KR20070116192A - 항혈전제 - Google Patents

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프랭크 씨. 바론
마이클 엔. 블랙번
지오라 지. 퓨어스타인
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스미스클라인 비참 코포레이션
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Abstract

본 발명은 항혈전제로서의 모노클로날 항체에 관한 것이다.
항혈전제, 인자 IX, 항체, 허혈, 뇌졸중, 플라즈미노겐 활성화제, 혈전 용해제

Description

항혈전제 {Antithrombotic Agents}
본 발명은 인간 응고 인자 또는 보조인자에 결합하는 모노클로날 항체 (mAb) 및 그의 혈전증 억제제로서의 용도에 관한 것이다.
정상 환경하에서, 혈관 안을 덮고있는 혈관 내피 세포에 대한 크거나 작은 손상은 통상 응고 "캐스케이드 (cascade)"라 불리우는 일련의 사건을 통해 지혈 반응을 촉발시킨다. 이 캐스케이드는 최종적으로 가용성 피브리노겐을 불용성 피브린으로 전환시키는데, 이 불용성 피브린이 혈소판과 함께 국소 응혈 또는 혈전을 형성하여 혈액 성분의 유출을 막는다. 그리하여 상처가 치유되고 나면 응혈이 분해되고 혈관 일체성과 혈류의 회복이 뒤따른다.
손상과 응혈 형성 사이에 발생하는 과정은 철저하게 조절되는 일련의 연관된 반응들이다. 요컨대, 불활성 전구효소 (proenzyme) 형태인 다수의 혈장 응고 단백질 및 보조인자들이 혈액 내에서 순환하고 있다. 활성 효소 복합체가 손상 부위에 모이면 활성화되어 세린 프로테아제가 되며, 각각의 연속적인 세린 프로테아제가 다음번의 전구효소를 촉매하여 프로테아제로 활성화한다. 이 효소 캐스케이드는 각 단계가 그 다음 단계의 효과를 증폭시키게 된다. 응고 캐스케이드에 대한 고찰 은 문헌 ["Thombosis and Hemorrhage", J. Loscalzo and A. Schafer, eds., Blackwell Scientific Publications, Oxford, England (1994)]의 제1장을 참조한다.
효율적인 응혈 형성이 손상 부위에서의 혈액 손실을 막긴하지만, 정맥 또는 동맥에서의 부적절한 혈전 형성은 장애 및 사망의 통상적인 원인이기도 하다. 비정상적인 응혈 활성은 심근 경색, 불안정형 협심증, 심방세동, 뇌졸중, 신장애, 경피 경관 관상동맥 혈관형성, 파종성 혈관내 응고, 패혈증, 폐 색전증 및 심정맥 혈전증과 같은 병리 현상을 초래하고(하거나) 이들의 치료로부터 기인할 수 있다. 인공 기관의 외래 물질 표면, 션트 (shunt) 및 보철 (예를 들어, 인공 심장 판막)에 대한 응혈의 형성도 문제가 된다.
뇌졸중은 사망의 주요 원인이고, 영구 장애의 통상적인 원인이다. 뇌졸중의 신경 결함을 초래하는 급성 국소 대뇌 허혈은 혈전 색전증에 의해 가장 빈번하게 발생한다. 혈전은 심장 및 죽종으로부터 생성될 수 있다. 동소내 (in situ) 혈전증은 커다란 대뇌외-공급 혈관에서 발생할 수 있다. 특정 연구들은 대뇌 동맥 폐색 이후 일정한 시간 간격을 넘어서면 돌이킬 수 없는 심각한 신경 손상과 지속적인 신경 결함이 발생함을 시사하고 있다 (문헌 [Stroke Therapy: Basic, Preclinical, and Clinical Directions, pp. 355-381, ed. L.P. Miller, Wiley-Liss, Inc. (1999)]의 제14장 참조).
이들 병리 및 기타 혈전성 장애와 색전증 장애의 치료에 현재 사용되고 있는 승인된 항응고제에는 황산염화 헤테로폴리사카라이드 헤파린 및 저분자량 (LMW) 헤 파린이 포함된다. 이들 제제는 비경구적으로 투여되고, 트롬빈 억제제인 항트롬빈 Ⅲ의 활성화 및 모든 응혈 인자의 불활성화에 의해 응혈을 신속하고 완전히 억제시킬 수 있다.
그러나, 헤파린 및 LMW 헤파린은 효능상 결점을 갖고 있다. 움직임 및 물체와의 접촉으로 인한 단순한 스트레스에 의한 제어되지 않은 출혈, 또는 수술 부위에서의 제어되지 않은 출혈이 주요 합병증이며, 이는 연속 주입 투여된 환자 중 1 내지 7％에서, 단속적 볼루스 투여를 받은 환자 중 8 내지 14％에서 관찰된다. 이러한 위험을 최소화하기 위해 샘플을 연속적으로 채취하여 생체외 응혈 시간을 연속적으로 모니터링하지만, 이로 인해 치료 비용이 들고 환자에게 불편을 끼친다.
또한, 환자를 출혈 위험에 노출시키지 않으면서 목적 수준의 효능을 달성할 수 있는 치료 표적의 범위는 좁다. 치료 범위는 혈장 1 ㎖ 당 약 1 내지 3 ㎍ 미만의 헤파린 (활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (aPTT) 분석 시간이 약 35 내지 약 100초가 된다)이다. 헤파린 농도를 3 ㎍/㎖로 증가시키면 표적 범위를 초과하고, 4 ㎍/㎖ 보다 높은 농도에서는 응혈 활성이 나타나지 않게 된다. 따라서, 환자의 혈장 농도를 치료 범위 내로 유지하기 위하여 세심한 주의가 필요하다.
효과가 보다 느리고 오래 지속되는, 승인된 다른 항응고제로는 쿠마린 유도체인 와르파린 (warfarin)이 있다. 와르파린은 프로트롬빈 및 다른 비타민 K 의존적 응혈 인자의 비타민 K 의존적 번역후 변형과 경쟁함으로써 작용한다.
치료 범위보다 약간 더 높은 농도만으로도 혈액이 비응고성이 되는 일반적인 항응고 작용 패턴은 헤파린 및 LMW 헤파린 뿐만 아니라 와르파린에서도 관찰되었 다.
급성 심근 경색 (MI)에서, 혈전용해 요법의 주요 목적에는 경색 혈관의 초기 재관류 및 지속성 재관류가 포함된다. 급성 MI에 대한 이 요법은 플라즈미노겐 활성화제, 예를 들어 조직 플라즈미노겐 활성화제 (tPA) 또는 스트렙토키나아제와, 항응고제, 예를 들어 비분획화 헤파린, 저분자량 헤파린 또는 직접적인 트롬빈 억제제 또는 항혈소판제, 예를 들어 아스피린 또는 혈소판 당단백질 Ⅱb/Ⅲa 차단제를 둘 다 포함한다 (문헌 [Topol, Am Heart J, 136, S66-S68 (1998)] 참조). 이러한 요법의 병용은 응혈의 형성 및 분해가 역동적인 과정이며, 트롬빈의 활성 및 생성이 폐색성 혈전의 형성 후에도, 그리고 응혈의 분해 동안 및 그 이후에도 계속된다는 관찰을 토대로 한 것이다 (문헌 [Granger et al, J Am Coll Cardiol, 31, 497-505 (1998)] 참조).
급성 MI의 치료를 위한 최적 전략은 모호한 상태로 남아있고, 입수가능한 약제 및 치료 프로토콜은 부정적인 특성과 긍정적인 특성을 모두 나타낸다. 예를 들어, 피브린-결합 트롬빈은 헤파린에 의한 억제에 감수성이 없고 (Becker et al. in Chapter 6 of "Chemistry and Biology of Serpins", Plenum Press, New York (1997)), 트롬빈 활성은 헤파린 요법의 중단에 따른 재결합 증가가 나타나 헤파린의 투여 중지 24시간 내에 재경색 증가가 관찰된다 (문헌 [Watkins et al., Catheterization and Cardiovascular Diagnosis, 44, 257-264 (1998)] 및 [Granger, Circulation, 91, 1929-1935 (1995)] 참조). 또한, 항혈소판제도 출혈 또는 혈소판 감소증을 수반할 수 있다.
또한, 다수의 임상시험으로 혈전 용해제를 다량 투여한 결과 혈장 지혈 마커의 심각한 변화를 초래함이 밝혀졌다 (문헌 [Rao et al., J Clin Invest, 101, 10-14 (1988)], [Bovill et al., Ann Int Med, 115, 256-265 (1991)] 및 [Neuhaus et al., J Am Coll Cardiol, 19, 885-891 (1992)] 참조). tPA의 농도를 증가시키면 응혈 분해가 증진되기는 하지만, 이들 지혈 마커의 변화는 혈전용해 요법의 부담, 특히 중증 출혈의 발생에 대한 부담이 증가된다는 것을 반영한다.
혈전 색전성 뇌졸중의 경우, 뇌졸중 증상이 나타난 이후 조기에 (3시간 이내) 혈전 용해 요법을 이용함으로써 돌이킬 수 없는 손상을 막는다. 허혈성 및(또는) 경색성 조직의 재관류를 위해 현재 승인된 혈전 용해제에는 플라즈미노겐 활성화제 tPA, 유로키나아제 및 스트렙토키나아제가 포함된다. 그러나, 혈전 용해 요법은 심각한 출혈에 대한 부담이 있고, 혈전 색전성 뇌졸중에서 혈전 용해 요법의 주된 문제점은 이 치료법이 출혈을 유발하여 허혈성 손상을 악화시킬 것이라는 데 있다.
분명한 것은, 지혈 기능을 유지하면서 혈전 장애를 제어하는 데 효능이 있는 항혈전제에 대한 필요성이 존재한다는 것이다.
본 발명은 항-인자 IX 항체 또는 항체 단편으로 동물의 혈전 색전증 후에 유도된 허혈을 치료한다.
본 발명에 따라 항-인자 IX 항체 또는 항체 단편을 플라즈미노겐 활성화제 또는 혈전 용해제와 조합하여 투여함으로써, 동물의 혈전 색전증 후에 유도된 허혈을 치료할 수 있고, 혈전 색전성 뇌졸중을 예방할 수 있으며, 혈전 용해제의 필요 투여량을 감소시킬 수 있다.
<발명의 개요>
본 발명의 한 측면은 항-인자 IX 항체 또는 항체 단편을 투여하는 것을 포함하는, 동물의 혈전 색전증 후에 유도된 허혈을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 측면은 항-인자 IX 항체 또는 항체 단편을 플라즈미노겐 활성화제와 조합하여 투여하는 것을 포함하는, 동물의 혈전 색전증 후에 유도된 허혈을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 측면은 항-인자 IX 항체 또는 항체 단편을 혈전 용해제와 조합하여 투여하는 것을 포함하는 동물의 혈전 색전증 후에 유도된 허혈의 치료시, 혈전 용해제의 필요 투여량을 감소시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 측면은 혈전 색전성 뇌졸중에 걸릴 위험이 있는 동물에게 항-인자 IX 항체 또는 항체 단편을 투여하는 것을 포함하는, 상기 동물에서 혈전 색전성 뇌졸중을 예방하는 방법에 관한 것이다.
<발명의 상세한 설명>
특허 및 특허 출원 등을 비롯하여 본 명세서에 인용된 모든 문헌은, 전체가 일일이 기재된 것처럼 본원에 참고로 포함된다.
특허 및 특허 출원 등을 비롯하여 본 명세서에 인용된 모든 문헌은, 전체가 일일이 기재된 것처럼 본원에 참고로 포함된다.
본 발명은 자기제한 중화 활성이라는 특징을 갖는, 응고 인자에 대한 다양한 항체, 그의 변형 항체 및 단편을 제공한다. 바람직하게는, 응고 인자는 고유 또는 공통의 응고 경로에서 유래한다. 가장 바람직하게는, 항-응고 인자 항체는 항-인자 IX, 항-인자 IXa, 항-인자 X, 항-인자 Xa, 항-인자 XI, 항-인자 XIa, 항-인자 VIII, 항-인자 VIIIa, 항-인자 V, 항-인자 Va, 항-인자 VII, 항-인자 VIIa, 항-트롬빈 또는 항-프로트롬빈 항체이다. 특히 바람직한 것은 항-인자 IX 항체이다. 항-응고 인자 항체의 예로는 인간 인자 IX에 대한 인간화 모노클로날 항체인 SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 249417, SB 257731 및 SB 257732, 인간 인자 IX에 대한 키메라 모노클로날 항체인 chαFIX, 인간 인자 IX 및(또는) 인자 IXa에 대한 쥐의 모노클로날 항체인 BC1, BC2, 9E4(2)F4 및 11G4(1)B9, 또는 각각 인간 인 자 X 및 XI에 대한 쥐의 모노클로날 항체인 HFXLC 및 HFXI가 있다. 특히 바람직한 것은 항-인간 인자 IX 모노클로날 항체인 SB 249417이다.
본 발명의 항체는 신규한 자기제한 중화성 항체를 생성시키는 통상의 하이브리도마 기술, 파지 디스플레이 조합 라이브러리, 면역글로불린쇄 셔플링 및 인간화 기술에 의해 제조될 수 있다. 또한, 자기제한 중화 활성을 갖는 인간 mAb도 포함된다. 이들 생성물은 심근 경색, 불안정형 협심증, 심방세동, 뇌졸중, 신장애, 폐 색전증, 심정맥 혈전증, 경피 경관 관상동맥 혈관형성, 파종성 혈관내 응고, 패혈증, 인공 기관, 션트 및 보철과 관련된 혈전증 및 색전증 장애를 위한 치료 조성물 및 제약 조성물에 유용하다.
본원에서 사용된 용어 "자기제한 중화 활성"은 바람직하게는 인자 IX/IXa, X/Xa, XI/XIa, VIII/VIIIa, V/Va, VII/VIIa 및 트롬빈/프로트롬빈을 포함하여 고유 및 공통의 경로로부터 유래한 인간 응고 인자에 결합하여 응고의 제한된 조절이 생겨나는 방식으로 혈전증을 억제하는 항체의 활성을 의미한다. "응고의 제한된 조절"은 모노클로날 항체의 농도 증가에도 불구하고 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (aPTT)이 최대치에 도달하면서 혈장이 응고가능 상태를 유지하는, aPTT의 연장으로 측정되는 응혈 시간의 증가로서 정의된다. 이 응고의 제한된 조절은 헤파린의 농도 증가시에 혈장이 비응고성이 되고 무한한 aPTT를 보이는 것과 대조적이다. 바람직하게는, 본 발명 방법의 최대 aPTT 값은 헤파린의 치료 범위 내에 존재한다. 가장 바람직하게는, 최대 aPTT는 정상 제어 aPTT값의 약 1.5배 내지 약 3.5배에 해당하는 약 35초 내지 약 100초의 범위 내에 존재한다. 본 발명의 한 실시양태에 서, 프로트롬빈 시간 (PT)이 그다지 연장되지 않은 채로 aPTT가 연장된다.
"~와 조합하여"란 어구는 단일 치료 과정에서 특정한 치료제를 다른 치료제의 투여 전에, 투여 후에, 또는 투여와 동시에 투여하는 것을 의미한다.
"변형 항체"는 선택된 숙주 세포에서 발현에 의해 수득될 수 있는 변형 면역글로불린 코딩 영역에 의해 코딩되는 단백질을 의미한다. 이러한 변형 항체에는 공학 처리된 (engineered) 항체 (예를 들어, 키메라 또는 인간화 항체) 또는 면역글로불린 불변 영역의 전부 또는 일부가 결여된 항체 단편, 예를 들어 Fv, Fab, Fab' 또는 F(ab')2 등이 있다.
"변형 면역글로불린 코딩 영역"은 본 발명의 변형 항체를 코딩하는 핵산 서열을 의미한다. 변형 항체가 상보성 결정 영역(CDR) 이식 항체 또는 인간화 항체인 경우에, 비인간 면역글로불린으로부터 유래한 상보성 결정 영역을 코딩하는 서열이 인간 가변 프레임워크 서열을 포함하는 제1 면역글로불린 파트너 내로 삽입된다. 임의로, 제1 면역글로불린 파트너는 제2 면역글로불린 파트너에 작동가능하게 연결된다.
"제1 면역글로불린 파트너"는 천연 (또는 자연 발생) CDR 코딩 영역이 공여체 항체의 CDR 코딩 영역에 의해 대체된, 인간 프레임워크 또는 인간 면역글로불린 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열을 의미한다. 인간 가변 영역은 면역글로불린 중쇄, 경쇄 (또는 중쇄 및 경쇄 모두), 그의 유사체 또는 기능성 단편일 수 있다. 항체 (면역글로불린)의 가변 영역 내에 위치한 상기 CDR 영역은 당업계에 공지된 방법에 의해 결정할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Kabat et al. "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)]에는 CDR의 위치 결정에 대한 규칙이 기재되어 있다. 또한, CDR 영역/구조의 확인에 유용한 컴퓨터 프로그램이 공지되어 있다.
"제2 면역글로불린 파트너"는 제1 면역글로불린 파트너가 프레임 내에 또는 임의의 통상적인 링커 서열에 의해 융합된 (즉, 작동가능하게 연결됨), 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 다른 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 이 파트너로는 면역글로불린 유전자가 바람직하다. 제2 면역글로불린 파트너는 동일한 목적 항체 (즉, 상동성, 제1 및 제2 변형 항체가 동일한 공급원으로부터 유래) 또는 추가의 목적 항체 (즉, 이종성)의 전체 불변 영역을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이는 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 (또는 단일 폴리펩티드의 일부로서의 중쇄 및 경쇄 모두)일 수 있다. 제2 면역글로불린 파트너는 특정 면역글로불린 클래스 또는 이소타입에 제한되지 않는다. 또한, 제2 면역글로불린 파트너는 Fab 또는 F(ab)2 (즉, 적절한 인간 불변 영역 또는 프레임워크 영역의 불연속 부분)에서 발견되는 것과 같은 면역글로불린 불변 영역의 일부를 포함할 수 있다. 또한, 상기 제2 면역글로불린 파트너는, 예를 들어 파지 디스플레이 라이브러리의 일부로서 숙주 세포의 외부 표면에 노출된 막통합 (integral membrane) 단백질을 코딩하는 서열, 또는 분석 또는 진단 검출을 위한 단백질, 예를 들어 홀스래디쉬 (horseradish) 퍼옥 시다제, β-갈락토시다제 등을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다.
용어 Fv, Fc, Fd, Fab, Fab' 또는 F(ab')2는 이들의 표준 의미로서 사용된다 (예를 들어, 문헌 [Harlow et al., "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory (1988)] 참조).
본원에서 사용된 "공학 처리된 항체"는 선택된 수용체 항체의 경쇄 및(또는) 중쇄 가변 도메인의 일부가 선택된 에피토프에 대한 특이성을 갖는 1종 이상의 공여체 항체로부터 유래한 유사 부분에 의해 대체된 변형 항체의 일종, 즉 전장 합성 항체 (예를 들어, 항체 단편에 대립하는 것으로서 키메라 또는 인간화 항체)를 의미한다. 예를 들어, 상기 분자는 비변형 경쇄 (또는 키메라 경쇄)와 결합된 인간화 중쇄, 또는 그 반대의 조합에 특징이 있는 항체를 포함할 수 있다. 또한, 공학 처리된 항체는 공여체의 항체 결합 특이성을 보유하기 위해서 수용체 항체 경쇄 및(또는) 중쇄 가변 도메인 프레임워크 영역을 코딩하는 핵산 서열의 변형에 의해 특성화될 수 있다. 이들 항체는 수용체 항체로부터 유래한 1종 이상 (바람직하게는 모두)의 CDR을 본원에서 기술된 공여체 항체로부터 유래한 CDR로 치환하는 것을 포함할 수 있다.
