PL194589B1 - Sposób wytwarzania trombiny - Google Patents
Sposób wytwarzania trombinyInfo
- Publication number
- PL194589B1 PL194589B1 PL98340300A PL34030098A PL194589B1 PL 194589 B1 PL194589 B1 PL 194589B1 PL 98340300 A PL98340300 A PL 98340300A PL 34030098 A PL34030098 A PL 34030098A PL 194589 B1 PL194589 B1 PL 194589B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- thrombin
- solution
- virus
- prothrombin
- sodium
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/45—Transferases (2)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2/00—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor
- A61L2/0005—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor for pharmaceuticals, biologicals or living parts
- A61L2/0011—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor for pharmaceuticals, biologicals or living parts using physical methods
- A61L2/0017—Filtration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L24/00—Surgical adhesives or cements; Adhesives for colostomy devices
- A61L24/04—Surgical adhesives or cements; Adhesives for colostomy devices containing macromolecular materials
- A61L24/10—Polypeptides; Proteins
- A61L24/106—Fibrin; Fibrinogen
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S977/00—Nanotechnology
- Y10S977/902—Specified use of nanostructure
- Y10S977/904—Specified use of nanostructure for medical, immunological, body treatment, or diagnosis
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S977/00—Nanotechnology
- Y10S977/902—Specified use of nanostructure
- Y10S977/904—Specified use of nanostructure for medical, immunological, body treatment, or diagnosis
- Y10S977/906—Drug delivery
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S977/00—Nanotechnology
- Y10S977/902—Specified use of nanostructure
- Y10S977/904—Specified use of nanostructure for medical, immunological, body treatment, or diagnosis
- Y10S977/908—Mechanical repair performed/surgical
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S977/00—Nanotechnology
- Y10S977/902—Specified use of nanostructure
- Y10S977/904—Specified use of nanostructure for medical, immunological, body treatment, or diagnosis
- Y10S977/92—Detection of biochemical
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Surgery (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
1. Sposób wytwarzania trombiny, znamienny tym, ze obejmuje nastepujace etapy: a) wytracania bialek pelnego osocza przez dodanie pierwszej soli, korzystnie jednozasadowego fosforanu sodu lub potasu lub octanu sodu lub potasu, w ilosci wystarczajacej do osiagniecia efektu wy- salania, tj. osiagniecia stezenia koncowego 1 M, i przy wartosci pH 7,5 do 8,5, w temperaturze pomie- dzy 0°C i 4°C, lub przez dodanie drugiej soli, korzystnie jednozasadowego fosforanu sodu lub potasu lub octanu sodu lub potasu, w ilosci wystarczajacej do osiagniecia wytracania na kwasno, korzystnie przy stezeniu równym 1 mol na litr mieszaniny, przy wartosci pH 4,5 do 5,5, w temperaturze pomiedzy 4°C do 20°C, dzieki czemu fibrynogen, czynnik XIII i fibronektyna wytracaja sie, przy czym wspomniane wytracanie prowadzi sie w obecnosci kwasu 6-aminoheksanowego o stezeniu co najmniej 50 mM z od- zyskiem supernatantu zawierajacego protrombine, b) diafiltracji wymienionego supernatantu az do uzyskania roztworu protrombiny o osmolarnosci 100 mOsmoli/kg masy lub nizszej, c) rozcienczania roztworu protrombiny woda, dodana w ilosci 4 objetosci na 1 objetosc roztworu protrombiny, d) wytracania protrombiny przez dodawanie kwasowego roztworu, korzystnie 2 do 5% kwasu octowego, az do uzyskania wartosci pH 5,2, e) solubilizacji osadu otrzymanego wedlug etapu (d) w roztworze o niemal obojetnym pH, i f) przeksztalcania protrombiny otrzymanej wedlug etapu (e) do trombiny, w obecnosci chlorku wapnia tak, aby osiagnac stezenie chlorku wapnia 20 do 32 mM. PL PL PL
Description
Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania trombiny, zwłaszcza koncentratu trombiny o wysokim bezpieczeństwie wirusowym w celu uzyskania kleju fibrynowego z mieszanej surowicy ludzkiej. W szczególności, przedmiotowy sposób wymaga trzech etapów inaktywacji wirusa: obróbki rozpuszczalnikiem lub detergentem, nanofiltracji i obróbki cieplnej.
Kleje biologiczne są lepkimi koncentratami białkowymi składającymi się z fibryny wytwarzanej z fibrynogenu, zaktywowanego przez trombinę i czynnika XIII, w obecności jonów wapnia. Zdolność adhezyjna skrzepu krwi, z uwagi na siatkę spolimeryzowanej fibryny, była znana od dawna. Fibrynę stosowano od początku tego wieku jako spoiwo, a Bergel: Uber Wirkungen des Fibrins (Dtschr. Med. Wochenschr 1909; 3:633-665) ujawnił jej przydatność jako fizjologicznej substancji klejącej i ponadto opisał jej właściwości gojące. Nieco później, w 1915 roku, w publikacji Greya: Fibrin as a hemostatic in cerebral surgery (Surg. Gynecol. Obstet. 1915;21:452) ujawniono zastosowanie tamponów fibrynowych do zatrzymywania krwotoków mózgowych, wątrobowych oraz w chirurgii mózgu. Jednakże, już w 1944 roku Cronkite: Use of thrombin and fibrinogen in skin grafting (JAMA 1944; 124:976-978), a następnie Tidrick i Wamer: Fibrin Fixation of skin transplants (Surgery 1944; 15: 90-95) zastosowali fibrynogen razem z trombiną do zabezpieczania przeszczepu skóry. Jednak niskie stężenie tych produktów nie zapewniało ani dobrego jakościowo przylegania, ani długotrwałego efektu. Od 1946 roku, dzięki istotnym badaniom naukowym E. J. Cohna i in.: Preparation and properties of serum plasma proteins. A system for the separation into fractions of me proteins and lipoprotein components of biological tissues and fluids (J. Am. Chem. Soc. 1946; 68: 459-475) dotyczącym frakcjonowania białek osocza, używano zwłaszcza białka koagulacyjne i kilka lat później ustalono mechanizm koagulacji i główne białka koagulacyjne, szczególnie czynnik XIII. W 1975 roku, Matras: Topographical Anatomy of the total osteotomy of the midface (J. Maxillofac Surg. 1975; 3(4): 260-262) jako pierwszy wykorzystał właściwości klejące fibryny za pośrednictwem bardzo stężonego fibrynogenu. Od tamtego czasu kleje biologiczne zdecydowanie wyparły kleje syntetyczne i są powszechnie stosowane u ludzi w klinicznej praktyce lekarskiej.
Kleje biologiczne stwarzają nową możliwość w dziedzinie chirurgii i szwów chirurgicznych. Chirurdzy już od dłuższego czasu poszukiwali skutecznego, łatwego w stosowaniu i przede wszystkim dobrze tolerowanego spoiwa, które można stosować oprócz lub zamiast szwów. Obecnie, szwy chirurgiczne są niesłychanie ważne. Jednakże, pojawiają się liczne problemy takie jak brak tolerancji lub toksyczność. Krew, dzięki jej właściwościom krzepnięcia, zawsze była dla chirurgów idealnym modelem biologicznej substancji klejącej, ale zastosowanie klejów biologicznych pochodzenia ludzkiego stwarza ryzyko przeniesienia wirusów, które zależy głównie od metod oczyszczania koncentratów osocza. W klinicznej praktyce lekarskiej, kleje biologiczne trzeba wytwarzać, silnie traktując w celu inaktywacji wirusa, ale bez zmiany jakości produktów. Nadal prowadzi się badania nad spoiwem o następujących właściwościach:
- wysokie bezpieczeństwo wirusowe
- dostateczna przyczepność
- dobra elastyczność
- dobre trzymanie się na sąsiednich tkankach
- brak toksyczności
- brak akcji metabolicznej
- dobra tolerancja
Opisy patentowe St. Zjedn. Ameryki nr 5290918 i nr 5395923 opublikowane przez Haemacure Biotech Corp. ujawniają metody wytwarzania i zastosowania koncentratu fibrynogenu, czynnika XIII i fibronektyny w celach terapeutycznych.
Z uwagi na właściwości krzepnięcia, koncentrat bogaty w fibrynogen i czynnik XIII jest dla lekarzy cennym i skutecznym narzędziem w chirurgii, gdzie wymagane są właściwości przeciwkrwotoczne. Dziedziny zastosowań klinicznych to: neurochirurgia, chirurgia naczyniowa, chirurgia plastyczna (przeszczepy skóry), chirurgia ORL, stomatologia, chirurgia ortopedyczna, chirurgia ogólna i traumatologia.
Głównym białkiem w tym koncentracie jest fibrynogen, który, dzięki enzymatycznej reakcji w obecności trombiny i jonów wapnia, wytwarza fibrynopeptydy A i B, umożliwiając powstanie monomerów fibryny. Te monomery szybko polimeryzują i tworzą rozpuszczalną fibrynę. Następnie, czynnik stabilizujący fibrynę (czynnik XIII), pod wpływem jonów wapnia tworzy wiązania kowalencyjne z rozPL 194 589 B1 puszczoną fibryną, co czyni ją trwałą i nierozpuszczalną w kwaśnym środowisku lub w obecności mocznika.
