JP2001513652A

JP2001513652A - 抗−ｇｐｉｉｂ／ｉｉｉａ組み換え抗体

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Publication number: JP2001513652A
Application number: JP50154899A
Authority: JP
Inventors: ベルヒトルトペーター; エフアーエッシャーローベルト
Original assignee: アサトアクチエンゲゼルシャフトアプライドサイエンスアンドテクノロジー
Priority date: 1997-06-06
Filing date: 1998-06-05
Publication date: 2001-09-04
Also published as: CN1263556A; US20040202659A1; EP0990034A1; AU8436798A; WO1998055619A1; CA2293693A1; US6790938B1; CN1163599C; AU745965B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、血小板膜蛋白質に対するヒト自己抗体及び抗イデイオタイプ抗体をコードする新規核酸配列、ヒト抗体の新規アミノ酸配列及び疾病の診断及び治療のためのそれらの使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】抗−ＧＰＩＩＢ／ＩＩＩＡ組み換え抗体本発明は、血小板−膜蛋白質に対するヒト自己抗体及び抗イデイオタイプ抗体をコードする新規核酸配列、ヒト抗体の新規アミノ酸配列及び病気の診断及び治療のためのそれらの使用に関する。自己免疫−血小板欠乏性紫斑病（ＡＩＴＰ）は、正常の又は増加した巨大核細胞毒の場合の低い血小板数により定義される免疫病である。抗−血小板−自己抗体の存在に基づき、網様内皮系（脾臓、肝臓、骨髄）中で血小板の強い崩壊が起こる。ＡＩＴＰ患者の約７５％で検出されうるこの自己抗体は、主として血小板膜−糖蛋白質（ＧＰ）ＩＩｂ／ＩＩＩａ及びＩｂ／ＩＸに対向する。特定の１患者において、複数の種々の自己−抗体−特異性を見出すことができる(例えば、B erchtold und Wenger,Blood 81(1993),1246-1250;Kiefel et al.,Br.J.Haematol .79(1991),256-262;McMillan et al.,Blood 70(1987),1040及びFujisawa et al. ，Blood 79(1991);1441参照)。しかしながら、結合エピトープの特定及び自己抗体の病因論的意義の調査は、ＡＩＴＰ患者から得られる自己抗体の量が限られているので困難のままである。ハイブリドーマ技術の使用下に、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａと反応するＡＩＴＰ患者のリンパ球からの僅かなヒトモノクローナル抗体を得ることができたにすぎない(Kunicki et al.，Hum.Antibodies Hybridomas 1(1990),83-95)。健康な人でも、種々の自己抗原に対向する、例えばヒト血小板の細胞内及び細胞骨格成分に対向する天然の自己抗体の出現も報告されている（Guilbert et al .，J.Immunol．128(1982),2779-2789;Hurez et al.，Eur．J．Immunol.23(1993) ,783-789及びPfueller et al.，Clin．Exp．Immunol．79(1990),367-373）。健康な人の血清中に観察されるこのいくつかの自己抗体は、血小板膜蛋白質に対しても対向しうる(souberbielle,Eur.J.Haematol.56(1996),178-180)。これらの天然の自己抗体の役割及び病気関連自己抗体へのそれの関係はなお未知である。ＡＩＴＰの治療のために、コルチコステロイドを使用することができる。患者の約半数は、プレドニゾンの適用で４週間以内に反応するが、長時間症状消失は非常に稀に見られるだけである。強い出血又は極めて低い血小板数を有する患者では、緊急治療として、静脈免疫グロブリン（ＩＶＩｇＧ）の高い投与量の適用が推奨される。しかしながら、この処置の後には、大抵の患者では急速であるが通常は一時的な血小板数の増加が起こるだけである。ＡＩＴＰの治療の際のコルチコステロイド及びＩＶＩｇＧの作用メカニズムはなお未知である。Berchtold 等の研究(Blood 74(198 9),2414-2417及びBerchtold und Wegner,Blood 81(1993),1246-1250)によれば、血小板−糖蛋白質への自己抗体の結合は、ＩＶＩｇＧ中の抗イデイオタイプ抗体により抑制できることが知られている。本発明の根底にある問題は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへの自己抗体の結合に関与する新規ＤＮＡ配列を同定することである。この方法で、ＡＩＴＰの診断及び治療を改良するために使用することのできる新規の薬物学的製剤を提供することができる。自己抗体からの結合配列の同定は、意外にも、健康なヒト提供者の末梢循環Ｂ −細胞の使用下に、ヒト抗体の重鎖又は軽鎖の結合ファージミド−デイスプレイライブラリーの作製により成功した。繊維状ファージＭ１３の表面での重い又は軽いヒト抗体Ｆａｂ−フラグメントの提示により、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへの特異的結合を示すファージ−クローンを同定することができた。このために、ファージミド−ライブラリーを、順次に、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａなしの血小板無力症血小板（負の選択）及び正常血小板（正の選択）と接触させた。Ｅ・コリーの感染による選択及び増幅の複数ラウンドの後に、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ複合体に結合できる２３個のクローンが得られた。ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対するモノクローナル抗体のプールの使用下での抑制研究は、２群のクローンを生じ：双方の群はＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ複合体に関して特異的であるモノクローナル抗体により抑制され、１つの群はＧＰＩＩｂ特異的なモノクローナル抗体によっても抑制された。これらの発見は、２つの異なる抗−ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａファージ−クローンの存在を示したクローンのＤＮＡ−分析により確認された。これらの結果は、２つのＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ特異的ファージ−クローン、即ち自己抗体が健康な人のゲノムからクローニングすることができ、かつ、これらのクローンがＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ複合体のコンフォメーションエピトープを認識できることを示している。更に、抑制研究により双方のファージ−クローンがＡＩＴＰを有する患者からの血小板−関連自己抗体の精製ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへの結合を抑制し、これによりおそらくＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａのＡＩＴＰ−関連エピトープを認識することが確認された。このファージ−クローンが健康な人のゲノムに由来する天然の自己抗体の抗原結合配列を含有するので、この発見は、ＡＩＴＰ中の血小板−関連自己抗体の原因に関する新たな認識をもたらすことができる。更に、本発明によるファージ−クローンの使用下に抗−ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体に対する組み換え抗イデイオタイプ抗体を得ることができ、この際、抗−ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａファージ−クローンが抗原として使用される。こうして得られる組み換え抗イデイオタイプ抗体は、ＩＶＩｇＧの使用のための重要な臨床変更である。同定されたファージ−クローンのヌクレオチド配列及びそれから誘導されたアミノ酸配列は、配列プロトコルＳＥＱＩＤＮｏ．１〜８（自己抗体）又はＳＥＱＩＤＮｏ．９〜１８（抗イデイオタイプ抗体）に記載されている。１．自己抗体本発明の第１の態様は、自己抗体をコードする核酸に関する。従って、本発明の１目的物は、ヒト抗体の重鎖、その官能性誘導体又はフラグメントをコードし、（ａ）アミノ酸配列：ＶＬＰＦＤＰＩＳＭＤＶ（Ｉ）をコードするヌクレオチド配列、（ｂ）アミノ酸配列：ＡＬＧＳＷＧＧＷＤＨＹＭＤＶ（ＩＩ）をコードするヌクレオチド配列、（ｃ）（ａ）及び（ｂ）からのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、有利に少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列及び（ｄ）ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへの当量結合能を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列から選択されたＣＤＲ３−領域を有する核酸である。