーテル(2×300ml)で抽出する。エーテル層
を一緒にし、水（５×1000ml）で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、真空濃
縮すると、10.2g(94％）の標題化合物が得られる、1H NMR(CDCl3）：d 10.30(s
、1H）、7.63(d、1H、J=3Hz)、7.50(d、1H、J=3Hz)、7.13(t、1H、J=3Hz)、3.81
(s、3H）、3.31(heptet 、1H、J=7.5Hz)、1.19(d、6H、J=7.5Hz)。
【０２４０】 2-(2- ヒドロキシノニル）-6- イソプロピルアニソール（スキームの中に示さ れていない） ： 塩化オクチルマグネシウム(8.4ml、16.9mmol、2.0M) を、−78
℃において10mlのテトラヒドロフラン中のＩ（1.5g、8.4mmol)の溶液に滴下する
。反応混合物を室温に加温しながら２時間撹拌する。反応混合物を50mlのエーテ
ルで希釈し、50mlの水中に注ぐ。エーテル層をブライン(1×50ml）で洗浄し、硫
酸ナトリウム上で乾燥し、真空濃縮する。フラッシュクロマトグラフィー（シリ
カゲル、10％エーテル／ヘキサン→15％エーテル／ヘキサン）により、734mg(30
％）の標題化合物が得られる、1H NMR(CDCl3）：d7.33-7.10(m、3H）、5.00(br
、s 、1H）、3.81(s、3H）、3.33(heptet 、1H、J=7Hz)、1.90-1.19 (m、14H)、
0.86(t、3H、J=6.5Hz);HRMS(EI）、実測値：292.2404；計算値：292.2402。
【０２４１】 2-ノニル-6- イソプロピルアニソール(2) ： 化合物２(663mg、2.3mmol)を５
mlのエタノールおよび５mlの酢酸の溶液中に溶解し、スパチュラ先端量の炭素担
持パラジウムを添加する。次いで反応混合物に水素ガスを供給し（簡単なバルー
ンおよび針を使用する）この混合物を室温において一夜撹拌する。次の日に、反
応混合物エーテル（100ml)中に注ぎ、エーテル層を飽和重炭酸ナトリウム溶液(3
×100ml)で抽出する。エーテル層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空濃縮すると
、581mg(91％）の(2）が得られる、1H NMR(CDCl3）：d7.14-7.00(m、3H）、3.75
(s、3H）、3.36 (heptet、1H、J=6.8Hz)、2.63(t、2H、J=7.5Hz)、1.68-1.15 (m
、14H)、0.86(t、3H、J=5.5Hz)；HRMS(EI)、実測質量：276.2459；計算値：276.
2453。
【０２４２】 サイロニン付加物（4)： 発煙硝酸(0.071ml）を-5℃に冷却した0.184ml の無
水酢酸に添加する。ヨウ素（66mg) をこの混合物を添加し、次いでトリフルオロ
酢酸（0.124mol) を添加する。この混合物を室温に加温しながら１時間撹拌し、
その時点ですべてのヨウ素は溶解する。次いで反応混合物を真空濃縮すると、油
状半固体状物質が得られる。残留物を0.7ml の無水酢酸中に溶解し、−20℃に冷
却する。
【０２４３】 1.2ml の無水酢酸および0.58mlのトリフルオロ酢酸中のアニソール（2)(581mg
、2.1mmol)の溶液を滴下する。反応混合物−20℃において１時間撹拌し、次いで
室温に加温しながら一夜撹拌する。反応混合物を水と塩化メチレンとの間で分配
する。塩化メチレン層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空濃縮すると、ヨードニ
ウム塩(3) が油状物として得られる。この物質を精製しないか、あるいは特性決
定し、カップリング反応の中に直接導入する。
【０２４４】 N-トリフルオロアセチル−3,5-ジヨードチロシンメチオニンエステル(552mg、
1.0mmol) (N.Lewis およびP.Wallbank, Synthesis 1103(1987)（引用することに
よって本明細書の一部とされる）の手順に従い製造した）および上からのすべて
の粗製ヨードニウム塩(3) を５mlの無水メタノール中に溶解する。ジアザビシク
ロ[5.4.0] ウンデカン（DBU) (1.83mg、1.2mmol)およびスパチュラ先端量の銅−
ブロンズを添加し、生ずる混合物を室温において一夜撹拌する。次の日に、反応
混合物濾過し、濾液を真空濃縮する。粗製残留物をフラッシュクロマトグラフィ
ー（シリカゲル、10％酢酸エチル／ヘキサン）により精製すると、保護されたサ
イロニン付加物(4) が得られる。
【０２４５】 脱保護されたサイロニン(TS10)： 保護されたサイロニン付加物４（30mg、0.
04mmol) を、2.25mlの酢酸と2.25mlの49％臭化水素酸との混合物中に溶解する。
反応混合物を５時間加熱還流させる。反応混合物を室温に冷却し、溶媒を真空除
去する。水を添加して油状残留物を粉砕すると、灰色固体が得られる。この固体
物質を濾過し、水で洗浄し、真空下にP2O5で乾燥すると、24mg (81％）の標題化
合物、TS10、が得られる、1H NMR(CDCl3）：d7.57 (s、1H）、6.86(s、1H）、6.
45(s、1H）、6.34(s、1H）、4.81(m、1H）、3.86(s、3H）、3.71(s、3H）、3.33
-3.05 (m、3H）、2.58-2.47 (m、2H）、1.62-0.76 (m、23H)、MS(LSIMS): M+ =8
17.0。
【０２４６】 前述したように、この反応スキームを変更して、3,5-ジヨード-3' イソプロピ
ルサイロニン誘導体により特徴づけられるクラスの化合物を合成することができ
、ここで(1)3' イソプロピル基を疎水性基で置換することができ、ここで疎水性
基はメチル、ベンジル、フェニル、ヨード、およびヘテロサイクル構造を包含し
、そして(2) 広範な種類の化学的構造を5'位に組込むことができ、ここで化学的
構造はアルキル基、平坦なアリール、ヘテロサイクル基、または極性および／ま
たは帯電した基を包含する。
【０２４７】 上記反応スキームにおけるアルデヒド(1) は融通性のある合成中間体であり、
これにより種々の化学的部分を最終サイロニン誘導体の5'位に結合することがで
きる。さらに、種々の化学反応を使用して化学的部分を結合することができる。
これらの反応はこの分野においてよく知られており、そしてアルデヒドへの有機
金属の付加（グリニヤール試薬、有機リチウムおよびその他を包含する）、アル
デヒドと第一級または第二級アミンとの還元性アミン化反応、およびリンイリド
または安定化ホスホネートアニオンとのウィッティッヒオレフィン化反応を包含
する。
【０２４８】 他の可能性は、アルデヒドをベンジルアルコールに還元して、5'位におけるエ
ーテル化反応を可能とすることを包含する。前述したように、これらの方法によ
り、広範な種類の化学的構造、例えば、アルキル基、平坦なアリール、ヘテロサ
イクル基、または極性および／または帯電した基を最終サイロニン誘導体の5'位
に組込むすることができる。
【０２４９】3,5-ジブロモ-4-(3,5-ジイソプロピル-4'-ヒドロキシフェノキシ）安息香酸（化 合物11）の合成
【化６】
【０２５０】 (a）2,6-ジイソプロピルフェノール(20g、0.11mmol) 、炭酸カリウム(62g、0.
45mmol) 、アセトン(160ml）およびヨウ化メチル (28ml、0.45mol ）の混合物を
３日間還流させる。反応混合物をセライトを通して濾過し、蒸発させ、エーテル
中に溶解し、1Mの水酸化ナトリウムで２回洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し
、濃縮すると、15.1g(0.008mol、70％）の2,6-ジイソプロピルアニソールがわず
かに黄色の油状物として得られる。
【０２５１】 (b）発煙硝酸 (12.4ml、265mmol ）を、ドライアイス／四塩化炭素浴中で冷却
した31.4mlの酢酸に滴下する。ヨウ素(11.3g、44.4mmol）を一度に添加し、次い
でトリフルオロ酢酸(20.5mlc、266mmol ）を滴下する。ヨウ素が溶解するまで、
反応混合物を室温において撹拌する。窒素を容器の中にフラッシュすることによ
って、窒素酸化物を除去する。反応混合物を濃縮し、残留物を126ml の無水酢酸
中に溶解し、ドライアイス／四塩化炭素浴中で冷却する。
【０２５２】 撹拌した溶液に、150ml の無水酢酸および22.6mlのトリフルオロ酢酸中の2,6-
ジイソプロピルアニソール(51g、266mmol ）を滴下する。反応混合物を室温にお
いて一夜放置し、次いで濃縮する。残留物を150ml のメタノール中に取り、150m
l の水性重炭酸ナトリウム溶液および１リットルの2Mのナトリウムテトラフルオ
ライド溶液で処理する。沈澱が凝集した後、石油エーテルを添加し、上清をデカ
ントする。沈澱を石油エーテルで粉砕し、濾過し、石油エーテルで洗浄し、室温
において真空乾燥する。これにより、34g(57mmol、65％）のビス(3,5−ジイソプ
ロピル-4- メトキシフェニル）ヨードニウムテトラフルオロボレートが白色固体
状物として得られる。
【０２５３】 (c）250ml のメタノール中の3,5-ジブロモ-4- メトキシ安息香酸(12g、40.5mm
ol) の撹拌した溶液に、塩化チオニル（３ml）を滴下する。反応混合物を５日間
還流させ、水を添加し、沈澱した生成物を濾過する。残留物を酢酸エチル中に溶
解する。水相から、メタノールを濃縮により除去する。次いで水相を塩化ナトリ
ウムで飽和させ、酢酸エチルで抽出する。一緒にした有機相を硫酸マグネシウム
上で乾燥し、濾過し、濃縮する。これにより、3,5-ジブロモ-4- メトキシベンゾ
エート12.5g (40.5mmol, 100％）が白色固体状物として得られる。
【０２５４】 (d）工程ｂおよびｃにおいて得られた生成物を下記のプロトコールに従い互い
に反応させる。０℃において７mlのジクロロメタン中のビス(3,5−ジイソプロピ
ル-4- メトキシフェニル）ヨードニウムテトラフルオロボレート(2.86g、4.8mmo
l ）および銅ブロンズ(0.42g、6.4mmol ）に、５mlのジクロロメタン中の3,5-ジ
ブロモ-4- メトキシベンゾエート (1.0g、3.2mmol ）およびトリエチルアミン(0
.36g、3.5mmol ）の溶液を滴下する。反応混合物を暗所で８日間撹拌し、次いで
セライトを通して濾過する。濾液を濃縮し、残留物をカラムクロマトグラフィー
（シリカゲル、97:3石油エーテル／酢酸エチル）により精製すると、0.62g (1.2
mmol、39％）の3,5-ジブロモ-4-(3',5'-ジイソプロピル-4'-メトキシフェノキシ
）メチルベンゾエートが固体として得られる。
【０２５５】 (e）工程ｄからの生成物 (0.2g、0.4mmol ）を２mlのジクロロメタン中に溶解
し、窒素雰囲気下に配置し、−40℃に冷却する。攪拌溶液に1M BBr3 (1.2ml、1.
2mmol ）を滴下する。反応混合物を室温に到達させ、次いで一夜放置する。それ
を０℃に冷却し、次いで水で加水分解する。ジクロロメタンを濃縮により除去し
、水相を酢酸エチルで抽出する。有機相を1Mの塩酸およびブラインで洗浄する。
次いでそれを硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、濃縮する。
【０２５６】 残留物をクロマトグラフィー（シリカゲル、96:3.6:0.4ジクロロメタン／メタ
ノール／酢酸）にかけると、93mg(0.2mmol、51％）の3,5-ジブロモ-4-(3',5'-ジ
イソプロピル-4'-ヒドロキシフェノキシ）安息香酸が白色固体状物として得られ
る。1H NMR(CDCl3）δ1.23(d、12H 、メチル) 、3.11(m、2H、CH) 、6.50(s、2H
、2,6-H)、8.33(s、2H、2',6'-H ）。 付加リガンドの合成は、米国特許出願第08/877,792号（1997年６月18日提出、
これは引用することによって本明細書の一部とされる）に記載されている。
【０２５７】 表２および第15図に、式Ｉに関するいくつかのTRの構造が描写されている。
【表８】
【０２５８】実施例２−TRリガンドのレセプターの結合アッセイ 甲状腺レセプター(TR)に結合する合成されたTRリガンドの能力を試験するため
に、下記の文献に記載されているように、ラット肝臓核および[125I]T3から調製
されたTRを使用して、TRのためのTRリガンドの結合アフィニティーをアッセイす
る：J.D.Apriletti, J.B.Baxter 、およびT.N.Lavin, J.Biol.Chem.263:9409-94
17(1988 ）。Apriletti(1995）およびApriletti(1988）を使用して、見掛けのKd
を計算する。
【０２５９】 見掛けのKdを表３に表す。0.21mlの体積の緩衝液Ｅ（400mM KCl 、200mM リン
酸カリウム、pH8.0 、0.5mM EDTA、1mM MgCl2 、10％グリセロール、1mM DTT ）
中で、アッセイすべき試料、１nMの[125I]T3、および50Tg/ml のコアヒストンの
存在下に、見掛けのKd(App.Kd)を測定する。４℃において一夜インキュベートし
た後、緩衝液Ｅと平衡化したQuick-Step Sepadex G-25 カラム(2.7×0.9cm 、1.
7ml のベッドカラム）上に0.2ml のインキュベーション混合物を負荷する。タン
パク質結合[125I]T3の排除したピークを１mlの緩衝液Ｅで溶離し、試験管の中に
収集し、計数する。非特異的結合を総結合から減ずることによって、特異的T3結
合を計算する。
【０２６０】
【表９】
【０２６１】実施例３−TRリガンドによる核タンパク質の共活性化の増加 核活性化タンパク質RIP-140 （核レセプター、例えば、エストロゲンレセプタ
ーに結合することができる核タンパク質）へのTRの結合を活性化するTRリガンド
の能力を試験するために、下記の文献に記載されているように、TRリガンドをTR
にリガンドし、次いでRIP-140 とインキュベートする：V.Cavailles, et al., E
MBO J.14(15):3741-3751(1995)、これは引用することによって本明細書の一部と
される。このアッセイにおいて、35S-RIP-140 タンパク質はリガンデッドTRに結
合するが、アンリガンデッドTRに結合しない。多数のTR35S リガンドは表３に示
すようにRIP-140 の結合を活性化することができる。
【０２６２】実施例４−培養した細胞中のTRリガンドの結合およびTRの活性化 細胞の環境における転写のTRの活性化を試験するために、それに作用可能に連
鎖したTR DNA結合配列を有する、リポーター遺伝子、クロラムフェニコールトラ
ンスフェラーゼ(「CAT)）を活性化する能力について、TRリガンドをアッセイする
。それぞれ、GCまたはL937細胞（ATCCから入手可能である）を使用することがで
きる。このようなアッセイにおいて、TRリガンドは細胞膜を横切り、TRに結合し
、TRを活性化し、次いでTRはCAT 遺伝子から上流のTR DNA結合領域を結合するこ
とによってCAT の遺伝子の転写を活性化する。本明細書および文献に記載されて
いるように種々の濃度においてCAT 遺伝子の活性化をアッセイすることによって
、半最大遺伝子活性化(EC50)の有効濃度を測定する。CAT 遺伝子の活性化実験の
結果を表３に示す。
【０２６３】CAT 遺伝子の活性化アッセイ ラット下垂体細胞系統、GC細胞（内因性甲状腺ホルモンレセプター（TR）を含
有する）またはU937細胞（この分野において知られているように発現された外因
性TRを含有する）において、甲状腺ホルモン(3,5,3'-トリヨードサイロニン、T3
）およびTRリガンドに対する機能的応答を評価する。10cmの皿において10％の新
生児ウシ血清、２mMのグルタミン、50単位/ml のペニシリンおよび50Tg/ml のス
トレプトマイシンを含むRPMI 1640 中で、GC細胞を成長させる。
【０２６４】 トランスフェクションのために、細胞をトリプシン処理し、緩衝液（PBS 、0.
