JP2001521941A - ウイルス汚染に対する安全性の高いフィブリンのり形成用成分をヒト血漿プールから製造する方法 - Google Patents
ウイルス汚染に対する安全性の高いフィブリンのり形成用成分をヒト血漿プールから製造する方法Info
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Abstract
Description
びフィブロネクチンからなる第1成分と、第1成分と同じヒト血漿プールに由来
するトロンビン濃縮物からなる第2成分とを含有し、ウイルス汚染に対する安全
性の高い生体組織接着剤を製造するための方法に関する。より詳細には、上記製
造方法は3つのウイルス不活化工程、即ち、溶媒/界面活性剤処理、ナノフィル
トレーション(nanofiltration)及び熱処理の工程を包含する。
て活性化されたフィブリノーゲンより生成される、フィブリンからなる接着性タ
ンパク質の濃縮物である。重合したフィブリンのネットワークによる血餅の接着
力は昔から知られている。フィブリンは今世紀の初めから接着剤として使用され
ており、Bergelによって1909年に発見された。Bergelは、フィブリンが生理
学的接着性物質であることに気づき、更にフィブリンには治癒を促す特性がある
ことを見出した。この発見にひき続き、1915年におけるGreyの研究では、脳
や肝臓の出血を止めるためや脳外科手術にフィブリンタンポンを用いた。しかし
ながら、まずCronkiteが、続いてTidrickとWarnerが、皮膚移植を確実にするた めにフィブリノーゲンと共にトロンビンを用いたのは1944年にもなってのこ
とである。しかし、これらのタンパク質は低濃度であったので、良好な接着性が
得られず、効果も持続しなかった。1946年にE.J.Cohnによる血漿タンパク
質類の分画に関する重要な科学的研究がなされて以来、特に血液凝固タンパク質
類が接着剤として使用されるようになり、上記研究の数年後には血液凝固のメカ
ニズム及び主要な血液凝固タンパク質類、特にXIII因子が解明された。1975
年には、Matrasが、初めて高度に濃縮されたフィブリノーゲンを用いて、フィブ
リンの接着特性の利用に成功した。以来、生体組織接着剤は完全に合成のりに取
って代わり、ヒトの臨床分野においてますます多用されている。
長い間、縫合糸に加えて用いるかあるいは縫合糸に代えて用いることのできる効
果的で使いやすく、とりわけ容易に生体が許容する接着剤を捜し求めてきた。外
科用縫合糸は現在重要である。しかしながら、生体による拒絶又は毒性などの多
くの問題が発生している。血液は凝固特性が優れるので、常に外科医にとって生
体組織接着剤の理想的なモデルとなってきたが、ヒト由来の材料から調製された
生体組織接着剤の使用はウイルス感染の問題を引き起こす。ウイルス感染の危険
性は、血漿濃縮物の精製方法に大きく依存している。ヒトの臨床に使用するため
には、生体組織接着剤は、製品の品質に影響することなく過酷なウイルス不活化
処理をして調製されなければならない。以下の特性を併せ持つ接着剤の開発研究
は未だ継続中である。 −ウイルス汚染に対する高度な安全性 −十分な接着性 −良好な弾力性 −隣接組織との良好な親和性 −無毒性 −代謝されずに機能すること −生体による許容度が良好であること
e Biotech Corp.)には、フィブリノーゲン、XIII因子及びフィブロネクチンの 濃縮物を治療目的で調製及び利用するための方法が開示されている。
縮物は、臨床医にとって、止血特性が非常に必要とされる外科手術のための貴重
で効果的な道具となっている。臨床応用の分野としては、神経外科、心臓血管外
科、形成外科(皮膚移植)、ORL(耳鼻咽喉)外科、口腔病学、整形外科、一
般外科及び外傷外科が挙げられる。
ノーゲンは、トロンビンとカルシウムイオンの存在下で起きる酵素反応によって
、フィブリンモノマーを形成させるフィブリノペプチドA及びBを生成する。こ
れらのモノマーは急速に重合し可溶性フィブリンとなる。その後、カルシウムイ
オンの作用により、フィブリン安定化因子(XIII因子)が溶解したフィブリンと
共有結合を形成してフィブリンを安定化し、酸性溶媒中又は尿素の存在下でも不
溶となる。
的で)安定であり、血液凝固薬としての役割を十分に発揮する。フィブリンは、
プラスミノーゲンを含まないフィブリノーゲンが高濃度で集合しているために、
線溶に対して耐性を示し、浸出が起きないので形態を維持する。この濃縮物は、
以下の特性を有している:水溶液に再び溶解後の良好な安定性、室温において数
分で溶解する性質、良好な弾力性、そして良好な接着性である。
速な方法であり、工業的生産に容易に適応可能である。生物学的、生化学的濃縮
物は全て保存され、それらの製品は臨床的要求を満たす。
来の製品には常にウイルス感染の問題がつきまとう。血液由来の安全な製品を提
供するもっとも確実な方法は、適当な技術を用いて、血漿製品の生化学的特性を
損ねることなく、存在する恐れのあるウイルスを周到なやり方で不活化すること
である。ウイルスの性質や単離するタンパク質のタイプに応じてウイルスを不活
化する多くの方法が現在知られており、それはこの点に関する科学的刊行物の量
の増大にも反映されている。
凝固因子類の濃縮物である。1948年にGellis等は、初めて、アルブミン調製
物を60℃で10時間加熱処理することによってウイルスを不活化する方法を用
いた。それ以来、ウイルス感染の危険性を減少させることに関する効力が立証さ
れているためにこの方法が一般に用いられている。同様の方法が免疫グロブリン
G類(IgG)の調製にも適用されており、同様の効果を示している。得られる
効果は、これらの血液製品の精製方法に依存しており、特にCohn、又はKistier とNitschmannの発表した完全な分画方法の使用に依存している。
ルス量を異なる画分に配分させる。エタノールは、Henin等(1988年)及びM
orgenthaler(1989年)が記載しているように、ウイルスなどの病原体に対 する殺菌剤として知られている。
しながら、この技術は、肝炎ウイルス(B型及び非A非B型肝炎ウイルス)を不
活化するための方法であった。Curran等(1984年)は、輸血、又は他の血液
由来物質、特に血液凝固因子類の使用によるHIVタイプのウイルス感染に関す
る問題を提示した。それ以来、ウイルスの不活化方法はHIVに焦点が当てられ
てた。アルブミンやIgG類の使用においてHIVの感染は認められず、これは
、低温殺菌の結果であるとされている(Mitra等(1986年))。VIII因子やI
X因子などの血液凝固因子類は血友病患者に広く用いられている。Heimburger等 (1980年)は、VIII因子を調製する際に、ウイルスを不活化するために、ア
ルブミンに用いられているのと同じ低温殺菌法を適用し、グリシンとショ糖の存
在下で殺菌することによって、60℃で10時間の熱変性条件下におけるタンパ
ク質の変性を防止した。彼らの研究は、HIVやB型及び非A非B型肝炎ウイル
スの不活化に効力を発揮することを記載している。Hilfenhaus等(1985年、
1986年)は、VIII因子濃縮物の調製において低温殺菌法がHIVのようなウ
イルスを不活化するのに効率的な方法であることを確認した。Tabor等(198 2年)は、安定化剤としてのクエン酸の存在下でアンチトロンビンIIIを加熱処 理することによってB型肝炎ウイルスを不活化した。Hollinger等(1984年 )は、HIVや肝炎ウイルスの感染の危険性を減少させるためにVIII因子濃縮物
を、凍結乾燥した状態で加熱した。Piszkiewicz等(1988年)は、凍結乾燥 した血液凝固因子類の濃縮物の加熱処理は、これらの因子類の活性に重大な影響
は与えないことを記載している。上記の著者等は、加熱処理による新生抗原の産
生がみられなかったことを強調した。加熱処理によるウイルスの不活化に関する
研究は、Piszkiewicz等によって“抗血友病因子類”(Hemofil T及びHemofil CT
(Hemofilは登録商標))の調製、及び抗凝血物質インヒビター複合体類(Autop
lex T(Autoplexは登録商標))やIX因子複合体(Proplex SX-T及びProplex T(
Proplexは登録商標))の調製について行われ、抗血友病因子類の調製について は、60℃で72時間加熱し、抗凝血物質インヒビター複合体類やIX因子複合体
の調製については60℃で144時間加熱した。上記5つの熱処理された血液凝
固因子製品の使用によるHIVセロコンバージョンに関する報告はなされていな
い。サルの研究においては、HBsAgや抗HBcについてスクリーニングされ
た血漿由来のHemofil T濃縮物は、NANBHに感染していないことが認められ ている。しかしながら、HBsAgについてのみスクリーニングされた血漿由来
の同じ製品の使用は、患者にNANBHをもたらした(Colombo等、1985年 )。Hemofil Tは、HBsAgに反応せず、正常ALTレベルにある血漿から一 般に大量生産されている。
安定でより高い耐熱性を示す。タンパク質の変性を最小にするための温度や加熱
時間は、タンパク質の性質によって異なる。しかしながら、完全なウイルスの不
活化に関する報告は未だ存在しない。NANBH感染についてはColombo等によ って報告され、HIV感染についてはWhite等(1986年)及びVan den Berg 等(1986年)によって報告されている。こうした理由により、Winkelman等 (1985年)は、VIII因子(8Y型)、IX因子(9A型)、VII因子、XI因子 及びトロンビンからなる濃縮物を80℃で72時間加熱した。これらの熱処理さ
れた製品を施された29人の患者について行われた研究においてHIVやHBの
セロコンバージョンが認められず、NANBH感染の発生の有意な減少が認めら
れたことを示している。
活化するための方法が開発されており、以下の参考文献を引用することができる
。Oliphant et al., Homologous serum jaundice: experimental inactivation
of etiologic agent in serum by ultraviolet irradiation (Publ. Health Rep
1946; 61: 598-600). Wolf et al., Ultraviolet irradiation of human plasm
a to control homologous serum jaundice (JAMA 1947; 135: 476-477). Blanch
ard et al., Methods of protection against homologous serum hepatitis. II
. The inactivation of hepatitis virus serum with ultraviolet rays (JAMA
1948; 138: 341). Murray et al., Effect of ultraviolet radiation on the i
nfectivity of icterogenic plasma (JAMA 1955; 157: 8-14). Gurzadyan et al
., Mechanism of high power picosecond laser UV irradiation of viruses an
d bacterial plasmids (Photochem. Photobiol. 1981; 3: 835-838). Redfield
et al., Psoralen inactivation of influenza and herpes simplex virus and
of viral infected cells (Infect Immun 1981; 32: 1216-1226). Heindrich et
al., Clinical evaluation of the hepatitis safety of beta-propiolactone-
ultraviolet treated factor IX concentrate (PPBS) (Throm. Res. 1982; 28:
75). Kitchen et al., Effect of gamma irradiation of the human immunodefi
ciency virus and human coagulation proteins (Vox Sang. 1989; 56: 233-229
).
