JP2001502883A - ミニアデノウイルスベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はアデノウイルス（Ａｄ）ベクター、並びに遺伝子移入、遺伝子治療、及び遺伝子ワクチン接種を含む遺伝学的医療の分野におけるそれらの用途に関する。特には、本発明は、Ａｄゲノムの最小ｃｉｓ−要素を坦持し（ミニＡｄベクター）、かつ約３６ｋｂまでの導入遺伝子及び／又は異種ＤＮＡを送達することが可能なＡｄベクターに関する。このミニＡｄベクターの生成及び増殖には、Ａｄヘルパー細胞系におけるパッケージ化弱力化複製欠損ヘルパーＡｄ（ヘルパー）のトランス補完性が必要とされる。本発明は、さらに、血友病の遺伝子治療において用いるためのミニアデノウイルス（ミニＡｄ）ベクター及びこのＡｄベクターのイン・ビボ評価のための動物試験系を生成するための方法論を包含する。特には、本発明では、Ａｄゲノムの最小シス−要素（いわゆるミニＡｄ）のみを有し、かつヒトＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡを他の支持ＤＮＡ要素と共に３６ｋｄまで含む第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）Ａｄベクターが説明される。このＦＶＩＩＩミニＡｄは、パッケージ化弱力化ヘルパーＡｄ及びヘルパー細胞系の補助により生成し、優先的に増幅させることができる。また、本発明は、ミニＡｄのイン・ビボ試験に用いることができるトランスジェニックマウスモデルを生成するための設計及び方法も報告する。

Description

【発明の詳細な説明】 ミニアデノウイルスベクター 本願は、１９９６年５月３１日出願の米国出願番号０８／６５８，９６１号及 び１９９７年１月３１日出願の米国出願番号０８／７９１，２１８号の優先権を 主張する。 発明の技術分野 本発明はアデノウイルス（Ａｄ）ベクター、並びに遺伝子移入、遺伝子治療、 及び遺伝子ワクチン接種を含む遺伝学的医療の分野におけるそれらの用途に関す る。特に、本発明は、Ａｄゲノムの最小ｃｉｓ−要素を坦持し（ミニＡｄベクタ ー）、且つ約３６ｋｂまでの導入遺伝子及び／又は異種ＤＮＡを送達することが 可能なＡｄベクターに関する。このミニＡｄベクターの生成及び増殖には、Ａｄ ヘルパー細胞系におけるパッケージ化弱力化複製欠損ヘルパーＡｄ（ヘルパー） のトランス補完性が必要とされる。 本発明は、さらに、血友病の遺伝子治療において用いるためのミニアデノウイ ルス（ミニＡｄ）ベクター及びこのＡｄベクターのイン・ビボ評価のための動物 試験系を生成するための方法論を包含する。特には、本発明では、Ａｄゲノムの 最小シス−要素（いわゆるミニＡｄ） のみを有し、且つヒトＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡを他の支持ＤＮＡ要素と共に３６ｋ ｄまで含む第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）Ａｄベクターが説明される。このＦＶ ＩＩＩミニＡｄは、パッケージ化弱力化ヘルパーＡｄ及びヘルパー細胞系の補助 により生成し、優先的に増幅させることができる。また、本発明は、ミニＡｄの イン・ビボ試験に用いることができるトランスジェニックマウスモデルを生成す るための構造及び方法も報告する。 従来技術の説明 遺伝学的医療の開発における重要な問題は好ましい遺伝子送達系の開発である 。この好ましい遺伝子送達系は、単一の遺伝子治療ベクターにおいて現在利用不 可能である幾つかの特性を有していなければならない。この好ましいベクターは 、大きな、もしくは複数の、調節要素を含む導入遺伝子を受け入れるのに適する 収容力を保持し、且つ製造のための簡潔な操作及びスケールアップに順応しなけ ればならない。また、このようなベクターは安全で低毒性を示すことはもちろん 、標的細胞又は組織への非常に効率的且つ選択的な導入遺伝子の送達を示さなけ ればならない。最後に、このようなベクターは、標的細胞における導入遺伝子の 適切な保持、発現、及び調節を支持することが可能でなければならない。本発明 は、新規構造の高収容力且つ高効率Ａｄベクター系を包含し、好ましい遺伝子送 達系に関する問題及び当業者の関心を 解決することに焦点を当てる。 血友病Ａは、疾患に冒された個体において凝固因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）の 発現又は機能における欠損の結果生じる。血友病の治療は、現在、血漿濃縮物か ら得られ、又は組換えＦＶＩＩＩタンパク質を発現するように操作された培養細 胞から精製して得られる正常ＦＶＩＩＩタンパク質の注入を含む（１）。治療上 の利点は血漿濃度が正常血漿濃度（ミリリットル当たり２００−３００ｎｇもし くは１単位；参考文献２）の５−１０％にまで回復することにより達成される。 正常血漿濃度の３０％を上回る濃度の維持が正常な生活様式の近いものと見込ま れることが研究により示されている（３）。血友病の治療を指向する遺伝子治療 アプローチは刺激的な潜在力を有する；しかしながら、幾つかの主な挑戦は、こ れらの治療様式を現実のものとするために克服すべきもののままである（４）。 本発明は、これらの困難を解決することが可能な幾つかの手段を提供する。 ＦＶＩＩＩは通常肝臓において生成され、新生ポリペプチドのアミノ末端から 誘導される、９２ｋＤａ乃至２１０ｋＤａの見かけの分子量範囲を有する重鎖ポ リペプチド及び８０ｋＤａのＣ−末端軽鎖を含んでなる（５３）。これは、ファ ンデルワールス力（ｖＷＦ）での複合体の形成によりタンパク分解から保護され ている。その活性化形態は、血液凝固カスケードにおいて、活性化第ＩＸ因子（ ＦＩＸａ）、負に荷電したリン脂質及びカルシウ ムイオンと共に補因子として作用し、第Ｘ因子をその活性化形態Ｘａに変換する 。ヒトｃＤＮＡは９ｋｂの長さであり、数種類のドメインをＡ１、Ａ２、Ｂ、Ａ ３、Ｃ１及びＣ２の順で含んでなる２３５１アミノ酸のペプチドをコードする（ ５−７）。Ａ及びＣドメインは機能的な活性に重要であり、これに対して約９８ ０アミノ酸からなるＢドメインの大部分は活性には不必要である（８）。完全長 ＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡはレトロウイルス及びアデノウイルスベクターのサイズ制 限を超えるため、現在までに当業者によって用いられる遺伝子治療プロトコルの 大部分は、残りのｃＤＮＡが約４．５ｋｂとなるようにＢドメインを欠失させた ＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡを用いる。 レトロウイルスベクターは遺伝子治療における使用について最初に研究すべき もののうちの１つであった（６４、６５）。外来性ＤＮＡの挿入に対するサイズ 容量は約７．５ｋｂに制限される。一般には、ウイルスｍＲＮＡの不安定性の問 題及びＦＶＩＩＩ遺伝子産生物（６１，６３，７４）をコードするｍＲＮＡの発 現の困難性のため、レトロウイルスベクターから高水準のＦＶＩＩＩの発現を得 ることは困難である。加えて、大部分の肝細胞のような非***細胞の感染にも問 題がある。この制限を克服する方法の１つは、レトロウイルス感染に先立って２ ／３部分的肝切除を行い、活発に再生する肝細胞の感染を可能にすることである （７３）。別のアプローチにおいては、筋肉特異的エンハンサーを用いて長期間 の発 現が達成されているが、低水準の遺伝子産生物ＦＩＸのみが達成されただけであ る（７８）。治療水準のＦＶＩＩＩはマウスにおいて達成されている（７７）。 近年、ネズミアルブミンプロモーターの制御の下にあるＢドメイン欠失ＦＶＩ ＩＩ ｃＤＮＡを含むＥ１置換アデノウイルスベクターが用いられ、マウス及び イヌにおいて治療水準のヒトＦＶＩＩＩの発現が達成されている（１３−１５） 。ＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡを含むこのアデノウイルスベクターを高用量（４Ｘ１０⁹ ｐｆｕ）投与した場合、免疫適格動物における遺伝子の発現は持続性の点で制 限された；遺伝子発現の漸進的な低下は肝臓組織におけるアデノウイルスベクタ ーＤＮＡの検出の喪失と相関していた（１３）。発現の低下はベクター接種物を 減少させることにより部分的に解消され、その結果、ＦＶＩＩＩの治療血漿濃度 が投与の後２２週間続いた（１６）。しかしながら、これらの研究において用い られたＣ５７Ｂ１／６株のマウスは免疫応答が弱力化された；このため、これら の結果は、完全に免疫適格の動物を用いて得ることができるものを反映していな い可能性がある。イヌにおける、これらのベクターを用いる発現の急速な低下は 、ヒトＦＶＩＩＩタンパク質又はアデノウイルスタンパク質に対する免疫応答に 起因するものであると考えることが可能であった。このようなＥ１置換アデノウ イルスベクターのヒトにおける潜在的な使用を確認するには、イヌのようなより 大型の動物でイヌＦＶ ＩＩＩを用いて実験を行うことが必要であろう。 アデノウイルスベクターは、１）アデノウイルスの静脈内（Ｉ．Ｖ．）注射の 結果、部分的にはこのアデノウイルスベクターが主として肝臓組織に蓄積するた め、遺伝子発現の標的が肝臓に設定され；２）肝臓からのＦＶＩＩＩの発現が血 漿中のＦＶＩＩＩの濃度を大きく上昇させ；及び３）正常な個体においては肝臓 がＦＶＩＩＩの合成の主要部位であるという事実により、ＦＶＩＩＩの送達に好 ましいものであり得る。 しかしながら、重大な困難はアデノウイルス遺伝子の送達に関連する。例えば 、Ａｄは通常宿主細胞のゲノムに組み込まれない。導入遺伝子の発現を長期間維 持するためには、Ａｄが宿主細胞の統合に必要な要素又はＤＮＡ保持の他の機構 を含まなければならない。加えて、アデノウイルスベクターに対して介在する免 疫応答がそのベクターの再投与を非常に困難なものとする（７６）。本発明のミ ニＡｄベクターは、導入遺伝子を坦持するミニＡｄベクターから全てのアデノウ イルス遺伝子が排除されている。これは、少なくとも部分的に、宿主細胞におけ るＡｄ遺伝子の発現によって生じる可能性がある、導入遺伝子の発現の低下に寄 与し得るあらゆる有害な免疫応答を排除する。 大きな異種ＤＮＡインサートを考慮したアデノウイルスベクターが国際特許出 願ＷＯ９６／３３２８０号に記述されている（参考文献１３２を参照）；しかし ながら、 このベクターは、標的細胞に侵入した際にこのベクターを標的細胞ゲノムに組み 込むための、又はエピソーム維持のための要素を提供しない。本発明は、標的細 胞ゲノムに組み込むことにより、又はエピソーム核酸として維持することにより 、宿主細胞における送達された導入遺伝子の保持が考慮された要素を提供する。 本発明によってこれが達成される方法の１つは、ウイルス組み込み機構を用いて 宿主細胞のゲノムへの導入遺伝子の組み込みを容易にすることを含む。アデノ関 連ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムは感染した細胞のＤＮＡに組み込まれる能力を有し 、ヒトゲノムの特定の部位、１９ｑ１３．３−ｑｔｅｒのＡＡＶＳ１に組み込ま れる外来性ＤＮＡの唯一の例である（３５、１３３）。ＡＡＶ組み込みの最小要 素は逆末端反復（ＩＴＲ）配列及び機能的Ｒｅｐ７８／６８タンパク質である。 本発明は、導入遺伝子の発現を持続させるために宿主細胞のゲノムに導入遺伝子 を組み込むためのこれらの組み込み要素を包含する。また、本発明は、標的細胞 のゲノムへの異種組換えが可能なアデノウイルスベクター、当業者が現在利用可 能なアデノウイルスベクターを上回る別の重要な利点をも提供する。また、本発 明は、導入遺伝子のエピソーム複製を可能にする要素をも提供する。 不死化細胞系（２２−２４、１３４）、エピソーム系（２５−２７）、及び細 胞非含有抽出物（２８）におけるＡＡＶ又はＡＡＶベースのベクターの部位特異 的組み 込みを検出するためにイン・ビトロモデル系が開発されている。始原ヒト細胞又 は不死化細胞系を用いるＡＡＶの形質導入効率の比較は、形質導入効率が不死化 ヒト細胞において始原細胞よりも１０−６０倍高いことを示した（２９）。これ らの結果は始原細胞を用いることの重要性を、又は、イン・ビボモデル系におい てＡＡＶベクターを遺伝子治療用途について正確に評価することがさらに良いこ とを強調する。しかしながら、現在に至るまで、部位特異的組み込みを検出する ためのイン・ビボ動物モデル系は開発されていない。そのゲノムにヒトＡＡＶＳ １配列が組み込まれた動物モデルが本発明において提供される。この動物モデル は、部位特異的組み込みを試験するだけではなく、イン・ビボでの遺伝子送達、 遺伝子導入効率、組織分布、及び遺伝子の発現の持続をも試験するための、ＡＡ Ｖ組み込み機構を有するベクターの評価に有用である。 血友病のイヌ及びマウスを含む動物モデルがＦＶＩＩＩ調製品の効率の試験に 用いられている（１１、１３−１５、８２、８３）。しかしながら、ヒトＦＶＩ ＩＩ遺伝子治療については、動物モデルにおけるヒトＦＶＩＩＩタンパク質に対 する免疫応答がＦＶＩＩＩの長期送達の研究を複雑なものにする可能性がある。 本発明はヒトＦＶＩＩＩに対して寛容である動物モデルを提供する。このような 動物におけるヒトＦＶＩＩＩに対する免疫応答の欠如には、ヒトＦＶＩＩＩに対 する免疫応答によっ て生じ得る免疫学的な複雑性なしに導入遺伝子の送達を正確に評価する余地があ る。 本発明のミニＡｄベクター系は２つの重要な発見に基づいて開発された：１） ウイルスゲノムの大部分がＳＶ４０の配列で置換されているものの、Ａｄ ＩＴ Ｒ及びパッケージ化要素が存在するため処理を受けてパッケージ化され得るＡｄ −ＳＶ４０ハイブリッドの発見（１７）；及び２）パッケージ化シグナルの部分 的な欠失によりＡｄのパッケージ化を弱力化することが可能であること（１８） 。パッケージ化及びゲノム複製のための最小シス要素の組み込みに基づく他のア デノウイルスベクターパッケージング系を他者が開発中である（１９−２１）。 発明の要約 本発明の目的は、１）導入遺伝子の発現を制御し、標的細胞ゲノムＤＮＡへの 外来性ＤＮＡの組み込みを助成し、及び／又はベクターを標的細胞内においてエ ピソーム形態で維持するための要素を含んでいてもよい約３６ｋｂの異種ＤＮＡ を挿入するための収容力を有する大容量アデノウイルス（Ａｄ）ベクター（“ミ ニＡｄ”ベクター）；２）このミニＡｄベクターの増殖を支持するように設計さ れ、且つ宿主産生細胞内でこのミニＡｄベクターがより大きなベクターにパッケ ージ化されるように操作されたパッケージ化シグナルを有する同族ヘルパーＡｄ ベクター；及び３）ミニＡｄベクター及びヘルパー Ａｄベクターの両者の増殖を支持するように設計されたヘルパー細胞系であって 、ウイルスの増殖の間の導入遺伝子の発現を調節し、且つヘルパーＡｄゲノムの パッケージ化を選択的に弱力化するのにも役立ち得るヘルパー細胞系を提供する ために、改変されたアデノウイルスベクターを提供することである。 当業者が遭遇する問題は、従来のベクターに挿入することができる外来性ＤＮ Ａの量が現在の最大で約８ｋｂに制限されることである。本発明の目的は、約３ ７ｋｂまでのインサート収容力を提供することが可能なミニＡｄベクターを提供 することにあり、この収容力は大きなコーディング領域を有するタンパク質をコ ードする核酸の送達に十分なものである。 態様の１つにおいて、本発明はミニＡｄベクターを単離ＤＮＡ分子として提供 し、この単離ＤＮＡ分子は複製、パッケージ化及び持続性の遺伝子発現に必要な 要素、例えば、逆末端反復（ＩＴＲ）、パッケージ化シグナル、転写調節領域、 エフェクター又はレポーター遺伝子、及びゲノム組み込み配列又はエピソーム維 持配列のいずれかを有し、これらの全ては感染性複製不全組換えアデノウイルス ベクターを産生するために作動の上で協働し、前記ＤＮＡ分子の残りの部分はア デノウイルスのタンパク質をコードしない。このようなベクターの例の１つにお いては、ヒトＦＶＩＩＩをコードするミニＡｄベクターが提供される。 当業者が遭遇する別の問題は、標的細胞に導入した後の遺伝子発現の持続期間 が制限されることである。本発明のさらに別の目的は、標的細胞に導入した後の 導入遺伝子の発現の持続時間を延長させるのに必要な要素を有するベクターを提 供することである。したがって、本発明は、標的細胞における導入遺伝子発現の 安定化をエピソームとして、又は導入された遺伝子のその細胞のゲノムへの組み 込みを容易にすることにより、助成し得る要素を有するベクターを提供する。態 様の１つにおいて、本発明は、ミニＡｄベクター内にゲノム組み込み要素又はエ ピソーム維持要素のいずれかを提供する。このような系の一例では、ＡＡＶの組 み込み要素を含むミニＡｄベクターが提供される。このような系の別の例では、 ミニＡｄベクター内に相同組換えアームが提供される。 本発明のさらに別の目的は、パッケージ化が弱力化された複製不全ヘルパーＡ ｄをＥ１補完性Ａｄヘルパー細胞系と組み合わせて用いて、ミニＡｄベクターを 生成するための試薬及び方法論を提供することにある。態様の１つにおいて、Ｅ １欠失ヘルパーＡｄゲノムが野生型ヘルパーＡｄゲノムよりも低い頻度でパッケ ージ化されるように変更されたパッケージ化シグナルを有するＥ１欠失ヘルパー Ａｄゲノムが提供される。別の態様においては、Ａｄ Ｅ１遺伝子配列が安定に 形質移入された細胞としてヘルパー又は産生細胞が提供され、このＡｄ Ｅ１遺 伝子欠失配列にはＥ１欠失ヘルパーＡｄゲノムのゲ ノムと重複する配列がない。加えて、さらに別の態様においては、ヘルパー又は 産生細胞にミニＡｄベクター及びＡｄヘルパーゲノムを同時形質移入し、及び／ 又はこの細胞にＡｄヘルパーウイルスを感染させ、且つ該産生細胞の細胞非含有 溶解物を調製することにより、組換えアデノウイルスベクターを生成する方法が 提供される。