"키메라 항체"는 수용체 항체로부터 유래한 경쇄 및 중쇄 불변 영역과 결합한, 공여체 항체로부터 유래한 자연 발생 가변 영역 (경쇄 및 중쇄)를 함유하는 공학 처리된 항체의 일종을 의미한다.
"인간화 항체"는 비인간 공여체 면역글로불린으로부터 유래한 CDR을 갖고 분 자의 나머지 면역글로불린 유래 부분은 1종 이상의 인간 면역글로불린으로부터 유래한, 공학 처리된 항체의 일종을 의미한다. 또한, 프레임워크 지지 잔기는 결합 친화도를 보존하기 위해 변경될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 10029-10032 (1986)] 및 [Hodgson et al., Bio/Technology, 9, 421 (1991)] 참조).
용어 "공여체 항체"는 그 가변 영역, CDR 또는 그의 다른 기능성 단편 또는 유사체의 핵산 서열을 제1 면역글로불린 파트너에게 제공하여, 변형된 면역글로불린코딩 영역을 제공하고 공여체 항체의 항원 특이성 및 중화 활성 특성을 갖는 변형 항체를 발현시키는 모노클로날 항체 또는 재조합 항체를 의미한다. 본 발명에 사용하기 적합한 공여체 항체는 BC2로 명명된 쥐의 자기제한 중화성 모노클로날 항체이다. 다른 적합한 공여체 항체로는 BC1, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFXLC 및 HFXI로 명명된 쥐의 자기제한 중화성 모노클로날 항체가 포함된다.
용어 "수용체 항체"는 제1 면역글로불린 파트너에 중쇄 및(또는) 경쇄 프레임워크 영역 및(또는) 그의 중쇄 및(또는) 경쇄 불변 영역을 코딩하는 핵산 서열의 전부 또는 일부를 제공하는 공여체 항체에 이종성인 모노클로날 항체 또는 재조합 항체를 의미한다. 인간 항체는 수용체 항체인 것이 바람직하다.
"CDR"은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 초가변 영역인 항체의 상보성 결정 영역 아미노산 서열로서 정의된다 (예를 들어, 문헌 [Kabat et al., "Sequence of Protein of Immunological Interest", 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institute of Health (1987)] 참조). 면역글로불린의 가변 부분에는 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR 또는 CDR 영역이 존재한다. 따라서, 본원에서 사용된 "CDR"은 적절한 경우, 3개 모두의 중쇄 CDR 또는 3개 모두의 경쇄 CDR, 또는 경쇄 및 중쇄 CDR 전부를 의미한다.
CDR은 항원 또는 에피토프에 대한 항체의 결합을 위한 대부분의 접촉 잔기를 제공한다. 본 발명에서 목적하는 CDR은 공여체 항체 가변 중쇄 및 경쇄 서열로부터 유래하고, 이들이 유래하는 공여체 항체와 동일한 항원 결합 특이성 및(또는) 중화 활성을 공유하거나 보유하는 자연 발생 CDR의 유사체를 포함한다.
"항원 결합 특이성 또는 중화 활성을 공유하는"은, 예를 들어 mAb인 BC2가 특정 수준의 자기제한 중화 활성을 갖는 특징이 있다고 할지라도 적절한 구조적 환경에서 BC2의 핵산 서열에 의해 코딩되는 CDR이 더 낮거나 더 높은 활성을 가질 수 있음을 의미한다. 상기 환경에서 BC2의 CDR은 BC2와 동일한 에피토프(들)을 인식할 것으로 예상된다.
"기능성 단편"은 단편이 유래된 항체와 동일한 항원 결합 특이성 및(또는) 중화 활성을 보유하는 부분적인 중쇄 또는 경쇄 가변 서열 (예를 들어, 면역글로불린 가변 영역의 아미노 또는 카르복시 말단 서열의 미소한 결실 변이체)이다.
"유사체"는 아미노산 서열이 비변형 서열의 생물학적 특성, 예를 들어 항원 특이성 및 높은 친화도를 갖도록 하는 몇몇 아미노산 (즉, 10개 이하)의 화학적 치환 또는 재배열일 수 있는, 1개 이상의 아미노산 서열이 변형된 아미노산 서열이다. 유사체의 예로는 치환에 의해 CDR 코딩 영역 내에 또는 그 주위에 특정 엔도뉴클레아제 제한 부위를 생성시킬 수 있는 침묵 (silent) 돌연변이체가 포함된다.
또한, 유사체는 대립유전자 변이로서 발생할 수도 있다. "대립유전자 변이 또는 변형"은 본 발명의 아미노산 또는 펩티드 서열을 코딩하는 핵산 서열의 변형이다. 이러한 변이 또는 변형은 유전자 코드의 축퇴성 (degeneracy)에 의한 것이거나, 목적 특성을 제공하기 위해서 고의로 공학 처리한 것일 수도 있다. 이러한 변이 또는 변형은 임의의 코딩되는 아미노산 서열을 변형시킬 수도 있고 변형시키지 않을 수도 있다.
용어 "이펙터 (effector) 물질"은 변형 항체 및(또는) 공여체 항체의 천연 또는 합성 경쇄 또는 중쇄 또는 공여체 항체의 다른 단편이 통상의 수단에 의해 결합될 수 있는 비단백질성 캐리어 분자를 의미한다. 이러한 비단백질성 캐리어에는 진단 분야에 사용되는 통상의 캐리어, 예를 들어 BIAcore (Pharmacia) 시스템에 사용되는 폴리스티렌 또는 기타 플라스틱 비드, 폴리사카라이드, 또는 의료 분야에 유용하고 인간 및 동물에 투여하기에 안전한 다른 비단백질성 물질이 포함될 수 있다. 다른 이펙터 물질에는 중금속 원자 또는 방사성 동위원소를 킬레이팅시키기 위한 마크로사이클 화합물 (macrocycle)이 포함될 수 있다. 이러한 이펙터 물질, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜은 또한 변형 항체의 반감기를 증가시키는 데 유용할 수 있다.
본 발명의 항체, 변형 항체 및 단편의 제조에 사용하기 위해서, 비인간 종, 예를 들어 소, 양, 원숭이, 닭, 설치류 (예를 들어, 쥐 및 래트)를 사용하여 인간 응고 인자, 바람직하게는 IX/IXa, X/Xa, XI/XIa, VIII/VIIIa, V/Va, VII/VIIa 또는 트롬빈/프로트롬빈, 또는 이로부터 유래한 펩티드 에피토프가 표출된 바람직한 면 역글로불린을 생성시킬 수 있다. 통상의 하이브리도마 기술을 사용하여 각각의 응고 인자에 대한 비인간 mAb를 분비하는 하이브리도마 세포주를 제공한다. 이어서, 실시예 부분에 기재된 바와 같이 96웰 플레이트에 코팅된 인자 IX/IXa, X/Xa, XI/XIa, VIII/VIIIa, V/Va, VII/VIIa 또는 트롬빈/프로트롬빈을 사용하여, 또는 별법으로 스트렙타비딘 코팅된 플레이트에 결합된 바이오티닐화 인자 IX/IXa, X/Xa, XI/XIa, VIII/VIIIa, V/Va, VII/VIIa 또는 트롬빈/프로트롬빈을 사용하여 상기 하이브리도마를 결합에 대하여 스크리닝한다. 별법으로, 당업계에 공지되고 본 발명에서 이용된 기술을 이용하여 인간 mAb를 충분히 생성시킬 수 있다.
일례로서, 본 발명의 자기제한 중화성 mAb는 키메라 또는 인간화 분자의 발생에 사용할 수 있는 쥐의 항체인 mAb BC2이다. BC2 mAb는 응혈 시간에 대해 자기제한 억제 활성이라는 특징을 갖는다. aPTT 분석에 의해 측정한 바와 같이, 응혈 시간에 대한 BC2 mAb의 효과는 약 100초의 최대값을 보인다. 또한, BC2 mAb는 인자 IXa에 결합하고, 인자 IX의 인자 IXa로의 전환을 억제하고, 인자 IXa 활성을 억제한다. 2가 금속 보조인자는 활성에 필요하고, mAb는 Mn+2 보다는 Ca2+에 대하여 큰 선호도를 보인다. aPTT 분석에서 관찰된 IC50은 약 50 nM이다. BC2 mAb는 쥐에 대한 종 교차 반응성을 보이고, 이 mAb는 이소타입 IgG2a이다.
다른 바람직한 공여체 항체는 쥐의 mAb인 BC1, 9E4(2)F4 및 11G4(1)B9이다. 이들 mAb는 응혈 시간에 대한 자기제한 억제 활성이라는 특징을 갖는다. aPTT 분석에 의해 측정한 바와 같이, 응혈 시간에 대한 이들 mAb의 효과는 9E4(2)F4의 경 우 약 90 내지 100초, 11G4(1)B9의 경우 약 80초의 최대값을 보인다. 또한, BC1 mAb는 인자 IXa에 결합하고 인자 IXa의 활성을 억제하지만, 인자 IX의 인자 IXa로의 전환을 억제하지 않는다. 금속 보조인자는 활성을 위해 필요하다. aPTT 분석에서 BC1에 대해 관찰된 IC50은 약 35 nM이다. BC1 mAb는 이소타입 IgG1이다.
응혈 시간에 대한 자기제한 억제 활성이라는 특징을 갖는 또다른 바람직한 공여체 항체는 쥐의 mAb HFXLC이다. aPTT 분석에 의해 측정한 바와 같이, 응혈 시간에 대한 HFXLC mAb의 효과는 약 50 내지 60초의 최대값을 보인다. HFXLC mAb는 인자 X 경쇄에 결합하고, 인자 X/Xa의 활성을 억제한다. aPTT 분석에서 관찰된 IC50은 약 20 nM이다.
응혈 시간에 대한 자기제한 억제 활성이라는 특징을 갖는 또다른 바람직한 공여체 항체는 쥐의 mAb HFXI이다. aPTT 분석에 의해 측정한 바와 같이, 응혈 시간에 대한 HFXI mAb의 효과는 약 100초의 최대값을 보인다. HFXI mAb는 인자 XI에 결합하고, 인자 XI/XIa의 활성을 억제한다. aPTT 분석에서 관찰된 IC50은 약 30 nM이다.
작용 메카니즘에 대하여 특정 이론에 얽매이려는 것은 아니지만, 이들 mAb는 단지 부분적인 억제가 달성되는 비경쟁적 또는 알로스테릭 (allosteric) 메카니즘에 의해 응고를 조절하는 것으로 보인다.
본 발명은 BC1, BC2, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFXLC, HFXI 또는 이들의 초가변 (즉, CDR) 서열의 사용에 제한되지 않는다. 자기제한 중화 활성이라는 특징을 갖 는 임의의 다른 적절한 고친화도 항체 및 상응하는 CDR이 대신 사용될 수도 있다. 다음 설명에서 공여체 항체를 BC1, BC2, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFXLC, HFXI로서 나타낸 것은 단지 예시 및 설명의 단순화를 위한 것이다.
또한, 본 발명은 적절한 인간 응고 인자 또는 보조인자에 대한 mAb로부터 유래한 Fab 단편 또는 F(ab')2 단편의 사용을 포함한다. 이들 단편은 응고 인자, 바람직하게는 인자 IX/IXa, X/Xa, VIII/VIIIa, V/Va, VII/VIIa 또는 트롬빈/프로트롬빈에 대하여 자기제한 중화 활성을 갖는 물질로서 유용하다. Fab 단편은 전체 경쇄 및 중쇄의 아미노 말단부를 함유한다. F(ab')2 단편은 이황화 결합에 의해 결합된 2개의 Fab 단편에 의해 형성된 단편이다. mAb인 BC1, BC2, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFXLC 및 HFXI 및 다른 유사한 고친화도 항체는, 예를 들어 적절한 단백질 분해 효소인 파파인 및(또는) 펩신을 사용한 mAb의 분해 또는 재조합 방법 등의 통상적인 방법에 의해 수득할 수 있는 Fab 단편 및 F(ab')2 단편의 공급원을 제공한다. 이들 Fab 및 F(ab')2 단편은 그 자체로 치료제, 예방제 또는 진단제로서 유용하고, 본원에서 기술한 재조합 또는 인간화 항체의 형성에 있어서 가변 영역 및 CDR 서열을 포함하는 서열의 공여체로서 유용하다.
Fab 및 F(ab')2 단편은 조합 파지 라이브러리 (문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12:433-455 (1994)] 참조) 또는 면역글로불린쇄 셔플링 (문헌 [Marks et al., Bio/Technology, 10779-783 (1992)] 참조)에 의해 제조할 수 있다. 상기 문헌들은 이 거명을 통해 그 전문이 본원에 참고로 포함되어 있고, 선택된 항체(예를 들어, BC2)로부터의 Fd 또는 VH 면역글로불린은 경쇄 면역글로불린 VL (또는 VK)의 군과 결합하여 신규 Fab를 형성할 수 있다. 반대로, 선택된 항체로부터의 경쇄 면역글로불린은 중쇄 면역글로불린 VH (또는 Fd)의 군과 결합하여 신규 Fab를 형성할 수 있다. 자기제한 중화성 인자 IX의 Fab는 mAb BC2의 Fd를 경쇄 면역글로불린의 군과 결합시켜 수득할 수 있다. 따라서, 쇄 셔플링 기술로부터 특유한 서열 (뉴클레오티드 및 아미노산)을 갖는 중화성 Fab를 수득할 수 있다.
상기 설명한 mAb BC2 또는 다른 항체는 공여체 항체의 항원 결합 특이성에 의해 특성화되는 다양한 변형 항체의 고안 및 수득에 유용한, 가변 중쇄 및(또는) 경쇄 펩티드 서열, 프레임워크 서열, CDR 서열, 기능성 단편 및 그의 유사체, 및 이들을 코딩하는 핵산 서열과 같은 서열을 제공할 수 있다.
또한, 가변 경쇄 및 중쇄 펩티드 서열을 코딩하는 본 발명의 핵산 서열 또는 그의 단편은 CDR 또는 프레임워크 영역을 코딩하는 핵산 서열 내에 특이적 변화의 돌연변이적 도입에 유용하며, 또한 생성되는 변형 또는 융합 핵산 서열 발현용 플라스미드 내로의 도입에 유용하다. 예를 들어, 프레임워크 및 CDR 코딩 영역의 뉴클레오티드 서열 내의 침묵 치환을 사용하여, 돌연변이된 CDR 및(또는) 프레임워크 영역의 삽입을 촉진하는 제한효소 부위를 생성시킬 수 있다. 상기 CDR 코딩 영역은 본 발명의 인간화 항체의 제조에 사용될 수 있다.
BC2 중쇄 가변 영역의 핵산 및 아미노산 서열은 서열 5 및 7에 나타내었다. 상기 서열로부터의 CDR 서열은 서열 8, 9 및 10에 나타내었다.
BC2 경쇄 가변 영역의 핵산 및 아미노산 서열은 서열 6 및 11에 나타내었다. 상기 서열로부터의 CDR 서열은 서열 12, 13 및 14에 나타내었다.
유전자 코드의 축퇴성을 고려하여, 가변 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열 및 본 발명의 CDR 서열 뿐만 아니라 공여체 항체의 항원 특이성을 공유하는 그의 기능성 단편 및 유사체를 코딩하는 다양한 코딩 서열을 제조할 수 있다. 가변쇄 펩티드 서열 또는 CDR을 코딩하는 본 발명의 단리된 핵산 서열 또는 그의 단편을 사용하여 변형 항체, 예를 들어 제2 면역글로불린 파트너와 작동가능하게 조합시에 본 발명의 키메라 또는 인간화 항체 또는 다른 공학 처리된 항체를 생성시킬 수 있다.
본원에서 설명하는 변형 항체 및 항체들의 일부를 코딩하는 단리된 핵산 서열 이외에, 천연 CDR 코딩 서열에 상보적인 서열 또는 CDR 코딩 영역 주위의 변형 인간 프레임워크 영역에 상보적인 서열과 같은 기타 핵산 서열도 본 발명에 포함됨을 알아야 한다. 유용한 DNA 서열에는 엄격한 혼성화 조건 하에서 상기 DNA 서열에 혼성화하는 서열이 포함된다 (문헌 [T. Maniatis et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory (1982), pp. 387-389] 참조). 엄격한 혼성화 조건의 일례로는 65℃에서 4XSSC로 혼성화시킨 후 65℃에서 1시간 동안 0.1XSSC로 세척하는 것이 있다. 별법으로, 엄격한 혼성화 조건의 다른 예로는 42℃에서의 50％ 포름아미드, 4XSSC가 있다. 바람직하게는, 상기 혼성화 DNA 서열은 길이가 약 18개 이상의 뉴클레오티드, 즉 대략 CDR의 크기이다.
변형 면역글로불린 분자는 키메라 항체 및 인간화 항체와 같이 공학 처리된 항체를 포함하는 변형 항체를 코딩할 수 있다. 목적하는 변형 면역글로불린 코딩 영역은 인간 프레임워크 또는 인간 면역글로불린 가변 영역과 같은 제1 면역글로불린 파트너 내로 삽입되는, 인자 IX/IXa, X/Xa, XI/XIa, VIII/VIIIa, V/Va, VII/VIIa 또는 트롬빈/프로트롬빈 항체, 바람직하게는 본 발명에 의해 제공되는 것과 같은 고친화도 항체의 항원 특이성을 갖는 펩티드를 코딩하는 CDR 코딩 영역을 함유한다.
바람직하게는 제1 면역글로불린 파트너는 제2 면역글로불린 파트너에게 작동가능하게 연결된다. 제2 면역글로불린 파트너는 상기 정의된 바와 같고, 목적하는 제2 항체 영역, 예를 들어 Fc 영역을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 제2 면역글로불린 파트너는 또한 경쇄 또는 중쇄 불변 영역이 프레임 내에 또는 링커 서열을 통하여 융합되는 다른 면역글로불린을 코딩하는 서열을 포함할 수도 있다. 응고 인자의 기능성 단편 또는 유사체에 대한 공학 처리된 항체는 동일한 항체와의 결합이 증진되도록 고안될 수 있다.
또한, 제2 면역글로불린 파트너는 제2 면역글로불린 파트너가 통상의 수단에 의해 작동가능하게 연결될 수 있는, 비단백질성 캐리어 분자를 비롯하여 상기 정의된 이펙터 물질과 결합할 수 있다.
제2 면역글로불린 파트너, 예를 들어 항체 서열과 이펙터 물질 사이의 융합 또는 결합은 임의의 적합한 수단, 예를 들어 통상의 공유결합 또는 이온결합, 단백질 융합 또는 이종-2기능성 교차 결합제 (예를 들어, 카르보디이미드, 글루타르알데히드 등)에 의해 이루어질 수 있다. 이러한 기술은 당업계에 공지되어 있고, 통 상의 화학 및 생화학 교재에 기재되어 있다.