的に用いられている方法の1つは、溶媒と界面活性剤を組み合わせて使用する方
法である。この方法は、NeurathとHorowitzによって開発された(1985年9 月に発行された米国特許第4,540,573号、1988年8月に発行された米
国特許第4,613,501号及び第4,764,369号、1989年4月に発行
された米国特許第4,820,805号、1989年6月に発行された米国特許第
4,841,023号、及び1996年7月に発行された米国特許第5,541,2
94号参照)。溶媒/界面活性剤(トリ−n−ブチルフォスフェート/界面活性
剤)混合物は、HIV、HTLV−1、HBV及びEBVなどのエンベロープを
もつウイルスを概して不活化する。
をもたないパルボウイルスやポリオウイルスが存在することから、溶媒/界面活
性剤法は安全な血漿製品類を提供するには十分ではない。溶媒/界面活性剤の効
果がない、エンベロープをもたないウイルスを除去するために別の技術が最近導
入されてきている。その技術はナノフィルトレーションである。ナノフィルター
は、微孔性ファイバーで構成され、“Planova BMM”という商品名(日本国、東 京、旭化成工業社製)で販売されている。このフィルターの孔径は約15〜35
nmと様々である。これらのフィルターは約25nmよりも大きなサイズを有す
る特定のタイプのウイルスを保持することができる。こららのフィルターは、H
IV−1(80〜100nm)、HBB(42nm)、HCV(<80nm)、
デルタ型肝炎ウイルス(35nm)、ウシウイルス性下痢ウイルス(60〜70
nm)、シンドビスウイルス(60〜70nm)、3型レオウイルス(60〜8
0nm)、セイビン1型ポリオウイルス(25〜30nm)、及びヒトパルボウ
イルス(20〜25nm)などのウイルスの除去に有効である。参考文献: Sek
iguchi et al., Possibility of hepatite B virus (HBV) removal from human
plasma using regenerated cellulose hollow fiber (BMM) (Membrane 1989; 14
: 253-261); Hamamoto et al., A novel method for removal of human immunod
eficiency virus: filtration with porous polymeric membranes (Vox Sang. 1
989; 56: 230-236); Tsurumi et al., Structure of cuprammonium regenerated
cellulose hollow fiber (BMM hollow fiber) for virus removal (Polym. J.
1990; 22: 751-758); Ishikawa et al., Novel determination method of size
of virus in solution using cuprammonium regenerated cellulose membrane (
BMM) (Membrane 1991; 16: 101-111); Tomokiyo et al., Studies on virus eli
mination and inactivation effect of highly purified F-VIII concentrate (
The clinical report 1991; 25: 271-275); Manabe, Virus removal and inacti
vation in process validation (Animal Cell Technology: Basic & Applied As
pects) (Murakami, H., Shirahata, S. 及び Tachibana, H. 編集, 1992; 15-30
); Burnouf et al., Strategy of virus removal/inactivation of plasma-deri
ved products: Interest of nanofiltration as a new virus elimination meth
od (manuscript submitted to JAACT 93).
00℃で30分間加熱するというVIII因子濃縮物の2段階ウイルス不活化法を用
いた。この著者等によると、最終製品の熱処理は、脂質エンベロープをもたない
非A非B型肝炎ウイルスを不活化させる。最終製品の熱処理は、操作中又は装置
による偶発的なウイルス汚染に対する予防処置でもある(Vox Sang. 1991; 60:
60)。
燥製品の100℃、1時間の熱処理(米国特許第5,506,127号(権利者:
Haemacure Biotech Inc.))。
組織接着剤の使用における安全性を増大させている。
いるための3工程からなるウイルス不活化方法については誰も開示していない。
又、ウイルス不活化工程を用いることは、血液由来製品の生産工程に更に多くの
工程を追加することによって有用な製品の収率の減少を生じさせることも意味し
ている。依然として、ウイルス汚染に対する安全性や製品の品質を犠牲にするこ
となく血液由来製品の収率を向上させたり、製品の収率や性質を犠牲にすること
なく製品の安全性を向上させる余地がある。
織接着剤成分の調製方法が提供される。
可能なタンパク質濃縮物の調製方法であって、タンパク質濃縮物が含むタンパク
質成分は実質的にフィブリノーゲン、内因性XIII因子及びフィブロネクチンから
なり、以下の工程(a)〜(l)を包含することを特徴とする調製方法を提供す
ることである。 (a)血漿中の全血漿タンパク質に対して行なう沈殿工程であって、約0℃〜
4℃の温度において塩析効果及び約7.5〜8.5へのpH調整効果を果たすの
に充分な量の塩類を血漿に加えるか、又は温度が約4℃〜20℃でpHが約4.
5〜5.5の条件下において酸性沈殿物を得るのに充分な量の塩類を血漿に加え
、その際該工程を50mM以上のアミノ−6−ヘキサン酸の存在下で行って、フ
ィブリノーゲン、内因性XIII因子及びフィブロネクチンを選択的に沈殿させる; (b)沈殿せしめたタンパク質類を、1gのタンパク質類に対して約0.2〜
0.3gのL−ヒスチジンの存在下において可溶化して溶解し該タンパク質類を
含む溶液を得る工程; (c)殺ウイルス剤となる溶媒/界面活性剤溶液を用いて、工程(b)で得ら
れた溶液中のウイルスを不活化する工程; (d)孔径約35nmのフィルターを用いて濾過する際に該タンパク質類の実
質的な損失がないように、該溶液の界面活性剤濃度を調整する工程; (e)工程(d)で得られた溶液を孔径約35nmのフィルターを用いて濾過
する工程;この工程により2回目のウイルス除去工程が提供される; (f)工程(a)で用いたのと同じ塩類を用い、工程(a)と同様の温度条件
及びアミノ−6−ヘキサン酸濃度において、工程(e)で濾過して得た溶液から
沈殿物を得る工程; (g)工程(f)で得られた沈殿物のpHが中性になるまで該沈殿物を洗浄す
る工程; (h)工程(g)で洗浄した沈殿物を、該沈殿物に含まれるタンパク質1gに
対して約0.2〜0.4gのL−ヒスチジンの存在下において可溶化して溶解す
る工程; (i)工程(h)で溶解した沈殿物に含まれるタンパク質の量に対応する量の
タンパク質安定化剤を、溶解した沈殿物に加えてタンパク質溶液を得る工程; (j)工程(i)で得たタンパク質溶液を濾過滅菌に付して滅菌濾液を得る工
程; (k)滅菌済のビンに工程(j)で得た滅菌濾液を分注する工程;及び (l)工程(k)で分注した滅菌濾液を凍結乾燥して凍結乾燥されたタンパク
質濃縮物を得る工程。
られた凍結乾燥製品を、更に、約100℃において約1〜2時間の乾熱処理に付
す工程を包含する。
ク質、1%のポリオキシエチレンソルビタンモノオレート、及び0.3%のトリ
−n−ブチルフォスフェート(いずれも終濃度)からなる溶液を、約24±1℃
において、約6時間の連続攪拌に付すことによって行う。
ルビタンモノオレートを使う。
リウム、リン酸一ナトリウム塩、リン酸二ナトリウム塩、リン酸一カリウム塩及
びリン酸二カリウム塩からなる群より選ばれる塩類である。工程(a)及び(f
)の工程は少なくとも30分行う。工程(g)は約2℃〜20℃で行う。
る工程、及び(g.ii)上記(g.i)で得た溶解した沈澱物を透析もしくは透析濾 過に付す工程を包含し;工程(h)においては、透析又は透析濾過した沈澱物に
、タンパク質1gに対して終濃度が約0.2〜0.3gとなるようにL−ヒスチ
ジン添加する。
性の純水は、純水を用いて調製した0.1〜0.5%のTris溶液である。
いて調製した0.1%のTris−HCl溶液であって、pHが4.5〜5.0
又は9.50〜10.50である溶液を用いる。
び1.6%のクエン酸ナトリウムからなるpH6〜7.3又はpH9.5〜10
.5の溶液を用い、L−ヒスチジンを添加する前のタンパク質濃度を約20〜2
2mg/mlとする。
の0.5%Tris溶液を用い、L−ヒスチジンを添加する前のタンパク質濃度
を約17〜20mg/mlとする。