このようにして調製される細胞非含有溶解物はこの感染性複製障害 組換えアデノウイルスベクター粒子を含み、その大部分はミニＡｄベクターＤＮ Ａを含む。 動物モデル系においてイン・ビボで、形質導入効率を分析し、且つＡＡＶの標 的をその組み込み部位ＡＡＶＳ１に設定することが困難であることも当業者にと っては立証されている。本発明のさらに別の目的は、本発明のミニＡｄベクター に組み込まれたＡＡＶ組み込み機構によって指向される標的組み込みを評価する ための動物モデル系を提供することにある。一例として、本発明は、それらのゲ ノム内にヒトＡＡＶＳ１組み込み配列を有するトランスジェニックマウスを生成 するための方法論を提供する。このような動物にミニＡｄベクターを注射した後 、ＡＡＶＳ１部位への導入遺伝子の標的組み込みを評価することができる。 また、当業者は、ヒトＦＶＩＩＩの外来タンパク質としての免疫学的認識のた め、ヒトＦＶＩＩＩベクターの毒性及び長期間の効力の決定において困難に直面 している。本発明の目的は、ヒトＦＶＩＩＩの発現を評価する ためのヒト第ＶＩＩＩ因子寛容動物を提供する。本発明は、成熟動物ではなく発 生中のマウスにおいてヒトＦＶＩＩＩが発現するように、発生的に調節されたプ ロモーター（すなわち、α−胎児タンパク質プロモーター）に作動可能に連結さ れたヒトＦＶＩＩＩ遺伝子を有するトランスジェニックマウスを開発するための 方法論を提供する。この一時的な発現の結果、その動物はヒトＦＶＩＩＩタンパ ク質に対して寛容となり、それによりヒトＦＶＩＩＩを“自己”タンパク質とし て認識する。この場合、そのような動物においてはヒトＦＶＩＩＩに対する免疫 応答は生じない。本発明は、さらに、ヒトＦＶＩＩＩ寛容友血病マウス種に加え て、そのゲノムにヒトＡＡＶＳ１予備組み込み部位が組み込まれているヒトＦＶ ＩＩＩ寛容友血病マウスを提供する。 したがって、本発明は、当業者が遭遇している、遺伝子治療ベクターに関連す る多くの困難を克服するのに必要とされる試薬及び方法論を提供する。本発明の 上述の目的はもちろん、他の目的も、以下に記載される発明の詳細な説明に鑑み て理解される。 図面の簡単な説明 図１．ミニＡｄベクター系の原理。ミニＡｄベクター系の３つの主要成分：ヘル パーＡｄ、ミニＡｄベクター、及びＡｄヘルパーが示される。ヘルパー細胞によ って供給されるＥ１はヘルパーＡｄがそれ自体で複製し、ウイ ルスキャプシドを形成する後期ウイルスタンパク質を合成することを可能にする 。このキャプシド内へのヘルパーＡｄゲノムのパッケージ化は、本発明のヘルパ ーＡｄのパッケージ化シグナルが弱力化されているため非能率的である。ミニＡ ｄベクターゲノムの存在下において、ヘルパーＡｄはそのミニＡｄベクターゲノ ムの複製を支持し、これはその野生型パッケージ化シグナルがヘルパ−ウイルス パッケージ化タンパク質に対して高い親和性を有するため優先的にパッケージ化 される（３１）。ミニＡｄベクターのさらなる精製は、生化学的又は物理的方法 、例えば超遠心、を用いて達成することができる。 図２．現在のＡｄベクターの本発明との比較。このミニＡｄベクター系と比較し た、現在のＡｄベクターの一般的な設計及び補完機構が図示される。 図３．ヘルパーウイルス及びミニＡｄベクターの原型。 Ａ．アデノウイルスの左ＩＴＲを参照したパッケージ化シグナルの配置。Ｂ．野 生型アデノウイルス5のパッケージ化シグナル配列領域の配列が示される。角括 弧は弱力化ヘルパーウイルスパッケージ化シグナルを含めるために欠失された領 域を示す。Ｃ．Ｂに示される配列の反復領域は共通反復と共に記載されている。 図４．パッケージ化弱力化ヘルパーＡｄＨβを生成するためのシャトルベクター の構築。ＧＴ５０００を構築するため、突然変異パッケージ化シグナル配列ｍｔ ΨをＰＣＲにより増幅し、シャトルベクター内で２８．９ｍｕ まで延びるＡｄ５配列で置換した（ＧＴ４００４）。ｐＴｋ−βに由来するβ− ｇａｌ発現カセットをＧＴ５０００のＥ１欠失物にクローン化し、シャトルベク ターＧＴ５００１を得た。 図５．ＡｄＨβの生成。シャトルベクターＧＴ５００１（図８を参照）をｐＪＭ １７と共に２９３細胞に同時形質移入した。これらのプラスミドの間の相同７Ｋ ｂ領域（Ａｄ５の９．２４乃至２８．９）での組換えにより、ＧＴ５００１から 誘導される左アームを有するパッケージ化可能なウイルスが生じる。最下部に示 されるＡｄＨβの左領域の数字はＡｄ５ ｎｔ配列に相当し、パッケージ化シグ ナルに加えてβ−ｇａｌ発現カセットが挿入されているＥ１における二重欠失の 伸長を示す。同時形質移入の２週間後、幾つかの青色プラークを単離し、パッケ ージ化シグナル中の突然変異をオリゴ７及び８を用いてＰＣＲにより分析した。 増幅した断片のサイズ、野生型パッケージ化シグナル（ｗｔΨ）については３１ ０ｂｐ、突然変異パッケージ化シグナル（ｍｔΨ）については１７７ｂｐは、示 されるように、２％アガロースゲルにおいて区別することが可能である。１Ｋｂ ラダー、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ（ゲーサースバーグ、ＭＤ）製の１Ｋｂ ＤＮＡラダーマーカー；ｗｔΨ及びｍｔΨ、ｖＤＮＲがそれぞれＥ１欠失ベクタ ーＡｄ−ＣＭＶβｇａ１及びｄｌ１０／２８ウイルスから抽出されたＰＣＲ対照 ；青色プラーク、Ｘ−ｇａｌで青色に染色されたプ ラークからのｖＤＮＡ；白色プラーク、Ｘ−ｇａｌで青色に染色されなかったプ ラークからのｖＤＮＡ（図６を参照）。 図６．Ｘ−ｇａｌでの染色によるＡｄＨβプラーク対他のものの同定。［これら のプラークのパッケージ化シグナルのＰＣＲ増幅が図５に示される。］ 図７．ＡｄＨβの増幅及び特徴付け。２９３細胞中に存在する内在性左Ａｄ５配 列を用いる組換えが複製適格アデノウイルス（ＲＣＡ、Ｅ１＋）又はｗｔΨを有 するＥ１アデノウイルスを生じ得る可能性があるため、ＡｄＨβのパッケージ化 シグナルを各継代後に増幅した。ＣｓＣ１精製以前には継代中にｗｔΨは検出さ れなかった（４乃至８）。継代９では、ＡｄＨβを精製したときに、ウイルスＤ ＮＡ含量を勾配の５つのバンドの全てについて別々に分析した。１％アガロース ゲル（最下部左）においては上方の３つのバンドにおいてｖＤＮＡはほとんど観 察されず、これは、これらが大部分空のキャプシドによって形成されることを示 す。下方のバンド（４及び５）は充満キャプシドによって形成される。ＰＣＲに より、全てのバンドにおいて期待される突然変異パッケージ化シグナルが検出さ れる（最下部右）。１Ｋｂラダーマーカー（図９と同様）は各々のゲルの左レー ンである。ｖＤＮＡを含むゲルは１／ＨｉｎｄＩＩＩマーカーも含む。 図８．ミニウイルスプラスミドの構築。これらのプラス ミドは、ＡｄＨβで補完された場合のパッケージ化に対するアデノウイルスゲノ ムの様々な欠失の効果を決定するために構築する。全ての構築体は、ＣＭＶプロ モーターによってβ−アクチンエンハンサー（濃い矢印）で駆動される緑色蛍光 タンパク質ｃＤＮＡ（ＧＦＰ、縦線付きのボックス）を含む。Ｍ７．９（最下部 右）はネオマイシンｃＤＮＡ及び内部リボソームエントリ部位（ＩＲＥＳ）をも 有する。上部の６つはＭ３２から誘導され、これはＡｄ５ゲノムの中間に１０Ｋ ｂの欠失があるｐＪＭ１７誘導体である。最下部の２つはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ ｔ−ＫＳ（ストラタジェン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＣＡ）からＡｄ５の複製 及びパッケージ化のための最小シス要素を含めて誘導される。数字はＡｄ５マッ プ単位に対応し、欠失及び挿入部位を示す。０／１００及び１００／０はＡｄ５ ＤＮＡの逆末端反復（ＩＴＲ）、Ａｄ５ ＤＮＡの天然の融合を示す、濃いレ ーン；プラスミド主鎖ＤＮＡ、薄いレーン。 図９．パッケージ化のために構築されたミニアデノウイルス（ミニＡｄ）ベクタ ーの模式的図示。最上部は、初期（Ｅ）及び後期（Ｌ）転写領域を伴うＡｄ５転 写マップ及びマップ単位（ｍｕ）。ＭＬＰ／ＴＬ：主要後期プロモーター及び三 部構成ラダー。逆末端反復（ＩＴＲ）及びパッケージ化シグナル（Ψ）は全ての ミニＡｄベクターにおける独自の共通配列である。ベクターは、複製の後にキャ プシド内で見出される通りに、直鎖形態で示 される。ベクターの生成に用いられる環状プラスミドは、同じ配列を有するがＩ ＲＴにより頭部が尾部に融合している。それぞれのミニＡｄベクターの名称はＫ ｂでのそのサイズを引き合いにする。Ｍ３２乃至Ｍ２０はｐＨＭ１７から中央ア デノウイルスゲノムの漸進的欠失により誘導される。これらのベクターにおいて は、プラスミド主鎖（ｐＢＲＸ、図示せず）は３．７ｍｕに位置する。Ｍ６．５ 乃至ｖＧｎＥ５Ｅ３は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ主鎖（図示せず；ＧＦＰ発現カ セットの前に位置する）において、ネオマイシンｃＤＮＡ及びｃｈｒ．４ｑ１１ −２２に由来するヒトゲノム断片を挿入することにより構築される。 図１０．補完の２つの方法。ミニウイルスベクターを生成するのに、類似の収量 が得られる２つの別々の補完プロトコルを用いた。第１の方法においては、ミニ ＡｄプラスミドをＡｄＨβに由来するウイルスＤＮＡと共に同時形質移入し、そ れらの細胞をＣＰＥが観察されるまで培養する。第２の方法においては、ミニＡ ｄプラスミドをｐＢＨＧ１０と共に同時形質移入した３日後にＡｄＨβをウイル スとして加え、細胞をＣＰＥが観察されるまで培養する。 図１１．ミニウイルスプラスミドでの２９３細胞の同時形質移入。ＣａＰＯ₄改 変プロトコルを用いることによりほとんど全ての細胞に形質移入した。Ｍ３２プ ラスミドの形質移入は形質移入の１日後に示される。右、明視野 ；左、同じ視野の蛍光顕微鏡写真。 図１２．ミニウイルス含有プラーク。ミニウイルス（ここではＭ３２）の存在が プラークの蛍光によって示される。右、明視野；左、同じ視野の蛍光顕微鏡写真 。 図１３．異なるサイズのミニウイルスベクターのパッケージ化効率。異なるサイ ズのミニＡｄベクターのパッキング効率及び増幅。同時形質移入の後に生成され るウイルスを継代０と命名する。その粗製溶解物を用いて２９３細胞を感染させ 、継代１を生成した。１ｍｌの粗製溶解物継代１を用いて１０６個の２９３細胞 を感染させ、２４時間後に蛍光を発する細胞の数を数えた（形質導入単位／ｍｌ 、黒柱）。２４時間後にＣＰＥが出現し、凍結／解凍によりウイルスを抽出した （粗製溶解物継代２）。再度、１ｍｌの粗製溶解物継代２を用いて１０６個の２ ９３細胞を感染させ、２４時間後に蛍光を発する細胞の数を数えた（斜線付きの 柱）。継代１と２との相違は５Ｘの増幅収量を示し、異なるミニＡｄベクター間 の相違はパッケージ化におけるサイズの効果を示す。 図１４．Ｍ３２の精製スキーム。数回継代することによりＭ３２を増幅させた後 、粗製抽出物をＣｓＣｌ分離した。第１勾配の結果４つのバンドが生じた：３つ は上方で１つが下方。これらを別々に集めて透析し、図１２に示されるように２ ９３細胞の感染に用いた。上方及び下方バンドの第２分離勾配から画分を集め、 図１６に示されるように２９３細胞の感染に用いた。 図１５．Ｍ３２ミニＡｄウイルスの精製（１）。第１ＣｓＣｌ勾配。Ｍ３２及び ＡｄＨβをより高密度のバンドにおいて同時精製する（第４番以下）。蛍光のチ ェックに用いたものと同じウェルを後に固定及びＸ−ｇａｌでの染色に用いる。 図１６．Ｍ３２ミニＡｄウイルスの精製（２）：第２ＣｓＣｌ勾配を用いる第１ ＣｓＣｌ勾配からの下方バンドの分画。各画分の一定分量０．５μｌを、６０％ 集密の２９３細胞を収容する９６ウェル／プレートのウェルの１つを感染するの に用いた。最初の画分（１乃至６）はＭ３２又はＡｄＨβを含んでいなかった（ これらの画分は勾配の３ｍｌまでを表す）。画分７乃至１６の１００μｌの試料 は多量のＭ３２及びＡｄＨβを明らかにする（パネルＡにおいて蛍光の下で示さ れるものと同じ画分のβ−ｇａｌ染色についてはパネルＢを参照）。続く画分（ １７乃至２９）はそれ以前の画分に類似する濃度のＭ３２を示すが、ＡｄＨβの 濃度は約１０倍低い。したがって、画分１７−２９は、ＡｄＨβに対して約１０ 倍のＭ３２の濃縮を表す。 図１７．ＧＡＬ４結合部位を用いるＡｄ５パッケージ化シグナルの改変。Ｘｈｏ Ｉ及びＸｂａＩ部位の間のヌクレオチド配列が示される（設計＃１及び設計＃２ ）。設計＃１においては、Ａ反復Ｉの前に２つのＧＡＬ４結合部位が存在し、Ａ 反復IIとＶＩとの間に１つのＧＡＬ４結合部位が存在する。設計＃２においては 、Ａ反復Ｉの 前に２つのＧＡＬ４結合部位が存在し、別の２つのＧＡＬ４結合部位がＡ反復Ｖ ＩＩの後に存在する。下線が付された配列は１７量体ＧＡＬ４結合部位である。 イタリック体の配列はＡ反復である。各ＧＡＬ４結合部位の中心とＡ反復との間 の距離が示される。 図１８．ｔｅｔＯ配列を用いるＡｄ５パッケージ化シグナルの改変。ＸｈｏＩ及 びＸｂａＩ部位の間のヌクレオチド配列が示される（設計＃１及び設計＃２）。 設計＃１においては、Ａ反復Ｉの前に２つのｔｅｔＯ配列が存在し、Ａ反復ＩＩ とＶＩとの間に１つのｔｅｔＯ配列が存在する。設計＃２においては、Ａ反復Ｉ の前に２つのｔｅｔＯ配列が存在し、Ａ反復ＶＩＩの後にさらなるｔｅｔＯ配列 が存在する。下線が付された配列は１９量体ｔｅｔＯ配列である。イタリック体 の配列はＡ反復である。各ｔｅｔＯ結合部位の中心とＡ反復との間の距離が示さ れる。 図１９．Ａｄ Ｐａｃ−ＧＡＬ４改変のための合成オリゴの位置及び配列。Ｇａ ｌ＃１乃至Ｇａｌ＃８は、設計＃１及び＃２におけるＸｈｏＩ及びＸｂａＩ部位 の間の配列に隣接する合成オリゴである。各オリゴの位置及び方向が矢印で示さ れる。Ｇａｌ＃１乃至Ｇａｌ＃8の配列が記載される。 図２０．ａｄ Ｐａｃ−ｔｅｒＯ改変のための合成オリゴの位置及び配列。ｔｅ ｔ＃１乃至ｔｅｔ＃１０は、設計＃１及び＃２におけるＸｈｏＩ及びＸｂａＩ部 位の間 の配列を覆う合成オリゴである。各オリゴの位置及び方向が矢印で示される。ｔ ｅｔ＃１乃至ｔｅｔ＃１０の配列が記載される。 図２１．ＣＭＶ−Ｅ１哺乳動物発現ベクターの構築。Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂをコード するアデノウイルス５配列４６２−３５３７（ＡｆｌＩＩＩ−ＡｆＩＩＩ断片） をｐｃＤＮＡ３のＥｃｏＲＶ部位に平滑末端クローン化した。 図２２．Ｅ１補完性細胞系Ａ５４９Ｅ１−６８におけるＧＦＰ発現及びプラーク 形成。Ｅ１欠失アデノウイルスＡｄ５ＣＡ−ＧＦＰを感染させた後。このプラー クの中心の透明領域はＥ１補完ウイルスの増幅によって生じるＣＰＥの証拠であ る。 図２３．Ｇ４１８ｒ Ａ５４９Ｅ１クローンのサザンブロット分析。ゲノムＤＮ ＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、７５０ｂｐのＥ１プローブ（ＰｓｔＩ断片）で探 索した。レーン１：１ｋｂＤＮＡラダー；レーン２：Ａ５４９；レーン３：２９ ３；レーン４：Ａ５４９Ｅ１−６８；レーン５：サブクローンＡ５４９Ｅ１−６ ８．３。 図２４．新規細胞系の形態学的分析。親Ａ５４９細胞（上部パネル）及びＥ１補 完性細胞系Ａ５４９Ｅ１−６８（下部パネル）の形態学的比較。 図２５．形質転換細胞系におけるＥ１タンパク質の発現の分析。Ａ．Ａ５４９細 胞（レーン１）、２９３細胞（レーン２）及びＡ５４９Ｅ１−６８（レーン３） におけるＥ１Ａタンパク質の発現の、Ｅ１Ａ特異的モノクロ ーナル抗体（Ｍ７３、オンコジーン・サイエンス（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅ ｎｃｅ））を用いるウェスタンブロット分析。Ｂ．Ｅ１Ｂ ｐ５５特異的モノク ローナル抗体（オンコジーン・サイエンス）を用いる、Ａ５４９細胞（レーン１ ）、２９３細胞（レーン２）及びＡ５４９Ｅ１−６８（レーン３）におけるＥ１ Ｂタンパク質の代謝性³⁵Ｓ標識及び免疫沈殿。 図２６．ｐＡｌｂ１２．５ＣＡＴプラスミドの模式図。 このプラスミドは、ｐＢＲＣＡＴプラスミドベクター中に、クロラムフェニコー ルアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）の上流に作動可能に連結するｐ Ａｌｂ１２．５ＣＡＴ １２．５ｋｂヒトアルブミンプロモーター（ＥｃｏＲＩ 乃至ＨｉｎｄＩＩＩ）を含む。近位プロモーター及びエンハンサー領域（Ｅ_1.7 及びＥ₆）が示される。 図２７．ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ＫＳ⁺ベクターへの１２．５ｋｂヒトアルブ ミンプロモーターのクローン化。ＥｃｏＲＩ乃至ＡｖａＩの１０．５ｋｂ断片及 び２．０ｋｂのＡｖａＩ乃至ＨｉｎｄＩＩＩアルブミンプロモーター断片をｐＡ ｌｂ１２．５ＣＡＴから別々に単離し、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ−ＫＳ⁺ベクタ ーのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に同時にライゲートしてＧＴ４０３１を生 成した。 図２８．ＧＴ４０３１へのｈＦＶＩＩＩ発現カセットのクローン化。７．５ｋｂ ヒトＦＶＩＩＩカセットをプラ スミドＧＴ２０５１からＸｈｏＩ及びＳａｌＩを用いて切り出してＧＴ４０３１ のＳａｌＩ部位にライゲートし、ｈＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡに作動可能に連結する ヒトアルブミンプロモーターを含むＧＴ２０５３を得た。 