ES2339724T3 - Procedimiento para modular la hematopoyesis y el crecimiento vascular. - Google Patents
Procedimiento para modular la hematopoyesis y el crecimiento vascular. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2339724T3 ES2339724T3 ES98906314T ES98906314T ES2339724T3 ES 2339724 T3 ES2339724 T3 ES 2339724T3 ES 98906314 T ES98906314 T ES 98906314T ES 98906314 T ES98906314 T ES 98906314T ES 2339724 T3 ES2339724 T3 ES 2339724T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- hedgehog
- compound
- cells
- protein
- hematopoiesis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 74
- 230000006444 vascular growth Effects 0.000 title claims abstract description 68
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 claims abstract description 91
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims abstract description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 151
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 116
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 101
- 102000003693 Hedgehog Proteins Human genes 0.000 claims description 86
- 108090000031 Hedgehog Proteins Proteins 0.000 claims description 86
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 86
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 81
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 81
- 241000289669 Erinaceus europaeus Species 0.000 claims description 63
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 claims description 42
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 40
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 37
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 33
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 28
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 claims description 23
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 claims description 19
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 19
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 19
- 230000002792 vascular Effects 0.000 claims description 19
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 18
- 102000000017 Patched Receptors Human genes 0.000 claims description 16
- 108010069873 Patched Receptors Proteins 0.000 claims description 16
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 15
- 241000051107 Paraechinus aethiopicus Species 0.000 claims description 14
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 claims description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 14
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 13
- 230000000925 erythroid effect Effects 0.000 claims description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 11
- 230000011664 signaling Effects 0.000 claims description 11
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 claims description 10
- 210000000267 erythroid cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims description 10
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 108010049931 Bone Morphogenetic Protein 2 Proteins 0.000 claims description 8
- 102100024506 Bone morphogenetic protein 2 Human genes 0.000 claims description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 8
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 claims description 7
- 108010049974 Bone Morphogenetic Protein 6 Proteins 0.000 claims description 6
- 102100022525 Bone morphogenetic protein 6 Human genes 0.000 claims description 6
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 claims description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 5
- 230000009459 hedgehog signaling Effects 0.000 claims description 5
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 claims description 5
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 5
- 208000032467 Aplastic anaemia Diseases 0.000 claims description 4
- 108010049870 Bone Morphogenetic Protein 7 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100022544 Bone morphogenetic protein 7 Human genes 0.000 claims description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 4
- 101710190237 Protein hedgehog Proteins 0.000 claims description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 4
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 4
- 208000008601 Polycythemia Diseases 0.000 claims description 3
- 230000002547 anomalous effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000035876 healing Effects 0.000 claims description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 208000031637 Erythroblastic Acute Leukemia Diseases 0.000 claims description 2
- 208000036566 Erythroleukaemia Diseases 0.000 claims description 2
- 208000021841 acute erythroid leukemia Diseases 0.000 claims description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 claims description 2
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 claims description 2
- 208000037893 chronic inflammatory disorder Diseases 0.000 claims description 2
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 201000011066 hemangioma Diseases 0.000 claims description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 claims description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 2
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 claims description 2
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 claims description 2
- 108010049955 Bone Morphogenetic Protein 4 Proteins 0.000 claims 2
- 102100024505 Bone morphogenetic protein 4 Human genes 0.000 claims 2
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 claims 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims 2
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 claims 2
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 claims 1
- 206010053159 Organ failure Diseases 0.000 claims 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims 1
- 230000009033 hematopoietic malignancy Effects 0.000 claims 1
- 208000019188 inherited aplastic anemia Diseases 0.000 claims 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 claims 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 claims 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 41
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 abstract description 22
- 210000001654 germ layer Anatomy 0.000 description 85
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 81
- 210000001900 endoderm Anatomy 0.000 description 73
- 230000009278 visceral effect Effects 0.000 description 68
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 64
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 59
- 238000011161 development Methods 0.000 description 54
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 54
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 46
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 44
- 108091005879 Hemoglobin subunit epsilon Proteins 0.000 description 40
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 38
- 102100030826 Hemoglobin subunit epsilon Human genes 0.000 description 34
- 210000001325 yolk sac Anatomy 0.000 description 32
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 29
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 26
- 239000000047 product Substances 0.000 description 26
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 23
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 22
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 22
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 22
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 21
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 21
- 102000018146 globin Human genes 0.000 description 20
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 20
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 20
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 19
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 18
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 17
- 230000007045 gastrulation Effects 0.000 description 17
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 16
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 16
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 15
- 210000002242 embryoid body Anatomy 0.000 description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 14
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 13
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 13
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 13
- 102100021796 Sonic hedgehog protein Human genes 0.000 description 12
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 12
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 11
- 230000010091 embryonic hemopoiesis Effects 0.000 description 11
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 10
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 10
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 10
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 10
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 10
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 10
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 10
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 10
- 210000002996 primitive erythroblast Anatomy 0.000 description 10
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 9
- 210000003013 erythroid precursor cell Anatomy 0.000 description 9
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 9
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 7
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 7
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 7
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 7
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 7
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 7
- 230000010437 erythropoiesis Effects 0.000 description 7
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 7
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 7
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 6
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 5
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 5
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 5
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 5
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 5
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 5
- 210000002960 bfu-e Anatomy 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 5
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 5
- 229940076264 interleukin-3 Drugs 0.000 description 5
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 5
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 5
- 230000004862 vasculogenesis Effects 0.000 description 5
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 4
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 4
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 4
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 102100030852 Run domain Beclin-1-interacting and cysteine-rich domain-containing protein Human genes 0.000 description 4
- 102000016549 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Human genes 0.000 description 4
- 108010053099 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Proteins 0.000 description 4
- HFACYLZERDEVSX-UHFFFAOYSA-N benzidine Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C=C1 HFACYLZERDEVSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 4
- 101150067309 bmp4 gene Proteins 0.000 description 4
- 210000001136 chorion Anatomy 0.000 description 4
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 4
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 4
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 4
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 4
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 4
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 4
- 210000003924 normoblast Anatomy 0.000 description 4
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 4
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- -1 BMP-4 Proteins 0.000 description 3
- 101000583086 Bunodosoma granuliferum Delta-actitoxin-Bgr2b Proteins 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 102100031690 Erythroid transcription factor Human genes 0.000 description 3
- 101710100588 Erythroid transcription factor Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 3
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 3
- 101000635799 Homo sapiens Run domain Beclin-1-interacting and cysteine-rich domain-containing protein Proteins 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 108010069381 Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 3
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 3
- 208000031439 Striae Distensae Diseases 0.000 description 3
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 3
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 210000001736 capillary Anatomy 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 3
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 3
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 3
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 3
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 3
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 3
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 230000003999 primitive hemopoiesis Effects 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 239000000018 receptor agonist Substances 0.000 description 3
- 229940044601 receptor agonist Drugs 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 102000013602 Cardiac Myosins Human genes 0.000 description 2
- 108010051609 Cardiac Myosins Proteins 0.000 description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101001083591 Homo sapiens Hemoglobin subunit epsilon Proteins 0.000 description 2
- 102100022248 Krueppel-like factor 1 Human genes 0.000 description 2
- 102000006461 Parathyroid Hormone Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010058828 Parathyroid Hormone Receptors Proteins 0.000 description 2
- 108700020797 Parathyroid Hormone-Related Proteins 0.000 description 2
- 102000043299 Parathyroid hormone-related Human genes 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 101710146873 Receptor-binding protein Proteins 0.000 description 2
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 241000269370 Xenopus <genus> Species 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 2
- 210000003995 blood forming stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 210000004039 endoderm cell Anatomy 0.000 description 2
- 108010089558 erythroid Kruppel-like factor Proteins 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 2
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 2
- 210000001704 mesoblast Anatomy 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 230000000921 morphogenic effect Effects 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 2
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 2
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 2
- 150000004492 retinoid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- KDELTXNPUXUBMU-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid boric acid Chemical compound OB(O)O.OB(O)O.OB(O)O.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KDELTXNPUXUBMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OCKGFTQIICXDQW-ZEQRLZLVSA-N 5-[(1r)-1-hydroxy-2-[4-[(2r)-2-hydroxy-2-(4-methyl-1-oxo-3h-2-benzofuran-5-yl)ethyl]piperazin-1-yl]ethyl]-4-methyl-3h-2-benzofuran-1-one Chemical compound C1=C2C(=O)OCC2=C(C)C([C@@H](O)CN2CCN(CC2)C[C@H](O)C2=CC=C3C(=O)OCC3=C2C)=C1 OCKGFTQIICXDQW-ZEQRLZLVSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 102100023635 Alpha-fetoprotein Human genes 0.000 description 1
- 208000003120 Angiofibroma Diseases 0.000 description 1
- 206010002961 Aplasia Diseases 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000713838 Avian myeloblastosis virus Species 0.000 description 1
- 101100410162 Caenorhabditis elegans ptc-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000349709 Echinosorex gymnura Species 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101150067056 Epsilon gene Proteins 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 241000027355 Ferocactus setispinus Species 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 101100175482 Glycine max CG-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 1
- 108091005902 Hemoglobin subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 1
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 101000987586 Homo sapiens Eosinophil peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 101000920686 Homo sapiens Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100446513 Mus musculus Fgf4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001046588 Mus musculus Krueppel-like factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100404586 Mus musculus Nfe2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 101800001295 Putative ATP-dependent helicase Proteins 0.000 description 1
- 101800001006 Putative helicase Proteins 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 206010043395 Thalassaemia sickle cell Diseases 0.000 description 1
- 208000002903 Thalassemia Diseases 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 101710185494 Zinc finger protein Proteins 0.000 description 1
- 102100023597 Zinc finger protein 816 Human genes 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011374 additional therapy Methods 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 1
- 210000001691 amnion Anatomy 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000009087 cell motility Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000512 collagen gel Substances 0.000 description 1
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007821 culture assay Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000001446 dark-field microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000005742 definitive hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 208000000718 duodenal ulcer Diseases 0.000 description 1
- 230000005584 early death Effects 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000032692 embryo implantation Effects 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 210000004696 endometrium Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 210000000646 extraembryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000005003 heart tissue Anatomy 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000777 hematopoietic system Anatomy 0.000 description 1
- 208000031169 hemorrhagic disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 102000044890 human EPO Human genes 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 201000002364 leukopenia Diseases 0.000 description 1
- 231100001022 leukopenia Toxicity 0.000 description 1
- 230000023061 limb morphogenesis Effects 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000001365 lymphatic vessel Anatomy 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000010311 mammalian development Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000004088 microvessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000002956 necrotizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000003988 neural development Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000005305 organ development Effects 0.000 description 1
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 description 1
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 230000001936 parietal effect Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 238000000059 patterning Methods 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012207 quantitative assay Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000007420 radioactive assay Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000007261 regionalization Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 230000000250 revascularization Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 208000007056 sickle cell anemia Diseases 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000002023 somite Anatomy 0.000 description 1
- 230000021595 spermatogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 208000001608 teratocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 1
- 238000012250 transgenic expression Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000002993 trophoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000000251 trophoblastic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001573 trophoblastic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 230000006459 vascular development Effects 0.000 description 1
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007879 vasectomy Methods 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000007998 vessel formation Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
- G01N33/5073—Stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0276—Knock-out vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/1875—Bone morphogenic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0641—Erythrocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/069—Vascular Endothelial cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
- G01N33/5041—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects involving analysis of members of signalling pathways
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5094—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for blood cell populations
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/15—Humanized animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0331—Animal model for proliferative diseases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
- A01K2267/0381—Animal model for diseases of the hematopoietic system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/40—Regulators of development
- C12N2501/41—Hedgehog proteins; Cyclopamine (inhibitor)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
- C12N2503/02—Drug screening
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
Abstract
Un procedimiento de estimulación in vitro de una población de células derivadas mesodérmicamente no diferenciadas para que experimenten al menos uno de hematopoyesis o crecimiento vascular, que comprende hacer que un compuesto acceda a las células de modo que estimule a las células para que experimenten al menos uno de hematopoyesis o crecimiento vascular, en el que el compuesto es un compuesto hedgehog seleccionado de una proteína hedgehog, un péptido funcional de una proteína hedgehog, o una secuencia codificante del mismo incorporada en un vector, y en el que dicho compuesto promueve la señalización de hedgehog, con la condición de que las células no sean células embrionarias humanas.
Description
Procedimiento para modular la hematopoyesis y el
crecimiento vascular.
Se proporcionan procedimientos y compuestos
novedosos para modular la hematopoyesis y el crecimiento vascular
in vitro e in vivo.
La vida de un nuevo individuo se inicia por la
fusión de material génico de los dos gametos, el espermatozoide y
el óvulo. Tras varias rondas de división, las células empiezan un
proceso de diferenciación que en última instancia da como resultado
el organismo adulto maduro. El proceso implica muchas etapas
incluyendo un número diverso de factores que actúan en momentos
específicos durante la ruta que conduce a la maduración. La
maduración hasta la forma adulta no termina completamente el
proceso diferenciación. Esto es porque el organismo adulto tiene,
además de células completamente diferenciadas, células madre no
diferenciadas que están disponibles tanto para el reabastecimiento
de células diferenciadas durante el ciclo natural de degeneración y
regeneración; como también para la reparación de tejido dañado.
Ejemplos de células no diferenciadas en el adulto son células madre
de médula ósea (más específicamente células madre hematopoyéticas y
células progenitoras) así como células progenitoras endoteliales.
Las células de esta clase proporcionan un conjunto de herramientas
terapéuticas en la naturaleza para la reparación y reconstitución
de tejido dañado o enfermo en un paciente. El uso de este conjunto
de herramientas terapéuticas por profesionales sanitarios para
tratar pacientes está limitado por la ausencia de procedimientos
para manipular las rutas de diferenciación de estas células y para
preparar o estimular los números existentes de células no
diferenciadas sin provocar diferenciación.
Por tanto, existe una necesidad de descubrir
procedimientos novedosos en los que el suministro de células no
diferenciadas de cualquier individuo particular puede aumentarse,
por ejemplo, estimulando la proliferación de las células sin
inducir diferenciación. También es deseable modular la
diferenciación de células no diferenciadas de una manera
controlada. Las células no diferenciadas que están listas para
diferenciarse cuando se estimulan para que lo hagan ofrecen un
tratamiento a sujetos que padecen enfermedades en las que o bien las
propias células madre se ven reducidas como en quimioterapia que
destruye la médula ósea, o bien como alternativa para enfermedades
en las que se están reduciendo las células diferenciadas a una tasa
superior a la que el organismo puede compensar la pérdida por medio
de la utilización del suministro natural de células madre no
diferenciadas. Por ejemplo, en el SIDA hay una rápida destrucción de
células sanguíneas maduras por el virus de la inmunodeficiencia
humana dando como resultado una disminución espectacular de las
células inmunitarias en el paciente. Existe una necesidad de
identificar los factores que hacen que las células madre proliferen
y que puedan modular la diferenciación de modo que se potencie la
disponibilidad de tales células.
El organismo adulto contiene tanto células madre
endoteliales como células madre hematopoyéticas (HSC). Estas
células son no diferenciadas, pero en las condiciones apropiadas, se
diferencian para formar células sanguíneas y vasos sanguíneos,
respectivamente. Aunque haya amplios estudios sobre el crecimiento
vascular en el adulto, no se sabe si el crecimiento vascular se
limita a la extensión del vaso (angiogénesis) o si también hay un
desarrollo vascular de novo (vasculogénesis). La comprensión
de los factores que regulan el crecimiento vascular no es sólo
importante en la comprensión de cómo inhibir el crecimiento vascular
anómalo como se produce en tumores, artritis reumatoide,
hemiangiomas, angiofibromas, psoriasis y proliferación capilar y
diabetes sino también en la comprensión de cómo reparar los vasos
tras acontecimientos traumáticos incluyendo cirugía, trasplante y
privación de nutrientes a tejidos como se produce en enfermedades
vasculares tales como las enfermedades cardiovasculares o
cerebrovasculares.
En contraposición al crecimiento vascular, la
hematopoyesis es normalmente un proceso continuo a lo largo de toda
la vida de un adulto. Las células sanguíneas se degradan
regularmente y se forman nuevas células dado como resultado una
producción diaria de millones de células sanguíneas maduras.
Numerosas enfermedades resultan de desequilibrios entre la
degradación y la reconstitución de células sanguíneas o de la
generación de números inapropiados de ciertas células sanguíneas.
Un esquema simplificado de diferenciación de células sanguíneas se
proporciona en la figura 12. Este esquema muestra el ruta de
desarrollo de ocho tipos diferentes de células sanguíneas que
pueden derivarse de una célula madre hematopoyética (HSC) y que pasa
por una fase progenitora inmadura. La célula madre hematopoyética
pluripotente da lugar a eritrocitos, neutrófilos, basófilos,
eosinófilos, plaquetas, mastocitos, monocitos, macrófagos
tisulares, osteoclastos y linfocitos T y B a través de varias rutas
diferentes. En el adulto, los eritrocitos se forman cuando la célula
madre pluripotente se diferencia en BFU-E (una
unidad formadora de colonias eritroides en ramillete), que a su vez
forma una CFU-E (unidad formadora de colonias
eritroides). Los órganos que forman células sanguíneas en el adulto
incluyen la médula ósea y en un menor grado, el hígado, mientras
que el bazo es el sitio principal de aclaramiento posterior de
células sanguíneas viejas o anómalas. Aunque la búsqueda de factores
que regulan la hematopoyesis no se ha limitado a los adultos, los
estudios en embriones se han limitado a acontecimientos que se
producen cuando el embrión ya está en una fase relativamente
avanzada de desarrollo.
Con respecto a los acontecimientos celulares en
el embrión, Cumano et al., Lymphoid Potential, Probed
before Circulation in Mouse, Is Restricted to Caudal Intraembryonic
Splanchnopleura, 86 (1996) 907-16, propusieron
que las células madre hematopoyéticas (HSC) que pueblan el adulto
surgen de un sitio embrionario. Las células sanguíneas que se
notifica que son las primeras en surgir en los islotes sanguíneos
en el embrión, parecen originarse a partir de células
hematopoyéticas progenitoras en la esplacnopleura paraaórtica
dentro del embrión en desarrollo. (Cumano et al. (1996). El
desarrollo temprano de un ratón se muestra en la figura 14 y la
región de formación temprana de silotes sanguíneos se identifica en
la periferia de la cavidad extracelómica.
En este momento existen varios factores de
crecimiento que se sabe que estimulan células intermediarias de
fase temprana en diferentes rutas hematopoyéticas. Estas incluyen
los factores de crecimiento hematopoyéticos, eritropoyetina, factor
estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) y
factor estimulante de colonias de
granulocitos-macrófagos (GMCSF). Por ejemplo,
CFU-E responde a eritropoyetina para producir el
primero miembro diferenciado reconocible del linaje de eritrocitos,
el proeritroblasto. Cuando disminuyen los niveles de oxígeno en la
sangre, los niveles de eritropoyetina aumentan, lo que conduce a la
producción de más células sanguíneas rojas. Cuando madura una
célula sanguínea roja, se convierte en un eritroblasto, que
sintetiza una enorme cantidad de hemoglobina y después en un
eritrocito. Los eritrocitos dejan la médula ósea para emprender el
suministro de oxígeno a los tejidos del cuerpo. Aunque los factores
conocidos pueden tener utilidad en el tratamiento de ciertas
neoplasias malignas o deficiencias hematológicas/inmunitarias,
existe una gran necesidad de desarrollar terapias adicionales,
particularmente aquéllas con un rango más amplio de actividades
biológicas que actúan de de manera temprana en la ruta de
diferenciación. La disponibilidad de una molécula que podría
estimular la proliferación y/o diferenciación de HSC de manera
temprana en la ruta de diferenciación sería especialmente valiosa
como agente terapéutico. Sin embargo, no existen factores que se
sepa más allá de toda la duda que estimulan el crecimiento de las
propias HSC pluripotentes. Se ha identificado que una proteína
denominada factor de células madres está asociada con células
hematopoyéticas pluripotentes, pero se cree que este factor es un
factor de supervivencia y no un factor que pueda estimular la
proliferación de estas células (Caceres-Cortes
et al., J. Biol. Chem., 269 (1994),
12084-91). HEMMATI-BRIVANLOU, A
ET AL.: "Ventral mesodermal patterning in Xenopus embryos:
Expression patterns and activities of BMP-2 and
BMP-4" Developmental Genetics, vol. 17, enero de
1995 (1995-01-00), páginas
78-89. El documento XP000578234 da a conocer que
BMP-2 y BMP-4 inducen la expresión
de \alphaT1 globina en hemisferios animales de Xenopus. Se inyectó
ARNm sintético que codifica BMP-2 y
BMP-4 en los hemisferios animales. La \alphaT1
globina es un marcador para eritrocitos. Existe una necesidad de
regular la proliferación y diferenciación de células madre
hematopoyéticas. Por ejemplo, sería deseable inhibir la
proliferación descontrolada de células madre o células progenitoras
como se produce en ciertas afecciones patológicas. Existe una
necesidad de procedimientos para expandir en número de HSC
pluripotentes o bien in vitro o bien in vivo para su
uso en el tratamiento de pacientes con anemia crónica o aquéllos que
se someten a quimioterapia en la que se destruyen la mayoría de sus
células de la médula ósea de modo que es necesario estimular
eficazmente las células restantes o aumentar la disponibilidad de
HSC para su trasplante a un paciente anémico.