れ添加後の濃度が約0.5g/gタンパク質、約0.05g/gタンパク質、及
び17〜20μg/mgタンパク質となるように包含するタンパク質安定化剤を
用いる。
て手動による攪拌を伴う条件下において、5分以内に水に可溶化して溶解し、溶
解タンパク質濃縮物を生じ、該溶解タンパク質濃縮物は、約4〜20℃の温度に
おいて少なくとも24時間は安定である。
動物由来の全血漿タンパク質である。
安定性に優れた治療学的品質のトロンビン組成物の大量生産を行なうための製造
方法であって、以下の工程(a)〜(i)を包含することを特徴とする製造方法
を提供することである。 (a)請求項1の方法の工程(a)で得られる上清を回収する工程; (b)低塩濃度溶液または塩を含まない溶液を交換しながら、該低塩濃度溶液
または塩を含まない溶液に対して該上清の透析濾過を行なう工程; (c)透析濾過した上清を、約100 mosmoles/kg以下の値を示すプロトロン
ビン溶液となるように希釈する工程; (d)該プロトロンビン溶液に、プロトロンビン溶液のpHが約5.2になる
まで酸性溶液を加えてプロトロンビンを沈殿化する工程; (e)工程(d)で生じた沈澱物を、pHが中性付近の溶液中に可溶化して溶
解する工程; (f)工程(e)で得た溶液中のプロトロンビンを、塩化カルシウムを含む希
釈液を用いて、約20〜30mMの塩化カルシウムの存在下でトロンビンに変換
する工程; (g)溶媒/界面活性剤溶液を殺ウイルス剤として用い、脂質含有ウイルスを
不活化するのに充分な量の溶媒/界面活性剤溶液と該トロンビンとをインキュベ
ートする工程; (h)イオン交換クロマトグラフィーを逐次用いてインキュベートしたトロン
ビンを精製する工程であって、スルホアルキル−活性化ポリアガロース、スルホ
アルキル−活性化ポリデキストラン、及びスルホアルキル−活性化デキストリン
とシリカ粒子からなる非圧縮性複合担体(noncompressible composite medium)
からなる群より選ばれる、トロンビンに対して高い選択性を示す1つのスルホア
ルキル−活性化ポリサッカリド−陽イオン交換体を用い、溶出剤としては、少な
くとも3種類の、溶出剤濃度を増加した水系緩衝液を用いる;及び (i)工程(h)のクロマトグラフィーによって得た溶出液のトロンビン溶出
ピーク部分を回収し、該溶出液の緩衝液を、回収したトロンビンを安定化するた
めの生理的に許容可能な安定化処方緩衝液(stabilizing formulation buffer)
に交換し、該トロンビンを含有する処方緩衝液を回収する工程。
の約4倍の量の水溶液を用いる。
容量の約4倍の量の40mMの塩化カルシウム溶液を希釈液として該溶解した沈
殿物に添加する。
なる非圧縮性複合担体である。
性化デキストリンとシリカ粒子からなるものである。溶出剤濃度を増加した緩衝
液は、実質的に約0.08M、0.15M及び0.4MのNaClを含むヒトト
ロンビン用緩衝液である。
化処方緩衝液を、該安定化処方緩衝液中に存在するウイルス粒子を除去するため
に銅アンモニウムセルロースからなる中空糸膜で濾過し、そして実質的にウイル
ス粒子を含まないトロンビン含有処方緩衝液を回収することを包含する。
mである。
した後に、更に凍結乾燥と乾熱処理を行なって、トロンビンを変性させずに残留
ウイルス粒子を不活化することを包含する。
て該乾熱処理を行なう。
安定化するのに充分な量のクエン酸塩、塩化ナトリウム、Tris−HCl及び
血漿アルブミンを含有する、pH約7.3の水溶液である。
リウムと、約0.45w/v%の塩化ナトリウムと、約0.25w/v%のTr
is−HClと、トロンビン溶出ピーク中の総タンパク質の約20倍に相当する
量であり、凍結乾燥前のトロンビン溶液において2w/v%となる量の血漿アル
ブミンとを含有する、pH約7.3の水溶液である。
安全性の両方について、工業的要件を全て満たすことにある。
らによって何ら限定されるものではない。
ン酸の濃度が少なくとも50mMとなるように攪拌下(under agitation)で加 える。得られた混合物を35〜37℃で最低15分間インキューベートする。そ
の後、得られた混合物を0℃±2℃まで冷却する。一塩基酸のリン酸ナトリウム
又はリン酸カリウム(Haemacure Biotech Inc.に発行された米国特許第5,29 0,918号);あるいは酢酸ナトリウム又は酢酸カリウム(Haemacure Biotech
Inc.に発行された米国特許第5,395,923号)を加えて終濃度を1Mとす る。得られた混合物を約0〜4℃±2℃で、約0.5〜1時間攪拌する。リン酸
塩類を用いた酸性沈殿処理を室温(約20℃)で行っても良い。
(Beckman J6-MC、 4.2型ローター)。上清をトロンビン調製のために回収し、沈
殿物を他のビーカーに移す。上清は後の工程に直ちに回してもよいし、又は−3
0℃より低温、好ましくは−80℃より低温で何ヶ月も保存してもよいし、又は
2℃〜4℃で約24時間保存しても良い。
、1%のTrisと1.6%のクエン酸ナトリウムを含む緩衝液(pH6.0±
0.1(pH7.3でもよい))で可溶化して溶解させる。沈殿物の可溶化は攪
拌下に室温で行なう。上記の緩衝液は約20〜22mg/mlのタンパク質濃度
を得るのに必要とされるだけ加える。この時点で、L−ヒスチジンをタンパク質
1g当たり0.2〜0.3gの割合で加える。次に、タンパク質溶液を約4℃で
20分間10,000rpmで遠心分離する(Beckman J2-MI、 JA-10型ローター
)。タンパク質溶液の表面に浮遊する脂質層を取り除く。タンパク質溶液を静か
にビーカーに移し、0.2ミクロンのカプセルフィルター(Gelman社製、SuporC
ap、 製品番号 12991又は12992)を用いて濾過する。
酸ナトリウム、2%のTween80(Tweenは登録商標)(ポリオキシエ
チレン ソルビタン モノオレエート)と0.6%のトリn−ブチルフォスフェー
ト(TnBP)を含む溶液(pH6.8±0.1)の同容量と混合することによ
りウイルス不活化処理を行なう。これにより、最終濃度はタンパク質が10mg
/ml、Tween80が1%、TnBPが0.3%となり、最終的なpHは7
.0±0.2となる。この溶液を、24℃±1℃で継続的に攪拌しながら少なく
とも6時間インキュベートする。
2%〜4%になるように、1%のTris、1.6%のクエン酸ナトリウム、6
%のTween80を含む緩衝液(pH7.0±0.1)を用いて調整する。得
られた混合物を0.2ミクロン及び0.1ミクロンのカスケードカプセルフィル
ター(Gelman社製、CritiCap 0.2μ、 製品番号 12995又は12996; CritiCap 0.1 μ 製品番号 12997又は12999)で濾過し、濾過した溶液をPlanova BMMフィルタ ー35nmでさらに濾過する。フィブリノーゲンのような高分子量の分子の濾過
を容易にし、また、その回収率を最適化するために、Tween80を加えるこ
とが必要である。Tween80を添加しないと、タンパク量が多いためにフィ
ルターはすぐに詰まってしまう。
約1時間35℃±2℃でインキュベートし、その後0℃±2℃に冷却する。上記
混合物1リットル当たり1モルに相当する一塩基酸のリン酸ナトリウム又はリン
酸カリウム(Haemacure Biotech Inc.に発行された米国特許第5,290,918
号)、あるいは酢酸ナトリウム又は酢酸カリウム(Haemacure Biotech Inc.に発行 された米国特許第5,395,923号)を上記混合物に加えると、沈殿物が即座
に現れる。攪拌を0℃±2℃で1時間続ける。
-MC、 4.2型ローター)で遠心分離する。溶媒と界面活性剤、不純物タンパク質を
遠心分離で除去する。沈殿物を回収してビーカーに移す。
1)で洗浄する。上記の沈殿工程に使用された塩類に応じて、溶液を中性にする
ためのTris緩衝液のpHを4.5〜5.0の範囲内或いは9.5〜10.5
の範囲内(濃度は0.1〜0.5%)で選択する。各洗浄操作の後に沈殿物を遠
心で分離する。Tris緩衝液は前もって0℃±2℃に冷却しておき、洗浄工程
は0℃±2℃で行なう。室温で洗浄工程を行なっても良好な結果が得られる。沈
殿物を最終的な緩衝液(pH7.3に塩基性化した水溶液を用る)中に戻した後
に単純な透析又は透析濾過を行うことで、洗浄の回数を減らすことができる。
ン酸ナトリウムを含む最終緩衝液(pH6.8±0.1(pH7.3でもよい)
)に溶解させる。緩衝液の容量は計量した沈殿物1gにつき約2〜3mlである
。沈殿物の可溶化は37℃に加熱することで促進される。完全な可溶化・溶解の
後、出発血漿1リットル当たり0.2〜0.3gに相当する量のL−ヒスチジン
を加える。そして、タンパク質溶液を濾過するか、または約4℃で20分間10
,000rpmで遠心する(Beckman J2-MI、 JA-10型ローター)。
最終工程を示すものである。
に調整する。タンパク質濃度はO.D.280nmで測定する。
質1g当たり0.2〜0.4g、好ましくは0.4gとなるように調整する。
]−加えたL−ヒスチジン0.2〜0.3g/血漿 1リットル]
ョ糖を加える。
量のヒトアルブミン(25%溶液、人体への使用が承認されたPlasbumin 25(Pl