本発明による核酸は、更に、有利に、（ａ）アミノ酸配列：ＧＹＳＷＲ（ＩＩＩ）をコードするヌクレオチド配列、（ｂ）アミノ酸配列：ＳＹＡＭＨ（ＩＶ）をコードするヌクレオチド配列及び（ｃ）（ａ）及び（ｂ）からのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、有利に少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列から選択されたＣＤＲ１−領域を有する。更に、本発明による核酸は、（ａ）アミノ酸配列：ＤＩＳＹＳＧＳＴＫＹＫＰＳＬＲＳ（Ｖ）をコードするヌクレオチド配列、（ｂ）アミノ酸配列：ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（ＶＩ）をコードするヌクレオチド配列及び（ｃ）（ａ）又は（ｂ）からのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、有利に少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列から選択されたＣＤＲ２−領域を有するのが有利である。本発明の第２の態様は、ヒト抗体の軽鎖、その官能性誘導体又はフラグメントをコードし、（ａ）アミノ酸配列：ＡＴＷＤＤＧＬＮＧＰＶ（ＶＩＩ）をコードするヌクレオチド配列、（ｂ）アミノ酸配列：ＡＡＷＤＤＳＬＮＧＷＶ（ＶＩＩＩ）をコードするヌクレオチド配列、（ｃ）（ａ）又は（ｂ）からのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、有利に少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列及び（ｄ）ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへの当量結合能を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列から選択されたＣＤＲ３−領域を有する核酸である。更に、本発明による核酸は、（ａ）アミノ酸配列：ＳＧＳＳＳＮＩＲＳＮＰＶＳ（ＩＸ）をコードするヌクレオチド配列、（ｂ）アミノ酸配列：ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＴＶＮ（Ｘ）をコードするヌクレオチド配列及び（ｃ）（ａ）又は（ｂ）からのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、有利に少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列から選択されたＣＤＲ１−領域を有するのが有利である。更に、本発明による核酸は、有利に更に（ａ）アミノ酸配列：ＧＳＨＱＲＰＳ（ＸＩ）をコードするヌクレオチド配列、（ｂ）アミノ酸配列：ＳＮＮＱＲＰＳ（ＸＩＩ）をコードするヌクレオチド配列及び（ｃ）（ａ）又は（ｂ）からのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、有利に少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列から選択されたＣＤＲ２−領域を有する。ＩＩ．抗イデイオタイプ抗体本発明の第２の態様は、抗イデイオタイプ抗体をコードする核酸に関する。従って、本発明の１つの目的物は、ヒト抗体の重鎖、その誘導体又はフラグメントをコードし、かつ（ａ）アミノ酸配列：ＶＲＤＬＧＹＲＶＬＳＴＦＴＦＤＩ（ＸＩＩＩ）をコードするヌクレオチド配列、（ｂ）アミノ酸配列：ＤＧＲＳＧＳＹＡＲＦＤＧＭＤＶ（ＸＩＶ）をコードするヌクレオチド配列、（ｃ）アミノ酸配列：ＭＧＳＳＶＶＡＴＹＮＡＦＤＩ（ＸＶ）をコードするヌクレオチド配列、（ｄ）アミノ酸配列：ＤＡＤＧＤＧＦＳＰＹＹＦＰＹ（ＸＶＩ）をコードするヌクレオチド配列、（ｅ）アミノ酸配列：ＬＲＮＤＧＷＮＤＧＦＤＩ（ＸＶＩＩ）をコードするヌクレオチド配列、（ｆ）アミノ酸配列：ＤＳＥＴＡＩＡＡＡＧＲＦＤＩ（ＸＶＩＩＩ）をコードするヌクレオチド配列、（ｇ）アミノ酸配列：ＥＤＧＴＴＶＰＳＱＰＬＥＦ（ＸＩＸ）をコードするヌクレオチド配列、（ｈ）アミノ酸配列：ＧＳＧＳＹＬＧＹＹＦＤＹ（ＸＸ）をコードするヌクレオチド配列、（ｉ）アミノ酸配列：ＧＬＲＳＹＮＹＧＲＮＬＤＹ（ＸＸＩ）をコードするヌクレオチド配列、（ｊ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）からのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、有利に少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列及び（ｋ）ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対する自己抗体への当量結合能を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列から選択されたＣＤＲ３−領域を有する核酸に関する。本発明による核酸は、更に有利に、第７ａ表に記載のアミノ酸配列ＮＦＡＭＳ、ＳＹＴＭＨ、ＤＹＡＬＨ又はＳＨＹＷＳをコードするヌクレオチド配列、アミノ酸配列ＴＹＹＷＳをコードするヌクレオチド配列、第７ｂ表に記載のアミノ酸配列ＤＹＧＭＨ、ＳＨＴＩＳ、ＫＹＡＩＨ又はＥＬＳＭＨをコードするヌクレオチド配列及び前記のアミノ酸配列の１つに対して少なくとも８０％、有利に少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列から選択されたＣＤＲ１−領域を有する。更に本発明による核酸は、第７ａ表中に記載のアミノ酸配列ＧＩＳＧＧＧＬＬＴＨＹＡ（Ｄ／Ｎ）ＳＶＫＧ、ＬＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ、ＧＩＳＷＤＳＴＳＩＧＹＡＤＳＶＫＧ又はＦＩＹＤＧＡＲＴＲＦＮＰＳＬＲＳをコードするヌクレオチド配列、アミノ酸配列ＹＩＹＹＳＧＮＴＮＹＮＰＳＬＫＳをコードするヌクレオチド配列、第７ｂ表中に記載のアミノ酸配列ＡＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ、ＧＩＴＰＩＦＧＴＶＮＹＡＱＫＦＱＧ、ＡＩＳＳＮＧＧＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧ又はＧＦＤＰＥＤＧＥＴＩＹＡＱＫＦＱＧをコードするヌクレオチド配列及び前記アミノ酸配列の１つに対して少なくとも８０％、有利に少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列から選択されたＣＤＲ２−領域を有するのが有利である。本発明のもう一つの目的物は、ヒト抗体の軽鎖、その官能性誘導体又はフラグメントをコードし、（ａ）アミノ酸配列：ＣＳＹＶＨＳＳＴＮ（ＸＸＩＩ）をコードするヌクレオチド配列、（ｂ）アミノ酸配列：ＱＶＷＤＮＴＮＤＱ（ＸＸＩＩＩ）をコードするヌクレオチド配列、（ｃ）（ａ）からのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、有利に少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列及び（ｄ）ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対する自己抗体への当量結合能を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列から選択されたＣＤＲ３−領域を有する核酸である。更に、本発明による核酸は、第７ａ表中に記載のアミノ酸配列ＴＧＴＳＳＡＩＧＮＹＮＦＶＰをコードするヌクレオチド配列、第７ｂ表中に記載のアミノ酸配列ＧＧＹＫＩＧＳＫＳＶＨをコードするヌクレオチド配列及び前記アミノ酸配列に対して少なくとも８０％、有利に９０％の相同性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列から選択されたＣＤＲ１−領域を有するのが有利である。更に、本発明による核酸は、有利に更に、第７ａ表中に記載のアミノ酸配列ＥＧＳＫＲＰＳをコードするヌクレオチド配列、第７ｂ表中に記載のアミノ酸配列ＥＤＳＹＲＰＳをコードするヌクレオチド配列及び先に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、有利に少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸をコードするヌクレオチド配列から選択されたＣＤＲ２−領域を有する。本発明における「ヒト抗体の鎖の官能性誘導体」なる概念は、前記のように定義された重鎖又は／及び軽鎖のＣＤＲ３−領域少なくとも１つを有し、場合によってはヒト抗体のそれぞれの相補的鎖（又はそのような鎖の誘導体）と一緒になって、誘導体化されていない抗体と同様に一つの抗原に関して当量の認識特異性を有する抗体誘導体を形成することができるポリペプチドと理解すべきである。このような抗体誘導体は、それぞれの抗原に関して少なくとも１０^-6ｌ／モル、有利に少なくとも１０^-8ｌ／モルの結合定数を有するのが有利である。ヒト抗体の鎖の官能性誘導体を製造することは、例えば、組み換えＤＮＡ−技術により、それぞれのポリペプチドをコードする遺伝子の画分の欠失、置換又は／及び挿入により行うことができる。抗体鎖又は抗体の特に有利な官能性誘導体は、例えばＨ−及びＬ−鎖の可変ドメイン又は１個又は２個のＨ−鎖ドメイン及び場合によっては１個の定常ドメインから成っていてよい１本鎖抗体である。このような構造の作製は、Hoogenboom et al.，Immunol.Rev.130(1992),41-68 ;Barbas III,Methods:Comp ,Immunochemistry(1994),Marcel Dekker Inc．Kapitel 9,210-235に記載されている。本発明における「当量結合能」なる概念は、一つの同じ結合アフィニテイ又は／及び特異性、即ち具体的に開示された配列中におけるようなエピトープ認識と理解すべきである。本発明のもう一つの目的物は、本発明による核酸のコピー少なくとも１個を含有するベクターである。