1 ％のグルコース）中に再懸濁させ、緩衝液 (15±５×106 細胞）中でTREtkCAT
プラスミド(10mg)またはファージと混合し、0.33キロボルトおよび960mF におい
てBio-Rad 遺伝子パルサーを使用して電気泳動させる。CAT(tkCAT)コーディング
配列に連鎖した最小(-32/+45）チミジンキナーゼプロモーターから直ぐ上流のpU
C19 ポリリンカーのHindIII 部位においてクローニングされたT3応答因子(AGGTC
AcaggATGGTCA）の２コピーを、TREtkCATプラスミドは含有する。
【０２６５】 電気泳動後、細胞を成長培地（10％の活性炭処理した、ホルモンを除去した、
新生児ウシ血清を含むRPMI）の中にプールし、６ウェルの皿の中に入れ、エタノ
ールまたはホルモンで処理する。下記の文献に記載されているように、CAT 活性
を24時間後に測定する：D.C.Leitman, R.C.J.Ribeiro, E.R.Mackow, J.D.Baxter
, B.L.West, J.Biol.Chem.266:9343(1991)、これは引用することによって本明細
書の一部とされる。
【０２６６】T3の存在または非存在におけるDR4-ALP リポーター遺伝子の転写調節に対するTS -10 の作用 TRAF細胞の特性： TRAFa1は、ヒト甲状腺ホルモンレセプターα１およびDR4.
ALP リポーターベクターをコードする発現ベクターで安定に形質転換されたCHO
K1細胞である；TRAFb1は、ヒト甲状腺ホルモンレセプターβ１およびDR4-ALP リ
ポーターベクターをコードする発現ベクターで安定に形質転換されたCHO K1細胞
である。
【０２６７】T3の存在または非存在におけるDR4-ALP リポーター遺伝子の転写調節に対する化 合物TS-10 の作用の解釈 TRAFa1リポーター細胞： TS-10 単独（白抜き円）は、天然の甲状腺ホルモン
T3による最大作用のほぼ27％までのALP リポータータンパク質の発現の部分的活
性化を誘導する。T3の存在（充填円）において、TS-10 は弱いアンタゴニスト作
用を有する。それぞれ、TS-10 のアゴニスト作用についてのEC50濃度およびその
T3アンタゴニスト作用についてのEC50濃度を図18に示す。
【０２６８】 図18において、白抜き円および充填円および点線は、毒性マーカー(MTS/PMS）
に対するTS-10 ／T3の投与量依存的作用を示し、ミトコンドリア中のテトラゾリ
ウム塩の減少は右のｙ軸に光学密度として表示されている。MTS/PMS マーカーに
対するTS-10 の明らかな毒性作用は存在しないが、光学顕微鏡下に見ることがで
きるように、それぞれ、T3の非存在および存在下に、TS-10 の最高濃度(32mM)に
おいて、細胞の形態に対して明瞭な作用が存在する（図面において示されていな
い）。
【０２６９】 TRAFb1リポーター細胞： TS-10 単独（白抜き円）は、T3による最大作用のほ
ぼ35％までのALP リポータータンパク質の発現の部分的活性化を誘導する。TS-1
0 のアゴニスト作用についてのEC50濃度を図19に示す。T3の存在（充填円）にお
いて、TS-10 は、示す場合、ALP リポータータンパク質の発現に対するT3の作用
のわずかの増強を示す。使用した最高濃度(32mM)におけるTS-10 のT3阻害作用は
、T3アンタゴニズムよりむしろ毒性作用である。
【０２７０】 図19において、白抜き円および充填円および点線は、毒性マーカー(MTS/PMS）
に対するTS-10 ／T3の投与量依存的作用を示し、ミトコンドリア中のテトラゾリ
ウム塩の減少は右のｙ軸に光学密度として表示されている。MTS/PMS マーカーに
対するTS-10 の明らかな毒性作用は存在しないが、光学顕微鏡下に観察できるよ
うに、それぞれ、T3の非存在および存在下に、TS-10 の最高濃度(32mM)において
、細胞の形態に対して明瞭な作用が存在する（図面において示されていない）。
【０２７１】 HepG2(HAF18)リポーター細胞： TS-10 単独（白抜き円）は、T3による最大作
用のほぼ50％までのALP リポータータンパク質の発現の部分的活性化を誘導する
。TS-10 のアゴニスト作用についてのEC50濃度を図20に示す。T3の存在（充填円
）において、TS-10 は作用を示さない、すなわち、T3アンタゴニズムおよびT3に
対する増強／加法的作用を示さない。白抜き円および充填円および点線は、毒性
マーカー(MTS/PMS）に対するTS-10 ／T3の投与量依存的作用を示し、ミトコンド
リア中のテトラゾリウム塩の減少は右のｙ軸に光学密度として表示されている。
光学顕微鏡下に観察できるように、使用したTS-10 ／T3のいかなる濃度において
も、MTS/PMS マーカーまたは細胞の形態に対するTS-10 の明らかな毒性作用は存
在しない。
【０２７２】実施例５−ヒトTR−αおよびhTR-βの比較 T3およびTriac によるTR LBDへの[125I]T3の結合のための競合 薬剤、Triac は甲状腺ホルモンのアゴニストである。Triac は3,5,3'−トリヨ
ードサイロ酢酸であり、そしてJorgensen, Thyroid Hormones and Analogs in H
ormonal Proteins and Pepitides,Thyroid Hormones at 150-151(1978 ）に記載
されている。Triac の代わりに使用できる他の化合物は、3,5-ジヨード-3'-イソ
プロピルサイロ酢酸である。非標識化T3またはTriac によるヒトTR−α LBDまた
はヒトTR−β LBDとの結合からの[125I]T3の変位を比較するために、競合アッセ
イを実施する。このようなアッセイの結果を図16に示す。 １nMの[125I]T3、30fmolのヒトTR−α（白抜き記号）またはTR−β（黒塗り記
号）、および種々の濃度の競合非標識化T3（円）またはTriac （三角形）を含有
する、標準的反応物を調製する。アッセイを二重反復実験において実施する。
【０２７３】 Triac およびGC-1による変異型TR LBDに結合する[125I]T3についての競合 下記はTRイソ型の間の選択的結合に関係する残基をアッセイする。競合アッセ
イを実施して、野生型ヒトTR−α LBDまたはヒトTR−β LBDとの結合から、TR L
BDの変異型への非標識化T3、Triac またはGC-1による[125I]T3の変位を比較する
。他のTRイソ型の対応する位置の中に見出される酢酸を置換することによって、
変異型TTR-αまたはTR−βを構築する。
【０２７４】 例えば、ヒトTR−β中のアスパラギン331 はヒトTR−α中のセリン277 に対応
する。この位置が寄与する結合特異性を試験するために、セリン残基で置換され
たアスパラギン331 を含有する変異型ヒトTR−βを構築する（Asn331Ser または
N331S と表示する）。結合アッセイはApriletti et al.(Protein Expression an
d Purification 6:363-370(1995)）に記載されている。このようなアッセイは図
27に示されており、そして下記表４において要約されている。
【０２７５】
【表１０】
【０２７６】 T3、Triac またはGC-1への結合についての野生型TR−β／変異型TR−βN331S
を比較する競合曲線が示すように、Triac についての突然変異のレセプターのア
フィニティーは概算的にT3についてのそれに減少する（これに対して野生型にお
いて３倍より大きい）ので、相対アフィニティーは野生型TR−αに類似する。GC
-1に対するアフィニティーは、また、TR−αを使用するとき見られるように、T3 より３倍小さく減少された。
【０２７７】 選択したリガンドについて天然のTRに対するTR−β変異型N331S のアフィニテ
ィーの比較は次の通りである： 種々のリガンド（T3、T4、Triac 、IpBr2 、Dimit 、GC-1）についての天然の
TR−α： IpBr2 ＞Triac ≒T3＞GC-1＞T4＞Dimit 天然のTR−β（T3、T4、Triac 、Dimit 、GC-1） Triac ＞GC-1≧T3＞T4＞Dimit 変異型TR−β（N331S ）（T3、Triac 、GC-1） Triac ≒T3＞GC-1
【０２７８】 TRに結合する[125I]T3のスキャッチャード分析 ヒトTR−α（左のパネル）またはヒトTR−β（右のパネル）を、増加する濃度
の[125I]T3の存在下にT3の結合についてアッセイする。見掛けの平衡解離定数（
Ｉについて20pMおよびβについて67pM）を線形回帰分析により計算し、そして図
17に示す。
【０２７９】3,5-ジブロモ-4-(3',5'-ジイソプロピル-4'-ヒドロキシフェノキシ）安息香酸は TR−α選択的リガンドである。
【化７】
【０２８０】 3,5-ジブロモ-4-(3',5'-ジイソプロピル-4'-ヒドロキシフェノキシ）安息香酸
（化合物11)(その構造は上に描かれている）を、TR、TR−αおよびTR−βの２つ
の異なるイソ型への結合についてアッセイする。化合物11はTR−αへの結合につ
いて1.6TM のIC50およびTR−βへの結合について0.91TMのIC50を示す。TR−αま
たはTR−β LBDに対する選択的結合を測定するアッセイは、ここに記載するよう
に、リポーターアッセイを包含することができる。また、Hollenberg, et al.,
J.Biol.Chem.(1995)270(24):1427-14280。
【０２８１】実施例６−TR−α LBDの製造および精製 ラットTR−α LBD、残基Met122-Val410 、を大腸菌(E.coli)から精製する（「
LBD-122/410」）。ラットTR−α LBDをコードする発現ベクターを新しく大腸菌(E
.coli)BL21(DE3）株の中にトランスフェクトし、そして２×LB培地を使用して50
リットルの発酵槽中で22℃において成長させる。2.5 〜３のA600において、IPTG
を0.5mM に添加し、３時間成長させた後、収集する。細菌のペレットを液体窒素
中で急冷し、プロセシングするまで−70℃において貯蔵する。抽出および精製工
程を４℃において実施する。細菌を抽出緩衝液（20mM Hepes、pH8.- 、1mM EDTA
、0.1 ％ MTG、0.1mM PMSF、および10％グリセロール）中で10mlの緩衝液／ｇの
細菌の比で融解する。
【０２８２】 細菌を0.2mg/mlのリゾチームと15分間インキュベートすることによって溶解し
、最大力で超音波処理すると同時に、溶液が粘度を失うまで、Brinkmann ホモジ
ナイザー（PT10/35 型、ジェネレーターPTA35/2 を有する）で均質化する。10,0
00ｇにおいて10分間遠心した後、上清を0.4M KClに調節し、0.6 ％PEI で処理し
てフラグメント化DNA を沈降させ、10,000ｇにおいて10分間遠心する。次いで上
清中のラットTR−α LBDを50％硫酸アンモニウムで沈降させ、10,000ｇにおいて
10分間遠心する。沈降物を緩衝液B(20mM Hepes、pH8.0 、1mM EDTA、1mM DTT 、
0.1mM PMSF、0.01％Lubrol、および10％グリセロール）で9mS/cm（ほぼ0.7M硫酸
アンモニウム）の最終導電性に再懸濁させ、10,000ｇにおいて１時間遠心する。
上清を液体窒素中で凍結させ、−70℃において貯蔵する。
【０２８３】 粗製抽出物を融解し、トレーサー量の[125I]T3を結合させ、そしてフェニル-T
oyopearl疎水性相互作用カラム(2.6×18cm、95mlのベッド体積）上に1.5ml/分で
直接負荷する。カラムを緩衝液C(20mM Hepes、pH8.0 、5mM EDTA、1mM DTT 、0.
2mM PMSF) 中の0.7 硫酸アンモニウム、０グリセロールから０塩、20％グリセロ
ールまでの２時間の勾配で溶離する。トレーサー[125I]T3に前もって結合したラ
ットTR−α LBD（全体のラットTR−α LBDの0.005 ％より少ない）を貫流ガンマ
放射検出器で検出するが、アンリガンデッドラットTR-I LBDをポストカラム[125 I]T3結合アッセイ（本明細書に記載する）によりアッセイする。
【０２８４】 フェニル-ToyopearlアンリガンデッドラットTR−α LBDピーク画分をプールし
、緩衝液Ｂで0.5mS/cm（ほぼ20Ｍ硫酸アンモニウムに等しい）の最終導電性に希
釈し、TSK-DEAEアニオン交換カラム(2×15cm、47mlのベッド体積）上に1.5ml/分
で負荷し、緩衝液Ｂ中の50〜200mM のNaClの60分の勾配で溶離する。 TSK-DEAEからのアンリガンデッドラットTR−α LBDピーク画分をプールし、緩
衝液Ｂで２倍に希釈し、 0.75ml/分でTSK-ヘパリンHPLCカラム(0.8×7.5cm 、３
mlのベッド体積）上に負荷し、緩衝液Ｂ中の50〜400mM のNaClの60分の勾配で溶
離する。
【０２８５】 TSK-ヘパリンHPLCカラムからのアンリガンデッドラットTR−α LBDピーク画分
のプールを0.7Mの硫酸アンモニウムに調節し、0.75ml／分でTSK-フェニルHPLCカ
ラム(0.8×7.5cm 、３mlのベッド体積）上に負荷し、緩衝液Ｃ中のグリセロール
を含まない0.7Mの硫酸アンモニウムから塩を含まない20％のグリセロールで溶離
する。アンリガンデッドラットTR−α LBDを含有する画分をプールし、５倍過剰
のホルモンと１時間インキュベートし、塩濃度を0.7Mの硫酸アンモニウムに調節
し、試料を再負荷し、前述と同一のカラム上でクロマトグラフィーにかける。
【０２８６】実施例７−リガンデッドTR−α LBDの特性決定 単一のLBD-122/410 からの材料をバッチに分割し、下記のリガンドの１つと定
量的に結合させる：Dimit 、T3、またはTriac IpBr2(3,5-ジヨード-3'-イソプロ
ピルサイロニン）（最終精製工程のために）。 リガンドとのラットTR−α LBDの完全な飽和を維持し、結晶化のための複合体
を製造するために、リガンド結合ラットTR−α LBDを濃縮し、10mMのHepes （pH
7.0 ）、3.0mM のDTT 、および1.0nM 〜10nMのリガンドを使用してAmicon Centr
icon-10 マイクロコンセントレーター(McGrath et al., Biotechniques, (1989)
, 7:246-247 、引用することによって本明細書の一部とされる）中の脱塩する。
【０２８７】 要因結晶化スクリーニング実験(Jancarik & Kim, J.App.Crystallogr.(1991)2
4:409-411 、引用することによって本明細書の一部とされる）を、17℃において
ハンギングドロップ蒸気拡散を使用して選択したリガンドに結合したラットTR−
α LBDについて実施する（シラン化カバーガラス用いて１μl のタンパク質溶液
、１μl の沈澱剤および0.5ml の溜を使用する：(McPherson, Preparation and
Analysis of Protein Crystals(1982)、引用することによって本明細書の一部と
される）。ラットTR−α LBDは４℃において安定ではなく、−80℃において貯蔵
し、ここでそれはホルモンに対する結合活性およびその結晶化能力をほぼ２〜３
カ月間維持する。
【０２８８】 これらの手順はMcGrath, M.E., et al., J.Mol.Biol.(1994)237:236-239 （引
用することによって本明細書の一部とされる）に記載されているように実施する
。結晶はスクリーニング実験（Jancarik & Kim 1991)の条件21において得られ、
次いで条件を最適化する。22℃において15％の2-メチル-2,4−ペンタンジオール
（MPD)、0.2Mの酢酸アンモニウムおよび0.1Mのカコジル酸ナトリウム(pH6.7) 、
３mMのDTT を使用し、およびシラン化カバーガラスとともに２μl のタンパク質
溶液、１μl の沈澱剤溶液および0.6ml の溜を使用し、そして8.7mg/ml(Dimit)
、5.5mg/ml(IpBr2) 、5mg/ml(Triac) 、または2.3mg/ml(T3)を使用して３日間に
わたって、ハンギングドロップ蒸気方式で、くさび形結晶が再現的に得られる。
【０２８９】 これらの条件下に、回折品質の結晶（寸法0.5 ×0.2 ×0.0075mm3)を周囲温度
（22℃）において成長させることができる。最良の結晶はほぼ100Tm の制限寸法
であり、そして３mMのDTT の存在下に2.3 〜8.7mg/mlのタンパク質濃度で得られ
る。結晶は単斜晶系の空間C2を有し、非対称単位において１つのモノマーを有す
る。
【０２９０】実施例８−T3、Triac 、またはGC-1を使用するヒトTR−β LBDの結晶化 ラットTR−α LBDについて前述したのと同一の手順に従い、下記の変更を加え
て、T3、Triac 、またはGC-1と複合化したヒトTR−β LBDを精製する。 図３に描写されている種々の核レセプターについてのアミノ酸のナンバリング
スキームに従い、ヒトTR−β LBDは位置716 におけるアミノ酸から位置1022を通
して延びることにおいて、ヒトTR−β LBDの発現はラットTR−α LBDと異なる。
列挙した核レセプターのすべてならびに任意の追加の相同的核レセプターに適用
可能なナンバリングスキームを図３に図解する。 位置725 および位置1025における図３上の垂直線は、リガンドの適切な結合を
得るために必要な、好ましい最小アミノ酸配列を描写する。図３に従う位置716
から位置1022までのアミノ酸配列は、公衆に入手可能なヒトTR−βのアミノ酸配
列の慣用のナンバリングに従うアミノ酸位置202 〜461 に対応する。また、ヒト
TR−β LBDは、下記の文献に記載されているように、ヒスチジン標識とともに発
現される：Crowe et al., Methods in Molecular Biology(1994)31:371-387、引
用することによって本明細書の一部とされる。
【０２９１】 ヒトTR−β LBDの精製は、下記を例外して、ラットTR−α LBDについて前述し
た精製と同一である。第１に、疎水性相互作用カラムを使用する精製工程の前に
、１工程を添加し、この工程において、発現されたヒトTR−β LBDをニッケルNT
A カラム（Qiagen、カリフォルニア州チャツワース、から商業的に入手可能であ
る）を製造業者のインストラクションに従い使用して精製し、200mM のイミダゾ
ールで溶離する。第２の差は、ヒトTR−β LBDの精製において、ヘパリンを使用
する精製工程を省略することである。
【０２９２】 T3、Triac またはGC-1に結合したヒトTR−β LBDの結晶化は次の通りである。
Jancarik & Kim(1991)の要因結晶化スクリーニング実験および商業的に入手可能
な製品（Hampton Recearch, Riverside から）を使用して、周囲温度 (22℃）に
おいて前述したようにハンギングドロップに従い要因スクリーニングの条件７に
おいて結晶を得る。最適条件は次の通りである：1.0 〜1.2Mの酢酸ナトリウム（
非調節のpH）および0.1Mのカコジル酸ナトリウム（pH7.4)、３mMのDTT を含有す
るハンギングドロップから、１μl のタンパク質溶液、１μl の沈澱剤溶液また
は２μl のタンパク質溶液、１μl の沈澱剤溶液および0.6ml の溜とともにシラ
ン化カバーガラスを使用して、７〜10mg/ml のタンパク質濃度において、六方晶
系のビビリミドの結晶を４℃において２〜３日間成長させる。
【０２９３】 最良の結晶は 200μm の制限寸法を有する。GC-1を使用するTR−β LBDの結晶
化のための最適条件は次の通りである：0.8 〜1.0Mの酢酸ナトリウム（非調節の
pH）、50〜200nM のコハク酸ナトリウム、および0.1Mのカコジル酸ナトリウム（
pH7.2)、３mMのDTT を含有するハンギングドロップから、１μl のタンパク質溶
液、１μl の沈澱剤溶液および0.6ml の溜とともにシラン化カバーガラスを使用
して、７〜10mg/ml のタンパク質濃度において、六方晶系のビビリミドの結晶を
４℃において２〜３日間成長させる。最良の結晶は 200μM の制限寸法を有する
。単位セル寸法はセル長さa=b=68.73 、セル長さc=130.09である。単位セル角度
はα=90 °、β=90 °、γ=120°である。
【０２９４】 T3、Triac またはGC-1に結合したヒトTR−β LBDの結晶系は空間群p3121 をも
つ偏六面体である。単位セル寸法はセル長さa=セル長さb=68.448、セル長さc=13
0.559 である。単位セル角度はα=90 °、β=90 °、γ=120°である。
【０２９５】実施例９−リガンデッドTR−α LBDおよびTR−β結晶構造の決定 各共結晶からデータ(Dimit、T3およびIpBr2 をもつラットTR−α LBD；Triac
およびGC-1をもつヒトTR−β LBD）を、Mar 面積検出器（Stanford Sychrotron
Radiation Laboratory、ビームライン7-1(λ=1.08 オングストローム))により1.