asbuminは登録商標)、Miles Inc.製、Pharmaceutical Division、IN 46515、US
A)を加える。
及び10%のTween80を含む緩衝液(pH6.8±0.1)を用いて、T
ween80の量をO.D.で測定したタンパク質1mg当たり17〜20μgに
調整する。Tween80の濃度はNew York Blood Centerの技術に従い、調整 前にO.D.620nmで検査・確認しなければならない。
itiCap 0.2μ、製品番号 12995又は12996)を用いて濾過する。
±5mgとなるように10mlバイアルに充填する。
凍結乾燥に付す。そして、温度を−40℃から22℃±2℃まで、0.02℃/
分の昇温速度で次第に上げて行く。この凍結乾燥によって製品の残留水分が1%
未満となり、その後の熱処理中の製品の変性を防ぐ。
プで封止する。そしてバイアルを、1996年4月に発行された米国特許第5, 506,127号に開示される方法に従い、約100℃±1℃で約1〜2時間の 乾熱処理による第3のウイルス不活化工程に付す。
A型肝炎ウイルスのような、小さくてエンベロープをもたないウイルスは熱処理
によって不活化する。回収率について予想される主要な問題は、ナノフィルトレ
ーション後のフィブリノーゲンをいかにして出来るだけ大量に得るかということ
である。Tween80の濃度を適宜調整してフィブリノーゲンのナノフィルタ
ーの通過を容易にすることによりこの問題を解決した。エンベロープをもたない
3型レオウイルスとSV40はナノフィルトレーションで除去する。従って、ウ
イルス不活化のための各工程が、ウイルスを除去するか不活化することによりウ
イルス汚染に対する安全性の高い製品を提供するという目的に貢献する。このこ
とは、3つの工程を組み合わせることにより、少なくともそれらの中の1つによ
ってウイルスの不活化又は捕捉を確実に行なえることを意味する。本発明の方法
を用いないと、上記の工程の1つ又は2つに抵抗力のあるウイルスが最終製品に
残り得る。
,290,918号及び米国特許第5,395,923号に報告されている回収率と
同等であり、これは、タンパク質類の活性を損なわずに、ウイルス汚染に対する
安全性を確実にできることを意味する。
れる血漿上清(実施例1におけるような)は、大量の塩類を含んでいる。血漿の
浸透圧モル濃度(osmolarity)は約2,200〜2,500 mOsm/kgである。該
上清に含まれるプロトロンビンを単離するためには、上記の大量の塩類を除去す
る必要がある。特に酸により血漿を沈殿させた場合には、血漿のイオン強度が低
くなければプロトロンビンを単離することができない。塩類の除去は、従来から
公知の手法である透析濾過によって行なう。上記の上清を透析濾過システム(Am
icon system社製、モデルDC10L、スパイラルカートリッジ付き)の貯槽(r
eservoir)に入れる。透析濾過の外液としては純水を用いる。血漿上清の容量に
対して平均で4倍容量の純水を用いて、血漿の浸透圧モル濃度が約50〜100
mOsm/kgとなるまで透析濾過を行なう。
〜7.8の間である。希釈血漿に酢酸溶液(2%〜5%;Allary et al., Ann.
pharmaceutiques francaises 48, 129-135, 1990)を滴下して、pHを5.2±
0.1まで下げる。pHの降下中に(およそpH5.5〜6.0で)プロトロン
ビンが沈殿しはじめ、pHが5.1〜5.3になったところで沈殿が完了する。
プロトロンビンはpHが6.0を越えたり塩濃度を上げると急速に再可溶化する
。血漿を室温で1時間静置してから、20℃で20分間、4,200rpmで遠
心する(Beckman J6MC、JS4.2型ローター)。沈殿物を回収して、2%のTri s−HCl緩衝液(pH7.5±0.1)(容量:血漿上清1リットルあたり1
20〜150 ml)に溶解する。プロトロンビンを、クロノメトリック定量法 (chronometric dosage)(Fibrometre Stago ST4-France)で定量する。プロト
ロンビンの回収率は血漿上清と出発血漿を基準として約90%であり、血漿1リ
ットルあたり750〜850単位のプロトロンビンを回収できることになる。
する。得られた混合物を室温で少なくとも約1時間静置してから、20℃におい
て4,200rpmで30分間遠心する(Beckman J6MC、JS4.2型ローター)。 トロンビンを含有する上清を回収し、0.2ミクロンフィルター(Gelman社製、
SuporCap、製品番号 12991または12992)で濾過する。プロトロンビンの変換に よって得られた粗トロンビン(crude thrombin)の活性は約110〜120NI
H単位/mlである。比活性は約25〜30NIH単位/mgタンパク質、即ち
、プロトロンビン1単位あたりトロンビン80〜100NIH単位である。全体
的なトロンビンの回収率は血漿上清1リットルあたり約60,000〜80,0 00NIH単位であり、これは例えば、米国特許第5,506,127号に記載の
方法によって得られる回収率の2倍である。
bozyme)(Stago reagents、Thrombozyme ref.00332)を用いて作製し、トロンボ
ザイム活性の測定には、NIH標準品、ロットJ(titer 310 NIH)を基準にし て行なった。プール血漿をトロンビン活性測定用のフィブリノーゲンの採取源と
して用いた。
ンの精製、濾過によるウイルス除去、トロンビン製品の調製、凍結乾燥、及び1
00℃での加熱によるウイルスの不活化をトロンビン溶液に順次行なうことによ
る、トロンビン溶液へのウイルス不活化処理の工程を示す。サーモスタットで2
4±0.5℃に調温された液循環システムを備えた二重壁構造のタンクに、トロ
ンビン溶液を入れる。0.5%のTris溶液を用いて調製した11%のTwe
en80と3.3%のトリ−n−ブチルフォスフェート(TnBP)の溶液(p
H7.0±0.1)を、緩やかに攪拌しながらトロンビン溶液に加える。トロン
ビンに添加した溶媒/界面活性剤溶液の容量はトロンビン溶液の10分の1であ
る。1時間攪拌した後、得られた混合物を第1のタンクと同様の第2のタンクに
移し、更に約5時間攪拌する。ウイルス不活化の後でトロンビン活性を測定する
と、(0〜5%の)溶媒/界面活性剤処理による大きな活性の低下は無かったこ
とが分かる。なお、プロトロンビンをトロンビンに変換する際に、溶液にして用
いるCaCl2の量にほぼ相当する固体のCaCl2をプロトロンビンに加えると
、粉末状のCaCl2を用いた場合で回収率が20%下がり、また、溶媒/界面 活性剤処理において約10〜15%の活性低下が起きることは、注目に値する。
カルシウムの粉末を添加した場合とCaCl2溶液を添加した場合とを全体的に 比較すると、前者ではトロンビン活性が約30%低下することになる。
製する。クロマトグラフィーによるタンパク質の精製は周知の技術であり、多く
の文献に詳細に記載されている。精製の目的やタンパク質の性質に応じて、異な
るマトリックス、即ち担体を使い分ける。本発明においては、担体としては、ス
ルホプロピル(-CH2−CH2-CH2-SO3)がグラフトされた硬質アガロース ゲルを用いる。SP Sepharose Fast Flow (商標)(Pharmacia社製、コード番号
17-0729-01)というゲルは、流動性に優れ、あらゆるpI値のタンパク質に対し
て高い交換容量(capacity)を有する。このゲルのイオン交換基は、pH4〜1
3の機能領域全体において電荷と高い交換容量を維持するスルホプロピルである
。SP Sepharoseを充填したカラムに、粗トロンビンを含むタンパク質溶液を流す
。トロンビンと不純物タンパク質(contaminating proteins)が支持体に吸着さ
れる。ゲルに吸着されたタンパク質を溶出する前に、0.08MのNaCl溶液
でゲルを充分に洗うことが必要である。トロンビンの溶出は、NaClの非連続
濃度勾配を用いて行なう。まず最初に0.15MのNaCl溶液をカラムに流し
て不純物タンパク質を除去する。次に0.4MのNaCl溶液でトロンビンを完
全に脱着して回収する。それからゲルを2MのNaCl溶液で洗浄して、ゲルに
吸着された不純物をすべて取り除く。クロマトグラフィーによるトロンビンの精
製で、その前のウイルス不活化工程で用いた溶媒/界面活性剤も除去できる。精
製されたトロンビン溶液にヒトアルブミン(25%のヒトアルブミン溶液、USP
Plasbumin 25、Miles Inc.製、Pharmaceutical Division、IN 46515、USA)を添
加して安定化する。添加すべきアルブミンの量は下記式で算出する。
ー後)× 100 ml〕/(25 × 1,000)
ンビンを急速に低温で保存しなかったり、又は、安定化処理をせずに透析濾過や
濃縮などの工程を行なうと、活性が大きく低下する場合がある。最終製品を処方
するための緩衝液交換を行なう際にトロンビン活性を保護するためにアルブミン
などの安定化剤を使用することが必要である(Amicon system CH2PRS又はTCF 10
の所要量を用いる)。最終処方に用いる緩衝液の組成は以下の通りである:0.