Tak utworzona fibryna ma postać nieodwracalną, jest trwała i całkowicie spełnia swoją rolę jako koagulant. Jest ona odporna na fibrynolizę, ponieważ występuje w dużym stężeniu, fibrynogen nie zawiera plazminogenu i zachowuje swój kształt w wyniku braku wysięku. Ten koncentrat ma następujące właściwości: doskonała trwałość po ponownym rozpuszczeniu w wodnym roztworze, solubilizacja w temperaturze pokojowej w czasie kilku minut, dobra elastyczność i, wreszcie, dobre przyleganie.
Te właściwości zależą tylko od sposobu przygotowania go z osocza. Jest to prosta, szybka metoda, którą łatwo zaadaptować do produkcji przemysłowej. Wszystkie biologiczne i biochemiczne koncentraty są konserwowane i produkt spełnia wymagania kliniczne. Zastosowanie produktów krwiopochodnych zawsze stwarza ryzyko przeniesienia wirusów pomimo dostępnych testów wirusologicznych. Najbezpieczniejszym sposobem wytworzenia bezpiecznych produktów krwiopochodnych jest systematyczne inaktywowanie wirusów, które mogą występować, z zastosowaniem odpowiednich technik, bez pogarszania właściwości biochemicznych produktów osocza. Aktualnie, znane są liczne metody inaktywacji wirusa, oparte o własności wirusów i rodzaj wydzielanych białek, co znajduje odbicie w zwiększającej się ilości publikacji naukowych na ten temat.
Najpowszechniej stosowanymi produktami osocza są albumina, immunoglobuliny i koncentraty środków koagulujących. W 1948 roku, Gellis i in.: Chemical, clinical and immunological studies on products of human plasma fractionation: inactivation of virus of homologous serum albumin by means of heat (J. Clin. Invest. 1948; 27: 239-244) jako pierwsi zastosowali metodę inaktywowania wirusów przez ogrzewanie preparatu albuminy w temperaturze 60°C przez 10 godzin. Obecnie nadal sposób ten znajduje zastosowanie z uwagi na jego udowodnioną skuteczność w zmniejszeniu ryzyka przeniesienia wirusów. Ten sam sposób stosuje się do wytwarzania immunoglobulin G (IgG), z tą samą efektywnością. Ta efektywność może zależeć od sposobu oczyszczania tych produktów krwi, szczególnie zastosowania metody całkowitego frakcjonowania, opisanej przez Cohna (op. cit.) lub Kistlera i Nitschmanna: Large scalę production of human plasma fractions (Vox Sanguinis 1962;7:414-424).
Zastosowanie etanolu w licznych etapach frakcjonowania albuminy i IgG umożliwia wydzielenie wielu wirusów w różnych frakcjach. Etanol jest znanym środkiem dezynfekcyjnym wobec czynników patogenicznych, takich jak wirusy, co opisują Henin i in.: Inactivation and partition of human immunodeficiency virus during Kistler and Nitschmann fractioantion of human blood plasma (Vox Sanguinis 1988; 54: 78-83)) i Morgenthaier: Effect of ethanol on virus inactivation in plasma products (Current Studies in Hematology and Blood Transfusion. Basel Karger 1989; 56: 109-121)).
Pasteryzacja albuminy i IgG pojawiła się na początku lat pięćdziesiątych. Ta technika, jednakże, była ukierunkowana na inaktywację wirusa zapalenia wątroby (zapalenie wątroby typu B i nie-A nie-B). Curran i in.: Acquired immodeficiency syndrome (AIDS) associated with transfusion (N. Engl. J. Med. 1984; 310: 69-75)) rozważali kwestię przeniesienia wirusów typu HIV przez transfuzję lub zastosowanie innych preparatów krwiopochodnych, szczególnie środków koagulujących. Od tamtej pory, metody inaktywacji wirusa skupiły się na HIV. Nie stwierdzono przeniesienia HIV przy zastosowaniu albuminy lub IgG, przy czym brak przeniesienia wirusów zawdzięcza się etapowi pasteryzacji (Mitra i in.: Elimination of infectious retroviruses during preparation of immunoglobulins: (Transfusion 1986; 26: 394397)). Środki koagulujące takie jak czynniki VIII i IX szeroko stosuje się u pacjentów z hemofilią. Heimburger i in.: a- Faktor VIII - Konzentrat-hepatitissicher: Fortschritte in der Behandlung der Hamophilie A (Die gelben Hefte 1980; 20: 165-174) i b- A Faktor VIII concentrate, high purified and heated in solution (1st International Hemophilia Conference, Bonn.3-7 października 1980 roku, abstrakt 110 i 117) zastosowali do tych produktów tę samą technikę pasteryzacji, jak opisana dla albuminy, do inaktywacji wirusów podczas wytwarzania czynnika VIII w obecności glicyny i sacharozy, w celu uniknięcia denaturacji białka w warunkach denaturacji termicznej w temperaturze 60°C przez 10 godzin. Ich badania wykazują efektywność inaktywacji HIV, wirusa zapalenia wątroby typu B i zapalenia wątroby typu nie-A nie-B. Hilfenhaus i in.: a- Safety of human blood products: Inactivation of retroviruses by heat treatement at 60°C (Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1985; 178: 580-584) b- Inactivation of the AIDS-causing retrovirus and other human viruses in antyhemophilic plasma protein preparations by pasteurization (Vox Sanguinis 1986; 50: 208-211) c- Pasteurization as an efficient method to inactivate blood borne viruses in FVIII concentrates (Drug Res. 1986; 22: 621-625) potwierdzają, że pasteryzacja jest skutecznym sposobem inaktywacji wirusów takich jak HIV, podczas wytwarzania koncentratu czynnika VIII. Tabor i in.: Inactivation of hepatitis B virus by heat in antithrombin III stabilized with citrates (Thromb. Res. 1982; 22: 233-238) inaktywowali wirusa zapalenia wątroby typu B ogrze4
PL 194 589 B1 wając antytrombinę III w obecności cytrynianu jako stabilizatora. Hollinger i in.: Reduction in risk of hepatitis transmission by heat treatement of a human factor VIII concentrate (J. Infect. Dis. 1984; 150: 250-262) ogrzewali koncentrat czynnika VIII w stanie liofilizowanym w celu zmniejszenia ryzyka przeniesienia HIV i wirusa zapalenia wątroby. Piszkiewicz i in.: a- Heat inactivation of human immunodeficiency virus in lyophilized anti-inhibitor coagulant complex (Autoplex) (Thromb. Res. 1986; 44: 701707) b- Heat inactivation of human immunodeficiency virus in lyophilized factor VIII and factor IX concentrates (Thromb. Res. 1987; 47: 235-241) wykazali, że obróbka cieplna liofilizowanych koncentratów środków koagulujących nie wpływa znacząco na aktywność tych czynników. Autorzy podkreślili, że nie była oczywista możliwość wykrycia powstawania swoistych antygenów z uwagi na obróbkę cieplną. Badania inaktywacji wirusa metodą obróbki cieplnej prowadzili Piszkiewicz i in.: Virus inactivation by heat treatement of lyophilized coagulation factor concentrates. Virus inactivation in plasma products (Current Stuies in Hematology and Blood Transfusion. Basel, Karger 1989; 56: 44-54) podczas wytwarzania „czynników anty-hemofilicznych (Hemofil® T, Hemofil® CT), przy czym ten ostatni ogrzewano przez 72 godzin w temperaturze 60°C i podczas wytwarzania kompleksów inhibitora antykoagulanta (Auteptex® T), kompleksu czynnika IX (Proplex® SX-T i Proplex® T), przy czym ten ostetei ogrzewano przez 144 godzin w temperaturze 60°C. Nie stwierdzono serokonwersji HIV przy zastosowaniu dowolnego z pięciu produktów koagulacji poddanych obróbce cieplnej. Dla koncentratu Hemofilu® T przygotowanego z osocza, który był masowo badany na obecność HBsAg i anty-HBc, nie wykazano przeniesienia NANBH w badaniach na małpach. Jednakże, zastosowanie tego samego produktu przygotowanego z osocza, masowo badanego tylko na obecność HBsAg wywołało NANBH u pacjentów (Colombo i in.: Transmission of non-A, non-B hepatitis by heat treated factor VIII concentrate (Lancet 1985;ii:1-4)). Obecnie Hemofil® T wytwarza się z osocza, które jest niereaktywne wobec HBsAg i ma normalną zawartość ALT.
Wirusy, jak również białka, są trwalsze i odporniejsze na ogrzewanie gdy występują w stanie suchym (są liofilizowane). Temperatura i czas ogrzewania różnią się w zależności od własności białek tak, aby zminimalizować ich denaturację. Jednakże, jak dotąd nie stwierdzono bardzo dobrej efektywności inaktywacji wirusa: o przeniesieniu NANBH wspomnieli Colombo i in. (op. cit.). Przeniesienie HIV opisywali White i in. (HTLV-III seroconversion associated with heat-treated factor VIII concentrate (Lancet 1986; i: 611-612)) oraz Van den Berg i in. (Seroconversion to HTLV-III in hemophilic given heat-treated factor VIII concentrate (Lance 1986; i: 803-803)). Z tych powodów, Winkelman i in. (A new therapeutic factor VIII concentrate of high specific activity and high yield (Tromb. Haemost. 1985; 54: 19-22)) ogrzewali koncentrat czynnika VIII (typ 8Y), czynnika IX (typ 9A), czynnika VII, czynnika XI i trombiny w temperaturze 80°C przez 72 godziny. Badania prowadzono na 29 pacjentach, którym podano produkty poddane obróbce cieplnej. Wykazały one, że nie nastąpiła serokonwersja HIV/HB i że nie nastąpiło znaczące zmniejszenie częstości przeniesienia NANBH.
