JP2001513760A

JP2001513760A - ミトコンドリアの保護方法及びそのための組成物

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Publication number: JP2001513760A
Application number: JP53690998A
Authority: JP
Inventors: ダニエルビーヤロシュ
Original assignee: オクシスインターナショナルインコーポレイテッド
Priority date: 1997-02-20
Filing date: 1998-02-20
Publication date: 2001-09-04
Also published as: US6103746A; AU744523B2; EP0981345A1; WO1998036748A1; AU6332598A

Abstract

(57)【要約】自然の又は疾病の過程に起因し、また外部因子、例えば入射太陽光、酸化性環境毒素の吸引による曝露、食事による酸化剤の消費、及び酸化性ストレス誘導薬物、とりわけ照射治療を含む照射への曝露の作用による酸化の傷害からミトコンドリアを保護することが、Ｌ−エルゴチオネインを含む組成物によって提供される。Ｌ−エルゴチオネインを薬学的に受容可能な担体中で調製して、皮膚への局所投与剤及び経口又は非経口投与剤を形成することができる。Ｌ−エルゴチオネインの効果的な適用及び投与をリポソーム中でカプセル化して強化することが好ましい態様である。哺乳動物における照射、遊離基及び反応性酸素種に対する曝露及び感受性を決定する診断方法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】ミトコンドリアの保護方法及びそのための組成物発明の背景ミトコンドリアは、エネルギーをアデノシン三リン酸（ATP）の形で生成し、酸素が還元して水となるような酸素を利用する有機体全てに存在する細胞下細胞小器官である。取り込まれた酸素の90％をミトコンドリアで消費する。このATP 生成の実質的な副生物は潜在的に毒性の酸素遊離基の形成である。例えば、全還元酸素の1−2％は超酸素（O₂-）及び過酸化水素(H₂O₂)を生じると推定される。他の反応性酸素種（ROS）を形成するのは一重項酸素（¹O₂）及びヒドロキシル遊離基（OH・）である。細胞におけるストレス条件下で、これは全消費酸素の10％まで上昇する。ミトコンドリア膜は、これらのROSによって生じる脂質の過酸化及び脱分極化に対して過敏である。ミトコンドリアの傷害は、上記したROSを形成する日光への曝露によっても生じる。ミトコンドリアの傷害は、いくつかの疾病、例えばガン、糖尿病、白内障、神経変性疾患、ポルフィリン症、心臓血管疾患の原因又は重要な因子と考えられており、また老齢化の悪化の一因となることから、ミトコンドリアをこのような傷害から保護し、このような傷害を修復することが要望されている。火及び他の強い熱源との接触又はそれらへの曝露による皮膚及び肺への火傷による細胞の傷害は遊離基による傷害によって仲介されている。さらに、工業による空気の汚染物並びに石油及びたばこの燃焼生成物を含む環境に悪影響を与える因子に曝すことは、肺及び身体の他の組織への酸化による傷害を助長することになる。そのうえ、種々の治療措置、例えば増殖異常症の治療に用いる化学療法剤及び放射線療法は、重大な酸化剤−ストレス−関連副作用、例えば心臓毒性を引き起こす。本発明はミトコンドリアをこのような傷害から保護する応用薬剤に関する。Ｌ−エルゴチオネインは硫黄を含むアミノ酸であり、多くの哺乳動物組織に見られるが、生体内で合成されるものではなく、食事で消費しなければならない。これはいくつかの組織ではミリモルの量で存在するが、その正確な役割は不明である(Melville,1959,Vitamins and Hormones 7：155-204参照)。これは通常抗酸化剤であるとされているが、相互に矛盾する結果がある。ある者はこれを過酸化水素の捕捉剤であるとしている（Hartman,1990,Methods in Enzymology 186 ：310-318）一方、他の者はこれは過酸化水素と直ちに反応はしないがヒドロキシル遊離基を補足すると強く主張している(Akammu et al.,1991,Arch.Biochem.B iophys.298：10-16,1991)。従来の試験管内における研究ではこれが、DNA及びタンパク質がUV照射で誘導される光毒性薬剤と結合することに対する保護作用を有し(例えば、vam den Broeke et al.,1993,J.Photochem.Phtobiol.B 17：279-286 )、ガンマ線照射に対してバクテリオファージを保護することが示されている（H artman et al.,1988,Radiation Research 114：319-330）が、生体内における結果は予期したとおりではなかった。