Esta Invención satisface la necesidad anterior
proporcionando procedimientos y compuestos novedosos que modulan la
proliferación y/o diferenciación de células derivadas
mesodérmicamente no diferenciadas de modo que tengan un efecto
sobre al menos uno de crecimiento vascular y hematopoyesis.
En una realización de la invención se
proporciona la <reivindicación 1>.
En otra realización de la invención, se
proporciona la <reivindicación 16>.
En otra realización de la invención, el
compuesto hedgehog como se definió anteriormente es para tratar a
un sujeto que adolece de un número anómalo de células
eritroides.
En otra realización de la invención se
proporciona la <reivindicación 38>.
En otra realización de la invención, el
compuesto hedgehog como se definió anteriormente es para tratar a
un sujeto que padece una isquemia en tejidos.
Se proporciona un ensayo in vitro para
determinar la actividad de un compuesto que puede modular la
hematopoyesis o el crecimiento vascular, que incluye las etapas de
seleccionar una población de células de un tejido derivado de un
óvulo fertilizado de un mamífero, en el que la población de células
es deficiente en formación de sangre detectable por la ausencia de
un marcador predeterminado; y añadir un agente a la población de
células de modo que se revierte la deficiencia.
Se proporciona un ensayo para determinar la
actividad de un compuesto que puede modular la hematopoyesis o el
crecimiento vascular, que incluye las etapas de seleccionar un
primer animal transgénico que porta un marcador: gen híbrido de
\varepsilon-globina, en el que el gen de
\varepsilon-globina puede expresarse al menos
hasta 15,5 dpc; aparear el primer animal transgénico con un segundo
animal que es transgénico de manera similar; aislar un embrión del
apareamiento en un momento dentro del primer tercio del periodo de
gestación; y determinar el efecto del compuesto sobre la
estimulación de la hematopoyesis y el crecimiento vascular en el
embrión aislado midiendo la expresión del marcador.
Las características anteriores de la invención
se comprenderán más fácilmente con referencia a la siguiente
descripción detallada tomada con los dibujos adjuntos.
La figura 1 muestra cuatro casetes de expresión
usados para generar ratones transgénicos. (a) -179
lacZ\varepsilon\muLCR (MB70) es el constructo básico con el
promotor mínimo de \varepsilon-globina
(\varepsilon-pro), que se extiende hasta -179 con
respecto al sitio de iniciación de la transcripción (+1) y \sim20
pb de la región no traducida en 5' de
\varepsilon-globina (mostrada como un pequeño
recuadro negro por debajo de +1). \varepsilon-pro
se conecta a un casete de expresión de LacZ que contiene un
secuencia consenso Kozak y un sitio de iniciación de la traducción
(región SDK). En el sentido de 5' del gen indicador LacZ hay un
parte de la región en 3' del gen de
\varepsilon-globina que contiene parte de exón 2,
la totalidad del intrón 2 (IVS 2) y la totalidad del exón 3; estas
secuencias se muestran como recuadros negros (exones) y una línea
negra (intrón). La región en 3' no traducida (que contiene el sitio
de poliadenilación, pA) se muestra como un línea discontinua. Una
versión truncada de LCR (\muPLCR) se ubica en el sentido de 5' de
las secuencias de \varepsilon-lacZ. (b) -849
lacZ\varepsilon\muLCR (MB73), (c)
\varepsilon-PRE(II+V)lacZ\varepsilon\muLCR
(MB72); y (d) - 2kblacZ\varepsilon\muLCR (MB92). (a)-(d)
contienen \varepsilon-pro y diferentes partes de
la región reguladora en el sentido de 3' del gen de la
\varepsilon-globina humana. Secuencias eucariotas
en (a)-(d) se escindieron del vector mediante digestión con KpnI y
NotI y luego se purificaron para microinyección en los pronúcleos
macho de cigotos de ratón.
La figura 2 muestra la expresión de LacZ,
correlacionada con la aparición de una tinción azul, en
eritroblastos primitivos. A (a) es un representación esquemática de
un embrión de 7,5 dpc; (b) es un embrión transgénico teñido con
XGal y visto mediante microscopía de campo claro, (c) es el mismo
embrión visto mediante microscopía de campo oscuro; B (a) es un
ratón no transgénico; (b) y (c) son embriones a los 8,5 dpc teñidos
con XGal; C(a) es un embrión de tipo natural de 12,5 dpc,
(b) y (c) son embriones transgénicos de 12,5 dpc. (1) de tipo
natural; (2) transgénico; (3) cono ectoplacentario; (4) islote
sanguíneo; (5) cavidad amniótica; (6) trofectodermo; (7)
alantoides; (8) mesodermo extraembrionario; (9) el propio embrión
(epiblasto).
La figura 3 muestra la formación de estructuras
de tipo saco vitelino mediante blastocistos cultivados (a)
blastocistos transgénicos antes del cultivo (b) Estructura de tipo
saco (no transgénica) teñida con bencidina para revelar células que
contienen hemoglobina (c) Saco de blastocistos transgénicos
cultivados teñidos con XGal para revelar células que contienen
hemoglobina tras 9 días de cultivo (d) Embrión transgénico normal
de 8,5 dpc y saco vitelino teñido con XGal.
La figura 4 muestra un análisis de
RT-PCR de cultivos de blastocistos: (A) se observó
\varepsilon-globina en blastocistos que se han
desarrollado en estructuras de tipo saco (saco) pero no en muestras
que eran montones relativamente planos de células (plano). La banda
de mayor peso molecular es la actina como control interno. La banda
de menor peso molecular es \beta-globina
embrionaria. (B) Los blastocistos cultivados respondieron a señales
ambientales lo cual se demostró mediante los efectos del sustrato
sobre la diferenciación eritroide (i) el tejido mesodérmico expresó
\beta-globina embrionaria sobre plástico pero no
sobre colágeno. Los marcadores endodérmicos (receptor PTHrP y
PTHrP) se expresaron en tejido endodérmico tanto sobre superficies
de plástico como de colágeno.
La figura 5 muestra que la eritropoyesis
primitiva se inicia tardíamente en la gastrulación. A la izquierda
se muestra un análisis de embriones completos
(whole-mount) in situ de embrión de
estría tardía (\sim7,5 dpc) y a la derecha hay un embrión de
estría temprana (\sim6,5 dpc). La tinción violeta es un sustrato
cromogénico. La sonda de ARN de
\varepsilon-globina revela células hematopoyéticas
en el embrión a la izquierda como se muestra en la vista rostral
(anterior), y ninguna en el embrión en la derecha demostrando la
ausencia de formación de sangre en el embrión de 6,5 dpc.
La figura 6 muestra expresión diferencial de los
genes patched (ptc) y Gli en el mesodermo de saco
vitelino diseccionado a los 10,5 dpc y 12,5 dpc por medio de
análisis de RT-PCR, revelando la expresión
sustancialmente exclusiva de Gli y ptc en el
mesodermo de saco vitelino diseccionado: completo, sacos vitelinos
no diseccionados; meso, capa del mesodermo; endo, capa del
endodermo; -ADNc, control negativo de ADNc. La actina sirvió como
un control interno.
La figura 7 muestra que cuando explantes
transgénicos de embriones en gastrulación (aislados a los
6,25-6,5 dpc) se ponen en cultivo sobre filtros o
portaobjetos de vidrio durante 72 horas, la inducción de la
hematopoyesis embrionaria se produce en el embrión completo, pero
está ausente en epiblastos solamente, como se determina mediante
tinción con XGal. Se dibujaron líneas discontinuas alrededor de los
epiblastos para facilitar la visualización de las estructuras. (a)
Embrión completo sobre un filtro; (b) epiblasto sobre un filtro; (c)
embrión completo sobre un portaobjetos; y (d) epiblasto sobre un
portaobjetos.
La figura 7-1 muestra la
formación de sangre en cultivos de explantes embrionarios
transgénicos. (Secciones de embriones teñidas con lacZ). Secciones
de tejido congeladas se tiñeron con XGAL para revelar la agrupación
de células hematopoyéticas positivas para lacZ en los embriones
completos (a), epiblastos (b), partes posteriores del embrión (c,
d) y parte anterior del epiblasto transgénico adyacente al VE (e),
pero no en el endodermo visceral circundante ni en el mesodermo no
diferenciado ni en el tejido de VE no transgénico de recombinantes
de VE/anteriores (e).
La figura 8-1 muestra la
inducción de hematopoyesis mediante señales de endodermo visceral
(VE). (a) microfotocrografía de fondo oscuro de recombinante que
contiene epiblasto transgénico (Tg) y VE no Tg que muestra tinción
de lac Z localizada en el embrión adyacente al endodermo visceral;
(b) diagrama esquemático que corresponde al panel (a).
Abreviaturas: Tg, transgénico; Ve, endodermo visceral; EryP, células
eritroides primitivas; (c) microfotografía de fondo claro del
recombinante mostrado en (a).
\newpage
La figura 8-2 muestra la
inducción de hematopoyesis embrionaria en embrión completo, y en
epiblasto más endodermo visceral, pero ningún en epiblastos
solamente, usando RT-PCR. (Se prepararon todas
muestras tras una incubación in vitro de 72 horas de
embriones aislados a las 6,5 dpc). La actina sirvió como un control
interno.
La figura 9 muestra que la proteína hedgehog
recombinante puede sustituir el endodermo visceral para estimular
hematopoyesis primitiva en epiblastos cultivados. Los epiblastos
aislados se cultivaron en ausencia (carriles marcados como
"ninguno") o en presencia de tres concentraciones diferentes de
proteína hedgehog recombinante (0,25, 1 y 5 \mug/ml). Se evaluó
la hematopoyesis primitiva mediante análisis de
RT-PCR para determinar la expresión de
\varepsilon-globina. La actina sirvió como un
control interno. YS, control de saco vitelino.
La figura 10 muestra la activación de
eritropoyesis primitiva mediante un factor difusible en células de
endodermo visceral por medio de análisis de
RT-PCR.
La figura 11 muestra la inhibición de
eritropoyesis primitiva en embriones completos cultivados usando un
anticuerpo de bloqueo de SHH por medio de análisis de
RT-PCR.
La figura 12 muestra una representación
esquemática de la jerarquía hematopoyética de adulto.
La figura 13 muestra la derivación de linajes
celulares en el saco vitelino embrionario de mamífero. La estructura
circular representa un blastocisto de aproximadamente 3,5 días.
La figura 14 muestra el desarrollo temprano del
ratón. La región de formación temprana de islotes sanguíneos se
produce en la cavidad exocelómica (f) entre el epiblasto por debajo
que está rodeado por el endodermo visceral y el tejido
extraembrionario encima.
La figura 15 muestra el esquema experimental
para la separación del epiblasto en las partes anterior y posterior.
(A) representa el embrión completo de 6,75 dpc con endodermo
visceral alrededor del perímetro del epiblasto y el mesodermo
extraembrionario. (B) representa el embrión tras haber eliminado el
endodermo visceral y (C) muestra el epiblasto solamente, mostrando
una línea de puntos de la transección cómo las secciones anterior y
posterior se dividen físicamente antes del cultivo por separado.
La figura 16-1 muestra que el
mesodermo hematopoyético surge de la estría primitiva posterior
(mesodermo posterior) cuando las partes anterior y posterior de
embriones transgénicos con lacZ se recogen en la gastrulación de
media a tardía. Panel A: no se detecta tinción en los epiblastos
anteriores. Panel B: la tinción histoquímica azul oscuro con XGAL
muestra la formación de sangre en los epiblastos posteriores en
cultivo. Barra de escala, 1 mm.
La figura 16-2 muestra que el
endodermo visceral puede reprogramar el ectodermo embrionario
anterior (epiblasto) para expresar marcadores hematopoyéticos. La
expresión de marcadores de \varepsilon-globina,
\beta-globina, GATA-1 y CD34 se
muestra para el epiblasto anterior (anterior: carriles
6-10), el epiblasto posterior (posterior: carriles
6-10) y anterior recombinado con endodermo visceral
(recombs a/Ve: carriles 1-5). Los tejidos de
control fueron embrión completo no en cultivo [emb(-cx)], embriones
completos en cultivo [emb(+cx)] y tejido de saco vitelino de 10,5
dpc. El marcador de control fue actina y miosina cardiaca. Un
control adicional es emb(+cx) sometido a PCR en ausencia de
transcriptasa inversa.
Figura 16-3. El endodermo
visceral puede reprogramar el ectodermo embrionario anterior
(epiblasto) para expresar marcadores vasculares. Se muestra la
expresión de PECAM-1, flk-1 y actina
para el epiblasto anterior (anterior: carriles
6-10), el epiblasto posterior (posterior: carriles
6-10) y anterior recombinado con endodermo visceral
(recombs a/Ve: carriles 1-5). Los tejidos de control
fueron embriones completos no en cultivo [emb(-cx)], embriones
completos en cultivo [emb(+cx)] y tejido de saco vitelino de 10,5
dpc. El marcador de control fue actina.
La figura 17 muestra los resultados de un
experimento de rescate usando células madre embrionarias mutantes
nulos (ES) y añadiendo de nuevo BMP-4 recombinante
al cultivo. (A) y (C) muestra cuerpos embrioides de tipo natural que
surgen de células madre embrionarias aisladas de un ratón de tipo
natural. En (B) las células madre embrionarias son homocigotas
deficientes en BMP-4, y los cuerpos embrioides
carecen de formación de sangre detectable. En (D), la proteína
BMP-4 se añade a los cuerpos embrioides de (B) y se
observa la formación de la sangre.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención identifica por primera vez
procedimientos para estimular actividades de desarrollo
seleccionadas en tejido embrionario y adulto, concretamente el
desarrollo de la sangre caracterizado por la hematopoyesis y el
crecimiento vascular. El procedimiento además utiliza moléculas
secretadas por tejidos extraembrionarios que pueden modular la
proliferación o diferenciación de células madre y células
progenitoras de embrión o adulto. Se usan ensayos novedosos para
identificar los compuestos que pueden estimular la hematopoyesis y
el crecimiento vascular: Se proporciona apoyo para los
procedimientos de la invención en los ejemplos contenidos en el
presente documento. Según una realización de la invención, se han
identificado compuestos que pueden estimular el desarrollo de la
sangre en el embrión y en el adulto y son funcionalmente
equivalentes a productos génicos expresados en el endodermo
visceral y el mesodermo del saco vitelino. Tales productos génicos
se ejemplifican mediante compuestos hedgehog,
TGF-\beta, TNF y compuestos WNT y se identifican
en el presente documento como que logran un efecto similar al
observado con tejidos extraembrionarios con respecto a la
hematopoyesis y el crecimiento vascular en tejidos derivados de
mesodermo no diferenciados. En una realización de la invención,
compuestos incluyendo los seleccionados de hedgehog y
TCF-\beta pueden actuar de manera sinérgica de
modo que potencian su efecto estimulador sobre las células
diana.
"Adulto" se define en el presente documento
y en las reivindicaciones como descriptivo de tejidos y células
derivados de o dentro de un sujeto animal en cualquier momento tras
el nacimiento.
"Embrionario" se define en el presente
documento y en las reivindicaciones, a menos que se indique lo
contrario, como descriptivo de tejidos y células derivados de o
dentro de un sujeto animal cualquier momento antes del
nacimiento.
"Desarrollo de la sangre" se define en el
presente documento y en las reivindicaciones como hematopoyesis y
crecimiento vascular.
"Crecimiento vascular" se define en el
presente documento como al menos uno de vasculogénesis y
angiogénesis e incluye formación de capilares, arterias, venas o
vasos linfáticos.
"Hematopoyesis" se define en el presente
documento y en las reivindicaciones como el proceso de producción
de células sanguíneas.
"Célula madre hematopoyética" se define en
el presente documento y en las reivindicaciones como un precursor
multipotente del cual se derivan todas las clases de células
sanguíneas.
"Células sanguíneas definitivas" se definen
en el presente documento y en las reivindicaciones como células
sanguíneas del organismo fetal o adulto.
"Células sanguíneas primitivas" se definen
en el presente documento y en las reivindicaciones como una
población transitoria de células sanguíneas que se forman durante
el desarrollo de la sangre en el embrión.
"Endodermo definitivo" es el endodermo que
se deriva durante la gastrulación de células de la estría primitiva
que contribuyen a tejidos adultos derivados endodérmicamente como
intestino e hígado.
"Endodermo visceral" se define en el
presente documento y en las reivindicaciones como células
endodérmicas extraembrionarias que son secretoras y no contribuyen
directamente a ningún tejido del organismo totalmente formado.
"Células progenitoras" se definen en el
presente documento y en las reivindicaciones como células no
diferenciadas que están más restringidas en su potencial para dar
lugar a tipos celulares diferenciados en comparación con una célula
madre.
"Comprometidas" se define en el presente
documento y en las reivindicaciones como células destinadas a
diferenciarse junto con un linaje específico en lugar de conservar
la multipotencia.
"RT-PCR" se define en el
presente documento como reacción en cadena de la polimerasa con
transcriptasa inversa que permite la detección de la transcripción
de un gen en un tejido.
"Efecto sinérgico" se define en el presente
documento en cuanto a dos o más compuestos en los que se observa
poco o ningún efecto biológico con los compuestos solos pero juntos
los compuestos tienen un efecto biológico potente.
"Compuesto hedgehog" se define en el
presente documento y en las reivindicaciones como una clase de
moléculas de la familia hedgehog (erizo) que incluye proteína
hedgehog recombinante, análogos, y derivados de proteínas hedgehog,
y agonistas y antagonistas de los receptores de proteína hedgehog y
equivalentes funcionales de los mencionados anteriormente.
"Células derivadas del mesodermo no
diferenciadas" quiere decir en el presente documento y en las
reivindicaciones que incluyen células que no están diferenciadas o
no están comprometidas y además incluye células madre y células
progenitoras
CFU-E se define en el presente
documento como célula formadora de colonia eritroide (unidad), que
es una célula progenitora tardía (madura). Las colonias que se
puntúan como CFU-E son pequeñas agrupaciones
apretadas, de células pigmentadas y aparecen en un plazo de
2-3 días de cultivo.
BFU-E se define en el presente
documento como unidad formadora de colonias eritroides en ramillete,
una célula eritroide primitiva. Estas colonias están pigmentadas y
son de mayor tamaño que CFU-E; sus células están más
ampliamente dispersas, y aparecen en un momento posterior tras el
cultivo en placa. Sus números son máximos alrededor de 7 días en
cultivo.
\newpage
CFU-GM se define en el presente
documento como unidad formadora de colonias mieloides o de
granulocitos-macrófagos. Éstas son de aspecto
similar a BFU-E pero no están pigmentadas.
CFU-S se define en el presente
documento como unidad formadora de colonias de bazo.