Inne sposoby inaktywacji wirusa opracowano w oparciu o z zastosowanie źródeł światła (UV, promienie gamma i laser) w celu napromieniowania czynników zakaźnych w osoczu. Następujące publikacje zamieszcza się tu na zasadzie odsyłacza: Oliphant i in.: Homologous serum jaundice: experimental inactyvation of etiologie agent in serum by ultraviolet irradiation (Publ. Health Rep 1946; 61: 598-600), Wolf i in.: Ultraviolet irradiation of human plasma to control homologous serum jaundice (JAMA 1947; 135; 476-477), Blanchard i in.: Methods of protection against homologous serum hepatitis II. The inactivation of hepatitis virus serum with ultraviolet rays (JAMA 1948; 138:341), Murray i in. Effect of ultraviolet radiation on the inefectivity of icterogenic plasma (JAMA 1955: 157: 8-14). Gurzadyan i in.: Mechanism of high power picosecond laser UV irradiation of yiruses and bacterial plasmids (Photochem. Photobiol. 1981; 3: 835-838), Redfield i in.: Psoralen inactivation of influenza and herpes simplex virus and of viral infected cells (Infect Immun 1981; 32: 1216-1226), Heindrich i in.: Clinical evaluation of the hepatits safety of beta-propiolactone-ultraviolet treated factor IX concentrate (PPBS), (Throm. Res. 1982; 28: 75), Kitchen i in.: Effect of gamma irradiation of the human immunodeficiency virus and human coagulation proteins (Vox Sang, 1989, 56: 233-229).
Od ponad 10 lat, jedną z najpowszechniej stosowanych metod inaktywacji wirusów w produktach krwiopochodnych jest sposób łączący zastosowanie rozpuszczalnika i detergenta. Tę metodę opracowali Neurath i Horowitz (opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 4540573 opublikowany we wrześniu 1985 roku, nr 4613501, nr 4764369 opublikowane w sierpniu 1988 roku; nr 4820805 opublikowany w kwietniu 1989 roku, nr 4841023 opublikowany w czerwcu 1989 roku i nr 5541294 opublikowany w lipcu 1996 roku). Mieszanina lub rozpuszczalnik/detergent (trifosforan n-butylu/detergent) zazwyczaj inaktywuje wirusy posiadające otoczki takie jak HIV, HTLV-I, HBV i EBV.
PL 194 589 B1
Metoda rozpuszczalnik/detergent jednakże nie jest odpowiednia do wytwarzania bezpiecznych produktów osocza, ze względu na ewentualną obecność wirusów nie posiadających otoczek, takich jak parwowirus i poliowirus, które są niewrażliwe na metodę rozpuszczalnik/detergent. Inną ostatnio wprowadzoną techniką eliminowania wirusów nie posiadających otoczek, na które nie wpływa metoda rozpuszczalnik/detergent, jest nanofiltracja. Nanofiltry składają się z mikroporowatych włókien i są sprzedawane pod nazwą handlową Planova BMM (Asahi Chemical Industries, Tokyo, Japan). Porowatość tych filtrów zmienia się od około 15 do 35 nm. Te filtry mogą zatrzymywać pewne typy wirusów o wymiarach większych niż około 25 nm. Te filtry efektywnie eliminują wirusy takie jak HIV-I (80-100 nm), HBB (42 nm), HCV (< 80 nm), wirus zapalenia wątroby typu Delta (35 nm), wirus bydlęcej biegunki wirusowej (60-70 nm), wirus Sindbis (60-70 nm), reowirus typu 3 (60-80 nm), poliowirus Sabin typu I (25-30 nm), ludzki parwowirus (20-25 nm); Sekiguchi i in.: Possibility of hepatite B virus (HBV) removal from human plasma using regenerated cellulose hollow fiber (BMM) (Membrane, 1989; 14: 253-261), Hamamoto i in.: A novel method for removal of human immunodeficiency wirus: filtration with porous polymeric membranes (Vox sang.,1989; 56: 230-236), Tsurumi i in.: Structure of cuprammonium regenerated cellulose hollow fiber (BMM hollow fiber) for wirus removal (Polym. J. 1990, 22: 751-758), Ishikawa i in.: Novel determination method of size of virus in solution using cuprammonium regenerated cellulose membrane (BMM) (Membranę, 1991; 16: 101-111), Tomokiyo i in.: Studies on virus elimination i inactivation effect of highly purified F-VIII concentrate (The clinical report, 1991; 25: 271-275), Manabe: Virus removal i inactivation in method validation (Animal Cell Technology: Basic & Applied Aspects (Murakami, H., Shirahata, S., Tachibana, H, 1992, 15-30), Burnouf-Radosewich i in.: Nanofiltration, a new specific virus elimination method applied to high-purity factor IX and factor VI concentrates (Vox Sanguinis 1994; 67(2): 132-138).
Rubinstein i in.: Combined solvent-detergent and 100°C (boiling) sterilizing dry-heat treatmentof Factor VIII concetrates to assure sterility (Vox. Sanguinis 1991; 60: 60) zastosowali podwójną inaktywację wirusową koncentratu czynnika VIII, poddając ten ostatni działaniu układu rozpuszczalnik/detergent i ogrzewając produkt końcowy w temperaturze 100°C przez 30 minut. Według tych autorów, obróbka termiczna produktu końcowego umożliwia inaktywację wirusów zapalenia wątroby typu nie-A nie-B posiadających otoczki nielipidowe. Obróbka cieplna produktu końcowego stanowi także ostrożny pomiar, w przypadku przypadkowego zakażenia wirusowego podczas zabiegów manualnych lub z powodu zastosowania zakażonego wyposażenia (Vox Sang., 1991: 60: 60).
Ostatnio, Proba i in. (opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 5506127) wprowadzili potrójną inaktywację wirusa podczas otrzymywania trombiny: (1) obróbka rozpuszczalnik/detergent, (2) nanofiltracja i (3) obróbka cieplna w temperaturze 100°C przez jedną godzinę liofilizowanego produktu (opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 5506127 wydane przez Haemacure Biotech Inc.).
Potrójna obróbka w celu inaktywacji wirusa zapewnia zwiększone bezpieczeństwo stosowania produktów krwiopochodnych, szczególnie środków koagulujących lub kleju biologicznego.
Niniejszy wynalazek zapewnia sposób przygotowywania trombin, które łączą wysoki poziom odzysku, jakości produktu i bezpieczeństwa wirusowego.
Przedmiotem mniejszego wynalazku jest sposób wytwarzania w skali masowej trombiny, charakteryzujący się tym, że obejmuje następujące etapy:
a) wytrącaniabiałek pełnegoosocza przez dodaniepierwszej soIl korzystniejednozasadowego fosforanu sodu lub potasu lub octanu sodu lub potasu, w ilości wystarczającej do osiągnięcia efektu wysalania, tj. osiągnięcia stężenia końcowego 1 M, i przy wartości pH 7,5 do 8,5, w temperaturze pomiędzy 0°C i 4°C, lub przez dodanie drugiej soli, korzystnie jednozasadowego fosforanu sodu lub potasu lub octanu sodu lub potasu, w ilości wystarczającej do osiągnięcia wytrącania na kwaśno, korzystnie przy stężeniu równym 1 mol na litr mieszaniny, przy wartości pH 4,5 do 5,5, w temperaturze pomiędzy 4°C do 20°C, dzięki czemu fibrynogen, czynnik XIII i fibronektyna wytrącają się, przy czym wspomniane wytrącanie prowadzi się w obecności kwasu 6-aminoheksanowego o stężeniu co najmniej 50 mM z odzyskiem supernatantu zawierającego protrombinę,
b) diafiitracji wymienionegosupernatantuaż do uzyskania roztworu protrombiny o o^rm^i^r^rn^s^c^i 100 mOsmoli/kg masy lub niższej,
c) rozcieńczania rc^^^ztw^ru protrombiny wodą, dodanąw i iości 4 objętości na 1 objętośćroztwotu protrombiny,
d) wytrącania protrombiny przez dodawanie kwasowego roztworu, korzystnie 2 do 5% kwasu octowego, aż do uzyskania wartości pH 5,2,
e) solubilizacji osadu otrzymanego według etapu (d) w roztworze o niemal obojętnym pH, i
PL 194 589 B1
f) przekształcania protrombiny otrzymanej według etapu (e) do trc^r^t^ir^yr, w obecności chlorku wapnia rnS, niy rziągoąć zrężcoic ahlrcSg wnuoin 20 dr 32 mM.
W Sśceyzroym wySroanig przedmiotowy zprzóe obejmuje ponadto oazrępgjąac crapy:
g) ioSgeśwaoia wymicoirocj rcrmeioy e wicgzreójaeym rrerwrrcm crepuzenealoiS/dcrccgcor, w ilrCai wyzracaeająacj dr ioaSrywaaji wirgzów eawiccająayah lipidy,
h) raeyzeaeaoia ioSgerwaocj zgezraoaji mctodą zcSwcoayjocj ahcrmatogcafii jrorwymicoocj, e eaztozrwaoicm pśjcdyoaecgr Sariroirg e prlizaaharydg aSrywrwaocgr zglfalSilcm, wyecaocgr e grupy śecjmgjąacj prliagarreę aSrywrwaoą zglfalSilcm, prlidcSzrrao aSrywrwaoy zglfalSilcm i oicCaiCliwcgr rCrrdSa ełrżrocgr e dcSzrraog aSrywrwaocgr zglfalSilcm i aeązrcS SrecmiroSi r wyzrSicj zclcSryworCai wreca rrrmeioy, zrrzgjąa CrrdcS clggjąay w ar oajmoicj rrecah różoyah, werazrająayah zrężcoiaah wrdocgr rrerwrrg egfrrg, i
i) odzyskiwania trombiny wymywanej chromatograficznie według ecapu (h) i wymiany buforu clgarg oa fiejrlrgiaeoic Srmparyeiloy egfrr zraeiliegjąay prcparar, w aclg zraeilieaaji rdeyzSaocj rrrmeioy i rdeyzSaoia egfrrrwaocgr rrerwrrg prcparato rrrmeioy.
