CN112641777B - 麦角硫因类物质在制备防治缺血性脑卒中药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了麦角硫因类物质在制备防治缺血性脑卒中药物中的应用，属于医药用途技术领域。本发明首次发现麦角硫因类物质能够降低LPS诱导的小胶质细胞炎症反应，对神经元和缺血再灌注诱导大鼠脑梗均具有保护作用，可以用于开发新的预防或治疗缺血性脑卒中的药物。

Description

麦角硫因类物质在制备防治缺血性脑卒中药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种麦角硫因类物质的新用途，具体涉及麦角硫因类物质在制备防治缺血性脑卒中药物中的应用，属于医药用途技术领域。

背景技术

脑卒中（stroke）俗称脑中风，是一种突发性脑血液循环障碍疾病，由于脑血流量供应减少，造成脑组织氧和营养物质缺乏，最终导致神经元细胞死亡和脑梗死。缺血性脑卒中约占脑卒中的80%以上，在中国所占比例逐年增加，并出现年轻化的趋势，成为我国第一位致残和致死原因，造成了严重的经济和社会负担。脑卒中除了高致残率和高致死率外，还有高发病率、高复发率以及并发症多的特征，因此对缺血性脑卒中进行预防和治疗显得尤为重要。目前，脑卒中的治疗方法有限，而临床上的药物多为尿激酶，大多数脑卒中经过当前的药物治疗神经功能不能得到完全恢复。除此之外，通过机械手段移除血栓达到回复血流供应的目的也是常用的治疗手段，但是高风险、低收益也限制了它的应用。因此，研发针对缺血性脑卒中新的治疗手段成为了一项巨大和迫切的临床需求。

麦角硫因(L-Ergothioneine，EGT)，化学名：2-巯基-L-组氨酸三甲基内盐，是一种含硫的组氨酸衍生物。麦角硫因主要存在于一些细菌和真菌中，人体自身不能合成。其化学结构式如下：

研究表明，麦角硫因有丰富的生物学功能，是具有较强抗氧化性的氨基酸，可以清除羟自由基、过氧亚硝基、次氯酸、螯合二价金属离子等；此外麦角硫因对紫外线和γ照射的细胞和组织也有保护作用；同时麦角硫因可以抑制过氧化氢和炎症因子的释放，对机体有一定的抗炎作用。目前，麦角硫因主要用于化妆品中，作为抗氧化成分和抗炎成分使用。麦角硫因由于其独特而显著的生物学功能，在食品、保健品、化妆品、医药、细胞保存等领域都具有重大的应用价值。

然而，目前关于麦角硫因在防治缺血性脑卒中的应用并未发现。

发明内容

本发明首次发现，麦角硫因类物质能够降低LPS诱导的小胶质细胞炎症反应，对神经元和缺血再灌注诱导大鼠脑梗均具有保护作用。经试验验证，麦角硫因类物质在防治缺血性脑卒中领域表现出优异的效果，具有研发前景。

针对上述研究成果，本发明提供了麦角硫因类物质在制备防治缺血性脑卒中药物中的应用。麦角硫因类物质的该新应用为开发预防或治疗缺血性脑卒中药物提供了新的思路和方向。

进一步的，所述麦角硫类物质包括麦角硫因或/和其在医药领域可接受的衍生物。所述麦角硫因在医药领域可接受的衍生物包括但不限于麦角硫因盐、麦角硫因互变异构体、麦角硫因立体异构体中的一种或多种。麦角硫因盐可以是麦角硫因盐酸盐。

进一步的，麦角硫因类物质在防治缺血性脑卒中药物中的含量为治疗有效量。经试验验证， 0.1ng/ml-50ng/ml浓度的麦角硫因类物质对LPS诱导小胶质细胞炎症反应有明显的降低作用；15mg/kg的剂量对缺血再灌注诱导大鼠脑梗有很好的保护作用。

