JP2001511650A - 造血及び血管生成の調節方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 造血及び血管生成を調節することにおける用途のために、胚の胚体外組織において発現される遺伝子産物と機能的に同等の化合物を選択するための方法及びアッセイが提供される。このような化合物は、ヘッジホグタンパク、およびヘッジホグタンパク結合レセプターにより例示される。本方法にしたがえば、このような化合物は、未分化中胚葉由来細胞が造血又は脈管形成の少なくとも一方を行うことを引き起こす。未分化中胚葉由来細胞の例としては、造血幹細胞及び胚性外植片細胞が挙げられる。本発明の方法は、血管生成又は造血における発生エラーを含む種々の病理学的状態及び異常な数のエリスロイド細胞から生じる病理学的状態、又は異常に強化された血管生成を処置するために用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】 造血及び血管生成の調節方法 技術分野 インビトロ及びインビボにおいて造血及び血管生成を調節するための新規な方 法及び組成物を提供する。 背景技術 新しい個体の生命は、２つの配偶子、***及び卵の遺伝物質の融合により開始 する。数ラウンドの***の後、細胞は、最終的に成熟した成体生物を生じる分化 の過程を始める。この過程には、成熟にいたる経路の間の特定の時に作用する多 様な数の因子を含む多くの工程が関与する。成体型への成熟は、分化の過程を完 全には終了しない。これは、成体生物が、充分に分化した細胞に加えて、分解及 び再生の自然のサイクルの間の分化した細胞の補充の両方、及び損傷を受けた組 織の修復にも利用可能な、未分化の幹細胞を有するからである。成体における未 分化な細胞の例としては、骨髄幹細胞(より具体的には造血幹細胞及び前駆細胞) ならびに内皮前駆細胞がある。この種の細胞は、本質的に、個体の損傷した又は 疾患を患う組織の修復及び再構成のための治療の道具箱を提供する。ヘルスケア 提供者による個体を処置するためのこの治療の道具箱の使用は、これらの細胞の 分化経路を操作するための方法及び分化を誘発せずに未分化の細胞の存在する数 を高める又は調製するための方法の欠如により、限られている。 したがって、任意の特定の個体からの未分化細胞の供給を、例えば分化を誘導 せずに細胞の増殖を刺激することにより、増大させ得る新規な方法を見出す必要 が存在する。制御された方式で未分化細胞の分化を調節することもまた望ましい 。分化するように刺激された場合に分化する用意のある未分化細胞は、骨髄を破 壊する化学療法のような幹細胞自体が枯渇する疾患、あるいは分化した細胞が、 身体が未分化の幹細胞の自然の供給を用いることにより損失を補填し得るよりも 速い速度で枯渇する疾患を患う個体に、治療を提供する。例えば、ＡＩＤＳ（エ イズ）においては、ヒト免疫不全症ウイルスによる成熟血液細胞の急速な破壊が 起 こり、個体の免疫細胞の激減がもたらされる。幹細胞が増殖することを引き起こ す因子及びそのような細胞の利用可能性を強化するために分化を調節する因子を 同定する必要性が存在する。 成体生物は、内皮幹細胞及び造血幹細胞（ＨＳＣ）の両方を含む。これらの細 胞は、未分化であるが、適切な条件下で分化して血管及び血液細胞をそれぞれ形 成する。成体における血管生成に関して広範な研究がされてきたが、血管生成が 管の拡張（angiogenesis;新脈管形成）に限られているかどうか、又はデノボ（ 新規）の管の発達（vasculogenesis；脈管形成）もあるのかどうかは未知である 。血管生成を調節する因子の理解は、いかにして腫瘍、慢性関節リウマチ、血管 腫、血管線維腫、乾癬及び毛細血管増殖ならびに糖尿病において起こるもののよ うな異常な血管生成を阻害するかを理解することにおいてだけではなく、外科的 手術、移植、及び心臓血管もしくは脳血管疾患のような血管疾患において起こる もののような組織への栄養欠乏を含む外傷事象の後にいかにして管を修復するか を理解することにおいても重要である。 血管生成とは対照的に、造血は、通常、成体の一生を通じての連続的な過程で ある。血液細胞は、規則的に分解され、新しい細胞が形成されて、毎日数百万の 成熟血液細胞の産生がもたらされる。多数の疾患が、血液細胞の分解と再構成と のアンバランス又は不適切な数のある種の血液細胞の生成から生じる。血液細胞 分化の単純化した模式図を図１２に掲げる。この模式図は、造血幹細胞（ＨＳＣ ）から由来し得る、そして未熟な前駆細胞の段階を通過する、８種の異なるタイ プの血液細胞の発生経路を示す。多能性造血幹細胞は、多数の異なる経路を通じ て赤血球、好中球、好塩基球、好酸球、血小板、マスト細胞、単核球、組織マク ロファージ、破骨細胞、及びＴ及びＢリンパ球を生じる。成体においては、赤血 球は、多能性幹細胞がＢＦＵ−Ｅ（赤芽球コロニー群形成細胞）に分化した場合 に形成され、ＢＦＵ−Ｅは、次にＣＦＵ−Ｅ（赤芽球コロニー形成細胞）を形成 する。成体において血液を形成する器官としては、骨髄、及びそれより重要では ないが肝臓が挙げられ、一方、脾臓は、老化した、又は異常な血液細胞を後に除 去する主要な部位である。造血を調節する因子の探索は、成体に限られていたも のではないが、胚においての研究は、胚が既に発生の比較的進んだ段階にある場 合 に起こる事象に限られていた。 胚における細胞の事象に関しては、Cumanoら、Lymphoid Potential,Probed be fore Circulation in Mouse，Is Restricted to Caudal Intraembryonic Splanc hnopleura，86(1996年)907-16頁は、成体に棲む造血幹細胞（ＨＳＣ）が胚内の 部位から生じることを提案していた。最初に胚内の血島から生じることが報告さ れた血液細胞は、発生中の胚内の副大動脈（para-aortic）内臓葉（splanchnopl eura）中の造血前駆細胞から由来するようである(Cumano et al.，1996)。マウ スの初期発生は、図１４に示すとおりであるが、初期の血島形成の領域は、胚体 外体腔の周縁上に同定される。 現在、異なる造血経路において初期の中間体細胞を刺激することが知られてい る多数の成長因子が存在する。これらとしては、造血（hematopoletic）成長因 子、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子(Ｇ−ＣＳＦ)、及び顆粒球マク ロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）が挙げられる。例えば、ＣＦＵ− Ｅは、エリスロポエチンに応答して、赤血球系列の第一の認識可能な分化メンバ ーである前赤芽球（proerythroblast）を産生する。血液酸素レベルが低下する につれて、エリスロポエチンレベルが増大し、より多くの赤血球の産生がもたら される。赤血球細胞が成熟するにつれて、それは赤芽球となって大量のヘモグロ ビンを合成し、次いで赤血球となる。赤血球は、骨髄を去って、身体組織への酸 素の配達を行う。公知の因子は、ある種の悪性腫瘍又は血液学的／免疫欠陥の治 療において有用性を有し得るが、さらなる療法、特に分化経路の初期に作用する より広い範囲の生物学的活性を有する療法の開発の必要性が非常に存在する。分 化の経路の初期においてＨＳＣの増殖及び／又は分化を刺激し得る分子の利用可 能性は、治療薬として特に価値が高いであろう。しかし、疑いなく多能性ＨＳＣ 自体の成長を刺激することが知られている因子は存在しない。幹細胞因子と呼ば れるタンパク質は、多能性造血細胞に関連することが同定されているが、この因 子は、生存因子であって、これらの細胞の増殖を刺激することができる因子では ないと信じられている(Caceres-Cortes et al.,J Biol.Chem.,269(1994年)12084 -91頁)。造血幹細胞の増殖及び分化を調節する必要性が存在する。例えば、ある 種の病理学的状態において起こるもののような幹細胞又は前駆細胞の制御されて いない増 殖を阻害することが望ましいであろう。慢性貧血個体、又は貧血個体に移植する ためのＨＳＣの利用可能性を増大させるため、もしくは残りの細胞を効率的に刺 激することが必要なように骨髄細胞の大半が破壊される化学療法を受けている個 体を治療することにおける使用のために、インビトロ又はインビボで多能性ＨＳ Ｃの数を増大させる方法に対する必要性が存在する。 発明の概要 本発明は、血管生成及び造血の少なくとも一方に対して効果を有するように、 未分化の中胚葉由来の細胞の増殖及び／又は分化を調節する新規な方法及び組成 物を提供することにより、上述の必要性を満足する。 本発明の１つの態様においては、造血及び血管生成の少なくとも一方を行うた めに、未分化の中胚葉由来の細胞の集団を刺激するための方法が提供される。こ の方法は、胚の胚体外組織において発現される遺伝子産物と機能的に同等の化合 物を選択する工程、及び造血及び血管生成の少なくとも一方を行うよう細胞を刺 激するように、その化合物の細胞への接近を引き起こす工程を含む。 本発明の別の態様においては、子宮内の胚における血管生成又は造血における 発生エラーを処置する方法であって、胚体外組織において発現される遺伝子産物 と機能的に同等の化合物の有効用量を選択する工程、及び造血及び血管生成の少 なくとも一方を行うよう細胞を刺激するように、インビボでその化合物の胚細胞 集団への接近を引き起こす工程を含む方法が提供される。 本発明の別の態様においては、異常な数のエリスロイド（erythroid）細胞を 経験する個体を処置する方法であって、胚体外組織において発現される遺伝子産 物と機能的に同等の有効用量の化合物を選択する工程、増殖又は分化の少なくと も一方を行う細胞の数を調節するように、有効な時間にわたって、その化合物が 造血幹細胞の集団に接近することを引き起こす工程を含む方法が提供される。 本発明の別の態様においては、中胚葉由来の細胞を含む組織の虚血を経験する 個体を処置する方法であって、胚体外組織において発現される遺伝子産物と機能 的に同等の有効用量の化合物を選択する工程、及び血管生成を刺激するように、 有効な時間にわたって、虚血部位にその化合物を投与する工程を含む方法が提供 される。 本発明の別の態様においては、造血又は血管生成を調節することができる化合 物の活性を決定するためのインビトロアッセイであって、哺乳動物の受精卵由来 の組織から細胞の集団を選択する工程であって、ここで前記細胞の集団は予め決 定したマーカーの欠如により検出可能なように血液形成が欠陥を有するものであ る工程、及びその欠陥を逆転するように細胞の集団に薬剤を添加する工程を含む アッセイが提供される。 本発明の別の態様においては、造血又は血管生成を調節することができる化合 物の活性を決定するためのアッセイであって、マーカー：ε−グロビンハイブリ ッド遺伝子を有する第一のトランスジェニック動物を選択する工程であって、こ のε−グロビン遺伝子は、少なくとも１５．５ｄｐｃまで発現をすることができ る工程、この第一のトランスジェニック動物を、同様にトランスジェニックであ る第二の動物と交配する工程、妊娠期間の最初の３分の１の間に交配から胚を単 離する工程、及びマーカーの発現を測定することにより単離された胚における造 血及び血管生成の刺激に対する化合物の効果を決定する工程を含むアッセイが提 供される。 図面の簡単な説明 本発明の上述の特徴は、添付の図面とともに以下の詳細な説明を参照すること により、さらに容易に理解されるであろう。 図１は、トランスジェニックマウスの作製に用いられた４つの発現カセットを 示す。（ａ）−１７９ｌａｃＺεμＬＣＲ（ＭＢ７０）は、最小ε−グロビンプ ロモーター（ε−ｐｒｏ）を有する基本構築物であり、転写の開始部位（＋１） に関して−１７９まで、及び〜２０ｂｐのε−グロビン５’非翻訳領域（＋１の 下の小さい黒四角として示す）にわたる。ε−ｐｒｏは、Ｋｏｚａｋコンセンサ ス配列及び翻訳開始部位（ＳＤＫ領域）を含むＬａｃＺ発現カセットに連結され ている。ＬａｃＺレポーター遺伝子から下流にあるのは、エキソン２の部分、イ ントロン２（ＩＶＳ２）の全部及びエキソン３の全部を含むε−グロビン遺伝子 の３’領域の部分である。これらの配列は、黒四角（エキソン）及び黒線（イン ト ロン）として示す。３’非翻訳領域（ポリアデニル化部位、ｐＡを含む）は、ス トライプのある線として示す。ＬＣＲの短縮型（μＬＣＲ）は、ε−ｌａｃＺ配 列の下流に位置する。（ｂ）−８４９ｌａｃＺεμＬＣＲ(ＭＢ７３)、（ｃ）ε −ＰＲＥ（II＋Ｖ）ｌａｃＺεμＬＣＲ(ＭＢ７２)、及び（ｄ）−２ｋｂｌａｃ ＺεμＬＣＲ(ＭＢ９２)。（ａ）〜（ｄ）は、ε−ｐｒｏ及びヒトε−グロビン 遺伝子の上流調節領域の異なる部分を含む。（ａ）〜（ｄ）の真核生物配列を、 ＫｐｎＩ及びＮｏｔＩでの消化によりベクターから切り出し、次に、マウス接合 子の雄性前核へのマイクロインジェクションのために精製した。 図２は、始原（primitive）赤芽球における、青色染色の出現と相関するＬａ ｃＺ発現を示す。Ａ：(ａ)は、７．５ｄｐｃ胚の図表であり、（ｂ）は、明視野 顕微鏡により観察した、ＸＧａｌで染色したトランスジェニック胚であり、（ｃ ）は、暗視野顕微鏡で観察した同じ胚である。Ｂ：(ａ)は、非トランスジェニッ クマウスであり、（ｂ）及び（ｃ）は、ＸＧａｌで染色した８．５ｄｐｃでの胚 である。Ｃ：(ａ)は、野生型１２．５ｄｐｃ胚であり、（ｂ）及び（ｃ）は、ト ランスジェニック１２．５ｄｐｃ胚である。（１）野生型；(２)トランスジェニ ック；(３)栄養膜円錐(Ectoplacental Cone)；(４)血島；(５)羊膜腔；(６)栄養 外胚葉；（７）尿膜；(８)胚体外中胚葉；(９)胚プロパー（Proper）(胚盤葉上 層)。 図３は、培養された胚盤胞の卵黄嚢様構造の形成を示す。（ａ）培養前のトラ ンスジェニック胚盤胞、（ｂ）ヘモグロビン含有細胞を明らかにするためにベン ジジンで染色された卵黄嚢様構造(非トランスジェニック)、（ｃ）培養９日後の 、ヘモグロビン含有細胞を明らかにするためにベンジジンで染色された培養され たトランスジェニック胚盤胞からの嚢、（ｄ）ＸＧａｌで染色された正常８．５ ｄｐｃトランスジェニック胚及び卵黄嚢。 図４は、胚盤胞培養のＲＴ−ＰＣＲ解析を示す。（Ａ）比較的平坦な細胞の小 丘であった試料中（「ＦＬＡＴ」）にはないが、嚢様構造（「ＳＡＣ」）に発生した 胚盤胞中ではε−グロビンが観察された。高分子量のバンドは、内部対照アクチ ンである。低分子量バンドは、胚性β−グロビンである。（Ｂ）エリスロイド分 化に対する基質の効果により明らかにされた、環境の合図に応答した培養胚盤胞 。（ｉ）プラスチック上で（コラーゲン上ではなく）胚性β−グロビンを発現し た 中胚葉組織。内皮マーカー（ＰＴＨｒＰ及びＰＴＨｒＰレセプター）は、プラス チック表面及びコラーゲン表面の両方の上で内皮組織中で発現された。 図５は、始原赤血球生成が原腸形成後期に開始することを示す。左側は、後期 ストリーク（線条）(〜７．５ｄｐｃ)胚のホールマウント・インサイチュ解析で あり、右側は、初期ストリーク（〜６．５ｄｐｃ）胚である。紫の染色は、色原 性基質である。ε−グロビンＲＮＡプローブにより、左側に吻の（後部）面に示 すように胚中の血球形成細胞が明らかになるが、右側の胚ではいずれにもなく、 ６．５ｄｐｃ胚においては血液形成が欠如していることを明らかにする。 図６は、ＲＴ−ＰＣＲ解析の手段による、１０．５ｄｐｃ及び１２．５ｄｐｃ での解剖された卵黄嚢中胚葉におけるｐａｔｃｈｅｄ（ｐｔｃ）及びＧｌｉ遺伝 子の差次的発現を示し、解剖された卵黄嚢中胚葉におけるＧｌｉ及びｐｔｃの実 質的に排他的な発現を明らかにする。「ＷＨＯＬＥ」＝解剖されていない卵黄嚢； 「ＭＥＳＯ」＝中胚葉層；「ＥＮＤＯ」＝内胚葉層；「−ｃＤＮＡ」＝ｃＤＮＡ抜き の対照。アクチンを内部対照として役立てた。 図７は、ＸＧａｌ染色により決定したところ、原腸形成中の胚のトランスジェ ニック外植片（６．２５〜６．５ｄｐｃで単離したもの）をフィルター又はガラ ススライド上で７２時間培養した場合、胚性血球形成の誘導は、全胚において起 こるが、胚盤葉上層のみでは欠如していることを示す。構造の視認を容易にする ために、胚盤葉上層の周囲に点線を引いた。（ａ）フィルター上の全胚；(ｂ)フ ィルター上の胚盤葉上層；(ｃ)スライド上の全胚；及び(ｄ)スライド上の胚盤葉 上層。 図７−１は、トランスジェニック胚外植片培養（ｌａｃＺ染色された胚の切片 ）における血液形成を示す。凍結組織切片をＸＧａｌで染色し、（ａ）全胚、（ ｂ）胚盤葉上層、（ｃ、ｄ）後部胚部分、及び（ｅ）ＶＥに隣接するトランスジ ェニック後部胚盤葉上層部分、におけるＬａｃＺ陽性血液形成細胞のクラスター が明らかになっているが、周辺の内臓内胚葉及び未分化の中胚葉においても、非 トランスジェニックＶＥ組織後部／ＶＥ組換え体（ｅ）においてもそうではない 。 