図２９．アルブミンプロモーター−ＦＶＩＩＩミニウイルスプラスミドの構築。 ＧＴ２０３３に由来するアデノウイルス５’ＩＴＲ及びパッケージ化シグナルを 含む断片をＸｈｏＩを用いて切り出し、ＧＴ２０５３のＳａｌＩ部位にクローン 化した。順方向又は逆方向（それぞれＧＴ２０６１及びＧＴ２０５９）のいずれ かのＩＴＲを有するプラスミドを得た。ＧＴ２０６１中のインサートは、ＦＶＩ ＩＩ遺伝子に近接する独自ＳａｌＩ部位と共に配向される。ＧＴ２０５９はＧＴ ２０６１とは反対の方向のＡｄ ＩＴＲを含む。 図３０．ＧＴ２０５３、ＧＴ２０５９及びＧＴ２０６１の制限消化プロフィール 。消化により、ＳａｌＩとの組み合わせでＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＣｌａＩ及び ＸｈｏＩに期待される結合パターンが示される。 図３１．染色体４上のアルブミン／α−胎児タンパク質遺伝子領域の図。この図 は相同組換えのための３’組換えアームとしての機能を果たす３つの領域：１） Ａｌｂ−Ｅ５、アルブミン遺伝子の３’領域；２）ＡＦＰ−３、α−胎児タンパ ク質遺伝子の中央領域；及び３）α−胎児タンパク質のさらに３’、に位置する ＥＢＢ１４を示す。 図３２．クローン化スキーム。異なる３酎鞄ッ組換えアー ムを含む３つのベクター（Ａ、Ｂ、及びＣ）の、それらのアームを（パネルＡ、 Ｂ、及びＣの上に示される）ＧＴ２０６１にクローン化した後の制限酵素マップ 。 図３３．クローン化スキーム。クローンｐＡｌｂ−Ｅ５のヒトアルブミン遺伝子 の３窒U．８Ｋｂ ＸｈｏＩ断片がＧＴ２０６１のＳａｌＩ部位にクローン化さ れているＧＴ２０６３の詳細なクローン化スキーム。このベクターをベースとす るミニウイルスはＦＶＩＩＩ遺伝子の潜在的なイン・ビトロ治療手段である。 図３４．制限酵素マッピング。図９に示される３’相同アルブミン相同組換えア ームを有するアルブミンプロモーター駆動ｈＦＶＩＩＩを含むプラスミドの生成 に用いられたベクターの制限酵素消化を示すアガロースゲル。示される構築体の 各々についてＥｃｏＲＩ及びＣｌａＩ消化が示されている。 図３５．ミニＡｄＦＶＩＩＩウイルスを生成するためのスキーム。ｈＦＶＩＩＩ ミニウイルスを生成するための２つのスキーム（Ａ及びＢ）が示される。スキー ムＡ ：第１日に、ヘルパーウイルスゲノムＤＮＡ及びプラスミドＧＴ２０６３を リン酸カルシウム沈殿により２９３細胞（ＡＴＣＣ♯ＣＲＬ１５７３）に同時形 質移入した。形質移入はリン酸カルシウム沈殿によるものであった。第６日に、 細胞変性効果（ＣＰＥ）を観察し、細胞溶解物を調製した。その後、継代４まで 毎回、感染に続く３日間溶解物を回収し、その時点でウイルス調製物は５倍 に増幅していた。培地は感染後毎日代えた。スキームＢ：プラスミドｐＢＨＧ１ ０をプラスミドＧＴ２０６３と共にリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉ ｎｅ）（ギブコ）を用いて２９３細胞に同時形質移入した。７２時間後に、５ｐ ｆｕ／細胞の多重度でヘルパーＡｄを感染させた。５日後、ＣＰＥを観察し、細 胞溶解物を調製した。その後、等しい接種容積を用いて継代３まで感染させ、そ の時点でウイルスは５倍に増幅し得る。培地は感染後毎日代えた。 図３６．ＦＶＩＩＩを含むミニＡｄベクターの生成。ミニＡｄＦＶＩＩＩベクタ ーを、ミニＡｄプラスミドＧＴ２０６３を２９３細胞に形質移入し、ヘルパーＡ ｄＨβを感染させることにより生成した。細胞変性効果（ＣＰＥ）が完了したと き、それらの細胞及び上清を集めた（継代０）。増殖させるため、数回の凍結／ 解凍サイクルによりウイルスを細胞から抽出し、新鮮な２９３細胞の感染に用い た。各々の継代時に、ＳＤＳ、ＥＤＴＡ、及びプロテイナーゼＫを含む溶液中で のインキュベーション及び続くエタノール沈殿によるウイルスＤＮＡの抽出に７ ４０μｌの上清を用いた。ビリオン溶解工程に先立って、上清をＤＮＡ分解酵素 Ｉ消化に処し、ＧＴ２０６３プラスミドＤＮＡからの汚染を回避した。１／２０ の精製ウイルスＤＮＡ（ｖＤＮＡ）を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＴ）による パッケージ化シグナル配列の増幅における基質として用いた。ＦＶＩＩＩミニＡ ｄ及び ヘルパー増幅領域の予想されるサイズは、それぞれ、１７７及び３１０ｂｐであ った。ＤＮＡサイズマーカー：ギブコ（ゲーサーズバーグ、ＭＤ）製の１Ｋｂラ ダー。さらなるＧＴ２０６３プラスミドを含み、又は含まない、非形質移入２３ ９細胞からの上清を、それぞれ、陰性対照及びＤＮＡ分解酵素Ｉ処理の対照とし て用いた。 図３７．ミニＡｄＦＶＩＩＩベクターの継代０乃至２１に由来するｖＤＮＡのサ ザンブロット分析。ｖＤＮＡは図１４と同様に精製した。１／２の精製ｖＤＮＡ （３７０μｌの上清に相当）をＰｓｔＩで消化し、１％アガロースゲルで分離し てナイロンメンブランにブロットした。ミニＡｄ及びヘルパーの両者に存在する 右（３秩ｊＩＴＲに隣接する配列に対応するプローブをｖＤＮＡの検出に用いた 。検出される断片の予想サイズ：ミニＡｄＦＶＩＩＩ＝３．３Ｋｂ；ＡｄＨβ＝ ２．２Ｋｂ。４つの独立のブロットが示される（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）。マーカー 断片への特異的ハイブリダイゼーションを標準化のために用いた。 図３８．連続継代の全期間にわたる、ミニＡｄＦＶＩＩＩ及びヘルパーにおける 動的変動。このプロットは、図１５に示されるバンドの濃度測定による定量化に よって得た。ヘルパーは方形を伴う明線によって示される；ミニＡｄＦＶＩＩＩ は菱形を伴う暗線によって示される。１単位はＹ軸上で検出される最低量と定義 される（継代１８でのヘルパーｖＤＮＡの量に相当）。他の値はこの 単位に標準化される。 図３９．ＣｓＣｌ勾配遠心によるミニＡｄＦＶＩＩＩ及びＡｄＨβの分離。第１ 勾配からの最下部バンドはビリオンを含んでおり、これらを第２勾配に適用する ことによりさらに分離した。ミニＡｄ（３１ｋｂ）とヘルパー（３７．１ｋｂ） とのサイズが異なることにより分離が可能となり、その結果、サザンブロットに よる測定で、１０：１ ミニＡｄ／ヘルパーウイルス比を有する上部画分及び１ ：１０ ミニＡｄ／ヘルパーウイルス比を有する下部画分が生じた。 図４０．ミニＡｄベクターが形質導入された細胞におけるＦＶＩＩＩの発現。２ ９３細胞をチャンバスライドにおいて成長させ、図１８Ｃに示されるように上部 又は下部画分の希釈した（１／１００）一定分量１μｌで感染させた。感染の２ ４時間後、これらの細胞を固定し、ＦＶＩＩＩ特異的ｍＡｂ（シーダーレーンシ ープ（Ｃｅｄａｒ Ｌａｎｅ Ｓｈｅｅｐ）抗ヒトＦＶＩＩＩＣ、＃ＣＬ２００ ３５Ａ、アキュレート・ケミカル・アンド・サイエンティフィック・コーポレー ション（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ウェストバリー、ＮＹ）、続いて二次抗体（ビオ チン化ロバ抗ヒツジＩｇＧ、ジャクソン・イムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉ ｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）、＃７１３−０６５−１４７）及びＤＡＢ（赤み を帯びた茶色を生じる；シグマ（ＳＩ ＧＭＡ）カタログ番号Ｄ７６７９）で染色した。Ａ．模倣非感染対照２９３細胞 。Ｂ及びＣ．図１８Ｃに示されるような上部画分の２つの独立の調製品での形質 導入（ミニＡｄＦＶＩＩＩ濃縮）。Ｂ及びＣの両者において、１０％の細胞がＦ ＶＩＩＩの発現について陽性に染色された（矢印）。Ｃ．図１８Ｃ（ヘルパーウ イルス濃縮）に示されるような下部画分での形質導入の結果、０．１％の細胞が ＦＶＩＩＩの発現について陽性に染色された。 図４１．ミニＡｄＦＶＩＩＩベクターが形質導入された細胞における機能的ＦＶ ＩＩＩ発現。機能的ＦＶＩＩＩのコーテスト（Ｃｏａｔｅｓｔ）色素生成検定。 上の表はＯＤ読み取り値を示す。試料からの読み取り値を外挿するための等式を 得るため、４０００ｎｇ／ｍｌ乃至６２．５ｎｇ／ｍｌ（列Ａ乃至Ｇ）から３回 （レーン１、２、及び３）作成した標準曲線もプロットする。レーン４、５及び ６は試料から３回得たものである。Ａ：２９３細胞中の一定分量１０μｌのミニ ＡｄＦＶＩＩＩ；Ｂ：２９３細胞中の１μｌのミニＡｄＦＶＩＩＩ；Ｃ：Ｈｅｐ Ｇ２細胞中の１０μｌのミニＡｄＦＶＩＩＩ；Ｄ：ＨｅｐＧ２細胞中の１μｌの ミニＡｄＦＶＩＩＩ。Ｅ：非形質導入２９３細胞からの馴化培地。Ｆ：非形質導 入ＨｅｐＧ２細胞からの馴化培地。 図４２．クローンＧＴ２０７４のマップ。このプラスミドは、プラスミドＧＴ４ ０２０からＳａｌＩ消化によって切り出され、ＧＴ２０７３の独自ＳａｌＩ部位 にクロ ーン化された、［Ｂ−ドメイン欠失ヒトＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡに作動可能に連結 された伸長因子−１（ＥＦ−１；参考文献５２）プロモーターを含む］発現カセ ットを含む。ＴＡＴＡ及びＣＣＡＡＴを含むｐＡＬＢ１２．５におけるＰｍｅＩ 部位の下流の３’近位アルブミンプロモーター領域（３２）が欠失していた。こ の発現カセットはＢ−ドメイン欠失ヒトＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡに連結する伸長因 子Ｉプロモーターを含む。 図４３．ｐＣＭＶ−ｈＦＶＩＩＩのマップ。このプラスミドは、ＧＴ２０７３の ＳａｌＩ部位にクローン化されている完全長ｈＦＶＩＩＩコーディング領域に作 動可能に連結するＣＭＶプロモーターを含む。このサイトメガロウイルスプロモ ーターはｐＣＭＶβ（クローンテック、パロアルト、ＣＡ）から誘導した。 図４４．組み込み頻度及び特異性の試験に用いられるプラスミドの模式図。プラ スミドＧＴ９００３及びＧＴ９００４は両側にＡＡＶ ＩＴＲ配列が隣接するｎ ｅｏ発現カセットを含む；ＧＴ９０１２及びＧＴ９０１３はＡＡＶ ＩＴＲ配列 が隣接するＧＦＰ発現カセットを含む；ＧＴ９００３及びＧＴ９０１２は組み込 みカセットの上流にＲｅｐ７８発現カセットも含む。プラスミドＧＴ９００３を 構築するため、ＡＡＶゲノムの１９３乃至２１２６のＲｅｐ配列をプラスミドｐ ＳＵＢ２０１からＰＣＲ（Ｐｆｕ ｐｏｌ）により増幅し、ｐＣＲＩＩ（インビ トロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＡ）にク ローン化した。得られたプラスミド（ＧＴ９０００）をＮｏｔＩ及びＸｈｏＩで 消化し、ＳＶ４０ポリＡ部位（Ｎｏｔ−ＳａｌＩ）を含む断片をその部位にクロ ーン化した。得られたプラスミド（ＧＴ９００１）をＸｂａＩで消化し、クレノ ウで平滑末端化した。全ＡＡＶゲノムを含むＰｖｕＩＩ−ＰｖｕＩＩ断片をｐＳ ＵＢ２０１から得、ＧＴ９００１の平滑末端化ＸｂａＩ部位にサブクローン化し た。その後、このプラスミド（ＧＴ９００２）をＸｂａＩで開裂させた。これは 、ＡＡＶコーディング配列を除去してＡＡＶ ＩＴＲを残す。次に、ｎｅｏ発現 カセット（ＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ）をＸｂａＩ及びＢａｍＨＩアダプターを用 いてＧＴ９００２にサブクローン化し、プラスミドＧＴ９００３を生成させた。 ＥｃｏＲＩを用いてＧＴ９００３からＲｅｐコーディング配列を除去することに よりプラスミドＧＴ９００４を生成した。ＧＴ９００３及びＧＴ９００４のｎｅ ｏ配列（ＸｂａＩ−ＸｂａＩ）をそれぞれＧＦＰ発現カセット（ＳｐｅＩ−Ｎｈ ｅＩ）で置換することによりプラスミドＧＴ９０１２及びＧＴ９０１３を生成し た。 図４５．組み込み可能な第ＶＩＩＩ因子カセットを含むミニアデノウイルスベク ターの設計。この構築体中に存在する複製及びパッケージ化に必要なミニＡｄ要 素はＡｄ ＩＴＲ及びパッケージ化シグナルである。第ＶＩＩＩ因子カセットは ２つのＡＡＶ ＩＴＲの間に含まれる。Ｒｅｐ発現カセットはこの組み込み可能 なセグメントの 外側に位置する。Ｒｅｐの発現はリプレッサーｔｅｔ−ＫＲＡＢを安定に発現す る細胞系のＴｅｔオペレーターで調節することができる。標的細胞において、Ｒ ｅｐの発現は、ＡＡＶ ＩＴＲが隣接する配列の染色体１９のＡＡＶＳ１部位を 標的とする組み込みをもたらすはずである。 図４６．２９３及びチャン（Ｃｈａｎｇ）肝細胞におけるＲｅｐタンパク質の免 疫沈殿。１０ｃｍペトリ皿においで成長させた細胞に１０ｍｇのプラスミドＧＴ ９００１、ＧＴ９００３、及びＧＴ９００４を形質移入した（プラスミドの構築 に関する詳細は図３１を参照）。非形質移入細胞及びＧＴ９００４形質移入細胞 を陰性対照として用いた。形質移入の２日後、細胞を溶解し、プロテインＧ−ア ガロースに結合させた抗−Ｒｅｐモノクローナル抗体（クローン２２６．７；Ａ ＲＰ、ベルモント、ＭＡ０２１７８）を用いてＲｅｐタンパク質を免疫沈殿させ 、１０％ポリアクリルアミドゲルに流して、免疫沈殿において用いたものと同じ 抗体で免疫ブロットした。タンパク質を化学発光（ＥＬＣキット、アマシャム（ Ａｍｅｒｓｈａｍ））により可視化した。Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質 の移動が示される。 図４７．プラスミドＧＴ９００３又はＧＴ９００４を形質移入した２９３クロー ンのサザンブロット。幾つかのｎｅｏ耐性クローンに加えてｎｅｏ耐性集団（プ ールで示される）からの１５ｍｇのゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩ で消化して電気泳動し、ナイロンメンブラン（ハイボンド−Ｎ（Ｈｙｂｏｎｄ− Ｎ）、アマシャム）にブロットして８ＫｂのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片にわた るＡＡＶＳ１プローブにハイブリダイズさせた。正常なＡＡＶＳ１遺伝子座が示 される（パネルＡ）。幾つかのＧＴ９００３クローンはバンドのずれを示し、こ れはＡＡＶＳ１遺伝子座のうちの１つの破壊に相当する。パネルＢはｎｅｏ配列 に再度ハイブリダイズされた同じメンブランを示す。 図４８．プラスミドＧＴ９０１２又はＧＴ９０１３を形質移入した２９３クロー ンのサザンブロット。条件は図３３に記述される通りである。Ａ）ＡＡＶＳ１サ ザンブロット。プラスミドＧＴ９０１２から誘導されたクローンの幾つかがＡＡ ＶＳ１の再編成を示す。Ｂ）幾つかのブロットをＧＦＰ配列に再度ハイブリダイ ズさせた。 図４９．ＡＡＶＳ１ Ｐ１ゲノムクローンのサザンブロット分析。ＰＣＲ［ＡＡ ＶＳ１ ＰＣＲ（＋）］によってＡＡＶＳ１配列が検出された（Ｐ１クローン６ ５７６、Ｐ１クローン６５７７、Ｐ１クローン６５７８、及びＰ１クローン６５ ７９と呼ばれる）４つのＰ１ゲノムクローンからプラスミドＤＮＡ（１μｇ）を 単離し、ＥｃｏＲＩ（図２３Ａ）又はＥｃｏＲＶと組み合わせたＥｃｏＲＩ（図 ２３Ｂ）で消化し、１％アガロースゲルで電気泳動し、ナイロンメンブラン（ハ イボンドＮ＋、アマシャム）にブロットし、２５３ｂｐのＡＡＶＳＩ ＰＣＲ 産生物をプローブとして用いてハイブリダイズした。Ａ及びＢの両者において、 レーン１はＰ１クローン６５７６を表し、レーン２はＰ１クローン６５７７を表 し、レーン３はＰ１クローン６５７８を表し、且つレーン４はＰ１−クローン６ ５７９を表す。 図５０．ｐＡＡＶＳ１−Ｎｅｏベクターの構築。ＡＡＶＳ１組み込み配列を含む ８．２ｋｂのＥｃｏＲＩ断片をＰ１クローン６５７６から単離し、Ｎｅｏ発現ベ クターｐＧＫｎｅｏのＥｃｏＲＩ部位にライゲートしてｐＡＡＶＳ１−Ｎｅｏを 作製した。 図５１．ヒトＡＡＶＳ１組み込み配列を有するトランスジェニックマウスの生成 。トランスジェニックマウスの生成に関する工程の列が図示される。ＥＳ細胞に ＡＡＶＳ１プラスミドクローンを形質移入して胚盤胞に微量注入した後、それら を仮母に移植した。約１７日後、キメラマウスをＣ５７ＢＬ／６と交雑育種し、 子孫をＡＡＶＳ１導入遺伝子の存在について試験した。陽性子孫の交雑育種を行 い、導入遺伝子がホモ接合している系を生成した。次いで、これらのモデルをア デノ関連ウイルス組み込み系を含むように改変されたミニＡｄベクターのイン・ ビボ送達を試験するのに用い、このベクターＤＮＡの部位特異的組み込みの効率 を評価した。 図５２．ｐＡＡＶＳ１−Ｎｅｏを形質移入した後のＮｅｏ^R ＥＳ細胞クローン のＰＣＲ分析。１７のＮｅｏ^RＥＳ細胞クローン（３．１−３．１７）及び非形 質移入 親ＥＳ細胞から独立に単離されたゲノムＤＮＡをＡＡＶＳ１特異的プライマーＵ ２４９３及びＬ２７２２を用いてＰＣＲによりスクリーニングし、ＡＡＶＳ１配 列を有するＮｅｏ^Rクローンを確認した。これらのＰＣＲ反応試料を以下のよう に１．５％アガロースゲルにのせた：レーン１−１ｋｂＤＮＡサイズマーカー（ ギブコ／ＢＲＬ）；レーン２−ｐＡＡＶＳ１−Ｎｅｏプラスミド対照；レーン３ −非形質移入ＥＳ細胞ＤＮＡ；レーン４乃至２０−１７の個々のｐＡＡＶＳ１Ｎ ｅｏ形質移入Ｎｅｏ^R ＥＳ細胞クローン。 図５３．ＡＡＶＳ１ ＰＣＲ（＋）ＥＳ細胞クローンのサザンブロット分析。２ つのＡＡＶＳ１ ＰＣＲ（＋）ＥＳ細胞クローン（ＥＳ＃４及びＥＳ３．１６） 及び親ＥＳ細胞に由来するゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＶと組み合わせたＥｃｏＲＩ で消化し、０．８％アガロースゲルで電気泳動し、ハイボンドＮ＋ナイロンメン ブランにブロットし、８．２ｋｂのＡＡＶＳ１ブローブとハイブリダイズさせた 。