2 °の振動を使用して測定する。Triac をもつhTR-β LBDの共結晶からのデータ
を、Mar 面積検出器（Stanford Sychrotron Radiation Laboratory、ビームライ
ン7-1(λ=1.08 オングストローム))により1.0 の振動を使用して測定する。GC-1
をもつhTR-β LBDの共結晶からのデータを、Rigaku回転Cuアノード (50Kv、300m
A ）上のR-軸II面積検出器により測定する。
【０２９６】 結晶を1.2Mの酢酸ナトリウム、0.1Mのカコジル酸ナトリウム、および15％のグ
リセロールを含有する極低温溶媒の中に移し、次いで30％のグリセロールの中に
移し、次いで液体窒素中でフラッシュ凍結する。DENZO を使用して、各結晶の配
向マトリックスを得る。反射をDENZO （Molecular Structure Corp., The Woodl
ans, Texas、から商業的に入手可能である）で積分し、SCALEPACK でスケーリン
グする（下記の文献に記載されているように、Otwinowsik, Z., Proceedings of
the CCP4 Study Weekend:″Data Collection and Processing,T56-62(SERC Dar
esbury Laboratoy, Warrington, UK 1993)、引用することによって本明細書の一
部とされる）。
【０２９７】 rTR-α共結晶について、T3共結晶からのデータをスピンドルとほぼ平行のb*軸
を使用して測定する。結晶を-178℃において窒素気体の流れ中で極低温溶媒とし
て働くMPD 母液を使用してフラッシュ凍結させる。各結晶についての配向マトリ
ックスをREFIX により測定する(Kabsh, W.J.App.Crystallogr.(1993)26:795-800
、引用することによって本明細書の一部とされる）。反射をDENZO で積分し、SC
ALEPACK でスケーリングする。 T3のデータの組について、Bijvoet 対を別々に保持し、MADSYS(W.Hendrickson
（コロンビア大学）およびW.Weis（スタンフォード大学))で局所的に目盛り定め
する。
【０２９８】 ３つの等電子配列のリガンドから製造した共結晶は同形である。CCP4の組(Col
laborative Computational Project, N.R.Acta Crystallogr.(1994)D50:760-763
、引用することによって本明細書の一部とされる）からのプログラムを使用して
、MIR 分析を実施する。Dimit 共結晶を親として、差分パターソンをT3およびIp
Br2 の双方について計算する。T3差分パターソンにおける３個のヨウ素原子の位
置は、バックグラウンドより上の11のピークとして密度地図のハーカー区画から
明瞭に決定される。IpBr2 共結晶中の２個の臭素原子についての位置は、ノイズ
レベルより上のピーク８として、独立に位置する。
【０２９９】 LBD-122/410 についての相をIpBr2 の差分パターソンに対する解から計算し、
そしてT3共結晶のユニークな第３ヨウ素の位置を確証するために使用する。ハロ
ゲンの位置をMLPHARE で洗練し、これらは常なヨウ素原子からの異常な寄与を含
む(Otwinowski, Z., Proceedings of the CCPR Study Weekend 80-86(SERC Dare
sbury Laboratoy, Warrington, UK 1991) ）。MIRAS 相はDMを使用する溶媒フラ
ッタリング／ヒストグラムの合致により改良される(Cowtan, K., Joint CCP4 an
d ESF-RACBM Newsletter on Protein Crystallography(1994)31:34-38 、引用す
ることによって本明細書の一部とされる）。
【０３００】 溶媒平坦化MIRAS 2.5 オングストローム密度地図からのプログラムＯを使用し
て、Dimit が結合したLBD-122/410 のモデルを構築する(Jones et al., Acta Cr
ystallogr.(1991)A47:110-119 、引用することによって本明細書の一部とされる
）。XPLOR を使用する最小二乗プロトコールにより、初期のモデル（リガンドを
含まない)(Rcryst=40.1 ％）を洗練する。下記のラウンド間にDimit リガンドを
明瞭なFo-Fc 異なる密度に構築する。引き続く洗練において、最小二乗法および
XPLOR を用いるシミュレートしたアニーリングプロトコールの双方を使用する(B
runger et al., Science(1987)235:458-460)、引用することによって本明細書の
一部とされる）。
【０３０１】 個々の原子B-ファクター等方的に細分する。PROCHECKにおいて定義されている
ように、すべての残基は許容された主要な鎖捩れ角の領域にある（Lawkowski et
al., J.App.Crystallogr.(1993), 26:283-291、引用することによって本明細書
の一部とされる、に記載されているように）。現在のモデルはＮ末端において34
残基（Met122-Gln156)を欠き、そしてＣ末端において５残基（Glu406-Val410 ）
欠く。
【０３０２】 さらに、下記の残基は劣った密度のためにＣβを越えてモデル化されない：18
4 、186 、190 、198 、206 、209 、240 、301 、330 、337 、340 、343 、35
9 、および395 。タンパク質原子についての平均Ｂ値は34.5Åである。最終モデ
ルは下記のものから成る：LBD-122/410 、残基Arg157-Ser183 、Trp185-Gly197 、Ser199-Asp206 およびAsp208-Phe405 ；３つのカコディレート修飾システイン
：Cys334、Cys380およびCys392；および水としてモデル化された73の溶媒分子 (
2003原子）。
【０３０３】 ＊ Rsym ＝100 ×Σhkl Σi ｜ Ii -I｜／Σhkl Σi I i † Rder ＝100 ×Σhkl ｜ FPH-FH ｜／Σhkl ｜ FP ｜ ２つの臭素部位の占有は35個の電子に設定される。ヨウ素部位の占有はこの値
に関係する。 §フェージング力＝〈FH〉／〈ε〉、ここで〈FH〉は平均の計算した重い原子
の表面ファクターの振幅であり、そして〈ε〉は平均の推定されたクロージャー
の欠如である。4Rcullis＝〈ε〉／〈iso 〉、ここで〈ε〉は平均の推定された
クロージャーの欠如であり、そして〈iso 〉は同形の差である。
【０３０４】 ¶Rcryst＝100 ×Σhkl ｜F0-Fc ｜／Σhkl ｜F0｜、ここでF0および Fc は観
測され、計算した構造ファクターの振幅である（データF/σ＞２について）。ラ
ンダムに選択し、細分から省略されたデータの３％を使用して、Rfree を計算し
た。 §相関係数＝Σhkl （｜F0｜−｜F0｜）×（｜ Fc ｜−｜ Fc ｜）／Σhkl （｜F0｜−｜F0｜）2 ×Σhkl （｜ Fc ｜−｜ Fc ｜）2
【０３０５】実施例10 Triac とのrTR-α LBDおよびhTR-β LBD複合体のフェージング Triac とのrTR α LBD複合体の可能な非同形性のために、T3とのrTRI LBD複合
体から成るが、リガンド、すべての水分子、および下記の残基が省略された、出
発モデルからAMORE(Navaza, J.Acta Crystallographica Section A-Fundamental
s of Crystallogrphy (1994)50:157-63)を使用して、分子の置換の解を決定する
：Asn179、Arg228、Arg262、Arg266、およびSer277。回転および転位の双方の研
究において、強いピークが得られ、有意な（＞0.5 ×上部ピーク）誤りの解は観
測されない（表６）。異常なおよび慣用の差分フーリエ地図の中に存在する強い
正の密度はこの解を確証する。
【０３０６】 15サイクルの最尤細分後、REFMAC(Murshudov et al.,″Application of Maxim
um Likelihood Refinements,″in Refinement of Porein Structures,Proceedin
gs of Daresbury Study Weekend(1996))によりシグマ-A加重係数の出力を使用し
て、地図を計算する。Triac 、省略された残基、および水分子503 、504 、534(
T3とのTR複合体についてのナンバリングのコンベンション後）をO(Jones et al.