図８−１は、内臓内胚葉（ＶＥ）シグナルによる造血の誘導を示す。（ａ）ト ランスジェニック（Ｔｇ）胚盤葉上層を含む組換え体及び内臓内胚葉に隣接する 胚 中に局在するｌａｃＺ染色を示す非Ｔｇ−ＶＥの暗視野写真；(ｂ)パネル（ａ） に対応する模式図。略号：「Ｔｇ」＝トランスジェニック；「Ｖｅ」＝内臓内胚葉； 「ＥｒｙＰ」＝始原エリスロイド細胞。（ｃ）(ａ)に示す組換え体の明視野写真 。 図８−２は、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、全胚中及び胚盤葉上層プラス内臓内胚葉 中における造血の誘導、及び胚盤葉上層のみにはそれがないことを示す。（すべ ての試料は、６．５ｄｐｃで単離した胚のインビトロでの７２時間のインキュベ ーションの後に調製した。）アクチンを内部対照として役立てた。 図９は、組換えヘッジホグ（hedgehog；ヘッジホグ）タンパクが培養胚盤葉上 層において始原造血を刺激するために内臓内胚葉を代替し得ることを示す。単離 された胚盤葉上層を、３種の異なる濃度の組換えヘッジホグタンパクの存在下( ０．２５、１及び５μｇ／ｍｌ)及び不在下（「なし」と記したレーン）で培養し た。始原造血は、ε−グロビン発現についてのＲＴ−ＰＣＲ解析により評価した 。アクチンを内部対照として役立てた。「ＹＳ」＝卵黄嚢対照。 図１０は、ＲＴ−ＰＣＲ解析による、内臓内胚葉における拡散性因子による始 原赤血球形成の活性化を示す。 図１１は、ＲＴ−ＰＣＲ解析による、ＳＨＨブロッキング抗体を用いた培養全 胚における始原赤血球形成の阻害を示す。 図１２は、成体の造血ヒエラルキーの模式図を示す。 図１３は、哺乳類胚の卵黄嚢における細胞系列の派生を示す。円形の構造は、 ３．５ｄｐｃ頃の胚盤胞を表す。 図１４は、マウスの初期発生を示す。初期血島形成の領域は、胚盤葉上層（そ の下は内臓内胚葉で囲まれている）とその上の胚体外胚組織との間の胚体外体腔 （ｆ）中に生じる。 図１５は、前部及び後部部分への胚盤葉上層の分離のための実験スキームを示 す。（Ａ）は、胚体外中胚葉及び胚盤葉上層の周辺のまわりの内臓内胚葉を伴う ６．７５ｄｐｃ胚全体を表す。（Ｂ）は、内臓内胚葉が除去された後の胚を表し 、（Ｃ）は、胚盤葉上層のみを示し、横断面の点線は、前部及び後部セクション を別個に培養する前にいかにして物理的に分けたかを示す。 図１６−１は、ｌａｃＺトランスジェニック胚の前部及び後部部分を原腸形成 の中期及び後期に収穫した場合に、造血中胚葉が後部始原ストリーク（後部中胚 葉）から生じることを示す。パネルＡ：前部胚盤葉上層には染色が検出されない 。パネルＢ：暗青色のＸＧａｌ組織化学染色は、培養後部胚盤葉上層における血 液形成を示す。スケールバーは１ｍｍである。 図１６−２は、内臓内胚葉が、前部胚外胚葉（胚盤葉上層）が造血マーカーを 発現するように再プログラムし得ることを示す。ε−グロビン、β−グロビン、 ＧＡＴＡ−１、及びＣＤ３４マーカーの発現を、前部胚盤葉上層(「前部」：レー ン６〜１０)、後部胚盤葉上層(「後部」：レーン６〜１０)及び内臓内胚葉と組換 えされた前部（「ａ／Ｖｅ組換え体」：レーン１〜５）について示す。対照組織は 、未培養全胚〔ｅｍｂ(−ｃｘ)〕、培養全胚〔ｅｍｂ(＋ｃｘ)〕及び１０．５ｄ ｐｃ卵黄嚢組織であった。対照マーカーは、アクチン及び心臓ミオシンであった 。付加的な対照は、逆転写酵素の不在下でＰＣＲに供したｅｍｂ（＋ｃｘ）であ る。 図１６−３。内臓内胚葉は、前部胚外胚葉（胚盤葉上層）が血管マーカーを発 現するように再プログラムすることができる。ＰＥＣＡＭ−１、ｆｌｋ−１及び アクチンの発現を、前部胚盤葉上層(「前部」：レーン６〜１０)、後部胚盤葉上層 （「後部」：レーン６〜１０）及び内臓内胚葉と組換えされた前部（ａ／Ｖｅ組換 え体：レーン１〜５）について示す。対照組織は、未培養全胚〔ｅｍｂ(−ｃｘ) 〕、培養全胚〔ｅｍｂ(＋ｃｘ)〕及び１０．５ｄｐｃ卵黄嚢組織であった。対照 マーカーは、アクチンであった。 図１７は、ヌル突然変異体の胚性幹細胞（ＥＳ）を用い、培養に復帰組換え体 ＢＭＰ−４を添加したレスキュー実験の結果を示す。（Ａ）及び（Ｃ）は、野生 型マウスから単離された胚性幹細胞から生じた野生型組織胚様体を示す。(Ｂ)に おいては、胚性幹細胞は、ホモ接合体ＢＭＰ−４欠損であり、組織胚様体は、検 出可能な血液形成を欠いている。（Ｄ）においては、ＢＭＰ−４タンパクが（Ｂ ）の組織胚様体に添加され、血液形成が観察される。 発明の詳細な説明 本発明は、胚組織及び成体組織において、選択された発生上の活性、具体的に は造血及び血管生成を特徴とする血液発生を刺激するための方法を、初めて同定 するものである。本方法は、さらに、胚又は成体からの幹細胞及び前駆細胞の増 殖又は分化を調節することができる胚体外組織により分泌される分子を用いる。 本発明の態様は、さらに、造血及び血管生成を刺激することができる化合物を同 定するための新規なアッセイに向けられている。本発明の方法のための支持は、 本明細書に含まれる実施例において提供される。本発明の１つの態様にしたがっ て、胚において及び成体において血液発生を刺激することができ、内臓内胚葉及 び卵黄嚢中胚葉において発現される遺伝子産物と機能的に同等である化合物が同 定されている。このような遺伝子産物は、ヘッジホグ化合物、ＴＧＦ−β、ＴＮ Ｆ、及びＷＮＴ化合物により例示され、ここでは、未分化の中胚葉由来の組織に おいて造血及び血管生成に関して胚体外組織について観察されるものと同様の効 果を達成するとして同定される。本発明の１つの態様においては、ヘッジホグ及 びＴＧＦ−βから選択されるものを含む化合物は、標的細胞に対するそれらの刺 激効果を強化するように相乗的に作用してもよい。 「成体(の)」は、本明細書及び特許請求の範囲において、誕生後の任意の時点 の、動物個体内の又はそれに由来する細胞及び組織の説明として定義される。 「胚性(の)」は、本明細書及び特許請求の範囲において、別に記載がされてい ない限り、誕生前の任意の時点の、動物個体内の又はそれに由来する細胞及び組 織の説明として定義される。 「血液発生」は、本明細書及び特許請求の範囲において、造血及び血管生成と して定義される。 「血管生成」は、本明細書及び特許請求の範囲において、脈管形成（vasculog enesis）及び新脈管形成（angiogenesis）の少なくとも一方として定義され、毛 細血管、動脈、静脈又はリンパ管の形成を含む。 「造血」は、本明細書及び特許請求の範囲において、血液細胞の産生の過程と して定義される。 「造血幹細胞」は、本明細書及び特許請求の範囲において、すべてのクラスの 血液細胞が由来するもととなる多型潜在性前駆細胞として定義される。 「完全（definitive）血液細胞」は、本明細書及び特許請求の範囲において、 胎児又は成体生物の血液細胞として定義される。 「始原（primitive）血液細胞」は、本明細書及び特許請求の範囲において、 胚における血液発生中に形成される一過性の血液細胞の集団として定義される。 「完全内胚葉」は、本明細書及び特許請求の範囲において、腸及び肝臓のよう な成体の内胚葉由来組織に寄与する始原ストリークの細胞から、原腸形成中に派 生する内胚葉として定義される。 「内臓内胚葉」は、本明細書及び特許請求の範囲において、分泌性の胚体外内 胚葉細胞であって、充分に形成された生物のいかなる組織にも直接寄与しないも のとして定義される。 「前駆細胞」は、本明細書及び特許請求の範囲において、分化した細胞タイプ を生じる潜在能力において幹細胞と比較してより制限されている未分化細胞とし て定義される。 「約束された」は、本明細書及び特許請求の範囲において、多能性を保持する かわりに特定の系列に沿って分化するように運命づけられた細胞として定義され る。 「ＲＴ−ＰＣＲ」は、本明細書及び特許請求の範囲において、組織中の遺伝子 の転写の検出を可能にする逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応として定義される。 「相乗効果」は、本明細書及び特許請求の範囲において、２又は３以上の化合 物について、単独のそれらの化合物を用いてはほとんど又は全く効果が観察され ないが、一緒の場合にそれらの化合物が強力な生物学的効果を有することとして 定義される。 「ヘッジホグ化合物」は、本明細書及び特許請求の範囲において、組換えヘッ ジホグタンパク、アナログ、及びヘッジホグタンパクの誘導体、及びヘッジホグ タンパクレセプターのアゴニスト及びアンタゴニスト、ならびに上述のものの機 能的同等物を含むヘッジホグファミリーの分子のクラスとして定義される。 「未分化中胚葉由来細胞」は、本明細書及び特許請求の範囲において、未分化 であるか、又は約束されていない細胞を含み、さらに幹細胞及び前駆細胞を含む ことを意味する。 ＣＦＵ−Ｅは、本明細書及び特許請求の範囲において、赤芽球コロニー形成細 胞（ユニット）として定義され、これは、後期（成熟）エリスロイド前駆細胞で ある。ＣＦＵ−Ｅとして採点されるコロニーは、色素を含む細胞の小さい、密な クラスターであり、培養２〜３日以内に出現する。 ＢＦＵ−Ｅは、本明細書及び特許請求の範囲において、赤芽球コロニー群形成 細胞（ユニット）として定義され、これは、始原エリスロイド細胞である。これ らのコロニーは、色素を含有し、ＣＦＵ−Ｅよりもサイズが大きい。これらの細 胞は、より広範に分散しており、プレーティング後、より遅い時期に出現した。 それらの数は、培養中７日頃が最大である。 ＣＦＵ−ＧＭは、本明細書及び特許請求の範囲において、ミエロイド又は顆粒 球−マクロファージコロニー形成ユニットとして定義される。これらは、外観は ＢＦＵ−Ｅと同様であるが色素を含まない。 ＣＦＵ−Ｓは、本明細書及び特許請求の範囲において、脾臓コロニー形成ユニ ットとして定義される。 造血及び血管生成は、成長中の組織塊が塊の内部の細胞への栄養の供給を確保 するための最初の要件のいくつかである。発生中の胚は、栄養を必要とし、した がって、赤芽球（酸素を運搬する細胞）を形成するための細胞の分化及び血管系 （輸送系）の形成は、発生過程の最初の事象の１つである。胚性組織は、トリ及 び爬虫類の原腸形成において見られるものを思い出させる細胞運動（始原ストリ ークを通じた中胚葉及び完全内胚葉細胞の移動）を行う一方、胚体外細胞は、母 親の子宮内で胎児が生き残ることを可能にする哺乳類組織を作る。これは、母親 の血液供給を刺激して子宮内膜を形成することを含む。胚を栄養芽層に連結する 胚体外中胚葉の狭い連結茎状部は、最終的に臍帯の管を形成する。栄養芽層組織 及び血管含有中胚葉からなる充分に発生した器官は、漿膜と呼ばれる。漿膜と子 宮壁との融合は、胎盤を形成する。妊娠後（ＰＣ）４週までに、ヒト胚は、母親 の循環に隣接する胎児血管を通じた栄養の供給源を有する。 成体においては、血管生成は、損傷した組織の修復中、及びガンを含む種々の 疾患中に起こり、ガンの場合は、腫瘍が正常組織中での血管の出芽を刺激する因 子を放出し、正常組織では新しい血管が腫瘍組織に向けられる。成体に棲む造血 幹細胞（ＨＳＣ）は、胚内部位で生じ得る(Cumano,et al.(1996))。この中胚葉 組織は、完全造血幹細胞及びおそらく脈管構造を生じる細胞の起源の、主要でな いとしても重要な部位であると信じられている。 造血及び血管生成の過程は、部分的にしか理解されていないが、マウスにおけ る発生の経路は、ヒトにおける同等の過程と似ているようである。マウスの造血 系は、６．５ｄｐｃ頃に始原ストリーク段階の胚において形成を始める中胚葉の 胚葉に由来する。血島は、７．５ｄｐｃに胚体外中胚葉に最初に出現し、造血前 駆細胞は、８ｄｐｃで１〜２中胚葉節対内の胚の内臓卵黄嚢中胚葉中に出現する 。８ｄｐｃの中頃に、核を有する始原赤血球細胞が卵黄嚢の脈管構造中に見られ るが、８．５ｄｐｃまでは始原循環系に入らない。８．５〜９ｄｐｃに始まって 、造血前駆細胞は、胚体内の中胚葉由来領域、特に副大動脈内臓葉に見出される (Cumano,et al.(1996))。卵黄嚢を裏打ちしている内臓の中胚葉細胞は、内皮細 胞により裏打ちされている管にくぼむ細胞の帯を形成する。血島の中央の細胞は 、胚性血液細胞に分化する。血島が成長するにしたがって、それらは最終的に合 体して毛細血管ネットワーク及び最終的には新たに形成される心臓につながる卵 黄の管を形成する。 現在まで、脈管形成及び造血においてある役割を果たす８ｄｐｃ頃前の生化学 的事象については、ほとんど知られていない。しかし、本発明者らは、発生のこ の段階が、胚における血液系の成熟及び成体において重要な役割を果たすことを 主張する。本発明の態様にしたがえば、胚の発生における血管生成及び造血の過 程は、内臓内胚葉中の化合物によって影響される。例えば、本発明者らは、ヘッ ジホグタンパクが血液形成を刺激するために未分化の中胚葉由来細胞にインビト ロで作用し、造血及び血管生成経路の非常に初期の段階で胚性組織及び卵黄嚢に 対して作用することを初めて同定した。さらに、本発明にしたがえば、これらの 初期に作用する化合物は、成体動物における造血及び血管生成を調節することに おいて有用性を有する(表１及び２)。本発明の態様にしたがえば、「造血及び血 管生成の少なくとも一方を行うように未分化の中胚葉由来細胞を刺激すること」 は、分化前の造血幹細胞及び前駆細胞の増殖を刺激することを含む(実施例４)。 血液発生及び血管生成を刺激する内臓内胚葉の因子の同定は、新規なアッセイ の使用を通じて本明細書において明らかにされる。これらのアッセイは、以下の ものを含む： （ａ） 血液発生前、その最中及びその後の胚性外植片組織の解析。例えば、 外植片は、哺乳類の発生の最初の段階において形成される胚盤胞から派生しても よい。胚盤胞は、胚が内部細胞塊、栄養外胚葉細胞から形成される外部栄養芽層 細胞層、及び胞胚腔として同定される液体を含有する内腔を形成する６４細胞段 階に達するときに形成される。内部細胞塊（ＩＣＭ）は、胞胚腔中に置かれ、Ｉ ＣＭの外層を形成する「始原内胚葉」及びＩＣＭ自体に分離するようになる。「 始原内胚葉」は、壁及び内臓内胚葉を生じる。内側のＩＣＭ細胞は、始原外胚葉 を形成し、胚プロパー（embryo proper）を生じる。胚盤胞は、血液発生が開始 される前に単離されるが、拍動する心筋のような脈管構造に付随する器官の特徴 的な組織の形成を可能にするような時間、培養中に維持され得る。血液発生は、 発生中の胚の卵黄嚢の内胚葉と中胚葉との間に血島が観察されるときに組織学的 に最初に観察される。理論によって拘束されることなしに、本発明者らは、観察 された島が、未分化の前駆細胞からの赤芽球及び内皮細胞の形成の結果として形 成されることを信じる。実験的なマウスのモデルにおいては、胚性外植片は、血 島の形成が観察される前に２ｄｐｃで、又はその後に、単離してもよく、また、 器官発生が進行中である場合、１４ｄｐｃまでインビトロで維持してもよく、血 液及び脈管系の開始及び進行を追跡するためのモデル系を提供する。本発明によ る血液の形成前の外植片の単離は、従来技術に関して新規であり、従来技術にお いては、血島形成の開始が既に起こった後の血液発生における事象が記載されて いる(Cumano et al.(1996年);Palis et al.,Blood 86(1995年)，160-63頁；Kana tsu et al.,Development 122(1996年),23-30頁)。 （ｂ）マーカー（例えばＬａｃＺ）が造血及び血管生成の開始を合図するのに役 立つように血液形成に付随する初期段階遺伝子（例えばε−グロビン遺伝子）産 物の調節領域をマーカーとカップリングしたトランスジェニック動物からの外植 片の使用(実施例１)。造血又は血管生成の開始は、血液発生に付随する遺伝子産 物の発現の開始及び発現の程度を検出することができるＲＴ−ＰＣＲ；ヘモグロ ビンのベンジジン染色により例示される組織化学染色；適切な特異性の抗体を用 いる免疫組織化学的法；ホールマウントのインサイチュ・ハイブリダイゼーショ ン；放射能標識したリボプローブを用いるインサイチュ・ハイブリダイゼーシ ョン；及び当業界で公知の他の方法のような、高感度の検出方法を用いて検出す ることができる。 以下で、実施例１及び２において４つの異なるアッセイデザインを記載する。 それらは、造血及び血管生成に関与する因子をスクリーニング及び同定するため に、個別的にも、また、組み合わせても、有用性を有する。 （ｉ）胚盤葉上層培養：インタクトな（無傷の）胚外植片を、血島の組織学的 な出現の前に、例えば６．５ｄｐｃで、収穫して、胚が発生を続けるのを可能に し、それによって血液形成の陽性対照として役立つように、標準的な培養技術を 用いて、インタクトな状態でインビトロでインキュベートした(実施例２Ａ−Ｂ) 。