このベクターは原核性ベクター又は真核性ベクターであってよい。原核性ベクターの例は、プラスミド、コスミド及びバクテリオファージである。このようなベクターは、例えば、Sambrook et al.，Molecular Cloni ng，A Laboratory Manual，2nd Edition(1989),Cold Spring Habor Laboratory Pressの１〜４章に記載されている。原核性ベクターはプラスミド又はファージであるのが有利である。他方、このベクターは真核性ベクター、例えば酵母ベクター、昆虫ベクター（バクロウイルス）又は哺乳動物ベクター（プラスミドベクター又はウイルスベクター）であってもよい。真核性ベクターの例は、Samb rook et al.，の前記文献１６章及びWinnacker,Gene ie(1985),VCH Verlagsgesellschaftの特に５、８及び１０章に記載されている。本発明のもう一つの目的物は、本発明による核酸を発現する細胞又は本発明による核酸又は本発明によるベクターで形質転換されている細胞である。これらの細胞は、原核性細胞（例えばグラム陰性菌細胞、殊にＥ・コリー）又は真核性細胞（例えば酵母−、植物−又は哺乳動物細胞）であってよい。好適な細胞の例及び本発明による核酸をこのような細胞中に導入する方法は前記文献中に存在する。本発明のもう一つの目的物は、本発明による核酸によりコードされているポリペプチド、殊に組み換えポリペプチドである。特に有利にこのポリペプチドは、ヒト抗体のＨ−又は／及びＬ−鎖の可変ドメインを含有する。特に、抗体特性を有し、下位単位としての重鎖又はその官能性誘導体及び軽鎖又はその官能性誘導体から構成されているポリペプチドが有利である。このポリペプチドは、２本の別々の鎖から成っていてよいか又は１本鎖ポリペプチドとして存在していてもよい。本発明のもう一つの目的物は、ポリペプチドの抗原認識に関与する領域に対向している本発明によるポリペプチドに対する抗体である。この抗体は、ポリクローナル抗血清、モノクローナル抗体又はポリクローナルもしくはモノクローナル抗体のフラグメント（例えば、Ｆａｂ−、Ｆ（ａｂ）₂−、Ｆａｂ’−又はＦ（ａｂ’）₂フラグメント）であってよい。この抗体は、本発明によるポリペプチドの重い又は／及び軽い抗体鎖のＣＤＲ３−領域又はその範囲に対向しているのが有利である。このような抗体は、公知方法で、実験動物を本発明によるＣＤＲ３−領域を含有するペプチド又はポリペプチドで免疫化し、生じるポリクローナル抗体を実験動物から回収することにより得ることが ilsteinの方法又はその更なる展開による実験動物の抗体−生産性Ｂ−細胞と白血病細胞との融合により得ることができる。更に、本発明によるポリペプチドのＣＤＲ３−領域に対向している組み換え抗体は、適当なファージミド−ライブラリー、例えば健康なヒト提供者からのファージミド−ライブラリーのスクリーニング（Musterung）によって得ることもでき、この際、抗原として本発明によるポリペプチドが使用される。本発明は、前記のような核酸、ベクター、ポリペプチド、抗体又は細胞を活性成分として、場合によっては他の活性成分及び薬剤学的に慣用の助剤、添加剤又は担持物質と一緒に含有する薬剤組成物にも関する。この薬剤組成物は、診断剤又は治療剤の製造のために使用することができる。診断用途の例は、ＡＩＴＰ又はＡＩＴＰの疾病素質の診断である。もう一つの有利な診断用途は、ＡＩＴＰの場合の疾病経過の観察である。診断剤としての薬剤組成物の使用は、例えば、本発明のポリペプチドを抗体として発現するＢ−細胞集団の検出を包含することができる。この抗体の検出は、例えば、核酸平面上で、例えば場合により前接続された増幅を伴う核酸−ハイブリド化−検定により行うことができる。他方、この検出は、蛋白質平面上で特異的にポリペプチドと反応する抗原又は抗体の使用下での免疫検定により行うことができる。更に、本発明による薬剤組成物は治療の分野でも、殊にＡＩＴＰの予防又は治療のために使用することができる。この治療用途は、例えば抗−自己抗体の生産の刺激を行うことに基づく。このために、例えば本発明による自己抗体−ポリペプチドを患者に適用し、これにより抗イデイオタイプ抗体の形成を惹起させ又は／及び刺激することができる。この場合、適用は慣用の免疫化プロトコル(Fox e t al.，J.Pharmacol．Expe.Ther．279(1996),1000-1008;Whittum-Hudson et al. ，Nat．Med．2(1996)，1116-1121;Jardieu,Curr．Opin．Immunol．7(1995)，779 782)に従うことができる。他方、抗体遺伝子の発現は、適当なアンチセンス−核酸の適用により特異的に抑制することができる。本発明による抗イデイオタイプ抗体−ポリペプチドは、自己抗体−活性の直接抑制を達成するために患者に適用することができる。本発明による自己抗体−ポリペプチドの試験は、これが意外にも、血小板へのフィブリノーゲンの結合を抑制することができることを示した。従って、本発明による自己抗体−ポリペプチド及び抗イデイオタイプ抗体−ポリペプチドは、場合によっては組み合わせで、血液凝固の変更のための薬剤として、例えば心不全、卒中の後の血栓症の阻止又は肺塞栓又は虚血を伴う静脈血栓症等の場合に使用することができる。従来は、治療の目的のためにフィブリノーゲン拮抗剤としてマウスモノクローナル抗体、例えばモノクローナル抗体７Ｅ３（例えばＵＳ−特許第５４４００２０参照）又はそのフラグメント（例えば市販のＦａｂが使用された。しかしながら、マウスモノクローナル抗体及び抗体フラグメントは、それらがヒト患者の処置の際に、その免疫原性に基づき不所望の副反応をもたらす欠点を有し、他方、短いペプチドは一般に非常に迅速に分解される。これらの公知薬剤とは反対に、本発明によるポリペプチドは、それがヒト由来のアミノ酸配列から成り、従って相応するマウス抗体又は抗体フラグメントよりは低い不所望の副作用を有し、その大きさに基づきペプチドのように早くは分解しない利点を有する。従って、本発明は、本発明による核酸、殊に自己抗体−ポリペプチドをコードする核酸、この核酸を含有するベクター、この核酸で又はベクターで形質転換された細胞、この核酸でコードされたポリペプチド又は前記物質１種以上を含有する薬剤組成物の、血小板へのフィブリノーゲンの結合の影響、殊に抑制のための薬剤の製造のための使用に関する。特に、この薬剤は血液凝固の変性のために、殊に血栓の溶解又は／及び血栓形成の防止のために使用される。本発明による薬剤組成物の適用は、既にマウス抗体又は抗体フラグメントで確立されているプロトコルに従って行うことができる。本発明のもう一つの課題は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対する自己抗体又はこの自己抗体に対向している抗イデイオタイプ抗体をコードする核酸を発現するファージミド−クローンを得る方法であり、これは、ヒト提供者のリンパ球からファージミド−ライブラリーを作製し、所望のファージミド−クローンを、負及び正の選択工程を包含するアフィニテイ選択により取得することよりなる。更に、この方法は、有利に、抗体−コード性核酸をこのクローンから取得し、又は／及び抗体−コード性核酸を組み換え抗体連鎖、その誘導体又はフラグメントの発現のために使用することを内容とする。更に、本発明を次の実施例、図面及び配列プロトコルにより説明する。ＳＥＱＩＤＮｏ．１は、本発明による抗体（ファージミドクローンＰＤＧ７）のＨ−鎖のヌクレオチド配列を示し、ここで、フレームワーク−領域（ＦＲ）１はｂｐ１−９０、補体決定領域（ＣＤＲ）１はｂｐ９１−１０５、ＦＲ２はｂｐ１０６−１４７、ＣＤＲ２はｂｐ１４８−１９５、ＦＲ３はｂｐ１９６−２９１、ＣＤＲ３はｂｐ２９２−３２４及びＦＲ４はｂｐ３２５−３５７に存在する、ＳＥＱＩＤＮｏ．２は、ＳＥＱＩＤＮｏ．１に記載のヌクレオチド配列に対するアミノ酸配列を示し、ここで、ＦＲ１はＡ．Ｓ．１−３０、ＣＤＲ１はＡ．Ｓ．３１−３５、ＦＲ２はＡ．Ｓ．３６−４９、ＣＤＲ２はＡ．Ｓ５０− ６５、ＦＲ３はＡ．Ｓ．６６−９７、ＣＤＲ３はＡ．Ｓ．９８−１０８及びＦＲ４はＡ．Ｓ．１０９−１１９に存在する、ＳＥＱＩＤＮｏ．３は、本発明によるポリペプチド（ファージミドクローンＰＤＧ７）のＬ−鎖のヌクレオチド配列であり、ここでＦＲ１はｂｐ１−６０、ＣＤＲ１はｂｐ６１−９９、ＦＲ２はｂｐ１００−１４４、ＣＤＲ２はｂｐ１４５−１６５、ＦＲ３はｂｐ１６６−２６１、ＣＤＲ３はｂｐ２６２−２９４及びＦＲ４はｂｐ２９５−３３３に存在する、ＳＥＱＩＤＮｏ．４は、ＳＥＱＩＤＮｏ．３に記載のヌクレオチド配列に対するアミノ酸配列を示し、ここで、ＦＲＩはＡ．Ｓ．１−２０、ＣＤＲ１はＡ．Ｓ．２１−３３、ＦＲ２はＡ．Ｓ．３４−４８、ＣＤＲ２はＡ．Ｓ．４９−５５、ＦＲ３はＡ．Ｓ．５６−８７、ＣＤＲ３はＡ．Ｓ．８８−９８及びＦＲ４はＡ．Ｓ．９９−１１に存在する、ＳＥＱＩＤＮｏ．５は、本発明によるポリペプチド（ファージミドクローンＰＤＧ１３）のＨ−鎖の核酸配列を示し、ここで、ＦＲ１はｂｐ１−９０、ＣＤＲ１はｂｐ９１−１０９、ＦＲ２はｂｐ１０６−１４７、ＣＤＲ２はｂｐ１４８ −１９８、ＦＲ３はｂｐ１９９−２９４、ＣＤＲ３はｂｐ２９５−３３６及びＦＲ４はｂｐ３３７−３６９に存在する、ＳＥＱＩＤＮｏ．６は、ＳＥＱＩＤＮｏ．５に記載のヌクレオチド配列のアミノ酸配列を示し、ここで、ＦＲ１はＡ．Ｓ．１−３０、ＣＤＲ１はＡ．Ｓ．３１−３５、ＦＲ２はＡ．Ｓ．３６−４９、ＣＤＲ２はＡ．Ｓ．５０−６６、ＦＲ３はＡ．Ｓ．６７−９８、ＣＤＲ３はＡ．Ｓ．９９−１１２及びＦＲ４はＡ．Ｓ．１１３−１２３に存在する、ＳＥＱＩＤＮｏ．７は、本発明によるポリペプチド（ファージミドクローンＰＧＤ１３）のＬ−鎖のヌクレオチド配列を示し、ここで、ＦＲ１はｂｐ１−６０、ＣＤＲ１はｂｐ６１−９９、ＦＲ２はｂｐ１００−１４４、ＣＤＲ２はｂｐ１４５−１６５ＦＲ３はｂｐ１６６−２６１、ＣＤＲ３はｂｐ２６２−２９４及びＦＲ４はｂｐ２９５−３３３に存在する、ＳＥＱＩＤＮｏ．