Zalcaa zię, aey w crapic diafilrraaji (e) oazręprwała wymiaoa wrdy w rejętoćai róworważocj aercrcm rejęrrCairm zgpcroaraora.
Proadrr Srreyzroic jczr, jcCli w crapic (f) drdajc zię 40 mM rrerwór ahlrrSg wapoia w rejęrrCai róworważocj aercrcm rejęrrCairm zrlgeilierwaocgr rzadg rrreymaocgr wcdłgg crapg (c).
Prżądaoc jczr, aey rCrrdcS wymiaoy Sarirog zraorwił oicCaiCliwy rCrrdcS, ełrżroy e dcSzrraog aSrywrwaocgr zglfralSilcm i aeązrcS SrecmiroSi lge oicCaiCliwy rCrrdcS ełrżroy e dcSzrraog aSrywrwaocgr zglfrprrpylcm i aeązrcS SrecmiroSi.
W Srreyzroym wySroaoig precdmirrrwy zprzóe wcdłgg wyoalaeSg recjmgjc proadrr crap (j) precząaeaoia egfrrrwaocgr rrerwrrg prcparato rrrmeioy prece mcmeraoę Sapilaroą e aclglrey micdeirwcj, w aclg rdząaecoia wirgzów wyzrępgjąayah w egfrrrwaoym rrerwrrec prcparato i rdeyzSg w eazadeic oic eawicrająacgr wirgza egfrrrwaocgr rrerwrrg prcparato rrrmeioy.
Zalcaa zię, aey mcmeraoa Sapilaroa e aclglrey micdeirwcj miała prrrwatoCć 15 om.
W prżądaoym wySroaoig zprzreg wcdłgg wyoalaeSg, precdmirrrwy zprzóe recjmgjc proadrr oazrępgjąac crapy:
S) lirfilieaaji rrerwrrg rrrmeioy rrreymaocgr wcdłgg crapg (j); i
l) zgahcgr rgrycwaoia lirfilierwaocgr rrerwrrg prcparato rrrmeioy, w aclg ioaSrywaaji wzeclSiah prerzrająayah wirgzów, ece dcoargraaji rrrmeioy.
Krreyzroic, precdmirrrwy zprzóe proadrr recjmgjc Srńarwy crap lirfilieaaji dr zgaha egfrrrwaocgr rrerwrrg prcparato rrrmeioy i prddaoic gr reróeac aicplocj, w aclg rdeyzSaoia oic eawicrająacj wirgzów i oicedcoargrrwaocj rrrmeioy.
Prżądaoc jczr, aey zgahą reróeSę aicploą precprrwadeać, rgrecwająa lirfilierwaoy prrdgSr prece 1 dr 2 grdeio w rcmpcrargrec 100°C.
Proadrr, jczr Srreyzroic, jcCli egfrrrwaoy rrerwór prcparato recjmgjc rrerwór wrdoy zrli ayrryoiaorwcj, ahlrrSg zrdg, Triz-HCl i alegmioy zgrrwiay Srwi, r pH rSrłr 7,3, w ilrCaiaah wyzraraeająayah dr zraeilieaaji rrrmeioy wreca iztoroej zrrary aSryworCai prdaeaz reróeSi aicplocj.
Nadto ealcaaoc jczr, aey egfrrrwaoy rrerwór prcparato eawicrał rrerwór wrdoy 0,25% ayrryoiaog zrdg, 0,45% ahlrrSg zrdg, 0,25% Triz-HCl, wzeyzrSic jaSr prracorrwc zrężcoia wagrwc, alegmioę zgrrwiay Srwi w ilrCai rówocj 20 raey łąaeocj ilrCai eiałSa w clgaaic, rdprwiadająaym piSrwi rrrmeioy i grcgglrwaoą precd lirfilieaają dr 2% zrężcoia wagrwcgr, i r pH 7,3.
Krreyzroic, dla lgdeSicj rrrmeioy egfrr r werazrająayah zrężcoiaah zSłada zię e 0,08M, 0,15M i 0,4M egfrra NaCl.
Proadrr prżądaoc jczr, aey crap ioSgeaaji (g) prrwadeić w recaorCai wirgzreójaecgr rrerwrrg rrepgzeaealoiS/dcrcrgcor, ece ayrryoiaog zrdg.
Zalcrą oioicjzecgr wyoalaeSg jczr zpcłoiaoic wzeyzrSiah wymagań precmyzłrwyah recjmgjąayah Srzer, zSgrcaeorCć i ecepicaecńzrwr wirgzrwc.
Precdmirrrwy wyoalaecS erzraoic proiżcj eliżcj rpizaoy oa prdzrawic oazrępgjąayah Srreyzroyah zpcayfiaeoyah preySładów jcgr wySroaoia i ryzgoSg, oa Srórym fig. 1 ilgzrrgjc crapy wyrwareaoia Sroacorrarg fieryorgcog, aeyooiSa XIII i fierrocSryoy, praeąwzey rd lgdeSicgr rzraea miczeaocgr, fig. 2 precdzrawia zprzóe wyrwareaoia rrrmeioy, praeąwzey rd zgpcroaraorg rzraea prerzrałcgr pr ierlaaji Sroacorrarg fieryorgcog, aeyooiSa XIII i fierrocSryoy.
PL 194 589 B1
P r z y k ł a d p o r ó w n a w c z y 1:
Wytwarzanie koncentratu bogatego w fibrynogen, czynnik XIII i fibronektynę
Pierwsze frakcjonowanie
Mieszane osocze utrzymuje się w temperaturze pomiędzy około 16 i około 37°C. Mieszając, dodaje się kwas 6-aminoheksanowy w celu osiągnięcia minimalnego stężenia 50 mM. Mieszaninę inkubuje się przez co najmniej 15 minut w temperaturze 35 do 37°C. Mieszaninę następnie ochładza się do temperatury 0°C ± 2°C, po czym dodaje się jednozasadowy fosforan sodu lub potasu (opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 5290918, wydany przez Haemacure Biotech Inc.) lub octan sodu lub potasu (opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 5395923, wydany przez Haemacure Biotech Inc.) w celu osiągnięcia stężenia końcowego 1 M. Mieszaninę miesza się przez około 0,5 do 1 godziny w temperaturze około 0 do 4°C ± 2°C. Kwasowe wytrącanie z zastosowaniem fosforanów można także prowadzić w temperaturze pokojowej (około 20°C).
Odwirowanie
Mieszaninę przesącza się lub odwirowuje przy 4200 obrotach/minutę (Beckman J6-MC, wirnik typu 4.2) przez 20 minut w temperaturze 4°C. Supernatant odzyskuje się dla preparatu trombiny i osad przenosi się do innej zlewki. Supernatant można stosować bezpośrednio do dalszej obróbki lub można go przechowywać w temperaturze poniżej -30°C, korzystnie w temperaturze -80°C przez wiele miesięcy lub w temperaturze 2 do 4°C przez około 24 godziny.
Solubilizacja
Otrzymany osad bogaty w fibrynogen, czynnik XIII i fibronektynę solubilizuje się z buforem zawierającym 1% Tris i 1,6% cytrynianu sodu, o pH: 6,0 ± 0,1 (dopuszczalne jest pH 7,3). Osad solubilizuje się w temperaturze pokojowej, mieszając. Następnie dodaje się opisany powyżej bufor w celu uzyskania stężenia białka około 20-22 mg/ml. Wówczas dodaje L-histydynę w ilości 0,2-0,3 g na 1 g białka. Roztwór białkowy następnie odwirowuje się przy 10000 obrotów/minutę przez 20 minut w temperaturze około 4°C (Beckman J2-MI, wirnik typu JA-10). Warstwę lipidu utrzymującą się na powierzchni roztworu białkowego usuwa się, roztwór białkowy ostrożnie przenosi się do zlewki i przesącza przez kapsułowy filtr 0,2 mikrona (Gelman SuporCap, produkt nr 12991 lub 12992).
Obróbka rozpuszczalnikiem/detergentem
Tak przesączony roztwór białkowy poddaje się obróbce w celu inaktywacji wirusów przez zmieszanie z równą objętością roztworu zawierającego 1% Tris, 1,6% cytrynianu sodu, 2% Tween80® (polioksyetylenowany monooleinian sorbitolu) i 0,6% fosforan n-butylu Tris (TnBP), o pH: 6,8 ± 0,1. W ten sposób uzyskuje się stężenie końcowe około 10 mg białka/ml, 1% Tween80® i 0,3% TnBP, końcowe pH wynosi około 7,0 ± 0,2. Roztwór inkubuje się w temperaturze 24°C ± 1°C, stale mieszając, przez co najmniej 6 godzin.