これらの状況においては、外植片はインビトロで血島を形成し、血液形成は、 ε−グロビン、(胚性β−グロビン)、ＧＡＴＡ−１、ＣＤ３４、ｓｃａ−１(造 血幹細胞のマーカー)、ＰＥＣＡＭ−１、ｆｌｋ−１、Ｖｅｚｆ−１（内皮マー カー）のような初期血液発生のマーカーの出現を測定することにより、追跡する ことができた。実施例２においては、ε−グロビン遺伝子発現は、ＲＴ−ＰＣＲ を用いて、胚盤葉上層培養のインビトロでの７２時間のインキュベーションの後 、検出された。トランスジェニック動物から外植された胚は、ε−グロビン遺伝 子プロモーター下にＬａｃＺマーカーを有し、同様の時間の後、ＸＧａｌで染色 された。 アッセイは、血島を生成することができず、この無能力が不可逆的である胚外 植片の作製を含む。胚が、最初に内臓内胚葉を除去されたとき、得られる胚盤葉 上層は、外植片培養中でＸＧａｌで陽性に染色されず、したがってε−グロビン を発現していなかった(図７、８)。造血の開始を直接の細胞−細胞接触に依存し ない方式で調節する、拡散性因子が同定された。これらの因子は、胚盤葉上層の 外側で、例えば内臓内胚葉において作られる。これらの因子の生物学的な役割は 、内臓内胚葉及び胚盤葉上層組織を用いる再構成実験により確認された(図８)。 内臓内胚葉中に含まれる因子の要件は、本発明者らが胚盤葉上層を内臓内胚葉細 胞培養から得られるコンディションド（馴化）培地で処理する効果を対照の非処 理胚盤葉上層と比較したときに、さらに明らかにされた(実施例２Ａ)。一方、コ ンディションド培地の不在下では、胚盤葉上層は、ε−グロビンを発現せず、分 泌された細胞因子を含有するコンディションド培地の添加は、胚性組織における ε −グロビンの発現を誘導した(実施例１０)。非トランスジェニックマウス由来の 胚盤葉上層を、ホールマウント・インサイチュ・ハイブリダイゼーション又は免 疫染色法を用いて遺伝子発現について解析した。 （ii）胚盤胞培養：胚性β様：ＬａｃＺグロビン（ε−グロビン：ＬａｃＺ） のような血液形成に付随する遺伝子の調節配列により制御された検出可能なマー カーから形成されたハイブリッド遺伝子を有するトランスジェニックマウス由来 の胚盤胞におけるＸＧａｌの発現を測定した。実施例２（Ｃ）においては、胚盤 胞は、３．５ｄｐｃで単離され、さらに７〜１０日インキュベートされた(図１ ３)。あるいは、胚盤胞培養は、非トランスジェニックマウスを用いて上記のよ うに調製され、遺伝子発現はホールマウント・インサイチュ・ハイブリダイゼー ション又は免疫染色法によって検出された。胚盤胞培養の詳細は、実施例２（Ｃ ）及び図３に記載する。 （iii）改変された胚盤葉上層培養アッセイ：原腸形成後期の胚を収穫し、胚 体外外胚葉を解剖して除くことにより、胚盤葉上層を調製した(実施例２(Ｂ))。 原腸形成中、胚性細胞は、基本的な体の設計及び胚体外中胚葉がそれぞれ胚体外 組織に寄与することを確立する。胚体外の部位に運命づけられた中胚葉細胞は、 後部始原ストリークを出て、７．５ｄｐｃの後期ストリーク段階までに３つの別 個の腔に胚を細分する。中央の腔、すなわち胚体外体腔は、中胚葉細胞で完全に 裏打ちされるようになる。これらの中胚葉細胞は、羊膜を形成するために胚性外 胚葉に、漿膜を形成するために胚体外外胚葉に、そして内臓卵黄嚢（ＶＹＳ）を 形成するために内臓内胚葉に、隣接して存在する。原腸形成の最後に、胚内の細 胞は、３つの胚葉、すなわち外側外胚葉(表皮及び神経系を生じる)；内側外胚葉 (消化管の裏打ち及び（膵臓、肝臓及び脾臓のような）その関連器官を生じる)； 及び中間中胚葉（いくつかの器官(心臓、腎臓、生殖腺)、結合組織（骨、筋、腱 ）及び完全血液細胞を生じる）に分かれる。 後期原腸形成胚からの単一の胚盤葉上層を、前部及び後部の部分に横に切開し 、各部分を個別に数日間培養した(図１４及び１５)。ＲＴ−ＰＣＲ技術を用いて ε−グロビンの発現により決定したところ、前部胚盤葉上層部分がほとんど又は 全く血島を形成しなかったのに対し、後部部分はインタクトな胚盤葉上層に匹敵 す るレベルで血液を形成した。このアッセイを用いて、前部胚盤葉上層に組成物を 添加して、血液形成の刺激を決定することができる。このアッセイにおける対照 は、前部胚盤葉上層が血島を形成することを引き起こすのに充分な内臓内胚葉の 添加である。内臓内胚葉又はヘッジホグタンパクのいずれかを培養に添加した場 合、血液形成が観察された(図１６)。 （iv）標的タンパクに欠陥を有する突然変異体から由来する外植片又は組織胚 様体：組織胚様体は、当業界で周知の技術を用いてインビトロでインキュベート される収穫された胚性幹細胞から形成される(実施例２(Ｃ))。これらの細胞は、 血液細胞及び内皮前駆細胞を含むいくつかの細胞タイプを含む組織胚様体を形成 する(図１７（Ａ、Ｃ）を参照されたい)。胚性幹細胞は、相同組換え及び選択可 能な薬剤耐性のような充分に確立された技術を用いて、その産物が造血及び血管 生成において役割を果たす選択されたマウス遺伝子のターゲティング突然変異誘 発に供してもよく、ターゲティングされた遺伝子突然変異についてホモ接合体の 細胞が得られる。（ｉ）コード遺伝子又は調節配列の「ノックアウト」;(ｉｉ)コ ード遺伝子又は調節配列の「ノックアウト」及び何かが作られることを引き起こ す「ノックイン」配列でのその配列の置換(ノックイン配列は突然変異を有する 配列であってもよい)；又は（ｉｉｉ）ゲノムへの外来ＤＮＡの挿入又は突然変 異を起こす化学物質の使用によるランダム突然変異の生成、といった突然変異を 、誘発させてもよい。これらの突然変異を形成することの結果には、特定の遺伝 子産物の活性を改変すること、及び遺伝子産物の活性を無にすることが含まれ、 さらに遺伝子操作の確立された方法により、別の遺伝子産物である遺伝子産物を 置換することが含まれ得る。 これらのターゲティングされた突然変異がタンパクの遺伝子発現の欠如をもた らす場合、それらの突然変異はヌル突然変異と呼ばれる。野生型胚性幹細胞を用 いて、ヌル突然変異体を作した。本発明にしたがえば、その欠如が血液を作るこ との障害をもたらすように内臓内胚葉に関与するタンパクにおいて欠陥があるヌ ル突然変異体は、胚体外組織に由来するもののようなライブラリーからの新規な 化合物のスクリーニングのための好適なモデル系であり、これらのライブラリー は、コンビナトリアル・ペプチドライブラリー及び組換えＤＮＡライブラリーを 含む。実験的試験の数を減少させるために、プールする戦略を用いることにより 、組織胚様体において造血及び血管生成を調節することにおいて有用な化合物を 同定することができる。 この一般的なタイプのアッセイは、血液形成に対するヘッジホグタンパク（例 えばインディアン・ヘッジホグ）のようなシグナリング因子の欠陥のような他の 突然変異の効果を研究するために用いることができる(実施例３〜５)。例えば、 Ｉｈｈヌル突然変異ＥＳ細胞が形成され得、この突然変異を克服し得る因子が同 定され得る。これらの細胞は、外来性のヘッジホグタンパクを提供することによ り、又は標準的ベクター又はレトロウイルスベクターを用いてヘッジホグ遺伝子 を発現するベクターで細胞をトランスフェクトすることにより、レスキューされ 得る(図９)。突然変異した細胞は、マウスに再導入してキメラを作製することも できる。 これらの検出技術を、以下のようにして、胚盤葉上層及び胚盤胞培養において 造血及び血管生成を検出するために用いた。本発明のアッセイにしたがえば、血 島形成の開始は、以下のものを含む、当業界で利用可能ないずれかの高感度の技 術を用いて検出することができる。 （１） ハイブリッド遺伝子、すなわち胚性β−様：ＬａｃＺグロビン（ε− グロビン：ＬａｃＺ）を有するトランスジェニックマウス由来の外植片における ＸＧａｌの検出。ホモ接合性トランスジェニックマウスの胚を、ＸＧａｌを用い て解析し、エリスロイド細胞の視覚的な検出に先立つ血液発生の指標であるグロ ビン遺伝子転写を明らかにした(図１、２)。 （２） 妊娠後の種々の時点における胚盤葉上層及び胚盤胞中の放射性半定量 的ＲＴ−ＰＣＲプローブを用いるグロビン遺伝子発現の検出。放射性アッセイを 用いる顕著な利点は、個別の外植片から回収される組織の量が非常に少なく、高 感度のアッセイが、単一の培養生成物からの多くの遺伝子の発現についてのアッ セイを可能にすることである(図４)。 上述のアッセイを用いて、本発明者らは、胚体外組織において発現され、血液 形成を刺激し得る遺伝子産物と機能的に同等の多数の化合物を同定した。これら の化合物には、ＴＧＦ−βタンパク、より具体的にはＴＧＦ−β１、より具体的 には骨形態形成タンパク(bone morphogenic protein；ＢＭＰ)、より具体的には ＢＭＰ−４；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）タンパク、より具体的にはＴＮＦ−α；ｗ ｎｔファミリー；及びヘッジホグタンパクが含まれる(図５、９及び１７)。化合 物は、また、上述のものの天然又は合成アゴニスト、アンタゴニスト、アナログ 及び誘導体をも含み得る。これらの因子は、シグナル伝達経路を開始して生物学 的応答をもたらす膜タンパクと相互作用し得る。したがって、上述の化合物に加 えて、それらの、ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、ｐａｔｃｈｅｄ及びｇｌｉのようなヘ ッジホグ結合レセプター及びヘッジホグシグナル伝達経路に関連するレセプター アンタゴニスト、レセプターアゴニスト及びレセプターを含むこれらの膜結合タ ンパクに対するアゴニスト及びアンタゴニストは、造血及び血管生成を調節する ことにおいて有用性を有し得る。 幹細胞増殖の刺激及び分化の調節のための標的部位は、本明細書において、胚 に存在するもののような前分化した中胚葉由来組織と同定された。胚性前分化中 胚葉組織としては、内臓卵黄嚢、尿膜、羊膜、漿膜、栄養外胚葉、及び出生前卵 黄嚢、胎児肝の造血幹細胞、及び臍帯血が挙げられる。成体における前分化中胚 葉由来組織としては、成体骨髄中の造血幹細胞及び前駆細胞、肝臓及び脾臓なら びに胎児及び成体の内皮幹細胞及び前駆細胞が挙げられる。 本発明の新規なアッセイは、以下のものを含む複数の適用において使用するこ とができる： （ｉ） 造血及び血管生成を刺激することにおける活性についての化合物のス クリーニング； （ii） 胚性造血及び血管生成に対する成長因子、サイトカイン、及び他のシ グナリング分子の効果の試験。 （iii） 胚、胎児及び成体における造血及び血管生成に対するヘッジホグタ ンパクの効果の決定。例えば、胚盤胞アッセイを、胚盤胞がトランスジェニック 又は非トランスジェニック動物由来である場合に卵黄嚢のエクスビボでの発生に 対するヘッジホグタンパクの効果を決定するために用いてもよい。 （iv） 通常は血液細胞を産生しないがその中胚葉が卵黄嚢のそれと同じ起源 である尿膜のような他の胚性組織の造血潜在能力の検査。 （ｖ） 脈管構造を概説し、造血ならびに血管生成のトラッキングを可能にす るための、ＸＧａｌのようなマーカーを用いる染色による始原エリスロイド細胞 及び血管構造の発生の追跡。そして、初期胚体内完全造血ならびに始原卵黄嚢造 血を解析するための手段を提供する。 （vi） 個別の外植片に対する、ヘッジホグ、ｐａｔｃｈｅｄ、Ｇｌｉ及び他 のタンパクを発現するトランスジーン（導入遺伝子）を有するものを含む親動物 における造血又は血管生成に影響する遺伝子中のターゲティングされた突然変異 の効果の決定。 （vii） 中胚葉由来組織に対する遺伝子治療の効果の検査。例えば、血島形 成の効果を調節するように、ヘッジホグタンパクの遺伝子を、種々のプロモータ ー下で、内臓内胚葉を破壊したストリーク前の胚に導入する。このタイプの遺伝 子治療モデルは、造血及び血管生成を調節することができる分子を同定するため の実験道具として役立ち得る。造血及び血管生成における形態形成タンパクの新たに確認された役割： ヘッジホグ（ハリネズミ）タンパク：本発明者らは、ここにおいて、ヘッジホ グタンパクが、卵黄嚢中及び胚又は胎児の内臓葉及び他の造血組織中での造血を 刺激でき、且つ、成体骨髄中での造血を刺激できることを初めて示した(実施例 ３〜５、表１−２、図６及び９)。内臓内胚葉中に存在する分子をスクリーニン グすることにより、本発明者らは、ヘッジホグ遺伝子産物を同定した。ヘッジホ グタンパク（ＳＨＨ）を胚盤葉上層培養物に添加し、２〜３日後にＲＮＡを単離 し、ＲＴ−ＰＣＲによって解析した（実施例３、図９）とき、造血が、ε−グロ ビン遺伝子の活性化によって決定したところ、刺激されたと観察された。さらに 、ＳＨＨタンパクは、内臓内胚葉が存在しない胚盤葉上層中で、造血を刺激する ことができた。実施例４及び図１１に記載されているように、ＳＨＨに対する抗 体を全胚に添加したとき、ε−グロビンの発現は実質的に低減された。 上記のアッセイは、胚体外組織で発現されたヘッジホグタンパクも、胚体外組 織で発現されたタンパクと非常に関連深いヘッジホグタンパクも、造血及び脈管 形成を刺激することを示す。シグナリング分子の明確なファミリー（例えば、Ｇ ｏｏｄｒｉｃｈら、Ｇｅｎｅ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐ.、１０巻（１９９６年）３ ０ １〜３１２頁においてレビューされている）であるヘッジホグのファミリーのメ ンバーは、四肢形態発生、神経発生、骨成形機能及び***形成において、ある種 の役割を果たすことが知られている。そのファミリーは、初め、ショウジョウバ エ属の正常体節パターン化に携わるとして同定された(Ｎｕｓｓｌｅｉｎ−Ｖｏ ｌｈａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ、２８７巻(１９８０年)、７９５〜８０１頁)。ヘ ッジホグのファミリーは、デザート・ヘッジホグ（ＤＨＨ）タンパク、インディ アン・ヘッジホグ（ＩＨＨ）タンパク、ムーンラット・ヘッジホグ（ゼブラフィ ッシュ）及びティギー・ウィンクル・ヘッジホグ（ゼブラフィッシュ）を含む。 本発明が理論によって限定されることは意図していないが、本発明者らは、内 臓内胚葉中でのＩＨＨの初めの発現が、卵黄嚢中胚葉中におけるその後のＤＨＨ の活性化をもたらし得ること、及び、ＤＨＨが、卵黄嚢の胚体外中胚葉に自己分 泌（オートクライン）で作用し得ることを示唆する。このようにして、６．５ｄ ｐｃにおいて内臓内胚葉を取り去った胚盤葉上層は、ＤＨＨのシグナリングに作 用するＩＨＨの存在下において、７．５ｄｐｃにおいて血島を製造し得る。一旦 、このようにしてＤＨＨのシグナリングが開始されると、ＩＨＨは、もはやまっ たく必要とはされ得ない。本発明者らは、ＩＨＨノックアウトもしくはＤＨＨノ ックアウトの単独での又は両者一緒での影響を観察した。本発明者らは、ＤＨＨ ノックアウトが血島の形成を妨害しないことに注目し、ＤＨＨ不存在下において 、ＩＨＨは、血液発生に対する連続する刺激効果を有すると結論づけている。本 発明者らは、血液細胞及び脈管構造を欠く卵黄嚢表現型をもたらすためには、Ｉ ＨＨとＤＨＨの両者がノックアウトされる必要があるかもしれないことを示唆す る。分子それ自体における見掛け上の機能の相違は、それらの生化学的な相違中 にはそれ程多くは存在しないかもしれず、むしろ、発現部位又は発現のタイミン グにおける相違の結果ということになるのかもしれない。この点についての前例 は、ｅｎｇｒａｉｌｅｄ遺伝子によって提供されている(Ｈａｎｋｓら、Ｓｃｉ ｅｎｃｅ、２６９巻(１９９５年)、６７９〜６８２頁)。上で提供された説は、 ＤＨＨとＩＨＨとの関係について、好ましい説明を与えるが、これらのタンパク 間において観察された関係について、他の説明を排除するということを意味しな い。 造血及び血管生成の刺激におけるヘッジホグタンパクの有用性は、本発明者ら の目的分子（これらの分子を通じてこれらのタンパクが作用する）についての実 験によって、さらに補強される。ｐａｔｃｈｅｄ及びＧｌｉの発現を解析するた めに、ＲＴ−ＰＣＲを用いて(実施例５、図６)、本発明者らは、卵黄嚢中胚葉、 すなわち、その唯一の機能は、血液及び血管内皮細胞を生成することである組織 において、これらのタンパクの実質的に独占的な発現を確認した。 ヘッジホグタンパクが造血を刺激することができるという本発明者らの観察を 支持して、本発明者らは、卵黄嚢中胚葉におけるＧｌｉ及びｐａｔｃｈｅｄの豊 富な発現を確認した。Ｇｌｉは、伝達径路（その径路上でヘッジホグタンパクが 作用する）に関与する転写因子であり、一方、ＰＴＣ（ｐａｔｃｈｅｄ）は、ヘ ッジホグタンパクに結合して、標的細胞において生物学的応答を最終的に引き起 こすシグナル伝達径路を開始させる、膜タンパクである。これらのタンパクの卵 黄嚢中胚葉との関係は、ヘッジホグタンパクが造血を刺激するという観察をさら に支持する。