）を使用して構築して差分密度を得る；これらの残基のコンフォメーションをシ
ミュレートしたアニーリング省略地図においてさらに確証される（Brunger et a
l.）。次いで位置の最小二乗法、シミュレートしたアニーリング、および制限さ
れ、グループ化されたＢファクターをXPLOR において使用して、完成したモデル
を23.6％のRcrystおよび24.1％のRfree に細分する。
【０３０７】 rTR-α LBDの構造を使用する関係するLBD のフェージングを次のようにして実
施する。T3と複合化したrTR-α LBDから成るが、リガンドおよびすべての水分子
が省略された出発モデルからのAMORE を使用して、Triac とのhTR-β LBDについ
ての分子置換の解を決定する。回転および転位の双方の研究において、強いピー
クが得られ、有意な（＞0.5 ×上部ピーク）誤りの解は観測されない（表７）。
異常なおよび慣用の差分フーリエ地図の中に存在する強い正の密度はこの解を確
証する。
【０３０８】 ９サイクルの最尤細分後、REFMACによりシグマ-A加重係数の出力を使用して、
初期の地図を計算する。OOPS(Keywegt, GJおよびJones, TA, OOPS-a-saisy, ESF
/CCP4 Newslettr 30, June 1994, pp.20-24 ）を使用して、各残基についての実
空間の適合を計算し、そして平均よりも２より小さい標準偏差の実空間の適合を
除去した：Ala253-Lys263;Glu245-Leu250 。バイアスを減少するために、下記の
実空間をアラニンとしてモデリングした：Arg282、Arg316、Arg320、Asn331。
【０３０９】 XPLOR とともに再構築のサイクルおよび位置の最小二乗法、シミュレートした
アニーリング、および制限された、グループ化したＢファクターにより、25.3％
のRcrystおよび28.9％のRfree を有するモデルが得られる。最終モデルは下記の
ものから成る：hTR-β LBD残基Glu202-Glu252 、Val264-Glu460 ；遊離ヒ素とし
てモデリングされたカコディレート部分をもつカコディレート修飾システイン：
Cys294、Cys298、Cys388、およびCys434；および水としてモデリングされた35の
溶媒分子。
【０３１０】実施例11 甲状腺ホルモンレセプターにおいてQSARと構造との接続 古典的甲状腺ホルモンレセプターの定量的構造−活性の関係の結論を次のよう
に要約することができる： 1) R4' ヒドロキシル基は水素結合のドナーとして機能する； 2) アミノ−ピロピオン酸はカルボキシレートアニオンを通してレセプターか
らの正に帯電した残基と相互作用する； 3) R3／R5置換基の優先性はI>Br>Me>>Hである； 4) R3' 置換基の優先性はIpr>I>Br>Me>>Hである。
【０３１１】 本発明において提供されるアゴニストT3、IpBr2 、Dimit 、Triac 、およびGC
１と複合化した甲状腺ホルモンレセプターのリガンド結合ドメインの構造は、下
記のことを可能とする： 1) 水素結合のレベルにおける結合のレセプター決定因子の同定； 2) これらの決定因子と古典的甲状腺ホルモンレセプターQSARとのアソシエー
ション； 3) リガンドおよびレセプターの双方について、どの結合決定因子が剛性であ
り、そしてどれが柔軟性であるかについての予測。 アゴニストの型についての分類（R1＝アミノ−ピロピオン、酢酸：R3、R5＝Ｉ、
Br、Me;R3'＝Ipr 、Ｉ）を後述する（代表的なリガンドT3について）： Ｆ＝基準（常に満足される） Ａ＝調節可能
【０３１２】
【化８】
【０３１３】 本明細書に記載する方法およびデータに基づいて、レセプターLBD のアミノ酸
残基の構造と本明細書に記載する４つの異なるリガンドとの間の相互作用に基づ
く核レセプターのリガンドの設計を可能とする、本発明のコンピューター的方法
の１態様は次の通りである。リガンドについての小さい分子構造はケンブリッジ
・ストラクチュラル・データベース(Cambrige Structural Database(CSD)）から
入手することができ、そして本明細書に記載する方法を使用して三次元のモデル
を構築することができる。合成リガンドの設計において考慮すべき因子は次の通
りである：
【０３１４】 1) ヒスチジン381 はR4' ヒドロキシルのための水素結合のアクセプターとし
て作用し、最適な互変異性は水分子により維持される。図23および図24参照。ヒ
スチジンはR4' 置換基を取り囲むこの疎水性ポケット中の唯一の親水性残基であ
る。ヒスチジンは、その互変異性状態に依存して、水素結合のアクセプターまた
はドナーであることができる。それは好ましくは水素結合のドナーであるが、例
えば、リガンドのR4' 位にメトキシが存在するとき、水素結合のアクセプターと
して許容されることができる。
【０３１５】 2) アルギニン228 、262 および266 は、直接的にかつ水仲介水素結合を通し
て、アルギニン266 により提供される静電的相互作用で（Triac 複合体における
ように）R1置換基と相互作用する。この極性ポケットは図23〜図25により例示さ
れる。図23にはTRI リガンド結合キャビティ中のT3が描写されており、ここでT3 アミノ−ピロピオン酸のR1置換基は水素結合を介してArg228、HOH502、H9H503お
よびHOH504と相互作用する。図24にはリガンド結合キャビティ中のTriac が描写
されており、極性ポケット中にその−COOHのR1置換基を有する。第24図において
、Arg228はリガンドと水素結合を共有するが、−COOHのR1置換基はArg266と水素
結合を形成する。
【０３１６】 図25はリガンド結合キャビティにおいてT3およびTriac を重ね、そしていくつ
かの位置的に未変化のアミノ酸および水分子、および選択された変化した相互作
用するアミノ酸および水分子を示す。３つの図面は変化することができる極性ポ
ケットの部分および異なるリガンドが結合したとき動かない部分を例示する。例
えば、R1置換基が-COOH からアミノピロピオン酸基に変化したときでさえ、極性
ポケットの上部におけるArg262は動かない。しかしながら、他の２つのアルギニ
ン、Arg228およびArg266は極性ポケット中で柔軟性を示し、R1置換基の大きさお
よび化学的特質の変化に対して応答する。
【０３１７】 3) R3／R5置換基のための内側および外側のポケットは、それぞれ、Ser260、
Ala263、Ile299；およびPhe218、Ile221、Ile222により形成される。第21図およ
び図22参照。内側ポケットは、置換基の大きさに無関係に、R3またはR5置換基に
より充填され、そしてリガンドをレセプターの中に位置決定することによって結
合決定因子として作用することができる。最適には、内側ポケットのアミノ酸は
ヨード基より大きくないR3またはR5置換基と相互作用する。
【０３１８】 内側ポケットがR3置換基により充填される場合、外側ポケットはR5置換基と相
互作用し、そしてまた逆もまた同じである。他のポケットをらせん３（Lys220-I
le221 ）における破壊において中心となる主要な炭素の運動によりその置換基の
大きさに調節することができ、H3の湾曲およびH3のＮ末端の運動がリガンドの結
合のとき誘導されるコンフォメーション変化を表すことができることが示唆され
る。外側ポケットはより大きい置換基を収容することによって、内側ポケットよ
りも大きい柔軟性を有する。
【０３１９】 4) R3' 置換基のポケットはPhe215、Gly290、Met388により形成される。ポケ
ットはR3' ヨード置換基により不完全に充填され、柔軟なMet388側鎖およびH7／
H8ループの運動によりわずかにより大きい3'−イソプロピル置換基を収容する。
ポケットはイソプロピルよりも大きいR3' 置換基、例えば、フェニル基を収容す
ることができる。
【０３２０】 上記情報は、自動化QSAR法を改良しかつ薬学的に主要な化合物のマニュアルの
モデリングの情報を与えることによって、高いアフィニティーのアゴニストおよ
びアンタゴニストの設計を促進する。例えば、離散した水分子の包含は薬作用発
生団の開発とともに使用するための極性ポケット中の水素結合の完全な説明を提
供する：また、レセプター内の移動性および不動性の残基の同定は、分子の機構
／動力学の結論において使用するための、物理的に合理的な拘束を示唆する。
【０３２１】実施例12 アフィニティーが増加したリガンドの設計 レセプターとリガンドとの間の直接的相互作用は、R1置換基と相互作用する、
極性ポケットにおいて制限される。相補性の欠如は生物学的調節のための関係づ
けを含むことができるが、また、極性ポケットのアミノ酸と合成リガンドのR1置
換基との間の相互作用を最適化することによってアフィニティーを増加するため
の機会を提供する。本明細書に記載するレセプター−リガンドの相互作用の構造
は、２つの相補的修飾を有する、アフィニティーが増加した合成リガンドの設計
を可能とする：
【０３２２】 1) 正に帯電したアミンを除去する。極性ポケットについて予測される強く正
の静電電位により示唆されるように、アミノピロピオン酸R1置換基の正に帯電し
たアミンは結合に対して有害であることがある。置換のための適当な基は、付近
の水素結合の相手の特質により示唆される：例えば、Thr275のＯまたはSer277の
Ｎ。例えば、付録２中の表参照。例えば、任意の負に帯電した置換基は極性ポケ
ットのアミノ酸との相互作用に適合性であり、カルボキシレート、カルボニル、
ホスホネート、およびサルフェートを包含し、０〜４個の炭素原子からなる。R1 置換基の他の例は、１または２以上のカルボニル基を有する天然に存在するリガ
ンドのアミンを置換するオキサミン酸である。
【０３２３】 2) 水素結合のアクセプターおよびドナーをR1置換基の中に組込んで、極性ポ
ケットのスカホールドとのより広い相互作用を提供する。R1置換基の中に組込ま
れた水素結合のアクセプターおよびドナーは、そうでなければ極性ポケット中の
水分子とで起こる相互作用を可能とするであろう。特定の水は、HOH504(Ala225
のＯおよびArg262のNHとの水素結合）およびHOH503 (Asn179のOD1 、Ala180のＮ
との水素結合）を包含し、それらの双方はすべての４つの複合体の中に存在する
（T3と複合化したTR LBD、IpBr2 と複合化したTR LBD、Dimit と複合化したTR L
BDおよびTriac と複合化したTR LBD）。
【０３２４】 極性ポケット中の水素結合のネットワークの解析は、HOH504と水素結合のアク
セプターとの置換、およびHOH503と水素結合のドナーとの置換を示唆する（しか
し、アスパラギンの化学的特質は多分この部位における柔軟性を可能とする）。
こうして、HOH504の配置を取ることができるR1置換基の中に水素結合のアクセプ
ターを組込むこと、あるいは位置的にHOH503を置換することができるR1置換基の
中に水素結合のアクセプターを組込むこと、あるいはそれらの組合わせは、新規
な合成TRリガンドを設計する方法である。
【０３２５】 下記表５中のものを包含する合成リガンドを設計するために、これらの２つの
設計のアプローチを別々にあるいは組合わせて使用することができる。 このアプローチに対する結論は、残基Arg262およびAsn179に対して特異的な相
互作用を設計することである。この目標は、ポケット中の水分子または帯電した
残基と水素結合を形成するR1置換基を有するリガンドを設計することによって、
これらの残基に対して相互作用を構築することである。
【０３２６】 構造をベースとするスクリーン中で同定し、次いでそれらの実験的に決定され
た結合の向きにおいて一緒に結合される、ターゲット核ホルモンレセプターの近
位のサブサイトに結合する小さい分子を使用して、高いアフィニティーのリガン
ドをまた設計し、選択することができる。このような方法は、FK506 結合タンパ
ク質(FKBP)、ストロメリシン、ゲラチナーゼＡ、およびヒト乳頭腫ウイルスE2の
ための高いアフィニティーのリガンドの設計において記載された(Hajduk et al.
, Science 278:497-499(1997) 、引用することによって本明細書の一部とされる
）。
【０３２７】 スクリーニングのために好ましい小さい分子は、式Ｉの化合物またはそれらの
誘導体である。例えば、式Ｉの化合物（φ-X- φ）またはその誘導体（φ-Xまた
はX-φ）を、ターゲット核ホルモンレセプターLBD への結合についてスクリーニ
ングする。核ホルモンレセプターの近接サブサイトは、LBD の疎水性および極性
のポケット、およびそれらから拡張したサブサイトを包含する。１例として、フ
ーリエ変換または核磁気共鳴（NMR ）をベースとする構造のスクリーンを使用す
ることができる。NMR をベースとするスクリーンを使用するとき、添加した化合
物存在および非存在において要求される二次元のヘテロ核単量子相関(HSQC)スペ
クトルにおいて観測される、アミドの化学シフトの変化から結合を検出すること
ができる。
【０３２８】 いったんレセプターに結合する２つのリガンドが同一であると、三元複合体の
結晶または溶液の構造を測定する。構造の情報から、２つのリガンドに結合する
化合物を合成し、ここでリンカーは構造の情報に基づいて選択される。次いで新
規な化合物を、例えば、ここに記載するように結合アッセイを使用して、結合の
アフィニティーについてスクリーニングする。このアプローチを使用するとき、
わずかの結合したリガンドを合成し、スクリーニングすることが必要であるだけ
である。
【０３２９】 本発明の化合物は、また、他の構造をベースとする設計／モデリング技術を使
用して前述の化合物の構造の情報から設計することができる（Jackson, R.C., C
ontributions of protein structrue-based drug dsign to cancer chemotherap
y.Semninars in Oncology, 1997, 24(2)L164-172; およびJones, T.R. et al.,
J.Med.Chem., 1996, 39(4):904-917）。
【０３３０】
【表１１】
【０３３１】 上記ビフェニルのエーテルスカッフォルド構造中の上記置換基の任意の組合わ
せにより、甲状腺ホルモンレセプターのために潜在的に薬理学的に有用なリガン
ドを生成することができる。これらの新規なリガンドは甲状腺レセプターのアン
タゴニストであることができる。
【０３３２】
【表１２】
【０３３３】
【表１３】
【０３３４】 この明細書中に記載したすべての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物ま
たは特許出願は、各個々の刊行物または特許出願が特別にかつ個々に引用するこ
とによって本明細書の一部とされると示されたと同一程度に、引用することによ
って本明細書の一部とされる。これらの参考文献の核レセプターのリガンド、特
にTRリガンドは引用することによって本明細書の一部とされ、そして必要に応じ
て特許請求される化合物から但し書きにより排除することができる。 題目および副題は読者の便利さのためにのみ提示され、そしてこのような題目
および副題の範囲内で使用される用語の意味で解釈するために使用すべきではな
い。 本発明は今回完全に説明されので、当業者にとって明らかなように、本発明の
精神または範囲から逸脱しないで多数の変化および変更が可能である。
【０３３５】
【表１４】
【０３３６】
【表１５】
【０３３７】
【表１６】
【０３３８】
【表１７】
【０３３９】
【表１８】
【０３４０】
【表１９】
【０３４１】
【表２０】
【０３４２】
【表２１】
【０３４３】
【表２２】
【０３４４】
【表２３】
【０３４５】
【表２４】
【０３４６】
【表２５】
【０３４７】
【表２６】
【０３４８】
【表２７】
【０３４９】
【表２８】
【０３５０】
【表２９】
【０３５１】
【表３０】
【０３５２】
【表３１】
【０３５３】
【表３２】
【０３５４】
【表３３】
【０３５５】
【表３４】
【０３５６】
【表３５】
【０３５７】
【表３６】
【０３５８】
【表３７】
【０３５９】
【表３８】
【０３６０】
【表３９】
【０３６１】
【表４０】
【０３６２】
【表４１】
【０３６３】
【表４２】
【０３６４】
【表４３】
【０３６５】
【表４４】
【０３６６】
【表４５】
【０３６７】
【表４６】
【０３６８】
【表４７】
【０３６９】
【表４８】
【０３７０】
【表４９】
【０３７１】
【表５０】
【０３７２】
【表５１】
【０３７３】
【表５２】
【０３７４】
【表５３】
【０３７５】
【表５４】
【０３７６】
【表５５】
【０３７７】
【表５６】
【０３７８】
【表５７】
【０３７９】
【表５８】
【０３８０】
【表５９】
【０３８１】
【表６０】
【０３８２】
【表６１】
【０３８３】
【表６２】
【０３８４】
【表６３】
【０３８５】
【表６４】
【０３８６】
【表６５】
【０３８７】
【表６６】
【０３８８】
【表６７】
【０３８９】
【表６８】
【０３９０】
【表６９】
【０３９１】
【表７０】
【０３９２】
【表７１】
【０３９３】
【表７２】
【０３９４】
【表７３】
【０３９５】
【表７４】
【０３９６】
【表７５】
【０３９７】
【表７６】
【０３９８】
【表７７】
【０３９９】
【表７８】
【０４００】
【表７９】
【０４０１】
【表８０】
【０４０２】
【表８１】
【０４０３】
【表８２】
【０４０４】
【表８３】
【０４０５】
【表８４】
【０４０６】
【表８５】
【０４０７】
【表８６】
【０４０８】
【表８７】
【０４０９】
【表８８】
【０４１０】
【表８９】
【０４１１】
【表９０】
【０４１２】
【表９１】
【０４１３】
【表９２】
【０４１４】
【表９３】
【０４１５】
【表９４】
【０４１６】
【表９５】
【０４１７】
【表９６】
【０４１８】
【表９７】
【０４１９】
【表９８】
【０４２０】
【表９９】
【０４２１】
【表１００】
【０４２２】
【表１０１】
【０４２３】
【表１０２】
【０４２４】
【表１０３】
【０４２５】
【表１０４】
【０４２６】
【表１０５】
【０４２７】
【表１０６】
【０４２８】
【表１０７】
【０４２９】
【表１０８】
【０４３０】
【表１０９】
【０４３１】
【表１１０】
【０４３２】
【表１１１】
【０４３３】
【表１１２】
【０４３４】
【表１１３】
【０４３５】
【表１１４】
【０４３６】
【表１１５】
【０４３７】
【表１１６】
【０４３８】
【表１１７】
【０４３９】
【表１１８】
【０４４０】
【表１１９】
【０４４１】
【表１２０】
【０４４２】
【表１２１】
【０４４３】
【表１２２】
【０４４４】
【表１２３】
【０４４５】
【表１２４】
【０４４６】
【表１２５】
【０４４７】
【表１２６】
【０４４８】
【表１２７】
【０４４９】
【表１２８】
【０４５０】
【表１２９】
【０４５１】
【表１３０】
【０４５２】
【表１３１】
【０４５３】
【表１３２】
【０４５４】
【表１３３】
【０４５５】
【表１３４】
【０４５６】
【表１３５】
【０４５７】
【表１３６】
【０４５８】
【表１３７】
【０４５９】
【表１３８】