レーン１−ＡＡＶＳ１ ＥＳ＃４；レーン２−ＡＡＶＳ１ ＥＳ＃３．１６； レーン３−親ＥＳ細胞。ＡＡＶＳ１配列全体をＥＳ細胞ゲノムに組み込んだ結果 生じる、予想される断片は、５．２及び３．０ｋｂである。 図５４．ＡＡＶＳ１キメラマウス。ＡＡＶＳ１ ＥＳ＃４細胞を用いる胚盤胞微 量注入実験から得られた２匹の高パーセンテージトランスジェニック（キメラ） マウス。 ＥＳ幹細胞を用いて生成した動物においては、キメラ現象の程度の高さは導入遺 伝子の伝達の可能性の高さと相関する。 図５５．キメラマウスにおいてＡＡＶＳ１導入遺伝子を検出するためのＰＣＲ分 析。ゲノムＤＮＡをＡＡＶＳ１キメラの尾及び、独立に、非キメラ同腹子から単 離し、ＡＡＶＳ１特異的プライマーＵ２４９２及びＬ２７２２を用いてＰＣＲに よりスクリーニングした。ＰＣＲ反応物を以下のように１．５％アガロースゲル にのせた：レーン１−１ｋｇＤＮＡサイズマーカー；レーン２−ｐＡＡＶＳ１− Ｎｅｏプラスミド対照Ｃ；レーン３−非形質移入親ＥＳ細胞ＤＮＡ；レーン４− ＡＡＶＳ１ ＥＳ＃４細胞ＤＮＡ（４）；レーン５−非キメラ同腹子からの尾の ＤＮＡ；レーン６−低パーセンテージキメラ（１０％未満のアグーチコート色） からの尾のＤＮＡ；レーン７−高パーセンテージＡＡＶＳ１キメラ（９０％を上 回るアグーチコート色）からの尾のＤＮＡ。予想ＰＣＲ産生物＝２５３ｂｐ。 図５６．ｈＦＶＩＩＩマウス寛容化ベクターの構築。７．２ｋｂの完全長ｈＦＶ ＩＩＩ遺伝子をＮｏｔＩを用いてＧＴ２０５１から切り出し、ＧＴ２０５７のＮ ｏｔＩ部位にクローン化してＧＴ２０５８におけるｍＡＦＰ−ＦＶＩＩＩカセッ トを生成した。次に、このｍＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩカセットをＡａｔＩＩ及びＳ ａｌＩ断片を用いてＣＧＴ２０５８から切り出し、ｐＧＫＮｅｏのＡａｔ ＩＩ／ＸｈｏＩにクローン化してｍＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ−ｐＧＫＮｅｏ（ＧＴ ２０６２）を生成した。 図５７．ｍＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ−ｐＧＫＮｅｏ ＥＳ細胞クローンのサザンブ ロット分析。非形質移入親ＥＳ細胞及び４つのＮｅｏ^R ＥＳクローンに由来す るゲノムＤＮＡをＸｂａＩで消化し（図２９を参照）、電気泳動し、ブロットし 、完全長ｈＦＶＩＩＩ ＮｏｔＩ断片をプローブとして用いてハイブリダイズさ せた。図に示されるように、ｍＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩカセットの挿入を示す予想 断片サイズは７．８ｋｂであった。 図５８．ｍＡＦＰ−ＥＧＦＰ−１ベクターの構築。ＡＦＰプロモーター／エンハ ンサー領域全体を含む７．５ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ断片をｐＥＧＦＰ−１ ベクター（クローンテック）のＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩにクローン化し、ｐＡＦＰ −ＥＧＦＰ−１を作製した。 図５９．免疫という結果をもたらすことなくｈＦＶＩＩＩのイン・ビボ送達を試 験するためにｈＦＶＩＩＩに対して子宮内で寛容化されたトランスジェニックマ ウスの生成スキーム。トランスジェニックマウスの生成に関する工程の列が図示 される。ａ−胎児タンパク質プロモーターに作動可能に連結するＦＶＩＩＩ ｃ ＤＮＡを含むＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ−Ｎｅｏプラスミドが形質移入されたＥＳ細 胞を胚盤胞に微量注入し、それを仮母に移植する。約１７日後、キメラマウスを Ｃ５７ＢＬ／６マウスと交雑育種し、子孫をＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ導入遺伝 子の存在について試験する。陽性子孫の交雑育種を行い、導入遺伝子がホモ接合 している系を生成した。これらのモデルを、ヒトＦＶＩＩＩ発現カセットを含む ように改変されたミニＡｄベクターのイン・ビボ送達の試験に用いる。 図６０．緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に対して寛容化されたトランスジェニッ クマウスの生成において用いられるＲＩＰ−ＥＧＦＰベクター。ＢＳプラスミド に由来するＲＩＰ−ｐＥＧＦＰの制限酵素マップが示される。このプラスミド（ ４８５５ｂｐ）は、ラットインシュリンプロモーターに作動可能に連結する緑色 蛍光タンパク質（ＧＦＰ）コーディング領域を含む。このインシュリンプロモー ターは、膵臓組織におけるＧＦＰの発現の駆動のためにこの構築体において用い られた。 図６１．ＦＶＩＩＩカセットを含むエピソームミニアデノウイルスベクターの構 造。このミニＡｄベクターは、このウイルスベクターが標的細胞に侵入した後に 、エピソーム維持機構及びＦＶＩＩＩ発現カセットを含む環状プラスミド構造が 形成されるように設計される。このベクターの一般的な構造は以下の成分：（ａ ）組換え発現カセット；（ｂ）複製起点；（ｃ）ヒトＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡ；（ ｄ）リコンビナーゼ標的部位；（ｅ）アデノウイルスＩＴＲ；及び（ｆ）スタフ ァー（Ｓｔｕｆｆｅｒ）ＤＮＡ配列を有する。 図６２．第１バージョンの抗癌性超Ａｄ（ｓｕｐｅｒ− Ａｄ）ベクターの一般的な構造。このウイルスベクターはＡｄヘルパーと癌抑制 及び抗癌性免疫調節のための複数の遺伝子とを含む超−Ａｄからなる。送達のた めに選択された遺伝子が図中に示される。 図６３．第２生成抗癌性超Ａｄベクターの一般的な構造。このウイルスベクター はＡｄヘルパーと癌抑制及び抗癌性免疫調節のための複数の遺伝子とを含む超Ａ ｄ−からなる。その一般的な構造はこれらのベクターの第１バージョンに類似す る。 図６４．ミニＡｄベクター及びヘルパーＡｄベクターの変種。Ａ．ミニＡｄベク ターの考えられる要素。Ｂ。ヘルパーＡｄベクターの考えられる要素。 発明の詳細な説明 本発明の目的は、１）導入遺伝子の発現を制御し、標的細胞ゲノムＤＮＡへの 外来性ＤＮＡの組み込みを助成し、及び／又はベクターを標的細胞内においてエ ピソーム形態で維持するための要素を含んでいてもよい約３７ｋｂまでの異種Ｄ ＮＡを挿入するための収容力を有する大容量アデノウイルス（Ａｄ）ベクター（ “ミニＡｄ”ベクター）；２）このミニＡｄベクターの増殖を支持するように設 計され、且つ宿主産生細胞内でこのミニＡｄベクターがヘルパーＡｄベクターよ りも高い頻度でパッケージ化されるように操作されたパッケージ化シグナルを有 する同族ヘルパーＡｄベクター；及び３）ミニＡｄ ベクター及びヘルパーＡｄベクターの両者の増殖を支持するように設計されたヘ ルパー細胞系であって、ウイルスの増殖の間の導入遺伝子の発現を制御し、且つ ヘルパーＡｄゲノムのパッケージ化を選択的に弱力化するのにも役立ち得るヘル パー細胞系を提供するために、改変されたアデノウイルスベクターを提供するこ とである。 本発明は、ＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡのような治療用遺伝子をイン・ビボで標的組 織に送達することが可能なウイルスベクターの生成に有用な３つの成分を包含す る。これらの成分はヘルパーウイルス、ミニウイルスゲノム、及びヘルパー細胞 系からなる。ヘルパーウイルス及びヘルパー細胞系はミニウイルスゲノムを遺伝 子送達用のウイルス粒子内にパッケージ化するのに用いられる。この系を用いて 生成されるミニウイルスは、ヘルパーウイルスが誘導されたアデノウイルス株と 等しい向性及び宿主範囲を有する。 本発明は、さらに、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）から誘導される要素を含め るためのミニＡｄベクターの改変を提供する。これらの要素は、宿主細胞ゲノム への遺伝物質の組み込みを促進する能力を有するものである。本発明においては 、宿主細胞ゲノムへのミニＡｄベクターのレポーター又はエフェクター遺伝子の 組み込みを促進するのにこれらの要素が用いられる。このようにして、遺伝子の 発現が従来のアデノウイルスベクターよりも長い期間宿主細胞において観察され る。 本発明は、さらに、ミニＡｄベクターであって、このベクターを宿主細胞内で エピソームとして維持して送達される遺伝子（１つ又は複数）の発現を長期化さ せるための要素を含むミニＡｄベクターを提供する。宿主細胞におけるＥ１欠失 ウイルスのウイルスゲノムの制限された複製には、複製が不可能であるゲノムと 比較して関心のある遺伝子がより長期間発現する余地があることが測定されてい る（８８）。アデノウイルスゲノムのＥ２領域を欠失させると、そのＥ２欠失ア デノウイルスベクターからの遺伝子の発現の複製及び持続が減少する。したがっ て、本発明の目的は、標的細胞におけるミニＡｄゲノムのＤＮＡ複製を容易にす る、正常な細胞ゲノムから誘導されるＤＮＡ配列又はそれと等価の配列を本発明 のミニＡｄベクターに組み込むことである。ＤＮＡの複製を容易にするような配 列の１つはアルフォイド（ａｌｐｈｏｉｄ）ＤＮＡである。アルフォイドＤＮＡ 反復の１６．２ｋｂ配列はＤＮＡ複製は可能にするが、そのＤＮＡの人工染色体 としての分離は許容しない。本発明には、この１６．２ｋｂ配列（７０−７２） のミニＡｄベクターへの組み込みの備えがある。したがって、これらの配列を含 むミニＡｄベクターの複製は、標的細胞内でのミニＡｄベクターＤＮＡの持続及 び関心のある遺伝子の発現を長期化させる。 本発明の改変ベクターを評価するための動物モデル試験系も提供される。本発 明によって提供される動物モデ ルには：１）ＡＡＶベースの組み込み機構を評価するためにそのゲノムにＡＡＶ Ｓ１配列が組み込まれているトランスジェニックマウス；及び２）そのゲノムに 挿入されている発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結するヒトＦＶ ＩＩＩ遺伝子を有する非ヒトトランスジェニック動物が含まれる。この第２のモ デルにおいては、発生の過程でのそのトランスジェニック非ヒト動物におけるヒ トＦＶＩＩＩの一時的な発現の結果、その動物のヒトＦＶＩＩＩに対する寛容化 が生じる。この動物のヒトＦＶＩＩＩ遺伝子はひとたびその動物が成熟すると発 現せず、したがって、これらの動物へのヒトＦＶＩＩＩ遺伝子の送達の評価が導 入遺伝子からのｈＦＶＩＩＩの発現により、又はｈＦＶＩＩＩに対する免疫応答 により複雑になることがない。したがって、このようにして、その動物による抗 −ｈＦＶＩＩＩ免疫応答によってもたらされる潜在的な複雑性が加わることなく 、ベクターによる遺伝子送達の効率を評価することができる。 本願においては、他に述べられない限り、用いられる技術は幾つかの公知の参 考文献のいずれかに見出すことができ、これらには：分子クローニング：実験マ ニュアル（Molecular Cloning:A Laboratovy Manual）（Sambrookら，1989，Col d Spring Harbor Laboratory Press）、遺伝子発現技術（Gene Expression Tech nology）（酵素学における方法（Methods in Enzymology），第185巻，D．Goedd el編，1991．Academic Press，San Diego，CA）、 ＰＣＲプロトコル：方法及び適用の手引（PCR Protocols:A Guide to Methods a nd Applications）（Innisら，1990．Academic Press，San Diego，CA）、動物 細胞の培養：基礎技術マニュアル（Culture of Animal Cells:A Manual of Basi c Technique）第２版（R.I．Freshney．1987．Liss，Inc．New York，NY），抗 体：実験マニュアル（Antibodies：A Laboratory Manual）（Harlow及びLane．1 988．Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY）、タンパク質 生成の手引：酵素学における方法（Guide to Protein Purification Methods in Enzymology）第182巻（M.P．Deutscher編，Academic Press，San Diego，CA） 、酵素学における方法（Methods in Enzymology）第225巻（参考文献５７−６０ を参照）及び奇形癌腫及び胚性幹細胞−実用アプローチ（Teratocarcinomas and embryonic stem cells-a practical approach）（Robertson，E.J.編，1987．I RL Press，Washington，D.C．；参考文献６１も参照）。 本願においては、転写調節領域又は転写制御領域は遺伝子の転写の調節に関わ るあらゆる核酸要素として定義され、これにはプロモーター、エンハンサー、サ イレンサー及びリプレッサーが含まれるがこれらに限定されるものではない。 ＤＮＡ断片は、あらゆる源から誘導される一本鎖又は二本鎖ＤＮＡのセグメン トとして定義される。 ＤＮＡ構築体は、あらゆる源から誘導されるプラスミ ド、ウイルス、自立的に複製する配列、ファージ又は一本鎖もしくは二本鎖ＤＮ ＡもしくはＲＮＡの直鎖セグメントとして定義される。 レポーター構築体は、検定可能な産生物をコードする遺伝子を含む染色体下の 精製ＤＮＡ分子として定義される。 検定可能な産生物は、検定を用いて検出可能である遺伝子によってコードされ るあらゆる産生物を含む。さらに、この検定可能な産生物の検出及び定量は、そ の遺伝子の発現の水準に直接比例するものと予想される。 組織特異的な方法で発現する遺伝子は、ある生物において１以上の第２の組織 とは対照的に１つの組織においてより多くの量の発現を示すものである。 エフェクター遺伝子は、その遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現 により、生物、組織又は細胞に効果を及ぼすあらゆる遺伝として定義される。 異種ＤＮＡは、アデノウイルスゲノム以外の源から単離された、アデノウイル ス構築体に導入されるＤＮＡとして定義される。 導入遺伝子は、生物のゲノムに挿入されている、その生物のゲノムに通常存在 するもの以外の遺伝子として定義される。 組換えアデノウイルスベクターは、そのゲノムに少なくとも１つの異種ＤＮＡ のセグメントが含められているアデノウイルスとして定義される。アデノウイルス粒子は、野生型又は組換えの両者を含む感染性アデノウイルス として定義される。アデノウイルスにはアデノウイルスゲノム内にコードされる タンパク質外被によってキャプシドが形成されているＤＮＡ分子が含まれるが、 これに限定されるものではない。 組換えアデノウイルス粒子は、少なくともそのゲノムの一部に少なくとも１つ の他の源から誘導されるものを有し、アデノウイルス遺伝物質はもちろんアデノ ウイルス遺伝物質以外の遺伝物質をも含む感染性アデノウイルスとして定義され る。 安定な遺伝子の発現は、少なくとも７日を上回る期間宿主において一貫して検 出することができる遺伝子の発現として定義される。 治療可能な状態は、ある形態の治療の執行により変更することが可能な生物の 状態として定義され、この治療には通常医療起源のものであると定義される治療 が含まれるがこれに限定されるものではない。 抗原は、抗体が結合し、且つ免疫応答の活性化及び阻止もしくは抑制の両者を 含めて免疫応答を刺激することが可能なあらゆる分子をさらに含むことができる 分子として定義される。 腫瘍抑制遺伝子は、そのタンパク産生物の発現により、腫瘍の発生を抑制する 役目を果たす遺伝子として定義され、この抑制には成長の抑制又は細胞の死の誘 発が含まれるがこれらに限定されるものではない。成長抑制遺伝子は、そのタンパク産生物の発現により、細胞の成長を抑制する 役目を果たす遺伝子として定義される。 癌遺伝子は癌を引き起こす遺伝子として定義される。 免疫調節遺伝子は、その核酸もしくはタンパク産生物の発現により、免疫反応 を変更する役目を果たすあらゆる遺伝子として定義される。 リボザイムは、他の核酸分子を分解する能力を有するＲＮＡ分子として定義さ れる。遺伝的状態は、本願においては、少なくとも部分的には少なくとも１つの特定 の遺伝子の発現の結果である生物の状態として定義され、この特定の遺伝子には その遺伝子の野生型形態及びその遺伝子のあらゆる突然変異体形態が含まれるが それらに限定されるものではない。 発現カセットは、コーディング配列を含むＤＮＡ断片であって、このコーディ ング配列がコードされたタンパク質の適切な細胞型における発現に十分な転写調 節領域又は転写制御領域に作動可能に連結するレポーター又はエフェクターのも のであるＤＮＡ断片である。 １．ミニＡｄベクター系の基本概念 １．系の構成 ミニＡｄベクター系は３つの主要部分：１）パッケージ化弱力 化ヘルパーＡｄ；２）最少量のウイルスゲノムを有する同族Ａｄベクター；及び ３）２９３細胞と同様のＥ１トランス活性化の機能及び／又は ヘルパーＡｄのパッケージ化シグナルの調節をもたらすＡｄヘルパー細胞系から なる。パッケージ化弱力化ヘルパーＡｄは、自己複製に必要されるのはもちろん ミニＡｄベクターの複製のトランス補完にも必要とされるウイルス性遺伝物質を 含む。