Usuwanie wirusów metodą nanofiltracji
Po obróbce w celu inaktywacji wirusów, zawartość Tween80® w białku następnie reguluje się od 2% do 4% stężenia końcowego, stosując bufor zawierający 1% Tris, 1,6% cytrynianu sodu, 6% Tween80®, o pH 7,0 ± 0,1. Mieszaninę następnie przesącza się przez kaskadę filtrów kapsułowych 0,2 i 0,1 mikrona (Gelman CritiCap 0,2 μ, produkt nr 12995 lub 12996; CritiCap 0,1 μ product nr 12997 lub 12999) i przesączony roztwór przepuszcza się przez filtr Planova BMM 35 nm. Dodanie Tween80® jest konieczne w celu ułatwienia przesączenia cząstek o dużej masie cząsteczkowej, takich jak fibrynogen i w celu optymalizacji jego odzysku. Przy braku Tween80™, filtr szybko blokuje się ze względu na obciążenie białkami.
Drugie frakcjonowanie mM kwasu 6-aminoheksanowego dodaje się do przesączu, mieszając i mieszaninę inkubuje się w temperaturze 35°C ± 2°C przez około 1 godzinę i następnie ochładza do temperatury 0°C ± 2°C. Następnie dodaje się jednozasadowy fosforan sodu lub potasu (opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 5290918, wydany przez Haemacure Biotech Inc.), lub octan sodu lub potasu (opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 5395923 wydany przez Haemacure Biotech Inc.) w ilości równoważnej jednemu molowi na litr mieszaniny i natychmiast pojawia się osad. Mieszanie kontynuje się przez 1 godzinę w temperaturze 0°C ± 2°C.
Odwirowanie
Mieszaninę przesącza się lub odwirowuje przy 4200 obrotach/minutę (Beckman J6-MC, wirnik typu 4.2) przez 20 minut w temperaturze 4°C. Rozpuszczalnik, detergent i zanieczyszczania białkowe usuwa się przez odwirowanie. Osad odzyskuje się i przenosi do zlewki.
PL 194 589 B1
Mycie
W celu zobojętnienia roztworu osad przemywa się kilkakrotnie (co najmniej 2 razy) buforem 0,1% Tris, o pH 7,0 ± 0,1. Zależnie od stosowanej soli w poprzednim etapie wytrącania, pH i stężenie roztworu Tris może zmieniać się od 4,5-5,0 do 9,5-10,5 (stężenie 0,1 do 0,5%). Osad oddziela się przez odwirowanie po każdym etapie mycia. Bufor Tris uprzednio ochładza się do temperatury 0°C ± 2°C i etapy mycia prowadzi się w temperaturze 0°C ± 2°C. Praca w temperaturze pokojowej również daje dobre rezultaty. Liczbę etapów mycia można zmniejszyć przez zastosowanie prostej dializy lub diafiltracji po umieszczeniu osadu z powrotem w buforze końcowym, stosując roztwór wodny zalkalizowany do pH 7,3.
Solubilizacja
Przemyty osad rozpuszcza się w buforze końcowym zawierającym 0,5% Tris, 0,1% NaCl i 0,5% cytrynianu sodu, o pH 6,8 ± 0,1 (dopuszczalne jest pH 7,3). Objętość buforu wynosi około 2 do 3 ml/g masy osadu. Solubilizację osadu można przyspieszyć ogrzewając w temperaturze 37°C. Po zakończeniu solubilizacji, dodaje się ilość L-histydyny odpowiadającą 0,2-0,3 g na 1 l wyjściowego osocza. Roztwór białkowy następnie przesącza się lub odwirowuje przy 10000 obrotów/minutę przez 20 minut w temperaturze około 4°C (Beckman J2-MI, wirnik typ JA-10).
Figura 1 przedstawia końcowe etapy wytwarzania koncentratu bogatego w fibrynogen, czynnik XIII i fibronektynę.
Regulowanie stężenia białka
Końcowe stężenie białka reguluje się do około 30-40 mg/ml, stosując ten sam bufor. Stężenie białka mierzy się gęstością optyczną przy 280 nm.
Preparat
Stężenie końcowe L-histydyny reguluje się do 0,2-0,4, korzystnie 0,4 g na 1 g białka, mierzonego metodą gęstości optycznej według następującego wzoru:
[0,4 g (L-histydyny) x stężenie białka mg/ml (gęstość optyczna) x objętość] - dodana L-histydyna 0,2-0,3 g/l osocza]
Do mieszaniny dodaje się sacharozę w ilości odpowiadającej 0,5 g/g białka zmierzonego metodą gęstości optycznej.
Do mieszaniny dodaje się ludzką albuminę (25% w roztworze, zaaprobowana do stosowania u ludzi Plasbumina 25®z firmy Miles Inc. Pharmaceutical Division, IN 46515 USA) w ilości odpowiadającej 0,2 ml/g białka zmierzonego metodą gęstości optycznej.
Ilość Tween80® reguluje się do 17-20 ng/mg białka zmierzonego metodą gęstości optycznej, stosując bufor zawierający 0,5% Tris, 0,1% NaCl, 0,5% cytrynianu sodu i 10% Tween80®, o pH 6,8 ± 0,1. Przed regulacją Tween80® należy zweryfikować metodą gęstości optycznej przy 620 nm, zgodnie z techniką New York Blood Center.
Sterylna filtracja
Końcowy roztwór białkowy przesącza się przez filtr kapsułowy 0,2 mikrona (Gelman, CritiCap 0,2 μ, produkt nr 12995 lub 12996).
Aseptyczne napełnianie
Roztwór białkowy umieszcza się w fiolkach o objętości 10 ml w ilości 60 ± 5 mg krzepliwego fibrynogenu na fiolkę.
Liofilizacja
Kolby zawierające 60 ± 5 mg krzepliwy fibrynogen poddaje się liofilizacji przez 66-72 godzin. Temperaturę podwyższa się progresywnie od -40°C do 22°C ± 2°C (postęp wzrostu wyniósł 0,02°C na minutę). Po tym etapie liofilizacji produkt zawiera poniżej 1% wilgoci, co zabobiega denaturacji podczas dalszej obróbki cieplnej.
Suche ogrzewanie
Po cyklu liofilizacji, fiolki zamyka się pod zmniejszonym ciśnieniem korkami i uszczelnia aluminiowymi nakrętkami. Fiolki następnie poddaje się trzeciej inaktywacji wirusów metodą suchej obróbki cieplnej w temperaturze około 100°C ± 1°C przez 1 do 2 godzin, sposobem ujawnionym w opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 5506127 opublikowanym w kwietniu 1996 roku.
Bezpieczeństwo wirusowe
Oszacowano bezpieczeństwo wirusowe. Małe wirusy nie posiadające otoczek, jak parwowirus, poliowirus i wirus zapalenia wątroby typu A, są inaktywowane obróbką cieplną. Głównym, oczekiwanym problemem związanym z odzyskiem było uzyskanie możliwie największą ilość fibrynogenu po nanofiltracji. Tę trudność pokonano odpowiednio regulując stężenie Tween80® w celu uprzywilejowaPL 194 589 B1 nia przedostawania się fibrynogenu przez nanofiltr. Wirusy nie posiadające otoczek, reowirus 3 i SV40, usunięto metodą nanofiltracji. Więc, każdy etap inaktywacji wirusa osiągnął swój cel: usunięcie lub inaktywację wirusów w każdym, odpowiednim etapie, zapewniając bezpieczny wirusowo produkt. Oznacza to, że kombinacja trzech etapów zapewnia inaktywację lub wychwycenie wirusów dzięki co najmniej jednemu z nich; w przeciwnym wypadku wirusy odporne na działanie jednego lub dwóch etapów można wykryć w produkcie końcowym.
Odzysk
Całkowity odzysk fibrynogenu, fibronektyny i czynnika XIII jest równoważny ujawnionemu w opisach patentowych St. Zjedn. Ameryki nr 5290918 i nr 5395923, oznacza to, że bezpieczeństwo wirusowe jest zapewnione przy zachowaniu aktywności białek.
P r z y k ł a d 1: Produkcja trombiny
Zmniejszanie zawartości soli metodą diafiltracji
Supernatant osocza, otrzymany po pierwszym odwirowaniu kwasu lub wysoleniu osadu osocza (jak w przykładzie 1), zawiera znaczną ilość soli. Osmolarność osoczowa po obróbce solami wynosi pomiędzy około 2200 i 2500 mOsm/kg. Tę dużą ilość soli należy usuwać w celu wydzielenia protrombiny zawartej w supernatancie. Wydzielanie protrombiny można przeprowadzić tylko, gdy środowisko osoczowe ma niską moc jonową, szczególnie gdy stosowano wytrącanie kwasem. Usunięcie soli przeprowadza się klasyczną metodą diafiltracji. Supernatant przenosi się do układu zbiorników diafiltracyjnych (Amicon system, model DC10L ze spiralną wkładką). Diafiltrację przeprowadza się wobec czystej wody. Jedną objętość supernatantu osocza wymienia się na średnio cztery objętości czystej wody lub aż do osiągnięcia osmolarności osocza poniżej około 50 do 100 mOsm/kg.
Odzysk protrombiny
Diafiltrowane osocze rozcieńcza się pięcioma krotnościami czystej wody. pH rozcieńczonego osocza wynosi pomiędzy około 7,4-7,8. pH obniża się do 5,2 ± 0,1 wkraplając roztwór kwasu octowego (2 do 5%; Allary i in. Ann. pharmaceutiques francaises 48, 129-135, 1990). Protrombina wytrąca się podczas obniżania pH (przy około 5,5-6,0) i ulega całkowitemu wytrąceniu przy pH pomiędzy 5,1 do 5,3. Protrombina szybko ponownie solubilizuje przy pH wyższym niż 6,0 i przy wzroście stężenia soli. Osocze inkubuje się bez mieszania przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej i następnie odwirowuje się przy 4200 obrotach/minutę przez 20 minut w temperaturze 20°C (Beckman J6MC, wirnik JS 4.2). Osad odzyskuje się i solubilizuje w 2% roztworze buforu Tris-HCI przy pH 7,5 ± 0,1 (objętość: 120-150 ml na 1 l supernatantu osocza). Ilość protrombiny określa się przez dawkowanie chronometryczne (Fibrometre Stago ST4 - Francja). Odzysk protrombiny wynosi około 90% w odniesieniu do supernatanta osocza i wyjściowego osocza, co daje około 750 do 850 jednostek protrombiny na 1 l osocza.