La hematopoyesis y el crecimiento vascular son
algunos de los primeros requisitos de una masa de tejido en
crecimiento para garantizar el suministro de nutrientes a las
células en el interior de la masa. El embrión en desarrollo
requiere nutrición y, por tanto, la diferenciación de las células
para formar eritroblastos (células que transportan oxígeno) y la
formación de un sistema vascular (sistema de transporte) son uno de
los primeros acontecimientos en el proceso de desarrollo. Mientras
que el tejido embrionario está experimentando un movimiento celular
que recuerda el observado en gastrulación de aves y reptiles
(migración de células de mesodermo y endodermo definitivo a través
de una estría primitiva), las células extraembrionarias están
fabricando tejido de mamífero que permite que el feto sobreviva en
el útero materno. Esto incluye estimular un suministro de sangre
materna para formar el endometrio uterino. El pedículo de conexión
estrecho de mesodermo extraembrionario que une el embrión al
trofoblasto forma finalmente los vasos del cordón umbilical. El
órgano totalmente desarrollado, constituido por tejido
trofoblástico y mesodermo que contiene vasos sanguíneos, se denomina
el corion. La fusión del corion y la pared uterina forma la
placenta. A las 4 semanas tras la concepción, el embrión humano
tiene una fuente de nutrientes a través de los vasos sanguíneos
fetales que están adyacentes a la circulación materna.
En el adulto, el crecimiento vascular se produce
durante la reparación de tejidos dañados y en una variedad de
enfermedades incluyendo cáncer, en el que un tumor libera factores
que estimulan la aparición de vasos sanguíneos en tejido normal en
el que los nuevos vasos sanguíneos se dirigen hacia el interior del
tejido tumoral. Las células madre hematopoyéticas (HSC) que pueblan
el adulto pueden surgir en un sitio intraembrionario. (Cumano,
et al. (1996)). Se cree que este tejido mesodérmico es un
sitio importante si no el principal sitio de origen de células
madre hematopoyéticas definitivas y quizás las células que dan lugar
a la vasculatura.
Aunque el proceso de hematopoyesis y crecimiento
vascular se comprende sólo parcialmente, la ruta de desarrollo en
ratones parece que imita el proceso equivalente en seres humanos. El
sistema hematopoyético del ratón se deriva de la capa germinal
mesodérmica que empieza a formarse en embriones en fase de estría
primitiva de alrededor de 6,5 dpc. En primer lugar aparecen islotes
sanguíneos en el mesodermo extraembrionario a 7,5 dpc y
progenitores hematopoyéticos en el mesodermo del saco vitelino
visceral de embriones dentro de 1-2 pares de
somitas a 8 dpc. A la mitad de 8 dpc, son visibles glóbulos rojos
primitivos nucleados en la vasculatura del saco vitelino pero no
entran en el sistema circulatorio primitivo hasta 8,5 dpc.
Comenzando en 8,5-9 dpc, se han encontrado células
progenitoras hematopoyéticas en regiones derivadas del mesodermo
dentro del cuerpo del embrión, de manera notable la esplancnopleura
paraaórtica (Cumano, et al. (1996). Células de
mesodermo espláncnico que cubren el saco vitelino forman cordones
de células que crean un orificio para producir un tubo revestido
por las células endoteliales. Las células centrales de los islotes
sanguíneos se diferencian en células sanguíneas embrionarias. Según
crecen los islotes sanguíneos, finalmente se funden para formar la
red de capilares y los vasos vitelinos que en última instancia se
conectan al corazón recién formado.
Hasta ahora, poco se ha sabido con respecto a
los acontecimientos bioquímicos antes de aproximadamente 8 dpc que
desempeñan un papel en la vasculogénesis y hematopoyesis. Sin
embargo, los inventores afirman que esta fase en desarrollo
desempeña un papel significativo en la maduración del sistema
sanguíneo en el embrión y en el adulto. Según realizaciones de la
invención, los procesos de crecimiento vascular y hematopoyesis en
el desarrollo embrionario se ven afectados por compuestos en el
endodermo visceral. Por ejemplo, los inventores han identificado
por primera vez que proteínas hedgehog actúan sobre células
derivadas del mesodermo no diferenciadas in vitro para
estimular la formación de la sangre y sobre el desarrollo de tejido
embrionario y saco vitelino en fases muy tempranas en las rutas de
la hematopoyesis y el crecimiento vascular. Además, según la
invención, estos compuestos de actuación temprana son útiles en la
regulación de la hematopoyesis y el crecimiento vascular en el
animal adulto. (Tablas 1 y 2). Según realizaciones de la invención,
"estimular una población de células derivadas del mesodermo no
diferenciadas para que experimenten al menos uno de hematopoyesis y
crecimiento vascular" incluye estimular la proliferación de
células progenitoras y células madre hematopoyéticas antes de la
diferenciación (ejemplo 4).
\vskip1.000000\baselineskip
La identificación de factores en el endodermo
visceral que estimulan el desarrollo de la sangre y el crecimiento
vascular se demuestran en el presente documento a través del uso de
ensayos novedosos. Estos ensayos incluyen:
- (a)
- el análisis de tejidos de explante embrionario antes, durante y después del desarrollo de la sangre. Por ejemplo, pueden derivarse explantes de blastocistos que se forman en la primera fase de desarrollo del mamífero. Los blastocistos se forman cuando el embrión alcanza la fase de 64 células formando una masa celular interna, una capa celular trofoblástica externa formada a partir de células trofoectodérmicas y un espacio interno que contiene fluido identificado como el blastocele. La masa celular interna (ICM) se sitúa en el blastocele y se segrega en el "endodermo primitivo" que forma la capa externa de la ICM, y la propia ICM. El "endodermo primitivo" da lugar al endodermo parietal y visceral. Las células internas de la ICM, que forman el ectodermo primitivo, dan lugar al propio embrión. Los blastocistos, que se aíslan antes de iniciarse el desarrollo de la sangre, pueden mantenerse en cultivo durantes periodos de tiempo que permiten la formación de tejidos característicos de órganos asociados con la vasculatura como músculo cardiaco que late. En primer lugar se observa histológicamente el desarrollo de la sangre cuando se observan islotes sanguíneos entre el endodermo y el mesodermo del saco vitelino embrionario en desarrollo. Sin estar limitado a la teoría, los inventores creen que los islotes observados se forman como resultado de la formación de eritroblastos y células endoteliales a partir de células precursoras no diferenciadas. En el modelo experimental de ratón, pueden aislarse explantes embrionarios a o tras 2 dpc antes de que se observe la formación de islotes sanguíneos y pueden mantenerse in vitro hasta 14 dpc y durante más tiempo cuando el desarrollo de órganos está en progreso, proporcionando un sistema modelo para seguir la iniciación y progresión del sistema sanguíneo y vascular. El aislamiento de explantes antes de la formación de la sangre según la invención es novedoso con respecto a la técnica anterior, técnica anterior que describe acontecimientos sobre el desarrollo de la sangre tras haberse producido ya la iniciación de la formación de islotes sanguíneos. (Cumano et al. (1996), Palis et al., Blood 86 (1995), 160-63, Kanatsu et al., Development 122 (1996), 23-30).
- (b)
- El uso de explantes de animales transgénicos en los que la región reguladora de un producto génico de fase temprana asociado con la formación de la sangre (por ejemplo el gen de la \varepsilon-globina) está acoplado a un marcador, de modo que el marcador (por ejemplo LacZ) sirve para señalizar el comienzo de la hematopoyesis y el crecimiento vascular [Ejemplo 1]. El comienzo de la de hematopoyesis o el crecimiento vascular puede detectarse usando procedimientos de detección sensibles como RT-PCR que pueden detectar la iniciación de la expresión y el grado de expresión de productos génicos que están asociados al desarrollo de la sangre; tinción histoquímica ejemplificada por tinción con bencidina de hemoglobina; inmunohistoquímica que utiliza un anticuerpo de especificidad apropiada; hibridación in situ de embriones completos; hibrida- ción in situ usando ribosondas radiomarcadas y otros procedimientos de detección conocidos en la técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
Se describen cuatro diseños de ensayos
diferentes a continuación y en los ejemplos 1 y 2 que son útiles
tanto individualmente como en combinación para cribar e identificar
factores implicados en la hematopoyesis y el crecimiento
vascular.
- (i)
- Cultivos de epiblastos: se recogieron explantes de embrión intactos antes de la aparición histológica de islotes sanguíneos por ejemplo a 6,5 dpc, y se incubaron intactos in vitro usando técnicas de cultivo convencionales de modo que permitan que continúe el desarrollo del embrión sirviendo de ese modo como controles positivos de formación de la sangre. (Ejemplo 2A-B). En estas circunstancias, los explantes formaron islotes sanguíneos in vitro y la formación de la sangre pudo seguirse midiendo la aparición de marcadores de desarrollo temprano de la sangre como \varepsilon-globina, (\beta-globina embrionaria) GATA-1, CD 34, sca-1 (marcadores de células madre hematopoyéticas) PECAM-1, flk-1, Vezf-1 (marcador endotelial). En el ejemplo 2, se detectó la expresión del gen de la \varepsilon-globina tras una incubación durante 72 h in vitro en cultivos de epiblastos usando RT-PCR. Los embriones explantados de animales transgénicos, que portaban el marcador LacZ bajo el promotor del gen de la \varepsilon-globina, teñido con XGal tras un periodo de tiempo similar. El ensayo incluye la creación de explantes de embrión que no pueden producir islotes sanguíneos, en los que esta incapacidad es reversible. Cuando se separaron por primera vez los embriones del endodermo visceral, los epiblastos resultantes no pudieron teñirse positivamente con XGal en cultivos de explante y por tanto no pudieron expresar \varepsilon-globina (figuras 7, 8). Se han identificado factores difusibles que modulan la iniciación de la hematopoyesis de una manera independiente del contacto directo célula-célula. Estos factores se fabrican en el exterior del epiblasto, por ejemplo, en el endodermo visceral. El papel biológico de estos factores se confirmó mediante experimentos de reconstitución usando tejidos de epiblasto y endodermo visceral (figura 8). El requerimiento de factores contenidos en el endodermo visceral se demostró adicionalmente cuando los inventores compararon el efecto del tratamiento de epiblastos con medio condicionado obtenido de cultivos celulares de endodermo visceral en comparación con epiblastos control no tratados (ejemplo 2A). Mientras que, en ausencia de medio condicionado, los epiblastos no expresan \varepsilon-globina, La adición de medio condicionado que contiene factores celulares secretados indujo la expresión de \varepsilon-globina en el tejido embrionario (figura 10). Se analizaron epiblastos derivados de ratones no transgénicos para detectar la expresión génica usando inmunotinción o hibridación in situ de embriones completos.
- (ii)
- Cultivos de blastocistos: se midió la expresión de XGal en blastocistos derivados de ratones transgénicos que contenían un gen híbrido formado a partir de un marcador detectable controlado por secuencias reguladoras de un gen asociado con la formación de la sangre como globina de tipo \beta embrionaria: LacZ (\varepsilon-globina: LacZ). En el ejemplo 2(C), se aislaron blastocistos a 3,5 dpc y se incubaron durante 7-10 días más. (Figura 13) Como alternativa, se han preparado cultivos de blastocistos como anteriormente usando ratones no transgénicos y se ha detectado la expresión génica mediante inmunotinción o hibridación in situ de embriones completos. Se proporcionan detalles de los cultivos de blastocistos en el ejemplo 2(C) y en la figura 3.
- (iii)
- Ensayos de cultivos de epiblastos modificados: se han recogido embriones en gastrulación en fase tardía y epiblastos preparados mediante retirada por disección del ectodermo extraembrionario (ejemplo 2(B)). Durante la gastrulación, células embrionarias establecieron el plano básico del cuerpo y el mesodermo extraembrionario contribuye a los tejidos extraembrionarios, respectivamente. Las células mesodérmicas destinadas a sitios extraembrionarios salen de la estría primitiva posterior y subdividen el embrión en tres cavidades separadas por la fase de estría tardía a 7,5 dpc. La cavidad central, el exoceloma, se reviste por completo con células mesodérmicas. Estas células mesodérmicas se extienden adyacentes al ectodermo embrionario para formar el amnios, el ectodermo extraembrionario para formar el corion y el endodermo visceral para formar el saco vitelino visceral (VYS). Al final de la gastrulación, las células en el embrión se han separado en tres capas germinales: el ectodermo externo, que da lugar a la epidermis y el sistema nervioso; el endodermo interno, que da lugar al revestimiento del tubo digestivo y sus órganos asociados (como páncreas, hígado y bazo); y el mesodermo intermedio, que da lugar a varios órganos (corazón, riñón, gónadas), tejido conjuntivo (hueso, músculo, tendones) y la células sanguíneas definitivas.
- Se transeccionaron epiblastos individuales de embriones en gastrulación en fase tardía en sus partes anterior y posterior y se cultivó cada parte individualmente durante varios días (figuras 14 y 15). Mientras que la parte anterior del epiblasto formó pocos o ningún islote sanguíneo como se determinó mediante la expresión de \varepsilon-globina usando técnicas de RT-PCR, las partes posteriores formaron sangre a niveles comparables a los del epiblasto intacto. Usando este ensayo, pueden añadirse composiciones al epiblasto anterior y determinarse la estimulación de la formación de la sangre. El control en este ensayo es la adición de endodermo visceral que sea suficiente para hacer que el epiblasto anterior forme islotes sanguíneos. Cuando se añadió o bien el endodermo visceral o bien la proteína hedgehog al cultivo, se observó la formación de sangre. (Figura 16)
- (iv)
- Explantes o cuerpos embrioides derivados de mutantes deficientes en la proteína dirigida: se forman cuerpos embrioides a partir de células madre embrionarias recogidas que se incuban in vitro usando técnicas bien conocidas en la técnica. (Ejemplo 2(C)) Estas células forman cuerpos embrioides que contienen varios tipos celulares incluyendo células sanguíneas y células precursoras endoteliales (véase la figura 17 (A, C). Las células madre embrionarias pueden someterse a mutaciones dirigidas en genes de ratón seleccionados, productos que desempeñan un papel en la hematopoyesis y el crecimiento vascular, usando técnicas bien establecidas como recombinación homóloga y resistencia a fármacos seleccionable, que dan como resultado células que son homocigotas para la mutación del gen dirigido. Pueden inducirse mutaciones que (i) "desactivan" un gen codificante o una secuencia reguladora; (ii) "desactivan" un gen codificante o secuencia reguladora y sustituyen la secuencia por una secuencia "activada" que hace con que se produzca otra cosa (la secuencia activada puede ser un secuencia mutada); o (iii) generar una mutación aleatoria mediante la inserción de ADN foráneo en el genoma o el uso de productos químicos para provocar mutaciones. Las consecuencias de formar tales mutaciones incluyen: modificación de actividad de un producto génico particular y anulación de la actividad del producto génico y puede incluir además la substitución de un producto génico por otro producto génico mediante procedimientos establecidos de manipulación génica.
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando estas mutaciones dirigidas dan como
resultado la no expresión génica de la proteína, las mutaciones se
denominan mutaciones nulas. Se formaron mutantes nulos usando
células madre embrionarias de tipo natural. Según la invención, los
mutantes nulos deficientes en una proteína que está asociada con el
endodermo visceral de tal modo que su ausencia da como resultado el
fallo para fabricar sangre, es un sistema modelo adecuado para
cribar compuestos novedosos de bibliotecas como aquéllas derivadas
de tejidos extraembrionarios, bibliotecas que incluyen bibliotecas
de péptidos combinatorios y bibliotecas de ADN recombinante. Usando
una estrategia de reunión para reducir en número de pruebas
experimentales, pueden identificarse los compuestos que son útiles
en la modulación de la hematopoyesis y el crecimiento vascular en
cuerpos embrioides.
Este tipo general de ensayo puede usarse para
estudiar el efecto de otras mutaciones, tales como deficiencia de
factores señalización tales como proteínas hedgehog (por ejemplo,
Indian hedgehog), sobre la formación de la sangre.(Ejemplos
3-5) Por ejemplo, pueden formarse células ES
mutantes nulas Ihh e identificarse factores que pueden superar la
mutación. Estas células podrían rescatarse o bien proporcionando
proteína hedgehog exógena o bien transfectando las células con
vectores que expresan un gen hedgehog utilizando vectores
convencionales o vectores retrovirales. (Figura 9) Las células
mutadas también podrían reintroducirse en ratones para formar
quimeras.
\vskip1.000000\baselineskip
Estas técnicas de detección se usaron para
detectar la hematopoyesis y el crecimiento vascular en cultivos de
epiblastos y blastocistos tal como sigue: según el ensayo de la
invención, el comienzo de la formación de islotes sanguíneos puede
detectarse usando cualquiera de las técnicas sensibles disponibles
en la técnica, incluyendo lo que sigue:
- (1)
- detección de XGal en explantes derivados de ratones transgénicos que contenían el gen híbrido globina de tipo \beta embrionaria:LacZ (\varepsilon-globina:LacZ). Los embriones de ratones transgénicos homocigotos se analizaron usando XGal para revelar la transcripción de gen de globina indicativa de desarrollo de sangre antes de la detección visual de células eritroides (figura 1, 2)
- (2)
- detección de expresión del gen de globina usando sondas de RT-PCR semicuantitativas radiactivas en epiblastos y blastocistos en diversos momentos tras la concepción. Una ventaja distinta de usar un ensayo radiactivo es que la cantidad de tejido recuperado de explantes individuales es muy pequeña, y un ensayo sensible hace posible someter a ensayo la expresión de muchos genes a partir de un único producto de cultivo (figura 4).
\vskip1.000000\baselineskip
Usando los ensayos anteriores, los inventores
han identificado varios compuestos que son funcionalmente
equivalentes a los productos génicos que se expresan en tejidos
extraembrionarios y puede estimular la formación de sangre. Estos
compuestos incluyen proteínas TGF-\beta, más
específicamente TGF-\beta1, más específicamente
proteína morfogénica ósea (BMP), más específicamente
BMP-4; proteínas de factor de necrosis tumoral
(TNF), más específicamente TNF-\alpha; la familia
wnt; y proteínas hedgehog (figuras 5, 9 y 17). Los compuestos
también pueden incluir agonistas, antagonistas, análogos y
derivados de los anteriores, que se producen de manera natural y
sintéticos. Estas moléculas pueden interaccionar con proteínas de
membrana que inician las rutas de transducción de señales dando
como resultado una respuesta biológica. Por tanto, además de los
compuestos anteriores, los agonistas y antagonistas a estas
proteínas de unión a membrana incluyendo aquellos receptores,
agonistas de receptor y antagonistas de receptor asociados con los
receptores de unión a hedgehog y rutas de transducción de
señalización de hedgehog tales como smoothened, patched y gli
pueden tener utilidad en la regulación de la hematopoyesis y el
crecimiento vascular.
El sitio diana para estimular la proliferación
de células madre y modular la diferenciación se identifica en este
caso como tejido derivado de mesodermo diferenciado previamente tal
como está presente en el embrión. El tejido mesodérmico
diferenciado previamente embrionario incluye saco vitelino visceral,
alontoides, amnios, corion, trofectodermo y saco vitelino prenatal,
células madre hematopoyéticas en hígado fetal y sangre de cordón
umbilical. El tejido derivado de mesodermo diferenciado previamente
en el adulto incluye células madre hematopoyéticas y células
progenitoras en médula ósea de adulto, hígado y bazo y células madre
endoteliales y células progenitoras en el feto y adulto.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ensayos novedosos pueden usarse en múltiples
aplicaciones, incluyendo:
- (i)
- cribar bibliotecas de compuestos para determinar actividad en la estimulación de la hematopoyesis y el crecimiento vascular;
- (ii)
- someter a prueba para determinar el efecto de factores de crecimiento, citoquinas y otras moléculas de señalización sobre la hematopoyesis embrionaria y también sobre el crecimiento vascular;
- (iii)
- determinar el efecto de proteínas hedgehog sobre la hematopoyesis y el crecimiento vascular en el embrión, el feto y el adulto. Por ejemplo, el ensayo de blastocistos puede usarse para determinar el efecto de las proteínas hedgehog sobre el desarrollo del saco vitelino ex vivo cuando se deriva el blastocisto de animales transgénicos o no transgénicos;
- (iv)
- examinar el potencial hematopoyético de otros tejidos embrionarios tales como el alantoides que normalmente no produce células sanguíneas pero cuyo mesodermo tiene el mismo origen que el del saco vitelino;
- (v)
- seguir el desarrollo de estructuras vasculares y células eritroides primitivas tiñendo con un marcador tal como XGal de modo que se destaca la vasculatura y permite seguir la pista del crecimiento vascular así como de la hematopoyesis; y proporciona los medios para analizar la hematopoyesis definitiva intraembrionaria temprana así como la hematopoyesis del saco vitelino primitiva;
- (vi)
- determinar el efecto sobre explantes individuales de mutaciones seleccionadas como diana en genes que afectan a la hematopoyesis o al crecimiento vascular en el animal parental incluyendo las que portan transgenes que expresan hedgehog, patched, Gli y otras proteínas; y
- (vii)
- examinar el efecto de la terapia génica sobre tejidos derivados mesodérmicamente; en los que por ejemplo, el gen para la proteína hedgehog se introduce en embriones en fase de pre-estría que carece del endodermo visceral, bajo diversos promotores de modo que modula el efecto de la formación de islotes sanguíneos. Este tipo de modelo de terapia génica puede servir como herramienta experimental para identificar moléculas que pueden modular la hematopoyesis y el crecimiento vascular.