Ｌ−エルゴチオネインは、遊離基を捕捉する局所製剤としてまた毛髪及び皮膚の傷害に対する紫外線保護剤として有用であるとしてクレームされてきた（例えば、ＷＯ 9404129）が、Van den Broekeらは(1 993,Int.J.Radiat.Biol.63：493-500)、上皮の生体分子と結合する紫外線で誘導した光毒性薬剤を有する動物モデルにおいて、局所適用したＬ−エルゴチオネインが有効であることを見出さなかった。生体内で使用した他の提案では、循環リポタンパク質（ａ）値の低下を含み(米国特許第5,272,166号)、皮膚の色素沈着の阻害、例えばほくろ（dark spots）及びそばかすの除去（JP63008335及びJP61 155302）を含んでいた。先に述べたように、前記の反応性酸素種（ROS）が高い値で存在することに対する身体の不都合な反応が多くの疾病の過程の原因となっている。眼においては、白内障、黄斑変性症及び変性網膜傷害はROSが原因となっている。他の器官における疾病及びROS関連疾病は以下を含む：たばこの燃焼生成物及びアスベストで誘導される肺ガン；皮膚の傷害を含む老化の加速及びその顕在化；アテローム性動脈硬化症；虚血症及び再潅流（reperfusion）損傷、神経系の疾病、例えばパーキンソン病、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、多発性硬化症；肺気腫及び気管支肺異形成症を含む他の肺疾患；鉄過負荷症、例えば血色素症及び地中海貧血症；膵臓炎；糖尿病；自己免疫性ネフローゼ症候群及び重金属で誘導される腎毒症を含む腎臓疾患；及び照射損傷。ある種の抗新生物薬、例えばアドリアマイシン及びブレオマイシンは重大な酸化による傷害を特に心臓に対して引き起こし、これが患者への薬物投与を制限している。レドックス金属、例えば鉄は組織に酸化による傷害を引き起こす；工業用化学薬品及びエタノールは、曝露及び消費により、多数の酸化による傷害に関連した損傷、例えば心筋症及び肝臓傷害を引き起こす。空中に浮遊する工業及び石油化学に由来する汚染物質、例えばオゾン、酸化窒素、放射活性粒子及びハロゲン化炭化水素は、肺、消化管及び他の器官に酸化による傷害を引き起こす。核反応装置からの漏洩を含む工業的な源からの照射による中毒及び核兵器による曝露は、照射及び遊離基による傷害の他の源である。曝露の他の経路は電磁照射、例えば発電装置、高圧電力系統、Ｘ線装置、粒子加速器、レーダーアンテナ、ラジオアンテナ、等の照射の源に近接する生活又は仕事から生じ、また、電磁照射を発生する電子製品及び装置、例えば携帯電話、テレビジョン及びコンピュータのモニターを使用することによっても同様に生じる。発明の要約本発明の目的は、哺乳動物のミトコンドリア膜を保護する方法及びそのための組成物を提供することによって、ミトコンドリアを傷害から保護する手段を提供することである。本発明の他の目的は、哺乳動物のミトコンドリアを酸化による傷害から保護することができる方法及びそのための組成物を提供することである。本発明のさらなる目的は、入射太陽光及び傷害を生じる他の照射の影響によって起こる傷害から哺乳動物のミトコンドリアを保護する方法及びそのための組成物を提供することである。本発明のさらなる他の目的は、空中に浮遊する酸化性毒素、例えば工業上の汚染物並びに石油化学及びたばこ燃焼生成物中に存在するようなものによって起こる傷害から哺乳動物のミトコンドリアを保護する方法及びそのための組成物を提供することである。本発明の他の目的は、酸化能のある物質及び種々の疾病の過程で生じ、種々の治療薬剤及び措置によって誘導される反応性酸素種の値が高くなったことの影響で起こる傷害から哺乳動物のミトコンドリアを保護する方法及びそのための組成物を提供することである。本発明の他の目的は、照射、遊離基及び反応性酸素種による哺乳動物におけるミトコンドリアの傷害の程度及び感受性を決定するための診断試験を提供することである。ミトコンドリアは酸化による傷害によって傷害を受けるが、酸化による傷害の原因には、自然の及び疾病の過程、外部因子、例えば入射太陽光、酸化能のある環境毒素を吸入することによる曝露、電磁照射、食事に含まれる酸化剤の消費、及び特に酸化によるストレスを誘導する薬剤がある。本発明において、細胞をＬ −エルゴチオネインで前処理又は処理すると、このような傷害からミトコンドリアを保護し、太陽光及び酸素遊離基の存在によってミトコンドリアに生じた傷害が低減する。ある実施例において、Ｌ−エルゴチオネインを薬学的に受容可能な担体と組合せて皮膚に局所的に適用するための薬剤を形成するが、これに限定されない。本発明は、Ｌ−エルゴチオネインを経口的に又は非経口的に投与して使用する治療方法を含む。好ましい態様では、Ｌ−エルゴチオネインの効果的な適用及び投与はリポソーム中にカプセル化することによって強化される。一例において、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、オレイン酸及びコレステリルヘミスクシネートよりなるリポソームを使用する。リポソームでカプセル化したＬ−エルゴチオネインも薬学的に受容可能な担体と組合せて局所適用とする。