进一步的，所述缺血性脑卒中为脑缺血再灌注损伤。

进一步的，所述防治缺血性脑卒中药物指的是各种类型、各种剂型的用于预防和治疗缺血性脑卒中的药物，麦角硫因类物质作为该药物的有效成分，可以单一使用，也可以与其他有效药物成分一起使用。所述药物的剂型可以是各种可行的剂型，例如片剂、胶囊、颗粒剂、口服液、滴丸、水针剂、冻干粉针、无菌粉针等。

进一步的，所述胶囊为缓释胶囊或控释胶囊。

另一方面，本发明提供了一种防治缺血性脑卒中的药物组合物，所述药物组合物的活性成分包括麦角硫因类物质。

进一步的，所述药物组合物的剂型与前面定义一致。

进一步的，单位剂量药物组合物中麦角硫因类物质的含量为治疗有效量。所述单位剂量药物，指的是药物组合物包装的单位剂量或者使用的最小单位。例如，单片、单胶囊、单包颗粒或滴丸、单瓶口服液、单针等。

进一步的，所述药物组合物还包括医学上可用的辅料。所述辅料是制成各种不同的剂型所必须的辅助材料，包括填充剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、表面活性剂等中的一种或多种。

本发明首次发现麦角硫因类物质能够降低LPS诱导的小胶质细胞炎症反应，对神经元和缺血再灌注诱导大鼠脑梗均具有保护作用，可以用于开发成新的预防或治疗缺血性脑卒中的药物。

具体实施方式

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。

实施例1：麦角硫因类物质对LPS诱导小胶质细胞炎症反应的影响

参照“线纹海马乙醇提取物对脂多糖诱导BV2小胶质细胞炎症反应的作用”（广东海洋大学学报，2019，39（1）:90-96）的方法考察麦角硫因类物质对LPS诱导小胶质细胞炎症反应的影响。具体如下：

1.试验方法：

1.1细胞培养：

将小胶质细胞BV2接种于含体积分数10%胎牛血清的DMEM高糖培养基（含体积分数1%双抗）中，在37℃、5% CO₂和饱和湿度的培养箱内培养，每隔2-3d传代，当BV2细胞贴壁且生长良好时接种于24孔板中，进行后续实验。

1.2 Griess法检测各组细胞释放的NO含量：

取对数生长期的BV2细胞，以1×10⁵个/孔的密度接种于24孔板中（每组设5个复孔），设置对照组（未加麦角硫因和LPS的培养基）、模型组（只含有100ng/mL LPS的培养基）、药物Ⅰ组（0.1ng/mL 麦角硫因预处理24h后+100ng/mL LPS的培养基）、药物Ⅱ组（10 ng/mL麦角硫因预处理24h后+100ng/mL LPS的培养基）、药物Ⅲ组（50 ng/mL 麦角硫因预处理24h后+100ng/mL LPS的培养基）、药物Ⅳ组（10ng/mL麦角硫因盐酸盐处理24h后+100ng/mL LPS的培养基）、药物Ⅴ组（50ng/mL酮咯酸处理24h后+100ng/mL LPS的培养基）。

1.3 ELISA检测各组细胞释放的TNF-α、IL-1β和IL-6含量：

取对数生长期的BV2细胞，以1×10⁵个/孔的密度接种于24孔板中（每组设5个复孔），设置对照组（未加麦角硫因和LPS的培养基）、模型组（只含有100ng/mL LPS的培养基）、药物Ⅰ组（0.1ng/mL麦角硫因预处理24h后+100ng/mL LPS的培养基），药物Ⅱ组（10 ng/mL麦角硫因预处理24h后+100ng/mL LPS的培养基），药物Ⅲ组（50 ng/mL麦角硫因预处理24h后+100ng/mL LPS的培养基），药物Ⅳ组（10 ng/mL麦角硫因盐酸盐预处理24h后+100ng/mL LPS的培养基），药物Ⅴ组（50 ng/mL酮咯酸预处理24h后+100ng/mL LPS的培养基）加入LPS 24h后收集各孔内上清液，并使用ELISA试剂盒按照其说明检测各组TNF-α、IL-1β和IL-6含量。