25%のTris、0.25%のクエン酸ナトリウム、0.45%のNaCl、
pH7.30±0.1。トロンビン溶液に対して約6倍容量の処方緩衝液を交換
する。交換する緩衝液の容量と透析濾過時間を低減するために、透析濾過の前に
トロンビン溶液を数倍に濃縮する。
い、透析濾過したトロンビン溶液を、孔径約15nmの銅アンモニア再生セルロ
ース繊維からなるPlanova BMM微多孔膜(BembergマイクロポーラスメンブランB
MMデベロップメント、旭化成工業社製、日本国、東京)などの中空糸膜を用い
て濾過する。この技術によると、上記のSD(溶媒/界面活性剤)処理では不活 化できない脂質エンベロープをもたないウイルスをほぼ完全に除去できる。
て、温度を−40℃から22±2℃まで、約0.02℃/分の昇温速度で次第に
上げていく。この工程によって残留水分が1%未満になる。
プで封止する。そしてバイアルを、約100±1℃で約1〜2時間の乾熱処理に
よる第3のウイルス不活化工程に付す。
号と米国特許第5,506,127号(いずれもHaemacure Biotech Incに与えら れた特許)に記載の方法を改善することができ、それによって安全性の高いトロ
ンビンの回収率を向上できることと、フィブリノーゲン回収率を犠牲にせずにフ
ィブリノーゲン濃縮物のウイルスに関する安全性を確実にできること、が本発明
によって示された。
い実施態様を改変できることは当業者には自明である。そのような改変は添付の
特許請求の範囲に規定される本発明の範囲内のものである。
II因子及びフィブロネクチンの濃縮物を調製するための工程を示すものである。
濃縮物の単離工程において残存する血漿上清から開始して、トロンビンを調製す
る工程を示すものである。
て活性化されたフィブリノーゲンより生成される、フィブリンからなる接着性タ
ンパク質の濃縮物である。重合したフィブリンのネットワークによる血餅の接着
力は昔から知られている。フィブリンは今世紀の初めから接着剤として使用され
ており、Bergelによって1909年に発見された(Bergel, Uber Wirkungen des
Fibrins (Dtschr. Med-Wochenschr 1909; 3: 633-665)参照)。Bergelは、フィ
ブリンが生理学的接着性物質であることに気づき、更にフィブリンには治癒を促
す特性があることを見出した。この発見にひき続き、1915年におけるGreyの
研究では、脳や肝臓の出血を止めるためや脳外科手術にフィブリンタンポンを用
いた(Grey, Fibrin as a hemostatic in cerebral surgery (Surg. Gynecol. O
bstet. 1915; 21: 452)参照)。しかしながら、まずCronkite(Use of thrombin
and fibrinogen in skin grafting (JAMA 1944; 124: 976-978)参照)が、続い
てR.T. TidrickとE.D. Warner(Fibrin fixation of skin transplants (Surger
y 1944; 15: 90-95)参照)が、皮膚移植を確実にするためにフィブリノーゲンと
共にトロンビンを用いたのは1944年にもなってのことである。しかし、これ
らのタンパク質は低濃度であったので、良好な接着性が得られず、効果も持続し
なかった。1946年にE.J.Cohn等による血漿タンパク質類の分画に関する重
要な科学的研究(E.J.Cohn et al., Preparation and properties of serum p
lasma proteins. A system for the separation into fractions of the protei
ns and lipoprotein components of biological tissues and fluids (J. Am. C
hem. Soc. 1946; 68: 459-475)参照)がなされて以来、特に血液凝固タンパク質
類が接着剤として使用されるようになり、上記研究の数年後には血液凝固のメカ
ニズム及び主要な血液凝固タンパク質類、特にXIII因子が解明された。1975
年には、Matrasが、初めて高度に濃縮されたフィブリノーゲンを用いて、フィブ
リンの接着特性の利用に成功した(Matras, Topographical anatomy of the tot
al osteotomy of the midface (J. Maxillofac Surg. 1975; 3 (4): 260-262)参
照)。以来、生体組織接着剤は完全に合成のりに取って代わり、ヒトの臨床分野
においてますます多用されている。
凝固因子類の濃縮物である。1948年にGellis等は、初めて、アルブミン調製
物を60℃で10時間加熱処理することによってウイルスを不活化する方法を用
いた(Gellis et al., Chemical, clinical and immunological studies on pro
ducts of human plasma fractionation: inactivation of virus of homologous
serum albumin by means of heat (J. Clin. Invest. 1948; 27: 239-244)参照
)。それ以来、ウイルス感染の危険性を減少させることに関する効力が立証され
ているためにこの方法が一般に用いられている。同様の方法が免疫グロブリンG
類(IgG)の調製にも適用されており、同様の効果を示している。得られる効
果は、これらの血液製品の精製方法に依存しており、特にCohn(Preparation an
d properties of serum plasma proteins. A system for the separation into
fractions of the proteins and lipoprotein components of biological tissu
es and fluids (J. Am. Chem. Soc. 1946; 68: 459-475)参照)、又はKistlerと
Nitschmann(Large scale production of human plasma fractions (Vox Sangui
nis 1962; 7: 414-424)参照)の発表した完全な分画方法の使用に依存している 。
ルス量を異なる画分に配分させる。エタノールは、Henin等(Inactivation and
partition of human immunodeficiency virus during Kistler and Nitschmann
fractionation of human blood plasma (Vox Sanguinis 1988; 54: 78-83)参照 )及びMorgenthaler(Effect of ethanol on virus. virus inactivation in pl
asma products (Current Studies in Hematology and Blood Transfusion. Base
l Karger 1989; 56: 109-121)参照)が記載しているように、ウイルスなどの病 原体に対する殺菌剤として知られている。
しながら、この技術は、肝炎ウイルス(B型及び非A非B型肝炎ウイルス)を不
活化するための方法であった。Curran等は、輸血、又は他の血液由来物質、特に
血液凝固因子類の使用によるHIVタイプのウイルス感染に関する問題を提示し
た(Curran et al., Acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) associated
with transfusion (N. Engl. J. Med. 1984; 310: 69-75)参照)。それ以来、ウ
イルスの不活化方法はHIVに焦点が当てられてた。アルブミンやIgG類の使
用においてHIVの感染は認められず、これは、低温殺菌の結果であるとされて
いる(Mitra et al., Elimination of infectious retroviruses during prepar
ation of immunoglobulins (Transfusion 1986; 26: 394-397)参照)。VIII因子
やIX因子などの血液凝固因子類は血友病患者に広く用いられている。Heimburger
等は、VIII因子を調製する際に、ウイルスを不活化するために、アルブミンに用
いられているのと同じ低温殺菌法を適用し、グリシンとショ糖の存在下で殺菌す
ることによって、60℃で10時間の熱変性条件下におけるタンパク質の変性を
防止した(Heimburger et al., (a) Faktor VIII - Konzentrat-hepatitissiche
r: Fortschritte in der Behandlung der Hamophilie A (Die gelben Hefte 198
0; 20: 165-174) 及び (b) A Factor VIII concentrate, high purified and he
ated in solution (1st International Hemophilia Conference, Bonn. October
3-7, 1980, abstr. 110 and 117)参照)。彼らの研究は、HIVやB型及び非 A非B型肝炎ウイルスの不活化に効力を発揮することを記載している。Hilfenha
us等は、VIII因子濃縮物の調製において低温殺菌法がHIVのようなウイルスを
不活化するのに効率的な方法であることを確認した(Hilfenhaus et al., (a) S
afety of human blood products: Inactivation of retroviruses by heat trea
tment at 60°C (Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1985; 178: 580-584)、(b) Inac
tivation of the AIDS-causing retrovirus and other human viruses in antih
emophilic plasma protein preparations by pasteurization (Vox Sanguinis 1
986; 50: 208-211) 及び (c) Pasteurization as an efficient method to inac
tivate blood borne viruses in F. VIII concentrates (Drug Res. 1986; 22:
621-625)参照)。Tabor等は、安定化剤としてのクエン酸の存在下でアンチトロ ンビンIIIを加熱処理することによってB型肝炎ウイルスを不活化した(Tabor e
t al., Inactivation of hepatitis B virus by heat in antithrombin III sta
bilized with citrates (Thromb. Res. 1982; 22: 233-238)参照)。Hollinger 等は、HIVや肝炎ウイルスの感染の危険性を減少させるためにVIII因子濃縮物
を、凍結乾燥した状態で加熱した(Hollinger et al., Reduction in risk of h
epatitis transmission by heat treatment of a human factor VIII concentra
te (J. Infect. Dis. 1984; 150: 250-262)参照)。Piszkiewicz等は、凍結乾燥
した血液凝固因子類の濃縮物の加熱処理は、これらの因子類の活性に重大な影響
は与えないことを記載している(Piszkiewicz et al., (a) Heat inactivation