発明の詳細な説明哺乳動物の種々の組織におけるミトコンドリアへの酸化による傷害を阻止することは、多くの病理的状態の予防及び処置にとって治療上有益であり、病理的状態は罹患率及び死亡率が大きい症状の原因となっている、例えばアテローム性動脈硬化症及びガンから、病理的症状は軽いが生理学的に不都合な症状、例えば長時間の光照射による老化（photoaging）の結果生じる皮膚の見苦しい変化まで広がっている。種々の疾病、例えばガン、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、白内障及び特に神経性疾患においては、反応性酸素種（ROS）が疾病の病態生理的に密接に関連している。虚血症では脳卒中及び心筋梗塞の間、組織の血流及び酸素が欠乏し、次いで虚血性組織に再灌流が生じるが、虚血症は梗塞の間に組織を直接死滅させることはないが重大なROS傷害を引き起こす。ガンの化学療法剤、例えばアドリアマイシン及びブレオマイシンは、抗ガン照射（例えばＸ線）治療がそうであるように、酸化剤による傷害を生じる。細胞下の細胞小器官は好気性エネルギー代謝及びそこでの酸化反応に重要な役割を持つものとして組み入れられているので、ミトコンドリアは内因性及び外因性の影響に敏感であり、簡単に傷害を受け又は破壊される。エネルギー代謝が機能障害を起こすと、より過酷にはミトコンドリアが傷害を受けると、細胞の老化及び死をもたらし、下流の組織及び器官の機能障害及び傷害をもたらす。皮膚においては紫外線曝露の結果として酸化による傷害が増加し、皮膚の細胞構造に傷害を起こし、老化に関連した早発性の心理的に衰弱を起こさせるような変化、例えば皮膚が薄くなること、しわ、及び異常な色素沈着をもたらす。環境に存在する酸化剤に肺を曝すと、ミトコンドリア及びそれに付随する細胞に傷害を生じ、慢性気道閉塞障害（airway o bstructive disorders）に至る。電磁及び核照射に曝すことも酸化による傷害を誘導する。本発明に従うと、Ｌ−エルゴチオネイン(L−ET）を含む組成物を適用又は投与することによってミトコンドリアを保護することが可能である。目的とする細胞、組織又は器官への投与は非経口的に；粘膜を経由して、例えば経口的に、経鼻的に、直腸経由で；又は経皮的に行うことができる。非経口投与は静脈内注射であり、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、クモ膜下腔内及び頭蓋内投与を含み、これに制限されない。例えば、本発明の組成物は梗塞を起こしている組織又は器官に直接注入することができ、例えば、脳卒中又は心臓麻痺が生じた脳又は心臓に注入して虚血性ペナンブラ（ischemic penumbra）の細胞中のミトコンドリアを保護することができるが、ここで直接梗塞を起こしている領域の外側は血流の停止中は死滅しないが、血流が回復すると過剰のROSが仲介する傷害が生じることとなる。L−ETは経口投与のために錠剤又はカプセル剤として製造することができる。局所的に使用する場合は、緩衝水溶液又は他の薬学的に受容可能な担体を加えたL−ETの水溶液、又は水層及び疎水層の乳剤を含むヒドロゲルローション又はクリームの形で、50μM及び5mMの間の濃度で使用する。好ましい濃度は約1mMである。これにアスコルビン酸又はその塩、又は他の成分、又はこれらの組合せを加えて、化粧品として使用できる製品とすることができる。金属類は最小限とすべきである。リポソーム中にカプセル化することによって経口、非経口又は好ましくは局所投与用に好ましくは製剤化することができる。以下に示すように、リポソーム中のL−ETの組成物は、照射による傷害で生じた酸化による傷害からミトコンドリアを保護する効率を改善する。 L−ETのリポソーム製剤がこの化合物のミトコンドリアの保護に対する効果を増強することを発見したのは予期しないことであった。リポソームによる投与は、他の多くの化合物を投与するための薬剤投与系として利用されてきた（Lager, Science 249：1527-1533(1990):Treat et al.,in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer,Lopez-Berestein and Fidler(編集),Liss:New York,pp.353-365(1989);Lopez-Berestein,ibid.,pp.317-327参照;一般的には同文献を参照）が、L−ETを効率的な形で細胞下投与することは本発明者がこのたび発見したことであり、これが本発明の組成物及び方法の好ましい態様である。リポソームの機能はL−ETのミトコンドリアへの投与を増強することであり、明確に又は付加的に、L−ETが目的の細胞又は組織に到達するまでそれを保護することである。リポソームの製剤の例は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、オレイン酸及びコレステリルヘミスクシネートを2：2：1：5 の比率で含み、10mMのL−ETをカプセル化したものから形成されるが、これに制限されない。