Konwersja protrombiny do trombiny
Cztery objętości 40 mM CaCb szybko dodano do jednej objętości roztworu protrombiny, mieszając przez kilka minut. Mieszaninę inkubuje się w temperaturze pokojowej przez około jedną godzinę lub dłużej i odwirowuje się przy 4200 obrotach/minutę przez 30 minut w temperaturze 20°C (wirówka Beckman J6MC, wirnik JS 4.2). Supernatant zawierający trombinę odzyskuje się i przesącza przez filtr 0,2 mikrona (Gelman SuporCap, produkt nr 12991 lub 12992), Aktywność surowej trombiny otrzymanej po konwersji protrombiny wynosi około 110 do 120 jednostek NIH/ml. Specyficzna aktywność wynosi około 25 do 30 jednostek NIH/mg białka, lub 80 do 100 jednostek NIH trombiny na jednostkę protrombiny. Całkowity odzysk trombiny wynosi w przybliżeniu 60,000-80,000 jednostek NIH na litr supernatanta osocza, np. dwukrotnie więcej niż odzysk zmierzony metodą ujawnioną w opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 5506127.
Aktywność trombiny oszacowano mierząc czas koagulacji na fibrometr (Fibrometre Stago ST4 Francja) i wyrażono w jednostkach NIH. Krzywą wzorcową ustalono w oparciu o trombozym (odczynniki Stago, Thrombozym ref. 00332); aktywność tego ostatniego określono z wzorca NIH, serii J (miano 310 NIH). Mieszane osocze użyto jako źródło fibrynogenu do określania aktywności trombiny.
Inaktywacja wirusa metodą rozpuszczalnik/detergent
Figura 2 przedstawia etapy inaktywacji wirusa przeprowadzone dla roztworu trombiny przez kolejne zastosowanie techniki rozpuszczalnik/detergent, oczyszczenia trombiny metodą chromatografii, odsączenia wirusów, wykonania preparatu, liofilizacji i inaktywacji wirusów przez ogrzewanie w temperaturze 100°C. Roztwór trombiny przenosi się do zbiornika o podwójnych ścianach zaopatrzonego w układ cyrkulacji cieczy termostatującej w temperaturze 24°C ± 0,5°C. Roztwór zawierający 11% Tween80® i 3,3% Wfosforanu n-butylu (TnBP) w 0,5% Tris, o pH 7,0 ± 0,1, dodaje się do rozporu
PL 194 589 B1 trombiny, delikatnie mieszając. Objętość układu rozpuszczalnik/detergent stanowi jedną dziesiątą objętości roztworu trombiny. Po jednej godzinie mieszania, mieszaninę przenosi się do drugiego zbiornika podobnego do zbiornika pierwszego i kontynuuje się mieszanie przez następne około 5 godzin. Aktywność trombiny zmierzona po inaktywacji wirusa wskazuje, że nie nastąpiła znacząca strata aktywności w wyniku obróbki rozpuszczalnik/detergent (0 do 5%). Warto zauważyć, że jeśli ilość stałego CaCl2 jest w przybliżeniu równoważna ilości ciekłego CaCb dodanego w celu przekształcenia protrombiny do trombiny, odzysk był niższy o 20% w przypadku proszku i strata aktywności wyniosła około 10 do 15% w wyniku obróbki rozpuszczalnik/detergent. Całkowita różnica pomiędzy dodaniem proszku wapnia w porównaniu do roztworu CaCb wykazuje stratę około 30% aktywności trombiny dla tego pierwszego.
Oczyszczanie trombiny metodą chromatografii
Trombinę następnie oczyszcza się metodą jednoetapowej chromatografii kationo-wymiennej. Chromatograficzne oczyszczanie białek jest techniką dobrze znaną i opisaną szczegółowo w wielu publikacjach. Zastosowanie różnych matryc lub nośników zależy od oczyszczanego produktu i własności białek. W tym przypadku, nośnikiem jest sztywny żel agarozowy zawierający wszczepiony sulfopropyl (-CH2-CH2-CH2-SO3). Żel o nazwie SP Sepharose Fast Flow™ (Pharmacia, kod nr 17-072901) jest mocnym kationitem o doskonałych właściwościach przepływu i dużej pojemności dla białek o wszystkich wartościach pH. Grupą wymieniającą jon jest sulfopropyl, na którym pozostaje ładunek i który utrzymuje stale wysokie pojemności w całym zakresie roboczym, przy pH 4-13. Roztwór białkowy zawierający surową trombinę przepuszcza się przez kolumnę zawierającą SP Sepharose. Trombinę i zanieczyszczające białka są absorbowane na nośniku. Przed wymywaniem białek zatrzymanych na żelu niezbędne jest staranne przemycie żelu 0,08 M roztworem NaCl. Wymywanie trombiny przeprowadza się stosując nieciągły gradient NaCl. Najpierw 0,15 M roztwór NaCl przepuszcza się przez kolumnę w celu usunięcia zanieczyszczających białek. Trombina ulega całkowitemu odszczepieniu i jest odzyskiwana w 0,4 M roztworze NaCl. Z żelu następnie usuwa się wszystkie zaadsorbowane zanieczyszczenia, przemywając 2 M roztworem NaCl. Oczyszczenie trombiny metodą chromatografii także umożliwia usunięcie układu rozpuszczalnik/detergent zastosowanego w poprzednim etapie inaktywacji wirusa. Oczyszczony roztwór trombiny stabilizuje się przez dodanie ludzkiej albuminy (roztwór ludzkiej albuminy Plasbumin-25 25%-USP, Miles Inc. Pharmaceutical Division, IN 46515 USA). Ilość albuminy, którą należy dodać oblicza się według następującego wzoru:
x [cl trombiny (zmierzona metodą gęstości optycznej) x objętość trombiny (po chromatografii) x 100 mli
25x1000
Trombina w roztworze po oczyszczaniu chromatograficznym jest bardzo nietrwała. Strata aktywności może być istotna jeśli trombiny nie zakonserwuje się szybko w niskiej temperaturze lub jeśli inne etapy takie jak diafiltracja i zatężenie są przeprowadzane bez stabilizowania. Zastosowanie stabilizatora takiego jak albumina jest niezbędne do zabezpieczenia aktywności trombiny podczas wymiany buforu w celu uzyskania końcowego preparatu (system Amicon CH2PRS lub TCF 10 po objętości). Końcowy preparat znajduje się w buforze o składzie 0,25% Tris - 0,25% cytrynianu sodu - 0,45% NaCl, o pH 7,30 ± 0,1. Około sześć objętości preparatu buforowego są wymieniane za jedną objętość roztworu trombiny. Roztwór trombiny można zatężyć kilkakrotnie przed diafiltracją w celu zmniejszenia wymienianej objętości i skrócenia czasu diafiltracji.
Odsączanie wirusów:
Zgodnie z metodami ujawnionymi w opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 5506127 opublikowanym dnia 9 kwietnia 1996 roku, diafiltrowany roztwór trombiny następnie przesącza się przez membranę kapilarną taką jak mikroporowata membrana Planova BMM (mikroporowata membrana Bemberg BMM, Development, Asahi Chemical Industries, Tokyo, Japan) zawierającą włókno z regenerowanej celulozy miedziowej o wymiarze porów około 15 nm. Ta technika w zasadzie umożliwia usunięcie wirusów posiadających otoczki nielipidowe, których nie można inaktywować obróbką SD (rozpuszczalnik/detergent).
Aseptyczne napełnianie
Roztwór trombiny po nanofiltracji rozcieńcza się do około 250 jednostek NIH/ml i wprowadza do szklanych kolb o objętości 5 ml.
PL 194 589 B1
Liofilizacja
Kolby zawierające 1 ml roztworu trombiny liofilizuje się przez 66 do 72 godzin. Temperaturę zwiększa się progresywnie od -40 do 22 ± 2°C przy postępie wzrostu temperatury około 0,02°C na minutę. Po tym etapie produkt zawiera poniżej 1% wilgoci.
Suche ogrzewanie
Po cyklu liofilizacji, fiolki zamyka się pod zmniejszonym ciśnieniem korkami i uszczelnia aluminiowymi nakrętkami. Fiolki następnie poddaje się trzeciej inaktywacji wirusa metodą suchej obróbki cieplnej w temperaturze około 100°C ± 1°C przez około 1 do 2 godzin.
Podsumowanie
Wychodząc od metod ujawnionych w opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 5290918, opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 5395923 i opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 5506127, wszystkie będące własnością Haemacure Biotech Inc, niniejszy wynalazek wykazał, że te metody można ulepszyć w celu zwiększenia odzysku trombiny o wysokim stopniu bezpieczeństwa i w celu zapewnienia bezpieczeństwa wirusowego koncentratowi fibrynogenu, nie tracąc na odzysku.