ヘルパーＡｄは、Ｅ１の欠失又は置換、及びヘルパーＡｄのパッケージ化 を本発明のミニＡｄベクターのパッケージ化に有利に制御又は区別するのに有用 な操作されたパッケージ化シグナルを除いて、野生型のＡｄ遺伝物質を保持する 。このミニＡｄベクターは、逆末端反復（ＩＴＲ）のみを含む最小Ａｄ遺伝物質 、並びにこのミニＡｄベクターの複製及びパッケージ化を促進する役割を果たす シス要素としての野生型パッケージ化シグナルを含む。このミニＡｄベクターの 残部は導入遺伝子、すなわち異種ＤＮＡを含む。本発明のＡｄヘルパー細胞系は 、Ａｄ Ｅ１遺伝子を含み、且つヘルパーＡｄの複製を支持するＡｄ Ｅ１遺伝 子産生物をもたらすという点で２９３細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１５３７）に類似 する。この細胞系は、さらに、ヘルパーＡｄのパッケージ化を弱力化するための 制御機構を含んでいでもよい（図１）。 ２．系の作動機構 Ａｄのパッケージ化タンパク質は感染細胞内に少量存在す るトランス作動性因子であり、Ａｄのパッケージ化において速度制限因子として の役割を果たす。本発明のミニＡｄベクターによって処理された野生型パッケー ジ化シグナルはヘルパーＡｄの操作さ れたパッケージ化シグナルよりも高い親和性でパッケージ化タンパク質によって 認識されるため、ヘルパーＡｄ遺伝物質のパッケージ化はこのミニＡｄベクター の存在下において部分的に、もしくは完全に抑制される。その結果、ミニＡｄベ クターの優先的なパッケージ化が生じる。ミニＡｄベクターを高力価で複製及び パッケージ化するため、ウイルスＤＮＡの複製のためのタンパク質及びキャプシ ド組み立てのためのタンパク質が適度の量でもたらされなければならない。これ らのタンパク質は幾つかの異なる源からもたらすことができ、これらの源には細 胞系又はウイルスが含まれるがそれらに限定されるものではない。本発明の好ま しい態様においては、これらのタンパク質はヘルパーＡｄによってもたらされる 。本発明では、多量のＡｄ構造タンパク質をミニＡｄベクターが利用可能である ように、ヘルパーＡｄがヘルパー細胞内でそれ自体を複製する点において完全に 機能的なままであることが考慮される。ミニＡｄベクターが存在しない状況にお いて、パッケージ化の弱力化の選択圧なしで、徐々に、又は非効率的にではある が、ヘルパーＡｄはパッケージ化される。ミニＡｄベクターの複数のコピーを生 成するため、ミニＡｄベクターＤＮＡの増幅にウイルスＤＮＡ複製タンパク質も 必要である。本発明の好ましい態様においては、これらのタンパク質はヘルパー Ａｄによってもたらされる。野生型パッケージ化シグナルを含むミニＡｄベクタ ーは、感染性複製適格Ａｄ粒 子としてＡｄビリオンにパッケージ化される。対照的に、ヘルパーＡｄ ＤＮＡ は操作されたパッケージ化シグナルに対するパッケージ化タンパク質の乏しい認 識又は低親和性により競合で排除され、そのためヘルパー細胞内で完全に、又は 部分的に遊離したままである。このヘルパーＡｄのパッケージ化の弱力化及びミ ニＡｄベクターのパッケージ化の選択により、本発明の系はミニＡｄベクターの 優先的な増殖を生じる。この系を用いて生成されたミニＡｄベクターは少量のヘ ルパーＡｄで汚染される可能性があり、したがって、このミニＡｄ粒子調製品は １００％純粋ではない可能性がある。必要であれば、汚染されているヘルパーＡ ｄを生物学的、生化学的、又は物理的方法を用いて除去することができ、これら の方法にはＣｓＣｌ勾配を通す超遠心が含まれるがこれに限定されるものではな い。 ３．系の収容力 本発明のミニＡｄベクター系の３つの主な特徴は、それを独 自の、洗練された、現在当業者が利用可能なＡｄベクターより大きく進歩したも のにする（図２）。これらの特徴には以下のものが含まれるがこれらに限定され るものではない：１）このミニＡｄベクターは最小の免疫原性を示す；２）粉の ミニＡｄベクターは現実には複製適格アデノウイルス（ＲＣＡ）を生成すること ができない；及び３）このミニＡｄベクターは従来のＡｄベクターよりも非常に 大きな異種ＤＮＡセグメントを含むことができる。免疫原性及びＲＣＡ生成 の低下（遺伝子治療の分野における主な安全性上の関心）は、このミニＡｄベク ターが最少量のウイルスシス要素（ＩＴＲ及びパッケージ化シグナル）のみを坦 持し、それだけではＡｄタンパク質をコードしないために可能となる。このため 、現在利用可能なＡｄベクターの免疫原性及び細胞毒性の主な源は大部分が除去 されている。したがって、通常宿主細胞内又はその細胞表面上でのＡｄウイルス タンパク質の発現から生じる細胞毒性、炎症性、及び免疫原性応答が減少する。 本発明のミニＡｄベクターは、さらに、従来のＡｄベクターよりも異種ＤＮＡ の収容力が増大している。野生型Ａｄは３６ｋｂの平均ゲノムサイズを有する。 Ａｄの最大パッケージ化収容力はそのゲノムの約１０５％、すなわち、約３８ｋ ｂである。本発明のミニＡｄベクターは１ｋｂ未満のＡｄ遺伝物質を含むことが できる；したがって、このミニＡｄベクターの異種ＤＮＡの収容力は３７ｋｂで あり得る。異種ＤＮＡには導入遺伝子発現カセット、調節要素、又はレポーター もしくはエフェクター遺伝子に作動可能に連結する転写制御領域が含まれ得るが 、これらに限定されるものではない。発現カセットには単一又は複数の発現カセ ットが含まれ得るがこれらに限定されるものではない。調節要素には導入遺伝子 の保持、組み込み、転写、及び／又はベクターターゲティングを制御するための ＤＮＡ配列が含まれるがこれらに限定されるものではない。４．パッケージ化弱力化ヘルパーＡｄ ａ．ヘルパーの原型構造 このヘルパーＡｄベクターは、操作されたパッケー ジ化シグナル及び変更されたＥ１遺伝子を有する野生型Ａｄゲノムを含む。安全 性の理由から、ヘルパーＡｄは現在利用可能なＥ１欠失もしくは置換ウイルス構 築体のように複製が不完全でなければならない。ミニＡｄベクターの存在下にお いてパッケージ化を制御するため、このヘルパーはパッケージ化も不完全でなけ ればならない（以下に詳述）。したがって、このヘルパーの一般構造は、Ｅ１領 域及びパッケージ化シグナルが操作されていることを除いて野生型ゲノムを有す るＡｄベクターとして要約することができる。しかしながら、Ｅ２及びＥ４のよ うな他の必須調節遺伝子を操作することも可能である。ウイルスゲノムは、ヘル パーＡｄの複製適格性をさらに無効とするため、又はＣｓＣｌ勾配を通す超遠心 を含むがこれに限定されるものではない生物学的、生化学的、もしくは物理的方 法を用いてミニＡｄベクターから分離するためにヘルパーＡｄのゲノムサイズを 減少させるため、断片に分割することができる。ヘルパーＡｄの力価が大きな影 響を受けない限り、ヘルパーＡｄのウイルス複製の不全及びパッケージ化の弱力 化の両者をヘルパーＡｄの設計に含めることができる。 ｂ．ヘルパーＡｄの一般的な機能 ヘルパーＡｄの主要機能はミニＡｄベクタ ーのパッケージ化に必要なキャ プシドタンパク質を供給することである。このタンパク質を提供するため、ヘル パーＡｄは、野生型Ａｄより効率が劣るとしても、宿主細胞内で複製可能でなけ ればならない。好ましくは、ヘルパーのゲノムの複製及び転写は影響を受けない 。ヘルパーＡｄゲノムの合成が阻害される場合、後期遺伝子産生物（キャプシド タンパク質）の収量が変化し、ミニＡｄベクターの力価に悪影響を及ぼし得る（ すなわち、力価が低下する）。特定の用途については、ミニＡｄからのヘルパー Ａｄの除去が不必要であることがある。このような状況においては、ヘルパーＡ ｄのパッケージ化弱力化の厳密性は大きく低下し得る。 ｃ．パッケージ化弱力化の設計 ヘルパーＡｄのパッケージ化を弱力化する目 的は、ミニＡｄベクターの調製品におけるヘルパーＡｄ汚染の可能性を減少させ ることである。これは、特定の用途に比較的純粋なミニＡｄベクターのバッチが 必要とされる場合に特に重要である。ヘルパーＡｄのパッケージ化機能は、ミニ Ａｄベクターが存在しない状況においてはヘルパーＡｄが徐々にではあっても増 殖することが可能でなければならないため、不完全ではあるが完全に無効ではな いように設計される。以下の遺伝子操作をパッケージ化弱力化ヘルパーＡｄの生 成に用いることができる。 １．パッケージ化シグナルの突然変異 Ａｄ５パッケージ化シグナルは機能的 に縮退した反復要素を含んでな る（１８）。このパッケージ化シグナル要素を部分的に欠失させることにより、 変異体Ａｄの収量が野生型パッケージ化シグナルを有するＡｄと比較して数倍か ら約１００倍減少することが示されている（１８）。したがって、本発明のパッ ケージ化シグナル突然変異の設計には、野生型Ａｄパッケージ化シグナルからの 共通アデノシン富化モチーフ（例えば、“Ａ反復”：ＴＡＡＡＴＴＴＧ；図３） の部分的欠失を取り込むことができる。 ２．合成パッケージ化シグナル Ａｄ５パッケージ化シグナルが共通Ａ（アデ ノシン）富化モチーフ（例えば、Ａ反復：ＴＡＡＡＴＴＴＧ）を有するため、選 択されたＡ−反復又は人工パッケージ化シグナルに対するパッケージ化タンパク 質の親和性を変更することが可能なあらゆる合成ＤＮＡモチーフを含むがこれら に限定されるものではない直列反復の組み込み。 ３．パッケージ化シグナルの妨害 Ａｄパッケージ化シグナルは、パッケージ 化タンパク質によって認識され、且つそれと結合する特異的ＤＮＡ配列である。 このシグナルへのパッケージ化タンパク質の有効な結合を妨害するため、ヘルパ ーＡｄパッケージ化シグナルのＡ反復列の近位又はその内部に他のＤＮＡ配列を 配置することができる。挿入されたＤＮＡはそれらの同族ＤＮＡ結合タンパク質 による結合を可能にし、この同族ＤＮＡ結合タンパク質はＡｄパッケージ化シグ ナルへのＡｄパッケージ化タンパク質の結合を位置的に競合して排除すること が可能なものである。 ４．パッケージ化シグナルの再配置 野生型Ａｄパッケージ化シグナルは野生 型Ａｄゲノムの左端に位置する。研究者らはこのパッケージ化シグナルが右端に 位置してその機能を保持し得ることを見出しており（７５）、これはパッケージ 化シグナルを再配置することができることを示す。操作されたパッケージ化シグ ナルを野生型以外の位置に配置することは、ヘルパーＡｄのパッケージ化効率を さらに弱力化するのに有用である可能性がある。加えて、Ａｄゲノムの別の領域 へのパッケージ化シグナルの再配置は、ヘルパーＡｄの加工されたパッケージ化 シグナルとミニＡｄベクターの野生型パッケージ化シグナルとの間の相同組換え によるヘルパーＡｄの野生型Ａｄの回帰（すなわち、ＲＣＡの生成）の可能性を 最小にする助けとなり得る。 ５．さらなる可能性 ヘルパーＡｄのパッケージ化を弱力化してミニＡｄベク ターの調製に対するヘルパーの汚染を最小にするため、２つの因子を考慮するこ とができる：シス要素及びトランス作動性因子。したがって、他の可能性のある 設計はこれらの２つの因子のいずれか、もしくは両者の操作を指向する。操作す ることができるシス要素の例はＡ反復モチーフである。操作することができるト ランス作動性因子の例はパッケージ化タンパク質である。その系によるミニＡｄ ベクターの高力価産生量を犠牲にすることなくパッケージ化を制御することが できる機構をさらに考慮すべきである。 ＩＩ．ミニＡｄベクター Ａ．ミニＡｄベクターの基本構造 ＡｄベクターはＡｄ ＩＴＲの融合による 環化プラスミドとして用いることができる（５４）。本発明のミニＡｄベクター の最も単純なプラスミド形態は、（野生型パッケージ化シグナルを有するＡｄ ＩＴＲを含む）ＩＴＲ融合配列、プラスミドＤＮＡ複製起点、及び１つもしくは 複数の制限酵素部位からなるポリクローン化部位を含む環状ＤＮＡ分子である。 ＩＴＲ融合配列は、野生型Ａｄの左端、好ましくはマップ単位０乃至１、及び右 端、好ましくはマップ単位９９乃至１００を含む。Ａｄ ＤＮＡ複製基点は各々 のＩＴＲ内に位置し、野生型パッケージ化シグナルは左ＩＴＲに隣接して位置す る。 Ｂ．ミニＡｄベクターの構造的及び機能的可能性 以下に記載され、且つ図７ Ｂに示されるものを含むがこれらに限定されるものではない他のＤＮＡ配列及び 要素をミニＡｄベクターに含めることができる。 １．導入遺伝子の発現カセット 発現カセットは基本的な転写単位である。所 定の遺伝子の単純な発現カセットは、一般に、転写制御領域、関心のある遺伝子 （すなわち、異種ＤＮＡ、インサートＤＮＡ）、及びポリアデニル化（ポリＡ） シグナルを含む。発現カセット内には、２以上の遺伝子を、これらの遺伝子の間 にＲＮＡの転写 もしくはスプライシングのためのさらなる要素がもたらされている限り、二もし くは多シストロン単位として含めることができる。一般に、ミニＡｄベクターは １つもしくは複数の発現カセットを含む。 ２．ベクターＤＮＡ保持のための機能的要素 標的細胞ゲノムへの発現カセッ トの組み込みを助成し得る（すなわち、ＡＡＶ組み込み要素）又は宿主細胞にお いてミニＡｄベクターをエピソーム形態として維持する要素。組み込みを助成す ることが示されている要素はアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）の逆末端反復（ＩＴ Ｒ）及びＲｅｐ７８／６８タンパク質である。ＡＡＶは、これらの要素を、ヒト 染色体１９（１９ｑ１３．３−ｑｔｅｒ）のＡＡＶＳ１と命名された部位へのそ のゲノムの特異的組み込みを達成するのに用いる。 ＡＡＶは遺伝子治療のための候補ベクターとして考えられているが、幾つかの 制限が研究者によって同定されている。ＡＡＶは：１）外来性ＤＮＡに対する低 収容力（４．３ｋｂ）；２）大規模調製における高力価の達成の困難性；及び３ ）組換えＡＡＶの特異的組換えの喪失により制限される。これらの各々は、当業 者にとって困難な挑戦であることが立証されている。本発明は、ＡＡＶ−ＩＴＲ 配列及びＲｅｐ７８／６８発現カセット（Ｒｅｐ発現カセット）をベクターに組 み込むことにより、ミニＡｄベクターの利点をＡＡＶの組み込み収容力と組み合 わせる。 同様にミニＡｄゲノムに含めることができる機構には染色体外複製配列（７０ ）が含まれる。染色体又はウイルス配列のいずれかを含んでなるこのような配列 は、ベクターが哺乳動物細胞内で効率的に複製し、且つ保持されることを可能に する役割を果たす。これらの配列は、ヒトゲノムＤＮＡのような複製成分及び／ 又は保持成分、例えば、ヒトセントロメア配列もしくはｏｒｉＰ族の反復及び／ 又はＥＢＮＡ−１のようなエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）から誘導され る配列を含むことができる（７０）。ヒトゲノムＤＮＡはテロメア及び／又はア ルフォイドＤＮＡを含むことができる（７０）。このような要素をミニＡｄベク ターに含めることにより、ミニＡｄゲノムが宿主細胞においてより高いコピー数 に複製し、それによりミニＡｄゲノムがヘルパーウイルスより高い効率でパッケ ージ化される可能性が増加する。加えて、これらの配列は、宿主細胞内でのエフ ェクター又はレポーター遺伝子の発現の持続を長期化する役割を果たす。このよ うな機能は遺伝子治療へのミニＡｄベクターの使用において有用である。 ３．ＤＮＡの転写を制御するための調節要素 エンハンサー、リプレッサー、 活性化因子結合部位、イントロン、及び５’もしくは３’非翻訳領域を含むがこ れらに限定されるものではない転写調節機能を有する要素。 ４．ベクター及び導入遺伝子ターゲティングのための要素 ターゲティングは 幾つかの方法で達成することが でき、この方法にはベクター表面修飾及び組織特異的発現が含まれるがこれらに 制限されるものではない。特定の細胞型又は組織における遺伝子の発現を駆動さ せるのに組織特異的プロモーターを用いることができる。 ５．さらなる支持要素 これらには原核細胞もしくは真核細胞のＤＮＡ複製起 点、プラスミドもしくはベクター選択マーカー、及びベクター主鎖が含まれ得る が、これらに限定されるものではない。 Ｃ．ミニＡｄベクターの高力価生成の設計 ミニＡｄベクターの高力価生成は 本発明の別の主要な側面である。他のウイルスベクターを上回るＡｄベクターの 利点の１つは、Ａｄ粒子が高力価調製品保存物の調製に貢献することである（６ ７）。ＡＤの高力価増殖は、主として、感染の間に２９３細胞のような宿主細胞 内に生じる多量のウイルスキャプシドタンパク質及びウイルスゲノムコピーのた めに可能である。以下に記載されるものは、高力価ミニＡｄベクターの生成方法 の設計において考慮することができる因子の幾つかである。 １．増強されたＤＮＡの複製 ＡｄはＤＮＡ複製のためのそれ自体の酵素系を 有する。Ｅ２領域タンパク質がウイルスＤＮＡの複製を生じる主要トランス作動 性要素である。複製起点はウイルスゲノムのいずれかの端部又は両端に位置する シス要素である。ミニＡｄゲノムの複製を支持するため、十分な量のＥ２タンパ ク質がヘルパーウイルスによってもたらされなければならない。ヘル パーウイルスゲノムを適切に設計することにより、（ＡｄのＥ２領域内でコード される）Ｅ２タンパク質の高水準の発現が保証される。ミニＡｄゲノムのコピー 数を増加させるための他のこのような機構を考慮することもできる。このような 機構には、ミニＡｄゲノムにＳＶ４０のＤＮＡ複製起点（５４）を挿入し、ヘル パー細胞におけるＳＶ４０ Ｔ−Ａｇ発現と同時にミニＡｄのコピー数を増加さ せることが含まれるが、これに限定されるものではない。 ２．増強されたパッケージ化シグナル より多数の、又はより効率的なパッケ ージ化配列を、例えば、ミニＡｄゲノムの一端もしくは両端により多数の直列配 列を組み込むことにより、又は野生型パッケージ化シグナルより効率的な様式で 機能する１つもしくは複数の合成パッケージ化シグナルを組み込むことにより用 いることができる。 ３．