最終的な濃度は1μMから10mMの、好ましくは約12μMのL−ETを使用する。この最終濃度は、薬学的に受容可能な担体中の精製したリポソームを希釈することによって達成できる。多くの他の適切なリポソーム製剤が当業者に公知であり、本発明の目的のために使用できる。例えば、Yaroshの米国特許第5,190, 762号“タンパク質を生きた皮膚細胞へ投与する方法”があり、ここに参考として取り入れる。リポソーム及びリポソーム技術に関する一般的な議論は“Liposo me Technology”G.Gregoriadis編，1993，CRC Press発行，Boca Raton，フロリダ，という三巻本に見ることができる。この文献の関連する部分をここで参考として取り入れる。 L−ETの経皮投与も、リポソーム製剤又は遊離L−ETと同様、企図している。種々の多くの方法が医薬の経皮投与の分野で公知であり、例えば経皮パッチを経由する方法である。経皮経路による投与は皮膚透過強化剤を使用することによって強化されることが直ちに理解できる。本発明の他の観点において、L−ETの薬剤組成物が提供される。この薬剤組成物は、注射、経口、肺経由、経鼻又は他の投与形態による投与とすることができる。一般に、本発明に含まれる薬剤組成物は、有効量のL−ETを薬学的に受容可能な希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント及び／又は担体を共に含む。この組成物は以下のものを含む:種々の緩衝液成分(例えばトリス−HCl、酢酸塩、リン酸塩)の希釈剤、pH及びイオン強度；添加剤、例えば洗浄剤及び可溶化剤(例えばツイーン80、ポリソルベート80)、抗酸化剤(例えばアスコルビン酸、ピロ亜硫酸ナトリウム)、保存剤（例えばチメロサール、ベンジルアルコール）及び充填剤(例えばラクトース、マンニトール)；重合性物質の粒状生成物への材料の取り込み、例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸、等又はリポソームへの取り込み(下を参照)。ヒアルロン酸も使用できる。これらの組成は、L−ETの物理的性状、安定性、生体内放出率及び生体内クリアランス率に影響を与える。組成物は液体の形状で、又は乾燥粉末の形状で、例えば凍結乾燥した形状で製造することができる。放出を制御した経口製剤が望ましい。薬物を、拡散又は浸出のいずれかの機構で放出する不活性なマトリックス、例えばゴム、中に取り込むことができる。徐々に変性するマトリックスも本製剤に取り込むことができる。いくつかの腸溶性被覆も放出を遅くする効果を有している。本治療剤の放出を制御する他の形態は Oros治療系（Alza社）に基づく方法によるもので、薬物を半透膜に封入し、水が内部に入りその浸透圧で薬物が単一の小さな開口部から外に押し出されるものである。ミトコンドリアを酸化による傷害から保護し又は処置するために、本発明の薬剤組成物を肺に投与することもここで企図している。肺への投与は肺の組織自体を処置するのに使用することができ、又は血流への投与経路として、それゆえ体内の他の部位への投与経路として役立つことができる。本発明の薬剤組成物は吸入によって哺乳動物の肺へ投与され、肺の上皮内層を横断して血流に入る。本発明の実施に使用する、治療生成物を肺に投与するために設計した広範囲の機械装置には、ネブライザー、計量投与量吸入器、粉末吸入器、など当業者によく知られたものが含まれるが、これに限られないことを企図している。投与装置の構成に関しては、この技術で知られているエアゾール化の形態はいかなるものでもよく、スプレーびん、噴霧、微粒化又は液状製剤のポンプエアゾール化、及び乾燥粉末製剤のエアゾール化を含むものが本発明の実施に使用することができるが、これに制限されない。例えば眼の水晶体のミトコンドリアを保護し処置するために本発明の組成物を眼に投与することも企図しており、眼では酸化による傷害が白内障の高い発生率の説明になると考えられている。他の眼への使用は、黄斑変性症及び変性網膜傷害の治療又は予防を含む。本発明の薬剤組成物を鼻へ投与することも企図している。鼻への投与により、治療生成物を鼻へ投与した後肺にその生成物が滞留せずに本発明の薬剤組成物が直接血流に到達することとなる。鼻へ投与するための製剤はデキストラン又はシクロデキストランとの製剤を含む。鼻への投与に有用な装置は、小さな硬いびんであり、そのびんには一定の投与量を噴霧する装置が結合している。ある態様において、本発明の薬剤組成物溶液を定容量室に吸引することによって一定投与量を投与するが、この定容量室はエアゾール化するような口径を有しており、室内の液体が加圧されると噴霧を形成してエアゾール製剤となる。室を加圧して本発明の薬剤組成物を投与する。特定の態様では、この室はピストン装置である。このような装置は市場で入手可能である。他の観点では、L−ETリポソームは血液脳関門を通過することができ、このことにより静脈内又は経口投与が可能となる。