８はＳＥＱＩＤＮｏ．７に記載のヌクレオチド配列のアミノ酸配列を示し、ここで、ＦＲ１はＡ．Ｓ．１−２０、ＣＤＲ１はＡ．Ｓ．２１−３３、ＦＲ２はＡ．Ｓ．３４−４８、ＣＤＲ２はＡ．Ｓ．４９−５５、ＦＲ３はＡ．Ｓ．５６−８７、ＣＤＲ３はＡ．Ｓ．８８−９８及びＦＲ４はＡ．Ｓ．９９−１１１に存在する、ＳＥＱＩＤＮｏ．９は、本発明によるポリペプチド（ファージミドクローンＡＩ−Ｘ１６）のＨ−鎖のヌクレオチド配列を示し、ここで、ＦＲ１はｂｐ１− ９０、ＣＤＲ１はｂｐ９１−１０５、ＦＲ２はｂｐ１０６−１４７、ＣＤＲ２はｂｐ１４８−１９８、ＦＲ３はｂｐ１９９−２８８、ＣＤＲ３はｂｐ２８９−３３６及びＦＲ４はｂｐ３３７−３６９に存在する、ＳＥＱＩＤＮｏ．１０は、ＳＥＱＩＤＮｏ．９に記載のヌクレオチド配列のアミノ酸配列を示し、ここで、ＦＲ１はＡ．Ｓ．１−３０、ＣＤＲ１はＡ．Ｓ．３１−３５、ＦＲ２はＡ．Ｓ．３６−４９、ＣＤＲ２はＡ．Ｓ．５０−６６、ＦＲ３はＡ．Ｓ．６７−９６、ＣＤＲ３はＡ．Ｓ．９７−１１２及びＦＲ４はＡ．Ｓ．１１３−１２３に存在する、ＳＥＱＩＤＮｏ．１１は、本発明によるポリペプチド（ファージミドクローンＡＩ−Ｘ１６）のＬ−鎖のヌクレオチド配列を示し、ここで、ＦＲ１はｂｐ１ −６０、ＣＤＲ１はｂｐ６１−１０２、ＦＲ２はｂｐ１０３−１４７、ＣＤＲ２はｂｐ１４８−１６８、ＦＲ３はｂｐ１６９−２６４、ＣＤＲ３はｂｐ２６５− ２９１及びＦＲ４はｂｐ２９２−３７５に存在する、ＳＥＱＩＤＮｏ．１２は、ＳＥＱＩＤＮｏ．１１に記載のヌクレオチド配列のアミノ酸配列を示し、ここで、ＦＲ１はＡ．Ｓ．１−２０、ＣＤＲ１はＡ．Ｓ．２１−３４、ＦＲ２はＡ．Ｓ．３５−４９、ＣＤＲ２はＡ．Ｓ．５０−５６、ＦＲ３はＡ．Ｓ．５７−８８、ＣＤＲ３はＡ．Ｓ．８９−９７及びＦＲ４はＡ．Ｓ．８９−１５３に存在する、ＳＥＱＩＤＮｏ．１３は、本発明によるポリペプチド（ファージミドクローンＡＩ−Ｘ２０）のＨ−鎖のヌクレオチド配列を示し、ここで、ＦＲ１はｂｐ１ −９０、ＣＤＲ１はｂｐ９１−１０５、ＦＲ２はｂｐ１０６−１４７、ＣＤＲ２はｂｐ１４８−１９５、ＦＲ３はｂｐ１９６−２９１、ＣＤＲ３はｂｐ２９２− ３３３及びＦＲ４はｂｐ３３４−３６６６に存在する、ＳＥＱＩＤＮｏ．１４は、ＳＥＱＩＤＮｏ．１３に記載のヌクレオチド配列のアミノ酸配列を示し、ここで、ＦＲ１はＡ．Ｓ．１−３０、ＣＤＲ１はＡ．Ｓ．３１−３５、ＦＲ２はＡ．Ｓ．３６−４９、ＣＤＲ２はＡ．Ｓ．５０−６５、ＦＲ３はＡ．Ｓ．６６−９７、ＣＤＲ３はＡ．Ｓ．９８−１１１及びＦＲ４はＡ．Ｓ．１１２−１２２に存在する、ＳＥＱＩＤＮｏ．１５は、本発明によるポリペプチド（ファージミドクローンＡＩ−Ｘ３９）のＨ−鎖のヌクレオチド配列を示し、ここで、ＦＲ１はｂｐ１ −９０、ＣＤＲ１はｂｐ９１−１０５、ＦＲ２はｂｐ１０６−１４７、ＣＤＲ２はｂｐ１４８−１９８、ＦＲ３はｂｐ１９９−２９４、ＣＤＲ３はｂｐ２９５− ３３９及びＦＲ４はｂｐ３４０−３７２に存在する、ＳＥＱＩＤＮｏ．１６は、ＳＥＱＩＤＮｏ．１５に記載のヌクレオチド配列のアミノ酸配列を示し、ここで、ＦＲ１はＡ．Ｓ．１−３０、ＣＤＲ１はＡ．Ｓ．３１−３５、ＦＲ２はＡ．Ｓ．３６−４９、ＣＤＲ２はＡ．Ｓ．５０−６６、ＦＲ３はＡ．Ｓ．６７−９８、ＣＤＲ３はＡ．Ｓ．９９−１１３及びＦＲ４はＡ．Ｓ．１１４−１２４に存在する、ＳＥＱＩＤＮｏ．１７は、本発明によるポリペプチド（ファージミドクローンＡＩ−Ｘ４０）のＨ−鎖のヌクレオチド配列を示し、ここで、ＦＲ１はｂｐ１ −９０、ＣＤＲ１はｂｐ９１−１０５、ＦＲ２はｂｐ１０６−１４７、ＣＤＲ２はｂｐ１４８−１９８、ＦＲ３はｂｐ１９９−２９７、ＣＤＲ３はｂｐ２９８− ３３９及びＦＲ４はｂｐ３４０−３７２に存在する、ＳＥＱＩＤＮｏ．１８は、ＳＥＱＩＤＮｏ．１７に記載のヌクレオチド配列のアミノ酸配列を示し、ここで、ＦＲ１はＡ．Ｓ．１−３０、ＣＤＲ１はＡ．Ｓ．３１−３５、ＦＲ２はＡ．Ｓ．３６−４９、ＣＤＲ２はＡ．Ｓ．５０−６６、ＦＲ３はＡ．Ｓ．６７−９９、ＣＤＲ３はＡ．Ｓ．１００−１１３及びＦＲ４はＡ．Ｓ．１１４−１２４に存在する、ＳＥＱＩＤＮｏ．１９は、本発明によるポリペプチド（ファージミドクローンＡＩ−Ｘ２）のＨ−鎖のヌクレオチド配列を示し、ここで、ＦＲ１はｂｐ１− ９０、ＣＤＲ１はｂｐ９１−１０５、ＦＲ２はｂｐ１０６−１４７、ＣＤＲ２はｂｐ１４８−１９５、ＦＲ３はｂｐ１９６−２９１、ＣＤＲ３はｂｐ２９２−３２７及びＦＲ４はｂｐ３２８−３６０に存在する、ＳＥＱＩＤＮｏ．２０は、ＳＥＱＩＤＮｏ．１９に記載のヌクレオチド配列のアミノ酸配列を示し、ここで、ＦＲ１はＡ．Ｓ．１−３０、ＣＤＲ１はＡ．Ｓ．３１−３５、ＦＲ２はＡ．Ｓ．３６−４９、ＣＤＲ２はＡ．Ｓ．５０−６５、ＦＲ３はＡ．Ｓ．６６−９７、ＣＤＲ３はＡ．Ｓ．９８−１０９及びＦＲ４はＡ．Ｓ．１１０−１２０に存在する、ＳＥＱＩＤＮｏ．２１は、本発明によるポリペプチド（ファージミドクローンＡＩ−Ｂ１４）のＨ−鎖のヌクレオチド配列を示し、ここで、ＦＲ１はｂｐ１ −９０、ＣＤＲ１はｂｐ９１−１０５、ＦＲ２はｂｐ１０６−１４７、ＣＤＲ２はｂｐ１４８−１９８、ＦＲ３はｂｐ１９９−２９４、ＣＤＲ３はｂｐ２９５−３３６及びＦＲ４はｂｐ３３７−３６９に存在する；この配列の次の変形も見出された：位置７にＣ、位置９にＧ、位置１３にＧ、位置１５にＧ、位置９１にＡ、位置９２にＧ、位置９８にＣ、位置１４９にＴ、位置２０５にＡ、位置２２８にＡ、位置２５１にＡ、位置２５３にＴ又は／及び位置２８４にＡが存在することができる。このことにより、結果としてアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮｏ．２２参照）中で、位置３にＱ、位置５にＶ、位置３１にＳ、位置３３にＡ、位置５０にＶ、位置６９にＴ、位置７６にＫ、位置８４にＮ、位置８５にＳ又は／及び位置９５にＹが存在することができる。ＳＥＱＩＤＮｏ．２２は、ＳＥＱＩＤＮｏ．２１に記載のヌクレオチド配列のアミノ酸配列を示し、ここで、ＦＲ１はＡ．Ｓ．１−３０、ＣＤＲ１はＡ．Ｓ．３１−３５、ＦＲ２はＡ．Ｓ．３６−４９、ＣＤＲ２はＡ．Ｓ．５０−６６、ＦＲ３はＡ．Ｓ．６７−９８、ＣＤＲ３はＡ．Ｓ．９９−１１２及びＦＲ４はＡ．Ｓ．１１３−１２３に存在する、ＳＥＱＩＤＮｏ．２３は、本発明によるポリペプチド（ファージミドクローンＡＩ−Ｂ１８）のＨ−鎖のヌクレオチド配列を示し、ここで、ＦＲ１はｂｐ１ −９０、ＣＤＲ１はｂｐ９１−１０５、ＦＲ２はｂｐ１０６−１４７、ＣＤＲ２はｂｐ１４８−１９８、ＦＲ３はｂｐ１９９−２９４、ＣＤＲ３はｂｐ２９５−３３３及びＦＲ４はｂｐ３３４−３６６に存在する；このヌクレオチド配列の次の変形も見出された：位置７にＣ、位置１３にＧ、位置１６にＣ、位置５６にＡ、位置９４にＴ、位置９７にＧ、位置１５５にＴ、位置１７３にＣ、位置２２３にＴ、位置２５２にＴ又はＣ、位置２６１にＧ、位置２６７にＧ、位置２７１にＡ、位置２７５にＣ又は／及び位置２７７にＧが存在することができる。このことにより、相応するアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮｏ．２４参照）中で、結果として位置３にＱ、位置５にＶ、位置６にＱ、位置１９にＫ、位置３２にＹ、位置３３にＡ、位置５２にＩ、位置５８にＡ、位置７５にＳ、位置８４にＳ、位置８７にＲ、位置８９にＥ、位置９１にＴ、位置９２にＡ又は／及び位置９３にＶが存在することができる。ＳＥＱＩＤＮｏ．２４は、ＳＥＱＩＤＮｏ．２３に記載のヌクレオチド配列のアミノ酸配列を示し、ここで、ＦＲ１はＡ．Ｓ．１−３０、ＣＤＲ１はＡ．Ｓ．３１−３５、ＦＲ２はＡ．Ｓ．３６−４９、ＣＤＲ２はＡ．Ｓ．５０−６６、ＦＲ３はＡ．Ｓ．６７−９８、ＣＤＲ３はＡ．Ｓ．９９−１１１及びＦＲ４はＡ．Ｓ．１１２−１２２に存在する、ＳＥＱＩＤＮｏ．２５は、本発明によるポリペプチド（ファージミドクローンＡＩ−Ｂ２４）のＨ−鎖のヌクレオチド配列を示し、ここで、ＦＲ１はｂｐ１−９０、ＣＤＲ１はｂｐ９１−１０５、ＦＲ２はｂｐ１０６−１４７、ＣＤＲ２はｂｐ１４８−１９８、ＦＲ３はｂｐ１９９−２９４、ＣＤＲ３はｂｐ２９５−３３０及びＦＲ４はｂｐ３３１−３６３に存在する；このヌクレオチド配列の次の変形も見出された：位置７にＣ、位置９にＧ、位置１３にＧ、位置１５にＧ、位置３１にＧ、位置４６にＡ、位置６７にＧ、位置８９にＧ、位置９２にＧ、位置９３にＣ、位置９８にＧ、位置１０２にＧ、位置１４０にＧ、位置１４１にＧ、位置１４５にＧ、位置１４９にＴ、位置１５７にＴ、位置１５８にＡ、位置１６０にＧ、位置１６６にＡ、位置１７３にＡ、位置２３５にＴ、位置２５１にＡ、位置２９０にＣ又は／及び位置２９３にＡが存在することができる。このことにより、相応するアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮｏ．２６参照）中で、結果として位置３にＱ、位置５にＶ、位置１１にＶ、位置１６にＲ、位置２３にＡ、位置３０にＳ、位置３１にＳ、位置３３にＧ、位置３４にＭ、位置４７にＷ、位置４９にＡ、位置５０にＶ、位置５３にＹ、位置５４にＤ、位置５６にＳ、位置５８にＫ、位置７９にＬ、位置８４にＮ、位置９７にＡ又は／及び位置９８にＫが存在することができる。ＳＥＱＩＤＮｏ．２６は、ＳＥＱＩＤＮｏ．２５に記載のヌクレオチド配列のアミノ酸配列を示し、ここで、ＦＲ１はＡ．Ｓ．１−３０、ＣＤＲ１はＡ．Ｓ．３１−３５、ＦＲ２はＡ．Ｓ．３６−４９、ＣＤＲ２はＡ．Ｓ．５０−６６、ＦＲ３はＡ．Ｓ．６７−９８、ＣＤＲ３はＡ．Ｓ．９９−１１０及びＦＲ４はＡ．Ｓ．１１１−１２１に存在する、ＳＥＱＩＤＮｏ．２７は、本発明によるポリペプチド（ファージミドクローンＡＩ−Ｂ２４）のＬ−鎖のヌクレオチド配列を示し、ここで、ＦＲ１はｂｐ１ −６０、ＣＤＲ１はｂｐ６１−９６、ＦＲ２はｂｐ９７−１３８、ＣＤＲ２はｂｐ１３９−１５９、ＦＲ３はｂｐ１６０−２５５、ＣＤＲ３はｂｐ２５６−２８２及びＦＲ４はｂｐ２８３−３６６に存在する；このヌクレオチド配列の次の変形も見出された：位置４にＣ又はＴ、位置３７にＧ、位置４０にＡ、位置５０にＧ、位置６７にＡ、位置７２にＴ、位置１３３にＡ、位置１３６にＴ、位置１３８にＴ又はＣ、位置１４８にＧ、位置１６０にＴ、位置１６１にＴ、位置１６２にＴ又はＣ、位置２００にＣ、位置２１７にＴ、位置２１８にＧ、位置２２０にＡ又はＣ、位置２６９にＧ、位置２７１にＴ、位置２７２にＧ、位置２７５にＧ又は／及び位置２８２にＴ又はＣが存在することができる。