\vskip1.000000\baselineskip
El recién identificado papel de las proteínas
morfogénicas en la hematopoyesis y el crecimiento vascular:
Proteínas hedgehog: Los inventores han
demostrado en el presente documento por primera vez que las
proteínas hedgehog pueden estimular la hematopoyesis en el saco
vitelino, y la esplancnopleura y otros tejidos hematopoyéticos del
embrión o feto y estimular la hematopoyesis en la médula ósea del
adulto. (Ejemplos 3-5, tablas 1-2,
figuras 6, 9). Al cribar moléculas que estaban presentes en el
endodermo visceral, los inventores identificaron el producto génico
hedgehog. Cuando se añadió una proteína hedgehog (SHH) a cultivos de
epiblasto y se aisló el ARN tras 2-3 días y se
analizó mediante RT-PCR (ejemplo 3, figura 9), se
observó que se estimulaba la hematopoyesis, como se determinó
mediante la activación del gen de
\varepsilon-globina. Además, la proteína SHH podía
estimular la hematopoyesis en el epiblasto que carecía de endodermo
visceral. Cuando se añadieron anticuerpos frente a SHH a embriones
enteros, como se describe en el ejemplo 4 y la figura 11, se redujo
sustancialmente la expresión de
\varepsilon-globina.
Los ensayos anteriores muestran que las
proteínas hedgehog expresadas en el tejido extraembrionario así como
las proteínas hedgehog que están estrechamente relacionadas con las
proteínas expresadas en tejidos extraembrionarios, estimulan la
hematopoyesis y la vasculogénesis. Se saben que los miembros de la
familia hedgehog que son una familia diferenciada de moléculas de
señalización (por ejemplo, revisada en Goodrich et al.,
Genes & Develop. 10 (1996), 301-12)
desempeñan un papel en la morfogénesis de extremidades, el
desarrollo neural, el modelado óseo y la espermatogénesis.
Inicialmente se identificó la familia como implicada en la formación
de patrones en segmentos normal en Drosophila
(Nusslein-Volhard et al, Nature, 287
(1980), 795-801). La familia hedgehog incluye
la proteína Desert hedgehog (DHH), la proteína Indian hedgehog
(IHH), Moonrat hedgehog (cebrita) y Tiggy winkle hedgehog
(cebrita).
Aunque la invención no tiene la finalidad de
quedar limitada por las teorías, los inventores sugieren que la
expresión inicial de IHH en el endodermo visceral puede dar como
resultado la activación de DHH posteriormente en el mesodermo del
saco vitelino y que la DHH pueda actuar sobre el mesodermo
extraembrionario del saco vitelino de una manera autocrina. De este
modo, los epiblastos separados del endodermo visceral a 6,5 dpc
pueden producir islotes sanguíneos a 7,5 dpc en presencia de IHH
que actúa sobre la señalización de DHH. Una vez que se inicia la
señalización de DHH de este modo, IHH pueden no requerirse ya de
manera absoluta. Los inventores han observado el efecto de
desactivación de IHH o desactivación de DHH solos o juntos. Los
inventores observaron que la desactivación de DHH no impide la
formación de islotes sanguíneos y se concluye que IHH tiene un
efecto estimulante continuado sobre el desarrollo de la sangre en
ausencia de DHH. Los inventores sugieren que sería necesario
desactivar tanto IHH como DHH para dar como resultado un fenotipo de
saco vitelino que carece de células sanguíneas y vasculatura. Las
diferencias funcionales evidentes en las propias moléculas pueden no
residir tanto en sus diferencias bioquímicas sino más bien proceder
de las diferencias en el sitio de expresión o el momento de
expresión. Un precedente para esto se proporciona por los genes
engrailed (Hanks, et al., Science, 269 (1995),
679-82). Las propuestas presentadas
anteriormente representan las explicaciones preferidas para la
relación de DHH e IHH pero no pretenden excluir otras explicaciones
para las asociaciones observadas entre estas proteínas.
La utilidad de las proteínas hedgehog en la
estimulación de la hematopoyesis y el crecimiento vascular se
refuerza adicionalmente mediante nuestros experimentos sobre
moléculas diana a través de las que actúan estas proteínas. Usando
RT-PCR para analizar la expresión de patched
y Gli, (ejemplo 5, figura 6) los inventores identificaron
sustancialmente una expresión exclusiva de estas proteínas en el
mesodermo del saco vitelino, un tejido cuya única función es
producir células endoteliales vasculares y sanguíneas.
En apoyo de las observaciones de los inventores
de que las proteínas hedgehog pueden estimular la hematopoyesis,
los inventores identificaron la expresión enriquecida de Gli
y patched en el mesodermo del saco vitelino. Gli es un
factor de transcripción implicado en la ruta de transducción sobre
la que actúan las proteínas hedgehog, mientras que PTC (patched) es
una proteína de membrana que se une a la proteína hedgehog para
iniciar la ruta de transducción de señales que provoca en última
instancia una respuesta biológica en la célula diana. La asociación
de estas proteínas con mesodermo del saco vitelino apoya además la
observación de que las proteínas hedgehog estimulan la
hematopoyesis. Puesto que ptc es la supuesta puerta a una respuesta
celular, se espera que cualquier agonista de hedgehog que pueda
unirse a patched induzca el mismo efecto biológico que hedgehog en
este caso, hematopoyesis y crecimiento vascular.
Se ha notificado que ciertas proteínas hedgehog
están implicadas en el inicio de la expresión de las moléculas de
señalización secundaria BMP-2 y
BMP-4 (proteínas que pertenecen a la familia
TGF-\beta) en el mesodermo y
Fgf-4 en el ectodermo (documento WO 95/18856). Los
inventores han identificado por primera vez que las proteínas
hedgehog pueden interaccionar de una manera sinérgica con las
moléculas de señalización secundaria para estimular la
hematopoyesis y el crecimiento vascular (ejemplo 6). Estas moléculas
de señalización incluyen BMP-2,
BMP-4, BMP-6 y
BMP-7 y otros miembros de la familia
TGF-\beta incluyendo Wnts y FGF, que pueden
encontrarse que están asociados con el endodermo visceral y/o el
mesodermo del saco vitelino.
La actividad de compuestos que son equivalentes
funcionales para un producto génico expresado en tejido
extraembrionario tal como proteína hedgehog recombinante, análogos,
derivados y productos de disociación de proteínas hedgehog, y
agonistas de receptores de proteína hedgehog tales como PTC según la
invención, pueden estimular la hematopoyesis y el crecimiento
vascular actuando sobre las células o los tejidos de embriones de
diferentes edades incluyendo células fetales, sangre periférica
fetal y sangre de cordón, así como sobre células madre
hematopoyéticas adultas y células progenitoras adultas. La
invención incluye el uso de péptidos funcionales de proteína
hedgehog. La expresión "péptido funcional" como una subclase
de un compuesto hedgehog definida anteriormente, pretende incluir
fragmentos peptídicos de la proteína hedgehog que pueden inducir una
actividad biológica que es igual o equivalente a la proteína
completa (documento WO 96/16668). La invención incluye además los
compuestos hedgehog descritos en el documento WO 95/18856,
incluyendo homólogos de proteínas hedgehog, proteínas hedgehog
recombinantes, ácidos nucleicos que codifican hedgehog, moléculas
antisentido, constructos génicos para su uso en terapia génica
incluyendo vectores virales conocidos en la técnica, mutantes
combinatorios de proteínas hedgehog como agonistas o antagonistas,
y anticuerpos específicos para un epítopo de la proteína hedgehog.
Estos y otros compuestos pueden seleccionarse para modular la
hematopoyesis y el crecimiento vascular según los ensayos descritos
en el presente documento.
Según la invención, estos factores pueden usarse
para estimular la hematopoyesis y el crecimiento vascular en
animales incluyendo los mamíferos, incluyendo los seres humanos. De
manera similar los antagonistas de los compuestos de la invención
pueden usarse para inhibir el crecimiento vascular y la
hematopoyesis. La utilidad terapéutica de estos factores se discute
a continuación.
Nuestro ensayo de blastocistos novedoso puede
usarse para determinar el efecto de las proteínas hedgehog sobre el
desarrollo del saco vitelino. Además, pudieron someterse a ensayo
blastosacos para determinar la gen expresión no sólo usando LacZ
como marcador histoquímico, sino también mediante hibridación in
situ de de embriones completos o mediante inmunotinción.
Los modelos de ratón transgénico tienen utilidad
en el estudio de acontecimientos de desarrollo. Cuando se introduce
un gen marcador histoquímico en el genoma de ratones, puede
establecerse la formación de patrones asociada con las células
marcadas.
Los ratones transgénicos de la técnica anterior
tienen al menos cuatro limitaciones principales: (i) la capacidad
de seguir la transcripción de los transgenes se basa en la
protección de ARNasa o ensayos de S1 nucleasa de producción de
ARNm, y las muestras de tejido pueden ser limitantes en las fases de
desarrollo tempranas; (ii) la especificidad de expresión no puede
examinarse al nivel de célula individual (salvo que se realicen
hibridaciones in situ usando ribosondas, pero estos
experimentos son técnicamente complicados y caros); (iii) un
desequilibrio en la expresión de un gen de
\beta-globina exógeno en ausencia de un gen de
\alpha-globina que lo contrarreste es probable
que conduzca a talasemia grave (Hanscombe, et al., Genes
& Develop. 3 (1989), 1572-81) y se cree que
reduce el rendimiento de la progenie transgénica por una muerte
temprana en el útero (Hanscombe et al., 1989; Pondel
et al. Nucleic Acids Res. 20 (1992),
5655-60.); (iv) el uso del gen de globina
completo con sus secuencias reguladoras en el sentido de 5', en
ratones transgénicos y el examen de ratones tras
8,5-9,5 dpc ha dado como resultado el análisis del
desarrollo de la sangre tras la iniciación, Pondel, et
al., (1992).
Los inventores han desarrollado animales
transgénicos que proporcionan modelos para el desarrollo de la
sangre que superaron las limitaciones de los ratones transgénicos
de la técnica anterior. Los inventores han adoptado en el presente
documento el uso de modelos de ratones seleccionados en los que se
pone un gen marcador bajo el control de secuencias reguladoras de
globina para obtener explantes adecuados para el ensayo como se
describió anteriormente. Los inventores han seleccionado un
marcador, ejemplificado mediante el gen indicador de
\beta-galactosidasa (LacZ), en lugar del cuerpo
del gen de \varepsilon-globina, de modo que la
proteína de hemoglobina exógena funcional no se fabricará y de modo
que pueda usarse un ensayo enzimático sensible para seguir la
expresión transgénica (ejemplo 1). Una ventaja adicional de usar un
gen indicador tal como LacZ es que permite estudios histoquímicos
detallados, rápidos, en los que puede analizarse la especificidad de
expresión al nivel de célula individual o cuantitativamente en los
lisados tisulares. La capacidad para examinar la expresión de
células individuales dentro de un tejido complejo es
particularmente útil para estudios que implican embriogénesis
temprana.
Los genes indicadores alternativos al de LacZ
incluyen fosfatasa alcalina y proteína fluorescente verde o sus
derivados. Los embriones formados según el ejemplo 1 pueden expresar
LacZ a un nivel pico tan pronto como 7,5 dpc de desarrollo,
continuando hasta tanto como 16,5 dpc. La expresión de LacZ en el
modelo de ratón de la presente invención puede identificarse en la
esplancnopleura para-aórtica intraembrionaria y en
la región aorta-gonadal-mesonefros
(AGM); véase a continuación). Como tal, son adecuados de manera
única para estudios sobre hematopoyesis en fases de desarrollo
tardías y tienen utilidad en una variedad de estudios in
vitro e in vivo sobre hematopoyesis embrionaria. En
consecuencia, estos animales tienen utilidad como fuente de células
eritroides marcadas genéticamente para diversos tipos de cultivos de
embriones o explantes.
Usando la metodología transgénica descrita en la
invención, pueden usarse ratones transgénicos LacZ como modelos
para la modulación de la expresión de hematopoyesis y crecimiento
vascular en un animal o bien embrionario o bien adulto utilizando
potenciadores y/o promotores que dirigen el momento de expresión
durante el desarrollo o dirigiendo la especificidad tisular de la
expresión, pudiendo inducirse opcionalmente tal potenciador. Los
ejemplos incluyen un potenciador de
\alpha-fetoproteína que dirige la expresión génica
al saco vitelino y al intestino en desarrollo, un potenciador de
actina cardiaca que dirige la expresión al músculo cardiaco, y
secuencias reguladoras sca-1 para expresar proteína
en células madre hematopoyéticas (Miles et al.
Development, Vol. 124, (1997) págs. 537-547), o
un elemento regulador específico de retina de la proteína de unión a
interfotorreceptor retinoide (Bobola et al. J. Biol.
Chem. Vol 270, (1995) págs. 1289-1294). Pueden
formarse otros ratones transgénicos en los que puede ponerse una
secuencia seleccionada de la familia de genes hedgehog bajo el
control de un potenciador y/o promotor de la clase descrita
anteriormente. Además, pueden generarse ratones transgénicos en los
que el hedgehog o agonista o antagonista de hedgehog se expresa bajo
el control de promotores/potenciadores específicos de tejido
heterólogos tales como los descritos anteriormente. Pueden formarse
otros animales transgénicos en los que las secuencias reguladoras
hedgehog se usan para dirigir la expresión de secuencias
codificantes de genes heterólogos en tejidos embrionarios o adultos
específicos, por ejemplo secuencias reguladoras de Ihh para dirigir
la expresión de Shh o Dhh.
Pueden formarse modelos de ratón transgénico
según lo anterior mediante la metodología descrita en el ejemplo 1.
Pueden prepararse ratones "no deficientes" usando el
procedimiento de Hanks et al. Science vol 269 (1995)
págs. 679-682, para seleccionar como diana genes
hedgehog en sitios seleccionados en el genoma bajo el control de
secuencias endógenas en células madre embrionarias (ES). Estas
células ES modificadas pueden microinyectarse entonces en
blastocistos para formar animales quiméricos (Joyner 1995). Estos
animales son heterocigotos para el gen seleccionado como diana y
expresarán de manera errónea las secuencias introducidas. De esta
manera puede conseguirse el control del nivel de expresión génica y
de los sitios en los que se produce la expresión. Un ejemplo de un
ratón transgénico de este tipo sería uno en el que se "meten"
secuencias Ihh en el locus flk-1 endógeno para
permitir la expresión en precursores de células endoteliales y HSC.
El transgén (gen "activado") puede modificarse como una
proteína de fusión con por ejemplo LacZ o GFP, para permitir una
detección molecular o inmunológica o histoquímica conveniente.
El uso de tecnología de animales transgénicos
puede proporcionar sistemas de modelo de ratón para aplicaciones
que incluyen las siguientes: identificar acontecimientos adicionales
en los procesos normales de hematopoyesis y crecimiento vascular en
mamíferos embrionarios, fetales y adultos, y acontecimientos que dan
lugar a enfermedades de la sangre tales como leucemias y
crecimiento vascular anómalo y hematopoyesis anómala. Estos
acontecimientos pueden analizarse con respecto a los compuestos
hedgehog.
Hay varias aplicaciones terapéuticas de la
invención. Tales usos están asociados con la modulación de la
hematopoyesis y el crecimiento vascular e incluyen procedimientos
que dan como resultado la estimulación así como los que dan como
resultado la inhibición de la proliferación y/o diferenciación de
células madre. Los ejemplos de compuestos usados según la invención
se han discutido anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
En realizaciones de la invención, el
procedimiento de estimular la hematopoyesis y el crecimiento
vascular puede utilizar:
- (a)
- compuestos terapéuticos tales como proteínas hedgehog, y péptidos funcionales de proteínas hedgehog. Los compuestos terapéuticos pueden aislarse de cultivos de tejidos extraembrionarios, fabricados mediante tecnología recombinante o preparados mediante química sintética;
- (b)
- secuencias codificantes para los compuestos terapéuticos enumerados anteriormente, incorporados en vectores adecuados para las técnicas de terapia génica; y
- (c)
- células de mamífero que se han transformado con secuencias codificantes de las anteriores para el trasplante de células.
\vskip1.000000\baselineskip
El tratamiento de sujetos con desarrollo de la
sangre anómalo puede lograrse administrando, en una dosis eficaz,
durante un tiempo eficaz, un agente terapéutico que se haya
identificado en uno de los ensayos de la invención al paciente
mediante cualquiera de los procedimientos anteriores. Como
alternativa, pueden someterse los pacientes a terapia génica
creando un plásmido o vector viral que contiene la secuencia
codificante para el agente terapéutico usando cualquiera de las
técnicas disponibles en la técnica. Por ejemplo, puede introducirse
una proteína, un análogo, un derivado, un antagonista o un
receptor, de una proteína identificada (denominados colectivamente
compuestos) tal como compuestos relacionados con hedgehog, en un
vector e introducirse el vector en el tejido diana apropiado en el
que se ubica este tejido en un adulto o en un embrión. La expresión
del agente terapéutico puede regularse mediante un potenciador
seleccionado para garantizar la expresión selectiva en el tejido
seleccionado como diana. Por ejemplo, el uso del potenciador de
actina cardiaca para expresar el compuesto deseado en el corazón,
el potenciador MCK para expresar el compuesto en músculo
esquelético; secuencias reguladoras sca-1
para expresar el compuesto hedgehog en células madre hematopoyéticas
o un elemento regulador específico de retina de la proteína de
unión a interfotorreceptor retinoide para expresar el compuesto en
la retina.
Los sujetos con un desarrollo de la sangre
anómalo pueden tratarse administrando el agente terapéutico por
medio de trasplante de células usando líneas celulares manipuladas
genéticamente como sistemas de suministro del agente secretado. Por
ejemplo, pueden manipularse células autólogas tales como
fibroblastos autólogos o células heterólogas contenidas dentro de
una barrera protectora inmunitaria, mediante técnicas convencionales
para secretar la proteína seleccionada tal como hedgehog, o
análogos, derivados, antagonistas o receptores de proteína.
En una realización de la invención, se
proporcionan procedimientos y compuestos para estimular la
hematopoyesis en un sujeto para tratar anomalías asociadas con
deficiencias en linajes celulares hematopoyéticos. Ejemplos de
dianas para tales tratamientos incluyen la exposición in vivo
o in vitro de células derivadas mesodérmicamente no
diferenciadas a un compuesto de la invención. Los ejemplos de
células diana incluyen células madre de médula ósea, células
progenitoras y células de sangre de cordón. Estas células pueden
aislarse de un sujeto y almacenarse en un banco de células para su
uso posterior, o las células pueden aislarse poco antes y mantenerse
in vitro en un medio de cultivo. La exposición de tales
células al compuesto da como resultado la potenciación de la
proliferación y/o diferenciación de las células, implantándose las
células estimuladas en el mismo sujeto o uno diferente del que se
derivaron las células, por medio de tecnología de trasplante. Como
alternativa, puede accederse a células derivadas mesodérmicamente
no diferenciadas en el embrión o adulto in vivo mediante
cualquiera de las diversas rutas incluyendo: vías oral, intradérmica
subcutánea, transmucosa, intramuscular o intravenosa.