血液脳関門を通過するための種々のやり方が可能であり、分子の疎水性を高めること；担体への共役体としての分子、例えばトランスフェリンを血液脳関門における受容体を標的として導入すること等を含むが、これに限定されない。他の態様において、この分子を頭蓋内に、より好ましくは脳室内に投与することができる。さらに他の態様において、L−E Tを血液脳関門を標的としてリポソームの形で投与することができる。 L−ETの投与がミトコンドリアを保護する治療措置として有用な対象は好ましくはヒトであるが、他の動物でもよい。それゆえ、当業者には直ちに理解できるように、本発明の方法及び薬剤組成物はすべての動物、特に哺乳動物に投与することに特に適しており、家庭用動物、例えばネコ又はイヌ、家畜、例えばウシであるがこれに限らない、ウマ、ヤギ、ヒツジ、及びブタ、野生動物(野外又は動物園にいるもの)、実験動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ等、鳥類、例えばニワトリ、シチメンチョウ、鳴鳥等、すなわち獣医学で使用するものを含むがこれに限らない。酸化による傷害からミトコンドリアを保護することも、多数の障害の防止及び治療に使用することが可能であり、この障害は太陽の影響、身体への電磁及び核照射、疾病の過程、たばこ燃焼生成物を含む汚染物質への曝露、及び作用機作によって反応性酸素種及び他の遊離基の発生を含むある種の薬剤の傷害に対する保護を含む。例えば、ある種の抗新生物剤はその作用機作として酸化作用を有する遊離基を含むが、患者における重大かつ限定された副作用は心臓毒性である；本発明の組成物及び方法により心臓及び他の組織のミトコンドリアを保護することによって、より高い投与量、それゆえ抗ガン効果の増強を達成することが可能となる。さらに、抗ガン治療に手術に代わるものとして又は手術と併用して使用する多くの種類の照射は、組織に対する重大な傷害を含む；L−ETを事前に投与することによって照射治療の身体への毒性を減少又は阻止することができる。線溶療法、例えば組織プラスミノーゲン活性化剤又はストレプトキナーゼと組合せて使用することが可能であり、ここで脳卒中及び心臓麻痺の原因となる血管をふさいでいる凝血塊が溶解される。再灌流の結果生じるROSからの組織の保護は本発明の目的の一つである。さらに多数の疾病の過程が反応性酸素種を含む。眼においては、白内障、黄斑変性症及び変性網膜傷害はROSが原因であり、局所、経口又は非経口で投与したL −ETで治療することが可能である。リポソーム製剤が好ましい。ROSが関与する肺の疾患、例えば肺気腫及び気管支肺異形成症並びにたばこ燃焼生成物及びアスベストの吸引により生じる病状は、上記したL−ETのエアゾール製剤で治療することができる。神経系の種々の疾病、例えばパーキンソン病、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、及び多発性硬化症は、経口又は非経口製剤又はクモ膜下腔内、脳室内及び頭蓋内投与による中枢神経系への直接の投与によって治療可能である。鉄過負荷症、例えぼ血色素症及び地中海貧血症も、本発明の組成物及び方法で治療することができる。他の疾病として、膵臓炎、糖尿病；自己免疫性ネフローゼ症候群及び重金属誘導腎毒症を含む腎臓疾患；及び照射損傷がある。火傷による局所及び全身損傷はROSによる傷害を含む。本発明の組成物を前に述べた治療及び予防に使用することに加え、多数の診断への使用も企図している。ミトコンドリアの傷害から哺乳動物を保護するL−エルゴチオネインの能力及び保護に必要なL−ETの値を、当該哺乳動物からの細胞試料及び種々の濃度のL−ETを含むアリコットを、傷害を生じる剤又は条件に試験管内で曝すことによって評価することができる。種々のアリコットのミトコンドリアへの傷害を決定し、合わせて、もしあれば、傷害を保護するのに十分なL −ETの最低濃度を決定する。ミトコンドリアに傷害を与える剤に曝した後の哺乳動物に対して治療上有効なL−ETの量を決定するため、上記したのと同様な診断試験を行うことが可能であり、この試験では種々の濃度のL−ETを、ミトコンドリアに傷害を与える剤に曝した後で細胞試料アリコットに適用する。他の態様において、ROSに対する哺乳動物の曝露の程度は、当該哺乳動物から採取した細胞の試料に対するL−ETの作用を決定することによって評価することができる。これらの診断の有用性は、L−ETの有効な治療投与量を選択する場合にさらに助けとなる。さらなる態様において、酸化による傷害を起こす治療措置、例えば担ガン哺乳動物に処置する抗新生物剤又は照射治療の傷害作用から細胞試料を保護するL−E Tの能力は、試験管内で抗新生物剤と種々の濃度のL−ETとを組み合わせ、この組合せを哺乳動物から得た細胞試料の同一のアリコットに適用し、この一連の試料におけるミトコンドリアの傷害の程度を決定することによって示すことができる。これらのデータは、哺乳動物の疾病に罹っていない細胞におけるミトコンドリアの傷害を保護するL−ETの有効投与量を決定するのに使用することができる。