このことにより、相応するアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮｏ．２８参照）中で、結果として位置２にＬ、位置１３にＧ、位置４１にＫ、位置１７にＲ、位置２３にＮ、位置２４にＮ、位置４５にＩ、位置４７にＹ、位置５０にＤ、位置５４にＦ、位置６７にＴ、位置７３にＳ、位置７４にＲ、位置９０にＳ、位置９１にＳ、位置９２にＳ又は／及び位置９４にＨが存在することができる。ＳＥＱＩＤＮｏ．２８は、ＳＥＱＩＤＮｏ．２７に記載のヌクレオチド配列のアミノ酸配列を示し、ここで、ＦＲ１はＡ．Ｓ．１−２０、ＣＤＲ１はＡ．Ｓ．２１−３２、ＦＲ２はＡ．Ｓ．３３−４６、ＣＤＲ２はＡ．Ｓ．４７−５３、ＦＲ３はＡ．Ｓ．５４−８５、ＣＤＲ３はＡ．Ｓ．８６−９４及びＦＲ４はＡ．Ｓ．９５−１２２に存在する、ＳＥＱＩＤＮｏ．２９は、本発明によるポリペプチド（ファージミドクローンＡＩ−Ｂ３８）のＨ−鎖のヌクレオチド配列を示し、ここで、ＦＲ１はｂｐ１ −９０、ＣＤＲ１はｂｐ９１−１０５、ＦＲ２はｂｐ１０６−１４７、ＣＤＲ２はｂｐ１４８−１９８、ＦＲ３はｂｐ１９９−２９４、ＣＤＲ３はｂｐ２９５− ３３３及びＦＲ４はｂｐ３３４−３６６に存在する；このヌクレオチド配列の次の変形も見出された：位置７にＣ、位置９にＧ、位置１３にＧ、位置１５にＡ又は／及び位置１６にＣが存在することができる。このことにより、相応するアミノ酸配列中で、結果として、位置３にＱ、位置５にＶ又は／及び位置６にＱが存在することができ、かつＳＥＱＩＤＮｏ．３０は、ＳＥＱＩＤＮｏ．２９に記載のヌクレオチド配列のアミノ酸配列を示し、ここで、ＦＲ１はＡ．Ｓ．１−３０、ＣＤＲ１はＡ．Ｓ．３１−３５、ＦＲ２はＡ．Ｓ．３６−４９、ＣＤＲ２はＡ．Ｓ．５０−６６、ＦＲ３はＡ．Ｓ．６７−９８、ＣＤＲ３はＡ．Ｓ．９９−１１１及びＦＲ４はＡ．Ｓ．１１２−１２２に存在する。図１は、抗イデイオタイプ抗体−ＰｈａｂＡＩ−Ｘ１７の添加によるＧＰＩＩａ／ＩＩｂへの自己抗体−Ｐｈａｂｓ（ＰＤＧ−Ｘ）の結合の抑制、図２は抗イデイオタイプ抗体−ＰｈａｂｓＡＩ−Ｂによる血小板への自己抗体 −Ｐｈａｂｓ（ＰＤＧ−Ｂ）の結合の抑制、図３は、非処理及びＥＤＴＡ−処理血小板への自己抗体−Ｐｈａｂｓの結合、図４は、自己抗体−ＰｈａｂｓによるＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへのフィブリノーゲン結合の抑制、図５〜７は、抗体７Ｅ３及び抗体フラグメントＲｅｏＰｈａｂｓの結合の抑制。実施例１．自己抗体配列の同定１．１．自己抗体の取得ＡＩＴＰを有する１２患者（初期ＡＩＴＰ患者８、群と関連しているＡＩＴＰ患者１）の自己抗体は、患者血漿を精製ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａと共に４℃で一晩インキュベーションし、引き続き、グリシン０.２モル／ｌ及びＮａＣｌ０.１５モル／ｌ中、ｐＨ２.５、室温で１５分間溶離させることにより得られた。１０００００ｇで３０分間の遠心分離の後に、上澄みを１モル／ｌトリス−ＨＣｌで中和し、トリス−緩衝塩溶液（ＴＢＳ）に対して一晩透析させた。血漿採取の時点で、全ての患者は血小板欠乏性（血小板数＜１５０×１０⁹／ｌ）であり、正常の又は増大された巨核細胞を脊髄中に有し、免疫血小板欠乏症の他の検出可能な形を有しなかった。１．２．精製抗原の取得抗原として、精製ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＧＰＩＩＩａの細胞質フラグメント（アミノ酸７２１−７４４）及びＧＤＩＩＩａの細胞外フラグメント（アミノ酸４６８−６９０）を使用した（Beardsley,Blut 59(1989)、47-51及びPhillips et al.,Methods Enzymol.215(1992),244263）。１．３．パンニング及び免疫ブロッテイングのための血小板の取得健康なヒト提供者のＥＤＴＡ−抗凝固血液試料から示差遠心分離により血小板の多い血漿を製造した。この血小板を２０００ｇで１５分間の遠心分離により単離し、クエン酸ナトリウム５０ミリモル／ｌ、ＮａＣｌ１００ミリモル／ｌ及びデキストロース１２５ミリモル／ｌを含有するクエン酸緩衝液(ｐＨ６.２)中で６回洗浄し、引き続き、同じ緩衝液中に再懸濁させた。血小板無力症血小板を、１４歳の血小板無力症GlanzmannタイプＩ羅病少年から、同じ富化プロトコルの使用下に得た。１．４．モノクローナル抗体ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの複合形を認識するマウスモノクローナル抗体及び選択的にＧＰＩＩｂ又はＧＰＩＩＩａを認識する抗体を使用した。これらの抗体は、慣用の免疫化プロトコルを用いて相応する抗原の使用下に取得され、ＡＩＴＰ− に関連していない。このような抗体の取得は、Konus等(J.Biol．Chem.267(1992) ,18844-18851)、Steiner等(Biochim.Biophys.Acta .Sci.USA 82(1985),48374841）により記載されている。１．５．ファージミド−ライブラリー結合Ｆａｂ−ライブラリーを、Vogel等(Eur.J.Immunol.24(1994),1200-1207) により記載された方法により作製し、この際、健康な前免疫化ヒト提供者からの末梢血液リンパ球を用いた。Ｔａｑポリメラーゼ(perkin Elmer,NJ,USA)以外の全ての酵素及びオリゴヌクレオチドを、Boehringer Mannheim GmbH(Mannhei m,Deutschland)から取り寄せた。Ｆａｂ−分子のＨ−及びＬ−鎖、ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ及びエセリキア・コリー菌株ＸＬ−ブルーのＰＣＲ−増幅のためのプライマーを、Stratacyte(La Jolla,CA,USA)から取り寄せた。ファージミドｐＣｏｍｂ３をScripps Research Institute(La Jolla、CA,USA)から取り寄せた。クローニング、ＸＬ−ブルー細胞中での形質転換及びＰｈａｂｓの作製を、Barbas III及びLerner,Methods:Companion Methods Enzymol.2(1991)、119 ）に記載のように行った。Ｐｈａｂｓを、ポリエチレングリコール８０００４％（ｗ／ｖ）及びＮａＣｌ３％（ｗ／ｖ）で沈殿させ、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に再懸濁させた。生じた発現ライブラリーは、特異性１×１０⁷を含有する。１．６．ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ−特異性Ｐｈａｂｓの単離ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ−特異性Ｐｈａｂｓを、アフィニテイ選択（パンニング）の合計５ラウンドで作製した。５×１０⁷血小板無力症血小板を用いる前吸着（負選択）の後に、このＰｈａｂｓを１０⁸個の正常血小板と共に４５分間インキュベートした（正選択）。次いで、結合したＰｈａｂｓをクエン酸ナトリウム（ｐＨ２．５）０．０５モル／ｌで溶離させ、１モル／ｌトリス−緩衝液で中和させた。各々のパンニング−ラウンドの後に、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ特異性Ｐｈａｂｓの富化をファージコロニー形成性単位の滴定により追跡した。５選択ラウンドの後に、溶離されたＰｈａｂｓの富化が１００倍以上で認められた。第４の選択ラウンドの後に得られたＰｈａｂｓのプールを、そのＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ特異性に関して詳細に分析した。このために、ランダムに４０Ｐｈａｂ −クローンを選択し、その結合特異性を免疫ドット−検定で測定した。正常及び血小板無力症血小板（１０９／ｍｌ）及び精製ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ（５００μ ｇ／ｍｌ）１μｌをニトロセルロース片（Millipore Corporation,Bedford,MA, USA）上に滴下した。この片をカゼイン０．１５％を含有するＴＢＳ（ＴＢＳ− カゼイン）中でブロッキングし、次いでＴＢＳ−カゼイン中に希釈されたＰｈａｂｓと共に一晩インキュベートした。ＴＢＳ−０．１％ツイーン２０（TBS-Twee n）で３回洗浄の後に、結合したＰｈａｂｓを、４−クロル−１−α−ナフトール（Merck,Darmstadt,Deutschland）を用いて、ＴＢＳ−カゼイン中に１：１０００で希釈された西洋わさびペルオキシダーゼ−接合ポリクローナル兎−抗−ファージ−抗体(Vogel et al.,前出)と共にインキュベートの後に、検出した。血小板及び精製ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへのＰｈａｂｓの結合を、滴下の前の加熱（７０℃）及び酸処理（０．５ＮＨＣｌでｐＨ２）による蛋白質の変性の後にも試験した。ランダムに選択された４０クローンの内、２３（５７．５％）がＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａと反応し、１７は結合を示さなかった。インキュベーションの前の加熱又はｐＨ２による抗原の変性の後には、Ｐｈａｂｓへの抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの結合は観察されなかったので、Ｐｈａｂ−結合のためには完全なＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａが必要であることが明らかである。