ｐｔｃは、細胞応答への推定された入り口であるから、パッチを結 合することができるヘッジホグのアゴニストは、ヘッジホグと同じ生物学的効果 （すなわち、この場合造血及び血管生成）を誘導することが期待される。 ある種のヘッジホグタンパクは、二次シグナリング分子である中胚葉における ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−４（ＴＧＦ−βファミリーに属するタンパク）と外胚葉 におけるＦｇｆ−４（国際公開ＷＯ９５／１８８５６）の発現の開始に関与する と報告されている。本発明者らは、造血及び血管生成を刺激するために、ヘッジ ホグタンパクが、二次シグナリング分子と相乗的に相互に影響し合うかもしれな いことを初めて確認した(実施例６)。これらのシグナリング分子は、内臓内胚葉 及び／又は卵黄嚢中胚葉と関係していることが見出され得る、ＢＭＰ−２、ＢＭ Ｐ−４、ＢＭＰ−６及びＢＭＰ−７、そしてＷｎｔｓとＦＧＦを含むＴＧＦ−β ファミリーの他のメンバーを包含する。 本発明に係る、組換えヘッジホグタンパク、ヘッジホグタンパクのアナログ、 誘導体及び解離生成物、及びＰＴＣのようなヘッジホグタンパクレセプターのア ゴニスト等の、胚体外組織中で発現される遺伝子産物と機能的に同等である化合 物の活性は、成体造血幹細胞及び成体前駆細胞に作用すると同様に、胎児細胞、 胎児末梢血及び臍帯血を包含する異なる齢の胚に由来する細胞又は組織にも作用 することにより、造血及び血管生成を刺激し得る。本発明は、ヘッジホグタンパ クの機能ペプチドの使用を包含する。上で定義したヘッジホグ化合物のサブクラ スとしての「機能ペプチド」という用語は、全タンパク（国際公開ＷＯ９６／１ ６６６８、参照によりここに組込まれる）と同じ又は同等の生物活性を誘導し得 るヘッジホグタンパクのペプチドフラグメントを包含することが、意味されてい る。本発明は、さらに、ヘッジホグタンパクのホモログ、組換えヘッジホグタン パク、ヘッジホグをコードする核酸、アンチセンス分子、当該分野で公知のウイ ルス・ベクターを含む遺伝子治療での使用のための遺伝子構築物、アゴニスト又 はアンタゴニストとしてのヘッジホグタンパクのコンビナトリアル(無作為配列) 突然変異体、及びヘッジホグタンパクのエピトープに特異的な抗体を含め、ＷＯ ９５／１８８５６（参照によりここに組込まれる）に記載されたヘッジホグ化合 物を包含する。これらの及び他の化合物は、本発明のアッセイにしたがって造血 及び血管生成を調節するために選択され得る。 本発明にしたがうと、これらの因子は、哺乳類（ヒトを含む）を含め、動物に おいて造血及び血管生成を刺激するために使用され得る。同様に、本発明の化合 物に対するアンタゴニストが、血管生成及び造血を阻害するために使用され得る 。これらの因子の治療上の有用性について、以下に論ずる。 本発明者らの新規の胚盤胞アッセイは、卵黄嚢の発生に対するヘッジホグタン パクの影響を決定するために使用され得る。加えて、組織化学マーカーとしてＬ ａｃＺを用いるばかりでなく、ホールマウント・インサイチュ・ハイブリダイゼ ーション又は免疫染色によっても、遺伝子の発現のために、胚盤嚢をアッセイし 得るであろう。造血及び血管生成に対する選択された化合物の影響を研究するためのトランスジ ェニックマウスモデル： トランスジェニックマウスモデルは、発生事象の研究において、有用性を有す る。組織学的マーカー遺伝子がマウスのゲノムに導入されると、マークされた細 胞と関係したパターン化が確立され得る。 先行技術のトランスジェニックマウスは、少なくとも４つの大きな制限を有し ている：(ｉ)導入遺伝子の転写を追跡する能力が、ＲＮａｓｅ防御又はｍＲＮＡ 生成のＳ１ヌクレアーゼアッセイに依存し、且つ、組織試料が、発生の初期段階 において制限的であり得る；(ii)発現の特異性が、単一細胞レベルでは試験され 得ない（リボプローブを用いてのインサイチュ・ハイブリダイゼーションの実施 の不足、しかし、これらの実験は、技術的に困難（ｃｈａｌｌｅｎｇｉｎｇ）で あり且つ高価である)；(iii)釣り合わせているα−グロブリン遺伝子の不存在下 における外来性β−グロブリン遺伝子の不均衡な発現が、重症サラセミアをもた らし易く(Ｈａｎｓｃｏｍｂｅら、Ｇｅｎｅ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐ.、３巻(１９ ８９年)、１５７２〜１５８１頁)、且つ、子宮内での早期の死を通じて、トラン スジェニックの子孫の収量を低下させると考えられる(Ｈａｎｓｃｏｍｂｅら、 １９８９年；Ｐｏｎｄｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ.、２０巻( １９９２年)、５６５５〜５６６０頁)；(iv)トランスジェニックマウスでの、そ の上流調節配列を伴う全グロビン遺伝子及び８．５〜９．５ｄｐｃ後のマウスの 試験の使用が、開始後の血液発生の解析をもたらす。Ｐｏｎｄｅｌら(１９９２ 年)。 本発明者らは、先行技術のトランスジェニックマウスの制限に打ち克つ、血液 発生のモデルを提供するトランスジェニック動物を開発した。本発明者らは、こ こにおいて、選択されたマウスモデル（このモデルにおいては、上記のアッセイ に適合させた外植片を得るために、マーカー遺伝子は、グロビン調節配列の制御 下に置かれている）の使用を採用した。本発明者らは、ε−グロビン遺伝子の主 要部の代わりに、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）レポーター遺伝子が実例で あるマーカーを選択した。したがって、機能的な外来性ヘモグロビンタンパクは 、形成されないであろうし、且つ、導入遺伝子の発現を追跡するために、感度の 高い酵素アッセイが使用できるであろう(実施例１)。ＬａｃＺのようなレポータ ー遺伝子を使用するさらなる利点は、それが、急速で詳細な組織化学的研究（こ の研究においては、発現の特異性を、単一細胞レベルで又は組織溶解物において 定量的に解析し得る）を可能にする点にある。複合組織中で単一細胞の発現を試 験する能力は、早期の胚形成に関与する研究のために、特に有用である。 ＬａｃＺのレポーター遺伝子の替わりのレポーター遺伝子としては、アルカリ ホスファターゼ及び緑色蛍光タンパクとその誘導体が挙げられる。実施例１に従 って形成された胚は、発生の７．５ｄｐｃという早期において、頂点のレベルで ＬａｃＺを発現することができ、それは、１６．５ｄｐｃという後期まで続く。 本発明のマウスモデルでのＬａｃＺの発現は、胎児内副大動脈内臓葉において、 及び大動脈−性巣−中腎（ＡＧＭ）領域（以下を参照のこと）において、確認さ れ得る。それ自体では、それらは、より遅い発生段階における造血の研究に、特 有の形で適合されており、且つ、様々なインビトロ及びインビボでの胚造血につ いての研究において、有用性を有する。したがって、これらの動物は、様々な種 類の外植片又は胚培養物のための遺伝的にマークされたエリスロイド細胞のソー スとして、有用性を有する。 本発明に記載されたトランスジェニックの方法を用い、発生の間の発現のタイ ミングを指示するエンハンサー（そのようなエンハンサーは、任意に誘導可能で ある）及び／又はプロモーターを利用することにより、あるいは、発現の組織特 異性を指示することにより、胚又は成体動物における造血及び血管生成の発現の 調節のために、ＬａｃＺトランスジェニックマウスをモデルとして使用し得る。 その例としては、卵黄嚢に遺伝子の発現と腸の発生を指示するα−フェトタンパ クエンハンサー、心筋に発現を指示する心アクチンエンハンサー、及び造血幹細 胞中でタンパクを発現するためのｓｃａ−Ｉ制御配列(Ｍｉｌｅｓら、Ｄｅｖｅ ｌｏｐｍｅｎｔ、１２４巻（１９９７年）５３７〜５４７頁)、又は内部光受容 体（ｉｎｔｅｒｐｈｏｔｒｅｃｅｐｔｏｒ）レチノイド結合タンパクの網膜特異 的調節エレメント（Ｂｏｂｏｌａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ.、２７０巻(１９ ９５年)、１２８９〜１２９４頁）が挙げられる。他のトランスジェニックマウ ス（そのマウス中では、ヘッジホグ遺伝子ファミリーから選択された配列が、上 記の種類のエンハンサー及び／又はプロモーターの制御の下に置かれ得る）も形 成し得る。さらにまた、トランスジェニックマウス（そのマウス中では、ヘッジ ホグ、又はヘッジホグのアゴニスト又はアンタゴニストが、上記のような異種組 織特異的プロモーター／エンハンサーの制御の下で発現される）を作り出し得る 。他のトランスジェニック動物（その動物中では、ヘッジホグ制御配列（例えば 、Ｓｈｈ又はＤｈｈを発現させるためのＩｈｈ調節配列）が、特定の胚又は成体 組織中で、異種遺伝子コード配列を発現させるために使用される）も作られ得 る。 上記にしたがうトランスジェニックマウスのモデルは、実施例１に記載された 方法によって作られ得る。「ノック−イン」マウスは、胚性幹（ＥＳ）細胞中の 内因性配列の制御の下、ヘッジホグ遺伝子をゲノム中の選択された部位に差し向 けるために、Ｈａｎｋｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６９巻(１９９５年)、６７９〜 ６８２頁の方法を用いて作られ得る。これらの改変されたＥＳ細胞は、その後、 キメラ動物を形成するために、胚盤胞にマイクロインジェクションされ得る(Ｊ ｏｙｎｅｒ、１９９５年)。これらの動物は、標的遺伝子についてヘテロ接合性 であり、且つ、導入された配列を誤って発現するであろう。このようにして、遺 伝子発現のレベル及び発現が生じる部位の制御は達成され得る。そのようなトラ ンスジェニックマウスの例は、Ｉｈｈ配列が外来性のｆｌｋ−１遺伝子座に「ノ ック・イン」されており、ＨＳＣ及び内皮細胞前駆体中での発現を許しているマ ウスである。導入遺伝子（「ノック−イン」遺伝子）は、例えばＬａｃＺ又はＧＦ Ｐとの融合タンパクとして改変され得、都合のよい組織化学的もしくは免疫学的 又は分子での検出を可能にする。 トランスジェニック動物の技術の使用は、次の用途を含む適用のための、マウ スモデル系を提供し得る：胚、胎児及び成体動物における造血及び血管生成の正 常なプロセスでのさらなる事象、及び白血病及び異常な血管生成及び異常な造血 のような血液の疾患を引き起こす事象の確認。これらの事象は、ヘッジホグ化合 物に関して解析され得る。治療での適用 ： 本発明の化合物には、治療での適用が数多く存在する。そのような用途は造血 及び血管生成の調節と関係しており、幹細胞の***増殖及び／又は分化の阻害を もたらす方法と同様に、刺激をもたらす方法を包含する。本発明の化合物の例は 、上で論じた。 本発明の実施態様においては、造血及び血管生成を刺激する方法は、次の(ａ) 、（ｂ）及び（ｃ）を利用し得る： （ａ） 誘導体、アナログ、及び天然に見出されるタンパクの分解生成物を含 むヘッジホグタンパク、タンパクレセプターのアゴニスト又はアンタゴニスト、 そして上記の化合物の機能同等物のような治療化合物。それらの治療化合物は、 胚体外組織の培養物から単離してもよく、組換え技術によって製造してもよく、 又は合成化学によって調製してもよい； （ｂ） 遺伝子治療技術に適したベクターに組込まれた、上記治療化合物のコ ード配列；及び （ｃ） 細胞移植のために上記のコード配列で形質転換された哺乳類細胞。 異常な血液の発生が生じている個体の治療は、本発明のアッセイの一つで同定 された治療薬を、有効投与量において、ある有効時間、上記方法のいずれかによ って個体に投与することにより、達成され得る。あるいは、患者を、その技術分 野で利用可能な技術のいずれかを用い、治療薬のためのコード配列を含むプラス ミド又はウイルスベクターを作ることにより、遺伝子治療の対象としてもよい。 例えば、ヘッジホグ関連化合物のようなある同定されたタンパク（集合的に化合 物と称される）のタンパク、アナログ、誘導体、アンタゴニスト又はレセプター を、ベクターに導入し、そして、そのベクターを、適当な標的組織（ここでは、 この組織は成体又は胚に位置している）に導入し得る。治療薬の発現は、目標と された組織での選択的な発現を保証するために、選択されたエンハンサーによっ て制御し得る。例えば、心臓において所望の化合物を発現させるための心アクチ ンエンハンサー、骨格筋においてその化合物を発現させるためのＭＣＫエンハン サー、造血幹細胞においてヘッジホグ化合物を発現させるためのｓｃａ−Ｉ調節 配列又は網膜においてその化合物を発現させるための内部光受容体レチノイド結 合タンパクの網膜特異的調節エレメントの使用。 異常な血液の発生が生じている個体は、分泌された薬の運搬系として遺伝的に 操作された細胞株を用い、細胞移植の手段によって治療薬を投与することにより 、治療され得る。例えば、自己由来の線維芽細胞のような自己由来の細胞又は免 疫保護バリアー中に含まれている異種細胞は、ヘッジホグ、又はタンパクのアナ ログ、誘導体、アンタゴニスト又は受容体のような選択されたタンパクを分泌す るための標準的な技術により、操作され得る。 本発明の１つの態様においては、造血細胞の系列における欠陥と関連した異常 を治療するために、個体において造血を刺激するための方法が提供される。その ような治療のための標的の例としては、未分化中胚葉由来細胞の、本発明の化合 物へのインビボ又はインビトロでの曝露が含まれる。標的細胞の例としては、骨 髄幹細胞、前駆細胞及び臍帯血細胞が挙げられる。これらの細胞は、個体から単 離してもよく、その後の使用のために細胞銀行に保存し得る。あるいは、それら 細胞は、新たに単離してもよく、培養培地中でインビトロで維持し得る。そのよ うな細胞のその化合物に対する曝露は、高められた細胞の増殖及び／又は分化を もたらし、その刺激された細胞は、移植技術の手段によって、その細胞が得られ たその同じ又は別の個体に移植される。あるいは、未分化中胚葉由来の細胞を、 経口、皮内、皮下、経粘膜、筋肉内又は静脈内の経路を含めて多くの経路のいず れかによって、インビボで胚又は成体中に接近させてもよい。 本発明の方法は、血液の異常に罹患している個体（胚又は成体）を治療するた めに使用され得る。これらは、遺伝子の障害、ガンの放射線及び化学療法のよう な治療の副作用によって生じ得、あるいは、ヒト免疫不全ウイルスのような感染 性因子によって引き起こされる疾患によって生じ得る。そして、これらは、造血 を刺激する方法及び化合物を用いて治療され得る。もしも治療しなかった場合に は、そのような異常の結果は、（赤血球が異常な低レベルであることと関連した ）様々な形態の貧血である。貧血の例としては、再生不良性貧血(特発性型、素 質型、あるいは二次的な型)；骨髄形成異常性貧血；転移又は壊死ガン腫患者に おける貧血；ホジキン病；悪性リンパ腫；慢性肝疾患の貧血；慢性腎疾患の貧血 (腎不全)；内分泌異常の貧血；赤血球形成不全；慢性炎症性疾患による、特発性 又は他の異常に関連した貧血；及び多くの原因の血小板減少症が挙げられる。加 えて、造血の刺激は、白血球減少症（例えば、白血病及びエイズ）の治療におい て有益である。 本発明の１つの態様にしたがうと、遺伝性疾患、慢性変性性疾患、老化、外傷 又は感染性因子によってもたらされる異常な血管形成（血管過多）を治療するた めに、１つの方法が更に提供される。その例には、糖尿病性慢性潰瘍、やけど、 凍傷、発作後の局所貧血（虚血）状態及び移植が包含される。本発明の化合物は 、局所貧血心筋症又は局所貧血肢体における、そして冠状動脈バイパス及び一般 に 外傷治療の促進における、血管再生又は側副血管の形成の誘導のために、成体に おいて使用され得る。例えば、本発明の化合物は、微小血管密度を高め、より急 速な癒合を促進することにより、十二指腸潰瘍の治療において使用され得る。加 えて、本発明の方法は、血管生成における異常によって引き起こされた、（上で 定義されたような）胚における発生の異常を正すために使用され得る。 本発明の一つの態様にしたがうと、赤血球の過生成、例えば、真性赤血球増加 症及び赤白血病又は他の造血に関する悪性疾患、に罹患している個体において、 造血を阻害するための方法が提供される。 同様に、例えば、乳ガンのような様々な固体腫瘍、幼児におけるヘムアンギオ ーマ(hemang oma)、糖尿病に関連する眼の血管新生、雌の生殖器官の出血異常及 び関節炎のある種の型においてみられるように、過剰な血管新生又は新血管形成 に罹患している個体において、血管生成を阻害するための方法が提供される。 上で参照したすべての引用文献は、参照により組込まれる。 実施例実施例１ ： 始原エリスロイド細胞の形成及び造血の検出のためのトランスジェ ニックマウスモデルの形成 早期の胚発生の間に形成された単一エリスロイド細胞は、ε−グロビンの発現 の監視によって確認することができる。本発明者らは、導入遺伝子発現のための 新しいε−グロビン／ＬａｃＺベクターを開発した。