該哺乳動物の疾病に罹った又はガン性細胞の試料を使用する同様の方法において、L−ETが抗ガン剤の抗ガン活性の減少に影響するかどうかを決定することができ；二つの試験に基づき、抗ガン剤と共投与するL−ETの値を、最大の抗ガン治療を提供する一方で、その抗ガン剤から哺乳動物の疾病に罹っていない細胞を最適に保護するように選択することができる。これらは、本発明の組成物及び方法の予防及び治療における利点を評価するために有用な診断試験の例であり、これに限定されるものではない。ミトコンドリアの傷害へのL−ETの適用及びその作用は以下の実験による実施例に示されており、ここでマウスのケラチノサイトをカプセル化しない又はリポソーム−カプセル化L−ETで処置する。次いでミトコンドリアを傷害作用のあるU V−B光及びアロキサン（これは酸素遊離基を誘導することが公知である）に曝し、得られたものを測定する。ミトコンドリアに対する傷害を二つの方法で検出する：1）MTT分析及び2）JC−１分析。実施例１ UV −B光：マウスのケラチノサイトを異なる濃度のＬ−エルゴチオネイン（カプセル化していない）で前処理し、次いで紫外線Ｂ照射（UV−B）に曝したが、短い波長範囲の紫外線光は太陽光に存在しており、皮膚に重大な光傷害を起こす原因となっている。光をFS200太陽灯で発生させ、Kodicellの二枚のシートでフィルターをかけ、280nmより短い波長を有する光を除去した。 MTT 分析：この分析は、可溶性染料MTT［3−（4,5−ジメチルチアゾール−2− イル）−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド］のテトラゾリウム環を開裂して不溶性の青色ホルマザン型を形成するというミトコンドリアの特定の活性を測定するものである。生きているミトコンドリアはMTTを代謝し、青色のホルマザンを形成する；死滅したミトコンドリアは青色ホルマザンの形成を直ちに停止する。MTT分析において、哺乳動物の細胞をL−エルゴチオネインで前処理し、次いでミトコンドリアに傷害を生じる剤、この実施例ではUV−Bで処理する。MTTを次いで添加し、青色染料の形成を分光光度計によって測定する。結果：表１は、平方メートル当たりのジュールで示した種々のUV−Bの値及び種々のL−エルゴチオネイン濃度における、存在するホルマザンブルーの光学濃度を、曝露しない（対象）細胞中のミトコンドリアに対する百分率として表わしている。L−ETが存在しないと、MTTがホルマザンへ転換する値が投与量に対応して減少していることに示されるように、UV−Bの照射強度の増加に伴ってケラチノサイト中の生きているミトコンドリアの数が減少することをこのデータは示している。紫外線照射したケラチノサイトはL−エルゴチオネインによって保護される：100 及び200J／ｍ²では、三つの濃度のL−ETがすべて95％より大きいミトコンドリアの生存率を保持し；最も高いUV−Bの照射量において、L−ETはなおミトコンドリアを保護している。実施例２アロキサン：マウスのケラチノサイトを種々の濃度のＬ−エルゴチオネイン( カプセル化していない)で前処理し、次いで種々の濃度のアロキサンに曝露した。 MTT 分析：前処理したミトコンドリアに対するアロキサンの作用を実施例１と同様にMTT分析により決定した。結果：表２は、種々のアロキサン濃度及びＬ−エルゴチオネイン濃度における、細胞中の曝露していない（対象）ミトコンドリアに対する存在するホルマザンブルーの光学濃度の百分率を示している。アロキサンはミトコンドリアに酸化による傷害を誘導する；投与量に対応するミトコンドリアの生存率の減少は、5mMの値までみることができ、これを越える濃度では傷害は高原状となる。カーブの投与量に対応する部分では、Ｌ−エルゴチオネインが酸化による傷害からの保護を行う。実施例３マウスのケラチノサイトをＬ−エルゴチオネインで前処理し、12.5μMの最終濃度でカプセル化せず、またリポソームでカプセル化した(以下に記載するようにして製造した)。対照群はＬ−エルゴチオネインで処理しなかった。マウスのケラチノサイトを次いで実施例１のようにUV−Bに曝露した。リポソームによるカプセル化：Ｌ−エルゴチオネインをホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、オレイン酸及びコレステリルヘミスクシネートを2：2：1：5の比率で含むリポソームでカプセル化した。取り込まれたＬ− エルゴチオネインの濃度を計算するために、リポソームをクロロホルムで抽出し、水層のOD₂₅₈を測定した。Ｌ−エルゴチオネインの濃度を14,500というＬ−エルゴチオネインのε₂₅₈を使用して計算する。精製リポソームにおけるL−ETの最終濃度は約1.1mMであった。この濃度を、細胞培養培地でリポソームを希釈することによって低下させて、培地中での最終濃度を12.5μMとした。カプセル化していないＬ−エルゴチオネインを希釈によって同一の濃度とした。前処理した及び未処理のミトコンドリアに対するUV−Bの作用を実施例１と同様にMTT分析によって決定した。