増強されたパッケージ化プロセス Ａｄのパッケージ化プロセス及び機構 は当業者によって未だに完全に理解されているわけではない。Ａｄのパッケージ 化シグナル以外のＤＮＡ結合タンパク質がパッケージ化に対して相乗的な役割を 有しているかどうかは明確ではない。“パッケージ化の足場”と呼ばれ、且つＡ ｄゲノム内に天然に存在する、ＤＮＡ結合タンパク質が親和性を示す配列をミニ Ａｄベクターに組み込むことができる。 Ｄ．Ａｄヘルパー細胞系 １．Ａｄヘルパー細胞の基本要素及び一般的機能 （宿主細胞としての役割を果たす）本発明の細胞系は、従来用いられる細胞系２ ９３（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１５７３）を改善する幾つかの重要な改変を提供する。 好ましい態様において、宿主細胞は、ヘルパーＡｄゲノムの転写プログラムをト ランス活性化するためのＡｄ−Ｅ１断片をコードする核酸配列を含む（図１）。 現在当業者に利用可能な２９３細胞のＥ１断片とは異なって独自に、本発明の細 胞系はヘルパーＡｄゲノムと重複する核酸配列を持たないＥ１断片をコードする 核酸配列を含むことができる。したがって、本発明は、Ａｄベクターに関連する 現在の困難の１つ：相同組換えによる野生型Ａｄ、すなわち複製適格Ａｄ（ＲＣ Ａ）の生成を排除する。他の要素にはミニＡｄベクターの高コピー数生成の支持 、ミニＡｄベクターのパッケージ化の増強、及び／又はヘルパーＡｄのパッケー ジ化の弱力化に関与する遺伝子が含まれるが、これらに限定されるものではない 。 ２．ヘルパーＡｄのパッケージ化弱力化のための補助機構 ヘルパーＡｄのパ ッケージ化を弱力化する他の方法には、ヘルパーＡｄゲノム内のパッケージ化タ ンパク質結合部位の近傍に異なるタンパク質の結合部位を配置することによりパ ッケージ化タンパク質の結合部位を妨害することが含まれ得る。このような系に はテトラサイクリン−リプレッサー（Ｔｅｔ−Ｒ）、リコンビナーゼ、及び／又 は変更されたパッケージ化タンパク質の使用が 含まれ得るが、これらに限定されるものではない。好ましい態様においては、こ の異なるタンパク質は宿主細胞内で発現する。Ｔｅｔ−Ｒは、Ｔｅｔ−Ｒの結合 部位、ｔｅｔ−オペロン（Ｔｅｔ−Ｏ）を含むヘルパーウイルスの操作されたパ ッケージ化シグナルに結合し、それにより、パッケージ化タンパク質の結合を阻 害することでパッケージ化を抑制することが可能である。Ｔｅｔ−ＲのＴｅｔ− Ｏへの結合はテトラサイクリンによって制御される。細胞培養培地にテトラサイ クリンを添加することによりＴｅｔ−Ｒへのテトラサイクリンの結合が生じ、そ れがｔｅｔ−Ｏに結合することを妨げる。テトラサイクリンを除去することによ りＴｅｔ−Ｒは加工されたパッケージ化シグナルへの結合について自由になり、 ヘルパーウイルスのパッケージ化をさらに弱力化する役割を果たす。 Ｃｒｅ又はＦｌｐのようなリコンビナーゼの発現も、ヘルパーウイルスのパッ ケージ化シグナルにそれぞれｌｏｘ−ｐ又はＦＲＰのような組換え部位が隣接す るのであれば、パッケージ化を阻害することが可能である（６６、６８）。ヘル パーウイルスの複製をさらに弱力化するため、ヘルパーウイルスゲノム内の他の 遺伝的改変を上に記載されるものとは別に、又はそれに加えて提供することもで きる。 幾つかの方法のいずれかによりパッケージ化タンパク質を変更することが可能 であり、これらの方法には、Ａ ｄの特定のパッケージ化タンパク質が同定されるという条件の下でミニＡｄのパ ッケージ化をヘルパーＡｄと区別するのにパッケージ化シグナルが異なる特定の 血清型又は種を用いることが含まれるがこれに限定されるものではない。加えて 、パッケージ化タンパク質は、そのパッケージ化タンパク質をコードする遺伝子 を遺伝的に改変することにより変更することができる。この改変は、そのパッケ ージ化タンパク質を野生型パッケージ化シグナルに対するその結合が増大するよ うに変更するものであってもよい。それにより、その改変されたパッケージ化タ ンパク質はミニＡｄゲノムの好ましいパッケージ化をさらに提供し得る。 ３．ミニＡｄベクターの高力価生成のための補助機構 宿主細胞内でのミニＡＤゲノムのコピー数が増加するように設計されたミニＡ ｄベクターの改変は、高力価ミニＡｄベクターの開発において有用である。宿主 細胞によるＳＶ４０Ｔ−Ａｇ（形質転換活性を持たない変異Ｔ−Ａｇ）の発現は 、ＳＶ４０ ＤＮＡ複製起点がミニＡｄプラスミドベクターに組み込まれている 場合、ミニＡｄゲノムのコピー数を増加させ得る。 ＩＶ．本発明の潜在的な用途 ａ．遺伝病の治療のためのイン・ビボでの遺伝子の送達 大きな治療用遺伝子 又は複数の遺伝はもちろん、制御可能な、もしくは組織特異的な発現を決定し、 且つよ り有効な治療上の効果を生じ得る、主要治療用遺伝子に伴う調節要素及び／又は 他の関連遺伝子の送達に大きな収容力が必要である。例には、嚢胞性線維症の遺 伝子治療の最適化に幾つかの遺伝子の制御可能な発現を必要とする嚢胞性線維症 が含まれるが、これに限定されるものではない。デュシェンヌ型筋ジストロフィ ー（ＤＭＤ）の遺伝子治療が、その治療に大容量ベクターが必要とされる状態の 別の例である。この疾患を治療するには、完全な生理学的効果をもたらして患者 の筋肉機能を回復させるため、筋肉及び神経成長因子を含むがこれらに限定され るものではない遺伝子を同時送達することが必要となり得る。 ｂ．ベクターの腫瘍内注射による宿主の抗癌性免疫の誘発 Ａｄベクターは、 培養腫瘍細胞及びイン・ビボでの異なる型の固形腫瘍モデルにおいて高水準の感 染性を示す。Ａｄベクターのこの特徴は癌の治療において用いられている。治療 の効率はベクターによって送達される遺伝子に依存する。腫瘍抑制及び免疫調節 の機能を併せ持つものを含むがこれに限定されるものではない複数の遺伝子が抗 癌効果の最適化に用いられる。このミニＡｄベクターは複数の遺伝子を送達する 能力を有し、腫瘍内注射のための抗癌性Ａｄベクターの構築に有用である。 ｃ．移植細胞又は組織の遺伝的改変による宿主の免疫の調節 移植には宿主の 免疫の一時的な、又は恒久的な抑制が必要である。移植細胞又は移植組織を含む がこれ らに限定されるものではない細胞又は組織に免疫抑制遺伝子を送達することが、 免疫抑制剤の投与に代わるアプローチであり得る。本発明において用いられる免 疫抑制タンパク質をコードする遺伝子の例には、本発明のミニＡｄベクターによ って単独で、又は組み合わせて送達することが可能なＴＧＦｂ、ＩＬ−１０、ウ イルスタンパク質ＨＳＶ−ＩＣＰ４７及びＣＭＶ−ＵＳ１１、並びに分泌性Ｆａ ｓリガンドタンパク質が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。 ｄ．遺伝的改変によるイン・ビボでの標的細胞機能の改変又は標的細胞の成長 の調節 Ａｄベクターは高力価の貯蔵物を生成することが可能であるという点で 他のウイルスベクターを上回る別の利点を有しており、これはイン・ビボ遺伝子 治療において有用である。ミニＡｄベクターは最少量のＡｄゲノムのシス要素の みを含むため、ミニＡｄの免疫原性は最小化されている。したがって、ミニＡｄ ベクターは、遺伝的改変によるイン・ビボでの標的細胞の機能の改変又は標的細 胞の成長の調節に有用である。 ｅ．ベクターの表面修飾によるイン・ビボでの標的細胞又は組織への導入遺伝 子の特異的送達 アデノウイルスのヘキソン及び腺維タンパク質をコードする遺 伝子を、標的細胞表面上に存在する特定のエピトープ又はリガンド（例えば、Ｉ ｇＧのＦｃ断片に結合するプロテインＡ）と融合するように加工する。これらの 改変遺伝子を、標 的細胞表面に対するターゲティング作用因子として作用するリガンドと相互作用 する表面部位を有するウイルスを生成するため、組換えウイルスゲノムに組み込 む。これにより、生成したウイルス粒子は組織又は細胞認識能を有する。 ｆ．直接イン・ビボアプローチによるＡｄ介在ワクチン接種への使用 ワクチ ン接種の目的に、Ｅ１置換Ａｄベクターの免疫原性は利益をもたらす可能性があ り、Ａｄベースの組換えベクターの開発において用いられている。この型の用途 において用いられるミニＡｄベクターは、Ｅ１置換Ａｄベクターを含むがこれに 限定されるものではないヘルパーウイルスはもちろんのこと、免疫をもたらす抗 原及び免疫源をコードする遺伝子の同時送達を用いる。 ｇ．エキソ・ビボ遺伝子送達への使用 従来のＡｄベクターの使用に関連する 一時的な遺伝子の保持及び発現は、Ａｄがエキソ・ビボ送達プロトコルにおいて 広く用いられることを妨げている。ＤＮＡ保持機構を有するこのミニＡｄベクタ ーはこの目的に有用である。さらに、培養細胞系におけるＡｄの高い感染性が、 このミニＡｄベクターを遺伝子治療に対するエキソ・ビボアプローチにとって非 常に有効な遺伝子送達系にしている。 ｈ．アデノウイルス学の基本的な研究及び開発並びに新規ベクターの構築のた めの手段としての使用 ミニＡｄベクター系それ自体は基本的なアデノウイルス 学の研 究にとって高い価値を有する。その構築と実施可能性及び作動の立証は既に当該 分野における大きな進歩である。このヘルパーＡｄ及びミニＡｄは、Ａｄ及びそ の潜在的な用途を研究するのに好都合の手段を提供する。これはミニＡｄベクタ ーについて特に言えることである。ミニＡｄの複製、パッケージ化、及び増殖効 率の特徴は、従来入手することができなかった重要な新しい情報を備える場を提 供する。 ｉ．遺伝子伝達及び治療の分野における他の方法論と組み合わせての使用 Ａ ｄベクターはポリリジン、リポソーム、及び他の結合物質と共に遺伝子送達複合 体として用いられている。このミニＡｄベクターも、これらの化合物はもちろん のこと、遺伝子送達複合体としての役目を果たす能力を有する他の化合物と共に 用いることができる。 ｊ．遺伝子伝達及び治療の分野における他の目的での使用 このミニＡｄベク ター系は、上に論じられているものに加えて、遺伝子伝達及び治療に用いられる 大きな潜在性を有している。この可能性は遺伝子伝達及び治療の分野のさらなる 開発に沿って理解されるであろう。 ＩＶ．肝臓関連疾患の治療のためのミニＡｄベクター アデノウイルスの静脈内注射の後、９０％を上回るウイルス粒子が肝臓に局在 する。ウイルス粒子の投与の後にアデノウイルス遺伝子又はアデノウイルスベク ターの 導入遺伝子の発現が観察されるのは肝臓においてである。 本発明は、レポーター又はエフェクター遺伝子の発現を駆動することが可能な転 写調節遺伝子、すなわちプロモーターを改変され、且つ大きく改善されたアデノ ウイルスベクターと組み合わせて用いて、遺伝子の発現を肝臓に向けるための方 法論を包含する。当業者は、肝臓における異常な遺伝子又は遺伝子の遺伝子産生 物の発現によって引き起こされる多くの疾患を思い描くことができる。異常な遺 伝子又は遺伝子産生物の発現は肝臓に通常見出されるものを上回り、又は下回る 水準の発現を含むことがあり、それは、遺伝子転写の構造もしくは機能の遺伝子 欠失、複製、挿入、もしくは変化、又は遺伝子それ自体もしくはそのタンパク産 生物のいずれかの他の変更の結果であり得る。また、異常な遺伝子又は遺伝子産 生物の発現は、それぞれ、遺伝子及び遺伝子産生物の転写又は翻訳の上で機構的 に調節する発現の変化からも生じ得る。 治療用又はレポーター遺伝子を肝臓に送達するためのベクターは本発明の重要 な利点を含んでいる。肝臓における遺伝子又はタンパク質のいずれかの発現の欠 陥に基づく多数の疾患の治療に本発明を用いることができることを当業者は理解 するであろう。本発明を用いて治療又は利用することができる疾患及び遺伝子の 例がそれぞれ表1にまとめられている。加えて、これらの遺伝子全てのプロモー ターが、肝臓における遺伝子又は遺伝子産生物 の発現を駆動する目的で肝臓における遺伝子の発現の駆動に有用であることが判 明する。 ^*表１は参考文献５５からのデータ及び情報を含んでなる。 本発明のさらに別の態様は、本発明のミニＡｄベクターを含む医薬組成物を包 含する。この医薬組成物は固体形態（顆粒、粉末又は座剤を含む）又は液体形態 （例えば、溶液、懸濁液、又はエマルジョン）で製造することができる。経口投 与のための固体投与形態にはカプセル、錠剤、ピル、粉末、及び顆粒が含まれ得 る。経口投与のための液体投与形態には、当該技術分野において一般に用いられ る不活性希釈剤、例えば水を含む、薬学的に許容し得るエマルジョン、溶液、懸 濁液、シロップ及びエリキシルが含まれ得る。このような組成物は、湿潤剤、甘 味料、調味料、香料のような添加剤を含んでいてもよい。本発明の化合物は無機 又は有機酸から誘導される塩の形態で用いることができる。 本発明のベクターは単独の活性医薬組成物として投与することができるが、本 発明の１以上のベクター又は他の薬剤と組み合わせて用いることも可能である。 組み合わせとして投与する場合、治療剤は同時に、もしくは異なる時期に投与さ れる別々の組成物として処方することも、単一の組成物として投与することもで きる。 ＩＶ． ＦＶＩＩＩ活性を置換するためのミニＡｄベクター ＦＶＩＩＩ遺伝子を含むＥ１置換アデノウイルスベク ターが宿主動物における治療水準のＦＶＩＩＩの発現の達成に用いられている（ １３）。しかしながら、アデノウイルスベクターを遺伝子治療に用いることを試 みている研究者は幾つかの困難に遭遇している。本発明は、以下に説明されるよ うに、これらの問題の多くの解決法を提供する。 Ａｄ ＤＮＡ複製及びパッケージ化の必須シス作動性要素がウイルスゲノムの 端部に位置するため（ＩＴＲに加えてパッケージ化シグナル、１ｋｂ未満）、ミ ニＡｄベクターの主鎖はこの必須シス要素のみを含むように改変されている。ミ ニＡｄゲノムの残部は、その約３８ｋｂのパッケージ化限界まで、異種ＤＮＡを 含むことが可能である。本発明においては、この異種ＤＮＡはヒトＦＶＩＩＩに 類似する活性を有するタンパク質をコードする核酸配列を含む。ＦＶＩＩＩは通 常肝臓において生成し、発生期ポリペプチドのアミノ末端から誘導される９２ｋ Ｄａ乃至２１０ｋＤａの見かけの分子量範囲を有する重鎖ポリペプチド及び８０ ｋＤａのＣ末端軽鎖を含む（５３）。その活性化形態は、血液凝固カスケードに おいて活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）、負に荷電したリン脂質及びカルシウムイ オンと共に補因子として作用し、第Ｘ因子をその活性化形態、Ｘａに変換する。 ヒトｃＤＮＡは９ｋｂの長さであり、幾つかのドメインをＡｌ、Ａ２、Ｂ、Ａ３ 、Ｃ１及びＣ２の順で含んでなる２３５１アミノ酸のポリペプチドをコードする （５−７）。Ａ 及びＣドメインは機能的活性に重要であり、これに対して約９８０アミノ酸から なるＢドメインの大部分は活性には不必要である（８）。本発明は、ＦＶＩＩＩ 様活性を有するミニＡｄベクターの例として、ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子を含むミニ Ａｄベクターを提供する。ＦＶＩＩＩ様活性（すなわち、第Ｘ因子のその活性化 形態Ｘａへの変換において補因子として作用する能力）を有するタンパク質をコ ードする遺伝物質を含むミニＡｄベクターが本発明に包含されることは当業者に よって理解されるはずである。 本発明のＦＶＩＩＩミニＡｄは、ヒトＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡはもちろんのこと 、宿主細胞ゲノムへの遺伝子の組み込み及び宿主細胞内でのヒトＦＶＩＩＩの発 現を支持するＤＮＡ要素（すなわち、異種組換えアーム、ＡＡＶ／ＩＴＲ配列、 及び転写制御領域）をも含む。ＤＮＡの複製及びＦＶＩＩＩミニＡｄベクターの キャプシド形成に必要なウイルスタンパク質はヘルパーＡｄ（トランス補完）か らトランスでもたらされる。ＦＶＩＩＩミニＡｄベクターの比較的純粋な調製品 をウイルス粒子として生成するため、そのパッケージ化シグナルの改変によりヘ ルパーＡｄゲノムのパッケージ化が弱毒化されている。これは、ヘルパー細胞系 におけるＦＶＩＩＩミニＡｄベクターゲノムの優先的なパッケージ化を斟酌する 。 態様の１つにおいて、このＦＶＩＩＩミニＡｄは部位特異的組み込み機構を含 む。この機構は、ヒト組み込み 配列（ＡＡＶＳ１部位）に標的設定された異種組換え配列又はＡＡＶ／ＩＴＲを 含むことができる。この組み込み機構を試験するためには、ＡＡＶＳ１部位をマ ウスゲノムに移さなければならない。これを伴う方法の１つは、胚幹細胞形質転 換のような遺伝子導入技術を用いることにより、又はＡＡＶＳ１部位を含む導入 遺伝子をマウス単細胞卵子の雄性前核に直接ＤＮＡを注射することにより達成す ることができる（５７−６０）。このような方法論によって開発されたトランス ジェニックマウスをミニＡｄベクターの組み込み効率及び特異性の試験に用いる ことができる。 本発明のさらなる態様は、宿主動物体内で生じ得る潜在的な抗−ヒトＦＶＩＩ Ｉ免疫応答に取り組む。このような免疫応答は、ミニＡｄベクターの利用又はこ のベクターの効率の分析を妨害する可能性がある。ミニＡｄベクターが送達され 、且つマウス体内でのヒトＦＶＩＩＩの発現を駆動するため、処置マウスの免疫 応答がＦＶＩＩＩの発現の持続及び水準の評価を複雑にする可能性がある。これ らの、及び他の理由から、ＦＶＩＩＩ不全トランスジェニックマウスモデルが本 発明によって提供される。ミニＡｄベクターのレポーター又はエフェクター遺伝 子が移入され、その結果そのレポーター又はエフェクター遺伝子の遺伝子産生物 に対して寛容である非ヒトトランスジェニック動物を本発明が包含することは理 解されるであろう。 上述のトランスジェニックマウスの各々の例が本発明によって提供され、これ らは遺伝的に改変された胚幹（ＥＳ）細胞の微量注入により生成される。