【０４６０】
【表１３９】
【０４６１】
【表１４０】
【０４６２】
【表１４１】
【０４６３】
【表１４２】
【０４６４】
【表１４３】
【０４６５】
【表１４４】
【０４６６】
【表１４５】
【０４６７】
【表１４６】
【０４６８】
【表１４７】
【０４６９】
【表１４８】
【０４７０】
【表１４９】
【０４７１】
【表１５０】
【０４７２】
【表１５１】
【０４７３】
【表１５２】
【０４７４】
【表１５３】
【０４７５】
【表１５４】
【０４７６】
【表１５５】
【０４７７】
【表１５６】
【０４７８】
【表１５７】
【０４７９】
【表１５８】
【０４８０】
【表１５９】
【０４８１】
【表１６０】
【０４８２】
【表１６１】
【０４８３】
【表１６２】
【０４８４】
【表１６３】
【０４８５】
【表１６４】
【０４８６】
【表１６５】
【０４８７】
【表１６６】
【０４８８】
【表１６７】
【０４８９】
【表１６８】
【０４９０】
【表１６９】
【０４９１】
【表１７０】
【０４９２】
【表１７１】
【０４９３】
【表１７２】
【０４９４】
【表１７３】
【０４９５】
【表１７４】
【０４９６】
【表１７５】
【０４９７】
【表１７６】
【０４９８】
【表１７７】
【０４９９】
【表１７８】
【０５００】
【表１７９】
【０５０１】
【表１８０】
【０５０２】
【表１８１】
【０５０３】
【表１８２】
【０５０４】
【表１８３】
【０５０５】
【表１８４】
【０５０６】
【表１８５】
【０５０７】
【表１８６】
【０５０８】
【表１８７】
【０５０９】
【表１８８】
【０５１０】
【表１８９】
【０５１１】
【表１９０】
【０５１２】
【表１９１】
【０５１３】
【表１９２】
【０５１４】
【表１９３】
【０５１５】
【表１９４】
【０５１６】
【表１９５】
【０５１７】
【表１９６】
【０５１８】
【表１９７】
【０５１９】
【表１９８】
【０５２０】
【表１９９】
【０５２１】
【表２００】
【０５２２】
【表２０１】
【０５２３】
【表２０２】
【０５２４】
【表２０３】
【０５２５】
【表２０４】
【０５２６】
【表２０５】
【０５２７】
【表２０６】
【０５２８】
【表２０７】
【０５２９】
【表２０８】
【０５３０】
【表２０９】
【０５３１】
【表２１０】
【０５３２】
【表２１１】
【０５３３】
【表２１２】
【０５３４】
【表２１３】
【０５３５】
【表２１４】
【０５３６】
【表２１５】
【０５３７】
【表２１６】
【０５３８】
【表２１７】
【０５３９】
【表２１８】
【０５４０】
【表２１９】
【０５４１】
【表２２０】
【０５４２】
【表２２１】
【０５４３】
【表２２２】
【０５４４】
【表２２３】
【０５４５】
【表２２４】
【０５４６】
【表２２５】
【０５４７】
【表２２６】
【０５４８】
【表２２７】
【０５４９】
【表２２８】
【０５５０】
【表２２９】
【０５５１】
【表２３０】
【０５５２】
【表２３１】
【０５５３】
【表２３２】
【０５５４】
【表２３３】
【０５５５】
【表２３４】
【０５５６】
【表２３５】
【０５５７】
【表２３６】
【０５５８】
【表２３７】
【０５５９】
【表２３８】
【０５６０】
【表２３９】
【０５６１】
【表２４０】
【０５６２】
【表２４１】
【０５６３】
【表２４２】
【０５６４】
【表２４３】
【０５６５】
【表２４４】
【０５６６】
【表２４５】
【０５６７】
【表２４６】
【０５６８】
【表２４７】
【０５６９】
【表２４８】
【０５７０】
【表２４９】
【０５７１】
【表２５０】
【０５７２】
【表２５１】
【０５７３】
【表２５２】
【０５７４】
【表２５３】
【０５７５】
【表２５４】
【０５７６】
【表２５５】
【０５７７】
【表２５６】
【０５７８】
【表２５７】
【０５７９】
【表２５８】
【０５８０】
【表２５９】
【０５８１】
【表２６０】
【０５８２】
【表２６１】
【０５８３】
【表２６２】
【０５８４】
【表２６３】
【０５８５】
【表２６４】
【０５８６】
【表２６５】
【０５８７】
【表２６６】
【０５８８】
【表２６７】
【０５８９】
【表２６８】
【０５９０】
【表２６９】
【０５９１】
【表２７０】
【０５９２】
【表２７１】
【０５９３】
【表２７２】
【０５９４】
【表２７３】
【０５９５】
【表２７４】
【０５９６】
【表２７５】
【０５９７】
【表２７６】
【０５９８】
【表２７７】
【０５９９】
【表２７８】
【０６００】
【表２７９】
【０６０１】
【表２８０】
【０６０２】
【表２８１】
【０６０３】
【表２８２】
【０６０４】
【表２８３】
【０６０５】
【表２８４】
【０６０６】
【表２８５】
【０６０７】
【表２８６】
【０６０８】
【表２８７】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、核レセプターのスーパーファミリーの核レセプターと相互作用するリ
ガンドを設計するコンピューター的方法を例示する流れ図である。
【図２】 図２は、核レセプターの構造の概略的表示であり、ファミリーのメンバー内の
相同性領域および種々のドメインの機能を示す。
【図３Ａ】 図３Ａは、核レセプターのスーパーファミリーのいくつかのメンバーのリガン
ド結合ドメインの整列されたアミノ酸配列を示す。
【図３Ｂ】 図３Ｂは、核レセプターのスーパーファミリーのいくつかのメンバーのリガン
ド結合ドメインの整列されたアミノ酸配列を示す。
【図３Ｃ】 図３Ｃは、核レセプターのスーパーファミリーのいくつかのメンバーのリガン
ド結合ドメインの整列されたアミノ酸配列を示す。
【図３Ｄ】 図３Ｄは、核レセプターのスーパーファミリーのいくつかのメンバーのリガン
ド結合ドメインの整列されたアミノ酸配列を示す。
【図３Ｅ】 図３Ｅは、核レセプターのスーパーファミリーのいくつかのメンバーのリガン
ド結合ドメインの整列されたアミノ酸配列を示す。
【図３Ｆ】 図３Ｆは、核レセプターのスーパーファミリーのいくつかのメンバーのリガン
ド結合ドメインの整列されたアミノ酸配列を示す。
【図３Ｇ】 図３Ｇは、核レセプターのスーパーファミリーのいくつかのメンバーのリガン
ド結合ドメインの整列されたアミノ酸配列を示す。
【図３Ｈ】 図３Ｈは、核レセプターのスーパーファミリーのいくつかのメンバーのリガン
ド結合ドメインの整列されたアミノ酸配列を示す。
【図３Ｉ】 図３Ｉは、核レセプターのスーパーファミリーのいくつかのメンバーのリガン
ド結合ドメインの整列されたアミノ酸配列を示す。
【図３Ｊ】 図３Ｊは、核レセプターのスーパーファミリーのいくつかのメンバーのリガン
ド結合ドメインの整列されたアミノ酸配列を示す。
【図３Ｋ】 図３Ｋは、核レセプターのスーパーファミリーのいくつかのメンバーのリガン
ド結合ドメインの整列されたアミノ酸配列を示す。
【図３Ｌ】 図３Ｌは、核レセプターのスーパーファミリーのいくつかのメンバーのリガン
ド結合ドメインの整列されたアミノ酸配列を示す。
【図３Ｍ】 図３Ｍは、核レセプターのスーパーファミリーのいくつかのメンバーのリガン
ド結合ドメインの整列されたアミノ酸配列を示す。
【図３Ｎ】 図３Ｎは、核レセプターのスーパーファミリーのいくつかのメンバーのリガン
ド結合ドメインの整列されたアミノ酸配列を示す。
【図３Ｏ】 図３Ｏは、核レセプターのスーパーファミリーのいくつかのメンバーのリガン
ド結合ドメインの整列されたアミノ酸配列を示す。
【図３Ｐ】 図３Ｐは、核レセプターのスーパーファミリーのいくつかのメンバーのリガン
ド結合ドメインの整列されたアミノ酸配列を示す。
【図３Ｑ】 図３Ｑは、核レセプターのスーパーファミリーのいくつかのメンバーのリガン
ド結合ドメインの整列されたアミノ酸配列を示す。
【図３Ｒ】 図３Ｒは、核レセプターのスーパーファミリーのいくつかのメンバーのリガン
ド結合ドメインの整列されたアミノ酸配列を示す。
【図４】 図４は、標識化された二次構造因子を有するラットTR−α LBDのリボンの図面
である。リガンド（マゼンタ）は空間充填モデルとして描写されている。アルフ
ァらせんおよびコイルのコンフォメーションは黄色であり、ベータ鎖は青色であ
る。
【図５】 図５は、レセプター内に緊密に詰められたリガンド（マゼンタ）を露出するラ
ットTR−αの空間充填モデルの２つの断面図である。
【図６】 図６は、リガンド結合キャビティの略図である。リガンドと相互作用する残基
は、ほぼ相互作用部位において出現する。水素結合は結合相手の間の破線として
示されている；各結合の間の距離は列挙されている。非結合の接触は、相互作用
する原子に向かう半径方向のスポークとして示されている。
【図７】 図７は、精製されたラットTR-I LBD中の結晶学的温度ファクターの分布である
。分布は、15（暗い青色）より小から35（黄色−緑色）より大までの色のグラデ
ーションとして表されている。
【図８】 図８は、リガンドに対するＣ末端の活性化ドメインを示すラットTR−α LBDの
リボンの図面である。Ｃ末端の活性化ドメイン（Pro393-Phe405)からなる残基は
スティックとして描写されている。疎水性残基、特にPhe401およびPhe405（青色
）は、リガンドに向かって面する。Glu403（赤色）は外方に向かって溶媒の中に
突起する。
【図９】 図９は、GRAPH を使用して計算した、ラットTR−α LBDの静電電位の表面であ
る。負の静電電位は赤色である；正の静電電位は青色である。Ｃ末端の活性化ド
メインは主として疎水性（白色）を形成する。Glu403は負の電荷（赤色）の単一
のパッチとして表されている。
【図１０】 図10は、いくつかのレセプターについてのアゴニストおよびアンタゴニストを
比較するダイアグラムである。
【図１１】 図11は、TS１、TS２、TS３、TS４およびTS５の合成スキームである。
【図１２】 図12は、TS６およびTS７の合成スキームである。
【図１３】 図13は、TS８の合成スキームである。
【図１４Ａ】 図14Ａは、TS10の合成スキームである。
【図１４Ｂ】 図14Ｂは、TS10の合成スキームである。
【図１５】 図15は、いくつかのTRリガンドの化学構造を描写する。
【図１６】 図16は、T3およびTriac がヒトTR−αまたはヒトTR−βに対する結合について
標識化T3と競合する、競合アッセイを例示するグラフである。
【図１７Ａ】 図17Ａは、TR−αに対する標識化T3のスキャッチャード分析を描写する。
【図１７Ｂ】 図17Ｂは、TR−βに対する標識化T3のスキャッチャード分析を描写する。
【図１８】 図18は、TRAF11リポーター細胞中でアッセイしたときの、T3存在または非存在
におけるTR4-ALP リポーター遺伝子の転写調節に対するTS-10 の作用を示すチャ
ートである。
【図１９】 図19は、TRAF91リポーター細胞中でアッセイしたときの、T3存在または非存在
におけるTR4-ALP リポーター遺伝子の転写調節に対するTS-10 の作用を示すチャ
ートである。
【図２０】 図20は、HepG2 、肝臓リポーター細胞系統中でアッセイしたときの、T3存在ま
たは非存在におけるTR4-ALP リポーター遺伝子の転写調節に対するTS-10 の作用
を示すチャートである。
【図２１】 図21は、リガンド結合キャビティ中のT3をもつTR−α LBDの部分的リボンの図
面である。選択された相互作用するアミノ酸は標識化されており、Ile221、Ile2
22およびSer260、Ala263、Ile299およびLeu276を包含する。
【図２２】 第22図は、リガンド結合キャビティ中で重ねられたT3およびDimit をもつTR−
α LBDの部分的リボンの図面である。Ile221、Ile222、Ala260、Ile299およびLe
u276との相互作用は標識化されている。
【図２３】 第23図は、T3をもつTR−α LBDの部分的リボンの図面であり、極性ポケットの
３つのアルギニン残基（Arg228、Arg262およびArg266（暗いスティックの図形))
、３つの水分子HOH502、HOH503およびHOH504を図解し、水素結合は点線で示され
ている。
【図２４】 第24図は、Triac をもつTR−α LBDの部分的リボンの図面であり、極性ポケッ
トの３つのアルギニン残基（暗いスティックの図形）、水分子（HOH503、HOH504
およびHOH600）を図解し、水素結合は点線で示されている。
【図２５】 第25図は、リガンド結合キャビティ中で重ねられたT3およびDimit をもつTR−
α LBDの部分的リボンの図面である。この図面は、T3またはTriac のどちらがリ
ガンド結合キャビティを占有しているかにかかわらず、未変化に止まる極性ポケ
ット中の、いくつかの相互作用するアミノ酸残基を示す：Arg262、Asn179、HOH5
03およびHOH504、およびSer277。Arg228およびArg266の双方は、T3またはTriac
のどちらが結合するかどうかに依存して、２つの異なる位置を占有する。
【図２６Ａ】 図26Ａは、結合したDimit をもつTR−α LBDの立体化学的表示である。
【図２６Ｂ】 図26Ｂは、結合したDimit をもつTR−α LBDの立体化学的表示である。
【図２７】 図27は、リガンド結合キャビティ中のGC-1をもつTR−α LBDの部分的リボンの
図面である。アミノ酸Arg282、Arg316、Arg320、Asn331およびHis435は標識化さ
れている。
【図２８】 図28は、リガンド結合キャビティ中のTriac をもつTR−α LBDの部分的リボン
の図面である。アミノ酸Arg282、Arg316、Arg320、Asn331およびHis435は標識化
されている。
【図２９】 図29は、リガンド結合キャビティ中においてDimit をもつTR−α LBD（赤色）
でオーバーレイされたGC-1をもつTR−β LBD（青色）の部分的リボンの図面であ
る。アミノ酸Arg222、Arg262、Arg266およびSer277（TR−α LBD）、およびArg2
82、Arg316、Arg320およびAsn331（TR−β LBD）は標識化されている。
【図３０】 図30は、リガンド結合キャビティ中においてTriac をもつTR−α LBD（赤色）
でオーバーレイされたTriac をもつTR−β LBD（青色）の部分的リボンの図面で
ある。アミノ酸Arg222、Arg262、Arg266、Ser277およびHis381（TR−α LBD）、
およびArg282、Arg316、Arg320およびHis435（TR−β LBD）は標識化されている
。
【図３１】 図31は、リガンド結合ドメイン中の単一のアミノ酸置換を有する変異型TR−β
に対して野生型TR−αおよびTR−βを比較する、競合曲線を示すグラフである。
【図３２】 図32は、サイロニン様リガンドについての原子のナンバリングを示す。
【手続補正書】
【提出日】平成１２年６月２９日（２０００．６．２９）
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２】
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３Ｍ
【補正方法】変更
【補正内容】
【図３Ｍ】
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３Ｒ
【補正方法】変更
【補正内容】
【図３Ｒ】
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１０】
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１１】
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１６
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１６】
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１７Ａ
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１７Ａ】
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１７Ｂ
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１７Ｂ】
【手続補正１１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２７
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２７】
【手続補正１２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２８
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２８】
【手続補正１３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２９
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２９】
【手続補正１４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３０
【補正方法】変更
【補正内容】
【図３０】
【手続補正１５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図３１】
【手続補正１６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図３２】
【手続補正１７】
【補正対象書類名】要約書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正内容】
【要約】 本発明は、核レセプター、特に甲状腺レセプター（TRと称する）の三次元構造
に基いて核レセプター合成リガンドの生成のための、新規な方法、特にコンピュ
ーターを用いる方法、及び組成物を提供する。さらに、結晶、核レセプター合成
リガンド、及び関連する方法も提供する。
【手続補正書】
【提出日】平成１２年８月１日（２０００．８．１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４４
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１４４】 リガンドが結合するとき再充填するアンリガンデッドTR中の拡張した構造に一
部分頼る、Ｃ末端の活性化ドメインにおけるリガンド誘導コンフォメーション変
化を予測することが可能である。回転中のラットTR−αのアミノ酸配列（配列番
号１の残基393-399;393-PTELFPP-399)はラットTR−αのペプチド鎖がα−らせん
を形成する傾向を有意に減少し、したがって再充填を小さい体積変化で達成する
ことができるので、リガンド誘導コンフォメーション変化は微妙であることがで
きる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６４
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２６４】 トランスフェクションのために、細胞をトリプシン処理し、緩衝液（PBS 、0.