結果：表３は、種々のUV−Bの値における、細胞中の曝露していない（対照）ミトコンドリアに対する各ケースに存在するホルマザンブルーの光学濃度の百分率を示している。Ｌ−エルゴチオネインが存在しないと、両方のUV−B照射においてケラチノサイトは重大なミトコンドリアの傷害を示した。カプセル化していないL−ETは、このような条件下ではかなりの保護を行うが完全ではなく、同濃度のL−ETのカプセル化製剤によって完全な保護が行われた。それゆえ、L−ETのリポソーム製剤は優れた保護を提供する。実施例４アロキサン：マウスのケラチノサイトを1mMのＬ−エルゴチオネイン（カプセル化していない）で前処理し、次いで８mMのアロキサンで処理した。Ｌ−エルゴチオネインで処理した１日後、細胞を10分間JC−１で処理し、次いで蛍光顕微鏡で細胞を検査した。 JC −１分析：JC−１分析は蛍光染料JC−１(5,5',6,6'−テトラクロロ−1,1,3, 3'−テトラエチルベンズイミダゾイルカルボシアニンヨージド)（Molecular Pro bes,Inc.,Eugene,OR）を利用する。この染料はミトコンドリア膜に直ちにかつ明確に挿入される。生きている、挿入された膜の中で、JC−１染料はモノマーとして緑色の蛍光として保持されている。ミトコンドリア膜が傷害を受けると、JC− 1染料が凝集してJ−凝集物が生じ、蛍光がオレンジ色に変わる。オレンジ色の着色がミトコンドリア膜の傷害の特徴となる。結果：未処理の細胞は主に緑色をしている。アロキサンだけで処理した細胞は明確なオレンジ色の斑点を示した。アロキサンとＬ−エルゴチオネインで処理した細胞は、アロキサン単独で処理した細胞より褪せたオレンジ色を示した。Ｌ− エルゴチオネイン単独で処理した細胞は緑の蛍光を示した。それゆえ、ミトコンドリアの生存率を決定するために異なる手段を使用することにより、L−ETによるミトコンドリアの保護が確認される。本発明は、その精神又は本質的な特徴から離れることなく、他の形に具体化し、または他のやり方で実施することができる。それゆえ、本開示は全ての観点において例示として考えられるべきであり、限定的に考えてはならず、本発明の範囲は付属する請求の範囲に示されており、均等の意味及び範囲に入る全ての変更はここに取り込まれる意図である。先に引用した種々の文献はここに参考として取り込む。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims

【特許請求の範囲】１．照射、遊離基及び反応性酸素種によって生じる傷害からミトコンドリアを保護する方法であって、該方法が、該ミトコンドリアを保護するのに有効な量のＬ −エルゴチオネイン及び薬学的に受容可能な担体を含む組成物を、該ミトコンドリアに利用可能とすることを含む方法。２．組成物が50μMから5mMの範囲内の濃度のＬ−エルゴチオネインを含む、請求項１に記載の方法。３．Ｌ−エルゴチオネインの濃度が約1mMである、請求項１に記載の方法。４．組成物がリポソームに分散している、請求項１に記載の方法。５．リポソームが、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、オレイン酸及びコレステリルヘミスクシネートを2：2：1：5の比率で含む組成物から製造される、請求項４に記載の方法。６．Ｌ−エルゴチオネインが1μMから10mMの範囲内の濃度で存在する、請求項５に記載の方法。７．Ｌ−エルゴチオネインが約12μMの濃度で存在する、請求項６に記載の方法。８．組成物をミトコンドリアに非経口、局所、経粘膜、肺経由、又は経皮で投与することにより組成物をミトコンドリアに利用可能とする、請求項１に記載の方法。９．経皮投与が皮膚表面への局所適用を含む、請求項８に記載の方法。１０．担体がヒドロゲルローションである、請求項９に記載の方法。１１．経粘膜投与が経口、直腸経由、及び経鼻投与からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。１２．非経口投与が静脈内、皮下、動脈内、筋肉内、腹腔内、クモ膜下腔内、頭蓋内、及び脳室内投与からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。１３．傷害が、たばこ燃焼生成物、工業汚染物、石油燃焼生成物、オゾン、酸化窒素、放射活性粒子、及びこれらの組合せからなる群から選択される空中浮遊毒物への曝露から生じる、請求項１に記載の方法。１４．傷害が、紫外線照射、太陽光照射、健康な日焼け（suntanning）照射、熱照射、太陽に当たりすぎた日焼け（sunburning）照射、ガンマ線照射、マイクロ波照射、電磁照射、核照射、及びこれらの組合せからなる群への曝露から生じる、請求項１に記載の方法。１５．傷害が、白内障、黄斑変性症、変性網膜傷害、肺ガン、皮膚ガン、メラノーマ、日焼け、放射線中毒、アスベスト肺、アテローム性動脈硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、多発性硬化症、火傷、肺気腫、気管支肺異形成症、鉄過負荷症、血色素症、地中海貧血症、膵臓炎、糖尿病、自己免疫性ネフローゼ症候群、重金属誘導腎毒症、及び照射損傷から成る群から選択される疾病又は症状における病理学的な原因である、請求項１に記載の方法。