또한, 단순히 제2 면역글로불린 파트너와 이펙터 물질 사이에 요구되는 만큼의 공간을 제공하는 통상의 링커 서열을 변형 면역글로불린 코딩 영역 내로 도입할 수 있다. 이러한 링커의 고안은 당업자에게 잘 알려져 있다.
또한, 발현을 증진시키기 위한 본 발명의 분자에 대한 신호 서열은 당업자에게 잘 알려져 있다.
바람직한 변형 항체는 mAb BC2, 예를 들어 VH 및 VL 쇄의 항원 특이성을 갖는 가변 중쇄 및(또는) 경쇄 펩티드 또는 단백질 서열을 함유한다. 본 발명의 다른 바람직한 변형 항체는 쥐의 항체 분자 BC2의 중쇄 및(또는) 경쇄의 가변 영역의 CDR을 하나 이상, 바람직하게는 전부 함유하는 아미노산 서열이고, 나머지 서열은 인간 공급원에서 유래한 서열 또는 그의 기능성 단편 또는 유사체인 아미노산 서열에 의해 특성화된다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 변형 항체에는 추가의 물질이 부착될 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 기술을 사용하여 완전한 항체 분자의 Fc 단편 또는 CH2 CH3 도메인이 효소 또는 다른 검출가능한 분자 (즉, 폴리펩티드 이펙터 또는 리포터 분자)로 대체된 본 발명의 변형 항체를 생성시킬 수 있다.
또한, 제2 면역글로불린 파트너는 응고 인자, 바람직하게는 인자 IX/IXa, X/Xa, XI/XIa, VIII/VIIIa, V/Va, VII/VIIa 또는 트롬빈/프로트롬빈에 대한 항원 특이성을 갖는 CDR 함유 서열에 이종성인 비면역글로불린 펩티드, 단백질 또는 그 의 단편에 작동가능하게 연결될 수 있다. 생성되는 단백질은 발현시에 항원 특이성 및 비면역글로불린의 특성을 모두 보일 수 있다. 이러한 융합 파트너의 특성은, 예를 들어 다른 결합 또는 수용체 도메인과 같은 기능적 특성이거나, 또는 융합 파트너 자체가 치료 단백질인 경우의 치료 특성이거나, 또는 추가의 항원 특성일 수 있다.
본 발명의 또다른 바람직한 단백질은 전장의 중쇄 및 경쇄를 갖는 완전한 항체 분자 또는 그의 임의의 불연속 단편, 예를 들어 Fab 및 F(ab')2 단편, 중쇄 다이머 또는 그의 임의의 최소 재조합 단편, 예를 들어 FV 또는 단일쇄 항체 (SCA) 또는 선택된 공여체 mAb, 예를 들어 mAb BC1, BC2, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFXLC 또는 HFXI와 동일한 특이성을 갖는 임의의 기타 분자를 포함할 수 있다. 그러한 단백질은 변형 항체의 형태로, 또는 그의 비융합 형태로 사용될 수 있다.
제2 면역글로불린 파트너가 공여체 항체와 상이한 항체, 예를 들어 면역글로불린 프레임워크 또는 불변 영역의 임의의 이소타입 또는 클래스에서 유래할 때는 항상 공학 처리된 항체가 생성된다. 공학 처리된 항체는 특정 공급원, 예를 들어 수용체 항체로부터의 면역글로불린(Ig) 불변 영역 및 가변 프레임워크 영역, 및 본원에서 기술된 공여체 항체, 예를 들어 항-인자 IX/IXa, X/Xa, XI/XIa, VIII/VIIIa, V/Va, VII/VIIa 또는 트롬빈/프로트롬빈 항체로부터의 1종 이상의 (바람직하게는 전부) CDR을 포함할 수 있다. 또한, 핵산 또는 아미노산 수준에서 수용체 mAb 경쇄 및(또는) 중쇄 가변 도메인 프레임워크 영역 또는 공여체 CDR 영역 의 변형 (예를 들어, 결실, 치환 또는 삽입)은 공여체 항체 항원 결합 특이성을 보유하기 위해서 실시될 수 있다.
이러한 공학 처리된 항체는 응고 인자 mAb (상기한 바와 같이 임의로 변형된)의 가변 중쇄 및(또는) 경쇄의 하나 (또는 두 개), 또는 하나 이상의 중쇄 또는 경쇄 CDR을 사용하여 고안된다. 본 발명의 공학 처리된 항체는 자기제한 중화 활성을 나타낸다.
이러한 공학 처리된 항체는 선택된 인간 면역글로불린 또는 서브타입의 프레임워크 영역을 함유하는 인간화 항체, 또는 응고 인자 항체의 기능성 단편에 융합된 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 함유하는 키메라 항체를 포함할 수 있다. 적합한 인간 (또는 다른 동물) 수용체 항체는 통상의 데이타베이스, 예를 들어 KABAT(등록상표) 데이타베이스, 로스 알라모스 (Los Alamos) 데이타베이스 및 스위스 프로테인 (Swiss Protein) 데이타베이스로부터 공여체 항체의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열과의 상동성에 의해 선택될 수 있다. 공여체 항체의 프레임워크 영역에 대해 상동성 (아미노산 기준으로)을 갖는 특징이 있는 인간 항체가 공여체 CDR의 삽입을 위한 중쇄 가변 프레임워크 영역의 제공에 적합할 수 있다. 경쇄 가변 프레임워크 영역을 제공할 수 있는 적합한 수용체 항체는 유사한 방식으로 선택될 수 있다. 수용체 항체의 중쇄 및 경쇄는 동일한 수용체 항체로부터 유래하지 않아도 된다는 것을 유의하여야 한다.
바람직하게는, 이종성 프레임워크 및 불변 영역은 인간 면역글로불린 클래스 및 이소타입, 예를 들어 IgG (서브타입 1 내지 4), IgM, IgA 및 IgE로부터 선택된 다. 그러나, 수용체 항체가 인간 면역글로불린 단백질 서열만을 포함할 필요는 없다. 예를 들어, 인간 면역글로불린쇄의 일부를 코딩하는 DNA 서열이 폴리펩티드 이펙터 또는 리포터 분자와 같은 비면역글로불린 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열에 융합된 유전자를 제조할 수 있다.
특히 바람직한 인간화 항체는 선택된 인간 항체 서열의 프레임워크 영역 상에 삽입된 BC2의 CDR을 함유한다. 중화성 인간화 항체의 경우, 인자 IX 항체의 중쇄 및(또는) 경쇄 가변 영역으로부터 유래한 1개, 2개, 또는 바람직하게는 3개의 CDR이, 선택된 인간 항체 서열의 프레임워크 영역 내에 삽입되어 인간 항체의 천연 CDR을 대체한다.
인간화 항체에서, 인간 중쇄 및 경쇄 모두의 가변 도메인은 하나 이상의 CDR 치환에 의해 공학 처리되는 것이 바람직하다. 6개의 CDR 모두, 또는 6개 미만의 CDR의 다양한 조합을 사용할 수도 있다. 6개의 CDR이 모두 치환되는 것이 바람직하다. 경쇄로서 인간 수용체 항체로부터 유래한 비변형 경쇄를 사용하여 인간 중쇄에서만 CDR을 치환시키는 것도 가능하다. 별법으로, 적합한 경쇄는 통상의 항체 데이타베이스를 통하여 다른 인간 항체로부터 선택될 수 있다. 공학 처리된 항체의 나머지 부분은 임의의 적합한 수용체 인간 면역글로불린으로부터 유래될 수 있다.
따라서, 공학 처리된 인간화 항체는 천연 인간 항체 또는 그의 단편의 구조를 갖고, 효과적인 치료 용도, 예를 들어 사람에게서 혈전증 및 색전증의 치료를 위하여 필요한 특성들의 조합을 보유하는 것이 바람직하다.
가장 바람직하게는, 인간화 항체는 서열 31, 52 또는 89에 나타낸 중쇄 아미노산 서열을 갖는다. 또한, 가장 바람직한 인간화 항체는 서열 44, 57, 62, 74, 78 또는 99에 나타낸 경쇄 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 특히 바람직한 항체는 중쇄가 서열 31의 아미노산 서열을 갖고 경쇄가 서열 44의 아미노산 서열을 갖는 인간화 항체 SB 249413이다. 또한, 특히 바람직한 항체는 중쇄가 서열 52의 아미노산 서열을 갖고 경쇄가 서열 57의 아미노산 서열을 갖는 인간화 항체 SB 249415이다. 또한, 특히 바람직한 항체는 중쇄가 서열 52의 아미노산 서열을 갖고 경쇄가 서열 62의 아미노산 서열을 갖는 인간화 항체 SB 249416이다. 또한, 특히 바람직한 항체는 중쇄가 서열 52의 아미노산 서열을 갖고 경쇄가 서열 74의 아미노산 서열을 갖는 인간화 항체 SB 249417이다. 또한, 특히 바람직한 항체는 중쇄가 서열 52의 아미노산 서열을 갖고 경쇄가 서열 78의 아미노산 서열을 갖는 인간화 항체 SB 257731이다. 또한, 특히 바람직한 항체는 중쇄가 서열 89의 아미노산 서열을 갖고 경쇄가 서열 99의 아미노산 서열을 갖는 인간화 항체 SB 257732이다.
당업자는 공학 처리된 항체가 공여체 항체 (즉, 유사체)의 특이성 및 고친화도에 본질적으로 영향을 미치지는 않으면서 가변 도메인 아미노산의 변화에 의해 추가로 변형될 수 있음을 이해할 것이다. 중쇄 및 경쇄 아미노산은 가변 도메인 프레임워크 또는 CDR 중 어느 하나 또는 둘 모두에서 다른 아미노산으로 치환될 수 있음이 예상된다. 이러한 치환은 공여체 항체 또는 특정 하위그룹으로부터의 콘센서스 (consensus) 서열에 의해 제공될 수 있다.
또한, 불변 영역은 본 발명의 분자의 선택성, 예를 들어 다이머 형성, Fc 수 용체에 대한 결합, 또는 상보체에 결합하여 활성화시키는 능력을 증진시키거나 감소시키도록 변형될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Angal et al., Mol. Immunol, 30, 105-108 (1993), Xu et al., J. Biol. Chem, 269, 3469-3474 (1994), Winter et al., EP 307434-B] 참조).
키메라 항체인 변형 항체는, 경쇄 및 중쇄에 대한 인간 면역글로불린 불변 영역과 결합된 프레임워크 영역을 비롯하여 전체 비인간 공여체 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 제공함으로써 상기한 인간화 항체와 상이하다. 본 발명의 인간화 항체에 비해 추가의 비인간 서열을 보유하는 키메라 항체는 인간에게서 상당한 면역 반응을 유도할 수 있을 것으로 예상된다.
상기 항체는 후술되는 혈전증 및 색전증 장애의 예방 및 치료에 유용하다.
가변 경쇄 및(또는) 중쇄 서열과, mAb BC2 또는 다른 적합한 공여체 mAb, 예를 들어 BC1, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFXLC, HFXI의 CDR, 및 이들의 코딩 핵산 서열은 하기 방법에 의한 본 발명의 변형 항체, 바람직하게는 인간화 항체의 제조에 유용하다. 또한, 동일하거나 유사한 기술을 이용하여 본 발명의 다른 실시양태를 구성할 수 있다.
선택된 공여체 mAb, 예를 들어 쥐의 항체 BC2를 생성하는 하이브리도마는 통상적으로 클로닝되고, 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 DNA는 당업자에게 공지된 기술, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd Ed., Cold Sprin Harbor Laboratory (1989)]에 기재된 기술에 의해 수득할 수 있다. 적어도 CDR 코딩 영역을 함유하는 BC2의 가변 중쇄 및 경쇄 영 역, 및 공여체 mAb 결합 특이성을 보유하기 위해서 필요한 수용체 mAb 경쇄 및(또는) 중쇄 가변 도메인 프레임워크 영역의 부분 뿐만 아니라 인간 면역글로불린으로부터 유래한 항체 쇄의 나머지 면역글로불린 유래 부분은 폴리뉴클레오티드 및 역전사 효소를 사용하여 수득된다. CDR 코딩 영역은 공지의 데이타베이스를 사용하여 다른 항체들과 비교함으로써 확인된다.
다음으로, 마우스/인간 키메라 항체를 제조하여 결합 능력을 분석할 수 있다. 이러한 키메라 항체는 경쇄 및 중쇄에 대한 인간 Ig 불변 영역과 함께 전체 비인간 공여체 항체 VH 및 VL 영역을 함유한다.
인간 항체에서 유래한 중쇄 가변 영역의 상동성 프레임워크 영역은 컴퓨터 데이타베이스, 예를 들어 KABAT(등록상표)을 사용하여 확인하고, BC2에 상동성을 갖는 인간 항체를 수용체 항체로서 선택한다. 인간 항체 프레임워크 내에 BC2 CDR 코딩 영역을 함유하는 합성 중쇄 가변 영역의 서열은 제한 부위를 도입하기 위해서 프레임워크 영역 내의 임의의 뉴클레오티드 치환을 사용하여 고안된다. 이어서, 이 고안된 서열은 장쇄의 합성 올리고머를 사용하여 합성된다. 별법으로, 고안된 서열은 중첩 (overlapping) 올리고뉴클레오티드에 의해서 합성되고, 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭되고, 합성 오류에 대하여 보정될 수 있다. 적합한 경쇄 가변 프레임워크 영역은 유사한 방식으로 고안될 수 있다.
인간화 항체는 키메라 항체로부터 유래될 수 있거나, 바람직하게는 선택된 중쇄 및 경쇄 프레임워크 내에 중쇄 및 경쇄로부터 유래한 공여체 mAb CDR 코딩 영 역을 적절하게 삽입하여 합성에 의해 제조할 수 있다. 별법으로, 본 발명의 인간화 항체는 표준 돌연변이 유발 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 따라서, 생성되는 인간화 항체는 인간 프레임워크 영역 및 공여체 mAb CDR 코딩 영역을 함유한다. 그 후에, 프레임워크 잔기를 조작할 수도 있다. 생성되는 인간화 항체는 재조합 숙주 세포, 예를 들어 COS, CHO 또는 골수종 세포에서 발현될 수 있다. 다른 적합한 인자 IX 특이적 또는 다른 응고 인자 특이적, 자기제한, 중화성, 고친화도, 비인간 항체에 대한 다른 인간화 항체가 상기 기술을 이용하여 제조될 수도 있다.
통상의 발현 벡터 또는 재조합 플라스미드는 숙주 세포 내에서의 복제 및 발현 및(또는) 숙주 세포로부터의 분비를 조절할 수 있는 통상의 조절 서열과 변형 항체에 대한 상기 코딩 서열을 작동가능하게 결합시켜 생성한다. 조절 서열은 프로모터 서열, 예를 들어 CMV 프로모터, 및 다른 공지 항체로부터 유래할 수 있는 신호 서열을 포함한다. 유사한 방식으로, 상보성 항체 경쇄 또는 중쇄를 코딩하는 DNA 서열을 갖는 제2 발현 벡터를 제조할 수 있다. 상기 제2 발현 벡터는 가능한 한 각각의 폴리펩티드 쇄가 기능적으로 발현되는 것을 보장하기 위해서 코딩 서열 및 선별가능 마커를 제외하고는 제1 발현 벡터와 동일하다. 별법으로, 변형 항체의 중쇄 및 경쇄 코딩 서열이 1개의 벡터 상에 존재할 수도 있다.
선택된 숙주 세포는 제1 및 제2 벡터 모두로 통상적인 기술을 사용하여 동시 형질감염시킴으로써 (또는 단일 벡터로 간단히 형질감염시킴) 재조합 또는 합성의 경쇄 및 중쇄 모두를 포함하는 본 발명의 형질감염 숙주 세포를 제조한다. 이어서 형질 감염 세포는 통상의 기술로 배양하여 본 발명의 공학 처리된 항체를 제조한 다. 재조합 중쇄 및(또는) 경쇄 모두의 결합체를 포함하는 인간화 항체는 ELISA 또는 RIA와 같은 적당한 분석법으로 배양물로부터 스크리닝된다. 통상적인 유사한 기술을 사용하여 본 발명의 다른 변형 항체 및 분자를 작제할 수 있다.
본 발명의 방법 및 본 발명의 조성물의 작제법에 사용되는 클로닝 및 서브클로닝 단계에서의 적당한 벡터는 당업자에 의해 선택될 수 있다. 애머샴 (Amersham) 또는 파마시아 (Pharmacia)와 같은 공급원으로부터 구입가능한 pUC19와 같은 pUC 시리즈의 클로닝 벡터를 사용할 수 있다. 또한, 용이하게 복제할 수 있고 풍부한 클로닝 부위 및 선별가능한 유전자 (예를 들어, 항생제 내성)를 가지며 쉽게 조작되는 임의의 벡터를 클로닝에 사용할 수 있다. 따라서, 클로닝 벡터의 선택은 본 발명에서 제한 요소가 아니다.
유사하게, 본 발명에 따른 공학 처리된 항체의 발현에 사용되는 벡터는 임의의 통상의 벡터로부터 당업자에 의해 선택될 수 있다. 벡터는 또한 선택된 숙주 세포 내에서 이종 DNA 서열을 복제시키고 발현시키는 선택된 조절 서열 (예를 들어, CMV 프로모터)을 포함한다. 상기 벡터는 공학 처리된 항체 또는 변형 면역글로불린 코딩 영역을 코딩하는 상기 DNA 서열을 포함한다. 또한, 이 벡터들은 용이한 조작을 위하여 원하는 제한효소 부위를 삽입하여 변형시킨 선택된 면역글로불린 서열이 삽입될 수 있다.
발현 벡터는 또한 이종 DNA 서열, 예를 들어 포유류 디히드로폴레이트 환원효소 유전자 (DHFR)의 발현을 증폭시키는 데 적당한 유전자로 특성화될 수 있다. 다른 바람직한 벡터 서열은, 예를 들어 소 성장 호르몬 (BGH)으로부터의 폴리 A 신 호 서열 및 베타글로빈 프로모터 서열 (betaglopro)을 포함한다. 본 명세서에서 유용한 발현 벡터는 당업자들에게 널리 알려진 기술로 합성할 수 있다.
상기와 같은 벡터의 성분, 예를 들어 레플리콘 (replicon), 선별 유전자, 인핸서, 프로모터, 신호 서열 등은 선택된 숙주 내에서 재조합 DNA의 생성물을 발현시키고(시키거나) 분비시키는 데 사용하기 위하여 구입하거나, 천연 원료로부터 수득하거나, 또는 공지된 방법으로 합성할 수 있다. 또한, 포유류, 세균류, 곤충류, 효모류 및 진균류 발현용으로 당업계에 공지된 다수 유형의 다른 적당한 발현 벡터를 상기 목적을 위하여 선택할 수 있다.
본 발명은 또한 공학 처리된 항체 또는 그의 변형된 면역글로불린 분자의 코딩 서열을 포함하는 재조합 플라스미드로 형질감염된 세포주를 포함한다. 상기 클로닝 벡터의 클로닝 및 다른 조작에 유용한 숙주 세포도 또한 통상적인 것이다. 그러나, 가장 바람직하게는 이. 콜라이 (E. coli)의 다양한 균주로부터의 세포가 본 발명의 변형 항체의 작제에 있어서 클로닝 벡터의 복제 및 다른 단계에 사용된다.