本発明者らは、それらのベ クターから、造血及び血管生成に関して、詳細な組織化学的データも、単一細胞 レベルでの発現の特異性のデータをも得た。ε−グロビン／ＬａｃＺ導入遺伝子 は、マウス胚の始原エリスロイド細胞（卵黄嚢及び胎児肝）においてのみ発現さ れるので、これらのマウスは、(主としてエリスロイドの)胚による造血に影響を 与えるかもしれない他の遺伝子を過剰発現又はノックアウトする効果の薬学的な 操作又は試験のための理想的な標的としての役割を果たす。例えば、関心のある 、ある遺伝子を過剰発現しているトランスジェニックマウスを、上記トランスジ ェニック系統の一つと交配してもよく(すべての子孫がＬａｃＺレポーターを有 するようにホモ接合性にされる)、そして、胚の造血への影響をＬａｃＺ染色で 測定 してもよい。Ｗａｓｓｅｒｍａｎら、Ｇｉｕｄｅ ｔｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ(サンディエゴ：アカデミック・ プレス社、１９９３年)；Ｈｅｒｂｏｍｅｌら、Ｃｅｌｌ、３９巻(１９８４年) 、６５３〜６６２頁に記載された方法を用い、組織溶解物中の発現の定量分析を 行った。あるいは、ターゲティングされた突然変異（ヌル突然変異又は他のより 複雑な突然変異）を有するマウスを、本発明者らのトランスジェニックマウスと 交配させることができ、そして、胚の造血に対する突然変異の影響を評価するこ とができる。このインビボのアッセイは、それゆえ、胚の造血に対する遺伝子産 物の影響を評価するための力強い道具である。 本発明者らは、発現を決定するための感度の高い酵素アッセイを提供するため に、その導入遺伝子を、レポーター遺伝子との組み合わせで設計した。すなわち 、本発明者らは、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）レポーター遺伝子を、ヒト 胚性β様ヘモグロビン（ε−グロビン）遺伝子の転写に関連する多数の調節エレ メントの下流において、ベクターに挿入した(図１)。血液細胞の発生を追うため に使用される導入遺伝子構築物の例は、以下に提供される。これらの構築物は、 アッセイの方法の例証であり、アッセイの方法は、これらの構築物のみに限定さ れる必要がなく、他のベクター構築物中で他の導入遺伝子及び他のレポーター遺 伝子を利用できる。導入遺伝子の説明 ： 「ミクロ−ＬＣＲ」(β−グロビン遺伝子座のずっと上流に位置する制御配列 の先端を切った短縮型、Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒら、１９８９年参照)に、最小ε− グロビン・プロモーター単独を加えたもの(構築物１)；「ミクロ−ＬＣＲ」に、− ８４９までの上流調節領域を加えたもの(構築物２)；「ミクロ−ＬＣＲ」に、−２ ０２５までの上流調節領域を加えたもの(構築物３)；「ミクロ−ＬＣＲ」に、組合 わせε−ＰＲＥ＋Ｖによって駆動される最小プロモーターを加えたもの（構築物 ４）(Ｔｒｅｐｉｃｃｈｉｏら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ.、１３巻(１９９ ３年)、７４５７〜７４６８頁）を含む、数種の異なるトランスジェニック構築 物を作った。原核β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）遺伝子を、コザック（Ｋｏ ｚａｋ）コンセンサス配列（Ｒａｖｉｄら）を含む短いオリゴヌクレオチ ド（ＳＤＫ）と一緒に、＋２０と＋４７３との間のＥ−グロブリン配列を削除し て、最小プロモーターとε−グロビン遺伝子の第二のイントロンの部分との間に 挿入した。各構築物について、８〜１０のファウンダー（創始者）が得られた( １４〜２１％のトランスジェネシティ)。導入遺伝子構築物の生成 ： 構築物１： −１７９ｌａｃＺεμＬＣＲ(ＭＢ７０）： これは、「基本カセット」であり、一連のクローニング工程を用いて作った。 先ず、ヒトε−グロビン遺伝子を−８４９から＋１７４６まで含むＣｌａＩ／ ＥｃｏＲＩフラグメント、改変されたμＬＣＲ（Ｔｒｅｐｉｃｃｈｉｏ，Ｗｉｌ ｌｉａｍ Ｌ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌ ｏｇｙ、１３巻、１２号、７４５７〜７４６８頁（１９９３年)）を含む２．５ ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIIIフラグメント、及びＳＰ７３（Ｐｒｏｍｅｇａ ）のＣｌａＩ／ＨｉｎｄIII消化誘導体（ここにおいて、ＸｈｏＩ部位は、Ｘｈ ｏＩ消化、クレノウＤＮＡポリメラーゼとの反応及びその後の平滑末端連結によ って壊してある）の間で、三方連結により、ＭＨＢ１３５を生成した。その後、 ＭＨＢ１３５のＥｃｏＲＶ部位にＫｐｎＩリンカーを挿入し、ＭＨＢ１３５Ｋを 作った。ｐＵＣεｘ（Ｂａｒｏｎら、Ｃｅｌｌ、４６巻(１９８６年)、５９１〜 ６０２頁）に由来する、−１７９から＋２０までの最小ε−グロビン遺伝子プロ モーターを含むＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩフラグメントを、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ消 化ＳＰ７３（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングし、その後、ＫｐｎＩ及びＸ ｈｏＩを用いる消化によって切り出し、ＫｐｎＩ／ＸｈｏＩ消化ＭＨＢ１３５Ｋ の主（バックボーン）フラグメントに連結してＭＢ４２を生産した。 標準的な方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ(Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ ｏｒ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅ ｓｓ)、１９８９年）を用いたＨｉｎｄIII部位でのＮｏｔＩリンカーの挿入によ り、ＭＢ４２を、改変した。この工程は、独特のＮｏｔＩ部位をμＬＣＲの末端 に挿入してＭＢ６０を生じた。 次に、ＭＢ５９を、次のようにして作った。ｐＳＤＫｌａｃＺｐＡ（ＲＥＦ） に由来するおよそ３．１ｋｂのＸｂａＩ／ＰｓｔＩ ＬａｃＺフラグメントを、 ＳＰ７３にサブクローニングし、ＳＰ７３ｌａｃＺを生じた。ｐＵＣεｘから、 ヒトε−グロビン遺伝子の＋４７４から＋１７４６までの３’部分を、ＢａｍＨ Ｉ／ＥｃｏＲＩフラグメントとして切り取り、ＳＰ７３ｌａｃＺの平滑にされた ＢａｍＨＩ部位に平滑末端連結し、ＭＢ５９を生じた。次に、ＭＢ５９のＫｐｎ Ｉ部位を、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼでの処理及び再連結（レレゲーション）に よって壊し、ＭＢ６９を生じた。最後に、ＭＢ６０のＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩ主要 部（バックボーン）を、ＭＢ６９の部分的なＥｃｏＲＩでのそしてその後のＸｈ ｏＩでの消化によって得られた、ＬａｃＺ及びε−グロビン３’配列を含むフラ グメントと連結した。この最終生成物、ＭＢ７０は、基本的構築物、−１７９１ ａｃＺεμＬＣＲであった。 構築物２： −８４９ｌａｃＺεμＬＣＲ(ＭＢ７３)： −８４９から＋２０までのε−グロビン上流領域を、ＭＨＢ１３５からＢｇｌ II／ＸｈｏＩフラグメントとして単離し、ＢｇｌII／ＸｈｏＩ消化ＭＢ７０の主 要部（バックボーン）にサブクローニングし、ＭＢ７３と名付けられた−８４９ ｌａｃＺεμＬＣＲを製造した。 構築物３： −２ｋｂｌａｃＺεμＬＣＲ(ＭＢ９２)： ＫｐｎＩ及びＸｈｏＩを用いた消化により、ＭＢ１６−３から、−２０２５か ら＋２０までのε−グロビン上流領域を含む２ｋｂのフラグメントを切り出し、 Ｋｐｎ／ＸｈｏＩ消化ＭＢ７０−３（−１８１ｌａｃＺεμＬＣＲ、上を見よ） の主（バックボーン）フラグメントに連結し、−２ｋｂｌａｃＺεμＬＣＲ（Ｍ Ｂ９２）を作った。 ＭＢ１６−３を、次のようにして作った。ｐＵＣεｘ（Ｂａｒｏｎ及びＭａｎ ｉａｔｉｓ、１９８６年）から、ＥｃｏＲＩでの消化、クレノウＤＮＡポリメラ ーゼでの平滑末端化、及びその後のＸｈｏＩでの消化により、２ｋｂのε−グロ ビン上流領域を単離した。その後、これを、ＫｐｎＩ／ＸｈｏＩ消化ＭＨＢ１３ ５Ｋ（上を見よ）に連結した。 構築物４： ε−ＰＲＥ（II＋Ｖ）μＬＣＲ(ＭＢ７２)： 参照文献（Ｔｒｅｐｉｃｃｈｉｏら、１９９３年）の図４の構築物６に由来す るＢｇｌII／ＢａｍＨＩフラグメントを、基本構築物ＭＢ７０のＢａｍＨＩ部位 に連結し、このベクターを作った。トランスジェニックマウスの生成 ： 胚へのマイクロインジェクションのために、プラスミドＤＮＡをＫｐｎＩ／Ｎ ｏｔＩ制限酵素で消化し(図１)、真核部分を標準的な方法（Ｈｏｇａｎら、１９ ９４年）を用いて精製した。標準的な方法（Ｈｏｇａｎら、１９９４年）を用い 、胚を、単一細胞段階において、ＤＮＡ試料のマイクロインジェクションを行い 、その後、里親に移植した。トランスジェニックマウスを作るために、異系交配 （アウトブレッド）マウス系（ＣＤ−１）を使用し、胚提供者(ドナー)、繁殖用 雄、偽妊娠雌、精管切除された雄、及び繁殖のための成熟雌の起源としての役割 を果たさせた。サザーン・ブロッティング（多くの異なるプローブを使用して、 再び標準的な方法で）又はＰＣＲ（下を見よ）による尾の生検材料で、遺伝型を 決定した。サザーン・ブロット解析は、転位、重複又は欠失が、導入遺伝子のゲ ノムへの組込みに伴わなかったことを確認するためにも使用した。トランスジェ ニックの雄（ヘテロ接合性トランスジェニックＣＤ−１雄）を得るために、ファ ウンダーを繁殖させ、そのトランスジェニックの雄を、ＬａｃＺ発現解析（図２ を見よ）のための胚又は成体動物を生産するために、正常なＣＤ−１雌と交配し た。その図に示された時期に、妊娠した雌を殺した(膣栓の観察の日の正午を、 交尾後０．５日（ｄｐｃ）とみなした)。胚を切り解剖し、固定し、ＸＧａｌで 染色した。段階ごとのマウス胚での導入遺伝子の発現の解析のために、標準的な 方法(Ｗａｓｓａｒｍａｎ及びＤｅＰａｍｐｈｉｌｉｓ、１９９３年)を用いての 、全標本（ホールマウント）の胚の染色により、酵素のβ−ｇａｌ活性を追跡し た。トランスジェニックマウスの遺伝型決定のためのＰＣＲ条件 ： １０日齢の子犬の足指の切削物（クリップ）から、又は３週齢の子犬の尾の生 検材料から、：ゲノムＤＮＡを調製した。足指の切削物を、プロテアーゼＫ（１ ｍｇ／ｍｌ）を含むＤＮＡ抽出緩衝液（５０ｍＭ トリス−塩酸、ｐＨ８、２０ ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ＳＤＳ）２０μｌに加え、５５℃に て１時間インキュベーションした(但し、初めの３０分間の後にはボルテックス で攪拌した)。その後、試料を２００μｌの水で希釈し、１０分間沸騰させ、２ ０分 間微小遠心分離を行った。ゲノムＤＮＡを、尾の生検材料から標準的な方法（Ｈ ｏｇａｎら、１９９４年）で調製した。０．４μｌのゲノムＤＮＡ（足指又は尾 ）を用い、１×緩衝液Ｇ（ＰＣＲ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒキット、Ｉｎｖｉｔｒｏ ｇｅｎ）及びＩ．Ｕ．Ａｍｐｌｉ−Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍ ｅｒ）を含む５０μｌの反応物中でＰＣＲを行った。３２サイクルの９４℃での 変性(１分)、５５℃でのアニーリング（１分）及び７２℃での伸長（１分）と、 その後の最終的な７２℃で６分間の伸長で増幅を行い、４０８ｂｐの生成物がも たらされた。反応物の一部（１０〜１５μｌ）を、１×トリス−ホウ酸塩−ＥＤ ＴＡ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年）中で、２％アガロースゲル上で解析し た。 増幅プライマーの配列は、 ５’Ｈε： ５'−ＡＴＧ ＧＡＴ ＣＣＡ ＧＣＡ ＣＡＣ ＡＴＴＡ−３'（ Ｈε−グロビンの−１７９〜−１６５に対応） ３'ＬａｃＺ： ５'−ＴＣＧ ＣＣＡ ＴＴＣ ＡＧＧ ＣＴＧ ＣＧ−３'（ ＬａｃＺの＋１５４〜＋１７０に対応） であった。結果 ： ＬａｃＺの発現は、交尾後７．５日（ｄｐｃ）という早期において(すなわち 、卵黄嚢中に血島が初めて見られる頃に)、胚体外体腔のレベルにおいて、期待 された「リング」パターンで検出可能であった(図２Ａ)。８．５ｄｐｃまで、卵 黄嚢の血管溝内に、始原赤芽球の染色が観察された(図２Ｂ)。実際の胚（胚プロ パー）内には、少数のＬａｃ−Ｚ染色始原赤芽球が観察された(図２Ｂ(ｃ))。１ ２．５ｄｐｃ、すなわちマウスのε−グロビン遺伝子の発現が頂点に達するとき まで、卵黄嚢の血管内に、Ｌａｃ−Ｚ染色始原エリスロイド細胞が見られた(図 ２Ｃ)。本発明者らは、これらの細胞がＬａｃＺを発現することを確かめるため に、胚の血液を直接染色した。 ＭＢ７０、ＭＢ７２又はＭＢ７３を有するマウスは、卵黄嚢の始原エリスロイ ド初期赤血球細胞中で、そして１６．５ｄｐｃの胎児肝中でも、ＬａｃＺを発現 した。ＭＢ７０及びＭＢ７３についてトランスジェニックなマウスは、成体組織 中でＬａｃＺを発現しなかった。対照的に、プロモーターの上流において負の調 節エレメントがないと、ＭＢ７２トランスジェニックマウスも、成体エリスロイ ド細胞においてＬａｃＺを発現した。 それゆえ、ＭＢ７２は、成体動物での貧血又は赤血球増加症の薬学的な誘導を 研究するために使用できる。これらのマウスは、成体での他の遺伝子の過剰発現 又はノックアウトの赤血球生成に対する影響を評価するために、他のトランスジ ェニック又はノックアウトマウスと交配することもできる。（適当な突然変異を 有する他のマウスと交配した後）これらのマウスを用いて研究することができる 疾患の例は、鎌状赤血球貧血及びサラセミア（例えば、Ｓｋｏｗ，Ｌ．Ｃ．ら、 Ｃｅｌｌ、３４巻、１０４３〜１０５２頁(１９８３年)；Ｃｉａｖａｔｔａ，Ｄ ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２巻、９２５９ 〜９２６３頁(１９９５年))を包含する。 卵黄嚢での発現に関して、始原エリスロイド細胞は、ＭＢ９２マウスにおいて は、他の３種の構築物のいずれかを有するマウスについて検出されたと同様に、 ＬａｃＺ−陽性であった。実施例２ ：始原胚の中胚葉は自ら造血及び血管生成をすることができないことの 証明；胚外植片培養物はこれらの培養物の中で造血及び血管生成を刺激する因子 を同定するために使用される ヒト胚性β−グロビン上流調節配列のうちの１つに連結されたＬａｃＺレポー ターについてトランスジェニックなマウス（図１）を、ホモ接合性を有するよう に交配した。これらの動物は、導入遺伝子が始原エリスロイド細胞にのみ発現さ れる、マークされた胚の起源として役立つ(図２)。 （Ａ）内臓内胚葉は、始原造血に必要とされる。 胚外植片培養物：実施例１のトランスジェニックマウスに由来する胚を、造血 中胚葉の形成の前に、原腸形成の開始付近の６．２５〜６．５ｄｐｃで単離し、 ８ウェル（ｗｅｌｌ）のスライドのチャンバー（コスター(Ｃｏｓｔａｒ)）又は ２４ウェルプレートのウェル（コスター）で個別に、又は、テラサキ（Ｔｅｒａ ｓａｋｉ）プレート（ヌンク(Ｎｕｎｃ)）の個々のウェル又は４ウェルプレート のウェルで、４８〜７２時間、それぞれ維持した。次に、胚を固定し、標準的な 技法（Ｗａｓｓｅｒｍａｎ、Ｐ．Ｍ．及びＭｅｌｖｉｎ Ｌ．ＤｅＰａｍｐｈｉ ｌｉｓ編、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｄｅ ｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｖｏｌ．２２５、４６１〜４６３頁、１９９３年）を使用 して、ＸＧａｌで染色し、始原赤芽球の生成を監視した。全胚を、ＬａｃＺ−陽 性血島用の血清を含む培地又は化学的に定義された培地（ＣＤＭ）のいずれかで 培養した。ＣＤＭは、ペニシリン(１，０００Ｕ／ｍｌ)、ストレプトマイシン( １，０００μｇ／ｍｌ)、及びヘペス（Ｈｅｐｅｓ）ｐＨ７．４（２０ｍＭ）を 添加した以外は、（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ及びＷｉｌｅｓ、１９９５年）により使 用されたのと同様であった。 胚盤葉上層からの内臓内胚葉の分離：前ストリーク（ｓｔｒｅａｋ）から早期 ストリークの胚を、トリプシン／パンクレアチン（１５秒〜２分）を使用し、標 準的な技術（Ｈｏｇａｎら、１９９４年）を使用して、外胚葉（胚盤葉上層）及 び内臓内胚葉成分に酵素的に分離した(Ｆａｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｓ．Ｍ．ら、Ｍ ｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｖｏｌ．６２、１９７〜 ２１１頁(１９９７年))。この操作の間、組織のクロス・コンタミネーションは 、無視してよいことがわかった(Ｆａｒｒｉｎｇｔｏｎら、１９９７年)。胚盤葉 上層又は全胚をそれぞれ培養した。図２ａは、胚盤胞の内部細胞塊の派生物であ る胚盤葉上層を表し、胚盤胞からＥＳ細胞が派生する。 内臓内胚葉は、中胚葉中における始原造血のために必要とされる。 （ａ）ＬａｃＺ−陽性血島は、全胚培養物中に容易に検出されたが、胚盤葉上層 培養物中では、化学的に定義された培地（ＣＤＭ）又は３０％の熱不活性化され た（５６℃、３０分）胎児ウシ仔ウシ血清（ハイクローン(Ｈｙｃｌｏｎｅ)）を 含むダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）改変イーグルス（Ｅａｇｌｅ’ｓ）培地（ ギブコービー・アール・エル(ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ)）のいずれでも、ＬａｃＺ染 色はほとんど又は全く観察されなかった。これらの結果は、中胚葉は、自ら胚で の造血を行うことはできず、内臓内胚葉と接触すること又は内臓内胚葉から放出 されるシグナルを必要とすることを示す。これに対し、より後の(６．７５〜７ ．５ｄｐｃ)胚から採取される胚盤葉上層は、培養４８時間後に血島を形成する が、これは、おそらく、この段階に存在する中胚葉細胞が、すでに内臓内胚葉に 由来 するシグナルを受信しているためである。 （ｂ）再構築実験：胚盤葉上層をコラーゲンゲル中で内臓内胚葉と再構築させ た（ラット尾コラーゲン・タイプＩ、コラボレーティブ・バイオメディカル・プ ロダクツ(Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃ ｔｓ))。コラーゲンは、製造者の指示にしたがって調製した。１０μｌのコラー ゲンの滴をプラスチックの表面に凝固させ、次に組織をウオッチメーカーズ（ｗ ａｔｃｈｍａｋｅｒ’ｓ）ピンセットを使用して作った小さい窪みに並べ、次に １μｌのコラーゲンで覆い、その場に保持した。あるいは、組織を５μｌのコラ ーゲンの滴の中に丁寧に放出させ、物理的接触を可能にするように並べ、次にコ ラーゲンを凝固させた。１０分後、外植片培養培地（３０％ＦＢＳ(５６℃、３ ０分間で熱不活性化されたもの)、２ｍＭグルタミン、１０ｍＭヘペス（Ｈｅｐ ｅｓ）ｐＨ７．４、６８μＭ α−メチルチオグリセロール、ペニシリン（１， ０００Ｕ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（１，０００μｇ／ｍｌ）を添加した ＤＭＥ）を、ウェル（２４ウェルプレートには０．５ｍｌ、より小さいウェルに はより少ない量）に添加した。胚断片は、引き伸ばされたパスツール・ピペット を使用して操作した。全ての培養物を、３７℃及び５％ＣＯ₂で維持した。培地 は、１日後に交換した。Ｃｈｏｍｅｚｙｎｓｋｉ、Ｐ．ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃ ｈｅｍ.、Ｖｏｌ．１６２、１５６〜１５９頁(１９８７)）の小規模法を使用し て、３日後にＲＮＡを収穫し、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｆａｒｒｉｎｇｔｏｎら、１９９ ７年）により胚グロビン遺伝子発現を分析した。これらの実験により、胚盤葉上 層が内臓内胚葉で再構築された場合にグロビン遺伝子発現の活性化を示すことが 明らかとなり、したがって、原腸形成の間、造血誘導中に内臓内胚葉が必要とさ れることが確立された(図７、図８−１)。 （ｃ）内臓内胚葉細胞中での拡散性因子による始原赤血球生成の活性化：ＥＮ Ｄ−２（Ｍｕｍｍｅｒｙら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１０９(１９８５)、４０２〜４ １０）−内臓内胚葉に由来する細胞系（セルライン）を、１５％胎児ウシ血清（ ＦＢＳ）を含むＤＭＥ中で集密的（コンフルエンス）になるまで増殖させた。細 胞をトリプシン処理し、３０％ＦＢＳを含む５ｍｌのＤＭＥ（ＤＭＥ−３０）中 に再度懸濁し、¹³⁷Ｃｓ源を使用してγ線照射（６０００ｒａｄ）した。細胞を ピ ペッティングして塊を壊し、次に、１０ｃｍの皿に、追加の１５ｍｌのＤＭＥ− ３０を添加した。細胞に、３日間３７℃（５％）ＣＯ₂で培地を馴化させた。培 地を収穫し、残りの細胞を、１０分間１５００ｒｐｍで遠心分離して除去し、次 に、上清を、０．２ｍｍフィルターを使用して滅菌した。得られる馴化（コンデ ィションド）培地（ＣＭ）を、小分して−８０℃で貯蔵した。 胚盤葉上層を、ＣＭあり（＋）又はなし（−）でインキュベートした。ＣＭな しで培養した胚盤葉上層のほとんどは、始原赤血球生成のマーカー（ε−グロビ ン遺伝子）を活性化しなかったが、ＣＭの存在下で培養された胚盤葉上層のほと んどは、この遺伝子を活性化した。これらの結果は、細胞−細胞接触は、内臓内 胚葉による赤血球生成の刺激には必須ではないが、その効果は、１つ以上の拡散 性因子によって媒介されることを示す。図１０中のアスタリスクは、人為的な増 幅産物を示す。 これらの結果は、非処理の全胚について、６／６がグロビンを産生したことを 示す。これに対し、８つの非処理の胚盤葉上層のうち、１つのみが検出可能な発 現を示した。コンディションド培地を添加した場合、８／１０の胚盤葉上層培養 物がグロビンを発現した。マウス発生の間で初めて造血が生じる時の決定 インサイチュハイブリダイゼーション及び組織学 ： ＢＭ パープル（Ｐｕｒｐｌｅ）(ベーリンガー・マンハイム(Ｂｏｅｈｒｉｎ ｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ))を、アルカリ性フォスファターゼ検出の基質として 使用して、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ及びＮｉｅｔｏ（１９９３年）中のようにホール マウント・インサイチュ・ハイブリダイゼーションを実施した。使用するプロー ブは、マウスε−グロビンプローブである。ジゴキシゲニン標識されたリボプロ ーブを、標準的な方法（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ及びＧｒｅｅｎ、Ｐｏｓｔｉｍｐｌ ａｎｔａｔｉｏｎ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａ ｐｐｒｏａｃｈ．Ｅｄ．Ａ．Ｃｏｐｐ．Ｏｘｆｏｒｄ：ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１ ９９０年）を使用して、ＳＰ７３ｍεＲＢと表されるＥｃｏＲＩで線状化したＤ ＮＡテンプレート（鋳型）のＴ７ポリメラーゼ転写により調製した。ＳＰ７３ｍ εＲＢは、マウスε−グロビン遺伝子（Ｂａｒｏｎ及びＭａｎｉａｔｉｓ、１９ ８６年）の＋１８７〜＋４３９のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントの連結に より生成された。このフラグメントは、この遺伝子の第一のイントロンの小さい 領域及び第二のエキソンのほとんどを含む。全胚についての、野生型マウスにお いて造血を検出することのできる時間を決定するためのインサイチュハイブリダ イゼーションの結果を、図５に示す。 造血誘導を測定するために、マルチプレックス（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）ＲＴ− ＰＣＲ技法を使用した。これは、マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲ法が、造血誘導 に関してＸＧａｌ染色よりもより感度が高く、定量的なアッセイだからである。 これは、また、組織中に発現する種々の遺伝子の分析が可能であるため、ＸＧａ ｌ染色よりも用途が広い。この技術のための出発物質は、ＲＮＡである。オリゴ ヌクレオチドプライマーを調製した。プライマーの例を、表１に示す。総ＲＮＡ を、１つの胚の組織（６．２５〜６．５ｄｐｃの試料）からのグアニジン−酸− フェノール抽出（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉら(１９８７年)）により調製した。 総ＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）プライマー（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年） を使用して、標準的な方法で、ＡＭＶ逆転写酵素（ライフ・サイエンス・インク (Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ.)）で逆転写した。マルチプレックスＰ ＣＲは、５ｐｍｏｌのβ−アクチンプライマー(内部標準物質として)、１０〜４ ５ｐｍｏｌのテスト遺伝子プライマー、及び、ポリアクリルアミドゲル電気泳動 の後のオートラジオグラフィーによる、増幅された産物の検出が可能であるよう に、痕跡量の［α−³²Ｐ］−ｄＣＴＰを含む１５μｌの反応液中で行った。ＰＣ Ｒに使用したプライマーを、表１に記載する。注入したｃＤＮＡの量は、β−ア クチンの発現について標準化した。サイクル数及び不飽和増幅を生じるプライマ ー及びテンプレートｃＤＮＡの量は、各場合において経験的に決定した。 胚性β様グロビン（ε）遺伝子発現は、６．５ｄｐｃの胚盤葉上層、又は、６ ．２５〜６．５ｄｐｃで単離された全胚では検出されなかった。培養７２時間後 、ε−グロビン遺伝子は、全胚中で活性化されたが、単離された胚盤葉上層中に は、ほとんど又は全くε−グロビン転写物は検出されなかった（図７及び図８) 。これは、胚での造血は、中胚葉自律的ではないこと、及び、胚性グロビン遺伝 子発現 の誘導は、内臓内胚葉の存在下で生じることを示した。この効果は、胚性グロビ ン遺伝子発現の誘導のための内臓内胚葉に対する要求と一致する。（観察された 効果は、発達がより進んだ段階で胚が収穫された時の単離された胚盤葉上層が、 低量のグロビン遺伝子発現をもたらし得る、同腹での胚の発生中の変動によって もたらされる、ランダムな事象の予想された効果とは、容易に区別することがで きた。） （Ｂ）後段階の原腸形成胚から得られた胚盤葉上層の前部部分の血液形成 個々の後段階原腸形成胚（約６．７５ｄｃｐ）を収穫し、取り囲む内臓内胚葉 を除去した。この段階で、胚盤葉上層はすでに内臓内胚葉シグナルを受信してお り、血液を生成する能力を発達させている。しかし、この能力は、この時点では 、この胚盤葉上層の後部領域に局在しているように思われる。本発明者らは、こ こにおいて、前部部分が、胚体外の内臓内胚葉への依存性を保持することを示し ている。内臓内胚葉は、Ｆａｒｒｉｎｇｔｏｎら（１９９７年）により記載され たように酵素的に除去し、胚体外の外胚葉を切除した。胚盤葉上層（胚外胚葉） を前部部分及び後部部分に横に切開し、３日間別々にインキュベートした。後部 方部分を、Ｄｏｗｎｓら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｖｏｌ．１１８（１９９３ 年）１２５５〜１２６６頁に記載されているように、始原ストリーク（後部の胚 盤葉上層）のような形態学上の目標に基づいて同定した(図１５)。結果を図５及 び図１６−１、図１６−２、図１６−３、及び図１６−４に示し、以下に議論す る。 （ｉ）後段階の原腸形成の間、胚の後部部分は、内臓内胚葉が存在しなくても 、血液を形成することが可能であるが、前部部分では不可能である。 上述のようにＲＴ−ＰＣＲを使用して、胚の前部部分では、ほとんど又は全く ε−グロビン発現が観察されず、又、血液の発達も組織学的に観察されなかった 。これに対し、後部部分は、内臓内胚葉が存在しなくても、インタクトな胚に匹 敵する濃度（対照として示されている）で血液を形成した。対照は、（ｉ）ｃＤ ＮＡテンプレートの不存在下で実施したＰＣＲ反応(−ｃ−ＤＮＡ)、（ｉｉ）逆 転写酵素なしで逆転写カクテルを使用して行ったＲＮＡインキュベーション（ａ ｎｔ(−ＲＴ)、ｐｏｓｔ(−ＲＴ)、Ｆａｒｒｉｎｇｔｏｎら、１９９７年）を含 ん でいた。この実験では、アクチンを１８サイクルで増幅し、グロビンを２３サイ クルで増幅した。 （ii）内臓内胚葉からのシグナルは、原腸形成の後段階での胚の後部部分に血 液を形成する能力を回復させることができる。 （ａ） 後段階の始原ストリーク段階の胚盤葉上層の４つの前部部分及び４つ の後部部分を、各々、内臓内胚葉不存在下で培養した。図２Ａの実験において観 察されたように、これらの原腸形成後段階の胚の後部部分は血液を形成すること ができたが、前部部分は形成できなかった。これに対し、胚盤葉上層の前部部分 を、内臓内胚葉と共にコラーゲンの滴中で培養すると、４試料中２つで血液形成 が再構成された(図中「ｒｅｃｏｍｂｓ」と記されている)。この実験では、アク チンを２１サイクルで増幅し、グロビンを２６サイクルで増幅した。 （ｂ）本発明者らは、以下のようにして、中胚葉による血液形成が内臓内胚葉 からのシグナルを必要とすることを決定した：トランスジェニック（Ｔｇ）胚外 胚葉（胚盤葉上層）を、その内臓内胚葉（ＶＥ）を剥ぎ取り、コラーゲンの滴中 で非トランスジェニックＶＥと再構築した。これらの実験では、造血細胞の可能 性のある唯一の起源は、トランスジェニック胚盤葉上層であり、非ＴｇＶＥでは ない。組織を３〜４日培養し、次にＸＧＡＬで染色してｌａｃＺ発現の領域を同 定した。これらの実験は、血液の形成がＶＥ組織の存在下で再構成されることを 示す。さらに、ＶＥ組織の近辺の領域に血球細胞が局在することは、直接細胞一 細胞接触が必要とされるか、又は、拡散性分子による短い範囲のシグナル伝達が 関与することを示唆した(図８−１)。 （ｃ）本発明者らは、以下のように、内臓内胚葉は胚盤葉上層の胚外胚葉の前 部が造血及び血管内皮マーカーの両方を発現するようにリプログラムできること を決定した：胚盤葉上層の前部部分を、内臓内胚葉と共に再構築し、図１６−２ に示される造血マーカー（ε−グロビン、ＧＡＴＡ−１、ＣＤ−３４）及び図１ ６−３に示される内皮マーカー（ＰＥＣＡＭ−１、ｆｌｋ−１及びＶｅｚｆ−１ ）の両方の活性化を得た。これらのマーカーは、中期〜後段階の原腸形成で単離 された、培養された胚盤葉上層の後部部分中(図１６−２、後部のレーン６〜１ ０、及び図１６−３、後部のレーン６〜１０)、及び培養された全胚中(ｅｍｂ＋ ｃｘ) で強度に発現された。同じ発生段階の内臓内胚葉のみ（図１６−２、前部レーン ６〜１０；図１６−４、前部レーン６〜１０）又は非培養全胚（図１６−２、ｅ ｍｂ(−ｃｘ)；図１６−３、ｅｍｂ(−ｃｘ)）では、これらのマーカーの発現は ほとんど又は全くなかった。これらの実験は、造血及び血管組織が両方とも、内 臓内胚葉シグナルにより誘導され、シグナルが有用であることを示した。特異性 の対照として、心臓組織中で（及び、したがって、より後の発生段階でのみ、７ 〜８ｄｐｃあたりに）発現されると予期される心ミオシン（Ｌｙｏｎｓら、１９ ９０年）は、胚盤葉上層の前部又は後部部分中、又は培養中の初めの３日間の再 構築物中（図１６−２、レーン３〜１７）には検出されないが、１０．５ｄｐｃ の胚対照で検出された(図１６−２、図１６−３)。Ｖｅｒｆ−１（５'）及び（ ３'）プライマーは、約７００ｂｐの産物を生成した。Ｖｅｒｆ−１は、ｄｂ− １と呼ばれるヒトタンパク質と相同性を有するジンクフィンガータンパク質であ り、発生中の血管構造中で発現される。これは、胚盤葉上層の後部部分及び再構 築胚盤葉上層で主に生じるが、胚盤葉上層の前部部分では生じないことが示され た(図１６−３)。 マーカーの発現を同定するために使用されたＰＣＲプライマー （Ｃ）約３．２５〜３．５ｄｐｃで単離された胚盤胞は、未分化中胚葉細胞の造 血及び血管生成を刺激することのできる化合物をスクリーニングするためのモデ ル系を提供する 胚盤胞培養物を調製し、未分化中胚葉に由来する細胞を、造血及び血管生成を 経験するように刺激することに対する化合物の効果を分析するために使用した。 本明細書に記載されている胚盤胞培養系は、例えば卵黄嚢のような通常インビボ で着床後に形成される胚構造の発生をインビトロで追跡するために適するもので ある。外部から添加された成長因子又は発生に関するシグナル分子の効果は、定 義された条件の下で本明細書において分析される。