Claims (15)
1. Sposób wytwarzania trombiny, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:
a) wytrącania białek pełnego osocza przez dodanie pierwszej soli, korzystnie jednozasadowego fosforanu sodu lub potasu lub octanu sodu lub potasu, w ilości wystarczającej do osiągnięcia efektu wysalania, tj. osiągnięcia stężenia końcowego 1 M, i przy wartości pH 7,5 do 8,5, w temperaturze pomiędzy 0°C i 4°C, lub przez dodanie drugiej soli, korzystnie jednozasadowego fosforanu sodu lub potasu lub octanu sodu lub potasu, w ilości wystarczającej do osiągnięcia wytrącania na kwaśno, korzystnie przy stężeniu równym 1 mol na litr mieszaniny, przy wartości pH 4,5 do 5,5, w temperaturze pomiędzy 4°C do 20°C, dzięki czemu fibrynogen, czynnik XIII i fibronektyna wytrącają się, przy czym wspomniane wytrącanie prowadzi się w obecności kwasu 6-aminoheksanowego o stężeniu co najmniej 50 mM z odzyskiem supernatantu zawierającego protrombinę,
b) dd5fltr;aaji wymienioneegsupprnatantuaa dduzzssaniarootworu protrombinyoosmolarności 100 mOsmoli/kg masy lub niższej,
c) roozienccznia rootwyruprotrombinywy0ą.dd0anew iI oSci 4 oOjętoScine 1 oOjętoSćrootwyru protrombiny,
d) wytrąccnia protrombine preze do0dwynie kwynowyeg rootwyru, karzzsUnie 2 dd 5% kwynu octowego, aż do uzyskania wartości pH 5,2,
e) solubilizacji osadu otrzymanego według etapu (d) w roztworze o niemal obojętnym pH, i
f) przekształcania protrombiny otrzymanej według etapu (e) do trombiny, w obecności chlorku wapnia tak, aby osiągnąć stężenie chlorku wapnia 20 do 32 mM.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje ponadto następujące etapy:
g) inkubowania wymienionej trombiny z wirusobójczym roztworem rozpuszczalnik/detergent, w ilości wystarczającej do inaktywacji wirusów zawierających lipidy,
h) oczyszczania inkubowanej substancji metodą sekwencyjnej chromatografii jonowymiennej, z zastosowaniem pojedynczego kationitu z polisacharydu aktywowanego sulfalkilem, wybranego z grupy obejmującej poliagarozę aktywowaną sulfalkilem, polidekstran aktywowany sulfalkilem i nieściśliwego ośrodka złożonego z dekstranu aktywowanego sulfalkilem i cząstek krzemionki o wysokiej selektywności wobec trombiny, stosując środek eluujący w co najmniej trzech różnych, wzrastających stężeniach wodnego roztworu buforu, i
i) οί^Σ^^θ^ trr^r^t^ir^^^ wymbwyner ch)omataorarlccaie weeR-iu θ^ρη (h) I w^^r^ićjr^^^ buPoru eluatu na fizjologicznie kompatybilny bufor stabilizujący preparat, w celu stabilizacji odzyskanej trombiny i odzyskania buforowanego roztworu preparatu trombiny.
3. SSmió wyełup za^rz. 1 albb 2, zznmieenn ttym Iż eeaa dianιrraaji (b) ooejmuje wymiane wody w objętości równoważnej czterem objętościom supernatanta.
4. Sppsuówyełup zznUΓz. 1 albb2, z znmieeny tym, żż w 2ranie (0 ddodij się44 ni (ootwyr chlorku wapnia w objętości równoważnej czterem objętościom solubilizowanego osadu otrzymanego według etapu (e).
5. Sp^ito wyełup zzrStz. 2, zr^ć^r^ier^r^^ tym, że oSro0kiem wymiane kationu ośrodek złożony z dekstranu aktywowanego sulfoalkilem i cząstek krzemionki.
PL 194 589 B1
6. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym. że ośrodkiem wymiany kationu jest ni^^tci^lii^yy ośrodek złożony z dekstranu aktywowanego suifopropyiem i cząstek krzemionki.
7. Sppssb weełuu zzatrz. 2, znamienny tym, 2ż ooejmuje ppnntto etaa jj) przzeąączaia buforowanego roztworu preparatu OromUiny przez membranę kapilarną z ceiuiozy miedziowej, w ceiu odsączenia wirusbw występujących w buforowanym roztworze preparatu i odzysku w zasadzie nie zawierającego wirusa buforowanego roztworu preparatu trombiny.
8. Spooób według zas^z. 7, znamienny tym, że membeana kapiiarna z celulozy miedziov/ej ma porowatość 15 nm.
9. SposbU według zastrz. 7, zaaminaay tym, że obejmuje ponadto następujące etapy: k) iiofiiizacji roztworu trombiny otrzymanego według etapu (j); i
i) suche ogrzewanie iiofiiizowanego roztworu preparatu trombiny, w ceiu inaktywacji wszeikich pozostających wirusbw, bez denaturacji trombiny.
10. Sposbb według zastrz. 2, zaaminaay tym, że ponadto obejmuje końcowy etap iiofiiizacji do sucha buforowanego roztworu preparatu trombiny i poddanie go obrbbce ciepinej, w ceiu odzyskania nie zawierającej wirusbw i niezdenaturowanej trombiny.
11. Bspośb wweług zas^. 2 zlbb 20, zzamienaa tym, że sschązOeZbeęzieelną zrzzerzweadz się, ogrzewając iiofiiizowany produkt przez 1 do 2 godzin w temperaturze 100°C.
12. Sp^cJ^ć^t) weeług zzi^z. 2, zzamienaa tym, że beff>-zwesn ζ^.^ przeptztu oObjmuje zrotwbr wodny soii cytrynianowej, chiorku sodu, Tris-HCi i aibuminy surowicy krwi, o pH około 7,3, w iiościach wystarczających do stabiiizacji trombiny wobec istotnej straty aktywności podczas obrbbki ciepinej.
13. Ssmib weeługzzstrz. 21, z zamienaa tym, że Zeff>-zwesn ζ^ιπζΙτ zObjmuje rz— twbr wodny 0,25% cytrynianu sodu, 0,45% chiorku sodu, 0,25% Tris-HCi, wszystkie jako procentowe stężenia wagowe, aibuminę surowicy krwi w iiości rbwnej 20 razy łącznej iiości białka w eiuacie, odpowiadającym pikowi trombiny i ureguiowaną przed iiofiiizacją do 2% stężenia wagowego, i o pH 7,3.
14. Spooch weełuu zassrz. 2, znamienny tym, że dla ^ζ^βΐ jtombinn bufc>- o wz-astatąccch stężeniach składa się z 0,08M, 0,15M i 0,4M bufora NaCi.
15. Spoośb wedku zassrz. 2, znamienna tym, że eeap i nnubbcjj jg) proneead. się; w obbcnoSci wirusobbjczego roztworu rozpuszczsiniU/detergent, bez cytrynianu sodu.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US08/960,660 US5981254A (en) | 1997-10-30 | 1997-10-30 | Process for producing thrombin from plasma |
PCT/CA1998/001008 WO1999023111A1 (en) | 1997-10-30 | 1998-10-29 | Process for the production of highly viral safe components for forming fibrin glue from a pool of human plasma |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
PL340300A1 PL340300A1 (en) | 2001-01-29 |
PL194589B1 true PL194589B1 (pl) | 2007-06-29 |
Family
ID=25503448
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL98340300A PL194589B1 (pl) | 1997-10-30 | 1998-10-29 | Sposób wytwarzania trombiny |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5981254A (pl) |
EP (1) | EP1027371B1 (pl) |
JP (1) | JP4278861B2 (pl) |
AT (1) | ATE305011T1 (pl) |
AU (1) | AU759145B2 (pl) |
CA (1) | CA2307380A1 (pl) |
DE (1) | DE69831684T2 (pl) |
DK (1) | DK1027371T3 (pl) |
ES (1) | ES2249843T3 (pl) |
IL (1) | IL135812A (pl) |
IN (1) | IN185759B (pl) |
NO (1) | NO323299B1 (pl) |
NZ (1) | NZ504246A (pl) |
PL (1) | PL194589B1 (pl) |
RU (1) | RU2236237C2 (pl) |
WO (1) | WO1999023111A1 (pl) |
Families Citing this family (33)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AT407484B (de) * | 1997-11-12 | 2001-03-26 | Bio Prod & Bio Eng Ag | Arzneimittel zur förderung der wundheilung |
CA2394797A1 (en) * | 1999-12-20 | 2001-06-28 | Tsuyoshi Takahashi | Process for producing virus-free plasma protein composition by porous membrane treatment, virus-free plasma protein composition and method of removing viruses |
ES2327208T3 (es) * | 1999-12-23 | 2009-10-27 | Csl Limited | Separacion de fibrinogeno de proteasas de plasma. |
AU779126B2 (en) * | 1999-12-23 | 2005-01-06 | Csl Limited | Separation of fibrinogen from plasma proteases |
JP2002114799A (ja) * | 2000-08-01 | 2002-04-16 | Nihon Pharmaceutical Co Ltd | ウイルス除去方法 |
US7411006B2 (en) * | 2000-10-23 | 2008-08-12 | Shanbrom Technologies, Llc | Enhanced production of blood clotting factors and fibrin fabric |
US7365173B2 (en) * | 2002-02-04 | 2008-04-29 | American National Red Cross | Method for the production of pure virally inactivated butyrylcholinesterase |
DE10211632A1 (de) | 2002-03-15 | 2003-10-09 | Aventis Behring Gmbh | Verfahren zur Abtrennung von Viren aus einer Proteinlösung durch Nanofiltration |
US20060275829A1 (en) * | 2002-04-15 | 2006-12-07 | Hammond David J | Combinatorial library for proteomic investigations |