본 발명의 공학 처리된 항체 또는 변형 항체의 발현에 적합한 숙주 세포 또는 세포주는 바람직하게는 CHO, COS, 섬유아 세포 (예를 들어, 3T3) 및 골수 세포와 같은 포유류 세포이며, 보다 바람직하게는 CHO 또는 골수 세포이다. 인간 세포를 사용함으로써 인간 글리코실화 패턴으로 분자를 변형시킬 수 있다. 별법으로는 다른 진핵 세포주를 사용할 수 있다. 적합한 포유류 세포, 형질전환 방법, 배양 방법, 증폭 방법, 스크리닝 방법 및 생성물 생산 방법과 정제 방법의 선택은 당업 계에 공지되어 있다 (예를 들어, 상기 Sambrook et al.의 문헌 참조).
본 발명의 재조합 Fab의 발현을 위해 적합한 숙주 세포로서 세균류 세포가 유용한 것으로 판명될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Plueckthun, A., Immunol. Rev, 130, 151-188 (1992)] 참조). 그러나, 세균류 세포 내에서 발현되는 단백질은 비폴딩 형태 또는 부적당하게 폴딩된 형태 또는 비글리코실화 형태로 되는 경향이 있기 때문에, 세균류 세포에서 생산되는 모든 재조합 Fab는 항원 결합능의 보유에 대하여 스크리닝되어야 한다. 세균류 세포에 의해 발현되는 분자가 정확히 폴딩된 형태로 생산된다면 상기 세균류 세포는 바람직한 숙주일 것이다. 예를 들어, 발현에 사용되는 다양한 이. 콜라이 균주는 생명공학 분야에서 숙주 세포로 널리 알려져 있다. 비. 서브틸리스 (B. subtilis), 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 및 다른 바실러스 (Bacullus) 등의 다양한 균주도 또한 사용될 수 있다.
원한다면 당업자에게 공지된 효모 균주, 및 곤충류 세포주, 예를 들어 드로소필라 (Drosophila) 및 레피도프테라 (Lepidoptera)와 바이러스 발현 시스템도 또한 숙주 세포로서 이용 가능하다 (예를 들어, 문헌 [Miller et al., Genetic Engineering, 8, 277-298 (1986), Plenum Press] 및 이 문헌에 인용되어 있는 참고문헌 참조).
본 발명의 벡터를 작제할 수 있는 일반적인 방법, 본 발명의 숙주 세포를 제조하는 데 필요한 형질감염 방법, 및 상기와 같은 숙주 세포로부터의 본 발명의 변형 항체의 생산에 필요한 배양 방법 모두는 종래 기술이다. 또한, 본 발명의 변형 항체는 일단 생산되면 황산암모늄 침전법, 친화도 컬럼, 컬럼 크로마토그래피, 겔 전기영동법 등을 비롯한 당업계의 표준 방법에 따라 세포 배양 내용물로부터 정제할 수 있다. 상기와 같은 기술은 당업계의 기술 범위 내에 존재하며 본 발명을 한정하지 않는다.
인간화 항체의 다른 발현 방법은, 미국 특허 제4,873,316호에 기재된 바와 같이 트랜스제닉 (transgenic) 동물에서의 발현법을 사용할 수 있다. 상기의 방법은 포유류 내로 트랜스제닉하게 삽입될 경우 암컷이 그의 모유 중에 원하는 재조합 단백질을 생산하게 하는 동물 카제인 프로모터를 사용하는 발현 시스템과 관련된 것이다.
원하는 방법으로 일단 발현되면, 공학 처리된 항체를 그 후 적당한 분석법을 사용하여 시험관내 활성에 대하여 조사한다. 현재, 통상적인 ELISA 분석 포맷을 사용하여 인자 IX 또는 다른 적당한 응고 인자에 대한 공학 처리된 항체의 결합을 정성적으로 그리고 정량적으로 평가한다. 또한, 다른 시험관내 분석법을 사용하여 일반적인 클리어런스 (clearance) 메카니즘에도 불구하고 체내에서 공학 처리된 항체가 존속하는 지를 평가하기 위하여 수행되는 후속 인간 임상 연구 이전에 중화 효능을 증명할 수 있다.
BC2로부터 제조된 인간화 항체에 대하여 기술된 방법에 따라 당업자는 본 명세서에 기술되어 있는 다른 공여체 항체로부터의 인간화 항체, 가변 영역 서열 및 CDR 펩티드를 또한 작제할 수 있다. 공학 처리 항체는 자신의 수용자에 의해 "자기 (self)"로서 잠재적으로 인지되는 가변 영역 구조를 갖도록 생성될 수 있다. 가변 영역 구조에 대한 미미한 변형은 수용자에 있어서 면역성을 거의 증가시키지 않고 항원 결합에서의 큰 증가를 달성하게 할 수 있게 해준다. 상기와 같은 공학 처리 항체는 응고 인자 매개 질환에 대해 인간을 효과적으로 치료할 수 있다. 그러한 항체는 상기와 같은 질환의 진단에도 유용할 수 있다.
본 발명은 또한 동물, 특히 인간에 있어서 자기제한 중화 활성을 갖는 항-응고 인자 모노클로날 항체의 유효량을 플라즈미노겐 활성화제와 조합하여 투여하는 것을 포함하는 혈전증의 억제 방법에 관한 것이다. 조합 요법은 혈류 회복에 대한 시간을 감소시키고 혈관 재관류의 빈도 및 총 지속 시간을 증가시키는 부분 최적 농도의 플라즈미노겐 활성화제 농도에서 혈전 용해를 증진시킨다. 헤파린과는 반대로, 조합 요법은 정상 지혈 기능을 거의 방해하지 않고, 피브리노겐, 플라즈미노겐 및 알파-2-항플라즈민의 양을 고갈시키지도 않는다. 따라서, 본 발명은 고유의 응고 경로 성분을 특이적 표적으로 하는 항응고제를 혈전 용해제와 조합하여 투여하는 것을 포함하는, 동물에서 혈전증 치료시 혈전 용해제의 필요 투여량을 감소시키는 방법에 관한 것이다.
바람직하게는, 응고 인자는 고유의 또는 통상적인 응고 경로로부터의 것이다. 가장 바람직하게는, 항-응고 인자 모노클로날 항체는 항-인자 IX, 항-인자 IXa, 항-인자 X, 항-인자 Xa, 항-인자 XI, 항-인자 XIa, 항-인자 VIII, 항-인자 VIIIa, 항-인자 V, 항-인자 Va, 항-인자 VII, 항-인자 VIIa, 항-트롬빈 또는 항-프로트롬빈이다. mAb는 본 명세서에 기술되어 있는 하나 이상의 공학 처리된 항체 또는 변형 항체, 또는 그의 단편들을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 플라즈미노겐 활성화제가 tPA, 스트렙토키나아제, 유로키나아 제이다. 특히 바람직한 것은 tPA이다. 또한 바람직한 것으로는, 문헌 [Tachias and Madison, J Biol Chem, 272, 14580-14585 (1997)], [Fujise et al., Circulation, 95, 715-722 (1997)], [Coombs et al., J Biol Chem, 273, 4323-4328 (1998)] 및 [Van de Werf et al., Am Heart J, 137, 786-791 (1999)]에 기재된 tPA 변이체, 및 스트렙토키나아제 및 유로키나아제 변이체, 예를 들어 단일쇄 유로키나아제 플라즈미노겐 활성화제, 아실화 플라즈미노겐 스트렙토키나아제 활성화제 복합체, 흡혈 박쥐 기원의 스타필로키나아제 및 플라즈미노겐 활성화제가 있다.
별법으로 아세틸살리실산을 항-응고 인자 모노클로날 항체와 조합하여 투여할 수 있다. 몇몇 경우, 조합 요법에서 항-응고 인자 모노클로날 항체의 치료 유효량이 감소된다.
본 발명의 분자를 사용함으로써 야기되는 치료적 반응은 각각의 응고 인자에 결합함으로써 그리고 그 후의 응고 캐스케이드의 자기제한 억제에 의해 생성될 수 있다. 따라서, 본 발명의 분자는 치료 용도에 적당한 제제 및 조성물 중에서 심근 경색, 불안정형 협심증, 심방세동, 뇌졸중, 신장애, 폐 색전증, 심정맥 혈전증, 및 인공 기관 및 보철 이식물 등과 관련된 비정상적인 응고 활성을 일으킬 수 있거나 또는 겪고 있는 사람에게 매우 바람직하다. 특히 바람직한 용도는 심근 경색에 사용되는 것이다.
다른 바람직한 용도는 혈전 색전증 후에 유도된 허혈의 치료에 사용되는 것이다. 따라서, 본 발명은 항-인자 IX 항체 또는 항체 단편을 투여하는 것을 포함하는, 동물의 혈전 색전증 후에 유도된 허혈의 치료 방법에 관한 것이다. 항체 또 는 그 단편은 색전 후에, 즉 맥관 구조 중 어느 곳에서 기원한 응혈이 대뇌 맥관 구조 내로 이동하여 혈류을 차단 및(또는) 감소시킴으로써 허혈을 유발한 후에 투여될 수 있다. 또한, 항체 또는 그 단편은 뇌졸중 후에, 즉 색전 형성으로부터 기인한 손상된 신경 기능의 개체 또는 관찰자의 일부를 인식한 후에 투여될 수도 있다. 또한, 본 발명은 항-인자 IX 항체 또는 항체 단편을 플라즈미노겐 활성화제와 조합하여 투여하는 것을 포함하는, 동물의 혈전 색전증 후에 유도된 허혈의 치료 방법에 관한 것이다. 항체 또는 그 단편, 및 플라즈미노겐 활성화제는 색전 후에 또는 뇌졸중 후에 투여될 수 있다. 이들 치료 방법은 부행 (collateral) 혈관에서 혈관 재관류를 유지시켜 준다. 본 발명의 손상 후 치료 방법은, 경색 조직의 증식 및 보다 심각한 신경 결함을 초래할 수 있는 허혈층에서의 지속적인 병리학적 혈전과 같은 장기간 허혈의 영향력을 완화시켜 준다.
또한, 본 발명은 항-인자 IX 항체를 혈전 용해제와 조합하여 투여하는 동물의 혈전 색전증 후에 유도된 허혈의 치료시 혈전 용해제의 필요 투여량을 감소시키는 방법에 관한 것이다.
다른 바람직한 용도는 혈전 색전성 뇌졸중에 걸리기 쉬운 동물에게 예방 목적으로 투여하는 것이다. 따라서, 본 발명은 혈전 색전성 뇌졸중에 걸릴 위험이 있는 동물에게 항-인자 IX 항체를 투여하는 것을 포함하는, 동물에게서 혈전 색전성 뇌졸중을 예방하는 방법에 관한 것이다. 혈전 색전성 뇌졸중에 걸릴 위험이 있는 동물에는 심방세동에 걸리기 쉬운 환자, 또는 외과적 중재 시술 또는 기타 전구응고제 관련 기술을 수행중인 환자가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 변형 항체, 항체 및 그의 단편들은 또한 다른 항체, 특히 본 발명의 공학 처리된 항체에 대한, 질환과 관련있는 다른 마커 (에피토프)에 반응성을 갖는 인간 mAb와 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 치료제는 약 1일 내지 약 3주, 또는 필요한 기간 동안 비정상적인 응고 질환의 치료에 바람직한 것으로 여겨진다. 이는 현재 사용되는 항응고제인 헤파린 및 와르파린보다 상당히 진보된 것이다. 치료시의 투여량 및 기간은 본 발명의 분자의 인간 순환계에서의 상대적 지속 기간에 관련되며, 치료될 증상 및 환자의 일반적인 건강 상태에 따라 당업자에 의해 조정될 수 있다.
본 발명의 치료제의 투여 방식은 약제를 숙주에 전달하는 임의의 적합한 경로일 수 있다. 본 발명의 변형 항체, 항체, 공학 처리된 항체, 및 그들의 단편들과, 플라즈미노겐 활성화제 및 제약 조성물은 비경구 투여, 즉 피하, 근육내, 정맥내 또는 비내 투여에 특히 유용하다.
본 발명의 치료제는 제약상 허용되는 담체 중에 활성 성분으로서 본 발명의 공학 처리된 (예를 들어, 인간화된) 항체 및 플라즈미노겐 활성화제를 유효량으로 함유하는 제약 조성물로서 제조될 수 있다. 별법으로, 본 발명의 제약 조성물은 아세틸살리실산을 함유할 수도 있다. 본 발명의 예방제에 있어서, 주사가 용이한 형태의 공학 처리된 항체를 함유하는, 바람직하게는 생리학적 pH로 완충된 수성 현탁액 또는 수용액이 바람직하다. 비경구 투여용 조성물은 일반적으로 제약상 허용되는 담체, 바람직하게는 수성 담체에 용해된 본 발명의 공학 처리된 항체 용액 또는 그의 칵테일 용액을 포함한다. 다양한 수성 담체로는, 예를 들어 0.4％의 식염 수, 0.3％의 글리신 등이 사용될 수 있다. 상기 용액은 멸균된 것이며 일반적으로 미립자 물질이 없다. 상기 용액들은 널리 알려진 통상의 멸균 기술 (예를 들어, 여과법)로 멸균할 수 있다. 본 조성물은 pH 조정제 및 완충제 등과 같이 생리학적 조건에 근접하게 하기 위해 요구되는 제약상 허용되는 보조 물질을 함유할 수 있다. 상기와 같은 제약 조성물에서 본 발명 항체의 농도는 광범위하게, 즉 약 0.5 중량％ 미만, 일반적으로 약 1 중량％ 이상 내지 15 중량％ 이하 또는 20 중량％ 이하까지 변화시킬 수 있고, 선택된 특정 투여 방식에 따라 주로 유체 부피, 점도 등을 토대로 선택될 것이다.
따라서, 본 발명의 근육내 주사용 제약 조성물은 1 ㎖의 멸균 완충수, 및 약 1 ng 내지 약 100 mg, 예를 들어 약 50 ng 내지 약 30 mg 이상, 바람직하게는 약 5 mg 내지 약 25 mg의 본 발명의 공학 처리된 항체를 함유하도록 제조할 수 있다. 이와 유사하게, 본 발명의 정맥내 주입용 제약 조성물은 약 250 ㎖의 멸균 링거액 (Ringer's solution), 및 약 1 mg 내지 약 30 mg, 바람직하게는 5 mg 내지 약 25 mg의 본 발명의 공학 처리된 항체를 함유하도록 제조할 수 있다. 비경구적으로 투여가능한 조성물의 실제적인 제조 방법은 당업자에게 널리 알려져 있거나 또는 명백할 것이며, 예를 들어 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Science", 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania]에 더 상세하게 기술되어 있다.
본 발명의 치료제는 제약 제제의 형태일 경우 단위 투여 형태로 존재하는 것이 바람직하다. 적당한 치료 유효량은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 인간 또는 다른 동물에서의 혈전증 또는 색전증을 효과적으로 치료하기 위하여 체 중 1 kg 당 단일 투여량이 대략 0.1 mg 내지 대략 20 mg인 본 발명의 단백질 또는 항체를 비경구적으로, 바람직하게는 정맥내 또는 근육내 투여하여야 한다. 상기 투여는 필요할 경우 혈전증 반응 동안 의사에 의해 적당하다고 선택된 적당한 시간 간격으로 반복될 수 있다.
본 명세서에서 기술된 항체, 변형 항체 또는 그의 단편들은 동결건조시켜 저장할 수 있으며, 사용 직전에 적당한 담체로 재구성시킬 수 있다. 이 기술은 통상의 면역글로불린에 효과적인 것으로 밝혀졌으며, 당업계에 공지된 동결건조 기술 및 재구성 기술이 사용될 수 있다.
본 발명을 이제 하기의 비제한적인 구체예를 참고로 하여 설명할 것이다.
[실시예]
<실시예 1>
항-인자 IX 모노클로날 항체의 제조 및 스크리닝
문헌 [Jenny, R. et al., Prep. Biochem. 16, 227-245 (1986)]에 기재된 바와 같이 정제된 인간 인자 IX를 암컷 Balb/C 마우스에 주사하였다. 일반적으로, 0.15 ㎖의 인산염 완충 식염수 (PBS)에 용해되고 0.15 ㎖의 완전한 프로인드 (Freund) 보조제와 혼합된 100 ㎍의 단백질을 최초로 각 마우스에 주사하였다. 0.15 ㎖의 불완전한 프로인드 보조제를 함유하는 0.15 ㎖의 PBS 중 50 ㎍의 단백질을 사용하여 2개월 내지 3개월에 걸쳐 대략 2주마다 추가로 면역화를 수행하였다. 최종 면역화 후, 비장/골수종 세포 융합 3일 전에 PBS 중 50 ㎍의 인자 IX를 마우스에게 제공하였다. 비장 세포는 면역화 마우스로부터 단리하여 문헌 [Oi, V.T. et al. in "Selected Methods in Cellular Immunology", Mishell, B.B. and Shigii, S.M., eds., Freeman Press, San Francisco]에 기재되어 있는 바와 같이 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 NS-1 골수종 세포 (Kohler, G. et al., Eur J Immunol, 6, 292-295 (1976))와 융합시켰다. 융합 후, 이 세포를 10％의 송아지 태아 혈청을 함유하는 RPMI 1640 배지에 재현탁시켰으며, 0.5 ㎖의 복막 세척 세포 조절 배지를 포함하는 4개의 24-웰 플레이트의 각 웰에 분액을 넣었다. 다음날에, 10％의 송아지 태아 혈청을 함유하는 RPMI 1640 배지 중 2 x 10-4 M의 히포크산틴, 8 x 10-7 M의 아미노프테린 및 3.2 x 10-5 M의 티미딘 1.0 ㎖을 각 웰에 제공하였다. 매 3일 내지 4일마다 배지의 절반을 제거하고, 1 x 10-4 M의 히포크산틴 및 1.6 x 10-5 M의 티미딘을 함유하는 신선 배지로 대체시킴으로써 세포를 배양하였다.
대략 2주 후에, 1.0 ㎖의 하이브리도마 배지를 각 웰로부터 분리하여 문헌 [jenny, R.J. et al., Meth. Enzymol. 222, 400-416 (1993)]에 기재된 바와 같이 ELISA 분석법을 이용하여 항-인자 IX 항체에 대하여 시험하였다. 요컨대, 인자 IX를 96웰 마이크로타이터 플레이트의 플라스틱 웰 상에 고정시켰다. 이어서, 하이브리도마 상층액 또는 정제 항체의 희석물을 웰에서 인큐베이션시켰다. 웰을 세척하고, 홀스래디쉬 퍼옥시다제에 접합된 염소 항-쥐 면역글로불린 제2 항체 및 발색성 기질인 o-디아니시딘을 사용하여 항체-항원 복합체의 존재를 검출하였다.