2.试验结果：

2.1麦角硫因类物质对LPS诱导的BV2细胞中NO释放的影响：

麦角硫因类物质对LPS诱导的BV2细胞中NO释放的影响考察结果见表1。

由表1可以看出，与对照组相比，LPS刺激24h后（模型组）的BV2细胞释放NO显著增加；采用麦角硫因类物质进行预处理后，能显著降低LPS诱导的BV2细胞释放NO。酮咯酸为常用的消炎药物，与麦角硫因类物质相比，同剂量的酮咯酸对LPS诱导的BV2细胞进行预处理后，其降低NO释放的效果不如麦角硫因类物质。

2.2麦角硫因类物质对LPS诱导的BV2细胞促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6浓度的影响：

麦角硫因对类物质LPS诱导的BV2细胞促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6浓度影响的考察结果见表2。

由表2可以看出，与对照组相比，LPS刺激24h后（模型组）的BV2细胞促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的浓度均显著增加；采用麦角硫因类物质进行预处理后，能显著降低LPS诱导的BV2细胞TNF-α、IL-1β和IL-6的释放，采用酮咯酸消炎药进行预处理后，对降低LPS诱导的BV2细胞炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的释放效果有限。

实施例2：麦角硫因类物质对神经元的保护作用

参照专利CN109908154A的方法考察麦角硫因类物质对神经元的保护作用，具体如下：

1.试验方法：

1.1大鼠原代皮层神经元细胞氧糖剥夺/复氧（OGD/R）模型的建立：

在低糖DMEM培养基中加入连二亚硫酸钠(Na₂S₂O₄)干粉使其充分溶解，使终浓度为20mM，用NaHCO₃调pH为7.2，即为缺氧液。原代皮层神经元细胞在24孔板细胞培养板中培养7-10天，选取生长状态良好的细胞进行实验。实验共包括空白对照组、模型对照组、酮咯酸给药对照组、麦角硫因给药Ⅰ组、麦角硫因给药Ⅱ组、麦角硫因给药Ⅲ组、麦角硫因盐酸盐给药组。

空白对照组用培养基继续培养，24h后去除培养基，加入等体积的维持培养基(Neurobasal Media 49mL+B27-Supplement 1mL)；

模型对照组用培养基继续培养，24h后去除培养基，加入等体积的缺氧液；

酮咯酸给药对照组，给药前轻轻吸去24孔板中的培养基，用PBS缓冲液洗涤2次后，用含30 ng/mL酮咯酸的培养基继续培养，24h后去除含药的培养基，置换成缺氧液；

麦角硫因给药Ⅰ组，给药前轻轻吸去24孔板中的培养基，用PBS缓冲液洗涤2次后，用含0.1 ng/mL麦角硫因的培养基继续培养，24h后去除含药的培养基，置换成缺氧液；

麦角硫因给药Ⅱ组，给药前轻轻吸去24孔板中的培养基，用PBS缓冲液洗涤2次后，用含10 ng/mL麦角硫因的培养基继续培养，24h后去除含药的培养基，置换成缺氧液；

麦角硫因给药Ⅲ组，给药前轻轻吸去24孔板中的培养基，用PBS缓冲液洗涤2次后，用含50 ng/mL麦角硫因的培养基继续培养，24h后去除含药的培养基，置换成缺氧液。

麦角硫因盐酸盐给药组，给药前轻轻吸去24孔板中的培养基，用PBS缓冲液洗涤2次后，用含10 ng/mL麦角硫因盐酸盐的培养基继续培养，24h后去除含药的培养基，置换成缺氧液。

将七组药物在培养箱中孵育2h后完全去除上清液，用PBS缓冲液洗涤两次后加入维持培养基。再次放入37℃，5% CO₂孵箱中继续培养2h后，造模完成，神经元细胞可用于实验。