1 ％のグルコース）中に再懸濁させ、緩衝液 (15±５×106 細胞）中でTREtkCAT
プラスミド(10mg)またはファージと混合し、0.33キロボルトおよび960mF におい
てBio-Rad 遺伝子パルサーを使用して電気泳動させる。CAT(tkCAT)コーディング
配列に連鎖した最小(-32/+45）チミジンキナーゼプロモーターから直ぐ上流のpU
C19 ポリリンカーのHindIII 部位においてクローニングされたT3応答因子（配列
番号17；AGGTCAcaggATGGTCA)の２コピーを、TREtkCATプラスミドは含有する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３Ａ
【補正方法】変更
【補正内容】
【図３Ａ】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 33/50 33/50 Ｚ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人 1111 Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｓｔｒｅｅｔ， 12ｔｈ Ｆｌｏｏｒ，Ｏａｋｌａｎｄ，Ｃ ａｌｉｆｏｒｎｉａ 94607−5200，Ｕｎ ｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒ ｉｃａ (72)発明者 バクスター，ジョン ディー． アメリカ合衆国，カリフォルニア 94127， サンフランシスコ，サン パブロ アベニ ュ 131 (72)発明者 フレテリック，ロバート ジェイ． アメリカ合衆国，カリフォルニア 94131， サンフランシスコ，クリストファー アベ ニュ 15 (72)発明者 ワグナー，リチャード エル． アメリカ合衆国，カリフォルニア 94117， サンフランシスコ，ウォーラー ストリー ト 1701 (72)発明者 クッシュナー，ピーター ジェイ． アメリカ合衆国，カリフォルニア 94122， サンフランシスコ，シックスス アベニュ 1362 (72)発明者 アプリレティ，ジェームズ ダブリュ． アメリカ合衆国，カリフォルニア 94702， バークレー，バージニア ガーデンズ 11 (72)発明者 ウエスト，ブライアン エル． アメリカ合衆国，カリフォルニア 94110， サンフランシスコ，アンダーソン ストリ ート 142 (72)発明者 シャウ，アンドリュー ケー． アメリカ合衆国，カリフォルニア 94122， サンフランシスコ，ヒューゴー ストリー ト 34 ＃３ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA36 DA56 DA77 JA01 JA04 4C206 DA21 FA33 FA44 MA04 ZA45 ZA70 ZC33 ZC42 4H045 AA10 AA20 AA30 DA50 EA50

Claims (60)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 それを必要とする哺乳動物に下記式の化合物投与することか
    らなる、甲状腺ホルモンレセプター(TR)の活性をモジュレートする方法： 【化１】 ここで前記化合物はTRリガンド結合ドメイン(TR LBD)の中に特異的かつ優先的
    に適合し、そして下記の置換基を含む： (i） R1置換基はヒトTR−αのArg228、Arg262およびArg266、およびヒトTR−
    βのArg282、Arg316およびArg320から成る群より選択される残基に対応するアル
    ギニンの側鎖窒素原子と相互作用するアニオン基からなり、そしてアニオン基は
    窒素原子から1.7 〜4.0 Åに存在する； (ii) R2置換基はTR LBDの中に特異的に適合する疎水性基または親水性基から
    なり、 (iii) R3置換基はヒトTR−αのSer260、Ala263およびIle299、およびヒトTR−
    βのSer314、Ala317およびIle352から成る群より選択される残基に対応するセリ
    ン、アラニンおよびイソロイシンの側鎖原子と相互作用する疎水性基または親水
    性基からなり、そして疎水性基または親水性基は側鎖原子から1.7 〜4.0 Åに存
    在する； (iv) R5置換基はヒトTR-IのPhe218、Ile221およびIle222、およびヒトTR−β
    のPhe272、Ile275およびIle276から成る群より選択される残基に対応するフェニ
    ルアラニンおよびイソロイシンの側鎖原子と相互作用する疎水性基または親水性
    基からなり、そして疎水性基または親水性基は側鎖原子から1.7 〜4.0 Åに存在
    する； (v) R6置換基はTR LBDの中に特異的に適合する疎水性基または親水性基から
    なり、 (vi) Ｘ置換基はヒトTR−αのLeu276およびLeu292、およびヒトTR−βのLeu3
    30およびLeu346から成る群より選択される残基に対応するロイシンの側鎖原子と
    相互作用する疎水性基または親水性基からなり、そして疎水性基または親水性基
    は側鎖原子から1.7 〜4.0 Åに存在する； (vii) R2' 置換基はTR LBDの中に特異的に適合する疎水性基または親水性基
    からなる； (viii) R3' 置換基はヒトTR−αのPhe215、Gly290およびMet388、およびヒト
    TR−βのPhe269、Gly344およびMet442から成る群より選択される残基に対応する
    フェニルアラニン、グリシンおよびメチオニンの側鎖原子と相互作用する疎水性
    基からなり、そして疎水性基は側鎖原子から1.7 〜4.0 Åに存在する； (ix) R4' 置換基はヒトTR−αのHis381、およびヒトTR−βのHis435から成る
    群より選択される残基に対応するヒスチジンの側鎖の炭素または窒素原子と相互
    作用する水素結合のドナーまたはアクセプターの基からなり、そして水素結合の
    ドナーまたはアクセプターの基は側鎖原子から1.7 〜4.0 Åに存在する； (x） R5' 置換基はTR LBDの中に特異的に適合する疎水性基または親水性基か
    らなる；および (xi) R6' 置換基はTR LBDの中に特異的に適合する疎水性基または親水性基か
    らなる； 前記化合物は付録１に引用されている参考文献に開示されているサイロニンま
    たはサイロニン様化合物以外であり、そして前記TRの活性はモジュレートされて
    いる。
  2. 【請求項２】 R1が-O-CH2CO2H、-NHCH2CO2H、-CO2H 、-CH2CO2H、-CH2CH2C
    O2H 、-CH2CH2CH2CO2H、-CH2CH(NH2)CO2H 、 -CH2CH[NHCOCHφ2]CO2H、-CH2CH[N
    HCO(CH2)15CH3]CO2H、-CH2CH[NH-FMOC]CO2H 、-CH2CH[NH-tBOC]CO2H 、または０
    〜３個の炭素原子のリンカーをもつ環に接続したカルボキシレート、-PO3H2、-C
    H2PO3H2 、-CH2CH2PO3H2、-CH2CHNH2PO3H2、 -CH2CH[NHCOCHφ2]PO3H2 、-CH2CH
    [NHCO(CH2)15CH3]PO3H2 、-CH2CH[NH-FMOC]PO3H2、-CH2CH[NH-tBOC]PO3H2、また
    は０〜３個の炭素原子のリンカーをもつ環に接続したホスフェートまたはホスホ
    ネート、-SO3H 、-CH2SO3H、-CH2CH2SO3H 、-CH2CHNH2SO3H 、 -CH2CH[NHCOCHφ 2 ]SO3H、-CH2CH[NHCO(CH2)15CH3]SO3H、-CH2CH[NH-FMOC]SO3H 、-CH2CH[NH-tBOC
    ]SO3H 、または０〜３個の炭素原子のリンカーをもつ環に接続したサルフェート
    またはサルファイトであるか、あるいはTRに結合したとき、分子の認識ドメイン
    においてCH2CH(NH2)CO2Hの機能的同等物として作用し、前記R1がアミンで必要に
    応じて置換することができ、 R2が-H、ハロゲン、-CF3、-OH 、-NH2、-SH 、-CH3、-Et であるか、あるいは
    TRに結合したとき、分子の認識ドメインにおいてＨの機能的同等物として作用し
    、 R3が-H、ハロゲン、-CF3、-OH 、-NH2、-N3 、-SH 、-CH3、-Et であるか、あ
    るいはTRに結合したとき、分子の認識ドメインにおいてＩの機能的同等物として
    作用し、 R5が-H、ハロゲン、-CF3、-OH 、-NH2、-N3 、-SH 、-CH3、-Et であるか、あ
    るいはTRに結合したとき、分子の認識ドメインにおいてＩの機能的同等物として
    作用し、そしてR3はR5と同一であることができ、 R6が-H、ハロゲン、-CF3、-OH 、-NH2、-SH 、-CH3であるか、あるいはTRに結
    合したとき、分子の認識ドメインにおいてＨの機能的同等物として作用し、そし
    てR2はR6と同一であることができ、 R2' が-H、ハロゲン、-CF3、-OH 、-NH2、-N3 、-SH 、-CH3、-Et であるか、
    あるいはTRに結合したとき、分子の認識ドメインにおいてＨの機能的同等物とし
    て作用し、 R3' が任意の疎水性基であり、ハロゲン、-CF3、-SH 、アルキル、アリール、
    ５または６員のヘテロサイクル、シアノを包含するか、あるいはTRに結合したと
    き、分子の認識ドメインにおいてＩの機能的同等物として作用し、 R4' が-H、ハロゲン、-CF3、-OH 、-NH2、-NH3、-N(CH3)3、カルボキシレート
    、ホスホネート、ホスフェートまたはサルフェート、-SH 、-CH3、-Et 、または
    アルキル、アリールであるか、あるいはR4' 位においてＯまたはＮまたはＳに尿
    素またはカルバメート結合を通して結合した５または６員の複素環式芳香族基で
    あるか、あるいはTRに結合したとき、分子の認識ドメインにおいてOHの機能的同
    等物として作用し、 R5' が-H、-OH 、-NH2、-N(CH3)2、-SH 、-NH3、-N(CH3)3、カルボキシレート
    、ホスホネート、ホスフェート、サルフェート、１〜９個の炭素原子を有する分
    枝鎖状もしくは直鎖状アルキル、置換もしくは非置換のアリール（前記置換アリ
    ールはハロゲンまたは１〜５個の炭素原子のアルキルで置換されており、そして
    前記アリールは-CH2- により環に接続されていてもよい）、５〜６個の原子を有
    する芳香族ヘテロサイクル（前記ヘテロサイクルは-OH 、-NH2、-SH 、-NH3、-N
    (CH3)3、カルボキシレート、ホスホネート、ホスフェートまたはサルフェートか
    ら選択される１または２以上の基で置換されることができる）、ヘテロアルキル
    、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ポリ芳香族、またはポリヘテロ
    芳香族であり、前記R5' は極性または帯電した基で置換されることができ、 R6' が-H、ハロゲン、-CF3、-OH 、-NH2、-SH 、-CH3、-Et であるか、あるい
    はTRに結合したとき、分子の認識ドメインにおいてＨの機能的同等物として作用
    し、 ＸがＯ、Ｓ、SO2 、NH、NR7 、CH2 、CHR7、CR7R7 であり、ここでR7はアルキ
    ル、アリールまたは５または６員の複素環式芳香族であり、そして 前記TR LBDリガンドが１またはそれより小さい結合するTR LBDについての見掛
    けのKdを有する、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 R1がカルボキシレート、ホスフェート、ホスホネートまたは
    サルファイトであり、そして０〜３個の炭素原子のリンカーをもつ環に接続して
    おり、 R2が-Hであり、 R3が-I、-Br 、または-CH3であり、 R5が-I、-Br 、または-CH3であり、 R6が-Hであり、 R2' が-Hであり、 R3' が-I、-Br 、-CH3、-iPr、−フェニル、ベンジル、または５または６員の
    ヘテロサイクルであり、 R4' が-OH 、-NH2、および-SH であり、 R5' が-H、-OH 、-NH2、-N(CH3)2、-SH 、-NH3、-N(CH3)3、カルボキシレート
    、ホスホネート、ホスフェート、サルフェート、１〜９個の炭素原子を有する分
    枝鎖状もしくは直鎖状アルキル、置換もしくは非置換のアリール（前記置換アリ
    ールはハロゲンまたは１〜５個の炭素原子のアルキルで置換されており、そして
    前記アリールは-CH2- により環に接続されていてもよい）、５〜６個の原子を有
    する芳香族ヘテロサイクル（前記ヘテロサイクルは-OH 、-NH2、-SH 、-NH3、-N
    (CH3)3、カルボキシレート、ホスホネート、ホスフェートまたはサルフェートか
    ら選択される１または２以上の基で置換されることができる）、ヘテロアルキル
    、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ポリ芳香族、またはポリヘテロ
    芳香族であり、前記R5' は極性または帯電した基で置換されることができ、そし
    て R6' が-Hである、 請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記化合物がTR LBDイソ型α(TR-α）の中に特異的かつ優先
    的に適合する、請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記化合物がヒトTR−αのSer277に対応するセリン残基の側
    鎖の酸素または炭素と相互作用するアニオン基からなり、そしてアニオン基が側
    鎖原子から1.7 〜4.0 Åに存在する、請求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記化合物がTR LBDイソ型β(TR-β）の中に特異的かつ優先
    的に適合する、請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記化合物がヒトTR−βのAsn331に対応するアルギニンの側
    鎖の窒素原子と相互作用するアニオン基からなり、そしてアニオン基が側鎖原子
    から1.7 〜4.0 Åに存在する、請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】 工程： 被験化合物に結合したTR LBDイソ型の原子構造モデルを使用して問題のTRリガ
    ンド結合ドメイン(TR LBD)イソ型の中に特異的かつ優先的に適合する被験化合物
    をモデリングし、 バイオアッセイにおいて、TR LBDイソ型に被験化合物を結合することによって
    特徴づけられるTRイソ型の活性について、被験化合物をスクリーニングし、そし
    て TRイソ型の活性を選択的にモジュレートする被験化合物を同定する、 からなる、甲状腺ホルモンレセプター(TR)イソ型の活性を選択的にモジュレート
    することができる化合物を同定する方法。
  9. 【請求項９】 前記化合物が下記式を有する、請求項８に記載の方法： 【化２】 ここで前記化合物は下記の置換基を含む： (i） R1置換基はヒトTR−αのArg228、Arg262およびArg266、およびヒトTR−
    βのArg282、Arg316およびArg320から成る群より選択される残基に対応するアル
    ギニンの側鎖窒素原子と相互作用するアニオン基からなり、そしてアニオン基は
    窒素原子から1.7 〜4.0 Åに存在する； (ii) R2置換基はTR LBDの中に特異的に適合する疎水性基または親水性基から
    なる； (iii）R3置換基はヒトTR−αのSer260、Ala263およびIle299、およびヒトTR−
    βのSer314、Ala317およびIle352から成る群より選択される残基に対応するセリ
    ン、アラニンおよびイソロイシンの側鎖原子と相互作用する疎水性基または親水
    性基からなり、そして疎水性基または親水性基は側鎖原子から1.7 〜4.0 Åに存
    在する； (iv) R5置換基はヒトTR−αのPhe218、Ile221およびIle222、およびヒトTR−
    βのPhe272、Ile275およびIle276から成る群より選択される残基に対応するフェ
    ニルアラニンおよびイソロイシンの側鎖原子と相互作用する疎水性基または親水
    性基からなり、そして疎水性基または親水性基は側鎖原子から1.7 〜4.0 Åに存
    在する； (v） R6置換基はTR LBDの中に特異的に適合する疎水性基または親水性基から
    なる； (vi) Ｘ置換基はヒトTR−αのLeu276およびLeu292、およびヒトTR−βのLeu3
    30およびLeu346から成る群より選択される残基に対応するロイシンの側鎖原子と
    相互作用する疎水性基または親水性基からなり、そして疎水性基または親水性基
    は側鎖原子から1.7 〜4.0 Åに存在する； (vii） R2' 置換基はTR LBDの中に特異的に適合する疎水性基または親水性基
    からなる； (viii) R3' 置換基はヒトTR−αのPhe215、Gly290およびMet388、およびヒト
    TR−βのPhe269、Gly344およびMet442から成る群より選択される残基に対応する
    フェニルアラニン、グリシンおよびメチオニンの側鎖原子と相互作用する疎水性
    基からなり、そして疎水性基は側鎖原子から1.7 〜4.0 Åに存在する； (ix) R4' 置換基はヒトTR−αのHis381、およびヒトTR−βのHis435から成る
    群より選択される残基に対応するヒスチジンの側鎖の炭素または窒素原子と相互
    作用する水素結合のドナーまたはアクセプターの基からなり、そして水素結合の