항-인자 IX 항체를 포함하는 웰을 제한 희석법에 의해 서브클로닝하고, 96웰 플레이트에서 배양하였다. 클로닝된 하이브리도마 세포 배양물로부터의 상층액을 상기 ELISA 분석법으로 인자 IX에 대한 항체를 스크리닝하였고, 양성 하이브리도마로부터의 세포를 배양하여 냉동시킨 후, 액체 질소에 저장하였고, 이어서 마우스의 복수 종양으로 배양하였다.
<실시예 2>
응고시 항-응고 인자 항체의 자기제한 효과
항-응고 인자 항체의 농도를 증가시킬 경우 인간 혈장의 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간에 대한 효과를 박스터 참고 방법인 LIB0293-J (Baxter Scientific, Edison, New Jersey; 93년 3월에 개정)를 이용하여 피브로미터 (fibrometer, Becton-Dickinson Microbiology Systems, Cockeyville, Maryland)로 측정하였다.
실험 시작 전에, 5 ㎖의 튜브 중 2 내지 3 ㎖의 0.02 M CaCl2를 피브로미터의 가열 챔버 내에 넣었다. 인간 혈장 샘플은 신선하게 채취하여 얼음에서 유지하거나, 또는 헤모스타시스 레퍼런스 플라스마 (Hemostasis Reference Plasma; American Diagnostics, Greenwich, Connecticut)로부터 제조자의 권고에 따라 재구성하였다.
돼지 장 점막 (Sigma Chemical, St. Louis, Missouri)으로부터의 비분획화 헤파린, 돼지 장 점막으로부터의 저분자량 헤파린 (로베녹스 (등록상표, Lovenox), 에녹사파린 나트륨, Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals, Collegeville, Pennsylvania) 또는 mAb 항응고제를 대략 50 μM 원액으로 제조하여, 시험 혈장 내 로 직접적으로 연속 희석하였다. 항응고제가 없는 혈장을 함유하는 블랭크가 기준으로서 포함되었다.
2개의 피브로튜브 (등록상표, fibroTube) 피브로미터 컵에 100 ㎕의 시험 혈장 또는 100 ㎕의 항응고제 함유 시험 혈장 및 125 ㎕의 액틴 활성화 세팔로플라스틴 시약 (Baxter Scientific으로부터 입수가능한 엘라그산 중의 토끼 뇌 세팔린으로부터의 액틴 시약)을 각각 충전시켜 37℃의 피브로미터 웰에 두었다.
1분 후에, 100 ㎕의 액틴 시약을 혈장 함유 컵으로 옮켜 피펫으로 내용물을 수회 혼합하였다. 3분 동안의 인큐베이션 후, 37℃에서 예열한 100 ㎕의 CaCl2를 자동화 피펫/타이머 제동기 (Becton-Dickinson)를 사용하여 혈장-액틴 시약 혼합물에 첨가하였다. 응혈 시간을 기록하였으며, 도 1의 결과는 전체 분석 부피 300 ㎕에서 항응고제의 최종 농도의 함수로서 응혈 시간을 나타낸다. 분석에서 인자 IX의 겉보기 농도는 30 내지 40 nM이다.
도 1에 나타낸 결과는 쥐의 항-인자 IX mAb인 BC1 및 BC2의 농도를 증가시킬 경우 aPPT 응혈 시간에 미치는 효과를 증명하였다. 상기 mAb 모두는 aPTT를 연장시킴으로써 응혈 형성을 억제하였으며, 상기 mAb 모두는 aPTT에 대한 최종 포화 효과에 이른다. IC50값은 각각 BC1과 BC2에 대하여 약 35 nM 및 약 50 nM로 유사하지만 두 가지 항체에 대한 최대 반응은 차이가 있었다. BC1의 포화 농도는 aPTT를 약 50％로 약 40초까지 증가시킨다. 반면, BC2는 aPTT를 3.5배로 약 90초까지 증가시킨다. 헤파린을 사용하는 항응고제 요법에서 사용되는 치료적 표적 영역에 흥 미가 집중된다. 그 결과는 두 mAb가 헤파린 치료 aPTT 범위에 포함되는 것으로 나타났다.
mAb인 BC1 및 BC2의 특성이 표 1a에 요약되어 있다. 각각의 BC mAb들은 모두 지모겐인 인자 IX 및 활성 프로테아제인 인자 IXa 모두를 인식하지만, 단지 BC2만이 지모겐 활성화 및 프로테아제 활성 모두를 차단할 수 있다. BC1 및 BC2는 키노몰로구스 (Cynomologous) 원숭이 인자 IX와 교차 반응하는 것으로 밝혀졌다. 또한, BC2는 래트 인자 IX와도 교차 반응하였다.
항-인자 IX mAb들의 시험관내 특성 요약
BC1 BC2
인자 IX와 결합 예 예
인자 IXa와 결합 예 예
IX에서 IXa로의 전환을 억제 아니오 예
Xase 복합체에서 IXa 활성을 억제 예 예
보조인자 요구 없음 2가 금속 (Ca2+ > Mn2+)
(aPTT최대치/aPTT정상치) x 100 (％) 150 350
IC50 (nM) ∼ 35 ∼ 50
종 교차 반응성 원숭이 래트, 원숭이
이소타입 IgG1 IgG2a
도 2에 나타낸 결과는 항-인자 IX mAb인 9E4(2)F4 및 11G4(1)B9의 농도를 증가시킬 경우 aPTT 응혈 시간에 미치는 효과를 증명한다. 분석용 혈장을 정상 농도의 절반으로 희석시키면 초기 aPTT는 45초였다. 상기 mAb 모두는 aPTT를 연장시킴으로써 응혈 형성을 억제하고, 상기 mAb 모두는 aPTT에 대한 최종 포화 효과에 이른다. 포화 농도의 9E4(2)F4 및 11G4(1)B9는, 9E4(2)F4의 경우 aPTT를 약 90 내지 100초 증가시키고 11G4(1)B9의 경우 약 80초까지 증가시킨다. 이 결과는 두 가지 mAb가 헤파린 치료 aPTT 범위의 상위 말단에 존재함을 나타낸다.
도 3에 나타낸 결과는 항-인자 X mAb인 HFXLC (경쇄 에피토프에 대한 것), HFXHC (중쇄 에피토프에 대한 것) 및 항-인자 XI mAb인 HFXI의 농도를 증가시킬 경우 aPTT 응혈 시간에 미치는 효과를 증명한다. 이들 mAb는 엔자임 리서치 래버러토리즈 (Enzyme Research Laboratories, South Bend, IN)로부터 얻었다. mAb인 HFXLC 및 HFXI는 aPTT를 연장시킴으로써 응혈 형성을 억제하고, 상기 mAb 모두는 aPTT에 대한 최종 포화 효과에 이른다. HFXLC에 대한 IC50값은 약 40 nM이며 포화 농도는 aPTT를 약 60초까지 증가시킨다. HFXI에 대한 IC50값은 약 20 nM이며 포화 농도는 aPTT를 약 100초까지 증가시킨다. 이 결과는 HFXLC가 헤파린 치료 aPTT 범위 내인 반면, HFXI는 헤파린 치료 범위의 상위 말단에 존재함을 나타낸다. mAb인 HFXHC는 aPTT 응혈 시간에 대하여 아무런 효과도 미치지 않았다.
aPTT의 자기제한 연장은 또한 인자 IXa에 대한 보조인자인 인자 VIII에 대한 항체에서도 관찰되었다. 예를 들어, 어피니티 바이올로지칼스, 인크. (Affinity Biologicals, Inc.)로부터 구입한 항-인간 인자 VIII 항체인 SAF8C-IG는 aPTT를 최대 약 65초까지 증가시켰다. 약 100 nM의 항체로 aPTT의 최대 연장치의 절반을 달성하였다.
<실시예 3>
래트 혈전 모델에서 쥐의 인자 IX mAb의 효능
동맥 혈전증의 예방에 있어서 항-인자 IX 항체의 효능을 평가하기 위해, 문헌 [Schumacher et al., J. Cardio. Pharm., 22, 526-533 (1993)]에 보고된 래트 경동맥 혈전증 모델을 채택하였다. 이 모델은 경동맥의 표면 상에 적용된 FeCl3 용액에 의해 발생되는 산소 라디칼에 의한 경동맥 내피의 구역성 (segmental) 손상으로 구성된다.
요컨대, 래트를 펜토바르비톤 나트륨으로 마취시키고, 정맥내 주입을 위해 경정맥에 캐뉼라를 삽입하고, 혈압 및 심박수 모니터링을 위해 좌측 대퇴부 동맥에 캐뉼라를 삽입하였다. 경동맥은 목 내의 외과적 절개부를 통해 무균술에 의해 단리하고, 혈류량 측정을 위해 자성 유동 프로브를 장착하였다. 안정화 기간 후, 경동맥 혈류량, 동맥 혈압, 심박수, 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (aPTT) 및 프로트롬빈 시간 (PT)의 변수에 대한 기준선 파라미터를 규정하였다. 그 구, 50％ FeCl3 용액에 침지시킨 예비측정 와트만 여과지를 15분 동안 경동맥 위에 놓아 기저 내피 세포를 완전히 손상시켰다. FeCl3에 침지된 상기 여과지를 제거한 후, 실험을 60분에 걸쳐 완결하였다. 실험의 말미에, 경동맥 혈전을 경동맥으로부터 추출하여 중량을 측정하였다.
모든 약제는 경동맥 손상이 발생하기 15분 전에 투여하였다. 다음과 같이 처리하여 결과를 조사하고, 이를 인자 IX mAb인 BC2와 비교하였다.
1. 헤파린: 각각 60분에 걸쳐, 15, 30, 60 또는 120 U/kg의 볼루스, 이어서 0.5, 1, 2 또는 4 U/kg/분의 주입
2. 아세틸살리실산 (ASA, 아스피린): 5 mg/kg의 볼루스
3. 항-인자 IX mAb인 BC2: 각각 60분에 걸쳐, 1, 3 또는 6 mg/kg 볼루스, 이어서 0.3, 1 또는 2 ㎍/kg/분의 주입
4. 헤파린: 30 U/kg 볼루스 + 1 U/kg/분 + 5 mg/kg의 ASA
5. 항-인자 IX mAb인 BC2: 1 mg/kg + 0.3 ㎍/kg/분 + 5 mg/kg의 ASA.
도 4 및 5는 aPTT (도 4) 및 PT (도 5)에 대한 헤파린, ASA 및 인자 IX mAb BC2의 효과를 보임으로써 항-응고제/혈전 투약법의 비교 약리학을 나타낸다.
출혈 소인에 대한 핵심 지수인 aPTT는 본 연구에서 사용된 항-응고제/항-혈전제의 효능 대 출혈성의 평가를 위한 1차 기준으로 사용하였다. 도 4의 결과는 두 가지 고투여량에서 시험 한계를 넘은, 응혈 시간이 최대로 연장된 헤파린에 의한 aPTT의 투여량-의존성 연장을 나타낸다. ASA 단독은 aPTT를 그다지 증가시키지 못하지만, 헤파린과 조합하여 사용하면 현저한 상승 효과가 관찰되었다. 인자 IX mAb는 aPTT에 대해 적당한 효과를 나타내었고, 가장 높은 투여량에서 조차도 응혈 시간의 증가가 임상적으로 수행된 표준 항-응고의 3배 한계를 초과하지 않았다. 가장 현저하게는, ASA와 조합한 인자 IX mAb BC2의 저투여량이 aPTT를 변화시키지 않았다.
도 5에서, 데이타는 PT가 두 가지 고투여량에서 헤파린에 의해, 그리고 ASA + 헤파린 조합에 의해 상당히 연장되지만, 단독으로 또는 ASA와 조합하여 사용된 임의 투여량의 인자 IX mAb에 의해서는 연장되지 않음을 보여준다.
경동맥 폐색에 대한 헤파린, ASA 및 인자 IX mAb의 효과는 도 6에 나타냈다. 그 결과는 모든 비히클-처리 동물의 경동맥이 손상에 반응하여 폐색됨을 나타낸다. 헤파린은 경동맥의 폐색을 투여량 의존적으로 억제하였다. 가장 높은 투여량에서, 헤파린은 경동맥의 폐색을 완전히 방지하였지만, 이러한 투여량에서 응고는 전혀 개시될 수 없었다. ASA 단독은 경동맥 폐색에 대해 미미한 효과만을 나타냈다. 헤파린과 조합하여 사용된 ASA도 경동맥 폐색을 완전히 방지하지는 못하였다. 인자 IX mAb는 두 가지 고투여량에서 경동맥 폐색을 완전히 차단하였는데, 임상적으로 원하는 표적을 벗어날 정도로 응고를 연장시키지는 못하였다. 대개 단독으로는 개방성을 보장하지 못하는 인자 IX mAb의 저투여량은 ASA와 조합하여 투여될 때 경동맥 폐색의 완전한 억제를 나타냈다.
혈전 중량에 대한 헤파린, ASA 및 인자 IX mAb의 효과는 도 7에 나타냈다. 헤파린은 경동맥에서 투여량 의존적으로 혈전 중량을 감소시켰다. 그러나, 응고의 완전한 차단에도 불구하고 일부 잔류 혈전이 여전히 경동맥에서 발견되었다. ASA 단독 또는 헤파린(30 U/kg 투약)과 조합하여 사용된 ASA는 혈전 중량에 대해 부분적인 효과만을 나타냈다. 인자 IX mAb는 투여량 의존적으로 혈전 중량을 감소시켰고, 고투여량은 혈전 형성을 실질적으로 완전히 방지하였다. 더욱이, 응고 지수에 악영향을 미치지 않으면서 경동맥 폐색을 완전히 방지하는 투약법인 저투여량의 항-인자 IX mAb와 ASA의 조합 투여는 혈전 형성을 완전히 방지하였다.
래트 경동맥 혈전증 모델에서 수행된 연구는 고혈전형성 동맥 손상 모델에서 혈전증의 예방에 있어 인자 IX mAb의 효능을 명백해 입증한다. 가장 현저하게는, 인자 IX mAb의 효능이 aPTT에 의해 정의된, 원하는 치료적 항응고제 표적 내에서 입증되었다. 또한, 현재 표준 항응고제인 헤파린은 응고불가능한 혈액을 생산하는 정도로 응고에 심각한 손상을 주는 투여량에서만 인자 IX mAb에 필적할 만한 효능을 나타냈다. 흥미롭게도, 헤파린과 조합하여 투여한 ASA에 의해 획득된 효능 증가 및 상승 작용의 관찰도 ASA가 항-인자 IX mAb와 함께 투여되었을 때 입증되었다. 그러나, 항-혈전 효과 및 항-응고 효과 둘 다의 효능 증가를 초래하는 헤파린과 ASA의 조합과는 달리, 인자 IX mAb와 ASA의 조합은 생체외 혈액 응고 파라미터에 대해 일관성없는 효과를 나타내면서 항-혈전 효능의 증가를 초래하였다. 이를 종합하면, 데이타는 헤파린, ASA, 또는 헤파린과 ASA의 조합에 비해 인자 IX mAb의 항혈전능이 우수함을 보여준다.
<실시예 4>
래트 혈전증 모델의 주사 전자현미경법
염화 제2철을 적용한지 15분 후, 래트 경동맥의 분절을 모조 (sham) 군, 염화 제2철만 함유한 군 및 염화철 + 6 mg/kg의 인자 IX 항체 함유 군으로부터 군 당 3개씩 수거하였다. 포름알데히드로 관류시켜 동맥을 고정하고, 손상된 영역의 위 및 아래를 결찰시켰다. 고정된 동맥을 탈수시키고, 헥사메틸디실라잔 중에서 인큐베이션시키고, 건조기에서 건조시켰다. 건조된 동맥을 길이를 따라 개방시키고, 금으로 코팅된 주사 전자현미경 (SEM)의 스터브 (stub) 및 스퍼터 (sputter) 상에 올려놓았다.
모조 동맥의 SEM은 산란된 혈소판이 드문 본질적으로 정상인 내피로 나타났다. 내피에는 몇개의 파손 부위가 있었는데, 이는 수술하는 동안의 기계적 손상에 의한 것일 가능성이 있고, 하부 기저막은 혈소판의 카페트에 의해 덮혀 있었다. 모조 래트에서는 어떠한 혈전 형성의 증거도 관찰되지 않았다.
염화 제2철로 처리된 동맥의 SEM에서는 혈관 루멘 (lumen)의 큰 부위를 차지하는 큰 벽혈전 (mural thrombus)이 나타났다. 이 혈전은 응집된 혈소판, 적혈구, 및 무정형 및 섬유상의 단백질성 물질로 구성되어 있었다. 단백질성 물질은 피브린과 일치하였다. 동맥의 내피는 대부분 큰 혈전에 의해 덮혀 있었다. 가시화된 곳에서는, 염화 제2철로 처리된 영역 위에 존재하는 내피가 다수의 부착 혈소판 및 무정형의 단백질성 물질로 덮혀 있었다.
인자 IX 항체로 처리된 래트로부터 얻은, 염화 제2철로 처리된 동맥의 SEM은 혈관의 루멘에 혈전이 거의 없는 것으로 나타났다. 제2 염화철로 처리된 영역 위에 존재하는 내피는 광범위한 손상을 나타내었고, 일부 영역은 부착성 혈소판 및 혈소판 응집물에 의해 덮혀 있었으나, 단백질성 물질은 거의 없거나 전혀 없었다.
<실시예 5>
항-인자 IX mAb BC2 중쇄 및 경쇄 cDNA의 서열 분석
트리리에이전트 (TriReagent) (Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH)를 제조자의 프로토콜에 따라 사용하여 전체 RNA를 정제하였다. 이소프로판올로 RNA를 침전시키고, 0.5％ SDS에 용해시킨 후, 0.5 M NaCl이 되게 조정하였다. 폴리 A+ RNA를 제조자의 프로토콜에 따라 다이나비드 올리고 (Dynabeads Oligo) (dT)25 (Dynal A. S., Lake Success, NY)로 단리하였다. Poly A+ RNA를 비드로부터 용출시키고 TE 완충액에 재현탁시켰다. 100 ng의 RNA 12개 분취액을 제조자의 지시에 따라 프라이밍용 dT 올리고를 사용하여 RT-PCR 킷트로 역전사시켰다 (Boehringer Mannheim Cat. No. 1483-188). 중쇄의 경우, 쥐의 IgG2a 힌지 프라이머 (서열 1) 및 중쇄 신호 서열 프라이머 (서열 2)를 사용하여 6개 RNA/DNA 하이브리드의 PCR 증폭을 25주기 수행하였다. 유사하게, 경쇄의 경우에 쥐의 카파 프라이머 (서열 3) 및 축퇴성 경쇄 신호 서열 프라이머 (서열 4)를 사용하여 6개 RNA/DNA 하이브리드의 PCR 증폭을 25주기 수행하였다. 12가지 증폭 각각으로부터 얻은 PCR 생성물을 pCR2000 벡터 (TA 클로닝 킷트, Invitrogen, Cat. No. K2000-01)에 라이게이션시켰다. 재조합 클론의 콜로니를 무작위적으로 선택하여, 문헌 [Birnboim and Doly, Nucl. Acids Res. 7, 1513 (1979)]에 기재된 알칼리성 추출 방법을 이용하여 플라스미드 DNA를 미니프렙으로 제조하였다. 단리된 플라스미드 DNA를 EcoRI으로 절단하고 0.8％ 아가로스 겔 상에서 분석하였다. 적당한 크기, 즉 중쇄의 경우 약 700 bp, 경쇄의 경우 약 700 bp의 이중 가닥 cDNA 삽입체를 생거 (Sanger) 방법의 변형법으로 서열분석하였다. 중쇄 및 경쇄의 12가지 모든 서열을 비교하여 콘센서스 BC2 중쇄 가변 영역 서열 (서열 5) 및 콘센서스 BC2 경쇄 가변 영역 서열 (서열 6)을 생성하였다.