of human immunodeficiency virus in lyophilized anti-inhibitor coagulant
complex (Autoplex) (Thromb. Res. 1986; 44: 701-707) 及び (b) Heat inacti
vation of human immunodeficiency virus in lyophilized factor VIII and fa
ctor IX concentrates (Thromb. Res. 1987; 47: 235-241)参照)。上記の著者 等は、加熱処理による新生抗原の産生がみられなかったことを強調した。加熱処
理によるウイルスの不活化に関する研究は、Piszkiewicz等によって“抗血友病 因子類”(Hemofil T及びHemofil CT(Hemofilは登録商標))の調製、及び抗凝
血物質インヒビター複合体類(Autoplex T(Autoplexは登録商標))やIX因子複
合体(Proplex SX-T及びProplex T(Proplexは登録商標))の調製について行わ
れ、抗血友病因子類の調製については、60℃で72時間加熱し、抗凝血物質イ
ンヒビター複合体類やIX因子複合体の調製については60℃で144時間加熱し
た(Piszkiewicz et al., Virus inactivation by heat treatment of lyophili
zed coagulation factor concentrates. Virus inactivation in plasma produc
ts (Current Studies in Hematology and Blood Transfusion. Basel, Karger 1
989; 56: 44-54)参照)。上記5つの熱処理された血液凝固因子製品の使用によ るHIVセロコンバージョンに関する報告はなされていない。サルの研究におい
ては、HBsAgや抗HBcについてスクリーニングされた血漿由来のHemofil
T濃縮物は、NANBHに感染していないことが認められている。しかしながら 、HBsAgについてのみスクリーニングされた血漿由来の同じ製品の使用は、
患者にNANBHをもたらした(Colombo et al., Transmission of non-A, non
-B hepatitis by heat treated factor VIII concentrate (Lancet 1985; ii: 1
-4)参照)。Hemofil Tは、HBsAgに反応せず、正常ALTレベルにある血漿
から一般に大量生産されている。
安定でより高い耐熱性を示す。タンパク質の変性を最小にするための温度や加熱
時間は、タンパク質の性質によって異なる。しかしながら、完全なウイルスの不
活化に関する報告は未だ存在しない。NANBH感染についてはColombo等(Tra
nsmission of non-A, non-B hepatitis by heat treated factor VIII concentr
ate (Lancet 1985; ii: 1-4)参照)によって報告され、HIV感染についてはWh
ite等(HTLV-III seroconversion associated with heat-treated factor VIII
concentrate (Lancet 1986; i: 611-612)参照)及びVan den Berg等(Seroconve
rsion to HTLV-III in hemophiliac given heat-treated factor VIII concentr
ate (Lancet 1986; i: 803-803)参照)によって報告されている。こうした理由 により、Winkelman等は、VIII因子(8Y型)、IX因子(9A型)、VII因子、XI
因子及びトロンビンからなる濃縮物を80℃で72時間加熱した(A new therap
eutic factor VIII concentrate of high specific activity and high yield (
Thromb. Haemost. 1985; 54: 19-22)参照)。これらの熱処理された製品を施さ れた29人の患者について行われた研究においてHIVやHBのセロコンバージ
ョンが認められず、NANBH感染の発生の有意な減少が認められたことを示し
ている。
をもたないパルボウイルスやポリオウイルスが存在することから、溶媒/界面活
性剤法は安全な血漿製品類を提供するには十分ではない。溶媒/界面活性剤の効
果がない、エンベロープをもたないウイルスを除去するために別の技術が最近導
入されてきている。その技術はナノフィルトレーションである。ナノフィルター
は、微孔性ファイバーで構成され、“Planova BMM”という商品名(日本国、東 京、旭化成工業社製)で販売されている。このフィルターの孔径は約15〜35
nmと様々である。これらのフィルターは約25nmよりも大きなサイズを有す
る特定のタイプのウイルスを保持することができる。こららのフィルターは、H
IV−1(80〜100nm)、HBB(42nm)、HCV(<80nm)、
デルタ型肝炎ウイルス(35nm)、ウシウイルス性下痢ウイルス(60〜70
nm)、シンドビスウイルス(60〜70nm)、3型レオウイルス(60〜8
0nm)、セイビン1型ポリオウイルス(25〜30nm)、及びヒトパルボウ
イルス(20〜25nm)などのウイルスの除去に有効である。参考文献: Sek
iguchi et al., Possibility of hepatite B virus (HBV) removal from human
plasma using regenerated cellulose hollow fiber (BMM) (Membrane 1989; 14
: 253-261); Hamamoto et al., A novel method for removal of human immunod
eficiency virus: filtration with porous polymeric membranes (Vox Sang. 1
989; 56: 230-236); Tsurumi et al., Structure of cuprammonium regenerated
cellulose hollow fiber (BMM hollow fiber) for virus removal (Polym. J.
1990; 22: 751-758); Ishikawa et al., Novel determination method of size
of virus in solution using cuprammonium regenerated cellulose membrane (
BMM) (Membrane 1991; 16: 101-111); Tomokiyo et al., Studies on virus eli
mination and inactivation effect of highly purified F-VIII concentrate (
The clinical report 1991; 25: 271-275); Manabe, Virus removal and inacti
vation in process validation (Animal Cell Technology: Basic & Applied As
pects) (Murakami, H., Shirahata, S. 及び Tachibana, H. 編集, 1992; 15-30
); Burnouf-Radosewich et al., Nanofiltration, a new specific virus elimi
nation method applied to high-purity factor IX and factor VI concentrate
s (Vox Sanguinis 1994; 67 (2): 132-138)).
00℃で30分間加熱するというVIII因子濃縮物の2段階ウイルス不活化法を用
いた(Rubinstein et al., Combined solvent-detergent and 100°C (boiling)
sterilizing dry-heat treatment of Factor VIII concentrates to assure st
erility (Vox Sanguinis 1991; 60: 60)参照)。この著者等によると、最終製品
の熱処理は、脂質エンベロープをもたない非A非B型肝炎ウイルスを不活化させ
る。最終製品の熱処理は、操作中又は装置による偶発的なウイルス汚染に対する
予防処置でもある(Vox Sang. 1991; 60:60)。
フィルトレーション、及び(3)凍結乾燥製品の100℃、1時間の熱処理(米
国特許第5,506,127号(権利者:Haemacure Biotech Inc.))。
れる血漿上清(実施例1におけるような)は、大量の塩類を含んでいる。塩処理
に基づく血漿の浸透圧モル濃度(osmolarity)は約2,200〜2,500 mOs
m/kgである。該上清に含まれるプロトロンビンを単離するためには、上記の大量
の塩類を除去する必要がある。特に酸により血漿を沈殿させた場合には、血漿の
イオン強度が低くなければプロトロンビンを単離することができない。塩類の除
去は、従来から公知の手法である透析濾過によって行なう。上記の上清を透析濾
過システム(Amicon system社製、モデルDC10L、スパイラルカートリッジ 付き)の貯槽(reservoir)に入れる。透析濾過の外液としては純水を用いる。 血漿上清の容量に対して平均で4倍容量の純水を用いて、血漿の浸透圧モル濃度
が約50〜100 mOsm/kgとなるまで透析濾過を行なう。
〜7.8の間である。希釈血漿に酢酸溶液(2%〜5%;Allary et al., Isole
ment par chromatographie d’affinite, sur support de silice, de la throm
bine humaine en vue de son utilisation dans les preparations de colle bi
ologique (Ann. pharmaceutiques francaises 1990; 48 (3): 129-135)参照)を
滴下して、pHを5.2±0.1まで下げる。pHの降下中に(およそpH5.
5〜6.0で)プロトロンビンが沈殿しはじめ、pHが5.1〜5.3になった
ところで沈殿が完了する。プロトロンビンはpHが6.0を越えたり塩濃度を上
げると急速に再可溶化する。血漿を室温で1時間静置してから、20℃で20分
間、4,200rpmで遠心する(Beckman J6MC、JS4.2型ローター)。沈殿物 を回収して、2%のTris−HCl緩衝液(pH7.5±0.1)(容量:血
漿上清1リットルあたり120〜150 ml)に溶解する。プロトロンビンを 、クロノメトリック定量法(chronometric dosage)(Fibrometre Stago ST4-Fr
ance)で定量する。プロトロンビンの回収率は血漿上清と出発血漿を基準として
約90%であり、血漿1リットルあたり750〜850単位のプロトロンビンを
回収できることになる。
Claims (46)
- 【請求項1】実質的にウイルス活性を有さない、トロンビンによって凝固可
能なタンパク質濃縮物の調製方法であって、タンパク質濃縮物が含むタンパク質
成分は実質的にフィブリノーゲン、内因性XIII因子及びフィブロネクチンからな
り、以下の工程(a)〜(l)を包含することを特徴とする調製方法。 (a)血漿中の全血漿タンパク質に対して行なう沈殿工程であって、約0℃〜
4℃の温度において塩析効果及び約7.5〜8.5へのpH調整効果を果たすの
に充分な量の塩類を血漿に加えるか、又は温度が約4℃〜20℃でpHが約4.