1.2麦角硫因类物质对神经元缺氧、复氧损伤后存活率的影响：

造模后将细胞培养板置于倒置显微镜下观察皮层神经元细胞的生长及细胞损伤情况。除去24孔板内的培养基，加入维持培养基450μL后每孔再加入MTT溶液（5mg/mL）50μL，放入37℃孵育4h。弃含MTT的培养基之后，每孔加入DMSO液200μL，放在摇床上震荡10min。从每孔中取出150μL移至96孔板中，在酶标仪490nm处测定各孔的OD值，以OD值反映细胞的存活情况。

2.试验结果：

麦角硫因类物质对神经元的保护作用考察结果见表3。

由表3可以看出，与空白对照组相比，神经元细胞缺氧/复氧损伤后，模型对照组的神经元细胞存活率显著降低；采用麦角硫因类物质进行处理能够显著提高造模后神经元细胞的存活率，而采用酮咯酸消炎药对神经元细胞的缺氧/富氧损伤并没有保护作用。

实施例3：麦角硫因类物质对缺血再灌注诱导大鼠脑梗的保护作用

参照专利CN109908154A的方法考察麦角硫因类物质对缺血再灌注诱导大鼠脑梗的保护作用，具体如下：

1.试验方法：

1.1脑梗模型的构建：

利用线栓阻断SD大鼠大脑中动脉对其进行缺血再灌注制备脑梗模型。

1.2试验分组及处理：

将建模成功的SD大鼠随机分为4组：模型组、阳性药物组、麦角硫因组和麦角硫因盐酸盐组；其中，阳性药物组尾静脉注射金纳多，剂量为15mg/kg，麦角硫因组尾静脉注射麦角硫因，剂量为15mg/kg，麦角硫因盐酸盐组尾静脉注射麦角硫因盐酸盐，剂量为15mg/kg，模型组给予等量生理盐水，连续给药3天。

1.3考察指标：

(1)神经功能评分

按Bederson的方法对动物的行为缺陷进行分级评分，标准如下：

0分：未观察到神经症状；

1分：提尾悬空时，动物的手术对侧前肢表现为腕肘屈曲，肩内旋，肘外展，紧贴胸壁；

2分：将动物置于光滑平面上，推手术侧肩向对侧移动时，阻力降低；

3分：动物自由行走时向手术对侧环转或转圈；

4分；软瘫，肢体无自发活动。

(2)脑梗死体积的测量

断头处死大鼠，取出全脑，称重。在视交叉及其前后各2mm处，做冠状切四刀，切成五片后迅速将脑片置5mL含有1%TTC的磷酸缓冲溶液中，避光温孵30min，在温孵过程中每隔7～8min翻动一次，温孵30min后取出脑片，用数码相机拍照，之后用眼科镊分离苍白区(梗塞区)和非苍白区(正常区)，计算梗塞百分比如下：

梗塞百分比(%)＝苍白区重量/(苍白区重量+非苍白区重量)×100%。

2.试验结果：

麦角硫因类物质对缺血再灌注诱导大鼠脑梗的保护作用的考察结果见表4。

由表4可以看出，与模型组相比，麦角硫因组以及麦角硫因盐酸盐组具有明显的改善神经缺陷的趋势，能显著减少脑梗模型动物的脑梗塞百分比；而且与阳性药物相比，麦角硫因及麦角硫因盐酸盐的缺血再灌注诱导大鼠脑梗的保护作用也有极大的提升。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (5)

1.麦角硫因类物质在制备防治缺血性脑卒中药物中的应用，其特征是：所述麦角硫因类物质为麦角硫因、麦角硫因盐、麦角硫因互变异构体和麦角硫因立体异构体中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征是：麦角硫因类物质在药物中的含量为治疗有效量。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征是：所述缺血性脑卒中为脑缺血再灌注损伤。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征是：所述防治缺血性脑卒中药物的剂型为片剂、胶囊、颗粒剂、口服液、滴丸、水针剂、冻干粉针或无菌粉针。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征是：所述胶囊为缓释胶囊或控释胶囊。