BC2 중쇄 가변 영역 cDNA의 서열 분석으로, 121개의 아미노산으로 구성된 서열 (서열 7)을 코딩하는 363개의 뉴클레오티드로 된 오픈 리딩 프레임이 밝혀졌다. 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 서열 8, 9 및 10에 각각 기재되어 있다.
BC2 경쇄 가변 영역 cDNA의 서열 분석으로, 107개의 아미노산으로 구성된 서열 (서열 11)을 코딩하는 321개의 뉴클레오티드로 된 오픈 리딩 프레임이 밝혀졌다. 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 서열 12, 13 및 14에 각각 기재되어 있다.
<실시예 6>
인간화 항체
상기 쥐의 CDR이 인간 항체 프레임워크에 함유되도록 SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 249417, SB 257731 및 SB 257732로 지칭되는 6종의 인간화 항체를 고안하였다.
SB 249413
SB 249413은 중쇄 F9HZHC 1-0 및 경쇄 F9HZLC 1-0을 함유한다. 합성 가변 영역 인간화 중쇄 F9HZHC 1-0은 면역글로불린 RF-TS3'CL (Capra, J. D. et al., J. Clin. Invest. 86, 1320-1328 (1990); Kabat 데이타베이스에서 Kabpro:Hhc10w로 확인됨)로부터 얻은 중쇄의 처음 3개 프레임워크 영역 및 상기 BC2 중쇄 CDR을 사용하여 고안하였다. CDR 표출에 영향을 미칠 수 있는 프레임워크 아미노산 치환이 전혀 일어나지 않았다. 어닐링되고 연장된 경우, CDR3 (서열 19 및 20)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 나타내는 아미노산을 코딩하는 4개의 중첩 합성 올리고뉴클레오티드 (서열 15, 16, 17 및 18)를 생성하였다. 이어서, PCR 프라이머 (서열 21 및 22)를 사용하여 상기 합성 유전자를 증폭시키고, pCR2000 벡터 (TA 클로닝 킷트, Invitrogen, Cat. No. K2000-01) 내로 라이게이션시킨 후, SpeI 및 KpnI 제한효소 절단으로 단리하였다. 가변 영역의 처음 5개 아미노산을 포함하는 캄패쓰 (campath) 신호 서열을 코딩하는 제2 DNA 단편 (서열 23 및 24)은, 인간화 항-RSV (Respiratory Syncitial Virus) 중쇄 (서열 25)를 코딩하는 제작물의 적당한 영역을 두 개의 프라이머 (서열 26 및 27)로 증폭시키고 제한효소 EcoRI 및 SpeI으로 절단함으로써 만들었다. 생성된 두 개의 단편을 인간 콘센서스 프레임워크 4의 나머지 및 IgG1 불변 영역을 함유하는, EcoRl 및 KpnI에 의해 절단된 pFHZHC2-6pCD 포유류 세포 발현 벡터 내로 라이게이션시켰다. 이 벡터는 공개된 국제 특허 출원 W094/05690에 기재된 pFHZHC2-3pCD 벡터의 단일 아미노산 돌연변이를 함유하였다. pFHZHC2-3pCD를 XbaI 및 EcoRV로 절단하고 두 개의 합성 올리고뉴클레오티드 (서열 28 및 29)로부터 발생된 링커를 삽입함으로써 프레임워크 2의 마지막 잔기 (잔기 49)를 Ser에서 Ala으로 돌연변이시켰다. F9HZHC 1-0의 서열은 서열 30 및 31에 기재되어 있다.
합성 가변 영역 인간화 경쇄 F9HZLC 1-0은 면역글로불린 LS8'CL (Carmack et al., J. Exp. Med. 169, 1631-1643 (1989); Kabat 데이타베이스에서 Kabpro:Hkl318로 확인됨)로부터 얻은 인간 경쇄의 프레임워크 영역 및 상기 BC2 경쇄 CDR을 사용하여 고안하였다. CDR 표출에 영향을 미칠 수 있는 프레임워크 아미노산 치환은 전혀 일어나지 않았다. 어닐링되고 연장된 경우, 경쇄 가변 영역 (서열 34 및 35)을 나타내는 아미노산을 코딩하는 2개의 중첩 합성 올리고뉴클레오티드 (서열 32 및 33)를 생성하였다. 이어서, PCR 프라이머 (서열 36 및 37)를 사용하여 상기 합성 유전자를 증폭시키고, pCR2000 벡터 (TA 클로닝 킷트, Invitrogen, Cat. No. K2000-01) 내로 라이게이션시킨 후, ScaI 및 SacII 제한효소 절단으로 단리하였다. 가변 영역의 처음 2개 아미노산을 포함하는 캄패쓰 신호 서열을 코딩하는 제2 DNA 단편 (서열 38 및 39)은, 인간화 항-RSV (Respiratory Syncitial Virus) 중쇄 (서열 25)를 코딩하는 제작물의 적당한 영역을 두 개의 프라이머 (서열 26 및 40)로 증폭시키고 제한효소 EcoRI 및 ScaI으로 절단함으로써 만들었다. 생성된 두 개의 단편을 인간 콘센서스 프레임워크 4의 나머지 및 카파 불변 영역을 함유하는, EcoRl 및 SacII에 의해 절단된 pFHzLC1-2pCN 포유류 세포 발현 벡터 내로 라이게이션시켰다. 이 벡터는 공개된 국제 특허 출원 W094/05690에 기재된 pFHZLC1-1pCN 벡터의 단일 아미노산 돌연변이를 함유하였다. pFHZLC1-pCN를 SmaI 및 KpnI으로 절단하고 두 개의 합성 올리고뉴클레오티드 (서열 41 및 42)로부터 발생된 링커를 삽입함으로써 프레임워크 2의 잔기를 Ser에서 Pro으로 돌연변이시켰다. F9HZLC 1-0의 서열은 서열 43 및 44에 기재되어 있다.
SB 249415
SB 249415는 중쇄 F9HZHC 1-1 및 경쇄 F9HZLC 1-1를 함유한다. 이들 중쇄 및 경쇄 제작물은 각각 F9HZHC 1-0 및 F9HZLC 1-0을 기초로 한 것이나, CDR 표출에 영향을 미칠 수 있는 프레임워크 아미노산 치환을 갖는다.
F9HZHC 1-1는 CDR 표출에 영향을 미칠 수 있는 3개의 프레임워크 아미노산 치환을 갖는다. 어닐링되고 연장된 경우, 변이된 중쇄 가변 영역 (서열 47 및 48)의 변이된 부분을 나타내는 아미노산을 코딩하는 2개의 중첩 합성 올리고뉴클레오티드 (서열 45 및 46)를 생성하였다. 이어서, PCR 프라이머 (서열 49 및 50)를 사용하여 상기 합성 유전자를 증폭시키고, pCR2000 벡터 (TA 클로닝 킷트, Invitrogen, Cat. No. K2000-01) 내로 라이게이션시킨 후, EcoNI 및 KpnI 제한효소 절단으로 단리하였다. 이 단편을 EcoNI 및 KpnI에 의해 절단된 F9HZHC1-0 (서열 30) 벡터 내로 라이게이션시켰다. F9HZHC 1-1 삽입체의 서열은 서열 51 및 52에 기재되어 있다.
F9HZLC 1-1은 CDR 표출에 영향을 미칠 수 있는 4개의 프레임워크 아미노산 치환을 갖는다. 어닐링된 경우, KpnI 및 BamHI 점착성 (cohesive) 말단을 갖고 경쇄 가변 영역 (서열 55)의 변이된 부분을 나타내는 아미노산을 코딩하는 2개의 합성 올리고뉴클레오티드 (서열 53 및 54)를 생성하였다. F9HZLC 1-0 (서열 43)을 제한효소 KpnI 및 BamHI으로 절단하고 합성 DNA에 라이게이션시켰다. F9HZLC 1-1 삽입체의 서열은 서열 56 및 57에 기재되어 있다.
SB 249416
SB 249416은 중쇄 F9HZHC 1-1 (상기 기재됨) (서열 52) 및 경쇄 F9HZLC 1-2를 함유한다. 경쇄 제작물은 F9HZLC 1-1을 기초로 하나, CDR 표출에 영향을 미칠 수 있는 1개의 추가 프레임워크 아미노산 치환을 갖는다.
어닐링된 경우, BamHI 및 XbaI 점착성 말단을 갖고 경쇄 가변 영역 (서열 60)의 변이된 부분을 나타내는 아미노산을 코딩하는 2개의 합성 올리고뉴클레오티드 (서열 58 및 59)를 생성하였다. F9HZLC 1-1 (서열 56) 벡터를 제한효소 BamHI 및 XbaI으로 절단하고 합성 DNA에 라이게이션시켰다. F9HZLC 1-2 삽입체의 서열은 서열 61 및 62에 기재되어 있다.
SB 249417
SB 249417은 중쇄 F9HZHC 1-1 (상기 기재됨) (서열 52) 및 경쇄 F9HZLC 2-0을 함유한다. F9HZLC 2-0 합성 가변 영역 인간화 경쇄는 면역글로불린 REI (Palm and Hilschmann, Z. Physio. Chem. 354,1651-1654 (1973); Kabat 데이타베이스에서 Kabpro:HKL111로 확인됨)로부터 얻은 인간 경쇄의 프레임워크 영역 및 상기 BC2 경쇄 CDR을 사용하여 고안하였다. 5개의 아미노산 콘센서스 인간 치환을 도입하였다. CDR 표출에 영향을 미칠 수 있는 쥐의 프레임워크 아미노산 6개의 치환을 일으켰다. 어닐링되고 연장된 경우, 경쇄 가변 영역 (서열 65 및 66)을 나타내는 아미노산을 코딩하는 2개의 중첩 합성 올리고뉴클레오티드 (서열 63 및 64)를 생성하였다. 이어서, PCR 프라이머 (서열 67 및 68)를 사용하여 상기 합성 유전자를 증폭시키고, pCR2000 벡터 (TA 클로닝 킷트, Invitrogen, Cat. No. K2000-01) 내로 라이게이션시킨 후, ScaI 및 SacII 제한효소 절단으로 단리하였다. 가변 영역의 처음 2개 아미노산을 포함하는 캄패쓰 신호 서열을 코딩하는 제2 DNA 단편 (서열 38)은, 인간화 항-RSV (Respiratory Syncitial Virus) 중쇄 (서열 25)를 코딩하는 제작물의 적당한 영역을 두 개의 프라이머 (서열 26 및 69)로 증폭시키고 제한효소 EcoRI 및 ScaI으로 절단함으로써 만들었다. 인간 프레임워크 4의 나머지 (서열 70)을 코딩하고 SacII 및 NarI 점착성 말단을 갖는 제3의 DNA 단편은 두 개의 합성 올리고뉴클레오티드 (서열 71 및 72)를 어닐링시킴으로써 생성하였다. F9HZLC 1-0 (서열 43)을 제한효소 EcoRI 및 NarI으로 절단하고 상기 3개의 DNA 단편에 라이게이션시켰다. F9HZLC 2-0 삽입체의 서열은 서열 73 및 74에 기재되어 있다.
SB 257731
SB 257731은 중쇄 F9HZHC 1-1 (서열 52) 및 경쇄 F9HZLC 1-3 (F9HZLC 1-2의 단일 아미노산 돌연변이체) (서열 62)를 함유한다. F9HZLC 1-2는 두 개의 프라이머 (서열 26 및 69)로 PCR 증폭하고, 제한효소 EcoRI 및 ScaI으로 절단하였다. 94 bp의 단편 (서열 75 및 76)을 단리하였다. 이 단편을 EcoRI 및 ScaI에 의해 절단된 F9HZLC 1-2 벡터에 라이게이션시켜 경쇄 제작물 F9HZLC 1-3을 생성하였다. F9HZLC 1-3 삽입체의 서열은 서열 77 및 78에 기재되어 있다.
SB 257732
SB 257732는 합성 가변 영역 인간화 중쇄 F9HZHC 3-0 및 경쇄 F9HZLC 3-0을 함유한다. 어닐링되고 연장된 경우, 변이될 중쇄 가변 영역 (서열 83 및 84)을 나타내는 아미노산을 코딩하는 4개의 중첩 합성 올리고뉴클레오티드 (서열 79, 80, 81 및 82)를 생성하였다. 이어서, PCR 프라이머 (서열 85 및 86)를 사용하여 상기 합성 유전자를 증폭시키고, pCR2000 벡터 (TA 클로닝 킷트, Invitrogen, Cat. No. K2000-01) 내로 라이게이션시키고, StuI 및 KpnI 제한효소 절단으로 단리하였다. 단리된 단편을 StuI 및 KpnI에 의해 절단된 F9HZHC1-1 (서열 52) 벡터에 라이게이션시켰다. 이어서, 이 벡터를 EcoRI 및 SpeI으로 절단하여 신호 서열을 제거하였다. 가변 영역의 처음 5개 아미노산을 포함하는 캄패쓰 신호 서열을 코딩하는 DNA 단편 (서열 23)은, F9HZHC1-0을 두 개의 프라이머 (서열 26 및 87)로 증폭시키고 제한효소 EcoRI 및 SpeI으로 절단함으로써 만들었다. 생성된 단편을 상기 벡터에 라이게이션시켰다. F9HZHC 3-0 삽입체의 서열은 서열 88 및 89에 기재되어 있다.
어닐링되고 연장된 경우, 경쇄 가변 영역 (서열 94 및 95)을 나타내는 아미노산을 코딩하는 4개의 중첩 합성 올리고뉴클레오티드 (서열 90, 91, 92 및 93)를 생성하였다. 이어서, PCR 프라이머 (서열 96 및 97)를 사용하여 상기 합성 유전자를 증폭시키고, pCR2000 벡터 (TA 클로닝 킷트, Invitrogen, Cat. No. K2000-01) 내로 라이게이션시킨 후, ScaI 및 NarI 제한효소 절단으로 단리하였다. 단리된 단편을 ScaI 및 NarI에 의해 절단된 F9HZLC1-3 (서열 77) 벡터에 라이게이션시켰다. F9HZLC 3-0 삽입체의 서열은 서열 98 및 99에 기재되어 있다.
인간화 항-인자 IX mAb를 CHO 세포에서 발현시켰다. 무혈청 배지 중에서의 현탁 배양을 위해 채택된 DG-44 세포주를, 37℃의 5％ CO2 및 95％ 공기 가습 인큐베이터내에서, 150 rpm의 이노바 2100 플랫폼 진탕기 (New Brunswick Scientific) 상의 250 ㎖ 일회용 멸균 삼각 플라스크 (Corning) 중에 1 x 뉴클레오시드 및 0.05％ F68을 함유하는 단백질-무함유 배지 100 ㎖에서 배양하였다. 이 세포를 주당 2회씩 4 X 105 세포/㎖로 계대배양하였다. pCN-Lc-경쇄 및 pCD-Hc-중쇄 벡터 각 15 ㎍을 NotI으로 절단하여 선형화시키고, 멸균 조건 하에서 동시침전시킨 후, 1 X TE 완충액 (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.5) 50 ㎕ 중에 재현탁시켰다. 문헌 [Hensley, J. Biol. Chem. 269, 23949-23958 (1994)]의 기술을 이용하여, 바이오-라드 유전자 펄서 (Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 DNA를 Acc-098 세포 내로 전기천공시켰다. 1.2 X 107 세포를 12.5 ㎖의 냉각 PBSucrose (PBS, 272 mM 수크로스, 7 mM 인산나트륨 pH 7.4, 1 mM MgCl2)로 1회 세척하고, 0.8 ㎖의 PBS에 재현탁시키고, 50 ㎕의 DNA 용액에 첨가한 후, 15분 동안 얼음 위에서 인큐베이션하였다. 세포를 380 V 및 25 마이크로패럿에서 펄싱한 후, 얼음 위에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 유지 배지가 들어있는 96 웰 배양 플레이트 내에 5 X 105 세포/플레이트로 플레이팅하고 24시간 후 선별하였다. 세포를 유지 배지 중에서 400 ㎍/㎖의 G418 (제네티신, Life Technologies, Inc.)에 대한 내성으로 선별하였다. 분석하기 24시간 전, 150 ㎕의 유지 배지를 세포에 공급하였다.
오리겐 (Origen) 분석기 (IGEN, Inc.) 상에서 전기화학발광 (ECL) 검출 방법을 이용하여 개별 콜로니로부터 얻은 조절 배지를 분석하였다 (문헌 [Yang et al., Biotechnology, 12, 193-194 (1994)] 참조).
분석 (분석 완충액) 수행 및 분석기 (세포 클리너)의 작동에 필요한 모든 용액은 IGEN으로부터 구입하였다. 항체 [항-인간 IgG (g-쇄 특이적 항체; Sigma Chemicals) 및 인간 IgG (H+L)에 대한 F(ab')2 단편 (Kirkegaard ＆ Perry Laboratories Inc.)]를 7:1의 TAG:단백질의 몰비로 TAG-NHS-에스테르 (IGEN, Inc.)로 표지하고, 단백질 A (Sigma)를 20:1의 바이오틴:단백질의 몰비로 바이오틴-LC-술포-NHS-에스테르 (IGEN, Inc.)로 표지하였는데, 둘 다 IGEN의 권고에 따라 표지하였다. 스트렙타비딘으로 코딩된 자성 비드 (M280)는 디날 (Dynal)로부터 구입하였다.
면역분석은 다음 프로토콜을 사용하여 수행하였다: 샘플 당, 50 ㎕의 스트렙타비딘-코팅 비드 (1.25％의 Tween이 함유된 PBS (pH7.8) 중에 희석된 최종 농도 600 ㎍/㎖)를 50 ㎕의 바이오틴-단백질 A (1.25％의 Tween이 함유된 PBS (pH 7.8) 중에 희석된 최종 농도 1 ㎍/㎖)와 혼합하고, 교반하면서 실온에서 15분 동안 인큐베이션하고, 50 ㎕의 TAG 항체 (1.25％의 Tween이 함유된 PBS (pH7.8) 중에 희석된, 인간 IgG (H+L)에 대한 최종 농도 1.25 ㎍/㎖의 F(ab')2 단편과 0.25 ㎍/㎖의 항-인간 IgG (g-쇄 특이적)의 혼합물)을 첨가한 후, 이 용액을 50 ㎕의 조절 배지에 첨가하고, 실온에서 교반하면서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 200 ㎕의 분석 완충액을 반응 혼합물에 첨가하고, 샘플을 오리겐 I 분석기 상에서 분석하여 ECL을 측정하였다. 그 결과는 분석된 콜로니의 대략 20 내지 37％가 약 150 ng/㎖의 평균 발현도로 15 ng/㎖이 넘는 항체를 분비함을 입증하였다.