El procedimiento de la invención puede usarse
para tratar sujetos (embrión o adulto) que padece anomalías
sanguíneas. Éstas pueden surgir de lesiones genéticas, efectos
secundarios de tratamientos terapéuticos tales como radiación y
quimioterapia para el cáncer o de una enfermedad provocada por
agentes infecciosos tales como virus de la deficiencia inmunitaria
humana y puede tratarse usando un procedimiento y compuestos que
estimulan la hematopoyesis. Las consecuencias de tales anomalías si
no se tratan son diversas formas de anemia (asociada con niveles
anómalamente bajos de eritrocitos). Los ejemplos de anemias
incluyen: anemia aplásica (idiopática, formas constitutivas o
formas secundarias): anemia mielodisplásica; anemia en pacientes con
carcinoma metastásico o necrotizante; enfermedad de Hodgkin;
linfoma maligno; anemia de enfermedad hepática crónica; anemia de
enfermedad renal crónica (fallo renal); anemia de trastornos
endocrinos; aplasia de glóbulos rojos; idiopática o asociada con
otros trastornos, anemia debida a enfermedad inflamatoria crónica; y
trombocitopenia de muchas etiologías. Además, la estimulación de la
hematopoyesis es beneficiosa en el tratamiento de leucopenias (por
ejemplo, leucemia y SIDA).
Según una realización de la invención, se
propone además un compuesto para tratar la formación anómala de
vasos sanguíneos (hipervascularización) que resulta de enfermedades
genéticas, enfermedad degenerativa crónica, envejecimiento,
traumatismo o agentes infecciosos. Los ejemplos incluyen úlceras
crónicas diabéticas, quemaduras, congelación, acontecimientos
isquémicos tras accidente cerebrovascular y trasplante. Los
compuestos de la invención pueden usarse en el adulto para la
inducción de la revascularización o formación de vasos colaterales
en miocardio isquémico o extremidades isquémicas, y en derivaciones
arteriales coronarias y en promover la cicatrización de heridas en
general. Por ejemplo, los compuestos de la invención pueden usarse
en el tratamiento de úlceras duodenales potenciando la densidad de
microvasos y promoviendo una cicatrización más rápida. Además, los
compuestos de la invención pueden usarse para corregir trastornos de
desarrollo en el embrión (como se definió anteriormente) provocados
por anomalías en el crecimiento vascular.
Según una realización de la invención, se
proporcionan compuestos para inhibir la hematopoyesis en sujetos
que padecen un exceso de producción de eritrocitos por ejemplo
policitemia verdadera y eritroleucemia u otros tumores
hematopoyéticos.
De manera similar, se proporcionan compuestos
para inhibir el crecimiento vascular en sujetos que padecen un
exceso de vascularización o neovascularización como se encuentra,
por ejemplo, en una variedad de tumores sólidos tales como cáncer
de mama, hemangiomas en la infancia, neovascularización ocular
asociada con diabetes, trastornos hemorrágicos del aparato
reproductor femenino y ciertas formas de artritis.
Las células eritroides individuales formadas
durante la embriogénesis temprana pueden identificarse controlando
la expresión de \varepsilon-globina. Los
inventores desarrollaron vectores de
\varepsilon-globina/LacZ novedosos para la
expresión de transgenes a partir de los cuales los inventores
obtuvieron datos histoquímicos detallados, así como datos sobre la
especificidad de expresión a nivel de la célula individual acerca de
la hematopoyesis y el crecimiento vascular. Puesto que el transgén
\varepsilon-globina/LacZ se expresa sólo en
células eritroides primitivas en embriones de ratón (saco vitelino e
hígado fetal), estos ratones sirven como diana ideal para la
manipulación farmacológica o el examen de los efectos de
sobreexpresar o desactivar otros genes que podrían afectar a la
hematopoyesis embrionaria (que es principalmente eritroide). Por
ejemplo, ratones transgénicos que sobreexpresan un gen de interés
pueden cruzarse con una de las líneas transgénicas descritas
anteriormente (convertida en homocigota de modo que toda la progenie
lleve el indicador lacZ) y puede medirse el efecto sobre la
hematopoyesis embrionaria mediante la tinción de LacZ. El análisis
cuantitativo de la expresión en lisados tisulares se realizó usando
los procedimientos descritos por Wassarman, et al., Guide
to Techniques in Mouse Development (San Diego: Academic Press, Inc.,
1993); Herbomel, et al., Cell 39 (1984),
653-62). Como alternativa, los ratones que
portan mutaciones dirigidas (mutaciones nulas u otras mutaciones
más sutiles) pueden cruzarse con nuestros ratones transgénicos y
pueden evaluarse los efectos de las mutaciones sobre la
hematopoyesis embrionaria. Por tanto, este ensayo in vivo es
una herramienta poderosa para evaluar los efectos de los productos
génicos sobre la hematopoyesis embrionaria.
Los inventores han diseñado el transgén en
asociación con un gen indicador para proporcionar un ensayo
enzimático sensible para determinar la expresión. Por consiguiente,
los inventores insertaron el gen indicador de
\beta-galactosidasa (LacZ) en un vector en el
sentido de 3' de varios elementos reguladores asociados con la
transcripción del gen de hemoglobina tipo \beta embrionaria
humana (\varepsilon-globina) (figura 1). Más
adelante se facilitan ejemplos de constructos de transgén usados
para seguir el desarrollo de las células sanguíneas. Estos
constructos son ilustrativos del procedimiento del ensayo que no es
necesario que se limite únicamente a esos constructos, sino que
puede utilizar otros transgenes y otros genes indicadores en otros
constructos de vectores.
Se generaron varios constructos transgénicos
diferentes que contenían un "micro-LCR" (una
versión truncada de secuencias reguladoras ubicadas lejos en el
sentido de 5' del locus del gen de \beta-globina,
ref. Forrester et al., 1989) más: el promotor mínimo
de \varepsilon-globina solo (constructo 1); la
región reguladora en el sentido de 5' hasta -849 (constructo 2); la
región reguladora en el sentido de 5' hasta -2025 (constructo 3);
el promotor mínimo dirigido por la combinación
\varepsilon-PRE II + V (constructo 4)
(Trepicchio, et al., Mol. Cell. Biol., 13 (1993),
7457-7468). Se insertó el gen de la
\beta-galactosidasa procariota (LacZ), junto con
un oligonucleótido corto (SDK) que contiene una secuencia consenso
Kozak (Ravid et al.), entre el promotor mínimo y parte del
segundo intrón del gen de \varepsilon-globina,
delecionando las secuencias de E-globina entre +20
y +473. Para cada constructo, se obtuvieron 8-10
individuos fundadores (transgenicidad del
14-21%).
Este fue el "casete básico" y se creó
usando una serie de etapas de clonación.
En primer lugar, se generó MHB135 mediante
acoplamiento de tres vías entre un fragmento de ClaI/EcoRI que
contenía el gen de la \varepsilon-globina humana
desde -849 hasta +1746, un fragmento de EcoRI/HindIII de 2,5 kb que
contenía un \muLCR modificado (Trepicchio, William L., et
al., Molecular and Cellular Biology, Vol. 13, N.º 12, págs.
7457-7468, (1993)), y un derivado digerido por
ClaI/HindIII de SP73 (Promega) en el que el sitio de XhoI se ha
destruido por la digestión de XhoI, la reacción con el fragmento
Klenow de la ADN polimerasa, y luego el acoplamiento de extremos
romos. Entonces se insertó un conector KpnI en el sitio de EcoRV de
MHB 135 para crear MHB 135K. Se subclonó un fragmento de BamHI/XhoI
de pUC\varepsilonx (Baron, et al., Cell, 46 (1986),
591-602.) que contenía el promotor mínimo de gen
de la \varepsilon-globina desde -179 hasta +20 en
SP73 digerido por BamHI/XhoI (Promega), luego se escindió mediante
digestión con KpnI y XhoI y se acopló en el fragmento de la
estructura principal de MHB 135K digerido por KpnI/XhoI para dar
MB42.
Se modificó MB42 mediante la inserción de un
conector NotI en el sitio de HindIII usando procedimientos
convencionales (Sambrook, et al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual (Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 1989); esta etapa introdujo un único sitio de NotI en el
extremo del \muLCR, dando MB60.
A continuación se generó MB59 como sigue. El
fragmento de Xbal/PstI LacZ de -3,1 kb de pSDKlacZpA (REF) se
subclonó en SP73 para dar SP731acZ. Se escindió la parte de 3' del
gen de la \varepsilon-globina humana desde +474
hasta +1746 como un fragmento de BamHI/EcoRI de pUC\varepsilonx y
se ligaron los extremos romos en el sitio de BamHI de extremos
romos de SP731acZ para dar MB59. A continuación se destruyó el sitio
de KpnI de MB59 mediante tratamiento con ADN polimerasa de T4 y
relegación, dando MB 69. Finalmente, se acopló la estructura
principal por XhoI/EcoRI de MB60 a un fragmento que contenía LacZ y
se obtuvieron las secuencias en 3' de
\varepsilon-globina mediante digestión parcial con
EcoRI y luego con XhoI de MB69. Este producto final, MB70, fue el
constructo básico, -179lacZ\varepsilon\muLCR.
Se aisló la región en el sentido de 5' de
\varepsilon-globina desde -849 hasta +20 como un
fragmento de BgIII/XhoI de MHB 135 y se subclonó en la estructura
principal de MB70 digerida con BgIII/XhoI para dar
-849lacZ\varepsilon\muLCR, denominado MB73.
Se escindió un fragmento de 2 kb que contenía la
región en el sentido de 5' de \varepsilon-globina
desde -2025 hasta +20 de MB 16-3 mediante digestión
con KpnI y XhoI y se conectó en el fragmento de estructura principal
de MB70-3 digerido con Kpn/XhoI
(-18llacZ\varepsilon\muLCR, véase anteriormente) para generar -
2 kblacZE\muLCR (MB92).
MB 16-3 se generó tal como
sigue. Se aisló la región en el sentido de 5' de
\varepsilon-globina de 2 kb de pUC\varepsilonx
(Baron y Maniatis, 1986) digiriendo con EcoRI, obteniendo extremos
romos con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa, y luego
digiriendo con XhoI. Entonces se conectó en MHB 135K digerido con
KpnI/XhoI (véase anteriormente).
Este vector se generó acoplando el fragmento de
BgIII/BamHI del constructo 6 de la figura 4 de la ref.
(Trepicchio et al., 1993) en el sitio de BamHI del
constructo básico, MB70.
Para la microinyección en embriones, se
digirieron ADN de plásmido con enzimas de restricción KpnI/NotI
(figura 1) y las partes eucariotas se purificaron usando
procedimientos convencionales (Hogan et al., 1994). Se
microinyectó a los embriones en la fase unicelular las muestras de
ADN y luego se implantaron en madres adoptivas, usando
procedimientos convencionales (Hogan et al., 1994). Se
usó una cepa de ratón no consanguínea (CD-1) para la
generación de ratones transgénicos y ha servido como fuente de
donantes de embriones, machos sementales, hembras pseudopreñadas,
machos sometidos a vasectomía y hembras maduras para reproducción.
Se obtuvo el genotipo de biopsias de la cola mediante transferencia
de tipo Southern (usando varias sondas diferentes, de nuevo mediante
procedimientos convencionales) o PCR (véase más adelante). El
análisis de transferencia de tipo Southern también se usó para
confirmar que ni transposiciones, ni duplicaciones ni deleciones
acompañaban a la integración genómica del transgén. Los individuos
fundadores se cruzaron para obtener machos transgénicos (machos
CD-1 transgénicos heterocigotos) que se aparearon
con hembras CD-1 normales para producir embriones o
animales adultos para el análisis de la expresión de LacZ (véase la
figura 2). Se sacrificaron las hembras preñadas en los momentos
indicados en la figura (a mediodía el día de la observación del
tapón vaginal se consideró 0,5 días post-coito
(dpc)). Los embriones se diseccionaron, se fijaron y se tiñeron con
XGal. Para el análisis de la expresión del transgén en los
embriones de ratón por fases, se siguió la actividad enzimática de
\beta-gal mediante la tinción de embriones
completos usando un procedimiento convencional (Wassarman y
DePamphilis, 1993).
Se preparó ADN genómico a partir de cortes de
los dedos de crías de 10 días de edad o a partir de biopsias de la
cola de crías de 3 semanas de edad. Los cortes de los dedos se
añadieron a 20 \mul de tampón de extracción de ADN
(Tris-HCl 50 mM, pH 8, NaCl 20 mM, EDTA 1 mM, SDS al
1%) que contenía proteasa K (1 mg/ml) y se incubaron durante 1 h a
55ºC con agitación mediante vórtex tras los primeros 30 min.
Entonces se diluyeron las muestras con 200 \mul de agua, se
hirvieron durante 10 min. y microcentrifugaron durante 20 min. Se
preparó ADN genómico de biopsias de la cola mediante un
procedimiento convencional (Hogan et al., 1994). Se
llevó a cabo PCR usando 0,4 \mul de ADN genómico (de dedo o de
cola) en una reacción de 50 \mul que contenía 1X tampón G (kit
PCR Optimizer, Invitrogen) y U.I. de Ampli-Taq
polimerasa (Perkin-Elmer). Se llevó a cabo la
amplificación durante 32 ciclos de desnaturalización a 94ºC (1
minuto), reasociando a 55ºC (1 minuto) y extensión a 72ºC (1
minuto) seguido por una extensión final de 6 min., a 72ºC y dio como
resultado un producto de 408 pb. Una parte (10-15
\mul) de la reacción se analizó en un gel de agarosa al 2% en 1X
Tris-borato-EDTA (Sambrook et
al., 1989). Las secuencias de los cebadores de amplificación
fueron:
\vskip1.000000\baselineskip
5' H\varepsilon: 5'-ATG GAT
CCA GCA CAC ATT A -3' (corresponde a de -179 a -165 del gen de
H\varepsilon-globina)
3' LacZ: 5'-TCG CCA TTC AGG CTG
CG -3' (corresponde a de +154 a +170 de LacZ)
\vskip1.000000\baselineskip
La expresión de LacZ pudo detectarse ya a los
7,5 días post-coito (dpc) (es decir, aproximadamente
el tiempo en el que se observan por primera vez islotes sanguíneos
en el saco vitelino), en el patrón de "anillos" esperado a
nivel del exoceloma (figura 2A). Hacia los 8,5 dpc, se observó
tinción de eritroblastos primitivos dentro de los canales
vasculares del saco vitelino (figura 2B). Dentro del embrión
propiamente dicho, se observó un pequeño número de eritroblastos
primitivos con tinción de LacZ (figura 2B(c)). Hacia el día
12,5, el momento en el que la expresión del gen de
\varepsilon-globina de ratón alcanza un máximo, se
observaron células eritroides primitivas con tinción de LacZ dentro
de los vasos sanguíneos del saco vitelino (figura 2C). Los
inventores han teñido la sangre embrionaria directamente para
verificar que estas células expresaban LacZ.
Los ratones que portaban MB 70, MB72 o MB73
expresaban LacZ en las células eritroides primitivas del saco
vitelino y también en el hígado fetal a los 16,5 dpc. Los ratones
transgénicos para MB 70 y MB 73 no expresaban LacZ en tejidos
adultos. En contraposición, en ausencia de elementos reguladores
negativos en el sentido de 5' del promotor, los ratones
transgénicos con MB72 también expresaban LacZ en células eritroides
adultas.
Por tanto, MB 72 puede usarse para estudiar la
inducción farmacológica de anemias o policitemia en animales
adultos. Estos ratones también pueden cruzarse con otros ratones
transgénicos o deficientes para examinar los efectos sobre la
eritropoyesis en adultos de sobreexpresar o desactivar otros genes.
Los ejemplos de enfermedades que pueden estudiarse usando estos
ratones (tras aparearse con otros ratones que portan mutaciones
apropiadas) incluyen anemia falciforme y talasemias (por ejemplo,
Skow, L.C., et al., Cell, Vol. 34, págs.
1043-1052, (1983); Ciavatta, D.J., et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 92, págs.
9259-9263, (1995)).
Con respecto a la expresión en el saco vitelino,
las células eritroides primitivas fueron positivas para LacZ en
ratones con MB 92, de manera similar a lo detectado para ratones que
portan cualquiera de los otros tres constructos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se han reproducido ratones transgénicos para
obtener un indicador LacZ conectado a una de varias secuencias
reguladoras en el sentido de 5' de la
\beta-globina embrionaria humana (figura 1) hasta
obtener la homocigosidad. Estos animales sirven como fuente de
embriones marcados en los que el transgén se expresa sólo en células
eritroides primitivas (figura 2).
El cultivo de explante de embrión: Se aislaron
embriones de los ratones transgénicos del ejemplo 1 entorno al
comienzo de la gastrulación a los 6,25-6,5 dpc antes
de la formación del mesodermo hematopoyético y se mantuvieron
individualmente en las cámaras de un portaobjetos de 8 pocillos
(Costar) o en los pocillos de una placa de 24 pocillos (Costar) o
en pocillos individuales de placas de Terasaki (Nunc) o en los
pocillos de una placa de 4 pocillos durante 48-72
h. Entonces se fijaron los embriones y se tiñeron con XGal usando
un protocolo convencional (Wasserman, P. M. y Melvin L. DePamphilis,
eds., Guide to Techniques in Mouse Development, Vol. 225, págs.
461-463. 1993) para controlar la generación de
eritroblastos primitivos. Se cultivaron embriones completos o bien
en medio que contenía suero o bien en medio definido químicamente
(CDM) para determinar islotes sanguíneos positivos para LacZ. El
CDM fue similar al usado por (Johansson y Wiles, 1995) excepto en
que se añadieron penicilina (1.000 U/ml), estreptomicina (1.000
\mug/ml) y Hepes pH 7,4 (20 mM).
Separación del endodermo visceral del
epiblasto: Se separaron enzimáticamente embriones en la fase de
pre-estría a estría temprana (Farrington, S. M.,
et al., Mechanisms of Development, Vol. 62, págs.
197-211, (1997)) en componentes del ectodermo
(epiblasto) y el endodermo visceral usando tripsina/pancreatina (de
15 s a 2 min.) usando una técnica convencional (Hogan et
al., 1994). Se encontró que la contaminación cruzada tisular
durante este procedimiento era insignificante (Farrington et
al. 1997). Se cultivaron epiblastos o embriones completos
individualmente. La figura 2a representa el epiblasto que es un
descendiente de la masa celular interna del blastocisto, del que se
derivan las células ES.
- (a)
- Aunque los islotes sanguíneos positivos para LacZ se detectaron fácilmente en cultivos de embriones completos, se observó poca o ninguna tinción de LacZ en cultivos de epiblasto, o bien en el medio definido químicamente (CDM) o en el medio de Eagle modificado por Dulbecco (GIBCO-BRL) que contiene un 30% de suero bovino fetal inactivado por calor (56ºC, 30 min.) (HyClone). Estos resultados demuestran que el mesodermo no puede dar lugar por sí mismo a hematopoyesis embrionaria, sino que requiere el contacto con o señales liberadas del endodermo visceral. En contraposición, los epiblastos tomados de embriones posteriores (de 6,75 dpc a 7,5 dpc) sí forman islotes sanguíneos tras 48 horas en cultivo, presumiblemente debido a que las células mesodérmicas presentes en esta fase ya habrán recibido señales del endodermo visceral.
- (b)
- Experimentos de recombinación: Se recombinaron epiblastos con endodermo visceral en geles de colágeno (colágeno de cola de rata de tipo I, Collaborative Biomedical Products). El colágeno se preparó según las instrucciones del fabricante. Se dejó que una gota de colágeno de 10 \mul solidificara en la superficie de plástico; entonces se yuxtapusieron los tejidos en una pequeña depresión creada usando pinzas de relojero y después se cubrieron con 1 \mul de colágeno para mantenerlos en su sitio. Como alternativa, los tejidos se expulsaron suavemente en una gota de colágeno de 5 \mul y se yuxtapusieron para permitir el contacto físico; entonces se permitió que el colágeno solidificara. Tras 10 min., se añadió medio de cultivo de explante (DME complementado con FBS al 30% (inactivado por calor a 56ºC, 30 min.), glutamina 2 mM, Hepes 10 mM pH 7,4, \alpha-metil-tioglicerol 68 \muM, penicilina (1.000 U/ml) y estreptomicina (1.000 \mug/ml) al pocillo (0,5 ml para placas de 24 pocillos, menos para los pocillos más pequeños). Se manipularon los fragmentos de embrión usando una pipeta Pasteur larga. Todos los cultivos se mantuvieron a 37ºC y un 5% de CO_{2}. Se cambió el medio tras un día. Se recogió el ARN tras 3 días usando el procedimiento a pequeña escala de (Chomezynski, P., et al., Anal. Biochem, Vol 162, págs. 156-159, (1987)) y se analizó para determinar la expresión génica de globina embrionaria mediante RT-PCR (Farrington et al., 1997). Estos experimentos demostraron la activación de la expresión génica de globina cuando los epiblastos se recombinaron con endodermo visceral y, por tanto, se estableció una necesidad de endodermo visceral en la inducción de hematopoyesis durante la gastrulación (figuras 7, 8-1).