負のＰｈａｂｓでのＦａｂ−測定は、１５クローン（８８％）でＦａｂ−分子を示さなかった。ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへの結合なしの２Ｆａｂ−正クローンは、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに関する低い結合アフィニテイを有することができた。１．７．Ｆａｂ分析カッパ（κ）、ラムダ（λ）及びＦｄ−鎖上の正のＰｈａｂｓの試験のために、抗−ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａＰｈａｂｓをニトロセルロース上に滴下した。このフィルターを、ＴＢＳ−カゼイン中で１：１０００に希釈されたペルオキシダーゼ−標識マウス−抗−ヒト−λ−、−κ−（The Binding Site Limited，B irmingham,England）及び−Ｆｄ−抗体（ミエローマセルラインＨＰ６０４５、ＡＴＣＣ１７５７、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）と共に４時間インキュベートし、化学蛍光（ECL,Amersham,Scweiz,Zuerich,Schweiz)で展開させた。κ 、λ及びＦｄ−鎖上のランダムに選択された１５抗−ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａＦａｂ−クローンの試験は、１２クローン（８０％）中のＦｄ−鎖の存在及び全てのクローン中のλ−鎖の存在を示した。血小板上のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへのＦａｂ−結合の定量測定は、プールされたＰｈａｂｓと種々の濃度の血小板と一緒の前インキュベーションにより行う。次いで、上澄みを免疫ドット法により分析した。この場合に、血小板１個当たりＰｈａｂｓ１〜３×１０⁴が結合することが確認された。このことは、血小板１個当たりＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ分子の約１０〜５０％がＰｈａｂｓにより占拠されうることを立証している。１．８．Ｐｈａｂ−結合エピトープの特徴付けＰｈａｂｓのエピトープ特異性は、種々のモノクローナル抗体（４参照）の使用下での抑制試験により測定した。解凍された正常及び血小板無力症血小板（１０９／ｍｌ）、精製ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ（５００μｇ／ｍｌ）、ＧＰＩＩＩａのペプチドフラグメント（アミノ酸４６８−６９０、５００μｇ／ｍｌ）及びＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの細胞質画分（５００μ／ｍｌ）１μｌを、それぞれ２バッチ中でニトロセルロース片上に滴下した。ブロッキングの後に、Ｐｈａｂ−クローン（Ｆａｂ０．４μｇ／ｍｌ）を、モノクローナル抗体なしで又はモノクローナル抗体（１μｇ／ｍｌ）と一緒に一晩インキュベートした。結合したＰｈａｂｓをペルオキシダーゼ−標識抗−ＰＨａｇｅ−抗体及び４−クロル−１−α− ナフトールにより検出した。この検査で、Ｐｈａｂクローンの２群が同定された。Ａ群（５クローン）は、全ての抗体の１プールにより中程度に、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ−複合体−特異性抗体により強く抑制された。抗−ＧＰＩＩｂ抗体は、効果を有しなかった。Ｂ群（１０クローン）は、全ての抗体のプールにより完全に抑制されたが、複合体特異性抗体及びＩＩｂ特異性抗体によっては僅かに抑制された。どの群もＧＰＩＩＩａ特異性抗体との反応を示さなかった。抗原として血小板及び精製ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの使用の際に、同様な結果が得られた。細胞質ペプチド又はＧＰＩＩＩａの細胞外フラグメントへのＰｈａｂ−結合は認められなかった。この結果を、第１表にまとめて示す。１．９．抑制試験発見された抗−ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａＰｈａｂｓによる患者からの自己抗体のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへの結合のブロッキングを抑制試験により測定した。このために、前記のように同定された２種のＰｈａｂクローン（ＰＤＧ１６、ＰＤＧ３１）を用いた。患者からの溶離された自己抗体の１：３〜１：１０００の系統的希釈を精製ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへの結合で分析した。このために免疫ドット検定を実施した。精製ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ１００ｎｇをそれぞれ３バッチ中でニトロセルロース片上に滴下し、このフィルターをＴＢＳ−カゼインでブロッキングした。ＰｈａｂｓによるＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへのＡＩＴＰ自己抗体結合のブロッキングのために、片をＰｈａｂｓ１０¹¹と共に１時間、次いで変動希釈度のＡＩＴＰ自己抗体と共に４時間インキュベートした。結合された自己抗体を、ペルオキシダーゼ−標識抗−ヒト−ＩｇＧ−Ｆｃ抗体及びＥＣＬにより検出した。８ＡＩＴＰ患者からの自己抗体の結合は、抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａＰｈａｂｓにより抑制された。この抑制範囲は、ＰＴＧ１６、ＰＴＧ３１又は双方のＰｈａｂｓのプールに関して、１０〜４６％、３２〜６０％及び２０〜６７％であった。４ＡＩＴＰ患者からの自己抗体の結合は、これらのＰｈａｂｓによって変えられなかった。双方の群中には、一次及び疾病関連ＡＩＴＰを有する患者の自己抗体があった。得られた結果を第２表にまとめて示す。１．１０．ＤＮＡ配列分析プラスミドＤＮＡを、Ａ群の４Ｐｈａｂクローン及ットＰＣ２０（Macherey-NagelAG,Oensingen,Schwe iz）を用いて精製した。核酸配列決定は、ＰＲＩＳＭ Ready Reaction Dye Deoxy Terminator Cycle Seqencing Kitの使用下で、ＡＢ１３７３Ａシークエンシングシステムで行った。プライマーは、Microsynth,Balgach,Schweizから取り寄せた。Ｈ鎖のシークエンシングのために、次のプライマーを使用した：Ｃｈｙ１（５’−ＣＧＣＴＧＴＧＣＣＣＣＣＡＧＡＧＧＴ−３’）及びＰＣＨ（５’−ＧＧＣＣＧＣＡＡＡＴＴＣＴＡＴＴＴＣＡＡＧＧ−３’）。Ｌ−鎖のシークエンシングのために次のプライマーを使用した：Ｃλ（５’−ＧＡＧＡＣＡＣＡＣＣＡＧＴＧＴＧＧＣ−３’）、Ｃｋ（５’−ＣＡＣＡＡＣＡＧＡＧＧＣＡＧＴＴＣＣ−３’）及びＰＣＬ（５’−ＣＴＡＡＡＣＴＡＧＣＴＡＧＴＣＴＣＣ−３’）。ＤＮＡ配列から誘導されたアミノ酸配列をＧｅｎＥＭＢＬ−遺伝子バンクと比較し、主系列（stammlinie）ＶＨ及びｖλファミリーを関係付けた。各群の４Ｐｈａｂクローン（Ａ群：ＰＤＧ７、ＰＤＧ８、ＰＤＧ１０、ＰＤＧ１６；Ｂ群：ＰＤＧ１３、ＰＤＧ１７、ＰＤＧ３１、ＰＴＧ３７）のＶＨ及びＶ λヌクレオチド配列を自動シークエンシングにより分析し、公知の主系列−遺伝子配列と比較した（第３表及び第４表）。各群内で、Ｈ−及びＬ−鎖の誘導されたアミノ酸配列中の相同性が１００％であった。これと反対に、ＡとＢ群の間のこの相同性は、Ｈ−鎖については３６．９％及びＬ− 鎖−アミノ酸配列については８１．９％であった。Ｈ−鎖中で、Ａ群のクローンは、ＶＨ４ファミリーの主系列遺伝子ＶＨ４．１１と最大の配列同一性を示す（Sanz,et al.,EMBO J.8(1989),3741-3748K）。フレームワーク領域（ＦＲ）内に７つ及び補体決定性領域（ＣＤＲ）内に８つのアミノ酸差異が生じた。Ｂ群のクローンは、ＶＨ３−ファミリーの最大相同主系列配列１．９ＩＩＩ(Berman et al.,ENBO J.7(1988),727-738)とはＦＲ中の４つ及びＣＤＲ中の１つのアミノ酸により異なっている。Ｌ−鎖中では、Ａ及びＢ群のクローンがＶλＩファミリーのＤＰＬ２の主系列配列に対する最大相同性を示した（Williams und Winter,Eur.J.Immunol.323(19 93),1456）。Ａ群のクローンに関してはＦＲ中に９つ及びＣＤＲ中に１０のアミノ酸差異が生じ、Ｂ群のクローンに関してはＦＲ中に１つ、ＣＤＲ中に２つのアミノ酸差異が生じた。得られた結果を、第３表及び第４表中にまとめた。第４表は、アミノ酸相同性による公知主系列Ｖ−遺伝子配列に対するＡ及びＢ群のクローンの関係を示している：２．抗イデイオタイプ抗体配列の同定２．１Ｐｈａｂ−クローンＡＩ−Ｘ例１に記載の方法で、ファージミド技術により抗イデイオタイプ抗体の配列を同定した。この場合に、例１で選択されたクローンＰＤＧ１６を抗原として使用した。負の前選択は行わなかった。結合Ｐｈａｂ−ライブラリーの１プール、末梢Ｂ−リンパ球の非免疫性の赤色血液細胞で固定されたライブラリー及び扁桃腺からのＢ−リンパ球の非免疫性ライブラリーの特異性を使用した。１４パンニングラウンドの後に得られたＰｈａｂｓのプールを分析した。このために、４０Ｐｈａｂ−クローンをランダムに選択し、それらの結合特異性を測定した。選択された２５クローンは、抗−ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ−Ｐｈａｂと反応した。