인간화 항-인자 IX mAb는 프로셉 A 켑쳐 (Procep A capture) 단계를 이용하한 후 이온-교환 크로마토그래피로 적재된 DNA를 감소시켜 조절 배지로부터 정제하였다. 프로셉 A 흡수체 (Bioprocessing Ltd., Durham, England)를 사용하여 직경과 높이의 비율이 1:1인 컬럼을 준비하였다. 정화된 조절 배지를 약 150 cm/hr로 컬럼 상에 로딩하였다. 컬럼을 인산염 완충 식염수 (PBS), 1 M NaCl이 함유된 PBS, 및 마지막으로 PBS로 연속 세척하였다. 결합된 물질을 0.1 M 아세트산 용출액으로 회수하였다. 용출물을 pH 5.5로 조정하고, 물로 희석하였다 (1:4). 20 mM 아세트산나트륨 (pH 5.5)로 미리 평형화시킨 S-세파로스 컬럼 (2.5 x 13 cm) 상에 희석된 용액을 80 cm/hr로 로딩하였다. 정상 상태의 (steady) 기준선이 얻어질 때까지 컬럼을 아세트산염 완충액으로 세척하고, 결합된 단백질을 20 mM의 인산나트륨 (pH 7.4)를 사용하여 25 cm/hr로 용출시켰다. 용출물을 0.4 ㎛ 막으로 여과하여 4℃에서 저장하였다.
<실시예 7>
마우스-인간 키메라 항체
프라이밍용 dT 올리고를 사용하여 제조자의 지시에 따라 RT-PCR 킷트 (Boehringer Mannheim Cat. No. 1483-188)로 100 ng의 BC2 RNA를 역전사시키고, 이를 합성 ScaI 프라이머 (서열 100) 및 NarI 프라이머 (서열 101)로 PCR 증폭하여 ScaI 및 NarI 말단을 갖는 BC2 경쇄 가변 영역 (서열 102 및 103)을 얻었다. 이 DNA를 ScaI 및 NarI에 의해 절단된 F9HZHC1-3 (서열 77) 내로 라이게이션시키고 ScaI 및 NarI으로 절단하여, 마우스-인간 키메라 경쇄 F9CHLC (서열 104 및 105)를 생성하였다.
프라이밍용 dT 올리고를 사용하여 제조자의 지시에 따라 RT-PCR 킷트 (Boehringer Mannheim Cat. No. 1483-188)로 100 ng의 BC2 RNA를 역전사시키고, 이를 합성 SpeI 프라이머 (서열 106) 및 NheI 프라이머 (서열 107)로 PCR 증폭하여 SpeI 및 NheI 말단을 갖는 BC2 중쇄 가변 영역 (서열 108 및 109)을 얻었다. EcoRI 프라이머 (서열 26) 및 SpeI (서열 87)로 RSVHZ19 중쇄 (서열 25)로부터 캄패쓰 신호 서열을 PCR 증폭하였다. 공개된 국제 특허 출원 W095/07301에 기재되어 있고 IL4 가변 영역이 BC2 인자 IX 마우스 가변 영역으로 대체된, EcoRI 및 NheI에 의해 절단된 IL4CHHCpcd 벡터에 상기 두 DNA 단편을 라이게이션시켜 마우스-인간 키메라 중쇄 F9CHHC (서열 110 및 111)를 얻었다.
마우스-인간 키메라 항체 chαFIX의 동시형질감염 및 정제는 인간화 제작물에 대해 상기한 바와 같이 달성하였다.
<실시예 8>
래트 혈전 모델에서 인간화 인자 IX mAb의 효능
동맥 혈전증의 예방에 있어 인간화 항-인자 IX 항체의 효능을 평가하기 위해, 상기 실시예 3에 기재된 바와 같은 래트 경동맥의 혈전증 모델을 이용하였다. 경동맥 혈류량, 동맥 혈압, 심박수, 혈관 개방 및 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (aPTT)에 대한 기준선 파라미터를 규정하였다. 그로부터 15분 후에, 경동맥에 10분 동안 손상을 주었다. 경동맥에 손상을 주고 나서 60분 후에 상기 파라미터를 측정하였다. 또한, 경동맥에서 경동맥 혈전을 추출하여 칭량하였다.
모든 약제는 경동맥에 손상을 주기 15분 전에 정맥 내로 투여하였다. 다음과 같이 처리하여 결과를 조사하고, 이를 항-인자 IX mAb인 BC2와 비교하였다.
1. 비히클
2. chαFIX: 볼루스 3 mg/kg
3. SB 249413: 볼루스 3 mg/kg
4. SB 249415: 볼루스 3 mg/kg
5. SB 249416: 볼루스 3 mg/kg
6. SB 249417: 볼루스 3 mg/kg
7. SB 257731: 볼루스 3 mg/kg
8. 헤파린: 60 단위/볼루스 kg + 2 단위/kg/분 주입.
본 연구에 사용된 항-응고제/항-혈전제의 효능 대 출혈성에 대한 일차적인 평가 기준으로 aPTT를 사용하였다. 도 8의 결과는 인간화 인자 IX mAb인 SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 249417 및 SB 257731이 임상적으로 허용되는 범위 내에 있는 3.0 mg/kg에서 aPTT에 대한 적절한 효과를 갖는다는 것을 입증한다.
혈전의 양에 대한 인자 IX mAb의 효과는 도 9에 나타나 있다. 이 결과는 혈전의 양을 감소시키는 데 있어서 모든 인간화 mAb가 동등하게 효과적이라는 것을 보여준다.
래트의 경동맥 혈전증 모델에서 수행된 연구는 혈전이 매우 많이 생성되는 동맥 손상 모델의 혈전증 예방에 있어서 인간화 인자 IX mAb의 효능을 분명하게 입증한다. 가장 현저하게는, 모든 인간화 인자 IX mAb의 효능이 aPTT에 의해 규정된, 목적하는 치료 항응고제 표적 내에서 입증되었다.
<실시예 9>
항체의 생화학 및 생물물리학적 특성
MALD-MS에 의해 측정된 SB 249417의 분자량은 148,OOO Da이었다. SB 249417을 분석적 초원심분리한 결과는 동일한 수치를 나타내었다. 인자 IX 및 Ca2+의 존재하에, BC2로부터 유래한 항체는 mAb 및 2가지 인자 IX 분자를 합한 질량에 상응하는 248,000 Da의 질량으로 침전되었다. 인자 IX의 존재 또는 부재하에서 높은 밀집도를 갖는 응집물에 대한 증거는 관찰되지 않았다.
고정된 단백질 A 표면에 결합된 항체를 사용하는 비아코어 (BIAcore) 분석에 의해 SB 249417에 결합하는 인자 IX의 반응 속도를 평가하였다. 49 nM의 재조합 인간 인자 IX (rhFIX, Genetics Institute)를 사용하여 5 mM Ca2+의 존재하에 측정을 수행하였다. 상호작용은 빠른 결합 (kass = 2.0 ×105 M-1s-1) 및 비교적 느린 해리 속도 (kdiss = 4.1 ×10-4s-1)를 갖는 특징이 있었다. 인자 IX 결합에 대한 Kd의 계산치는 1.9 nM이었다.
하기 표 1은 SB 249417의 생물물리학적 특성에 대한 요약이다.
SB 249417의 생물물리학적 특성의 요약
이소타입 IgG1, kappa
SDS-PAGE에 의한 순도 >95％ (환원 조건하)
분자량 질량분광법 분석적 초원심분리 148,000 Da 148,000 Da
인자 IX 결합의 화학량론 등열 적정 열량측정법 인자 IX 1.5 몰: mAb 1 몰
인자 IX 결합 친화성 등열 적정 열량측정법 바이오센서 Kd = 4 nM, 25℃ Kd = 2 nM
인자 IX의 결합 반응 속도 바이오센서 kass = 2.0 ×105M-1s-1 kdiss = 4 ×10-4s-1
표 2는 본 발명 mAb의 인자 IX에 대한 결합 특성을 요약한 것이다. 해리 상수의 계산치는 실험 오차 범위 내에서 본질적으로 동일하였다.
항-인자 IX mAb에 결합하는 인자 IX의 반응 속도
mAb kass(M-1s-1) kdiss(s-1) KD의 계산치 (nM)
SB 249417 2.0 ×105 4.1 ×10-4 1.9
BC2 4.8 ×105 9.1 ×10-4 1.9
Chf9 2.4 ×105 3.0 ×10-4 1.3
SB 249413 6.5 ×105 2.8 ×10-3 3.7-5.1
SB 249415 7.5 ×105 1.8 ×10-4 1.1-2.3
SB 249416 5.2 ×105 4.1 ×10-4 0.8
SB 257731 9.2 ×105 9.9 ×10-4 1.1
SB 257732 1.1 ×106 1.2 ×10-3 1.5
rhFIX와 SB 249417, BC2 및 다른 인간화 작제물 사이의 상호작용은 고유 결합열로부터 용액 중의 결합 상호작용을 측정하는 적정 미세열량측정법에 의해 특성화되었다. mAb인 SB 249417 2 μM을 포함하는 열량측정기에 106 μM FIX로 된 9개의 인젝션을 넣었다. 결합은 발열에 따라 처음 4개의 인젝션에서 검출되었다. 나머지 5개의 인젝션에서, mAb 결합 부위가 FIX로 포화되었으며, 배경 수준의 혼합열만이 관찰되었다. 이 결과는 예상한 바와 같이, 등량점이 mAb 당 대략 2 FIX의 몰 결합 비율에서 발생함을 보여주었다. 데이타의 비선형 최소자승 분석법으로 결합 친화도를 수득하였다.
mAb의 rhFIX 친화도를 1O mM HEPES, 1O mM CaCl2, 150 mM NaCl (pH 7.4) 중에서 34 내지 44℃의 온도 범위에 걸쳐 측정하였다. 이 데이타를 이용하여 37℃에서의 친화도를 직접 측정하였으며, 반 호프 (van't Hoff) 방정식에 의해 25℃에서의 친화도를 계산하였다. 하기 표 3의 데이타는 SB 249417, BC2 및 그의 다른 인간화 작제물의 친화도가 오차 (인자 2) 범위 내에서 동일함을 나타낸다.
항-FIX mAb에 대한 적정 열량측정 결과
mAb Kd, nM, 25℃ Kd, nM, 37℃ 몰 결합 비율 FIX/mAb
BC2 10 20 1.4
SB 249413 6 12 1.9
SB 249415 3 7 1.7
SB 249417 4 12 1.5
SB 257732 4 9 1.8
시차주사열량측정법에 의해 측정한 결과, mAb인 SB 249413, SB 249415, SB 249417 및 SB 257732는 모두 매우 유사한 열 안정성을 나타내었다. 이들의 언폴딩 Tm은 열에 의해 유도된 변성에 대하여 높은 안정성을 나타내는 70 내지 75℃ 범위이다.
<실시예 10>
인자 IX의 항체-매개 억제 메카니즘
상동 단백질 인자 VII의 프레임워크 내로 스플라이싱된 인자 IX의 서열로 이루어진 키메라 작제물의 라이브러리를 구성하고, 이를 사용하여 인자 IX BC2 mAb에 대한 에피토프를 맵핑하였다 (문헌 (Cheung et al., Thromb. Res. 80, 419-427 (1995)) 참조). 비아코어 (BiaCore) 2000 표면 플라스몬 공명 장치를 사용하여 결합을 측정하였다. NHS/EDC 반응을 이용하여 BC2 항체를 칩에 직접 커플링시켰다. 25 mM MOPS, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 5 mM CaCl2 중의 200 nM의 제공된 각 작제물을 사용하여 20 ㎕/분으로 2분간의 접촉 시간으로 결합을 측정하였다. 단백질을 포함하지 않는 동일한 완충액을 사용하여 3분 동안 해리를 모니터링하였다. 50 mM EDTA의 존재하에 야생형 작제물에 대한 결합은 검출되지 않았다. 이 데이타는 하기 표 4에 제시되어 있다.
인자 IX 작제물의 BC2 항체로의 결합에 대한 요약
작제물 결합 정도
혈장 IXa 결합
r-IX 결합
혈장 VII 결합하지 않음
IX LC/VII HC 결합
IX-A/VII 결합
VII gla/IX 결합하지 않음
VII-A/IX 결합하지 않음
VII gla (IX 3-11)/IX 결합
VII gla (IX 3-6)/IX 매우 적게 결합
VII gla (IX 9-11)/IX 매우 적게 결합
IX K5A 결합
상기 데이타는 인자 IX 경쇄 및 인자 VII 중쇄 (IX LC/VII HC); 인자 IX gla 및 방향족 스택 (stack) 도메인 (IX-A/VII); 인자 VII gla 도메인 내의 인자 IX gla 도메인의 잔기 3-11 (VII gla (IX 3-11)/IX); 및 잔기 5에서 리신이 알라닌으로 치환된 인자 IX (IX K5A)를 포함하는 작제물이 BC2에 대한 결합을 나타낸다는 것을 보여준다. VII gla (IX 3-11)/IX 작제물은 야생형 인자 IX (혈장 IXa 및 r-IX)에 대해 동등한 BC2 결합을 나타내었다. 따라서, BC2 항체는 인자 IX gla 도메인의 잔기 3-11 내에 포함된 에피토프에 결합한다.
<실시예 11>
항-인자 IX 항체 및 조직 플라즈미노겐 활성화제를 사용한 동맥 혈전증의 치료
경동맥이 완전히 폐색된 다음, 보조 요법을 병행하거나 병행하지 않고 tPA를 투여하였다. 동맥의 혈류를 지속적으로 모니터링하였다. 체중이 300 내지 490 g인 수컷 스프라그-돌리 래트 (Charles River, Raleigh, NC)를 나트륨 펜토바르비탈 (55 mg/kg, 복강내 투여)로 마취시켰다. 가열된 (37℃) 수술대 위에 등부분이 닿도록 래트를 위치시키고 경부를 절개하였으며, 기관 (trachea)을 적출하여 PE-240, 인트라메딕 (Intramedic) 튜브로 캐뉼라를 삽입하였다. 이어서 좌측 경동맥 및 경정맥을 적출하였다. 파라필름 (Parafilm) M 쉬이트 (4 mm2, American National Can)를 경동맥 아래에 넣고, 전자기성 혈류 프로브 (Carolina Medical)를 동맥에 넣어 혈류를 측정하였다. 약물 투여를 위해 캐뉼라 (Tygon, 0.02" ×0.04", Norton Performance Plastics)를 경정맥 내에 삽입하였다. 이어서 좌측 대퇴동맥을 적출하고, 혈압 측정 및 혈액 샘플 수집을 위해 캐뉼라를 삽입하였다.
실시예 3에 기재된 바와 같이, FeCl3 용액 (50％)으로 포화시킨 직경 6.5 mm의 유리 미세-여과지의 원형 패취를 혈류 프로브로부터 경동맥의 하류에 10분 동안 위치시켜 경동맥에서 혈전증을 일으켰다. 이러한 잘 특성화된 모델에서, 혈전 형성은 일반적으로 15분 이내에 완료된다.
항-인자 IX 항체인 SB 249415를 tPA (Genentech, South San Francisco, CA)와 조합하여 볼루스로 투여하였으며, 헤파린 (Elkins-Sinn Inc., Cherry Hill, NJ)도 주입에 의해 볼루스로 투여하였다. 모든 약물 주입은 실험 기간의 끝, 즉 혈관 폐색 시기로부터 60분까지 지속하였다. aPTT 및 PT 분석을 위해 0, 30 및 60분 (연구 종료)에 대퇴동맥으로부터의 혈액 샘플 1 ㎖를 3.8％ 시트르산 용액 중에 수집하고 원심분리하였다. 표준 방법으로 피브로미터 (BB1L, Baxter Dade or MLA Electra 800 Automatic Coagulation Timer)를 이용하여 aPTT 및 프로트롬빈 시간 (PT)을 모니터링하였다. 실험의 말미에, 경동맥으로부터 혈전을 추출하여 칭량하였다.
모든 데이타는 각 그룹에서 지시된 수의 래트에 대하여 평균 그룹 수치 ±SEM으로 제시되어 있다. 그룹 분석에 있어서 여러가지 비교를 위해 ANOVA 및 본페로니 (Bonferoni) 테스트를 이용하였으며, 유의도로서 p가 0.05 미만인 것을 허용하였다.
FeCl3 처리된 패취를 래트 경동맥에 붙혀 동맥을 손상시키고 나서 대략 15분 후에 폐색성 혈전이 형성되었다. 도 10에 나타낸 바와 같이, tPA 단독의 경우, tPA를 9 mg/kg의 투여량으로 투여하고 나서 폐색된 혈관의 재관류가 관찰되었으며, 처리된 혈관의 67％가 60분의 프로토콜 동안 혈류를 회복하는 것으로 나타났다. 이러한 tPA의 투여시에, 헤파린 60 U/kg 또는 항-인자 IX 항체인 SB 249415 3 mg/kg을 포함시키는 것은 재관류 발생을 더 증가시키지 않았으며, 이는 FeCl3 손상 모델에서 혈전의 약 30％가 용해시키기 어려운 것임을 시사한다.
도 10의 결과는, tPA의 투여량이 적을수록 어떤 항응고제가 혈전 용해제와 조합하여 공동 투여되느냐에 따라 재관류 발생이 상당히 좌우된다는 사실을 보여준다. 헤파린 60 U/kg을 투여하는 경우, 재관류를 나타내는 혈관 비율은 크게 감소하였고, 3 mg/kg 및 6 mg/kg의 tPA의 투여량에서 각각 단지 12.5％ 및 40％의 재관류만이 관찰되었다. 그러나, 3 mg/kg의 SB 249415를 tPA와 함께 공동 투여한 결과, 3 mg/kg tPA 투여량에서 60％ 초과의 재관류 및 6 mg/kg tPA 투여량에서 79％ 초과의 재관류가 달성되었다. 따라서, 항-인자 IX 항체는 혈전 용해 투여 반응 곡선을 크게 이동시켰으며, 더 적은 투여량의 혈전 용해제로 재관류를 가능하게 하였다.
혈전 용해 및 응혈 형성은 역동적인 과정이어서, 개방 기간 이후에도 때때로 재폐색이 관찰되었다. 경동맥의 혈류는 60분의 실험 프로토콜 동안 지속적으로 모니터링되었기 때문에, 경동맥이 개방되는 전체 시간을 측정할 수 있었다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 3 mg/kg 항-인자 IX 항체 및 tPA를 조합함으로써 혈관이 개방되는 전체 시간을 실질적으로 증가되었다. 이는 tPA의 가장 적은 투여량 및 중간 투여량, 즉 각각 3 mg/kg 및 6 mg/kg에서 특히 분명하다. SB 249415 3 mg/kg 및 tPA 3 mg/kg의 조합 투여량에서, 전체 개방 시간은 헤파린 60 U/kg 및 tPA 3 mg/kg의 조합에 대한 7.1 ±7.1분에 비해 30.6 ±9.2분이었다. 3 mg/kg의 tPA 단독에서 개방 시간은 0분이었다. 6 mg/kg의 tPA 투여량에서, 헤파린의 공동 투여는 개방 시간을 12.9 ±6.0분으로 단지 약간만 증가시켰지만, tPA-SB 249415 조합은 38.7 ±8.4분의 최대 개방 시간을 달성하였다. tPA의 가장 높은 투여량 (9 mg/kg)에서만, 헤파린 조합은 SB 249415로 달성된, 각각 31.9 ±4.8분 및 38.0 ±8.4분의 개방 시간에 근접하였다.