本発明 の一態様においては、一時的な遺伝子の発現を可能とするために発生的に調節さ れたシス作動性制御要素に作動可能に連結する二本鎖ヒトＦＶＩＩＩ ＤＮＡが 組み込まれている非ヒトトランスジェニック動物が提供される。プロモーターは 、発生の間の一時的なヒトＦＶＩＩＩ遺伝子の発現をその発現した外来性タンパ ク質に対する寛容化が生じるように方向付けることが可能な発生的に調節された あらゆる遺伝子単位から誘導することができる。その動物の寛容化及び成熟の後 には、そのＦＶＩＩＩ導入遺伝子はもはや発現しない。本発明においては、α− 胎児タンパク質プロモーターがヒトＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡに作動可能に連結され 、そのゲノム内にヒトＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡを有するトランスジェニックマウス の生成に用いられた。このようなマウスは発生的に調節された様式でｈＦＶＩＩ Ｉを発現し、そのようなものとしてヒトＦＶＩＩＩに対して寛容化される。別の モデルには、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子治療ベクターの部位特異的組 み込みの標的である二本鎖ＡＡＶＳ１配列を有するトランスジェニック動物が含 まれる。ヒト第ＦＶＩＩＩ因子寛容血友病動物モデルを作製するため、このヒト ＦＶＩＩＩ及びＡＡＶＳ１トランスジェニック動物を飼育して血友病動物とする ことができる。 以下の例は本発明の特定の熊様を説明するものであり、本明細書及び請求の範 囲をいかなる意味においても限定するものではない。 ＩＶ．実施例実施例１： パッケージ化シグナル変異ヘルパーＡｄ、及び緑色蛍光タンパク質（ ＧＦＰ）レポーター遺伝子を坦持するミニＡｄベクターの構築及び特徴付け １．１ パッケージ化シグナル変異ヘルパーＡｄの生成 Ａｄ５のパッケージ化シグナル欠失変異体の幾つかが記述されている（９０） 。変異体ｄｌ１０／２８（ｄｌ３０９−１９４／２４３：２７４／３５８とも記 述される）はＡｄ５のｎｔ１９４乃至２４３及び２７４乃至３５８が欠失してい る。ｄｌ１０／２８ウイルスは、Ｓｔｏｗの方法（８９）により、Ａｄ５の左端 含むプラスミドをこの二重変異体（ｐＥ１Ａ−１０／２８）及びＡｄ５ゲノムの 残部とライゲートすることにより生成した（９０）。ｄ１１０／２８は単一のウ イルス感染におけるウイルスの収量で１４３倍の低下を示し、野生型ウイルスと 同時感染した場合には検出されなかった。我々は、ｄｌ１０／２８と同じ突然変 異を有するヘルパーウイルスに関して、低収量であってもそのウイルスを増幅す ることが可能であり、且つ野生型パッケージ化シグナルを含むミニウイルスベク ターの存在下においてそのヘルパ ーウイルスは未包被のままであるはずだと結論付けた。 このパッケージ化シグナルをＰＣＲによりｐＥ１Ａ−１０／２８から下記プラ イマーを用いて増幅した。 Ｒ７：５’−ＧＧＡＡＣＡＣＡＴＧＴＡＡＧＣＧＡＣＧＧ （Ａｄ５のｎｔ１３７乃至１６３、ＡｆｌＩＩＩ部位には下線が付されている ）及び Ｒ８：５’−ＣＣＡＴＣＧＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＡＡＣＧＣＣＡＡＣＴＴＴＧ ＡＣＣＣＧ （ｎｔ４４９乃至４２１、ＣｌａＩ部位が結合している） 増幅した１３３ｂｐの断片をＡｆｌＩＩＩ及びＣｌａＩで切断し、シャトルベク ターＧＴ４００４の対応する配列の置換に用いた（この構築スキームについては 図4を参照）。ＧＴ４００４はＡｄ５の左領域をＸｈｏＩ部位（ｎｔ５７９２、 １６ｍｕ）からＳｎａＢＩ部位（ｎｔ１０３０７、２８ｍｕ）まで伸長すること によりｐＸＣＸ２（９１）から誘導され、したがって、ＧＴ４００４はＡｄ５の 左端を０．３８ｍｕのＡｆｌＩＩＩ部位を含めて０ｍｕから１．２ｍｕまで、Ｅ １欠失をこの欠失点内のＣｌａＩを含めて１．２ｍｕから９．２ｍｕまで、及び Ａｄ５の左アームの残部を２８ｍｕまで含む。この伸長された左アームは組換え ウイルスの生成に用いられる相同組換えの頻度を高める。野生型パッケージ化シ グナルが欠失したもので置換されているＧＴ４００４はＧ Ｔ５０００と命名された。ｐＴｋβ（クローンテック、Ｃａ）に由来するβ−ｇ ａｌ発現カセットをＳａｌＩ断片として切断し、クレノウ酵素で平滑末端化して 、ＧＴ５０００の平滑末端化ＣｌａＩ部位に挿入した。したがって、得られたプ ラスミドＧＴ５００１は二重欠失パッケージ化シグナル及びＴｋプロモーターに よって駆動されるβ−ｇａｌ遺伝子で置換されたＥ１領域を含む（図４）。この 構築体では、Ｘ−ｇａｌ染色によるヘルパーウイルスの検出が斟酌される。 ヘルパーウイルスを生成するのに、Ｇｒａｈａｍ及びＰｒｅｖｅｃによって記 述される方法を用いた（９１）（図５）。ＡＴＣＣから入手した２９３細胞の早 期継代をＭＥＭ−１０％ウマ血清において成長させ、６０ｍｍプレートに播種し た。３０％集密で、ＣａＰＯ₄により、プレート当たり２ｍｇのＧＴ５００１及 び４ｍｇのｐＪＭ１７（９１）を用いて細胞に同時形質移入した。同時形質移入 の３日後、細胞を０．５％アガロースを含む培地で覆い、その後そのオーバーレ イ上の培地を毎日代えた。プラークが視認されるようになったら、Ｘ−ｇａｌ（ ＤＭＳＯ中４０ｍｇ／ｍｌ）を１００ｍｇ／ｍｌまで培地に直接添加し、一晩イ ンキュベートした。所望のヘルパーウイルスを生成するプラークを青色で識別し た（図６）。青色プラークを採取し、そのアガロースプラグを１ｍｌＭＥＭ−１ ０％ＦＢＳに再懸濁した。この培地の３７０ｍｌをパッケージ化シグナルのＰＣ Ｒ増幅の ために以下のように処理した：４０ｍｌの１０ＸＤＮＡ分解酵素Ｉバッファ（４ ００ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．５、６０ｍＭ Ｃｌ₂Ｍｇ、２０ｍＭ Ｃｌ₂ Ｃａ）（この処理の対照として０．５ｍｇのシャトルベクターを収容する管を用 いた）及び１ｍｌのＤＮＡ分解酵素Ｉ（ベーリンガーＭ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍ）、１０ｕ／ｍｌ）を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。ＤＮＡ 分解酵素Ｉを不活性化し、３２ｍｌ ＥＤＴＡ（０．２５Ｍ）、ＥＧＴＡ（０． ２５Ｍ）、１０ｍｌ ＳＤＳ（２０％）、５ｍｌプロテイナーゼＫ（１６ｍｇ／ ｍｌ）を添加することによりウイルスのキャプシドを開裂させ、５６℃で２時間 インキュベートした。フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（１： １：１／２４）で１回抽出した後、１ｍｌの酵母ｔＲＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）を 添加してウイルスＤＮＡの調製を助成し、これを微量遠心において１２０００ｒ ｐｍで遠心することに集めて２０ｍｌのＨ₂Ｏに再懸濁した。５ｍｌを、プライ マーＲ７及びＲ８を用いるＰＣＲ反応に用いた。 所望の欠失パッケージ化シグナルを含む青色プラークの１つをＤＭＥＭ−１０ ％ＦＢＳ中で成長する２９３細胞においてさらに増幅させた。以下、Ａｄヘルパ ー−βｇａｌ又はＡｄＨβと命名する（図５を参照）。このウイルスを、感染後 ４８時間で、集めた細胞の８００ｇで５分間の遠心並びに細胞ペレットの３回の 急速冷凍及び 解凍サイクルにより抽出した。このＸ細胞からの粗製抽出物を３Ｘ細胞の感染に 用いた（増幅スケールは、野生型パッケージ化シグナルを有するウイルスの１対 ２０とは対照的に１対３であった）（図６）。継代毎に、上清のＰＣＲによりパ ッケージ化シグナルの欠失サイズを検証した（図７）。この欠失及びβ−ｇａｌ の発現は分析した継代の全てにおいて安定であった。継代９で、ＡｄＨβをＣｓ Ｃｌにより精製した。精製は、凍結−解凍サイクルを３回行い、その溶解物を０ ．５ｍｌ ＣｓＣｌ １．５ｍｇ／ｍｌ＋２．５ｍｌ ＣｓＣｌ １．３５ｍｇ ／ｍｌ＋２．５ｍｌ ＣｓＣｌ １．２５ｍｇ／ｍｌの段階的勾配に積層し、Ｓ Ｗ４１ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ローターにおいて１０℃、３５０００ｒｐ ｍで１時間遠心することにより行った。集めたウイルスバンドをＣｓＣｌ １． ３５ｍｇ／ｍｌと混合し、前と同様に１８時間遠心した。このウイルスバンドを ＰＢＳに対して２回、ＰＢＳ−１０％グリセロールに対して１回透析し、−８０ ℃で保存した。第２勾配の後に５つの異なるバンドが見られ、それらの全てを別 々に精製した。精製したウイルスから、ＥＤＴＡ／ＳＤＳ／プロテイナーゼＫ処 理、フェノール／クロロホルム抽出、及びエタノール沈殿（ＰＣＲについて上述 されるものと同じ条件）によりウイルスＤＮＡを抽出した。臭化エチジウムゲル においては上部３つのバンドにはＤＮＡが検出されず、それらは大部分が空のキ ャプシドであると考えられる。 下部の２つのバンドはウイルスＤＮＡを含み、したがって、完全なキャプシドで あり、これは制限マップ分析によりＡｄＨβと一致することが示された。Ｒ７＋ Ｒ８オリゴを用いるＰＣＲにより欠失パッケージ化シグナルが全てのバンドから 増幅され、これは、ウイルスが所望の弱力化を備えることを示す。溶液中のウイ ルスのミリリットル当たりのプラーク形成単位（ＰＦＵ）の数で表される力価を 決定するため、ウイルス含有溶液をＤ−ＭＥＭ１０％ＦＢＳで連続的に希釈し（ １：１０希釈で１０^-12まで）、９０％集密の２９３細胞（６ウェルプレート内 に０．５ｍｌ／ウェル）の感染に用いた。３７℃で１時間感染させた後、ウイル ス懸濁液を新鮮な培地で置き換えた。翌日、細胞を０．５％アガロース、０．０ ２５％酵母抽出物及び５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４を含む培地で覆った。６ 乃至１０日後、プラークをカウントした。ＡｄＨβの増幅及び精製の後に得られ た力価は約１０⁹ＰＦＵ／ｍｌ（ウイルスを１５０ｍｍ²のプレート２枚から精製 し、再懸濁して最終容積１ｍｌとした）であった。この力価は、ｗｔパッケージ 化シグナルを含む類似のウイルスベクターを用いて得られるものより約１００Ｘ 低い。 １．２ ミニウイルスベクター用のプラスミドの構築 直鎖アデノウイルスＤＮＡは、その末端ＩＴＲによって頭部と尾部とが共有結 合で環化した場合、細菌内でプラスミドとして成長することが可能であるが、許 容的ヒ ト細胞に移入された場合に複製してウイルスを精製することが示されている（９ ２）。機能的接合は、感染細胞から抽出された環状ＤＮＡを用いて細菌を形質転 換することにより自然に選択されている。接合部には小さな欠失が観察されてお り、それは、おそらく、アデノウイルスＤＮＡのＩＴＲの頭部と尾部との融合の 結果生じた完全な回文構造を破壊することによりそのプラスミドに安定性を付与 している。したがって、基本的なミニウイルスの構造はＡｄ５の右端（少なくと も１０３ｎｔ−ＩＴＲを含む）に融合したＡｄ５の左端（１０３ｎｔ−ＩＴＲ及 びパッケージ化シグナルをｎｔ３５８まで含む）を含むプラスミドである。ミニ ウイルスベクター系の試験に用いられた初期のアプローチには、機能的ＩＴＲ融 合を含むプラスミドｐＪＭ１７において漸進性欠失を生成することが含まれてい た。ｐＪＭ１７は、Ａｄ５のゲノム全体をＩＴＲ配列で環化したＤＮＡ分子とし て、及び（細菌複製起点並びにアンピシリン及びテトラサイクリン耐性遺伝子を もたらす）Ｅ１Ａに挿入されたｐＢＲ３２２誘導体ｐＢＲＸを含むプラスミドで ある（９３）。Ｅ１Ａの欠陥を補完する２９３細胞内に形質移入されると、ｐＪ Ｍ１７は複製するが、アデノウイルスキャプシド（最大は３８ｋｂ）内にパッケ ージ化するには大きすぎる（４０．３ｋｂ）ためパッケージ化はされない。 本発明のものに加えて現在の文献示される様々なミニウイルスベクターの例が 図５に示されている。ｐＪＭ１ ７をＡｓｃＩで切断し、再ライゲートしてｐＢＲＸ−ＡｓｃＩを得た。これによ りＡｄ５のｍｕ４３．５乃至７０．２が除去され、これはＥ２Ａ（ＤＮＡ結合タ ンパク質）及びＬ３（ヘキソン、ヘキソン関連タンパク質及び２３Ｋプロテアー ゼ）を完全に欠失させ、且つＬ２（ペントン基部及び核タンパク質）及びＬ４（ ヘキソン関連タンパク質、ヘキソン−三量体足場タンパク質、及び３３Ｋタンパ ク質）を部分的に欠失させる。この欠失は環状ウイルスＤＮＡから複製及びキャ プシド形成を抑止し、それを十分な量の必要とされる複製タンパク質をトランス 作動的に提供するヘルパーウイルスに完全に依存性にする。ｐＢＲＸ−ＡｓｃＩ は７５．２ｍｕ（Ｌ４）に独自ＳｐｅＩ部位を含み、Ｍ３２（３２ｋＢのミニウ イルス）を得るため、そこに緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現カセットを含む ２．７ｋｂのＤＮＡ断片が挿入された。このＧＦＰカセットは、ＣＭＶエンハン サー／β−アクチンプロモーター（ＣＡプロモーター）、エクオレア・ビクトリ アＧＦＰ ｃＤＮＡ、及びＳＶ４０ポリＡシグナルを含んでなる。ミニウイルス ベクター構築体におけるＧＦＰの使用は、細胞におけるこのベクターの存在を蛍 光顕微鏡法を用いて測定するために用いた。蛍光顕微鏡法は、ＧＦＰを発現する 細胞の検出に用いることができるフローサイトメトリーを含むがこれに限定され るものではない幾つかの方法のうちの１つを代表する。ＡｄＨβの存在はＸ−ｇ ａｌ染色の青色によって検出す ることができる。Ｍ３１を生成するため、Ｍ３２をＭｌｕＩで切断して再ライゲ ートした。これにより３１．４乃至３４．５ｍｕが除去され、これはＬ１（５２ Ｋ、５５Ｋ及びペントン関連タンパク質）を部分的に欠失させた。Ｍ２８を生成 するため、Ｍ３２をＭｌｕＩ及びＡｓｃｌで切断して再ライゲートした。これに より３１．４乃至４３．５ｍｕが除去され、これはＭ３２に依然として残留して いたＬ１及びＬ２タンパク質を完全に欠失させた。Ｍ２６を生成するため、Ｍ２ ８をＲｓｒＩＩ及びＳｐｅＩで切断して再ライゲートした。これにより３０．９ 乃至７５．２ｍｕが除去され、これはＬ１及びＬ４の欠失に及んだ。Ｍ２３を生 成するため、Ｍ３２をＮｓｉＩで消化して再ライゲートした。ＧＦＰカセットを 含む、３２．２ｍｕ乃至ＣＡプロモーターのＮｓｉＩ断片（７５．２ｍｕでの融 合の次のＮｓｉＩ部位を含む）は再ライゲートされ、その結果、ＣＡプロモータ ーのＮｓｉＩ部位は５．５ｍｕにライゲートされ、３２．２のＮｓｉＩ部位は７ ５．３ｍｕでライゲートされた。これは、Ｅ２ｂ（末端タンパク質、ＤＮＡポリ メラーゼ）及びＩＶａ２タンパク質を含む５．５乃至７５．３ｍｕの全てのタン パク質の発現を抑止する。Ｍ２０を生成するため、Ｍ２３をＭｌｕＩ及びＡｓｃ Ｉで切断し（これは、Ｍ２３のＮｓｉＩ断片の３４．５乃至４３．５ｍｕの領域 を除去する）、再ライゲートした。 ｐＪＭ１７におけるものような環化完全長ウイルスゲ ノムの切り落としの代わりに、ＩＴＲ配列及びパッケージ化シグナルを含む、複 製及びパッケージ化に必要な最小シス要素をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタ ジーン）のような小プラスミドにサブクローン化し、導入遺伝子カセット及びそ のウイルスベクターの治療上の潜在性を改善し得る他の要素、例えば、エピソー ム維持もしくは染色体組み込みのための要素を漸進的に加えることにより他のミ ニウイルスベクターを構築した（図８、最下部）。頭部と尾部とが融合したＩＴ Ｒ及び左ＩＴＲの次のパッケージ化シグナル（ＩＴＲ／ＩＴＲ＋ｐａｃ）をＥｃ ｏ４７Ｉ１Ｉ（９８．７ｍｕ）及びＰｖｕＩＩ（１．２６ｍｕ）を用いてｐＢＲ Ｘ−ＡｓｃＩから切断し、平滑末端化して、それぞれｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔの ＳｍａＩ−ＥｃｏＲＶにサブクローン化した。得られたプラスミドｐＢＳ／ミニ ＩＴＲ、すなわちＧＴ４００７は、発現カセットを含まず、且つＩＴＲ／ＩＴＲ ＋ｐａｃに隣接する幾つかの独自制限部位を有する３．８ミニウイルスプラスミ ドである。ＸｈｏＩ及びＫｐｎＩを用いて、上述のＧＦＰ発現カセットをｐＢＳ ／ミニＩＴＲにサブクローン化してＭ６．５を生成した。次に、内部リボソーム エントリ部位（ＩＲＥＳ）及びネオマイシン（ｎｅｏ）ｃＤＮＡをＣＡプロモー ターとＧＦＰ遺伝子との間にサブクローン化してＭ７．０を生成した。２つの別 々のカセットにｎｅｏ及びＧＦＰを含む類似のミニウイルスＭ８．５を生成した ；Ｔｋプロモーター、ｎｅｏ ｃＤＮ Ａ及びＴｋ ｐＡを含むｐＲＥＰ９（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） ）に由来するＮｒｕＩ−ＢｓｔＥＩＩ断片を平滑末端化し、Ｍ６．５のＳｔｕＩ −ＥｃｏＲＩにサブクローン化した。アデノウイルスゲノムを外来性ＤＮＡで完 全に置換したミニＡｄベクターのパッケージ化を試験するため、より大きなミニ Ａｄプラスミドの構築にＭ８．５を用いた。インサートとして、アルブミン遺伝 子の３’、半分及びα−胎児タンパク質遺伝子の５’、半分に相当するゲノム断 片を用いた。これらの断片は、潜在的なアームとして、この部位での相同組換え を研究する見込みで選択した。これらの断片は、Ｍ８.５の二重ＧＦＰ／ｎｅｏ 発現カセットの上流及び下流に挿入した。したがって、得られた構築体において は、ｐＧｎＥ５Ｅ３（２３．８Ｋｂ）、ＧＦＰ及びｎｅｏ導入遺伝子がそのヒト ゲノム内に存在する対応１０Ｋｂアルブミン−ａ−胎児タンパク質遺伝子間領域 を置換する。図９は上述のプラスミドを用いて得られるミニウイルスの構造を示 す。 １．