胚盤胞は、野生型のマウス、 トランスジェニックマウス又はノックアウトマウスから得ることができる。ノッ クアウトマウスの胚での造血を、ヘテロ接合性動物の交配により得られたヌル突 然変異胚盤胞を使用して研究した。これらのヌル突然変異胚盤胞は、より優れた 単離の容易性から、インビトロの分化実験（Ｋｅｌｌｅｒ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏ ｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ.、７（１９９５年）８６２〜６９頁）で使用され るヌル突然変異胚性幹（ＥＳ）細胞よりも好ましい。 胚盤胞のアッセイは、約４．５ｄｐｃで母親の子宮内へ胚が着床する前に、マ ウスから胚を回収することによる。ここでは、胚盤胞は、（ａ）実施例１にした がって調製し、ＬａｃＺ染色により分析する、ε−グロビン／ＬａｃＺトランス ジェニックマウス、及び（ｂ）個々の胚盤胞を、多様な遺伝子の発現について、 ＲＴ−ＰＣＲにより分子レベルで分析する、非トランスジェニックマウス又はノ ックアウトマウスから得た。 Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎにより、Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅ ｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒ ｏａｃｈ．Ｏｘｆｏｒｄ：ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９９３年に記載されているよ うに、３．２５〜３．５ｄｐｃで胚盤胞を収穫した。本発明者らは、いくつかの 異なるマウス株からの胚盤胞の培養に成功した。この実施例では、ＣＤ−１マウ スを使用した。培養方法は、Ｃｈｅｎ及びＨｓｕ（Ｃｈｅｎら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍ ａｔ.，７（１９７９年）２３１〜４４頁）の方法に基づいた。しかし、過剰排 卵のメスは使用しなかった。収穫の後、胚盤胞を、鉱油の下、滴（ドロップ）培 養 物中で２〜３回連続した移動（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、４７１〜４７８頁、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８７）により、夾雑する母体の血液細胞がないように洗浄し、 未処理の３５ｍｍのプラスチック組織培養皿又は２４ウェル皿のウェルへ移した 。胚盤胞は、プラスチックに接着し、再編成され、成長した。胚盤胞を、個々に （２４ウェル皿のウェル中）又は２０までの群で(３５ｍｍのプレート又は２４ ウェル皿で)、ＣＭＲＬ−１０培地で初めの４８時間、及び次にＣＭＲＬ−２０ で１０日まで３７℃及び５％ＣＯ₂で培養した。ＣＭＲＬ−１０は、１０％の熱 不活性化された胎児ウシ血清、ペニシリン(２，０００Ｕ／ｍｌ)、ストレプトマ イシン(２，０００μｇ／ｍｌ)、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸、０．１ ｍＭ非必須アミノ酸(ギブコ−ビー・アール・エル(ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ))、及び １０^-4Ｍのβ−メルカプトエタノールを含む、ＣＭＲＬ１０６６培地（ギブコ− ビー・アール・エル）であった。嚢様構造は、初めに培養７日あたりに見られ、 ９〜１０日後では、それらは肉眼で容易に見られる程度に大きくなった(直径０ ．５〜２ｍｍ)。これらの嚢様構造（本明細書において「ブラストサックス(ｂｌ ａｓｔｏｓａｃｓ)」という）は、初期のマウス卵黄嚢によく似ていた。 トランスジェニック・ブラストサックスを、標準的な方法（Ｗａｓｓａｒｍａ ｎ及びＤｅＰａｍｐｈｉｌｉｓ、１９９３年）により、ＬａｃＺ発現についてイ ンサイチュで染色した。ＲＴ−ＰＣＲによる分析のため、個々のブラストサック スを、Ｐ２００ピペットマンを使用してエッペンドルフ・チューブに移し、１０ 分間４℃で微量遠心（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅｄ）した。培地を吸引し、ＲＮＡを組 織のペレットから単離した(Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉら、１９８７年)。一部（２ ５μｌのうち５〜８μｌ）のＲＮＡをｃＤＮＡの合成に使用した(Ｆａｒｒｉｎ ｇｔｏｎら、１９９７年、本明細書に援用する)。０．５〜２μｌのＲＮＡを、 記載のとおり（Ｆａｒｒｉｎｇｔｏｎら、１９９７年）に５０μｌ中でＰＣＲに より増幅した。図４では、試料を３５サイクルの増幅に供し、次に、１０μｌの 反応混合物を、臭化エチジウムを含む２％アガロースゲルを通して電気泳動する ことにより分析した。 アクチン及びマウスＧＡＴＡ−１ ＰＣＲプライマーは、既に記載されている (Ｂａｒｏｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ ｇｙ，ｖｏｌ．１４、(１９９４年)、３１０８〜３１１４頁)。全ての他のプラ イマーは、５５℃のアニーリング温度で使用した。プライマーの大きさは、マウ スε−グロビン、４８７ｂｐ；マウスＮＦ−Ｅ２、２５７ｂＰ；マウスＥＫＬＦ 、１２９ｂｐ；ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプター、２７９ｂｐ；ＰＴＨｒＰ、４２ １ｂｐであった。プライマーの配列は、 であった。 ヘモグロビン化された組織は、これらの「ブラストサックス」中で、ベンジジ ンでの染色の後に同定された(図３ｂ)。ベンジジン染色は、エリスロイド細胞中 のヘモグロビンの存在に対応する。これは、トランスジェニックマウスに由来す る胚の分析により確認された。これらのマウスでは、ＬａｃＺ発現は、始原赤芽 球でのみ観察されたが、他の胚の細胞タイプでは観察されなかった。トランスジ ェニック胚盤胞を、９日間培養し、次にＸ−Ｇａｌで染色した。図３Ｃからわか るように、発生中のブラストサックス中に生成されたエリスロイド細胞は、染色 後にその青色により容易に明らかにされる。野生型のブラストサックス及びトラ ンスジェニック・マーカー株に由来するブラストサックスの両方とも、血管溝( チャンネル)を含むように見え、非常に発達した血管構造を有する後期の卵黄嚢( 図２と比較のこと)よりも初期胚卵黄嚢（図３Ｄ）に似ている。上記の培養方法 は、４０〜８０％の効率でブラストサックスを提供した。 ＲＴ−ＰＣＲを、発生中のブラストサックス中の中胚葉及び内胚葉マーカーの 時間的な発現のパターン、及び、異なる細胞タイプの形成に対する他の成長因子 及び細胞外マトリックス成分の影響を同定するために使用した。図４Ａに示すよ うに、胚性グロビンは、卵黄嚢様構造が形成された時にのみ生成されるが、栄養 外胚葉細胞の不定形な盛り上がりを越えて、胚盤胞がその発生を進行しない場合 には生成されない。 ヌル突然変異体胚を、遺伝子ターゲッティングによりマウス生殖細胞系へ導入 された突然変異の、造血及び血管生成への影響を決定するために分析した。胚盤 胞培養物を、ホモ接合性のヌル突然変異体の子孫を生じるように交配したヘテロ 接合性Ｂｍｐ−４ノックアウト・マウス（Ｗｉｎｎｉｅｒ，Ｇ．ら、Ｇｅｎｅｓ ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｖｏｌ．９、２１０５〜２１１６頁(１９９５年)） から３．５ｄｐｃで収穫した。胚盤胞を、種々の期間（例えば、９日間）培養中 でインキュベートし、その後、個々のブラストサックスを、栄養外胚葉組織を残 してＲＴ−ＰＣＲ分析のために培地プレートから除去した。胚盤胞が由来するト ランスジェニックマウスがホモ接合性であることを確立するために、この組織を 、ジェノタイピング（遺伝子型決定）するために使用した。ホールマウント・イ ンサイチュ・ハイブリダイゼーション及び免疫組織化学もまた、エリスロイド細 胞又は内皮での深刻な欠損を引き起こす突然変異についての仮定の変異体を同定 するために使用した。 ヌル突然変異体「組織胚様体」組織胚様体は、適当な培養条件下で血島を形成 するＥＳ細胞に由来する構造である(Ｋｅｌｌｅｒ(１９９５年))。本発明者らは 、組織胚様体を使用して、Ｂｍｐ−４のようなヌル突然変異体の組織胚様体が、 ほとんど又は全く血液を形成しないこと、及びこの欠損は、外因性の組換えタン パク質（ＢＭＰ−４）を添加することによって更正できることを示すためのアッ セイ系を開発した。この実験に使用するＥＳ細胞は、ＴＬ−１サブラインに由来 した。しかし、以下に記載するこのアッセイの条件は、他のＥＳ細胞サブライン の多くにも有効である。これらは、また、細胞がフィーダー非依存性について選 択されていても、又はフィーダー細胞上で維持されていても(Ｊｏｙｎｅｒ（１ ９９５年）Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒ ｏａｃｈ．(Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ))、有効であり、選択され た遺伝子中の突然変異は、非変異遺伝子により発現された遺伝子産物と機能的に 同等である化合物の添加により更正された。 Ｂｍｐ−４遺伝子の両方の対立遺伝子にヌル突然変異を有するＥＳ細胞を、標 準的な技術（Joyner(1995年)Gene Targeting:A Practical Approach.(New York: IRL Press);Keller、Current Opin.Cell Biol.7、(1995年)862〜869頁;Orkin、C urrent Opin.Cell Biol.7(1995年)870〜877頁;Mortensen、Molec.Cell Biol.12( 1995年)2391〜2395頁)）を使用して形成した。これらの細胞は、約２．５×１０⁵ の細胞数で、５ｍｌのＩＭＤＭ／１５％血清（血漿由来の血清又はＰＤＳと胎 児ウシ血清の１：１混合物のいずれか）を含む６ｃｍの細菌用皿上にプレート培 養した。多くの文献（例えば、Ｋｅｌｌｅｒ(１９９５年)）では、成長因子の異 なるカクテルが必須であると主張しているにもかかわらず、エリスロポエチン又 はＩＬ−３のような外因性の成長因子の添加は、ここでは必要であるとは思われ なかった。２４時間後、ＥＳ細胞は、集塊を形成し、そして、これらを、同じ培 地中に丁寧に再懸濁し、１０％血清を含むＩＭＤＭ中０．８％メチルセルロース に、ＢＭＰ−４（ジェネティクス・インスティテュート（Genetics Institute） からの組換えヒト、２ｎｇ／ｍｌ）あり又はなしで、プレート培養した。図１７ （Ａ）及び（Ｃ）は、低い（Ａ）及び高い（Ｃ）拡大倍率での野生型（親の）Ｔ Ｌ−Ｉ細胞を示す。野生型のＥＳ細胞に由来する組織胚様体の８７％は、１０日 後にヘモグロビン化された(図の上方の表を参照のこと)。これに対し、ヌル突然 変異ＥＳ細胞（Ｂ）に由来する組織胚様体の４％のみしかヘモグロビン化されな かった。ＢＭＰ−４を培養物に添加すると(Ｄ)、組織胚様体の数が約５９％に増 加した。これらの結果から、上述の胚性β−グロビンについての半定量的ＲＴ− ＰＣＲアッセイを使用することを確認した。これらの結果は、造血の阻害は、Ｂ ｍｐ−４遺伝子の突然変異の結果として生じうること、及びこの欠損は、外因性 のＢＭＰ−４タンパク質を添加することにより回復できることを示す。実施例３ ：胚の体外組織中に発現される遺伝子産物と機能的に同等である化合物 （ハッジホグタンパク質により例示される）は、未分化の中胚葉細胞（胚盤葉上 層中胚葉により例示される）の造血及び血管生成を刺激する。 （ａ）ソニック・ヘッジホグ（Sonic hedgehog）を典型的とする、ヘッジホグタ ンパク質が、実施例２（Ａ）の方法を使用して胚盤葉上層内胚葉での造血を刺激 することを証明した(図９)。２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール、及び１ｍＭ ＤＴＴ中の細菌により発現されたア ミノ末端ＳＨＨタンパク質（Ｂｕｍｃｒｏｔら、１９９５年）を、１０ｍｇ／ｍ ｌ胎児ウシ血清アルブミン（ステム・セル・テクノロジー(Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ)）中で１μｇ／μｌになるよう希釈した。ＳＨＨタ ンパク質を、種々の濃度（０．２５μｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌ）で外植片培養培 地へ添加した。１日後に培地を交換し、ＲＮＡ（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ及びＳ ａｃｃｈｉ、１９８７年）をＲＴ−ＰＣＲ分析のために単離した。図９は、ＳＨ Ｈタンパク質が、濃度依存的に内臓内胚葉の代替物となることができることを示 す。 （ｂ）胚の胚体外組織で発現される遺伝子産物と機能的に同等である化合物（ヘ ッジホグ化合物により例示される）は、未分化の中胚葉細胞（成体骨髄細胞によ り例示される）の造血及び血管生成を刺激する。 組換えヘッジホグタンパク質が成体造血幹細胞又は前駆細胞の発生又は分化に 影響するかどうかを決定するために、本発明者らは、インビトロでのクローナル アッセイを実施した。マウス骨髄細胞から単離された単核球を以下のようにメチ ルセルロース中でプレート培養した：骨髄造血前駆細胞アッセイ ： 骨髄を、標準的な方法（Lord、in Haemopoiesis:A Practical Approach、1〜5 3頁、Testa及びＭｏｌｉｎｅｕｘ編、１９９３年出版、Oxford University Pres s）で５〜６週齢の２〜３匹のメスＩＣＲマウスの大腿骨及び脛骨から洗い出し 、２％胎児ウシ血清（ハイクローン(hyClone)）を含むα−培地（ギブコ・ビー ・アール・エル）５ｍｌへ移した。プールされた試料からの単核球を、フィコー ル（Ｆｉｃｏｌｌ、アキュレート・ケミカル社(Accurate Chemical Co.)）のク ッション上で遠心することにより単離し(Ｔｅｓｔａ及びMolineux、1993年)、コ ールター・カウンターを使用して細胞数を決定した。細胞を、イスコブス改変ダ ルベッコス培地（Iscove's Modified Dulbecco's Medium）(ＩＭＤＭ)中に３× １０⁵／ｍｌで再懸濁し、胎児ウシ血清(１０％)、脱イオン化仔ウシ血清アルブ ミン(細胞培養等級のＢＳＡ、１％)、２−メルカプトエタノール（１×１０Ｍ） 及び指示された成長因子及び組換えヘッジホグタンパク質を含むＩＭＤＭ中のメ チルセルロース（フィッシャー・サイエンティフィック(Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ ｅｎｔｉｆｉｃ)、１．２％）の混合物中にプレート培養した。組換えヒトエリ スロポエチン（Ｅｐｏ）は、アムジェン（Ａｍｇｅｎ）から入手し、４０Ｕ／ｍ ｌで使用した。組換えインターロイキン−３（ＩＬ−３）及び顆粒球／マクロフ ァージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、各々５０Ｕ／ｍｌで使用した。メ チルセルロース−単核球混合物の一部（０．３ｍｌ）を、各々、２つの４ウェル 皿（ヌンク）のうち、３つのウェルにプレート培養し、各々の成長条件を試験し た。各皿の４番目のウェルは、湿度を維持するために、ｄＨ₂Ｏを含んでいた。 培養物を、５％ＣＯ₂中３７℃で、約２週間インキュベーションし、示された日 でのコロニー数を記録した。コロニーは、ＣＦＵ−Ｅ、ＢＦＵ−Ｅ、骨髄(ミエ ロイド)、又は混合として記録した。培養物中に含まれる場合、組換えヘッジホ グタンパク質は、１〜５μｇ／ｍｌの間の濃度で添加した。緩衝液のみ（５ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ５．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＤＴＴ） を陽性対照としていくつかの培養物に添加した。各々の培養条件について、デー タは、２つのプレートの各々の、３つのウェル（総計６つのウェル）のカウント ＋／−標準偏差から編集した。 骨髄から単離された単核球を、造血成長因子のみ（エリスロポエチンのみ、又 はＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−３、又はＥｐｏ＋ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−３の組み合わせ ）を含むか、又は、ＳＨＨのヒスチジン・タッグ標識されたアミノ末端ペプチド (ＳＨＨ−ＨＩＳ)、ＳＨＨのアミノ末端ペプチド(ＳＨＨ−Ｎ)、又はＩＨＨのヒ スチジン・タッグ標識されたアミノ末端ペプチドを補充されたメチルセルロース にプレート培養した。