5〜5.5の条件下において酸性沈殿物を得るのに充分な量の塩類を血漿に加え
、その際該工程を50mM以上のアミノ−6−ヘキサン酸の存在下で行って、フ
ィブリノーゲン、内因性XIII因子及びフィブロネクチンを選択的に沈殿させる; (b)沈殿せしめたタンパク質類を、1gのタンパク質類に対して約0.2〜
0.3gのL−ヒスチジンの存在下において可溶化して溶解し該タンパク質類を
含む溶液を得る工程; (c)殺ウイルス剤となる溶媒/界面活性剤溶液を用いて、工程(b)で得ら
れた溶液中のウイルスを不活化する工程; (d)孔径約35nmのフィルターを用いて濾過する際に該タンパク質類の実
質的な損失がないように、該溶液の界面活性剤濃度を調整する工程; (e)工程(d)で得られた溶液を孔径約35nmのフィルターを用いて濾過
する工程; (f)工程(a)で用いたのと同じ塩類を用い、工程(a)と同様の温度条件
及びアミノ−6−ヘキサン酸濃度において、工程(e)で濾過して得た溶液から
沈殿物を得る工程; (g)工程(f)で得られた沈殿物のpHが中性になるまで該沈殿物を洗浄す
る工程; (h)工程(g)で洗浄した沈殿物を、該沈殿物に含まれるタンパク質1gに
対して約0.2〜0.4gのL−ヒスチジンの存在下において可溶化して溶解す
る工程; (i)工程(h)で溶解した沈殿物に含まれるタンパク質の量に対応する量の
タンパク質安定化剤を、溶解した沈殿物に加えてタンパク質溶液を得る工程; (j)工程(i)で得たタンパク質溶液を濾過滅菌に付して滅菌濾液を得る工
程; (k)滅菌済のビンに工程(j)で得た滅菌濾液を分注する工程;及び (l)工程(k)で分注した滅菌濾液を凍結乾燥して凍結乾燥されたタンパク
質濃縮物を得る工程。 - 【請求項2】工程(l)で得られた凍結乾燥製品を、更に、約100℃にお
いて約1〜2時間の乾熱処理に付す工程(m)を包含することを特徴とする、請
求項1に記載の方法。 - 【請求項3】工程(c)におけるウイルスの不活化を、10mg/mlの溶
解したタンパク質、1%のポリオキシエチレンソルビタンモノオレート、及び0
.3%のトリ−n−ブチルフォスフェート(いずれも終濃度)からなる溶液を、
約24℃において、約6時間の連続攪拌に付すことによって行うことを特徴とす
る、請求項1に記載の方法。 - 【請求項4】該工程(d)において、約2%〜4%の濃度のポリオキシエチ
レンソルビタンモノオレートを使うことを特徴とする、請求項3に記載の方法。 - 【請求項5】該塩類が、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、リン酸一ナトリウ
ム塩、リン酸二ナトリウム塩、リン酸一カリウム塩及びリン酸二カリウム塩から
なる群より選ばれる塩類であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。 - 【請求項6】工程(a)及び(f)の沈殿工程を少なくとも30分行うこと
を特徴とする、請求項1に記載の方法。 - 【請求項7】工程(g)を約2℃〜20℃で行うことを特徴とする、請求項
1に記載の方法。 - 【請求項8】工程(g)が、更に、 (g.i)pHが中性付近の溶液中に洗浄した沈澱物を可溶化して溶解する工程 、及び (g.ii)上記(g.i)で得た溶解した沈澱物を透析もしくは透析濾過に付す工 程 を包含し; 工程(h)においては、透析又は透析濾過した沈澱物に、タンパク質1gに対
して終濃度が約0.2〜0.3gとなるようにL−ヒスチジン添加することを特
徴とする、請求項1に記載の方法。 - 【請求項9】工程(g)における該沈澱物の洗浄の際に、純水を用いて調製
した0.1%のTris−HCl溶液であって、pHが4.5〜5.0又は9.
50〜10.50である溶液を用いることを特徴とする、請求項1に記載の方法
。 - 【請求項10】透析又は透析濾過工程の前に該沈殿物を可溶化して溶解する
ために用いる塩基性の純水が、純水を用いて調製した0.1〜0.5%のTri
s溶液であることを特徴とする、請求項8に記載の方法。 - 【請求項11】タンパク質を可溶化する工程(b)において、1%のTri
s及び1.6%のクエン酸ナトリウムからなるpH6〜7.3又はpH9.5〜
10.5の溶液を用い、L−ヒスチジンを添加する前のタンパク質濃度を約20
〜22mg/mlとすることを特徴とする、請求項1に記載の方法。 - 【請求項12】タンパク質を可溶化する工程(h)において、pHが6〜7
.3の0.5%Tris溶液を用い、L−ヒスチジンを添加する前のタンパク質
濃度を約17〜20mg/mlとすることを特徴とする、請求項1に記載の方法
。 - 【請求項13】ショ糖、アルブミン及びポリオキシエチレンソルビタンモノ
オレートをそれぞれ添加後の濃度が約0.5g/gタンパク質、約0.05g/
gタンパク質、及び17〜20μg/mgタンパク質となるように包含するタン
パク質安定化剤を用いることを特徴とする、請求項1に記載の方法。 - 【請求項14】該凍結乾燥されたタンパク質濃縮物は、室温において手動に
よる攪拌を伴う条件下において、5分以内に水に可溶化して溶解し、溶解タンパ
ク質濃縮物を生じ、該溶解タンパク質濃縮物は、約4〜20℃の温度において少
なくとも24時間は安定であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。 - 【請求項15】該全血漿タンパク質が、ヒト由来の全血漿タンパク質または
動物由来の全血漿タンパク質であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。 - 【請求項16】実質的にウイルス活性を有さない、トロンビンによって凝固
可能なタンパク質濃縮物の調製方法であって、タンパク質濃縮物が含むタンパク
質成分は実質的にフィブリノーゲン、内因性XIII因子及びフィブロネクチンから
なり、以下の工程(a)〜(m)を包含することを特徴とする調製方法。 (a)血漿中の全血漿タンパク質に対して行なう沈殿工程であって、約0℃〜
4℃の温度において塩析効果及び約7.5〜8.5へのpH調整効果を果たすの
に充分な量の塩類を血漿に加えるか、又は温度が約4℃〜20℃でpHが約4.
5〜5.5の条件下において酸性沈殿物を得るのに充分な量の塩類を血漿に加え
、その際該工程を50mM以上のアミノ−6−ヘキサン酸の存在下で行って、フ
ィブリノーゲン、内因性XIII因子及びフィブロネクチンを選択的に沈殿させる; (b)沈殿せしめたタンパク質類を、1gのタンパク質類に対して約0.2〜
0.3gのL−ヒスチジンの存在下において可溶化して溶解し該タンパク質類を
含む溶液を得る工程; (c)殺ウイルス剤となる溶媒/界面活性剤溶液を用いて工程(b)で得られ
た溶液中のウイルスを不活化する工程であって、該不活化を、10mg/mlの
溶解したタンパク質、1%のポリオキシエチレンソルビタンモノオレート、及び
0.3%のトリ−n−ブチルフォスフェート(いずれも終濃度)からなる溶液を
、約24℃において、約6時間の連続攪拌に付すことによって行う; (d)孔径約35nmのフィルターを用いて濾過する際に該タンパク質類の実
質的な損失がないように、該溶液の界面活性剤濃度を調整する工程; (e)工程(d)で得られた溶液を孔径約35nmのフィルターを用いて濾過
する工程; (f)工程(a)で用いたのと同じ塩類を用い、工程(a)と同様の温度条件
及びアミノ−6−ヘキサン酸濃度において、工程(e)で濾過して得た溶液から
沈殿物を得る工程; (g)工程(f)で得られた沈殿物のpHが中性になるまで該沈殿物を洗浄す
る工程; (h)工程(g)で洗浄した沈殿物を、該沈殿物に含まれるタンパク質1gに
対して約0.2〜0.4gのL−ヒスチジンの存在下において可溶化して溶解す
る工程; (i)工程(h)で溶解した沈殿物に含まれるタンパク質の量に対応する量の
タンパク質安定化剤を、溶解した沈殿物に加えてタンパク質溶液を得る工程; (j)工程(i)で得たタンパク質溶液を濾過滅菌に付して滅菌濾液を得る工
程; (k)滅菌済のビンに工程(j)で得た滅菌濾液を分注する工程; (l)工程(k)で分注した滅菌濾液を凍結乾燥して凍結乾燥されたタンパク
質濃縮物を得る工程;及び (m)該凍結乾燥されたタンパク質濃縮物を、約100℃において約1〜2時
間の乾熱処理に付す工程。 - 【請求項17】工程(d)において、約2%〜4%の濃度のポリオキシエチ
レンソルビタンモノオレートを使うことを特徴とする、請求項16に記載の方法
。 - 【請求項18】活性を有するウイルスを実質的に含まない、保存安定性に優
れた治療学的品質のトロンビン組成物の大量生産を行なうための製造方法であっ
て、以下の工程(a)〜(i)を包含することを特徴とする製造方法。 (a)請求項1の方法の工程(a)で得られる上清を回収する工程; (b)低塩濃度溶液または塩を含まない溶液を交換しながら、該低塩濃度溶液