동맥 경색 이후 혈류의 빠른 회복은 허혈성 조직에 대한 손상을 최소화하는 데 있어서 중요하다. 도 12의 결과는 항-인자 IX 항체와 tPA의 조합이 tPA 단독 또는 헤파린 + tPA에 비해 재관류 시간을 감소시키며, 이는 더 적은 투여량의 tPA로 달성된다는 사실을 나타낸다. SB 249415 3 mg/kg 및 tPA 3 mg/kg로 혈전 용해를 수행하는 경우, 혈전 용해 시간은 29.4 ±9.2분이었다. tPA 3 mg/kg 단독의 경우, 재관류는 관찰되지 않았다. 헤파린 60 U/kg 및 tPA 3 mg/kg을 사용하는 경우, 혈전 용해 시간은 52.8 ±7.1분이었다. tPA의 보다 높은 투여량인 6 mg/kg 및 9 mg/kg에서, 항체 및 tPA 처리 요법에 의해 각각 19.4 ±6.3분 및 20.8 ±8.7분의 초기 혈전 용해를 달성하였다. 첨가된 항응고제의 부재시에, 혈전 용해 시간은 6 mg/kg 및 9 mg/kg의 투여량에서 각각 60분 (즉, 실험 프로토콜의 한도) 및 27.5 ±6.4분이었다. 헤파린 60 U/kg을 첨가하는 경우, 상응하는 혈전 용해 시간은 44.0 ±7.1분 및 27.0 ±4.9분이었다. 따라서, 보다 빠른 재관류는 항상 헤파린 또는 tPA 단독에 의해서보다는 SB 249415를 이용하여 달성되었다.
<실시예 12>
지혈 작용에 대한 항-인자 IX 항체의 효과
tPA 단독, tPA + 헤파린 및 tPA + SB 249415로 처리된 래트에서 처리 기간의 말미에 피브리노겐, 플라즈미노겐 및 알파-2-항플라즈민의 수준을 모니터링하여 지혈 작용의 유지에 있어서의 보조제로서 항-인자 IX 또는 헤파린의 영향을 측정하고, 그 결과를 비히클 처리된 동물과 비교하였다. 도 13에 나타낸 바와 같이, tPA의 투여량 증가는 측정되는 각각의 지혈 마커의 수준을 감소시켰다. tPA의 투여량을 9 mg/kg으로 증가시켰을 때, tPA로 처리되지 않은 동물에서 알파-2-항플라즈민 수준은 약 90％에서 약 20％로 감소하였다. 플라즈미노겐 수준은, tPA를 처리하지 않은 경우의 평균 약 100％에서 9 mg/kg의 처리군에서 약 40％로 감소하였다. 이와 유사하게, 피브리노겐 수준은 고투여량의 tPA 군에서 약 150 mg/㎗에서 약 90 mg/㎗로 감소하였다. 흥미롭게도, 보조제의 선택은 이들 마커 중 어떠한 것에도 유의한 영향을 주지 않는 것으로 보인다. 각 tPA 투여량에서, 유사한 수준의 알파-2-항플라즈민, 플라즈미노겐 및 피브리노겐이 비히클, 30 U/kg 또는 60 U/kg의 헤파린, 또는 1 mg/kg 또는 3 mg/kg의 SB 249415를 제공받은 동물에서 관찰되었고, 관찰된 지혈 마커량의 감소는 단지 혈전 용해제인 tPA 투여량의 함수이며, 이러한 감소는 특히 피브리노겐의 경우에 있어서 6 mg/kg보다 더 많은 tPA 투여량, 즉 9 mg/kg의 고투여량 군에서 특히 큰 것으로 보인다.
표준 aPTT 응고 분석의 aPTT에 대한 여러 치료 요법의 효과를 모니터링하였다 (도 14). tPA의 투여량을 증가시키자 aPTT는 비히클 및 9 mg/kg tPA의 경우 각각 19.3초 ±0.6초에서 30.O초 ±1.6초로 증가하였다. SB 249415 3 mg/kg의 투여는 대조구 동물의 aPTT에 있어서 49.6초 ±6.4초로의 제한된 증가를 나타내었다. SB 249415를 tPA와 함께 공동 투여한 경우, 증가는 약간 더 큰 것으로 관찰되었으며, tPA의 투여량에 의존하였다. SB 249415와 3 mg/kg의 tPA의 조합은 58.3초 ±5.2초의 aPTT를 나타내었으며, SB 249415와 투여량 9 mg/kg의 tPA의 조합은 aPTT를 77.3초 ±19.7초로 증가시켰다. 투여량 30 U/kg 또는 60 U/kg의 헤파린의 투여는 aPTT를 크게 증가시켰다. tPA를 투여하지 않은 경우, aPTT는 30 U/kg 및 60 U/kg의 투여량에 대하여 각각 약 300초 내지 600초의 범위였다. tPA 처리된 동물에서, aPTT는 약 800초였다.
효과적인 재관류를 달성하기 위해서는 tPA의 높은 투여량이 요구되기 때문에, 특히 지혈 파라미터의 변동과 연계된 경우, 헤파린의 사용으로 인한 aPTT의 상승은 출혈을 야기할 가능성이 있다. 바꾸어 말하면, SB 249415는 aPTT의 주요한 증가를 유발하지 않으며, 더 적은 투여량의 tPA 사용을 가능하게 하므로 심근 경색 및 뇌졸중의 혈전 용해 치료에 있어서 상당한 이점을 제공한다.
<실시예 13>
SB 249417은 뇌졸중에서 조직 플라즈미노겐 활성화제의 용해 능력을 증진시킨다
상기 연구에 이용된 래트 혈전 색전성 뇌졸중 모델은 사실상 문헌 [Busch et al., Brain Research, 778, 16-24 (1997)]에 기재되어 있다. 이 모델의 3가지 주요 단계는 색전술의 준비, 래트 준비에 이은 색전술, 및 약리적 개입이다.
공여체 래트로부터 전혈을 채취하여 시트르산 처리된 진공 채혈관에 넣었다. 인간 트롬빈 1 단위 및 1M CaCl2 5 ㎕를 포함하는 시험관에 시트르산 처리된 혈액 (500 ㎕)을 신속하게 가하여 CaCl2의 최종 농도를 10 mM로 하였다. 5 내지 10초 내에, 이 칵테일의 일부를 약 15 cm 길이의 PE50 카테터로 인출하고, 실온에서 1시간 동안 응혈시켰다. 이 기간의 말미에, 관상 응혈을 카테터로부터 식염수로 채워진 페트리 디쉬로 배출시키고, 1.5 mm 길이의 절편으로 절단하였다. 이러한 절편 (응혈) 12개를, 래트 알부민 0.04 mg/㎖를 포함하는 식염수 용액으로 옮기고, 부피가 약 60 ㎕인 PE50 카테터로 재인출하였다. 카테터에서 헤드 투 테일 (head to tail)로 연결 (line-up)된 응혈을 색전술을 위해 래트 내에 넣었다.
무게가 350 내지 400 g인 수컷 스프라그 돌리 래트를 피하 투여량의 아트로핀 (0.5 mg/kg)을 수용하도록 수술적으로 준비하고, 이어서 5％ 이소플루란으로 마취시킨 다음 2％의 투여량을 유지하였다. 체온을 37 내지 38℃로 유지하였다. 무균 조건하에, 경부에서 정중 시상선을 절개하여 우측 총경동맥 (CCA), 우측 내경동맥 (ICA), 우측 외경동맥 (ECA), 및 익돌구개동맥을 노출시켰다. 익돌구개동맥을 묶어 지혈하였다. 소정의 길이의 ECA를 적출한 다음, 묶어 지혈하고 절단하였다. CCA 및 ICA를 클램핑하고, 색전을 포함하는 PE50 카테터를 ECA 말단에 삽입하여 분지시켰다. ICA 클램프를 제거하고, 색전을 ICA 내로 서서히 주입하면서, 동시에 CCA의 클램프를 제거하였다. 색전술을 실시하고 5분 후에, 미부정맥을 통해 비히클 (식염수), SB 249417 (2.O mg/kg) 및(또는) t-PA (5.O mg/kg)의 정맥내 주입을 시작하였다. SB 249417은 단일 볼루스 투여로 주입하였으며, 투여량 5 mg/kg의 t-PA는 10％ 볼루스로 주입한 다음, 나머지 90％를 30분에 걸쳐 주입하였다. 수술 절개를 종료하고, 래트를 회복시켰다.
색전술 실시 24시간 후에, 래트를 마취시켜 도살하였다. 뇌를 적출하고, 7개의 뇌 횡단 절편을 전두극으로부터 2 mm 간격으로 채취하였다. 절편을 1％ 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드 중에서 20분 동안 인큐베이션시킨 다음, 포르말린으로 고정하였다. 염색된 뇌 절편의 사진을 촬영하고, 상 분석 시스템 (Optimus Inc., Bothell, Wash)을 이용하여 분석하였다. 블라인디드 오퍼레이터 (blinded operator)에 의해 컴퓨터 스크린 상에서 경색 부위를 추적하여 경색 부위의 면적 (mm2)을 계산하였다. 각 처리에 대한 응집물의 평균 경색은 도 15에 나타나 있다 (대조구 (n = 20), tPA (n = 7) 및 SB 249417 (n = 6)). 색전 후에 래트에게 tPA (5.O mg/kg)를 투여하면, 생성된 평균 경색 부피가 약 33％ 감소하였다. SB 249417을 단독 투여하면, 생성된 경색 부피가 약 70％ 감소하였다. tPA (5.O mg/kg)와 SB 249417 (2.O mg/kg)의 조합은 추가의 보호를 제공하였으며, 평균 경색 부피 (P = 0.126)를 약 88％ 감소시켰다. 이 모델에서의 경색은 선조체 및 신피질에서 유사한 빈도로 나타났다. 경색된 조직의 위치를 기준으로, 폐색이 가장 빈번한 부위는 중뇌동맥 (MCA)인 것으로 보인다. 빈도가 더 적기는 하지만, 이러한 증거는 맥락막동맥, 전뇌동맥 및 후뇌동맥도 때때로 폐색되었음을 시사한다. 관상 절편으로 검토한 경우 (데이타는 나타내지 않음), 처리시 발생하는 경색 부피 감소의 대부분은 중심 MCA 관류 영역 내에 있었다. 경색된 조직의 분포는 처리 이후에 눈에 띄게 변화하지 않았다.
상기 결과는, 색전 후에 투여시 항-인자 IX 항체 (예를 들어, SB 249417)가 단일요법으로 또는 혈전 용해제 (예를 들어, tPA)에 대한 보조제로 사용되는 경우 경색된 뇌조직 형성을 감소시킬 수 있음을 나타낸다. 항-인자 IX 항체, 예를 들어 SB 249417은 단독으로 또는 혈전 용해제에 대한 보조제로서 혈전 색전성 뇌졸중의 치료에 있어서 임상적 유용성을 가질 것으로 예상된다. 조합 요법에 의해 혈전 용해제의 양을 감소시키고, 후속되는 출혈성 뇌졸중의 자극 위험을 감소시킬 수 있다.
본 발명은 그의 사상 또는 본질적 특징을 벗어나지 않으면서 다른 특정의 형태들로 구현될 수 있으며, 따라서 본 발명의 범위를 나타내는 것으로는 상기 상세한 설명보다는 하기 첨부된 청구의 범위를 참고해야 한다.
도 1은 쥐의 항-인자 IX mAb인 BC1 및 BC2를 사용한 정상 인간 혈장의 역가적정을 설명하는 실험 결과의 그래프이다.
도 2는 쥐의 항-인자 IX mAb인 9E4(2)F4 및 11G4(1)B9를 사용한 정상 인간 혈장의 역가적정을 설명하는 실험 결과의 그래프이다.
도 3은 쥐의 항-인자 X mAb인 HFXHC 및 HFXLC, 및 쥐의 항-인자 XI mAb인 HFXI를 사용한 정상 인간 혈장의 역가적정을 설명하는 실험 결과의 그래프이다.
도 4는 래트의 경동맥 혈전증 모델에서 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (aPTT) 60분에 대해 헤파린, 아세틸살리실산 및 쥐의 인자 IX mAb가 미치는 효과를 설명하는 실험 결과의 막대 그래프이다.
도 5는 래트의 경동맥 혈전증 모델에서 프로트롬빈 시간 60분에 대해 헤파린, 아세틸살리실산 및 쥐의 인자 IX mAb가 미치는 효과를 설명하는 실험 결과의 막대 그래프이다.
도 6은 래트의 경동맥 혈전증 모델에서 경동맥 혈류의 폐색에 대해 헤파린, 아세틸살리실산 및 쥐의 인자 IX mAb가 미치는 효과를 설명하는 실험 결과의 막대 그래프이다.
도 7은 래트의 경동맥 혈전증 모델에서 혈전의 중량에 대해 헤파린, 아세틸살리실산 및 쥐의 인자 IX mAb가 미치는 효과를 설명하는 실험 결과의 막대 그래프이다.
도 8은 래트의 경동맥 혈전증 모델에서 aPTT 60분에 대해 헤파린, 쥐의 인자 IX mAb인 BC2, 인자 IX의 키메라 mAb 및 인자 IX의 인간화 mAb가 미치는 효과를 설명하는 실험 결과의 막대 그래프이다.
도 9는 래트의 경동맥 혈전증 모델에서 혈전의 중량에 대해 헤파린, 쥐의 인자 IX mAb인 BC2, 인자 IX의 키메라 mAb 및 인자 IX의 인간화 mAb가 미치는 효과를 설명하는 실험 결과의 막대 그래프이다.
도 10은 tPA 매개의 재관류에 대해 항-인자 IX mAb 및 헤파린이 미치는 효과를 설명하는 실험 결과의 막대 그래프이다.
도 11은 경동맥 혈관 개방에 대해 항-인자 IX mAb 및 헤파린이 미치는 효과를 설명하는 실험 결과의 막대그래프이다.
도 12는 혈류의 회복 시간에 대해 항-인자 IX mAb 및 헤파린이 미치는 효과를 설명하는 실험 결과의 막대 그래프이다.
도 13은 지혈 파라미터인 피브리노겐, 플라즈미노겐 및 항플라즈민에 대해 tPA가 미치는 효과를 설명한다.
도 14는 aPTT에 대해 tPA, 헤파린 및 항-인자 IX mAb가 미치는 효과를 설명한다.
도 15는 혈전 색전성 뇌졸중에서의 응집체 평균 경색 부피에 대해 tPA, SB 249417, 및 tPA와 SB 249417의 조합이 미치는 효과를 설명한다.
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(ii) TITLE OF INVENTION: ANTICOAGULANT AGENTS USEFUL IN TREATMENT OF THROMBOSIS (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 111 (iv) CORRESPONDENCE ADDRESS: (A) ADDRESSEE: SmithKline Beecham Corporation (B) STREET: 709 Swedeland Road (C) CITY: King of Prussia (D) STATE: PA (E) COUNTRY: USA (F) ZIP: 19406 (v) COMPUTER READABLE FORM: (A) MEDIUM TYPE: Diskette (B) COMPUTER: IBM Compatible (C) OPERATING SYSTEM: DOS (D) SOFTWARE: FastSEQ Version 1.5 (vi) CURRENT APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: unknown (B) FILING DATE: herewith (C) CLASSIFICATION: (vii) PRIOR APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: 09/571,434 (B) FILING DATE: 15-MAY-2000 (viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION: (A) NAME: Baumeister, Kirk (B) REGISTRATION NUMBER: 33,833 (C) REFERENCE/DOCKET NUMBER: P50438-2 (ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION: (A) TELEPHONE: 610-270-5096 (B) TELEFAX: 610-270-5090 (C) TELEX: (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:1: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: 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Claims (23)

  1. 항-인자 IX 항체 또는 항체 단편을 투여하는 것을 포함하는, 동물의 혈전 색전증 후에 유도된 허혈 (post-thromboembolic induced ischemia)을 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 항-인자 IX 항체 또는 항체 단편이 색전 후에 (post-embolus) 투여되는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 항-인자 IX 항체 또는 항체 단편이 뇌졸중 후에 투여되는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 항-인자 IX 항체 또는 항체 단편이 SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 249417, SB 257731 또는 SB 257732의 식별 특성 번호를 갖는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 항-인자 IX 항체 또는 항체 단편이 SB 249417의 식별 특성 번호를 갖는 것인 방법.
  6. SB 249417을 투여하는 것을 포함하는, 동물의 혈전 색전증 후에 유도된 허혈을 치료하는 방법.
  7. 항-인자 IX 항체 또는 항체 단편을 플라즈미노겐 활성화제와 조합하여 투여하는 것을 포함하는, 동물의 혈전 색전증 후에 유도된 허혈을 치료하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 항-인자 IX 항체 또는 항체 단편과 플라즈미노겐 활성화제가 색전 후에 투여되는 것인 방법.
  9. 제7항에 있어서, 항-인자 IX 항체 또는 항체 단편과 플라즈미노겐 활성화제가 뇌졸중 후에 투여되는 것인 방법.
  10. 제7항에 있어서, 항-인자 IX 항체 또는 항체 단편이 SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 249417, SB 257731 또는 SB 257732의 식별 특성 번호를 갖는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 항-인자 IX 항체 또는 항체 단편이 SB 249417의 식별 특성 번호를 갖는 것인 방법.
  12. 제7항에 있어서, 혈전 용해제가 tPA, 유로키나아제, 스트렙토키나아제 또는 이들의 변이체인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 혈전 용해제가 tPA인 방법.
  14. SB 249417을 tPA와 조합하여 투여하는 것을 포함하는, 동물의 혈전 색전증 후에 유도된 허혈을 치료하는 방법.
  15. 항-인자 IX 항체 또는 항체 단편을 혈전 용해제와 조합하여 투여하는 것을 포함하는 동물의 혈전 색전증 후에 유도된 허혈의 치료에 있어서, 혈전 용해제의 필요 투여량을 감소시키는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 항-인자 IX 항체 또는 항체 단편이 SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 249417, SB 257731 또는 SB 257732의 식별 특성 번호를 갖는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 항-인자 IX 항체 또는 항체 단편이 SB 249417의 식별 특성 번호를 갖는 것인 방법.
  18. 제15항에 있어서, 혈전 용해제가 tPA, 유로키나아제, 스트렙토키나아제 또는 이들의 변이체인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 혈전 용해제가 tPA인 방법.
  20. 혈전 색전성 뇌졸중에 걸릴 위험이 있는 동물에게 항-인자 IX 항체 또는 항체 단편을 투여하는 것을 포함하는, 상기 동물에서 혈전 색전성 뇌졸중을 예방하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 항-인자 IX 항체 또는 항체 단편이 SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 249417, SB 257731 또는 SB 257732의 식별 특성 번호를 갖는 것인 방법.
  22. 제20항에 있어서, 항-인자 IX 항체 또는 항체 단편이 SB 249417의 식별 특성을 갖는 것인 방법.
  23. 혈전 색전성 뇌졸중에 걸릴 위험이 있는 동물에게 SB 249417을 투여하는 것을 포함하는, 상기 동물에서 혈전 색전성 뇌졸중을 예방하는 방법.
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