これらの抗イデイオタイプＰｈａｂ−クローンは、２つの群に属する：群Ｉ（３クローン）は、もっぱらＡ群の自己抗体−Ｐｈａｂ−クローン（ＰＤＧ７、８、１０及び１８）との反応を示し、群ＩＩのＰｈａｂ−クローン（合計２２クローン）は、Ａ及びＢ群のＰｈａｂ−クローンと、マウスモノクローナル抗−ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ−抗体と、それからの精製血清免疫グロブリン（ＩＶＩｇＧ）又はＦ（ａｂ’）₂フラグメントとも、抗−ＩｇＥ−Ｆａｂとも反応する。１４Ｐｈａｂ−クローン（群ＩＩＩ）は、前記物質のどれとも反応しなかった。群ＩＶの１Ｐｈａｂ−クローンは、抗−ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体のみと反応した。これら特異性検査の結果を第５表にまとめた。群ＩのＰｈａｂ−クローン（ＡＩ−Ｘ１６、１７及び２４）のＤＮＡ−配列分析は、重鎖をコードする配列中にＣＤＲ２領域中のアミノ酸１個までの完全な同一性を示し、軽鎖をコードする配列中で完全な同一性を示した。公知の主系列− 遺伝子配列との比較は、Ｈ−鎖−配列ＶＨ３に対する約８５％の相同性及びＬ− 鎖ファミリーＶ−λＩＩの配列に対して約９０％相同性を示した。群ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶのＰｈａｂ−クローンからＨ−鎖遺伝子のＤＮＡ−配列分析を、それぞれ１代表で実施した。これらの配列分析及び公知主系列−遺伝子配列との比較の結果を第６表及び第７ａ表にまとめた。抑制試験の結果は、図１中に記載されている。ＰＤＧ−ＡへのＡＩ−Ｘ１７の結合の精製ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａによる抑制を、免疫ドット検定により測定した。ＰＤＧ−ＡＰｈａｂ６６０又は２２０ｎｇをニトロセルロース上に施与した。この抗原を、５０μｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度でのＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａと共にかつ対照としての緩衝液と共に２時間、次いで、ファージクローンＡＩ−Ｘ１７(最終濃度１０¹²／ｍｌ)と共に更に２時間インキュベートした。結合したファージをペルオキシダーゼ−接合ポリクローナル兎−抗ファージ抗体及び電気化学的蛍光を用いて検出した。ＰｈａｂＡＩ−Ｘ１７（群Ｉ）は、糖蛋白質ＩＩｂ／ＩＩＩａへのＡ群の自己抗体−Ｐｈａｂｓ（ＰＤＧ−Ｘ）の結合を抑制できることが判明した。このことは、ＡＩ−Ｘ１７がＰＤＧ−Ａ上の抗原結合位置を認識することを意味する。ＰＤＧ−Ａに結合するもう一つのクローンＡＩ−Ｘ２をシークエンシングした。このクローンは、−クローンＡＩ−Ｘ２０、３９及び４０と同様に−１つのみの重鎖を有するが、軽鎖を有しない。この重鎖は、単独で、場合によってはジマーとして、充分な特異性及びアフィニテイで抗原、即ちＰＤＧ−Ａに結合することができる。２．２Ｐｈａｂ−クローンＡＩ−Ｂ例２．１に記載の方法で、ファージミド技術により他の抗イデイオタイプ抗体の配列を同定した。この場合に、例１で選択されたクローンＰＤＧ−Ｂを抗原として使用した。合計４０のＰｈａｂ−クローンを選択し、その結合特異性を測定した。選択された３４のクローンは、抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ−ＰＨＡＢと反応した。これらの抗イデイオタイプＰｈａｂクローンは３つの群に属した：群Ｉ（１４クローン）は、もっぱらＢ群の自己抗体−Ｐｈａｂ−クローンとの反応を示し、群ＩＩのＰｈａｂ−クローン（合計８クローン）は、Ａ及びＢ群のＰｈａｂ−クローンとも反応した。更に、群ＩＩＩのＰｈａｂ−クローン（合計１２クローン）は、マウスモノクローナル抗−ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ−抗体と、その精製血清免疫グロブリン（ＩＶＩｇＧ）又はＦ（ａｂ’）₂−フラグメントと、かつ抗ＩｇＥ−Ｆａｂと反応した。６つのＰｈａｂ−クローン（群ＩＶ）は、前記物質のどれとも反応しなかった。この特異性検査の結果を第５ｂ表にまとめる。群ＩのＰｈａｂ−クローン（ＡＩ−１４、１８、２４及び３８）のＤＮＡ配列分析の結果を、第６表及び第７ｂ表にまとめる。クローンＡＩ−Ｂ１４、１８及び３８は１つのみの重鎖を有する。ＡＩ−Ｂ１４及び１７は同じである。同様にＡＩ−Ｂ３４及び４０はＡＩ−Ｂ１８と同じである。ＡＩ−Ｂ−Ｐｈａｂｓによる血小板へのＰＤＧ−Ｂ−結合の抑制は図２に示されている。測定はフローサイトメトリー分析により行った。このために、血小板の豊富な血漿（血小板合計１０⁷）を、ビオチン化ＰＤＧ−Ｂと共にＡＩ−ＢＰｈａｂｓの存在又は不存在下にかつ対照としてのヘルパーファージの使用下にインキュベートした。血小板をパラホルムアルデヒドで固定し、結合されたＰＤＧ−ＢをＲ−フィコエリスリン（ＲＰＥ）−標識ストレプトアビジンで検出した。１００００事例をＦＡＣＳｃａｎ−装置中で計数し、蛍光の平均値（±ＳＤ）を記録した。最大の抑制（＞６０％）がクローンＡＩ−Ｂ１８、２４及び３８で得られた。結合の抑制は、ＡＩ−ＢクローンのＰＤＧ−Ｂ上の抗原結合位置との交換作用を示している。３．血小板へのフィブリノーゲン結合上への自己抗体−ポリペプチドの影響３．１方法ＥＤＴＡ−前処理された血小板へのＦａｂ−結合の分析血小板の多い血漿をＥＤＴＡ１０ｍＭと共に３０分間インキュベートした。ビオチニル化ＤＰＧ−Ｂ及びＤＰＧ−Ａポリペプチドを添加し、室温で１時間インキュベートした。ＤＰＧ−Ａ及びＤＰＧ−Ｂの血小板への結合を、フィコエリスリン−標識ストレプトアビジンの使用下でのフローサイトメトリー分析により測定した。凝集実験血小板の多い血漿（２５０×１０⁹／ｌ）を新たに製造し、ＣＯ₂５％下に保持した。この血漿をＰＤＧ−Ａ又はＰＤＧ−Ｂの不存在又は存在（最大量１０μｇＦａｂ）下に、ＡＤＰの種々の希釈（最大濃度４１０μＭ）により活性化させた。凝集をアグレゴメー定した。他の実験でＰＤＧ−Ａ又はＰＤＧ−Ｂの添加の後に、ポリクローナル抗 −Ｆａｂ−抗−血清を、活性化された血小板に加えた。フィブリノーゲン−結合試験ＥＬＩＳＡ−プレートのウエルにＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ０．５μｇ／ｍｌを塗布し、トリス−緩衝塩溶液中の３．５％仔牛血清アルブミンでブロッキングした。次いで、フィブイノーゲン（Kabl Diagnostics，Stockholm Schweden）を種々の濃度（最大０．０８ μｇ／ｍｌ）で、ＰＤＧ−Ａ、ＰＤＧ−Ｂ又は抗−ＩｇＥ−Ｆａｂの不存在又は存在下に対照のために添加した（最大濃度23μｇ／ｍｌ）。結合されたフィブリノーゲンを、ラッテ−抗−ヒトフィブリノーゲン−抗体、ビオチニル化マウス− 抗−ラッテ−抗体及びストレプトアビジンとビオチニル化西洋わさびペルオキシダーゼからの接合体（Amersham Pharmacia Biotheh Europe GmbH,Duebendor f,CH）を用いて、ＥＬＩＳＡ−Ｅａｓｙ−読みとり装置（EAR340AT,SLT-Instrum 。血小板の多い血漿（２３０×１０⁹／ｌ）をＰＤＧ−Ｂ又はＰＤＧ−Ａ（２００又は４００μｇ／ｍｌ）と一緒に、マウスモノクローナル抗体７Ｅ３又はその全量は１０¹⁴〜１０¹⁰の範囲）又は不存在下に、インキュベートした。同量の１％パラホルムアルデヒドでの固定の後に、血小板へのＰＤＧ−Ｂ及びＰＤＧ−Ａの結合を、フィコエリスリン−標識ストレプトアビジンの使用下でのフローサイトメトリー分析により測定した。３．２結果試験された組み換え抗−ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａＦａｂ自己抗体フラグメントは、１０ｍＭＥＤＴＡで前処理された血小板への結合を示さなかった。このとは、自己抗体フラグメントがその形態が完全な抗原のみを認識することを示している（図３）。血小板の多い血漿を使用した凝集実験で、ＰＤＧ−Ａ又はＰＤＧ−Ｂは、凝集の抑制を示さなかった。血清中よりもフィブリノーゲン濃度が１０⁴〜１０⁶分の１よりも低いフィブリノーゲン結合試験で、フィブリノーゲン結合はＰＤＧ−Ａ及びＰＤＧ−Ｂにより完全に抑制された（図４）。類似の富化プロトコルにより得られた対照としての抗−ＩｇＥＦａｂの使用の際に、抑制は現れなかった。これらの結果は、ＰＤＧ−ＡもＰＤＧ−ＢもＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ上のフィブリノーゲン結合位置との強力な交換作用を示すことを示している。活性ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへのフィブリノーゲン結合を抑制するマウスモノクローナル抗−ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体７Ｅ３及びその市場で入手されるＦａｂ板へのＰＤＧ−Ｂ結合の選択的及び完全な抑制が見出された（図５〜図７）。これと反対に、血小板へのＰによっても有意に抑制されなかった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 43/00 １１１Ｃ０７Ｋ 7/06 Ｃ０７Ｋ 7/06 7/08 7/08 16/18 16/18 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｎ 5/10 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 21/08 5/00 Ｂ (31)優先権主張番号１９８２０６６３．１ (32)優先日平成10年５月８日(1998．5．8) (33)優先権主張国ドイツ（ＤＥ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒト抗体のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに結合しうる重鎖、その官能性誘導体又はフラグメントをコードし、（ａ）アミノ酸配列：ＶＬＰＦＤＰＩＳＭＤＶ（Ｉ）をコードするヌクレオチド配列、（ｂ）アミノ酸配列：ＡＬＧＳＷＧＧＷＤＨＹＭＤＶ（ＩＩ）をコードするヌクレオチド配列及び（ｃ）（ａ）及び（ｂ）からのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列から選択されたＣＤＲ３−領域を有する核酸。