- (c)
- Activación de eritropoyesis primitiva mediante un factor difusible en células de endodermo visceral: Se hizo crecer END-2 (Mummery et al., Dev. Biol., 109 (1985), 402-410), una línea celular derivada de endodermo visceral, hasta la confluencia en DME que contenía un 15% de suero bovino fetal (FBS). Las células se tripsinizaron, se resuspendieron en 5 ml de DME que contenía un 30% de FBS (DME-30) y se irradiaron con rayos gamma (6000 rad) usando una fuente de ^{137}Cs. Se pipetearon las células para disolver los agrupamientos y luego se añadieron a 15 ml adicionales de DME-30 en una placa de 10 cm. Se permitió que las células se acondicionaran al medio durante 3 días a 37ºC (5%) de CO_{2}. Se recogió el medio, se extrajeron las células residuales mediante centrifugación durante 10 min. a 1500 rpm y luego se esterilizó el sobrenadante usando un filtro de 0,2 mm. El medio acondicionado (CM) resultante se almacenó en alícuotas a -80ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se incubaron epiblastos con (+) o sin (-) CM. La
mayoría de los epiblastos cultivados sin CM no pudieron activar un
marcador de eritropoyesis primitiva (el gen de
\varepsilon-globina), mientras que la mayoría de
los epiblastos cultivados en presencia de CM sí activaron el gen.
Estos resultados sugieren que el contacto
célula-célula no es esencial para la estimulación
de la hematopoyesis por el endodermo visceral, sino que el efecto
está mediado por uno o más factores difusibles. El asterisco en la
figura 10 indica un producto de amplificación artefactual.
Los resultados muestran que para los embriones
completos no tratados, 6/6 producían globina. En contraposición, de
8 epiblastos no tratados, sólo 1 mostró alguna expresión detectable.
Cuando se añadió medio acondicionado, 8/10 cultivos de epiblastos
expresaron globina.
Se llevó a cabo la hibridación in situ de
embriones completos como en Wilkinson y Nieto, 1993, usando BM
Purple (Boehringer Mannheim) como sustrato para la detección de la
fosfatasa alcalina. La sonda usada es la sonda de
\varepsilon-globina de ratón. Se preparó la
ribosonda marcada con digoxigenina mediante la transcripción con
polimerasa de T7 de un molde de ADN linealizado con EcoRI denominado
SP73 mERB, usando un procedimiento convencional (Wilkinson y Green,
Postimplantation Mouse Embryos: A Practical Approach. Ed. A. Copp.
Oxford: IRL Press, 1990). Se generó SP73 mERB mediante acoplamiento
del fragmento de EcoRI-BamHI del gen de
\varepsilon-globina de ratón (Baron y Maniatis,
1986) desde +187 hasta +439. Este fragmento contiene una pequeña
región del primer intrón y la mayor parte del segundo exón de este
gen. Los resultados de la hibridación in situ en los
embriones completos para determinar el momento en que podía
detectarse la hematopoyesis en los ratones de tipo natural se
muestra en la figura 5.
Se usó el protocolo de RT-PCR
Multiplex para medir la inducción de hematopoyesis porque es un
ensayo más sensible y cuantitativo para la inducción de
hematopoyesis que la tinción con XGal. También es más versátil que
la tinción con XGal porque permite el análisis de la expresión de
una variedad de genes en un tejido. El material de partida para
esta técnica es el ARN. Se prepararon cebadores de oligonucleótidos.
En la tabla 1 se facilitan ejemplos de cebadores. El ARN total se
preparó mediante extracción con
guanidinio-ácido-fenol (Chomczynski, et
al. (1987)) a partir de tejidos de embriones individuales
(muestras de 6,25 dpc a 6,5 dpc).
Se realizó la transcripción inversa del ARN
total con la transcriptasa inversa de VMA (virus de la
mieloblastosis aviar) (Life Sciences, Inc.) mediante procedimientos
convencionales, usando un cebador de oligo(dT) (Sambrook
et al., 1989). Se realizó la PCR Multiplex en una
reacción de 15 \mul que contenía 5 pmoles de cebadores de
\beta-actina (como patrón interno), 10- 45 pmoles
de cebadores del gen de prueba y una cantidad traza de
[\alpha-^{32}P]-dCTP para
permitir la detección de productos de amplificación mediante
autorradiografía tras electroforesis en gel de poliacrilamida. En
la tabla 1 se describen los cebadores usados para la PCR. Las
cantidades de ADNc de entrada se normalizaron para la expresión de
\beta-actina. En cada caso se determinó
empíricamente el número de ciclos y las cantidades de cebador y ADNc
molde que produjeron amplificación sin saturación.
No se detectó la expresión del gen de la globina
(\varepsilon) de tipo \beta embrionaria en los epiblastos o
embriones completos de 6,5 dpc aislados a de 6,25 dpc a 6,5 dpc.
Tras 72 h en cultivo, se activó el gen de
\varepsilon-globina en embriones completos, pero
en epiblastos aislados pudo detectarse poca o ninguna transcripción
de \varepsilon-globina (figuras 7, 8). Esto
demostró que la hematopoyesis embrionaria no era autónoma con
respecto al mesodermo y que la inducción de la expresión del gen de
la globina embrionaria se producía en presencia de endodermo
visceral. Este efecto era compatible con una necesidad del endodermo
visceral de inducción de expresión del gen de la globina
embrionaria. (El efecto observado podía distinguirse fácilmente del
efecto pronosticado de acontecimientos aleatorios que resultan de
variaciones en el desarrollo del embrión en una camada en la que
epiblastos aislados en una fase más avanzada de desarrollo en el
momento en que se recogió el embrión pueden proporcionar bajos
niveles de expresión del gen de la globina).
Se recogieron embriones en gastrulación
individuales en fase tardía (aproximadamente de 6,75 dpc) y se
eliminó el endodermo visceral circundante. En ese momento, el
epiblasto ya ha recibido señales del endodermo visceral y ha
desarrollado la capacidad de formar sangre. Sin embargo, esta
capacidad parece ubicarse en este momento en la región posterior
del epiblasto. Los inventores han demostrado en el presente
documento que la región anterior conserva su dependencia del
endodermo visceral extraembrionario. Se eliminó enzimáticamente el
endodermo visceral tal como describen Farrington et al.
(1997) y se eliminó mediante disección el ectodermo
extraembrionario. Se realizó una transección del epiblasto
(ectodermo embrionario) en secciones anterior y posterior y se
incubaron por separado durante 3 días. La sección posterior sección
se identificó partiendo de la base de marcas morfológicas tales
como la estría primitiva (epiblasto posterior), como describen
Downs et al. Development, vol. 118 (1993)
1255-1266 (figura 15). Los resultados se
muestran en las figuras 5 y 16-1,
16-2, 16-3 y 16-4 y
se discuten más adelante.
Usando RT-PCR como se describió
anteriormente se observó poca o ninguna expresión de
\varepsilon-globina en la parte anterior del
embrión y no pudo observarse histológicamente el desarrollo de
sangre. En contraposición, la sección posterior formó sangre
incluso en ausencia del endodermo visceral, a niveles comparables
con los de un embrión intacto (mostrado como control). Los
controles incluyeron (i) una reacción de PCR llevada a cabo en
ausencia de molde de ADNc; (-ADNc), (ii) incubaciones de ARN
llevadas a cabo usando un cóctel de transcripción inversa sin
transcriptasa inversa (ant (-RT), post (-RT), Farrington et
al, 1997). En este experimento, la actina se amplificó
durante 18 ciclos y la globina se amplificó durante 23 ciclos.
- (a)
- Se cultivaron cuatro partes de epiblasto anteriores y cuatro posteriores de embriones en fase de estría primitiva tardía individualmente en ausencia de endodermo visceral. Tal como se observa en el experimento de la figura 2A, las partes posteriores pero no las anteriores de estos embriones en fase de gastrulación tardía pudieron formar sangre. En contraposición, cuando se cultivaron partes anteriores del epiblasto en gotas de colágeno con endodermo visceral, se reconstituyó la formación de sangre en 2 de 4 muestras (denominadas "recombs" en la figura). En este experimento, la actina se amplificó durante 21 ciclos y la globina se amplificó durante 26 ciclos.
- (b)
- Los inventores determinaron que la formación de sangre por el mesodermo requiere señales del endodermo visceral tal como sigue: se separó el endodermo visceral (VE) de ectodermos embrionarios (epiblastos) transgénicos (Tg) y se recombinó con VE no transgénico en gotitas de colágeno. En estos experimentos, la única fuente posible de células hematopoyéticas sería el epiblasto transgénico, pero no el VE no Tg. Los tejidos se cultivaron durante 3-4 días y luego se tiñeron con XGAL para identificar zonas de expresión de lacZ. Estos experimentos demostraron que la formación de sangre se reconstituía en presencia de tejido de VE. Además, la ubicación de las células sanguíneas en la zona inmediatamente alrededor del tejido de VE sugirió o bien que se requiere el contacto directo célula-célula o bien que está implicada una señalización de intervalo corto mediante moléculas difusibles (figura 8-1).
- (c)
- Los inventores determinaron que el endodermo visceral puede reprogramar el ectodermo embrionario anterior del epiblasto para expresar tanto marcadores endoteliales vasculares como hematopoyéticos tal como sigue: Se recombinó el epiblasto anterior con endodermo visceral, para obtener activación tanto de marcadores hematopoyéticos (\varepsilon-globina, GATA-1, CD-34) mostrados en la figura 16-2 como de marcadores endoteliales (PECAM-1, flk-1 y Vezf-1) mostrados en la figura 16-3. Estos marcadores se expresaban fuertemente en epiblastos posteriores cultivados aislados en la gastrulación de media a tardía (figura 16-2, carriles posteriores 6-10, y figura 16-3, carriles posteriores 6-10) y en embriones completos cultivados (emb+cx). Se detectó poca o ninguna expresión de estos marcadores en el endodermo visceral solo (figura 16-2, carriles anteriores 6-10; figura 16-4, carriles anteriores 6-10) o en embriones completos no cultivados (figura 16-2, emb (-cx); figura 16-3, emb (-cx)) de la misma fase de desarrollo. Estos experimentos demostraron que tanto el tejido hematopoyético como el vascular se inducían mediante señales del endodermo visceral y que las señales eran instructivas. Como control de la especificidad, no se detectó miosina cardiaca que se esperaba que se expresase en el tejido cardiaco (y, por tanto, sólo en una fase de desarrollo posterior, alrededor de los 7-8 dpc) (Lyons et al. 1990) en epiblastos anteriores o posteriores ni en recombinantes durante los primeros 3 días en cultivo (figura 16-2, carriles 3-17) pero se detectó en un control embrionario de 10,5 dpc (figura 16-2, 16-3). Los cebadores en (5') y (3') de Vezf-1 dieron un producto de aproximadamente 700 pb. Vezf-1 es una proteína en dedo de cinc homóloga a una proteína humana denominada db-1 y se expresa en la vasculatura en desarrollo. Se demostró que se producía predominantemente en el epiblasto posterior y en los epiblastos recombinantes, pero no en los epiblastos anteriores (Figura 16-3).
Secuencias de cebadores:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon cultivos de blastocistos y se
usaron para analizar los efectos de compuestos sobre la estimulación
de células derivadas del mesodermo no diferenciadas que van a
experimentar hematopoyesis y vasculogénesis. El sistema de cultivo
de blastocistos descrito en este caso es adecuado para seguir el
desarrollo de estructuras embrionarias in vitro, tales como
el saco vitelino, que normalmente forman la
post-implantación in vivo. Los efectos de
las moléculas de señalización o factores de crecimiento añadidos de
manera exógena sobre el desarrollo se analizan en este caso en
condiciones definidas. Los blastocistos pueden obtenerse de ratones
de tipo natural, ratones transgénicos o ratones deficientes. La
hematopoyesis embrionaria en ratones deficientes se estudió usando
blastocistos mutantes nulos, obtenidos cruzando animales
heterocigotos. Estos blastocistos mutantes nulos se prefieren sobre
las células madre embrionarias (ES) mutantes nulas usadas en
ensayos de diferenciación in vitro (Keller, Current Opin.
Cell Biol., 7 (1995) 862-69) debido a su mayor
facilidad de aislamiento.
El ensayo de blastocistos se basa en la
recuperación de embriones de ratones en un momento anterior a la
implantación del embrión en el útero de la madre aproximadamente a
los 4,5 dpc. En este caso, los blastocistos se obtuvieron de (a)
ratones transgénicos con \varepsilon-globina/LacZ
preparados según el ejemplo 1 y analizados mediante tinción de Lac
Z; y (b) ratones no transgénicos o ratones deficientes en los que
los blastocistos individuales se analizaron a nivel molecular para
determinar la expresión de múltiples genes mediante
RT-PCR.
Se recogieron los blastocistos a de 3,25 dpc a
3,5 dpc como describe Robertson, Teratocarcinomas and Embryonic
Stem Cells: A Practical Approach. Oxford: IRL Press, 1993. Los
inventores han cultivado satisfactoriamente blastocistos de varias
variedades diferentes de ratón. En este ejemplo, se usaron ratones
CD-1. El procedimiento de cultivo se basó en el
procedimiento de Chen y Hsu (Chen, et al., Exp. Hemat, 7
(1979) 231-44). Sin embargo, no se usaron
hembras superovuladas. Tras la recogida, se eliminaron de los
blastocistos mediante lavado las células sanguíneas maternas
contaminantes mediante de dos a tres transferencias secuenciales en
cultivos en gota en aceite mineral (Robertson, págs. 471- 478, ed
IRL Press 1987) y se transfirieron a placas de cultivo tisular de
plástico de 35 mm no tratadas o a los pocillos de una placa de 24
pocillos. Los blastocistos se adhirieron al plástico, se
reorganizaron y crecieron. Los blastocistos se cultivaron
individualmente (en pocillos de placas de 24 pocillos) o en grupos
(placas de 35 mm o placas de 24 pocillos) de hasta 20, en medio
CMRL-10 durante las primeras 48 h y luego en
CMRL-20 durante hasta 10 días a 37ºC y un 5% de
CO_{2}, CMRL-10 era medio CMRL1066
(GIBCO-BRL) que contenía un 10% de suero bovino
fetal inactivado por calor, penicilina (2.000 U/ml), estreptomicina
(2.000 \mug/ml), glutamina 2 mM, piruvato 1 mM, aminoácidos no
esenciales 0,1 mM (GIBCO-BRL) y
\beta-mercaptoetanol 10^{-4} M. Pudieron
observarse en primer lugar estructuras de tipo saco aproximadamente
a los 7 días en cultivo; hacia los 9-10 días se
habían agrandado hasta el punto en el que eran fácilmente visibles
a simple vista (0,5-2 mm de diámetro). Estas
estructuras de tipo saco (denominadas en el presente documento
"blastosacos") se parecen mucho a los sacos vitelinos murinos
tempranos.
Los blastosacos transgénicos se tiñeron
in situ para determinar la expresión de LacZ usando
procedimientos convencionales (Wassarman y DePamphilis, 1993). Para
el análisis mediante RT-PCR, se transfirieron
blastosacos individuales a tubos eppendorf usando una pipeta
pipetman P200 y se sometieron a microcentrifugación durante 10 min.
a 4ºC. Se aspiró el medio y se aisló el ARN de los sedimentos
tisulares (Chomczynski et al. 1987). Una parte (de 5
a 8 \mul de 25 \mul) del ARN se usó para la síntesis del ADNc
(Farrington et al., 1997). De 0,5 a 2 \mul de ARN se
amplificaron mediante PCR en 50 \mul tal como describe
(Farrington et al., 1997). En las figuras 4, las
muestras se sometieron a 35 ciclos de amplificación y después se
analizaron 10 \mul de la mezcla de reacción mediante
electroforesis a través de un gel de agarosa al 2% que contenía
bromuro de etidio.
Anteriormente se han descrito los cebadores de
PCR GATA-1 de ratón y actina (Baron et
al., Molecular and Cellular Biology, vol 14, (1994) págs.
3108-3114). El resto de los cebadores se usó a
una temperatura de reasociación de 55ºC. El tamaño de los cebadores
fue: \varepsilon-globina de ratón, 487 pb;
NF-E2 de ratón, 257 pb; EKLF de ratón, 129 pb;
PTH/receptor de PTHrP, 279 pb; PTHrP, 421 pb. Las secuencias de los
cebadores fueron:
Me directo: 5'-GGA AAA AAC CCT
CAT CAA TG-3'
Me inverso: 5'-ATT CAT GTG CAG
AGA GGA GGC ATA -3'
mNF-E2 directo:
5'-cga CTA GTT CGG GAC ATC CG-3'
(las letras minúsculas indican un sitio de SpeI)
mNF-E2 inverso:
5'-atg gta ccG TAC ATA TTC CTC TGG
TG-3' (las letras minusculas, un sitio de KpnI)
EKLF directo: 5'-cga cta GTG GCG
GTC TGA GGA GAC-3' (las letras minúsculas, un sitio
de Spel)
EKLF inverso: 5'-atg gta ccA CGC
ACA GGT CAC GT-3' (las letras minúsculas, un sitio
de KpnI)
\vskip1.000000\baselineskip
Se identificó tejido hemoglobinizado en estos
"blastosacos" tras la tinción con bencidina (figura 3b). La
tinción con bencidina corresponde a la presencia de hemoglobina en
las células eritroides. Esto se confirmó analizando embriones de
ratones transgénicos. En estos ratones, se observó expresión de LacZ
sólo en eritroblastos primitivos, pero no en otros tipos de células
embrionarias. Se cultivaron los blastocistos transgénicos durante 9
días y luego se tiñeron con X-Gal. Como puede
observarse a partir de la figura 3C, las células eritroides
producidas en los blastosacos en desarrollo se revelan fácilmente
por su color azul tras la tinción. Tanto los blastosacos de tipo
natural como los derivados de líneas con marcador transgénico
parecen contener canales vasculares y se parecen a los sacos
vitelinos embrionarios tempranos (figura 3D) más que a los sacos
vitelinos tardíos con vasculatura bien desarrollada (compárese con
la figura 2). El procedimiento de cultivo descrito anteriormente
proporcionó blastosacos con una eficacia de entre el
40-80%.
Se usó RT-PCR para identificar
el patrón de expresión temporal de los marcadores del mesodermo y el
endodermo en los blastosacos en desarrollo y los efectos de
diferentes factores de crecimiento y componentes de la matriz
extracelular en la formación de diferentes tipos de células. Tal
como se muestra en la figura 4A, la globina embrionaria se produce
sólo cuando se forman estructuras de tipo saco vitelino, pero no si
los blastocistos no progresan en su desarrollo más allá de un
montón amorfo de células del trofectodermo.
Embriones mutantes nulos se analizaron
para determinar los efectos sobre la hematopoyesis y el crecimiento
vascular de mutaciones introducidas en la línea germinal del ratón
mediante transporte dirigido de genes. Se recogieron cultivos de
blastocisto a los 3,5 dpc de ratones deficientes en
Bmp-4 heterocigotos (Winnier, G., et al.,
Genes & Development, Vol. 9, págs. 2105-2116,
(1995)) que se cruzaron para dar lugar a crías mutantes nulas
homocigotas. Se incubaron los blastocistos en cultivo durante
periodos de tiempo variables (por ejemplo 9 días), tiempo tras el
cual, se extrajeron de la placa de cultivo los blastosacos
individuales para un análisis de RT-PCR, dejando el
tejido trofectodérmico. Este tejido se usó para determinar el
genotipo para establecer que los ratones transgénicos de los que se
derivan los blastocistos, eran homocigotos. También se usó
hibridación in situ de embriones completos e
inmunohistoquímica para identificar presuntos mutantes para las
mutaciones que dan como resultado una deficiencia grave en células
eritroides o endotelio.