または塩を含まない溶液に対して該上清の透析濾過を行なう工程; (c)透析濾過した上清を、約100 mosmoles/kg以下の値を示すプロトロン
ビン溶液となるように希釈する工程; (d)該プロトロンビン溶液に、プロトロンビン溶液のpHが約5.2になる
まで酸性溶液を加えてプロトロンビンを沈殿化する工程; (e)工程(d)で生じた沈澱物を、pHが中性付近の溶液中に可溶化して溶
解する工程; (f)工程(e)で得た溶液中のプロトロンビンを、塩化カルシウムを含む希
釈液を用いて、約20〜30mMの塩化カルシウムの存在下でトロンビンに変換
する工程; (g)溶媒/界面活性剤溶液を殺ウイルス剤として用い、脂質含有ウイルスを
不活化するのに充分な量の溶媒/界面活性剤溶液と該トロンビンとをインキュベ
ートする工程; (h)イオン交換クロマトグラフィーを逐次用いてインキュベートしたトロン
ビンを精製する工程であって、スルホアルキル−活性化ポリアガロース、スルホ
アルキル−活性化ポリデキストラン、及びスルホアルキル−活性化デキストリン
とシリカ粒子からなる非圧縮性複合担体からなる群より選ばれる、トロンビンに
対して高い選択性を示す1つのスルホアルキル−活性化ポリサッカリド−陽イオ
ン交換体を用い、溶出剤としては、少なくとも3種類の、溶出剤濃度を増加した
水系緩衝液を用いる;及び (i)工程(h)のクロマトグラフィーによって得た溶出液のトロンビン溶出
ピーク部分を回収し、該溶出液の緩衝液を、回収したトロンビンを安定化するた
めの生理的に許容可能な安定化処方緩衝液に交換し、該トロンビンを含有する処
方緩衝液を回収する工程。 - 【請求項19】工程(b)の透析濾過で行なう溶液の交換の際に、該上清の
容量の約4倍の量の水溶液を用いることを包含する、請求項18に記載の方法。 - 【請求項20】工程(f)において、工程(e)で溶解した沈殿物の容量の
約4倍の量の40mMの塩化カルシウム溶液を希釈液として該溶解した沈殿物に
添加することを特徴とする、請求項18に記載の方法。 - 【請求項21】工程(f)において、工程(e)で溶解した沈殿物の容量の
約4倍の量の40mMの塩化カルシウム溶液を希釈液として該溶解した沈殿物に
添加することを特徴とする、請求項19に記載の方法。 - 【請求項22】該陽イオン交換体が、スルホアルキル−活性化デキストリン
とシリカ粒子からなる非圧縮性複合担体であることを特徴とする、請求項18の
製造方法。 - 【請求項23】該陽イオン交換体が、スルホアルキル−活性化デキストリン
とシリカ粒子からなる非圧縮性複合担体であることを特徴とする、請求項21の
製造方法。 - 【請求項24】該陽イオン交換体が、スルホプロピル−活性化デキストリン
とシリカ粒子からなる実質的に非圧縮性の複合担体であることを特徴とする、請
求項22の製造方法。 - 【請求項25】該陽イオン交換体が、スルホプロピル−活性化デキストリン
とシリカ粒子からなる実質的に非圧縮性の複合担体であることを特徴とする、請
求項23の製造方法。 - 【請求項26】更に、トロンビンを含有する安定化処方緩衝液を、該安定化
処方緩衝液中に存在するウイルス粒子を除去するために銅アンモニウムセルロー
スからなる中空糸膜で濾過し、そして実質的にウイルス粒子を含まないトロンビ
ン含有処方緩衝液を回収することを包含する、請求項18の製造方法。 - 【請求項27】更に、トロンビンを含有する安定化処方緩衝液を、該安定化
処方緩衝液中に存在するウイルス粒子を除去するために銅アンモニウムセルロー
スからなる中空糸膜で濾過し、そして実質的にウイルス粒子を含まないトロンビ
ン含有処方緩衝液を回収することを包含する、請求項21の製造方法。 - 【請求項28】該銅アンモニウムセルロースからなる中空糸膜の孔径が約1
5nmであることを特徴とする、請求項26に記載の製造方法。 - 【請求項29】該銅アンモニウムセルロースからなる中空糸膜の孔径が約1
5nmであることを特徴とする、請求項27に記載の製造方法。 - 【請求項30】トロンビン含有処方緩衝液を濾過した後に、更に凍結乾燥と
乾熱処理を行なって、トロンビンを変性させずに残留ウイルス粒子を不活化する
ことを包含することを特徴とする請求項18に記載の方法。 - 【請求項31】トロンビン含有処方緩衝液を濾過した後に、更に凍結乾燥と
乾熱処理を行なって、トロンビンを変性させずに残留ウイルス粒子を不活化する
ことを包含することを特徴とする、請求項26に記載の方法。 - 【請求項32】トロンビン含有処方緩衝液を濾過した後に、更に凍結乾燥と
乾熱処理を行なって、トロンビンを変性させずに残留ウイルス粒子を不活化する
ことを包含することを特徴とする、請求項29に記載の方法。 - 【請求項33】凍結乾燥製品を約100℃で約1〜約2時間加熱することに
よって該乾熱処理を行なうことを特徴とする、請求項30に記載の方法。 - 【請求項34】凍結乾燥製品を約100℃で約1〜約2時間加熱することに
よって該乾熱処理を行なうことを特徴とする、請求項31に記載の方法。 - 【請求項35】凍結乾燥製品を約100℃で約1〜約2時間加熱することに
よって該乾熱処理を行なうことを特徴とする、請求項32に記載の方法。 - 【請求項36】該処方緩衝液が、熱処理による実質的な活性の低下からトロ
ンビンを保護して安定化するのに充分な量のクエン酸塩、塩化ナトリウム、Tr
is−HCl及び血漿アルブミンを含有する、pH約7.3の水溶液であること
を特徴とする、請求項30に記載の方法。 - 【請求項37】該処方緩衝液が、熱処理による実質的な活性の低下からトロ
ンビンを保護して安定化するのに充分な量のクエン酸塩、塩化ナトリウム、Tr
is−HCl及び血漿アルブミンを含有する、pH約7.3の水溶液であること
を特徴とする、請求項31に記載の方法。 - 【請求項38】該処方緩衝液が、熱処理による実質的な活性の低下からトロ
ンビンを保護して安定化するのに充分な量のクエン酸塩、塩化ナトリウム、Tr
is−HCl及び血漿アルブミンを含有する、pH約7.3の水溶液であること
を特徴とする、請求項32に記載の方法。 - 【請求項39】該処方緩衝液が、熱処理による実質的な活性の低下からトロ
ンビンを保護して安定化するのに充分な量のクエン酸塩、塩化ナトリウム、Tr
is−HCl及び血漿アルブミンを含有する、pH約7.3の水溶液であること
を特徴とする、請求項35に記載の方法。 - 【請求項40】該処方緩衝液が、約0.25w/v%のクエン酸ナトリウム
と、約0.45w/v%の塩化ナトリウムと、約0.25w/v%のTris−
HClと、トロンビン溶出ピーク中の総タンパク質の約20倍に相当する量であ
り、凍結乾燥前のトロンビン溶液において2w/v%となる量の血漿アルブミン
とを含有する、pH約7.3の水溶液であることを特徴とする、請求項36に記
載の方法。 - 【請求項41】該処方緩衝液が、約0.25w/v%のクエン酸ナトリウム
と、約0.45w/v%の塩化ナトリウムと、約0.25w/v%のTris−
HClと、トロンビン溶出ピーク中の総タンパク質の約20倍に相当する量であ
り、凍結乾燥前のトロンビン溶液において2w/v%となる量の血漿アルブミン
とを含有する、pH約7.3の水溶液であることを特徴とする、請求項37に記
載の方法。 - 【請求項42】該処方緩衝液が、約0.25w/v%のクエン酸ナトリウム
と、約0.45w/v%の塩化ナトリウムと、約0.25w/v%のTris−
HClと、トロンビン溶出ピーク中の総タンパク質の約20倍に相当する量であ
り、凍結乾燥前のトロンビン溶液において2w/v%となる量の血漿アルブミン
とを含有する、pH約7.3の水溶液であることを特徴とする、請求項38に記
載の方法。 - 【請求項43】該処方緩衝液が、約0.25w/v%のクエン酸ナトリウム
と、約0.45w/v%の塩化ナトリウムと、約0.25w/v%のTris−
HClと、トロンビン溶出ピーク中の総タンパク質の約20倍に相当する量であ
り、凍結乾燥前のトロンビン溶液において2w/v%となる量の血漿アルブミン
とを含有する、pH約7.3の水溶液であることを特徴とする、請求項39に記
載の方法。 - 【請求項44】該溶出剤濃度を増加した水系緩衝液は、実質的に約0.08
M、約0.15M及び約0.4MのNaClをそれぞれ含むヒト トロンビン用 緩衝液であることを特徴とする、請求項18に記載の方法。 - 【請求項45】該溶出剤濃度を増加した水系緩衝液は、実質的に約0.08
M、約0.15M及び約0.4MのNaClをそれぞれ含むヒト トロンビン用 緩衝液であることを特徴とする、請求項21に記載の方法。 - 【請求項46】該溶出剤濃度を増加した水系緩衝液は、実質的に約0.08
M、約0.15M及び約0.4MのNaClをそれぞれ含むヒト トロンビン用 緩衝液であることを特徴とする、請求項42に記載の方法。
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