１６．傷害が、核廃棄物、放射性降下物、工業用化学薬品又はエタノールに曝露し又は消費することによって誘導される、請求項１に記載の方法。１７．傷害が、反応性酸素種、基、遊離基、酸化によるストレス、酸化による傷害、及びこれらの組合せから成る群から選択される因子によって生じる、請求項１に記載の方法。１８．薬剤の治療投与又は照射によって生じる傷害からミトコンドリアを保護する方法であって、該ミトコンドリアを有効に保護する量のＬ−エルゴチオネイン及び薬学的に受容可能な担体を含む組成物であって、該組成物が該治療剤又は照射治療と共に共投与される組成物をミトコンドリアに利用可能とさせることを該方法が含む方法。１９．治療剤が、抗ガン剤、抗ガン照射治療、線溶治療、及びこれらの組合せから成る群から選択される、請求項18に記載の方法。２０．組成物がリポソームに分散している、請求項18に記載の方法。２１．薬学的に受容可能な担体中のＬ−エルゴチオネインを含む、傷害を生じる照射、遊離基、及び反応性酸素種からミトコンドリアを保護する組成物。２２．担体がヒドロケルローションである、請求項21に記載の組成物。２３．Ｌ−エルゴチオネインが50μMから5mMの範囲内の最終濃度で存在する、請求項21に記載の組成物。２４．Ｌ−エルゴチオネインが約1mMの最終濃度で存在する、請求項22に記載の組成物。２５．組成物がリポソームに分散している、請求項21に記載の組成物。２６．少なくとも部分的にリポソームにカプセル化しているＬ−エルゴチオネインを含む、傷害を生じる照射、遊離基及び反応性酸素種からミトコンドリアを保護する組成物。２７．リポソームを、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、オレイン酸及びコレステリルヘミスクシネートを2：2：1：5の比率で含むリポソーム形成組成物から製造する、請求項26に記載の組成物。２８．Ｌ−エルゴチオネインが1μMから5mMの範囲内の濃度で存在する、請求項2 6に記載の組成物。２９．Ｌ−エルゴチオネインが約12μMの濃度で存在する、請求項28に記載の組成物。３０．以下の一連の工程を順次含む、哺乳動物に対する照射、遊離基又は反応性酸素種による傷害の値を決定する方法：（a）哺乳動物から細胞試料を分離する工程；（b）細胞試料を一連の同一のアリコットに分割する工程；（c）薬学的に受容可能な担体中のＬ−エルゴチオネインのある濃度範囲のうちの一つにアリコットを曝露する工程；（c）アリコット中のミトコンドリアの傷害の程度を決定する工程；及び（d）照射、遊離基又は反応性酸素種に曝露した試験哺乳動物からの細胞試料における種々の程度のミトコンドリアの傷害を阻害する度合いとＬ−エルゴチオネインの値との間の前もって決定した関連を使用し、哺乳動物に対する傷害の程度を引き出す工程。３１．以下の一連の工程を順次含む、哺乳動物に対する照射、遊離基又は反応性酸素種による傷害への感受性を決定する方法：（a）哺乳動物から細胞試料を分離する工程；（b）細胞試料を照射、遊離基又は反応性酸素種に曝露する工程；（b）細胞試料を一連の同一のアリコットに分割する工程；（c）薬学的に受容可能な担体中の種々の濃度のＬ−エルゴチオネインを含む一連の組成物の一つに各アリコットを曝露する工程；（d）アリコット中のミトコンドリアへの傷害の程度を決定し、該ミトコンドリアの傷害を阻害するＬ−エルゴチオネインの濃度を特定する工程；（e）照射、遊離基又は反応性酸素種に前もって曝露した哺乳動物細胞のミトコンドリアの傷害から保護する程度とＬ−エルゴチオネイン濃度との間の前もって決定した相関関係に該濃度を対比し、それによって哺乳動物の傷害に対する感受性を引き出す工程。３２．以下の一連の工程を順次含む、照射、遊離基又は反応性酸素種による傷害に対するＬ−エルゴチオネインによる哺乳動物における保護の程度を決定する方法：（a）哺乳動物から細胞試料を分離する工程；（b）細胞試料を一連のアリコットに分割する工程；（c）薬学的に受容可能な担体中の種々の濃度のＬ−エルゴチオネインを含む一連の組成物の一つに各アリコットを曝露する工程；（d）該アリコットを照射、遊離基、又は反応性酸素種に曝露する工程；（e）アリコット中のミトコンドリアへの傷害の程度を決定し、該ミトコンドリアの傷害を阻害するＬ−エルゴチオネインの濃度を特定する工程；（f）照射、遊離基又は反応性酸素種に前もって曝露した哺乳動物細胞のミトコンドリアの傷害から保護する程度とＬ−エルゴチオネインの濃度との間の前もって決定した相関関係に、Ｌ−エルゴチオネインの濃度に対する外傷買いの値を対比し、これにより該哺乳動物の該傷害に対する保護の程度を引き出す工程。３３．照射、遊離基又は反応性酸素種に曝露された哺乳動物の治療に使用するＬ −エルゴチオネインの有効投与量を決定するのに使用する、請求項32に記載の方法。