"Cuerpos embrioides" mutantes nulos.
Los cuerpos embrioides son estructuras derivadas de células ES que
forman islotes sanguíneos en condiciones de cultivo apropiadas
(Keller (1995)). Los inventores han desarrollado un sistema
de ensayo usando cuerpos embrioides para demostrar que los cuerpos
embrioides mutantes nulos tales como Bmp-4, forman
poca o ninguna sangre, y que este defecto puede rescatarse mediante
la adición de una proteína recombinante exógena
(BMP-4). Las células ES usadas en este experimento
se derivaron de la sublínea TL-1. Sin embargo, las
condiciones de ensayo descritas a continuación son eficaces para
otras varias sublíneas de células ES. También son eficaces si las
células se han seleccionado para la independencia de las células
alimentadoras o se mantienen en las células alimentadoras (Joyner
(1195) Gene Targeting: A Practical Approach (New York: IRL Press).
Con mutaciones en genes seleccionados se rescataron mediante la
adición de un compuesto que es funcionalmente equivalente al
producto génico expresado por el gen no mutado.
Se formaron células ES que llevaban una mutación
nula en ambos alelos del gen Bmp-4 usando técnicas
convencionales (Joyner (1995) Gene Targeting: A Practical Approach.
(New York:IRL Press), Keller, Current Opin. Cell Biol. 7, (1995)
862-869; Orkin Current Opin. Cell Biol. 7 (1995)
870-877, Mortensen, Molec. Cell Biol. 12 (1995)
2391-2395). Estas células se sembraron en placa
aproximadamente a 2,5 x 10^{5} células en una placa de bacterias
de 6 cm que contenía 5 ml de IMDM/15% de suero (o bien suero
derivado de plasma o bien una mezcla 1:1 de PDS y suero bovino
fetal). No se encontró necesaria en este caso la adición de
factores de crecimiento exógenos tales como erirtropoyetina o
IL-3, pese a la existencia de una amplia
bibliografía que reivindica que son esenciales diferentes cócteles
de factores de crecimiento (por ejemplo Keller 1995). Tras 24 h,
las células ES habían formado agregados y éstos se resuspendieron
suavemente en el mismo medio y se sembraron en placa en
metilcelulosa al 0,8% en IMDM que contenía un 10% de suero con o
sin BMP-4 (recombinante humana, de Genetics
Institute; 2 ng/ml). La figura 17 (A) y (C) muestra las células
TL-1 de tipo natural (parentales) a bajo (A) y alto
(C) aumento. El 87% de los cuerpos embrioides procedentes de
células ES de tipo natural llegaron a hemoglobinizarse tras 10 días
(véase la tabla en la parte superior de la figura). En
contraposición, sólo el 4% de los cuerpos embrioides procedentes de
células ES mutantes nulas (B) llegaron a hemoglobinizarse. Cuando
se añadió BMP-4 a los cultivos (D), el número de
cuerpos embrioides aumentó hasta aproximadamente el 59%. Estos
resultados se confirmaron usando un ensayo de RT-PCR
semicuantitativa para la B-globina embrionaria
descrito anteriormente. Estos resultados muestran que la inhibición
de la hematopoyesis puede producirse como resultado de una mutación
en el gen de Bmp-4 y esta deficiencia puede
revertirse mediante la adición de la proteína BMP-4
exógena.
\vskip1.000000\baselineskip
- (a)
- Se demostró que una proteína hedgehog, tipificada por Sonic hedgehog, estimula la hematopoyesis en el mesodermo del epiblasto usando el procedimiento del ejemplo 2(A) (figura 9). Se diluyó la proteína SHH amino-terminal expresada en bacterias (Bumcrot et al., 1995) en Tris-HCl 20 mM pH 7,6, NaCl 250 mM, glicerol al 5% y DTT 1 mM hasta 1 \mug/\mul en albúmina sérica bovina 10 mg/ml (Stem Cells Technology). Se añadió la proteína SHH a diversas concentraciones (de 0,25 \mug/ml a 5 \mug/ml;) para explantar el medio de cultivo. Se cambió el medio tras un día y se aisló el ARN (Chomczynski y Sacchi, 1987) para el análisis de RT-PCR. La figura 9 muestra que la proteína SHH puede sustituirse por endodermo visceral de una manera dependiente de la dosis.
- (b)
- Los compuestos que son funcionalmente equivalentes a un producto génico expresado en un tejido extraembrionario de embrión (ejemplificado mediante la proteína hedgehog) estimulan la hematopoyesis y el crecimiento vascular de células mesodérmicas no diferenciadas (ejemplificado mediante células de médula ósea adultas).
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar si las proteínas hedgehog
recombinantes influyen en el desarrollo o la diferenciación de
células progenitoras o madre hematopoyéticas adultas, los
inventores llevaron a cabo ensayos de clonación in vitro. Se
sembraron en placa células mononucleares aisladas de médula ósea
murina en metilcelulosa tal como sigue:
Se lavó la médula ósea de fémures y tibias de 2
a 3 ratones ICR hembras, con edades comprendidas entre las 5 y las
6 semanas, mediante un procedimiento convencional (Lord, en
Haemopoiesis: A Practical Approach, págs. 1-53, ed.
Testa y Molineux, 1993 pub. Oxford University Press) y se
transfirió a 5 ml de medio alfa (GIBCO-BRL) que
contenía un 2% de suero bovino fetal (hyClone). Se aislaron células
mononucleares de las muestras reunidas mediante centrifugación en
un colchón de Ficoll (Accurate Chemical Co.) (Testa y Molineux,
1993) y se determinó el número de células usando un contador
Coulter. Se resuspendieron las células en medio modificado por
Dulbecco de Iscove (IMDM) a 3 x 10^{5}/ml y se sembraron en placa
en una mezcla de metilcelulosa (Fisher Scientific, 1,2%) en IMDM
que contenía suero bovino fetal (10%), albúmina sérica bovina
desionizada (BSA de calidad para cultivo celular, 1%),
2-mercaptoetanol (1x10 M) y los factores de
crecimiento y las proteínas hedgehog recombinantes indicados. La
eritropoyetina (Epo) humana recombinante se obtuvo de Amgen y se usó
a 40 U/ml. La interleuquina-3 recombinante
(IL-3) y el factor estimulador de colonias de
granulocitos/macrófagos (GM-CSF) se usaron a 50
U/ml cada uno. Se sembraron en placa partes (0,3 ml) de la mezcla de
metilcelulosa-células mononucleares en 3 pocillos
de cada una de dos placas de 4 pocillos (Nunc) para cada condición
de crecimiento sometida a prueba. El cuarto pocillo de cada placa
contenía dH_{2}O para mantener la humedad. Se incubaron los
cultivos en un 5% de CO_{2} a 37ºC durante aproximadamente 2
semanas y se anotaron los números de colonias en los días
indicados. Las colonias se anotaron como CFU-E,
BFU-E, mieloide o mixta. Cuando se incluyeron en los
cultivos, las proteínas hedgehog recombinantes se añadieron a
concentraciones entre 1 \mug/ml y 5 \mug/ml. Se añadió tampón
solo (fosfato de sodio 5 mM, pH 5,5, NaCl 150 mM, DTT 0,5 mM) a
algunos cultivos como control negativo. Para cada condición de
cultivo, se recopilaron datos de los recuentos de los 3 pocillos de
cada una de las dos placas (6 pocillos totales) +/- desviaciones
estándar.
Se sembraron en placa las células mononucleares
aisladas de la médula ósea en metilcelulosa que contenía factores
de crecimiento hematopoyéticos solos (eritropoyetina sola; o
GM-CSF + IL-3; o la combinación Epo
+ GM-CSF + IL-3) o complementada
con uno de péptido amino-terminal marcado con
histidina de SHH (SHH-HIS), un péptido
amino-terminal de SHH (SHH-N) o un
péptido amino-terminal marcado con histidina de IHH.
Los cultivos que contenían factores de crecimientos solos o
factores de crecimiento más tampón se usaron como controles
negativos.
En tres experimentos independientes, los números
de colonias de todos los tipos (eritroide: CFU-E,
BFU-E; mieloide: CFU-GM) aumentaron
en de -1,5 a más de 4 veces, de una manera dependiente de la dosis
(proteína hedgehog recombinante añadida a 1, 2,5, 5 \mug/ml, X
ug). La observación de que las proteínas hedgehog aparentemente no
son selectivas para el linaje eritroide frente al linaje mieloide
concuerda con la hipótesis de que estimulan el desarrollo de las
células progenitoras tempranas o madre. Las tres proteínas hedgehog
recombinantes estimularon la formación de colonias. A partir de
estos datos los inventores concluyeron que tanto SHH como IHH
potencian la proliferación, la diferenciación y/o la supervivencia
de las células progenitoras/madre hematopoyéticas in vitro,
incluso en presencia de uno o más factores de crecimiento
hematopoyéticos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo un ensayo de colonias de bazo de
CFU-S in vivo para células de repoblación de
la médula y multipotenciales inyectando una fuente de células
progenitoras/madre hematopoyéticas en ratones. Las colonias
macroscópicas formadas en el bazo tras 8-10 días
reflejaron la presencia de células progenitoras/madre (Testa y
Molineux, 1993). Como ocurre para el ensayo de células progenitoras
in vitro descrito anteriormente, la madurez de la colonia se
reflejó en el tiempo que tarda la colonia en desarrollarse: las
colonias de aparición temprana representaban más células
progenitoras maduras, mientras que las colonias de aparición tardía
representaban más células progenitoras primitivas.
En un experimento separado, poblaciones de
células progenitoras/madre de tejido hematopoyético murino y humano
se enriquecen mediante citometría de flujo (clasificación de células
activada por fluorescencia, FACS) o inmunoselección magnética
(Testa y Molineux, 1993) y su desarrollo se potencia en presencia de
la proteína hedgehog. Estas poblaciones resultantes se examinan
usando ensayos in vivo incluyendo el ensayo de
CFU-S (unidad formadora de colonias del bazo) y
cultivos de médula ósea a largo plazo. Un cultivo de médula ósea
típico incluye ensayos de repoblación competitivos y estudios de
trasplante de médula en serie (Morrison, et al., 1995a;
Morrison et al., 1995b).
\vskip1.000000\baselineskip
Se aislaron embriones completos de dos camadas
de ratones aproximadamente a los 6,5 dpc y se cultivaron
individualmente en ausencia de IgG exógena (ninguna) o en presencia
de IgG purificada (46 \mug/ml) (Ericson et al., Cell 87
(1996), 661-73). Se sometió a ensayo la
expresión de \varepsilon-globina embrionaria
mediante el procedimiento de RT-PCR
semicuantitativa. Los resultados se muestran en la figura 11. El
asterisco indica un producto amplificado artefactual. Tal como se
predijo en el experimento 3, la expresión de
\varepsilon-globina se redujo sustancialmente en
presencia del anticuerpo que bloquea SHH.
\vskip1.000000\baselineskip
Usando los procedimientos del ejemplo
2(b), los inventores demostraron que la expresión génica de
patched y Gli se producía de manera sustancialmente
exclusiva en el mesodermo del saco vitelino. (Figura 6). La
expresión enriquecida de Gli y patched en el
mesodermo del saco vitelino señala al mesodermo como la diana de la
señalización de hedgehog: Se separaron sacos vitelinos de embriones
de 10,5 dpc y 12,5 dpc en fracciones de endodermo (e) y mesodermo
(m) y se preparó el ARN tal como describen Farrington et
al (1997). Se llevaron a cabo análisis de
RT-PCR tal como se describió en el ejemplo 3
anterior usando los cebadores siguientes:
Gli-1 5': 5'-CAG
GGA AGA GAG CAG ACT GA-3' (de +465 a +484 de
secuencia)
Gli-1 3': 5'-AGC
TGA TGC AGC TGA TCC AG-3' (de +697 a +716 de
secuencia)
ptc 5': 5'-CTG CTG CTA TCC ATC
AGC GT-3' (de +3040 a +3059 de secuencia)
ptc 3': 5'-AAG AAG GAT AAG AGG
ACA GG-3' (de +3491 a +3472 de secuencia)
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó una temperatura de reasociación de 55ºC y
23 ciclos tanto para Gli como para ptc y 16 ciclos para actina (la
actina sirvió como control interno). Los productos amplificados
fueron de 252 pb (Gli) y 453 pb (ptc). Se encontró que tanto la
expresión de Gli como de ptc era sustancialmente exclusiva para la
fracción de mesodermo del saco vitelino.
\vskip1.000000\baselineskip
Usando los procedimientos del ejemplo
3(A) anterior, los inventores han demostrado usando
RT-PCR, que tanto Indian Hedgehog como
BMP-6 se expresan en el endodermo visceral
temprano. El embrión completo (6,5 dpc), los epiblastos, los
epiblastos más la proteína hedgehog, los epiblastos más la proteína
BMP-6 y los epiblastos más las proteínas hedgehog y
BMP-6; se examinan tras una incubación de 72 h para
determinar el grado de activación de la expresión de
\varepsilon-globina. El experimento se repite para
BMP-2, BMP-4 y
BMP-7. Los inventores esperan observar un efecto
potenciado cuando estén presentes tanto hedgehog como
BMP-4 en comparación con cualquiera de ellas
sola.
Claims (56)
1. Un procedimiento de estimulación in
vitro de una población de células derivadas mesodérmicamente no
diferenciadas para que experimenten al menos uno de hematopoyesis o
crecimiento vascular, que comprende hacer que un compuesto acceda a
las células de modo que estimule a las células para que experimenten
al menos uno de hematopoyesis o crecimiento vascular, en el que el
compuesto es un compuesto hedgehog seleccionado de una proteína
hedgehog, un péptido funcional de una proteína hedgehog, o una
secuencia codificante del mismo incorporada en un vector, y en el
que dicho compuesto promueve la señalización de hedgehog, con la
condición de que las células no sean células embrionarias
humanas.
2. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que el compuesto hedgehog es una proteína hedgehog o un
péptido funcional de una proteína hedgehog, y en el que dicho
compuesto hedgehog se une a una proteína patched.
3. El procedimiento según la reivindicación 1 o
la reivindicación 2, en el que el compuesto hedgehog es un péptido
funcional de una proteína hedgehog.
4. El procedimiento según la reivindicación 3,
en el que el péptido funcional es un péptido funcional de una
proteína Sonic hedgehog.
5. El procedimiento según la reivindicación 1 o
la reivindicación 2, en el que el compuesto hedgehog es una
proteína hedgehog seleccionada de Indian hedgehog, Desert hedgehog o
Sonic hedgehog.
6. El procedimiento según la reivindicación 5,
en el que la proteína hedgehog es lndian hedgehog.
7. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que la composición comprende además
un segundo compuesto seleccionado de una proteína
TGF-\beta o una proteína BMP.
8. El procedimiento según la reivindicación 7,
en el que la proteína BMP se selecciona de cualquiera de
BMP-2, BMP-4, BMP-6
y BMP-7.
9. El procedimiento según la reivindicación 5,
en el que el compuesto hedgehog es una proteína Sonic hedgehog.
10. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que dicha población de células se
mantiene in vitro en un medio de cultivo y el compuesto
hedgehog se proporciona en el medio de cultivo.
11. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que las células son una población de
células madre hematopoyéticas.
12. El procedimiento según la reivindicación 11,
en el que las células madre hematopoyéticas se seleccionan de
cualquiera de células de sangre de cordón umbilical, células de
sangre periférica fetal y células de hígado fetal, o se obtienen de
médula ósea de adulto.
13. El procedimiento según la reivindicación 10,
en el que las células son células progenitoras obtenidas de un ser
humano adulto, o células precursoras de un ser humano adulto que
pueden experimentar crecimiento vascular cuando se estimulan
mediante el compuesto.
14. El procedimiento según la reivindicación 10,
en el que las células constituyen tejido embrionario, un cultivo de
explante embrionario, o un blastocisto.
15. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en el que las células son células madre
hematopoyéticas aisladas de médula ósea de un animal, o células
madre hematopoyéticas seleccionadas de cualquiera de células
hematopoyéticas encontradas en al menos uno de médula ósea, sangre
de cordón umbilical, sangre periférica fetal e hígado fetal.
16. Un compuesto hedgehog que promueve
señalización de hedgehog para estimular al menos uno de
hematopoyesis o crecimiento vascular en un ser humano o animal, en
el que el compuesto hedgehog es una proteína hedgehog, un péptido
funcional de una proteína hedgehog, o una secuencia codificante del
mismo incorporada en un vector.
17. El compuesto según la reivindicación 16 para
estimular una población de células derivadas mesodérmicamente no
diferenciadas para que experimenten al menos uno de hematopoyesis o
crecimiento vascular.
18. El compuesto según la reivindicación 16 o la
reivindicación 17, en el que el compuesto hedgehog es una proteína
hedgehog o un péptido funcional de una proteína hedgehog, y en el
que dicho compuesto hedgehog se une a una proteína patched.
19. El compuesto según una cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 18, en el que el compuesto hedgehog es una
proteína hedgehog.
20. El compuesto según la reivindicación 16 o la
reivindicación 17, en el que el compuesto hedgehog es un péptido
funcional de una proteína hedgehog.
21. El compuesto según una cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 19, en el que el compuesto hedgehog es una
proteína hedgehog seleccionada de cualquiera de Indian hedgehog,
Desert hedgehog y Sonic hedgehog.
22. El compuesto según la reivindicación 21, en
el que la proteína hedgehog es Indian hedgehog.
23. El compuesto según una cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 22, en el que dicho compuesto hedgehog se
combina con un segundo compuesto, en el que el segundo compuesto se
selecciona de una proteína TGF-\beta o una
proteína BMP.
24. El compuesto según la reivindicación 23, en
el que la proteína BMP se selecciona de cualquiera de
BMP-2, BMP-4, BMP-6
y BMP-7.
25. El compuesto según una cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 24, para estimular una población de células
derivadas mesodérmicamente no diferenciadas para que experimenten al
menos uno de crecimiento vascular o hematopoyético, y en el que las
células son: células madre hematopoyéticas in vivo dentro de
la médula ósea de un animal, o células madre hematopoyéticas
presentes en un animal y seleccionadas de cualquiera de las células
hematopoyéticas encontradas en al menos uno de médula ósea, sangre
de cordón umbilical, sangre periférica fetal e hígado fetal.
26. El compuesto según una cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 25, en el que el compuesto se proporciona
como un medicamento administrado mediante cualquiera de las vías
oral, intradérmica, subcutánea, transmucosa, intramuscular o
intravenosa.
27. El compuesto según la reivindicación 16,
para tratar a un sujeto que adolece de un número anómalo de células
eritroides.
28. El compuesto según la reivindicación 27, en
el que el compuesto hedgehog estimula la proliferación o
hematopoyesis de células madre hematopoyéticas.
29. El compuesto según la reivindicación 27 o la
reivindicación 28, en el que el compuesto hedgehog es una proteína
hedgehog o un péptido funcional de una proteína hedgehog que se une
a patched.
30. El compuesto según una cualquiera de las
reivindicaciones 27 a 29, en el que el compuesto hedgehog se
combina con un segundo compuesto, en el que el segundo compuesto se
selecciona de una proteína TGF-\beta o una
proteína BMP.
31. El compuesto según una cualquiera de las
reivindicaciones 27 a 30, en el que el número anómalo de células
eritroides es un número bajo de manera anómala de células
eritroides, caracterizado por una anemia en el sujeto,
seleccionándose la anemia de cualquiera de anemia aplásica
idiopática, anemia aplásica constitucional, formas secundarias de
anemia aplásica, anemia mielodisplásica, anemia crónica inducida
viral, anemia inducida por enfermedad inflamatoria crónica, anemia
inducida por cáncer, anemia crónica inducida por insuficiencia
orgánica, trombocitopenia y anemia inducida por fármacos.
32. El compuesto según una cualquiera de las
reivindicaciones 27 a 31, en el que el número anómalo de células
eritroides provoca una enfermedad seleccionada de cualquiera de
policitemia verdadera y eritroleucemia.