    ドナーまたはアクセプターの基は側鎖原子から1.7 〜4.0 Åに存在する； (x） R5' 置換基はTR LBDの中に特異的に適合する疎水性基または親水性基か
    らなる；および (xi) R6' 置換基はTR LBDの中に特異的に適合する疎水性基または親水性基か
    らなる。
  10. 【請求項１０】 R1が-O-CH2CO2H、-NHCH2CO2H、-CO2H 、-CH2CO2H、-CH2CH 2 CO2H 、-CH2CH2CH2CO2H、-CH2CH(NH2)CO2H 、 -CH2CH[NHCOCHφ2]CO2H、-CH2CH
    [NHCO(CH2)15CH3]CO2H、-CH2CH[NH-FMOC]CO2H 、-CH2CH[NH-tBOC]CO2H 、または
    ０〜３個の炭素原子のリンカーをもつ環に接続したカルボキシレート、-PO3H2、
    -CH3PO3H2 、-CH2CH2PO3H2、-CH2CHNH2PO3H2、 -CH2CH[NHCOCHφ2]PO3H2 、-CH2 CH[NHCO(CH2)15CH3]PO3H2 、-CH2CH[NH-FMOC]PO3H2、-CH2CH[NH-tBOC]PO3H2、ま
    たは０〜３個の炭素原子のリンカーをもつ環に接続したホスフェートまたはホス
    ホネート、-SO3H 、-CH2SO3H、-CH2CH2SO3H 、-CH2CHNH2SO3H 、 -CH2CH[NHCOCH
    φ2]SO3H、-CH2CH[NHCO(CH2)15CH3]SO3H、-CH2CH[NH-FMOC]SO3H 、-CH2CH[NH-tB
    OC]SO3H 、または０〜３個の炭素原子のリンカーをもつ環に接続したサルフェー
    トまたはサルファイトであるか、あるいはTRに結合したとき、分子の認識ドメイ
    ンにおいてCH2CH(NH2)CO2Hの機能的同等物として作用し、前記R1がアミンで必要
    に応じて置換することができ、 R2が-H、ハロゲン、-CF3、-OH 、-NH2、-SH 、-CH3、-Et であるか、あるいは
    TRに結合したとき、分子の認識ドメインにおいてＨの機能的同等物として作用し
    、 R3が-H、ハロゲン、-CF3、-OH 、-NH2、-N3 、-SH 、-CH3、-Et であるか、あ
    るいはTRに結合したとき、分子の認識ドメインにおいてＩの機能的同等物として
    作用し、 R5が-H、ハロゲン、-CF3、-OH 、-NH2、-N3 、-SH 、-CH3、-Et であるか、あ
    るいはTRに結合したとき、分子の認識ドメインにおいてＩの機能的同等物として
    作用し、そしてR3はR5と同一であることができ、 R6が-H、ハロゲン、-CF3、-OH 、-NH2、-SH 、-CH3であるか、あるいはTRに結
    合したとき、分子の認識ドメインにおいてＨの機能的同等物として作用し、そし
    てR2はR6と同一であることができ、 R2' が-H、ハロゲン、-CF3、-OH 、-NH2、-N3 、-SH 、-CH3、-Et であるか、
    あるいはTRに結合したとき、分子の認識ドメインにおいてＨの機能的同等物とし
    て作用し、 R3' が任意の疎水性基であり、ハロゲン、-CF3、-SH 、アルキル、アリール、
    ５または６員のヘテロサイクル、シアノを包含するか、あるいはTRに結合したと
    き、分子の認識ドメインにおいてＩの機能的同等物として作用し、 R4' が-H、ハロゲン、-CF3、-OH 、-NH2、-NH3、-N(CH3)3、カルボキシレート
    、ホスホネート、ホスフェートまたはサルフェート、-SH 、-CH3、-Et 、または
    アルキル、アリールであるか、あるいはR4' 位においてＯまたはＮまたはＳに尿
    素またはカルバメート結合を通して結合した５または６員の複素環式芳香族基で
    あるか、あるいはTRに結合したとき、分子の認識ドメインにおいてOHの機能的同
    等物として作用し、 R5' が-H、-OH 、-NH2、-N(CH3)2、-SH 、-NH3、-N(CH3)3、カルボキシレート
    、ホスホネート、ホスフェート、サルフェート、１〜９個の炭素原子を有する分
    枝鎖状もしくは直鎖状アルキル、置換もしくは非置換のアリール（前記置換アリ
    ールはハロゲンまたは１〜５個の炭素原子のアルキルで置換されており、そして
    前記アリールは-CH2- により環に接続されていてもよい）、５〜６個の原子を有
    する芳香族ヘテロサイクル（前記ヘテロサイクルは-OH 、-NH2、-SH 、-NH3、-N
    (CH3)3、カルボキシレート、ホスホネート、ホスフェートまたはサルフェートか
    ら選択される１または２以上の基で置換されることができる）、ヘテロアルキル
    、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ポリ芳香族、またはポリヘテロ
    芳香族であり、前記R5' は極性または帯電した基で置換されることができ、 R6' が-H、ハロゲン、-CF3、-OH 、-NH2、-SH 、-CH3、-Et であるか、あるい
    はTRに結合したとき、分子の認識ドメインにおいてＨの機能的同等物として作用
    し、 ＸがＯ、Ｓ、SO2 、NH、NR7 、CH2 、CHR7、CR7R7 であり、ここでR7はアルキ
    ル、アリールまたは５または６員の複素環式芳香族であり、そして 前記TR LBDリガンドが１またはそれより小さい結合するTR LBDについての見掛
    けのKdを有する、請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 R1がカルボキシレート、ホスフェート、ホスホネートまた
    はサルファイトであり、そして０〜３個の炭素原子のリンカーをもつ環に接続し
    ており、 R2が-Hであり、 R3が-I、-Br 、または-CH3であり、 R5が-I、-Br 、または-CH3であり、 R6が-Hであり、 R2' が-Hであり、 R3' が-I、-Br 、-CH3、-iPr、−フェニル、ベンジル、または５または６員の
    ヘテロサイクルであり、 R4' が-OH 、-NH2、および-SH であり、 R5' が-H、-OH 、-NH2、-N(CH3)2、-SH 、-NH3、-N(CH3)3、カルボキシレート
    、ホスホネート、ホスフェート、サルフェート、１〜９個の炭素原子を有する分
    枝鎖状もしくは直鎖状アルキル、置換もしくは非置換のアリール（前記置換アリ
    ールはハロゲンまたは１〜５個の炭素原子のアルキルで置換されており、そして
    前記アリールは-CH2- により環に接続されていてもよい）、５〜６個の原子を有
    する芳香族ヘテロサイクル（前記ヘテロサイクルは-OH 、-NH2、-SH 、-NH3、-N
    (CH3)3、カルボキシレート、ホスホネート、ホスフェートまたはサルフェートか
    ら選択される１または２以上の基で置換されることができる）、ヘテロアルキル
    、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ポリ芳香族、またはポリヘテロ
    芳香族であり、前記R5' は極性または帯電した基で置換されることができ、そし
    て R6' が-Hである、 請求項10に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記化合物がTR LBDイソ型α(TR-α）の中に特異的かつ優
    先的に適合する、請求項８に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記化合物がヒトTR−αのSer277に対応するセリン残基の
    側鎖の酸素または炭素と相互作用するアニオン基からなり、そしてアニオン基が
    側鎖原子から1.7 〜4.0 Åに存在する、請求項12に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記化合物がTR LBDイソ型β(TR-β）の中に特異的かつ優
    先的に適合する、請求項８に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記化合物がヒトTR−βのAsn331に対応するアルギニンの
    側鎖の窒素原子と相互作用するアニオン基からなり、そしてアニオン基が側鎖原
    子から1.7 〜4.0 Åに存在する、請求項14に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 サイロニンまたはトリヨードサイロニンより大きいアフィ
    ニティーを有するTR LBDイソ型に前記化合物が結合する、請求項８に記載の方法
    。
  17. 【請求項１７】 工程： コンピューター化されたモデリング系へのTRリガンド結合ドメイン（TR LBD）
    の原子の配位を形成し、 TR LBDの中に特異的に適合するリガンドをモデリングし、そして バイオアッセイにおいて、TR活性を増加または減少するリガンドをTR活性につ
    いて同定し、これによりTRのアゴニストまたはアンタゴニストを同定する、 からなる、甲状腺ホルモンレセプター(TR)のアゴニストまたはアンタゴニストの
    リガンドを同定する方法。
  18. 【請求項１８】 請求項８または17に記載の方法により同定され、ただし付
    録１に引用されている参考文献に開示されているサイロニンまたはサイロニン様
    化合物以外である、ペプチド、ペプチド模倣物または合成の分子。
  19. 【請求項１９】 工程： TR LBDの原子構造モデルを使用して、TRリガンド結合ドメイン（TR LBD）の中
    に特異的に適合する化合物をモデリングし、 TR LBDのコンフォメーション的に拘束された残基と相互作用する、コンフォメ
    ーション的に拘束された構造の特徴からなる化合物を選択し、そして バイオアッセイにおいて、他の核レセプターに比較してTR LBDに選択的に結合
    する化合物をTR活性について選択し、これによりTRを選択的にモジュレートする
    化合物を同定する、 からなる、他の核ホルモンレセプターに比較して甲状腺ホルモンレセプター(TR)
    の活性を選択的にモジュレートする化合物を同定する方法。
  20. 【請求項２０】 TR LBDの前記コンフォメーション的に拘束された残基がヒ
    トTR−αの残基Met259、Leu276、Leu292、His381、Gly290、Ile221およびPhe401
    、およびヒトTR−βの残基Met313、Leu330、Leu346、His435、Gly344、Ile275お
    よびPhe455に対応する、請求項19に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記化合物が下記式を有する、請求項19に記載の方法： 【化３】 ここで前記化合物は下記の置換基を含む： (i） R1置換基はヒトTR−αのArg228、Arg262およびArg266、およびヒトTR−
    βのArg282、Arg316およびArg320から成る群より選択される残基に対応するアル
    ギニンの側鎖窒素原子と相互作用するアニオン基からなり、そしてアニオン基は
    窒素原子から1.7 〜4.0 Åに存在する； (ii) R2置換基はTR LBDの中に特異的に適合する疎水性基または親水性基から
    なる； (iii）R3置換基はヒトTR−αのSer260、Ala263およびIle299、およびヒトTR−
    βのSer314、Ala317およびIle352から成る群より選択される残基に対応するセリ
    ン、アラニンおよびイソロイシンの側鎖原子と相互作用する疎水性基または親水
    性基からなり、そして疎水性基または親水性基は側鎖原子から1.7 〜4.0 Åに存
    在する； (iv) R5置換基はヒトTR−αのPhe218、Ile221およびIle222、およびヒトTR−
    βのPhe272、Ile275およびIle276から成る群より選択される残基に対応するフェ
    ニルアラニンおよびイソロイシンの側鎖原子と相互作用する疎水性基または親水
    性基からなり、そして疎水性基または親水性基は側鎖原子から1.7 〜4.0 Åに存
    在する； (v） R6置換基はTR LBDの中に特異的に適合する疎水性基または親水性基から
    なる； (vi) Ｘ置換基はヒトTR−αのLeu276およびLeu292、およびヒトTR−βのLeu3
    30およびLeu346から成る群より選択される残基に対応するロイシンの側鎖原子と
    相互作用する疎水性基または親水性基からなり、そして疎水性基または親水性基
    は側鎖原子から1.7 〜4.0 Åに存在する； (vii） R2' 置換基はTR LBDの中に特異的に適合する疎水性基または親水性基
    からなる； (viii) R3' 置換基はヒトTR−αのPhe215、Gly290およびMet388、およびヒト
    TR−βのPhe269、Gly344およびMet442から成る群より選択される残基に対応する
    フェニルアラニン、グリシンおよびメチオニンの側鎖原子と相互作用する疎水性
    基からなり、そして疎水性基は側鎖原子から1.7 〜4.0 Åに存在する； (ix) R4' 置換基はヒトTR−αのHis381、およびヒトTR−βのHis435から成る
    群より選択される残基に対応するヒスチジンの側鎖の炭素または窒素原子と相互
    作用する水素結合のドナーまたはアクセプターの基からなり、そして水素結合の
    ドナーまたはアクセプターの基は側鎖原子から1.7 〜4.0 Åに存在する； (x） R5' 置換基はTR LBDの中に特異的に適合する疎水性基または親水性基か
    らなる；および (xi) R6' 置換基はTR LBDの中に特異的に適合する疎水性基または親水性基か
    らなる。
  22. 【請求項２２】 前記化合物が下記の原子および置換基を含む、請求項19に
    記載の方法： (i） ヒトTR−αのMet259、およびヒトTR−βのMet313に対応するメチオニン
    残基の炭素および酸素原子と相互作用する環炭素原子、ここで環炭素原子はメチ
    オニンの炭素および酸素原子から約3.0 〜4.0 Åに存在する； (ii) ヒトTR−αのLeu276、およびヒトTR−βのLeu330に対応するロイシン残
    基の炭素原子と相互作用する環炭素原子、ここで環炭素原子はロイシンの炭素原
    子から約3.0 〜4.0 Åに存在する； (iii）ヒトTR−αのLeu292、およびヒトTR−βのLeu346に対応するロイシン残
    基の炭素原子と相互作用する環炭素原子、ここで環炭素原子はロイシンの炭素原
    子から約3.0 〜4.0 Åに存在する； (iv) ヒトTR−αのIle221、およびヒトTR−βのIle275に対応するイソロイシ
    ン残基の炭素原子と相互作用するR3置換基、ここでR3置換基はイソロイシンの炭
    素原子から約3.0 〜4.0 Åに存在する； (v） ヒトTR−αのGly290、およびヒトTR−βのGly344に対応するグリシン残
    基の酸素原子と相互作用するR3' 置換基、ここでR3' 置換基はグリシンの酸素原
    子から約3.0 〜4.0 Åに存在する；および (vi) (a）ヒトTR−αのHis381、およびヒトTR−βのHis435に対応するヒスチ
    ジン残基の酸素および窒素原子と相互作用するR4' 置換基、ここでR4' 置換基は
    ヒスチジンの酸素および窒素原子から約2.0 〜4.0 Åに存在する；および(b）ヒ
    トTR−αのPhe401、およびヒトTR−βのPhe455に対応するフェニルアラニン残基
    の炭素原子、ここで前記原子はフェニルアラニンの炭素原子から約3.0 〜4.0 Å
    に存在する。
  23. 【請求項２３】 R1が-O-CH2CO2H、-NHCH2CO2H、-CO2H 、-CH2CO2H、-CH2CH 2 CO2H 、-CH2CH2CH2CO2H、-CH2CH(NH2)CO2H 、 -CH2CH[NHCOCHφ2]CO2H、-CH2CH
    [NHCO(CH2)15CH3]CO2H、-CH2CH[NH-FMOC]CO2H 、-CH2CH[NH-tBOC]CO2H 、または
    ０〜３個の炭素原子のリンカーをもつ環に接続したカルボキシレート、-PO3H2、
    -CH2PO3H2 、-CH2CH2PO3H2、-CH2CHNH2PO3H2、 -CH2CH[NHCOCHφ2]PO3H2 、-CH2 CH[NHCO(CH2)15CH3]PO3H2 、-CH2CH[NH-FMOC]PO3H2、-CH2CH[NH-tBOC]PO3H2、ま
    たは０〜３個の炭素原子のリンカーをもつ環に接続したホスフェートまたはホス
    ホネート、-SO3H 、-CH2SO3H、-CH2CH2SO3H 、-CH2CHNH2SO3H 、 -CH2CH[NHCOCH
    φ2]SO3H、-CH2CH[NHCO(CH2)15CH3]SO3H、-CH2CH[NH-FMOC]SO3H 、-CH2CH[NH-tB
    OC]SO3H 、または０〜３個の炭素原子のリンカーをもつ環に接続したサルフェー
    トまたはサルファイトであるか、あるいはTRに結合したとき、分子の認識ドメイ
    ンにおいてCH2CH(NH2)CO2Hの機能的同等物として作用し、前記R1がアミンで必要
    に応じて置換することができ、 R2が-H、ハロゲン、-CF3、-OH 、-NH2、-SH 、-CH3、-Et であるか、あるいは
    TRに結合したとき、分子の認識ドメインにおいてＨの機能的同等物として作用し
    、 R3が-H、ハロゲン、-CF3、-OH 、-NH2、-N3 、-SH 、-CH3、-Et であるか、あ
    るいはTRに結合したとき、分子の認識ドメインにおいてＩの機能的同等物として
    作用し、 R5が-H、ハロゲン、-CF3、-OH 、-NH2、-N3 、-SH 、-CH3、-Et であるか、あ
    るいはTRに結合したとき、分子の認識ドメインにおいてＩの機能的同等物として
    作用し、そしてR3はR5と同一であることができ、 R6が-H、ハロゲン、-CF3、-OH 、-NH2、-SH 、-CH3であるか、あるいはTRに結