US20070015230A1 (en) * | 2002-04-15 | 2007-01-18 | Hammond David J | Identification and characterization of analytes from whole blood |
AU2003225008A1 (en) * | 2002-04-15 | 2003-11-03 | American National Red Cross | Plasma protein-binding ligands |
US20060275753A1 (en) * | 2002-04-15 | 2006-12-07 | Hammond David J | Recovery of analytes using combinatorial libraries |
GB0216001D0 (en) | 2002-07-10 | 2002-08-21 | Nat Blood Authority | Process and composition |
DK1528930T3 (da) * | 2002-07-23 | 2009-08-03 | Bio & Bio Licensing Sa | Thrombindannelsesdygtige og thrombinholdige farmaceutiske præparater af virksomt stof samt lægemidler |
ES2214967B1 (es) * | 2003-03-06 | 2005-06-16 | Probitas Pharma, S.A | Procedimiento para la eliminacion de virus en soluciones de fibrinogeno y fibrinogeno obtenido por dicho procedimiento. |
EP3594222B1 (en) | 2003-12-01 | 2022-08-03 | Novo Nordisk Health Care AG | Virus filtration of liquid factor vii compositions |
CA2570478C (en) * | 2004-06-22 | 2011-08-23 | Zymogenetics, Inc. | Thrombin compositions |
DE102004044429B4 (de) * | 2004-09-14 | 2009-04-30 | Biotest Ag | Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung enthaltend von Willebrand Faktor |
ES2226587B1 (es) * | 2004-10-22 | 2005-12-16 | Probitas Pharma, S.A. | Composicion de trombina estable. |
US20060270015A1 (en) * | 2005-05-26 | 2006-11-30 | Dan Pawlak | Thrombin purification |
FR2887883B1 (fr) | 2005-06-29 | 2007-08-31 | Lab Francais Du Fractionnement | Procede de separation des proteines fibrinogene, facteur xiii et colle biologique d'une fraction plasmatique solubilisee et de preparation de concentres lyophilises desdites proteines |
US20120195953A1 (en) * | 2007-09-19 | 2012-08-02 | Kieu Hoang | Fibrin sealant (FIBRINGLURAAS) consisting of a kit of lyophilized high concentrate fribinogen intentionally enriched and preserved with fibronolysis inhibitor A1AT |
GB0814570D0 (en) * | 2008-08-08 | 2008-09-17 | Diagnostics For The Real World | Isolation of nucleic acid |
US9011846B2 (en) | 2011-05-02 | 2015-04-21 | Biomet Biologics, Llc | Thrombin isolated from blood and blood fractions |
CN104703612B (zh) * | 2012-09-26 | 2021-03-19 | 骨治疗公司 | 包含溶剂/去污剂处理过的血浆(s/d血浆)的制剂及其用途 |
RU2583931C2 (ru) * | 2014-06-11 | 2016-05-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение Гематологический научный центр Министерства здравоохранения РФ | Способ получения концентрата тромбина |
US9932388B2 (en) | 2014-11-13 | 2018-04-03 | Hemarus Therapeutics Limited | Chromatographic process for producing high purity fibrinogen and thrombin |
JP6666757B2 (ja) * | 2016-03-10 | 2020-03-18 | 日本メジフィジックス株式会社 | ポリオキシエチレン系非イオン界面活性剤の定量方法及び放射性医薬品製剤の製造方法 |
EP3755455A1 (en) * | 2018-02-19 | 2020-12-30 | Bayer HealthCare, LLC | Modified filter membrane and method |
WO2020229521A1 (en) | 2019-05-14 | 2020-11-19 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods for inhibiting or reducing bacterial biofilms on a surface |
CN113754757B (zh) * | 2021-07-01 | 2024-06-14 | 华兰生物工程股份有限公司 | 一种人纤维蛋白原的制备方法 |
EP4387993A1 (en) | 2021-08-18 | 2024-06-26 | Biotest AG | Dry heat treatment of plasma-derived factor viii |
KR20230121373A (ko) * | 2022-02-11 | 2023-08-18 | 주식회사 녹십자 | 인자 xiii의 정제방법 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3843126C3 (de) * | 1988-12-22 | 1994-10-06 | Octapharma Ag | Verfahren zur Herstellung eines hochreinen Thrombinkonzentrates |
FR2679251B1 (fr) * | 1991-07-18 | 1993-11-12 | Nord Assoc Essor Transfusion San | Procede de preparation d'un concentre de thrombine humaine destine a un usage therapeutique. |
US5395923A (en) * | 1993-02-23 | 1995-03-07 | Haemacure-Biotech, Inc. | Process for the obtention of a biological adhesive made of concentrated coagulation factors by "salting-out" |
US5290918A (en) * | 1993-02-23 | 1994-03-01 | Haemacure Biotech Inc. | Process for the obtention of a biological adhesive made of concentrated coagulation factors by acidic precipitation |
US5506127A (en) * | 1994-09-21 | 1996-04-09 | Proba; Zbigniew | Therapeutic grade thrombin produced by chromatography |
-
1997
- 1997-10-30 US US08/960,660 patent/US5981254A/en not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-10-29 PL PL98340300A patent/PL194589B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1998-10-29 AT AT98951133T patent/ATE305011T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-10-29 DE DE69831684T patent/DE69831684T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-29 AU AU97316/98A patent/AU759145B2/en not_active Ceased
- 1998-10-29 RU RU2000113224/15A patent/RU2236237C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1998-10-29 ES ES98951133T patent/ES2249843T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-29 JP JP2000518981A patent/JP4278861B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-10-29 EP EP98951133A patent/EP1027371B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-29 IL IL135812A patent/IL135812A/en not_active IP Right Cessation
- 1998-10-29 WO PCT/CA1998/001008 patent/WO1999023111A1/en active IP Right Grant
- 1998-10-29 IN IN1927CA1998 patent/IN185759B/en unknown
- 1998-10-29 CA CA002307380A patent/CA2307380A1/en not_active Abandoned
- 1998-10-29 NZ NZ504246A patent/NZ504246A/xx unknown
- 1998-10-29 DK DK98951133T patent/DK1027371T3/da active
-
2000
- 2000-04-28 NO NO20002293A patent/NO323299B1/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2236237C2 (ru) | 2004-09-20 |
IL135812A0 (en) | 2001-05-20 |
CA2307380A1 (en) | 1999-05-14 |
DE69831684T2 (de) | 2006-06-22 |
NO323299B1 (no) | 2007-03-05 |
EP1027371B1 (en) | 2005-09-21 |
AU759145B2 (en) | 2003-04-03 |
NO20002293D0 (no) | 2000-04-28 |
US5981254A (en) | 1999-11-09 |
PL340300A1 (en) | 2001-01-29 |
EP1027371A1 (en) | 2000-08-16 |
IN185759B (pl) | 2001-04-21 |
JP2001521941A (ja) | 2001-11-13 |
ATE305011T1 (de) | 2005-10-15 |
DE69831684D1 (de) | 2006-02-02 |
IL135812A (en) | 2007-09-20 |
NO20002293L (no) | 2000-06-30 |
AU9731698A (en) | 1999-05-24 |
JP4278861B2 (ja) | 2009-06-17 |
ES2249843T3 (es) | 2006-04-01 |
DK1027371T3 (da) | 2006-01-09 |
NZ504246A (en) | 2002-09-27 |
WO1999023111A1 (en) | 1999-05-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
PL194589B1 (pl) | Sposób wytwarzania trombiny | |
US5099003A (en) | Method of preparing a sterile plasma-protein solution containing fibrinogen and factor xiii | |
CA1329542C (en) | Plasma and recombinant protein formulations in low ionic strength media | |
AU2006202680B2 (en) | Process for separating proteins fibrinogen, factor XIII and biological glue from a solubilized plasma fraction and for preparing lyophilised concentrates of said proteins | |
JP5719266B2 (ja) | ウイルス不活性化熱処理へ供するための血漿タンパク質の寒冷沈降物を安定化する方法 | |
US4490361A (en) | Virus inactivating heat treatment of plasma fractions | |
JP2009507015A (ja) | 超高収率静注免疫グロブリン製剤 | |
KR960008653B1 (ko) | γ-글로불린 주사용 액상 제제 | |
AU549584B2 (en) | Heat stabilization of plasma proteins | |
EA003182B1 (ru) | Универсальная плазма крови | |
BRPI0312521B1 (pt) | Método para a separação de fibrinogênio de plasminogênio | |
RU2112522C1 (ru) | Состав для стабилизации плазмы крови, способ пастеризации плазмы и использование стабилизированной плазмы в терапии | |
JP2879427B2 (ja) | ウイルスおよびバクテリア汚染物の熱的不活性化中の生物学的および製薬的生成物の安定化 | |
WO1998030230A1 (fr) | Compositions proteinees et procede de production | |
RU2045902C1 (ru) | Состав для стабилизации плазмы крови в ходе пастеризации и способ пастеризации плазмы крови | |
de Lille | llllllllllllllllllllllIlllllwglllllllllIllllllllllllllllllllllllllllllll | |
JPH09286798A (ja) | 活性蛋白質組成物の製造方法 | |
IE55182B1 (en) | Heat treatment of plasma | |
JPH02304030A (ja) | 抗nanbウイルス抗体陽性静注用免疫グロブリン製剤の製造方法 | |
JPH01250326A (ja) | ヒト血漿由来血液凝固第x3因子の製造方法 | |
JPS59500812A (ja) | 血漿蛋白質の熱安定化 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20101029 |