33. El compuesto según una cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 18, para tratar a un sujeto que padece una
isquemia en los tejidos.
34. El compuesto según la reivindicación 33, en
el que la isquemia es isquemia miocárdica.
35. El compuesto según la reivindicación 33 o la
reivindicación 34, en el que el compuesto hedgehog es una proteína
hedgehog o un péptido funcional de una proteína hedgehog que se une
a patched.
36. El compuesto según la reivindicación 33 o la
reivindicación 34, en el que el compuesto hedgehog es una proteína
hedgehog seleccionada de Sonic hedgehog, Indian hedgehog o Desert
hedgehog.
37. El compuesto según una cualquiera de las
reivindicaciones 33 a 36, en el que el compuesto hedgehog se
combina con un segundo compuesto, en el que el segundo compuesto se
selecciona de una proteína TGF-\beta o una
proteína BMP.
38. Un anticuerpo que inhibe la señalización de
hedgehog para tratar el crecimiento vascular potenciado de manera
anómala o para inhibir la hematopoyesis en un sujeto.
39. El anticuerpo según la reivindicación 38, en
el que el anticuerpo es un anticuerpo de bloqueo de hedgehog.
40. El anticuerpo según la reivindicación 38 o
la reivindicación 39, en el que el crecimiento vascular potenciado
de manera anómala acompaña al cáncer.
41. El anticuerpo según la reivindicación 40, en
el que el cáncer es cáncer de mama.
42. El anticuerpo según la reivindicación 38 o
la reivindicación 39, en el que el crecimiento vascular potenciado
de manera anómala es neovascularización ocular relacionada con
diabetes.
43. El anticuerpo según la reivindicación 38,
para tratar una neoplasia maligna hematopoyética.
44. El anticuerpo según la reivindicación 38,
para inhibir el crecimiento vascular en sujetos que padecen
neovascularización o vascularización en exceso.
45. El anticuerpo según la reivindicación 44,
para tratar un tumor sólido o un hemangioma en la infancia.
46. El compuesto según una cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 20, para promover la cicatrización de
heridas.
47. Uso de un compuesto hedgehog que promueve
señalización de hedgehog en la fabricación de un medicamento para
estimular al menos uno de hematopoyesis o crecimiento vascular, en
el que el compuesto hedgehog es una proteína hedgehog, un péptido
funcional de una proteína hedgehog, o una secuencia codificante del
mismo incorporada en un vector.
48. El uso según la reivindicación 47, en el que
el compuesto hedgehog es según la reivindicación 2 o la
reivindicación 5.
49. El uso según la reivindicación 47 ó 48, en
el que dicho medicamento es para tratar a un sujeto que padece una
isquemia en tejidos.
50. El uso según la reivindicación 49, en el que
la isquemia es isquemia miocárdica.
51. El uso de un anticuerpo que inhibe la
señalización de hedgehog en la fabricación de un medicamento para
tratar el crecimiento vascular potenciado de manera anómala o para
inhibir la hematopoyesis en un sujeto.
52. El uso según la reivindicación 51, en el que
el anticuerpo es un anticuerpo de bloqueo de hedgehog.
53. El uso según la reivindicación 51 o la
reivindicación 52, en el que el crecimiento vascular potenciado de
manera anómala es según una cualquiera de las reivindicaciones 40 a
42.
54. El uso según la reivindicación 51, para
tratar una neoplasia maligna hematopoyética.
55. El uso según la reivindicación 51, para
inhibir el crecimiento vascular en sujetos que padecen
neovascularización o vascularización en exceso.
56. El uso según la reivindicación 47 ó 48, en
la fabricación de un medicamento para promover la cicatrización de
heridas.
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US3751397P | 1997-02-10 | 1997-02-10 | |
US37513P | 1997-02-10 | ||
US4976397P | 1997-06-16 | 1997-06-16 | |
US49763P | 1997-06-16 | ||
PCT/US1998/002633 WO1998035020A2 (en) | 1997-02-10 | 1998-02-10 | Methods for modulating hematopoiesis and vascular growth |
US09/021,660 US6713065B2 (en) | 1997-02-10 | 1998-02-10 | Methods of using hedgehog proteins to modulate hematopoiesis and vascular growth |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2339724T3 true ES2339724T3 (es) | 2010-05-24 |
Family
ID=27361699
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES98906314T Expired - Lifetime ES2339724T3 (es) | 1997-02-10 | 1998-02-10 | Procedimiento para modular la hematopoyesis y el crecimiento vascular. |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US6713065B2 (es) |
EP (1) | EP1019490B1 (es) |
JP (2) | JP4669968B2 (es) |
AT (1) | ATE449836T1 (es) |
CA (1) | CA2280736C (es) |
DE (1) | DE69841320D1 (es) |
DK (1) | DK1019490T3 (es) |
ES (1) | ES2339724T3 (es) |
WO (1) | WO1998035020A2 (es) |
Families Citing this family (27)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6713065B2 (en) * | 1997-02-10 | 2004-03-30 | President And Fellows Of Harvard College | Methods of using hedgehog proteins to modulate hematopoiesis and vascular growth |
WO1999000117A2 (en) | 1997-06-27 | 1999-01-07 | Ontogeny, Inc. | Neuroprotective methods and reagents |
US7144997B2 (en) | 1997-07-24 | 2006-12-05 | Curis, Inc. | Vertebrate embryonic patterning-inducing proteins, compositions and uses related therto |
US6639051B2 (en) * | 1997-10-20 | 2003-10-28 | Curis, Inc. | Regulation of epithelial tissue by hedgehog-like polypeptides, and formulations and uses related thereto |
US20030129750A1 (en) * | 1998-02-05 | 2003-07-10 | Yitzhack Schwartz | Homing of donor cells to a target zone in tissue using active therapeutics or substances |
US7291626B1 (en) | 1998-04-09 | 2007-11-06 | John Hopkins University School Of Medicine | Inhibitors of hedgehog signaling pathways, compositions and uses related thereto |
US7098196B1 (en) | 1999-10-13 | 2006-08-29 | Johns Hopkins University School Of Medicine | Regulators of the hedgehog pathway, compositions and uses related thereto |
WO2000015246A2 (en) | 1998-09-11 | 2000-03-23 | President And Fellows Of Harvard College | Regulation of lung tissue by hedgehog-like polypeptides, and formulations and uses related thereto |
US6884770B1 (en) | 1998-11-06 | 2005-04-26 | Curis, Inc. | Methods and compositions for treating or preventing peripheral neuropathies |
GB9910664D0 (en) | 1999-05-07 | 1999-07-07 | Zeneca Ltd | Cells and assay |
WO2001041786A1 (en) * | 1999-12-10 | 2001-06-14 | The General Hospital Corporation | METHODS TO STIMULATE INSULIN PRODUCTION BY PANCREATIC β-CELLS |
AU2001243220A1 (en) * | 2000-02-23 | 2001-09-03 | Musc Foundation For Research Development | Methods of screening for compounds that modulate blood vessel formation |
US7498304B2 (en) | 2000-06-16 | 2009-03-03 | Curis, Inc. | Angiogenesis-modulating compositions and uses |
EP1294752A2 (en) * | 2000-06-16 | 2003-03-26 | Curis, Inc. | Angiogenesis-modulating compositions and uses |
JP5196700B2 (ja) | 2000-10-13 | 2013-05-15 | キュリス,インコーポレイテッド | ヘッジホッグアンタゴニスト、それらに関する方法及び利用 |
US7708998B2 (en) | 2000-10-13 | 2010-05-04 | Curis, Inc. | Methods of inhibiting unwanted cell proliferation using hedgehog antagonists |
CA2452152A1 (en) | 2001-07-02 | 2002-10-10 | Sinan Tas | Use of cyclopamine in the treatment of psoriasis |
US7828101B2 (en) * | 2002-12-03 | 2010-11-09 | Radtke Jeffrey L | Self-propelled wheel for bicycles and similar vehicles |
JP4750697B2 (ja) * | 2003-06-25 | 2011-08-17 | オタワ ヘルス リサーチ インスティテュート | 幹細胞の成長及び分化を調節する方法及び組成物 |
CA2561221C (en) | 2004-03-26 | 2016-09-20 | Curis, Inc. | Rna interference modulators of hedgehog signaling and uses thereof |
JP2007217283A (ja) * | 2004-03-30 | 2007-08-30 | Niigata Tlo:Kk | 血管新生促進剤および血管新生療法 |
US20050265980A1 (en) | 2004-05-14 | 2005-12-01 | Becton, Dickinson And Company | Cell culture environments for the serum-free expansion of mesenchymal stem cells |
US7517870B2 (en) * | 2004-12-03 | 2009-04-14 | Fondazione Telethon | Use of compounds that interfere with the hedgehog signaling pathway for the manufacture of a medicament for preventing, inhibiting, and/or reversing ocular diseases related with ocular neovascularization |
WO2008137115A1 (en) | 2007-05-03 | 2008-11-13 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Multipotent stem cells and uses thereof |
US8574567B2 (en) * | 2007-05-03 | 2013-11-05 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Multipotent stem cells and uses thereof |
AU2009313902B9 (en) * | 2008-11-13 | 2014-03-27 | The General Hospital Corporation | Methods and compositions for regulating iron homeostasis by modulation of BMP-6 |
GB201204201D0 (en) * | 2012-03-09 | 2012-04-25 | Ucl Business Plc | Erythropoiesis |
Family Cites Families (40)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4811522A (en) * | 1987-03-23 | 1989-03-14 | Gill Jr Gerald L | Counterbalanced polishing apparatus |
US6610656B1 (en) * | 1993-12-30 | 2003-08-26 | President And Fellows Of Harvard College | Method of promoting chondrocyte differentiation with hedgehog related polypeptides |
US5789543A (en) * | 1993-12-30 | 1998-08-04 | President And Fellows Of Harvard College | Vertebrate embryonic pattern-inducing proteins and uses related thereto |
NZ278765A (en) | 1993-12-30 | 1998-05-27 | Harvard College | Vertebrate proteins involved in spatial arrangements of differentiated tissues called hedgehog proteins, their production and use |
US6884775B1 (en) * | 1993-12-30 | 2005-04-26 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and compositions for regulating skeletogenic formation |
US6165747A (en) * | 1993-12-30 | 2000-12-26 | President & Fellows Of Harvard College | Nucleic acids encoding hedgehog proteins |
US20030186357A1 (en) * | 1993-12-30 | 2003-10-02 | Philip W. Ingham | Vertebrate embryonic pattern-inducing proteins, and uses related thereto |
US6271363B1 (en) * | 1993-12-30 | 2001-08-07 | President & Fellows Of Harvard College | Nucleic acids encoding hedgehog proteins |
US6261786B1 (en) * | 1993-12-30 | 2001-07-17 | Imperial Cancer Res. Technology | Screening assays for hedgehog agonists and antagonists |
US7060450B1 (en) | 1993-12-30 | 2006-06-13 | President And Fellows Of Harvard College | Screening assays for agonists and antagonists of the hedgehog signaling pathway |
JPH09509574A (ja) * | 1994-02-25 | 1997-09-30 | ザ・トラスティーズ・オブ・コランビア・ユニバーシティー・イン・ザ・シティー・オブ・ニューヨーク | 脊索によって発現されるヘッジホッグ、Vhh−1、の脊椎動物相同体をコードするDNA、及びこれらの使用 |
US5681278A (en) * | 1994-06-23 | 1997-10-28 | Cormedics Corp. | Coronary vasculature treatment method |
US6429354B1 (en) * | 1994-10-07 | 2002-08-06 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Patched genes and uses related thereto |
ATE299529T1 (de) * | 1994-10-07 | 2005-07-15 | Univ Leland Stanford Junior | Ptc gene und ihre verwendung |
US6946257B1 (en) * | 1994-10-07 | 2005-09-20 | Regents Of The University Of California | Patched genes and uses related thereto |
US6027882A (en) * | 1994-10-07 | 2000-02-22 | The Regents Of The University Of California | Patched genes and their use for diagnostics |
US6281332B1 (en) | 1994-12-02 | 2001-08-28 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Hedgehog-derived polypeptides |
US5759811A (en) | 1996-11-13 | 1998-06-02 | The Regents Of The University Of California | Mutant human hedgehog gene |
US6713065B2 (en) | 1997-02-10 | 2004-03-30 | President And Fellows Of Harvard College | Methods of using hedgehog proteins to modulate hematopoiesis and vascular growth |
US6432970B2 (en) * | 1998-04-09 | 2002-08-13 | Johns Hopkins University School Of Medicine | Inhibitors of hedgehog signaling pathways, compositions and uses related thereto |
US6867216B1 (en) * | 1998-04-09 | 2005-03-15 | Johns Hopkins University School Of Medicine | Inhibitors of hedgehog signal pathways, compositions and uses related thereto |
WO2000018428A2 (en) | 1998-09-11 | 2000-04-06 | Biogen, Inc. | Hedgehog and patched antagonists for inhibiting cell and tissue growth and differentiation and uses therefor |
WO2000015246A2 (en) | 1998-09-11 | 2000-03-23 | President And Fellows Of Harvard College | Regulation of lung tissue by hedgehog-like polypeptides, and formulations and uses related thereto |
WO2000025725A2 (en) | 1998-11-02 | 2000-05-11 | Biogen, Inc. | Functional antagonists of hedgehog activity |
US6291516B1 (en) | 1999-01-13 | 2001-09-18 | Curis, Inc. | Regulators of the hedgehog pathway, compositions and uses related thereto |
JP2003501395A (ja) | 1999-06-08 | 2003-01-14 | ローランティス・リミテッド | 治療的使用 |
US20050080138A1 (en) * | 1999-09-16 | 2005-04-14 | Curis, Inc. | Mediators of hedgehog signaling pathways, compositions and uses related thereto |
WO2001019800A2 (en) | 1999-09-16 | 2001-03-22 | Curis, Inc. | Mediators of hedgehog signaling pathways, compositions and uses related thereto |
WO2001026644A2 (en) | 1999-10-14 | 2001-04-19 | Curis, Inc. | Mediators of hedgehog signaling pathways, compositions and uses related thereto |
US6552016B1 (en) * | 1999-10-14 | 2003-04-22 | Curis, Inc. | Mediators of hedgehog signaling pathways, compositions and uses related thereto |
DE20022471U1 (de) * | 2000-01-08 | 2001-12-06 | SensoPart Industriesensorik GmbH, 79695 Wieden | Nachrüstgerät für ein Zielfernrohr |
AU2001249664C1 (en) | 2000-03-30 | 2008-08-14 | Curis, Inc. | Small organic molecule regulators of cell proliferation |
US6613798B1 (en) * | 2000-03-30 | 2003-09-02 | Curis, Inc. | Small organic molecule regulators of cell proliferation |
EP1294752A2 (en) | 2000-06-16 | 2003-03-26 | Curis, Inc. | Angiogenesis-modulating compositions and uses |
US7498304B2 (en) * | 2000-06-16 | 2009-03-03 | Curis, Inc. | Angiogenesis-modulating compositions and uses |
JP2002100593A (ja) * | 2000-09-21 | 2002-04-05 | Nikon Corp | 研磨装置、これを用いた半導体デバイスの製造方法及びこの製造方法により製造された半導体デバイス |
JP5196700B2 (ja) | 2000-10-13 | 2013-05-15 | キュリス,インコーポレイテッド | ヘッジホッグアンタゴニスト、それらに関する方法及び利用 |
US7708998B2 (en) * | 2000-10-13 | 2010-05-04 | Curis, Inc. | Methods of inhibiting unwanted cell proliferation using hedgehog antagonists |
JP2004534743A (ja) | 2001-04-09 | 2004-11-18 | ロランティス リミテッド | ヘッジホッグ |
IL159858A0 (en) | 2001-07-27 | 2004-06-20 | Curis Inc | Mediators of hedgehog signaling pathways, compositions and uses related thereto |
-
1998
- 1998-02-10 US US09/021,660 patent/US6713065B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-02-10 ES ES98906314T patent/ES2339724T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-02-10 WO PCT/US1998/002633 patent/WO1998035020A2/en active Application Filing
- 1998-02-10 DK DK98906314.4T patent/DK1019490T3/da active
- 1998-02-10 CA CA2280736A patent/CA2280736C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-02-10 DE DE69841320T patent/DE69841320D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-02-10 EP EP98906314A patent/EP1019490B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-02-10 AT AT98906314T patent/ATE449836T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-02-10 JP JP53504298A patent/JP4669968B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2004
- 2004-02-03 US US10/772,090 patent/US20050002933A1/en not_active Abandoned
-
2009
- 2009-06-05 JP JP2009136272A patent/JP2009261956A/ja active Pending
-
2012
- 2012-06-27 US US13/534,833 patent/US8691230B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE69841320D1 (de) | 2010-01-07 |
EP1019490A2 (en) | 2000-07-19 |
US20130071407A1 (en) | 2013-03-21 |
JP2001511650A (ja) | 2001-08-14 |
DK1019490T3 (da) | 2010-03-15 |
WO1998035020A3 (en) | 1999-01-14 |
JP2009261956A (ja) | 2009-11-12 |
JP4669968B2 (ja) | 2011-04-13 |
US6713065B2 (en) | 2004-03-30 |
EP1019490B1 (en) | 2009-11-25 |
CA2280736C (en) | 2012-05-29 |
US20050002933A1 (en) | 2005-01-06 |
ATE449836T1 (de) | 2009-12-15 |
CA2280736A1 (en) | 1998-08-13 |
WO1998035020A2 (en) | 1998-08-13 |
US8691230B2 (en) | 2014-04-08 |
US20010041668A1 (en) | 2001-11-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2339724T3 (es) | Procedimiento para modular la hematopoyesis y el crecimiento vascular. | |
Puri et al. | The receptor tyrosine kinase TIE is required for integrity and survival of vascular endothelial cells. | |
US6242666B1 (en) | Animal model for identifying a common stem/progenitor to liver cells and pancreatic cells | |
Gendron et al. | Induction of Embryonic Vasculogenesis by bFGF and LIFin Vitroandin Vivo | |
Shi et al. | Rho kinases in embryonic development and stem cell research | |
US7626074B2 (en) | Method of screening candidate drugs for the treatment of leukemia | |
EP2590503A1 (en) | A transgenic animal as a model for identifying adult stem cells, and uses thereof | |
Alcalay et al. | Regulation of cell proliferation and differentiation in the kidney | |
Fernández-Medarde et al. | Ras GEF mouse models for the analysis of ras biology and signaling | |
ES2213429B1 (es) | Empleo del gen slug como marcador genetico de funciones mediadas por scf (stem cell factor) y aplicaciones. | |
Aoki et al. | Postnatal Expression of Kitl Affects Pigmentation of the Epidermis | |
Herbst et al. | Adoptive transfer of the hematopoietic system of trisomic mice with limited life span: stem cells from six different trisomies are capable of survival | |
JP2003500074A (ja) | 骨髄性細胞系列においてJunB発現を欠損するトランスジェニックマウスの使用 | |
Vassalli | A genetic test of the role of activins in mouse mesoderm formation | |
KR20060130542A (ko) | Vitamin D3를 유효성분으로 포함하는 자연살해세포분화제 및 분화 방법 | |
WO2005116070A9 (en) | Reporter system for detecting signal pathway activation in multiple cell types | |
US20050101536A1 (en) | Modulation of angiogenesis | |
Lee | Functional analysis of EGFR using a conditional allele | |
Qiu | The role of Lmx1b in the control of dorsoventral compartmentalization in the distal mesenchyme of the developing mouse limb | |
Liu | Generation and utilization of knockout mice to elucidate the functions of the TGF-β pathway in mammalian endodermal specification and placental development | |
Orelio | Regulation of hematopoietic stem cells during mouse development | |
Zhao | Study Of Focal Adhesion Kinase (Fak) Functions In Developmental Angiogenesis And Mammary Tumors Utilizing Knockin Technology | |
WO1997022708A1 (en) | Primate cluster-forming embryonic hematopoietic stem cells | |
Sanford | In vitro and in vivo studies on the function of transforming growth factor beta types 1 and 2 in the mouse | |
Fine | Expression of Escherichia coli beta-galactosidase in transgenic mice: An approach to cell lineage analysis |