成長因子のみ又は成長因子に加えて緩衝液を含む培養物を 、陰性対照として使用した。 ３つの独立した実験において、全てのタイプ（エリスロイド：ＣＦＵ−Ｅ：Ｂ ＦＵ−Ｅ；ミエロイド：ＣＦＵ−ＧＭ）のコロニーの数は、濃度依存的（組換え ヘッジホグタンパク質を１、２．５、５μｇ／ｍｌ、Ｘｕｇで添加した）に−１ ．５〜４倍以上に増加した。ヘッジホグタンパク質が、エリスロイド対ミエロイ ド系列に対して見かけ上選択的でないという観察は、それらが幹又は初期前駆細 胞の発達を刺激するという仮説と一致する。３つのヘッジホグタンパク質は、全 てコロニーの形成を刺激した。これらのデータから、本発明者らは、ＳＨＨ及び Ｉ ＨＨは両方とも、１つ以上の造血成長因子が存在しようとも、インビトロで造血 幹／前駆細胞の増殖、分化、及び／又は生存を促進すると結論づける。 表 １ 組換えＨＨタンパク質による骨髄前駆細胞の刺激^{1 1}全ての培養物は、ＥＰＯ(２Ｕ／ｍｌ)，ＩＬ−３（５０Ｕ／ｍｌ）及びＧＭ− ＣＳＦ（２ｎｇ／ｍｌ）に加えて示された添加物(なし、緩衝液又はＨＨタン パク質)を含んでいた。 ²増加(倍)は、２つの対照(添加物なし又は緩衝液のみ)の値の平均に基づいて計 算された。 表 ２ 組換えＨＨタンパク質による骨髄前駆細胞の刺激^{1 1}エリスロイドのコロニー(ＣＦＵ−Ｅ及びＢＦＵ−Ｅ)は、Ｅｐｏ（２Ｕ／ｍｌ ）に加えて示された添加物(なし、緩衝液又はＨＨタンパク質)を含む培養物で カウントされた。エロイドのコロニー(ＣＦＵ−ＧＭ)は、ＩＬ−３（５０Ｕ／ ｍｌ）及びＧＭ−ＣＳＦ（２ｎｇ／ｍｌ）に加えて示された添加物を含む培養 物でカウントされた。 ²増加(倍)は、２つの対照(添加物なし又は緩衝液のみ)の値の平均に基づいて計 算された。 ³ＨＩＳ−タッグを有するタンパク質は、緩衝液（ｐＨ８．０）に貯蔵された。 タッグを有しないＳＨＨは、緩衝液（ｐＨ５．５）に貯蔵された。 胚体外組織中で発現される遺伝子産物と機能的に同等である化合物の未分化中 胚葉細胞に対する効果を測定するための他の試み ： 多型潜在性及び骨髄再集合性細胞のためのインビボＣＦＵ−Ｓ脾臓コロニーア ッセイを、造血幹／前駆細胞源をマウスに注射することにより実施した。８〜１ ０日後に脾臓に形成された肉眼で見えるコロニーは、幹／前駆細胞の存在を反映 した(Ｔｅｓｔａ及びＭｏｌｉｎｅｕｘ、１９９３年)。上記のようなインビトロ 前駆細胞アッセイの場合と同様、コロニーの成熟度は、コロニーが発達するのに かかった時間を反映し、後に現われるコロニーがより始原的な前駆細胞を表す のに対し、早期に現われるコロニーは、より成熟した前駆細胞を表した。 別の実験では、マウス及びヒト造血組織に由来する幹／前駆細胞集団を、フロ ーサイトメトリー(蛍光活性化細胞分析分離、ＦＡＣＳ)、又は磁性免疫選択(Tes ta及びMolineux、1993年)により濃縮し、その発達を、ヘッジホグタンパク質の 存在下で促進した。これらの得られる集団は、ＣＦＵ−Ｓアッセイ（脾臓コロニ ー形成単位）及び長期骨髄培養を含むインビボアッセイを使用して試験される。 典型的な骨髄培養物は、競合的再集合アッセイ及び連続的骨髄移植研究（Morris onら、1995年a;Morrisonら、1995年ｂ）を含む。実施例４ ：ＳＨＨ阻止抗体を使用した培養された全胚での初期造血の阻害 ２匹の同腹のマウスに由来する全胚を約６．５ｄｐｃで分離し、外因性ＩｇＧ の非存在下（なし）又は精製ＩｇＧ（Ericsonら、Cell 87(1996年)661〜73頁） （４６μｇ／ｍｌ）の存在下でそれぞれ培養した。胚性ε−グロビンの発現を、 半定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により測定した。結果を図１１に示す。アスタリスクは 、人工的に増幅された産物を示す。実験３から予測されるように、ε−グロビン の発現は、ＳＨＨ阻止抗体の存在下で、実質的に減少した。実施例５ ：細胞レセプターｐａｔｃｈｅｄ及びＧｌｉは、造血及び血管生成を刺 激する標的である。 実施例２（ｂ）の方法を使用して、本発明者らは、ｐａｔｃｈｅｄ及びＧｌｉ の遺伝子発現が、実質的に卵黄嚢中胚葉において限定されていることを示した( 図６)。卵黄嚢中胚葉中でのＧｌｉ及びｐａｔｃｈｅｄの豊富な発現は、ヘッジ ホグシグナルの標的として中胚葉を指す。１０．５〜１２．５ｄｐｃ胚からの卵 黄嚢を、内胚葉（ｅ）及び中胚葉（ｍ）画分に分離し、ＲＮＡを、Ｆａｒｒｉｎ ｇｔｏら（１９９７年）により記載されたように調製した。ＲＴ−ＰＣＲ分析は 、以下のプライマーを使用して上記実施例３に記載されたように実施した。 Ｇｌｉ及びｐｔｃ（ｐａｔｃｈｅｄ）については、５５℃のアニーリング温度 及び２３サイクルを、アクチンについては１６サイクルを使用した(内部対照と してアクチンを使用した)。増幅産物は、２５２ｂｐ(Ｇｌｉ)及び４５３ｂｐ（ ｐａｔｃｈｅｄ）であった。Ｇｌｉ及びｐａｔｃｈｅｄの両方の発現は、卵黄嚢 の中胚葉画分に実質的に限定されていることがわかった。実施例６ ：造血（及び血管生成）に対するＴＧＦ−βタンパク質とのヘッジホグ タンパク質の相乗的な効果 上記の実施例３（Ａ）の方法を使用し、本発明者らは、ＲＴ−ＰＣＲを使用し て、インディアン・ヘッジホグ及びＢＭＰ−６の両方が、早期の内臓内胚葉に発 現されることを示した。全胚(６．５ｄｐｃ)、胚盤葉上層、胚盤葉上層とヘッジ ホグタンパク質、胚盤葉上層とＢＭＰ−６タンパク質、及び胚盤葉上層とヘッジ ホグタンパク質とＢＭＰ−６を、７２時間のインキュベーションの後にε−グロ ビン発現の活性化の程度を決定するために試験する。実験は、ＢＭＰ−２、ＢＭ Ｐ−４、及びＢＭＰ−７について繰り返される。本発明者らは、ヘッジホグ及び ＢＭＰ−４の両方が存在すると、いずれかのみのときに比べて強化された効果が 観察されることを予期する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/48 Ａ０１Ｋ 67/027 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ // Ａ０１Ｋ 67/027 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者 ファーリントン、サラー・エム アメリカ合衆国、マサチューセッツ州 02140、ケンブリッジ、フロスト・ストリ ート 18 (72)発明者 ベラウソフ、マリア アメリカ合衆国、マサチューセッツ州 02139、ケンブリッジ、ナンバー３・ウエ スト・ストリート 27

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．未分化の中胚葉由来細胞の集団を、造血及び血管生成の少なくとも一方を経 験するように刺激する方法であって、以下の工程： （a） 胚の胚体外組織において発現される遺伝子産物と機能的に同等の化合 物を選択する工程；及び （b） 上記細胞が造血及び血管生成の少なくとも一方を経験するように、上 記細胞への上記化合物の接近を引き起こす工程 を含む方法。 ２．上記化合物が、分泌タンパクである、請求項１記載の方法。 ３．上記タンパクが、ヘッジホグタンパクである、請求項１記載の方法。 ４．上記化合物が、ヘッジホグタンパク結合レセプターのアゴニストである、請 求項３記載の方法。 ５．ヘッジホグタンパク結合レセプターが、ｐａｔｃｈｅｄである、請求項４記 載の方法。 ６．上記化合物が、Ｇｌｉの強化された発現を引き起こす、請求項１記載の方法 。 ７．ヘッジホグ化合物が、インディアン・ヘッジホグ、デザート・ヘッジホグ及 びソニック・ヘッジホグ化合物からなる群から選択される、請求項３記載の 方法。 ８．上記化合物が、インディアン・ヘッジホグ化合物である、請求項３記載の方 法。 ９．上記化合物が、第一の遺伝子産物に由来する第一の化合物であり、造血及び 血管生成の少なくとも一方の刺激を強化するように、胚体外組織において発 現される第二の遺伝子産物に由来する第二の化合物と相乗的に作用すること ができる、請求項１記載の方法。 10．上記第二の化合物が、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーの機能的同等物であ る、請求項９記載の方法。 11．上記ＴＧＦ−βが、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６及びＢＭＰ−７か らなる群から選択される、請求項９記載の方法。 12．胚体外組織が、内臓内胚葉である、請求項１記載の方法。 13．胚体外組織が、卵黄嚢中胚葉である、請求項１記載の方法。 14．工程（ｂ）が上記化合物を培地中に提供することを含むように、培地中でイ ンビトロで上記細胞集団を維持する工程をさらに含む、請求項１記載の方法 。 15．細胞が、造血幹細胞の集団である、請求項１４記載の方法。 16．造血幹細胞が、臍帯血細胞、胎児抹消血細胞及び胎児肝細胞からなる群から 選択される、請求項１５記載の方法。 17．造血幹細胞が、成体骨髄細胞である、請求項１５記載の方法。 18．細胞が、成人から得られる前駆細胞である、請求項１４記載の方法。 19．細胞が、上記化合物により刺激される場合、血管生成をすることができる成 人からの前駆細胞である、請求項１４記載の方法。 20．細胞が、胚組織を構成する、請求項１４記載の方法。 21．細胞が、胚性外植片培養物を構成する、請求項２０記載の方法。 22．胚性外植片培養物が、胚盤胞である、請求項２１記載の方法。 23．細胞が、動物の骨髄内のインビボ造血幹細胞である、請求項１記載の方法。 24．細胞が、動物内に存在する造血幹細胞であり、かつ、骨髄、臍帯血細胞、胎 児抹消血細胞及び胎児肝細胞の少なくとも１つにおいて見出される造血細胞 の群から選択される、請求項１記載の方法。 25．経口、皮内、皮下、経粘膜、筋内又は静脈内経路のいずれかによって動物に 有効用量の上記化合物を投与することにより、上記化合物の幹細胞への接近 を引き起こすことをさらに含む、請求項２４記載の方法。 26．上記化合物が、骨髄形態形成タンパク（ＢＭＰ）ファミリーからのタンパク と機能的に同等である、請求項２記載の方法。 27．子宮内の胚における血管生成又は造血の発生エラーを処置する方法であって 、以下の工程： （a） 胚体外組織において発現される遺伝子産物と機能的に同等の化合物の 有効用量を選択する工程；及び （b） 胚細胞が造血及び血管生成の少なくとも一方を経験するように、イン ビボで胚細胞の集団への上記化合物の接近を引き起こす工程 を含む方法。 28．上記化合物が、ヘッジホグタンパクレセプターのアゴニストである、請求項 ２７記載の方法。 29．上記化合物が、ヘッジホグタンパクである、請求項２７記載の方法。 30．上記化合物が、胚細胞における造血の刺激を強化するように、胚体外組織に おいて発現される第二の遺伝子産物に由来する第二の化合物と相乗的に作用 することができる第一の化合物である、請求項２７記載の方法。 31．異常な数のエリスロイド細胞を経験している個体を処置する方法であって、 以下の工程： （a） 胚体外組織において発現される遺伝子産物と機能的に同等の化合物の 有効用量を選択する工程；及び （b） 増殖又は造血の少なくとも一方を経験している異常な数の細胞を調節 するように有効な時間にわたって造血幹細胞の集団への上記化合物の接近 を引き起こす工程 を含む方法。 32．上記化合物が、ヘッジホグタンパクレセプターのアゴニストであり、造血幹 細胞が、増殖又は造血の少なくとも一方を経験するように刺激される、請求 項３１記載の方法。 33．上記化合物が、ヘッジホグタンパクである、請求項３２記載の方法。 34．上記化合物が、造血幹細胞の造血の刺激を強化するように、胚体外組織にお いて発現される第二の遺伝子産物に由来する第二の化合物と相乗的に作用す ることができる第一の化合物である、請求項３１記載の方法。 35．上記化合物が、ヘッジホグタンパクのアンタゴニストであり、造血幹細胞が 、増殖又は造血の一方を経験することを阻害される、請求項３１記載の方法 。 36．異常な数のエリスロイド細胞が、個体における貧血を特徴とする異常に少数 のエリスロイド細胞であり、その貧血が、特発性再生不良性貧血、素質型再 生不良性貧血、再生不良性貧血の二次的な型、骨髄形成異常性貧血、ウイル スによる慢性貧血、慢性炎症性疾患による貧血、ガンによる貧血、器官障害 により誘発された慢性貧血、血小板減少症及び薬剤による貧血からなる群か ら選択される、請求項３１記載の方法。 37．異常な数のエリスロイド細胞が、真性赤血球増加症及び赤白血病からなる群 から選択される疾患を引き起こす、請求項３１記載の方法。 38．組織における虚血を経験する個体を処置する方法であって、以下の工程： （a） 胚体外組織において発現される遺伝子産物と機能的に同等の化合物の 有効用量を選択する工程；及び （b） 虚血組織内での血管生成を刺激するように有効な時間にわたって虚血 部位に上記化合物を投与する工程 を含む方法。 39．虚血が、心筋虚血である、請求項３７記載の方法。 40．上記化合物が、ヘッジホグタンパクレセプターのアゴニストである、請求項 ３８記載の方法。 41．上記化合物が、ヘッジホグタンパクである、請求項４０記載の方法。 42．上記化合物が、血管生成の刺激を強化するように、胚体外組織において発現 される第二の遺伝子産物に由来する第二の化合物と相乗的に作用することが できる第一の化合物である、請求項３９記載の方法。 43.個体において異常に強化された血管生成を処置する方法であって、以下の工 程： （a） 胚体外組織において発現される遺伝子産物の活性を阻害することがで きるヘッジホグタンパクの有効用量を選択する工程；及び （b）異常に強化された血管生成を阻害するように有効な時間にわたって個体 に上記化合物を投与する工程 を含む方法。 44．造血又は血管生成を調節することができる化合物の活性を決定するためのイ ンビトロアッセイであって、以下の工程： （a） 哺乳類の受精卵に由来する組織からの細胞の集団であって、上記細胞 の集団は、予め決定されたマーカーの欠如により検出可能なように血液形 成において欠陥を有するものである細胞の集団を選択する工程；及び （b） 上記欠陥を逆転するように上記細胞の集団に薬剤を添加する工程 を含む方法。 45．上記細胞の集団が、胚盤胞である、請求項４４記載の方法。 46．上記細胞の集団が、胚盤葉上層であり、この胚盤葉上層が、内臓内胚葉の欠 如を特徴とし、組織学的染色により検出可能なように血島の出現の前に哺乳 類から単離されたもののである、請求項４４記載の方法。 47．上記細胞の集団が、胚盤葉上層の部分であり、この部分が、前部部分であり 、この胚盤葉上層が、組織学的染色により検出可能なように前部部分の血島 の出現の前に哺乳類から単離されたものである、請求項４４記載の方法。 48．哺乳類が、トランスジェニックマウスである、請求項４７記載の方法。 49．トランスジェニックマウスが、マウスゲノムの改変により作製されている、 請求項４８記載の方法。 50．上記改変が、ＤＮＡ配列のランダム挿入、ＤＮＡ配列のターゲティングされ た挿入、ＤＮＡ配列のターゲティングされた欠失及びＤＮＡ配列のターゲテ ィングされた置換の１つから選択される、請求項４９記載の方法。 51．トランスジェニックマウスが、上記改変に関してホモ接合性である、請求項 ５０記載の方法。 52．造血又は血管生成を調節することができる化合物の活性を決定するためのア ッセイであって、以下の工程： （a） マーカー：ε−グロビンハイブリッド遺伝子であって、ε−グロビン 遺伝子が少なくとも１５．５ｄｐｃまで発現をすることができるものを有 する第一のトランスジェニック動物を選択する工程； （b） 第一のトランスジェニック動物を、同様にトランスジェニックである 第二の動物と交配する工程； （c） 妊娠期間中にこの交配からの胚を単離する工程；及び （d） マーカー発現を測定することによって単離された胚における造血及び 血管生成の刺激に対する化合物の影響を決定する工程 を含むアッセイ。 53．工程（ｄ）に先行するさらなる工程が、胚体外組織から胚性組織を分離する ことを含む、請求項５２記載の方法。 54．マーカーが、ＬａｃＺ、アルカリホスファターゼ、緑色蛍光タンパク及び誘 導体からなる群から選択される組織化学的マーカーである、請求項５２記載 のアッセイ。 55．胚が、マウス胚であり、このマウス胚が、およそ６．０〜１２．０ｄｐｃの 間に単離される、請求項５２記載のアッセイ。 56.胚が、マウス胚であり、このマウス胚が、およそ３．５〜３．７５ｄｐｃの 間に単離される、請求項５２記載のアッセイ。