    合したとき、分子の認識ドメインにおいてＨの機能的同等物として作用し、そし
    てR2はR6と同一であることができ、 R2' が-H、ハロゲン、-CF3、-OH 、-NH2、-N3 、-SH 、-CH3、-Et であるか、
    あるいはTRに結合したとき、分子の認識ドメインにおいてＨの機能的同等物とし
    て作用し、 R3' が任意の疎水性基であり、ハロゲン、-CF3、-SH 、アルキル、アリール、
    ５または６員のヘテロサイクル、シアノを包含するか、あるいはTRに結合したと
    き、分子の認識ドメインにおいてＩの機能的同等物として作用し、 R4' が-H、ハロゲン、-CF3、-OH 、-NH2、-NH3、-N(CH3)3、カルボキシレート
    、ホスホネート、ホスフェートまたはサルフェート、-SH 、-CH3、-Et 、または
    アルキル、アリールであるか、あるいはR4' 位においてＯまたはＮまたはＳに尿
    素またはカルバメート結合を通して結合した５または６員の複素環式芳香族基で
    あるか、あるいはTRに結合したとき、分子の認識ドメインにおいてOHの機能的同
    等物として作用し、 R5' が-H、-OH 、-NH2、-N(CH3)2、-SH 、-NH3、-N(CH3)3、カルボキシレート
    、ホスホネート、ホスフェート、サルフェート、１〜９個の炭素原子を有する分
    枝鎖状もしくは直鎖状アルキル、置換もしくは非置換のアリール（前記置換アリ
    ールはハロゲンまたは１〜５個の炭素原子のアルキルで置換されており、そして
    前記アリールは-CH2- により環に接続されていてもよい）、５〜６個の原子を有
    する芳香族ヘテロサイクル（前記ヘテロサイクルは-OH 、-NH2、-SH 、-NH3、-N
    (CH3)3、カルボキシレート、ホスホネート、ホスフェートまたはサルフェートか
    ら選択される１または２以上の基で置換されることができる）、ヘテロアルキル
    、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ポリ芳香族、またはポリヘテロ
    芳香族であり、前記R5' は極性または帯電した基で置換されることができ、 R6' が-H、ハロゲン、-CF3、-OH 、-NH2、-SH 、-CH3、-Et であるか、あるい
    はTRに結合したとき、分子の認識ドメインにおいてＨの機能的同等物として作用
    し、 ＸがＯ、Ｓ、SO2 、NH、NR7 、CH2 、CHR7、CR7R7 であり、ここでR7はアルキ
    ル、アリールまたは５または６員の複素環式芳香族であり、そして 前記TR LBDリガンドが１またはそれより小さい結合するTR LBDについての見掛
    けのKdを有する、請求項21記載の方法。
  24. 【請求項２４】 R1がカルボキシレート、ホスフェート、ホスホネートまた
    はサルファイトであり、そして０〜３個の炭素原子のリンカーをもつ環に接続し
    ており、 R2が-Hであり、 R3が-I、-Br 、または-CH3であり、 R5が-I、-Br 、または-CH3であり、 R6が-Hであり、 R2' が-Hであり、 R3' が-I、-Br 、-CH3、-iPr、−フェニル、ベンジル、または５または６員の
    ヘテロサイクルであり、 R4' が-OH 、-NH2、および-SH であり、 R5' が-H、-OH 、-NH2、-N(CH3)2、-SH 、-NH3、-N(CH3)3、カルボキシレート
    、ホスホネート、ホスフェート、サルフェート、１〜９個の炭素原子を有する分
    枝鎖状もしくは直鎖状アルキル、置換もしくは非置換のアリール（前記置換アリ
    ールはハロゲンまたは１〜５個の炭素原子のアルキルで置換されており、そして
    前記アリールは-CH2- により環に接続されていてもよい）、５〜６個の原子を有
    する芳香族ヘテロサイクル（前記ヘテロサイクルは-OH 、-NH2、-SH 、-NH3、-N
    (CH3)3、カルボキシレート、ホスホネート、ホスフェートまたはサルフェートか
    ら選択される１または２以上の基で置換されることができる）、ヘテロアルキル
    、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ポリ芳香族、またはポリヘテロ
    芳香族であり、前記R5' は極性または帯電した基で置換されることができ、そし
    て R6' が-Hである、 請求項23に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記化合物がTR LBDイソ型α(TR-α）の中に特異的かつ優
    先的に適合する、請求項19に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 前記化合物がヒトTR−αのSer277に対応するセリン残基の
    側鎖の酸素または炭素と相互作用するアニオン基からなり、そしてアニオン基が
    側鎖原子から1.7 〜4.0 Åに存在する、請求項25に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 前記化合物がTR LBDイソ型β(TR-β）の中に特異的かつ優
    先的に適合する、請求項19に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 前記化合物がヒトTR−βのAsn331に対応するアルギニンの
    側鎖の窒素原子と相互作用するアニオン基からなり、そしてアニオン基が側鎖原
    子から1.7 〜4.0 Åに存在する、請求項27に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 サイロニンまたはトリヨードサイロニンより大きいアフィ
    ニティーを有するTR LBDイソ型に前記化合物が結合する、請求項19に記載の方法
    。
  30. 【請求項３０】 前記化合物がヒトTR−ＩのMet259、およびヒトTR−βのMe
    t313に対応するメチオニン残基の炭素および酸素原子と相互作用する環炭素原子
    を含み、ここで環炭素原子はメチオニンの炭素および酸素原子から約3.0 〜4.0
    Åに存在する、請求項１に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 前記環炭素原子が内側の環の炭素C11 である、請求項30に
    記載の方法。
  32. 【請求項３２】 前記化合物がヒトTR−αのLeu276、およびヒトTR−βのLe
    u330に対応するロイシン残基の炭素原子と相互作用する環炭素原子を含み、ここ
    で環炭素原子はロイシンの炭素原子から約3.0 〜4.0 Åに存在する、請求項１に
    記載の方法。
  33. 【請求項３３】 前記環炭素原子が内側の環の炭素C7およびC9である、請求
    項32に記載の方法。
  34. 【請求項３４】 前記化合物がヒトTR−αのLeu292、およびヒトTR−βのLe
    u346に対応するロイシン残基の炭素原子と相互作用する環炭素原子を含み、ここ
    で環炭素原子はロイシンの炭素原子から約3.0 〜4.0 Åに存在する、請求項１に
    記載の方法。
  35. 【請求項３５】 前記環炭素原子が内側の環の炭素C6およびC8である、請求
    項34に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 前記R3置換基がヒトTR−αのIle221、およびヒトTR−βの
    Ile275に対応するイソロイシン残基の炭素原子と相互作用する原子を含み、ここ
    でR3置換基の原子はイソロイシンの炭素原子から約3.0 〜4.0 Åに存在する、請
    求項１に記載の方法。
  37. 【請求項３７】 前記R3' 置換基がヒトTR−αのGly290、およびヒトTR−β
    のGly344に対応するグリシン残基の酸素原子と相互作用する原子を含み、ここで
    R3' 置換基の原子はグリシンの炭素原子から約3.0 〜4.0 Åに存在する、請求項
    １に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 前記R4' 置換基がヒトTR−αのHis381、およびヒトTR−β
    のHis435に対応するヒスチジン残基の炭素および窒素原子と相互作用する酸素お
    よび炭素から成る群より選択される原子を含み、ここでR4' 置換基の原子はヒス
    チジンの炭素原子から約3.0 〜4.0 Åに存在する、請求項１に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 前記R4' 置換基がヒトTR−αのPhe401、およびヒトTR−β
    のPhe455に対応するフェニルアラニン残基の炭素原子と相互作用する酸素原子を
    含み、ここで前記原子はフェニルアラニンの炭素原子から約3.0 〜4.0 Åに存在
    する、請求項１に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 工程： コンピューター化されたモデリング系へのTRリガンド結合ドメイン（TR LBD）
    の原子の配位を形成し、 TR LBDの中に特異的に適合しかつTRイソ型の中に保存されるTR LBDのコンフォ
    メーション的に拘束された残基と相互作用するリガンドをモデリングし、そして バイオアッセイにおいて、前記TRに選択的に結合しかつ前記TRの活性を増加ま
    たは減少するリガンドをTR活性について同定し、これによりTRの活性を選択的モ
    ジュレートするTRのアゴニストまたはアンタゴニストを同定する、 からなる、他の核レセプターに比較してTRの活性を選択的にモジュレートする甲
    状腺ホルモンレセプター(TR)のアゴニストまたはアンタゴニストのリガンドを同
    定する方法。
  41. 【請求項４１】 請求項19または40に記載の方法により同定され、ただし付
    録１に引用されている参考文献に開示されているサイロニンまたはサイロニン様
    化合物以外である、ペプチド、ペプチド模倣物または合成の分子。
  42. 【請求項４２】 機械読取り可能なデータでコードされたデータ記憶材料か
    らなり、前記データを使用するインストラクションでプログラミングされた機械
    を使用するとき、前記データ記憶材料は、甲状腺ホルモンリガンド結合ポケット
    のための分子または分子複合体のグラフ的三次元表示をディスプレイすることが
    でき、前記結合ポケットはヒトTR−αのアミノ酸Met259、Leu276、およびIle221
    に対応するTR−αアミノ酸の構造配位、または前記分子または分子複合体の相同
    体からなり、ここで前記相同体は1.5 Å以下の前記アミノ酸のバックボーン原子
    からの二乗平均偏差を有する結合ポケットからなる、機械読取り可能なデータの
    記憶媒体。
  43. 【請求項４３】 機械読取り可能なデータでコードされたデータ記憶材料か
    らなり、前記データを使用するインストラクションでプログラミングされた機械
    を使用するとき、前記データ記憶材料は、甲状腺ホルモンリガンド結合ポケット
    のための分子または分子複合体のグラフ的三次元表示をディスプレイすることが
    でき、前記結合ポケットはヒトTR−αのアミノ酸Leu292、His381、Gly290および
    Phe401に対応するTR−αアミノ酸の構造配位、または前記分子または分子複合体
    の相同体からなり、ここで前記相同体は1.5 Å以下の前記アミノ酸のバックボー
    ン原子からの二乗平均偏差を有する結合ポケットからなる、機械読取り可能なデ
    ータの記憶媒体。
  44. 【請求項４４】 前記結合ポケットがヒトTR−αアミノ酸Met259、Leu276、
    Leu292、His381、Gly290、Ile221およびPhe401に対応するTR−αアミノ酸の構造
    配位からなる、請求項42または43に記載の機械読取り可能な記憶媒体。
  45. 【請求項４５】 前記結合ポケットがヒトTR−αアミノ酸Arg228、Arg262お
    よびArg266に対応するTR−αアミノ酸の構造配位からなる、請求項44に記載の機
    械読取り可能な記憶媒体。
  46. 【請求項４６】 前記結合ポケットがヒトTR−αアミノ酸Ser260、Ala263お
    よびIle299に対応するTR−αアミノ酸の構造配位からなる、請求項44に記載の機
    械読取り可能な記憶媒体。
  47. 【請求項４７】 前記結合ポケットがヒトTR−αアミノ酸Phe218、Ile221お
    よびIle222に対応するTR−αアミノ酸の構造配位からなる、請求項44に記載の機
    械読取り可能な記憶媒体。
  48. 【請求項４８】 前記結合ポケットがヒトTR−αアミノ酸Phe215、Gly290お
    よびMet388に対応するTR−αアミノ酸の構造配位からなる、請求項44に記載の機
    械読取り可能な記憶媒体。
  49. 【請求項４９】 前記結合ポケットがヒトTR−αアミノ酸Ser277に対応する
    TR−αアミノ酸の構造配位からなる、請求項44に記載の機械読取り可能な記憶媒
    体。
  50. 【請求項５０】 機械読取り可能なデータでコードされたデータ記憶材料か
    らなり、前記データを使用するインストラクションでプログラミングされた機械
    を使用するとき、前記データ記憶材料は、甲状腺ホルモンリガンド結合ポケット
    のための分子または分子複合体のグラフ的三次元表示をディスプレイすることが
    でき、前記結合ポケットはヒトTR−βのアミノ酸Met313、Leu330、およびIle275
    に対応するTR−βアミノ酸の構造配位、または前記分子または分子複合体の相同
    体からなり、ここで前記相同体は1.5 Å以下の前記アミノ酸のバックボーン原子
    からの二乗平均偏差を有する結合ポケットからなる、機械読取り可能なデータの
    記憶媒体。
  51. 【請求項５１】 機械読取り可能なデータでコードされたデータ記憶材料か
    らなり、前記データを使用するインストラクションでプログラミングされた機械
    を使用するとき、前記データ記憶材料は、甲状腺ホルモンリガンド結合ポケット
    のための分子または分子複合体のグラフ的三次元表示をディスプレイすることが
    でき、前記結合ポケットはヒトTR−βのアミノ酸Leu346、His435、Gly344および
    Phe455に対応するTR−βアミノ酸の構造配位、または前記分子または分子複合体
    の相同体からなり、ここで前記相同体は1.5 Å以下の前記アミノ酸のバックボー
    ン原子からの二乗平均偏差を有する結合ポケットからなる、機械読取り可能なデ
    ータの記憶媒体。
  52. 【請求項５２】 前記結合ポケットがヒトTR−βアミノ酸Met313、Leu330、
    Leu346、His435、Gly344、Ile275およびPhe455に対応するTR−βアミノ酸の構造
    配位からなる、請求項50または51に記載の機械読取り可能な記憶媒体。
  53. 【請求項５３】 前記結合ポケットがヒトTR−βアミノ酸Arg282、Arg316お
    よびArg320に対応するTR−βアミノ酸の構造配位からなる、請求項52に記載の機
    械読取り可能な記憶媒体。
  54. 【請求項５４】 前記結合ポケットがヒトTR−βアミノ酸Ser314、Ala317お
    よびIle352に対応するTR−βアミノ酸の構造配位からなる、請求項52に記載の機
    械読取り可能な記憶媒体。
  55. 【請求項５５】 前記結合ポケットがヒトTR−βアミノ酸Phe272、Ile275お
    よびIle276に対応するTR−βアミノ酸の構造配位からなる、請求項52に記載の機
    械読取り可能な記憶媒体。
  56. 【請求項５６】 前記結合ポケットがヒトTR−βアミノ酸Phe269、Gly344お
    よびMet442に対応するTR−βアミノ酸の構造配位をさらに含む、請求項52に記載
    の機械読取り可能な記憶媒体。
  57. 【請求項５７】 前記結合ポケットがヒトTR−βアミノ酸Asn331に対応する
    TR−βアミノ酸の構造配位からなる、請求項52に記載の機械読取り可能な記憶媒
    体。
  58. 【請求項５８】 前記分子または分子複合体が付録３、４、５および６に描
    写されている配位から成る群より選択される構造配位の組により規定されるか、
    あるいは前記分子または分子複合体の相同体であり、前記相同体が1.5 Å以下の
    前記アミノ酸のバックボーン原子からの二乗平均偏差を有する、請求項52に記載
    の機械読取り可能な記憶媒体。
  59. 【請求項５９】 前記分子または分子複合体が付録７および８に描写されて
    いる配位から成る群より選択される構造配位の組により規定されるか、あるいは
    前記分子または分子複合体の相同体であり、前記相同体が1.5 Å以下の前記アミ
    ノ酸のバックボーン原子からの二乗平均偏差を有する、請求項52に記載の機械読
    取り可能な記憶媒体。
  60. 【請求項６０】 第１組の機械読取り可能なデータでコードされたデータ記
    憶材料からなり、前記データ記憶材料は、第２組の機械読取り可能なデータと組
    み合わせ、前記第１組のデータおよび前記第２組のデータを使用するためのイン
    ストラクションでプログラミングされた機械を使用するとき、第２組の機械読取
    り可能なデータに対応する構造配位の少なくとも一部分を決定することができ、
    ここで：前記第１組のデータは付録３、４、５、６、７および８に詳述されてい
    る配位から成る群より選択される構造配位の少なくとも一部分のフーリエ変換か
    らなり、そして前記第２組のデータは分子または分子複合体のＸ線回折図形から
    なる、機械読取り可能なデータの記憶媒体。
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