２．更に、（ａ）アミノ酸配列：ＧＹＳＷＲ（ＩＩＩ）をコードするヌクレオチド配列、（ｂ）アミノ酸配列：ＳＹＡＭＨ（ＩＶ）をコードするヌクレオチド配列及び（ｃ）（ａ）及び（ｂ）からのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列から選択されたＣＤＲ１−領域を有する、請求項１に記載の核酸。３．更に、（ａ）アミノ酸配列：ＤＩＳＹＳＧＳＴＫＹＫＰＳＬＲＳ（Ｖ）をコードするヌクレオチド配列、（ｂ）アミノ酸配列：ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（ＶＩ）をコードするヌクレオチド配列及び（ｃ）（ａ）又は（ｂ）からのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列から選択されたＣＤＲ２−領域を有する、請求項１又は２に記載の核酸。４．ヒト抗体のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに結合しうる軽鎖、その官能性誘導体又はフラグメントをコードし、（ａ）アミノ酸配列：ＡＴＷＤＤＧＬＮＧＰＶ（ＶＩＩ）をコードするヌクレオチド配列、（ｂ）アミノ酸配列：ＡＡＷＤＤＳＬＮＧＷＶ（ＶＩＩＩ）をコードするヌクレオチド配列及び（ｃ）（ａ）又は（ｂ）からのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列から選択されたＣＤＲ３−領域を有する、但し、核酸が（ｂ）のヌクレオチド配列を有する場合には、これは、同時にはアミノ酸配列ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＴＶＮ及びＳＮＮＱＲＰＳをコードするヌクレオチド配列を有さず、核酸が（ｃ）のヌクレオチド配列を有する場合には、これは同時にはアミノ酸配列ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＴＶＮ及びＲＮＮＱＲＰＳをコードするヌクレオチド配列を有しないことを条件とする、核酸。５．更に、（ａ）アミノ酸配列：ＳＧＳＳＳＮＩＲＳＮＰＶＳ（ＩＸ）をコードするヌクレオチド配列、（ｂ）アミノ酸配列：ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＴＶＮ（Ｘ）をコードするヌクレオチド配列及び（ｃ）（ａ）又は（ｂ）からのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列から選択されたＣＤＲ１−領域を有する、請求項４に記載の核酸。６．更に、（ａ）アミノ酸配列：ＧＳＨＱＲＰＳ（ＸＩ）をコードするヌクレオチド配列、（ｂ）アミノ酸配列：ＳＮＮＱＲＰＳ（ＸＩＩ）をコードするヌクレオチド配列及び（ｃ）（ａ）又は（ｂ）からのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列から選択されたＣＤＲ２−領域を有する、請求項４又は５に記載の核酸。７．ヒト抗体の重鎖、その誘導体又はフラグメントをコードし、（ａ）アミノ酸配列：ＶＲＤＬＧＹＲＶＬＳＴＦＴＦＤＩ（ＸＩＩ）をコードするヌクレオチド配列、（ｂ）アミノ酸配列：ＤＧＲＳＧＳＹＡＲＦＤＧＭＤＶ（ＸＩＶ）をコードするヌクレオチド配列、（ｃ）アミノ酸配列：ＭＧＳＳＶＶＡＴＹＮＡＦＤＩ（ＸＶ）をコードするヌクレオチド配列、（ｄ）アミノ酸配列：ＤＡＤＧＤＧＦＳＰＹＹＦＰＹ（ＸＶＩ）をコードするヌクレオチド配列、（ｅ）アミノ酸配列：ＬＲＮＤＧＷＮＤＧＦＤＩ（ＸＶＩＩ）をコードするヌクレオチド配列、（ｆ）アミノ酸配列：ＤＳＥＴＡＩＡＡＡＧＲＦＤＩ（ＸＶＩＩＩ）をコードするヌクレオチド配列、（ｇ）アミノ酸配列：ＥＤＧＴＴＶＰＳＱＰＬＥＦ（ＸＩＸ）をコードするヌクレオチド配列（ｈ）アミノ酸配列：ＧＳＧＳＹＬＧＹＹＦＤＹ（ＸＸ）をコードするヌクレオチド配列、（ｉ）アミノ酸配列：ＧＬＲＳＹＮＹＧＲＮＬＤＹ（ＸＸＩ）をコードするヌクレオチド配列、（ｊ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）からのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、有利に少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列及び（ｋ）ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対する自己抗体への当量結合能を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列から選択されたＣＤＲ３−領域を有する核酸。８．第７ａ表又は第７ｂ表中に記載のアミノ酸配列及びこれに対して少なくとも８０％の相同性のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列から選択されたＣＤＲ１−領域又は／及びＣＤＲ２−領域を有する、請求項７に記載の核酸。９．ヒト抗体の軽鎖、その官能性誘導体又はフラグメントをコードし、（ａ）アミノ酸配列：ＣＳＹＶＨＳＳＴＮ（ＸＸＩＩ）をコードするヌクレオチド配列、（ｂ）アミノ酸配列：ＱＶＷＤＮＴＮＤＱ（ＸＸＩＩＩ）をコードするヌクレオチド配列、（ｃ）（ａ）からのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、有利に少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列及び（ｄ）ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対する自己抗体への当量結合能を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列から選択されたＣＤＲ３−領域を有する核酸。１０．更に、第７ａ表又は第７ｂ表に記載のアミノ酸配列及びこれに対して少なくとも８０％相同性のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列から選択されたＣＤＲ１−領域又は／及びＣＤＲ２−領域を有する、請求項９に記載の核酸。１１．（ａ）請求項１から３までのいずれか１項に記載の核酸のコピー少なくとも１つ又は／及び請求項４から６までのいずれか１項に記載の核酸のコピー少なくとも１つを含有するか又は（ｂ）請求項７又は８の核酸のコピー少なくとも１つ又は／及び請求項９又は１０の核酸のコピー少なくとも１つを含有することを特徴とする、ベクター。１２．（ａ）請求項１から３までのいずれか１項に記載の核酸又は／及び請求項４から６までのいずれか１項に記載の核酸又は（ｂ）請求項７又は８に記載の核酸又は／及び請求項９又は１０に記載の核酸を発現することを特徴とする、細胞。１３．（ａ）請求項１から３までの１ずれか１項に記載の核酸又は／及び請求項４から６までのいずれか１項に記載の核酸により又は（ｂ）請求項７又は８に記載の核酸又は／及び請求項９又は１０に記載の核酸によりコードされていることを特徴とする、ポリペプチド。１４．ヒト抗体のＨ−鎖の可変ドメイン又は／及びＬ−鎖の可変ドメインを有する、請求項１３に記載のポリペプチド。１５．Ｈ−鎖の可変ドメインもＬ−鎖の可変ドメインも有する、請求項１４に記載のポリペプチド。１６．標識基又はトキシンと結合されている、請求項１３から１５のいずれか１項に記載のポリペプチド。１７．請求項１３から１６のいずれか１項に記載のポリペプチドに対する抗体。１８．ポリペプチドの重い又は／軽い抗体鎖のＣＤＲ３−領域に対向している、請求項１７に記載の抗体。１９．活性成分として、請求項１から１０のいずれか１項に記載の核酸、請求項１１に記載のベクター、請求項１２に記載の細胞、請求項１３から１６のいずれか１項に記載のポリペプチド又は請求項１７又は１８に記載の抗体を、場合により他の活性成分及び薬剤学的に慣用の助剤、添加剤又は担持物質と一緒に含有する、医薬組成物。２０．ＡＩＴＰの診断又は治療又は予防のための薬剤を製造するための、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の核酸、請求項１１に記載のベクター、請求項１２に記載の細胞、請求項１３から１６のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項１７又は１８に記載の抗体又は請求項１９に記載の医薬組成物の使用。２１．血小板へのフィブリノーゲンの結合に影響する薬剤を製造するための、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の核酸、請求項１１に記載のベクター、請求項１２に記載の細胞、請求項１３から１６のいずれか１項に記載のポリペプチド又は請求項１９に記載の医薬組成物の使用。２２．血液凝固の変性のため、殊に血栓の溶解又は／及び血栓形成の予防のための薬剤を製造するための請求項２１に記載の使用。２３．ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対する自己抗体又はこの自己抗体に対向する抗イデイオタイプ抗体をコードする核酸を発現するファージミド−クローンを取得する方法において、健康なヒト提供者のリンパ球からファージミド−ライブラリーを作製し、所望のファージミド−クローンを、負及び正の選択工程を包含するアフィニテイ選択により取得することを特徴とする、ファージミド−クローンを取得する方法。２４．抗体をコードする核酸をクローンから取得する、請求項２３に記載の方法。２５．抗体をコードする核酸を組み換え抗体鎖、その誘導体又はフラグメントの発現のために使用する、請求項２３又は２４に記載の方法。