３ ミニＡｄＧＦＰベクターの生成及び増幅 様々なミニＡｄプラスミドの複製及びパッケージ化を支持するのにＡｄＨβを 用いた。ミニウイルスがパッケージ化可能であったかどうかを決定することが重 要であった。また、ミニウイルスのサイズがパッケージ化効率に影響を及ぼすか どうかを決定することも重要であった。 アデノウイルスにおいては、１００％野生型長のＤＮ Ａが最も効率的にパッケージ化され、ゲノムサイズが最大で１０５％まで増加し 、又は１００％未満に減少するに従いパッケージ化の効率が低下した。野生型ア デノウイルスを欠陥ミニウイルスの補完に用いた場合、６９％（２５ｋｂ）とい うより低い限界が示唆されている（９４）が、弱力化ヘルパーウイルスを用いる ことにより、より短いミニウイルスのパッケージ化が可能であった。 本発明のミニウイルスを補完するため、各々同様の効率で作用する２つの方法 を用いた（図１０）。第１の方法においては、ＣｓＣｌ精製ミニウイルスプラス ミドを精製ＡｄＨβから抽出した直鎖ウイルスＤＮＡと共に同時形質移入した。 このウイルスＤＮＡの精製に用いられた方法は、複製の初回刺激の原因である末 端タンパク質を破壊するＳＤＳ及びプロテイナーゼＫに処されることに注意され たい。この方法は、同様に末端タンパク質を欠くミニウイルスプラスミドを上回 る複製の利点をヘルパー−ウイルスに付与することを回避するために用いた。し たがって、ＡｄＨβでの直接感染による補完がミニウイルスを救済することはな かった。同時形質移入は、５０％集密の２９３細胞で、６ウェルプレートのウェ ル当たりＣａ₂ＰＯ₄及び２ｍｇのミニウイルスプラスミド及び１ｍｇのウイルス ＤＮＡを用いて行った。この形質移入混合物中で一晩インキュベートした後、培 地を代え、蛍光顕微鏡法を用いて細胞を検査することにより形質移入の効率を評 価した。ＣｓＣｌ精製プラスミドで、この 効率はプラスミドのサイズに関わりなく１００％に達した（図１１）。同時形質 移入の６日後にＣＰＥが観察され、３回の凍結及び解凍サイクルによりウイルス を細胞から回収した。第２の補完方法においては、ミニウイルスプラスミドをｐ ＢＨＧ１０、パッケージ化シグナルが完全に欠失しているためにパッケージ化が 不可能であるｐＪＭ１７に類似する環化アデノウイルスプラスミド（９５）、と 共に同時形質移入した。このプラスミドは、複製に必要な早期タンパク質の全て に加えてキャプシドを形成する後期タンパク質をも生成する。ミニウイルスがｐ ＢＨＧ１０と同じ細胞内に存在する場合、それもまた複製し、且つ、ミニウイル スが野生型パッケージ化シグナルを含むため、ミニウイルスベクターがキャプシ ドに包まれる主要核酸である。しかしながら、ミニウイルスが隣接細胞に放出さ れる場合、欠陥を有するために増幅しない。したがって、このミニウイルスを増 幅させるため、同時感染の３日後、その細胞単層に１０プラーク形成単位（ｐｆ ｕ）／細胞の感染多重度（ｍｏｉ）でＡｄＨβを感染させた。同時形質移入の３ 日後にＣＰＥが観察され、３回の凍結及び解凍サイクルによりウイルスを回収し た。 補完の方法に関わりなく、その溶解物（生成ミニウイルスの継代０）を用いて ９０％集密２９３細胞の新鮮な単層に（１対３の増幅スケールを用いて）感染さ せた。感染後の当日、ミニウイルスの存在を蛍光により観察し、 ヘルパーの存在をＸ−ｇａｌ染色により確認した。どのようなものであっても溶 解物中にヘルパーウイルスが存在した場合には、それらの細胞のさらなるインキ ュベーションによりミニウイルス＋ヘルパー混合物の増幅がＣＰＥの出現を伴っ て導かれた（この単層の新たな溶解物はミニウイルスの継代１と考えられる）。 溶解物中にヘルパーが存在しない場合には、ミニウイルス単独ではパッケージ化 せず、新たなヘルパーを添加することによってのみＣＰＥが出現した。したがっ て、ヘルパーの存在をＸ−ｇａｌ染色により、及びより高い感度でＣＰＥの出現 により評価した。 ミニウイルス構築体（Ｍ３２、Ｍ３１、Ｍ２８、Ｍ２６、Ｍ２３、及びＭ２０ ）の各々を用いて別々に形質移入した後、ＧＦＰを含むプラークの出現を観察し た（図１２）。これにより、試験したプラスミドの各々について補完が可能であ ったことが示された。新鮮な２９３細胞単層に各々のウイルスの粗製抽出物を感 染させた２日後にＣＰＥが観察され、これはヘルパーウイルスの存在を示した。 さらなるミニウイルスの継代の結果は、全ての継代において５倍の増幅が生じ、 パッケージ化効率がミニウイルスのサイズに比例することを示した（図１３）。 ベクターサイズが３ｋｂ減少する毎に効率が２倍低下することが観察された。例 えば、Ｍ２０のパッケージ化効率は野生型（（３６−ｘｋｂ）／３＝ｎ、効率は ０．５ⁿである）の２．４８％である。しかしながら、Ｍ６．５、 Ｍ７．９及びＭ８．５では蛍光プラークは見出されず、これは非常に非能率的な パッケージ化、又はパッケージ化が存在しないことを示した（図１３）。これは 、８．５Ｋｂ乃至２０Ｋｂのどこかに存在するパッケージ化下限を反映している 可能性があった。しかしながら、これらの限界の間でもパッケージ化は依然とし て生じているが、観察された線形の減少によると、１１．５Ｋｂのサイズの差が ７．６倍のパッケージ化効率の低下を生じ、それにより増殖が不可能になり得る というのがより確からしいように思われる。 外来ＤＮＡによるウイルスゲノムの完全な置換が可能であり、これがパッケー ジ化効率に影響を及ぼすかどうかを試験した。Ａｄ５のＩＴＲ及びパッケージ化 シグナルのみを含む２３．８Ｋｂの完全に置換されたミニＡｄを構築した。外来 性ＤＮＡとして、一方がＧＦＰで他方がネオマイシンのものである２つの直列の 発現カセットにアルブミン ａ−胎児タンパク質ゲノムＤＮＡの２つの長アーム を隣接させた（図９）。ＡｄＨｂ ｖＤＮＡで最初に補完した後に得られたウイ ルスを継代させたときに、ＧＦＰ−陽性２９３細胞の数を増加させることにより パッケージ化が示された。この形質導入単位力価はＭ２３で得られるものに類似 しており（図１３）、これは、Ａｄ５ ＤＮＡと比較した場合、外来性ＤＮＡが パッケージ化効率において有害な効果を持たないことを示した。 １．４ ミニＡｄＧＦＰウイルス（Ｍ３２）の精製 ミニウイルスの継代に続いて、感染後に全ての細胞が蛍光を発するようになる まで力価を増加させた。これは、例えば、Ｍ３２の継代４で生じた。Ｍ３２を１ 対３の増幅スケールで連続的に継代することにより継代８に達したとき、１５０ ｍｍ²のプレート７５枚を感染させるのに十分なウイルスが得られた。ＣＰＥが 出現したら、上述のように３回の凍結／解凍サイクルによりウイルスを抽出し、 ＣｓＣｌ勾配により精製した。勾配中には、３つの上部バンドと遠心管の中央部 のより濃い１つのバンドとの４つのバンドが観察された（図１４のスキームを参 照）。管の頂部から吸引することによりそれぞれのバンドを別々に集め、透析し た。２９３細胞にそれぞれのバンドを感染させて蛍光を観察し、又はＸ−ｇａｌ 染色することにより、ミニウイルス及びヘルパーウイルスが両者とも高密度バン ドに存在することが示された（図１５）。緑色及び青色細胞の数に基づいて、ミ ニウイルス及びヘルパーの量が同じ範囲内にあることが決定された。Ｍ３２（３ ２Ｋｂ）及びＡｄＨβ（３７．１Ｋｂ）内に存在するウイルスＤＮＡのサイズの 相違は、Ｍ３２をＡｄＨβよりも密度が僅かに劣るものとした。ミニＡｄベクタ ーのヘルパーに対する比を増加させるため、高密度バンドを１．３５ｇ／ｍｌ連 続ＣｓＣｌ勾配中に分離し、その管の底部から画分を集めた。それぞれの画分の ０．５ｍｌを亜集密の２９３細胞の感染に直接用い、２４時間後に蛍光性及び青 色細胞をチェックした。多量のＡｄＨ βを含むピーク（図１６、画分７乃至１６）の後により軽い画分が続き、これは ＡｄＨβに対して１０倍のＭ３２の濃縮を示した（画分１７乃至２９）。したが って、ミニＡｄ調製品中に存在するヘルパーウイルスの量の低減にＣｓＣｌによ る分画を用いることができる。 まとめると、これらの結果は、ｄｌ１８／２８から採取されたパッケージ化シ グナルにおける部分的な欠失と共に用いられるヘルパーはミニウイルス系におけ る大きな欠失を補完することが可能であるが、ミニウイルスの存在下において依 然としてパッケージ化することを示す。このヘルパーは、純粋なミニウイルスの 集団が重要ではない場合、例えば、幾つかの治療用遺伝子（例えば、インタ−ロ イキン及び腫瘍抑制遺伝子）を含むミニウイルスを他の治療用遺伝子を含むこの ヘルパーに結合させることが可能な抗腫瘍ベクター系において用いることができ る。ヘルパーに対するより高いミニＡｄの比が必要である場合には、このヘルパ ーをそのパッケージ化においてさらに弱力化する必要がある。 実施例２．パッケージ化シグナルが妨害されたヘルパーＡｄの設計 アデノウイルスのパッケージ化はパッケージ化要素（Ａ反復）に結合するのに パッケージ化タンパク質を必要とする（９０、９６）ため、本発明ではＡｄ５パ ッケージ化シグナル(A反復）に隣接する幾つかの特定のＤ ＮＡ結合配列を導入してヘルパーウイルスのパッケージ化機能をさらに物理的に 妨害する。２つのＤＮＡ結合配列が選択されている：Ａ．ＧＡＬ４結合配列（９ ７）；Ｂ．テトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）（９８、９９）。Ｇ ＡＬ４は、酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃ ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における転写を活性化する配列特異的ＤＮＡ結合タンパク 質である。ＧＡＬ４の最初の１４７アミノ酸は、ガラクトース中の活性化領域Ｕ ＡＳ_G又は自然に生じる部位、“１−量体”５’ＣＧＧＡＧＴＡＣＴＧＴＣＣＴ ＣＣＧ−３’もしくは５’−ＣＧＧＡＧＧＡＣＴＧＴＣＣＴＣＣＧ−３’近似共 通の上流の４つの部位に結合する（９７）。ｔｅｔＯは大腸菌のＴｎ１０特異的 テトラサイクリン耐性オペロンに由来するものであり、耐性介在遺伝子の転写は ｔｅｔＯの１９−ｂｐ逆転反復配列５’ＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧ Ａ−３’の結合するテトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）によって負に調 節される（９８、９９）。 パッケージ化シグナル変異構築体ＧＴ５０００（実施例、第１項）に基づいて 、ＧＴ５０００のＸｈｏＩ乃至ＸｂａＩ（ｎｔ１９４、０．５ｍｕ乃至ｎｔ４５ ２、１．２５ｍｕ）の配列の置換に合成配列が用いられている。４種類の合成配 列（図２１及び２２）が設計されている。４種類の合成配列は全て、Ａｄ５パッ ケージ化要素（Ａ反復）Ｉ、II、ＶＩ及びＶＩＩを含む。１７量体ＧＡＬ ４結合配列（５’ＣＧＧＡＧＴＡＣＴＧＴＣＣＴＣＣＧ−３’（９７）又は１９ 量体ｔｅｔＯ配列（５’−ＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡ−３’（１ ００、１０２）の３つもしくは４つの反復をこれらのＡ反復の周囲又はそれらの 間に導入した（図１７及び１８）。Ａ反復の間の領域はパッケージ化効率に影響 を及ぼす（９０、９６）ため、各Ａ反復間の距離はそのヘリックスのほぼ完全な ターン、すなわち、１０、２１又は３１ｂｐに維持する（図１７及び１８）。図 １９及び２０は合成オリゴ配列及び位置を示す。 実施例３．Ａｄ−Ｅ１ヘルパー細胞系の構築及び特徴付け 遺伝子治療用途において用いられるアデノウイルスペクターの大部分はアデノ ウイルス５（Ａｄ５）ゲノムのＥ１領域に欠失を有するように設計されていた。 領域ＩＸを含まないＥ１領域はＡｄ５の左端の９％（１．２−９．８マップ単位 ）からなり、２つの早期領域タンパク質Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂをコードする。Ｅ１Ａ ／Ｅ１Ｂの発現には、ウイルスの複製並びにＥ２−Ｅ４及び後期タンパク質のよ うな他のＡｄ５タンパク質全ての発現が必要とされる（１００）。Ｅ１の欠失は 、理論上は、全てのＡｄ５タンパク質の発現について無活動であり、且つ関心の ある導入遺伝子のみを発現する複製不適格ウイルスを創出する。Ｅ１Ａ及びＥ１ Ｂの欠失も、これらの２種 類のタンパク質が組み合わせて哺乳類動物細胞の癌遺伝子性形質転換に関連付け られているため、安全性の理由から関心のあるものである（１０１−１０３）。 ヒトの臨床試験において現在までに用いられている全てのクラスＩアデノウイル スベクターに加えて、実施例１に記述される新規パッケージ化不全ヘルパーウイ ルスもＥ１が欠失されている。 Ｅ１不全アデノウイルスは２９３と呼ばれるＡｄ５ヘルパー細胞系において増 殖する（１０４）。２９３細胞は、Ａｄ５ ＤＮＡの共有断片を含むヒト胚性腎 臓細胞を形質転換することにより誘導された。ゲノムの分析により、２９３細胞 は細胞当たり４乃至５コピーのウイルスゲノムの左側１２％（Ｅ１領域全体を含 む）及び細胞当たり約１コピーの右端、Ｅ４領域の９％を含むことが明らかにな った（１０５）。２９３細胞は高力価のＥ１不全アデノウイルスを生成する点で は非常に効率的ではあるが、（Ｅ１領域以外の）２９３ゲノムに組み込まれてい る外来性Ａｄ５配列の存在のため、Ｅ１欠失アデノウイルスベクター中の配列と の組換えが生じ、それがＥ１を含む複製適格アデノウイルス（ＲＣＡ）の生成を 引き起こす可能性があるという不利な点を有する。Ｅ１不全アデノウイルスの増 幅及び増殖の間にいかに早い継代（この継代はアデノウイルス貯蔵物の大規模生 成に用いられるものである）で異常な組換え現象が生じるのかに依存して、２９ ３細胞におけるＲＣＡの生成はヒト遺伝 子治療試験の安全性に対する深刻な結果を提示し得る（１０６）。ＲＣＡの生成 に加えて、２９３細胞における組換えは、導入遺伝子の発現に影響を与え、それ により機能的アデノウイルス粒子の力価を低下させる欠失及び再配置をも引き起 こし得る。近年、Ｅ１領域を含む決定されたＡｄ５ ＤＮＡを用いて細胞系が開 発されているが、これらの細胞系はＥ１欠失アデノウイルスベクター中の相同配 列と重複する重要な配列を保持し、これが望ましくない相同組換え現象及びＲＣ Ａの生成の可能性の余地を残す（１０７、１０８）。 ３．１ 細胞系生成のためのプラスミドの構築 アデノウイルスベクターとの組換えの可能性を排除するため、補完に必要とさ れるＥ１Ａ／Ｅ１Ｂ配列のみを有し、且つＥ１不全アデノウイルス中の領域と重 複するいかなる相同配列をも含まない新規Ａｄ５ヘルパー細胞系が開発されてい る。Ａｄ５ Ｅ１Ａ及びＥＩＢをコードする配列を含む、ＡｆＩ ＩＩＩ（４６ ２ｂｐ）部位とＡｆＩ ＩＩ（３５３７ｂｐ）部位との間の３．１ｋｂ ＤＮＡ 断片を、以下のように、スーパーリンカーベクターｐＳＬ３０１（インビトロゲ ン）に２つの断片として連続的にクローン化した：まず、８８１ｂｐのＡｆｌＩ ＩＩ乃至ＸｂａＩ断片（Ａｄ５ ｂｐ４６２−１３４３）をｐｂＲＸａｄ５Ｋｐ ｎＩＣｌ（ｐＪＭ１７のサブクローン）からｐＳＬ３０１（ＡｆｌＩＩＩ／Ｘｂ ａＩ）にクローン化した。次に、近接する２１９４ｂｐの ＸｂａＩ乃至ＡｆｌＩＩ（Ａｄ５ ｂｐ１１３４３−３５３７）をｐＢＲＸａｄ ５ＸｈｏＩＣｌから同じベクターにクローン化した。得られた３０７５ｂｐのＥ １断片（ｐＳＬ３０１中）は、Ｅ１ＡのＴＡＴＡボックス及びＲＮＡキャップ部 位、Ｅ１Ａコーディング配列、完全なＥ１Ｂプロモーター、並びにＥ１Ｂコーデ ィング配列を含み、これにはＥ１Ｂｐ５５タンパク質の停止コドンが含まれるが 領域ＩＸは含まれない。この３０７５ｂｐのＡｆｌＩＩＩ−ＡｆｌＩＩ Ｅ１Ａ ／Ｅ１Ｂ断片（Ａｄ５ ｂｐ４６２−３５３７）を単離し、クレノウ酵素で平滑 末端化して、ＣＭＶプロモーター／エンハンサーの制御の下で哺乳動物発現ベク ターｐＣＤＮＡ３（インビトロゲン）のＥｃｏＲＶ部位に平滑末端ライゲートし た。このプロセスによりＡｄ５Ｅ１発現ベクターＣＭＶ−Ｅ１が生じた（図２１ ）。 ３．２ 新規細胞系の生成及び特徴付け このＣＭＶ−Ｅ１発現￥ベクター（Ｇ４１８耐性遺伝子、ｎｅｏを含む）をリ ポフェクタミン（ギブコ／ＢＲＬ）を用いてＡ５４９ヒト肺癌細胞に形質移入し 、Ｇ４１８^Rコロニーを単離した。単細胞クローンを機能的なＥ１Ａ／Ｅ１Ｂの 発現についてスクリーニングした；緑色蛍光タンパク質（ＦＧＰ）発現カセット をＣＭＶ／β−アクチン（ＣＡ）プロモーターＡｄ５ＣＡ−ＧＦＰの存在下に含 むＥ１欠失アデノウイルスをＡ５４９−Ｅ１クローンの感染に用いた。感染の３ 日後、細胞変性効果（ＣＰ Ｅ）の目視検査によりＥ１補完Ａｄ５ＣＡ−ＧＦＰアデノウイルスの生成につい てクローンをスクリーニングした。クローンの１つ、Ａ５４９Ｅ１−６８が３日 間で（２９３細胞について観察されるものに類似する）１００％のＣＰＥを示し た。このクローンは高い感染性も示し、実質的に１００％の細胞が感染後２４時 間で緑色の蛍光を発した（図２２）。 この細胞系に誘発されたＣＰＥの迅速な生成に加えてこの高い感染率は、Ｅ１ 欠失Ａｄ５ＣＡ−ＧＦＰウイルスの複製及び増幅を促進することが可能な機能的 Ｅ１Ａ／Ｅ１Ｂタンパク質が生じていることの強力な証拠である。Ｅ１配列特異 的プローブを用いるサザンブロット分析により、Ａ５４９Ｅ１−６８、Ａ５４９ Ｅ１−６８のサブクローン（Ｅ１−６８．３）、及び２９３細胞におけるＣＭＶ −Ｅ１導入遺伝子の存在が示されたが、親のＡ５４９細胞系には示されなかった （図２３）。これらのＥ１形質移入細胞の形態は親のＡ５４９細胞系とは大きく 異なっていた。亜集密密度のＡ５４９細胞は細長い線維芽細胞様の形態を有する 別々の単細胞として成長し、これに対してＥ１細胞系、Ａ５４９Ｅ１−６８はよ り立方体状の形態を有する細胞のコロニーとして成長する（図２４）。 Ｅ１欠失アデノウイルス（Ａｄ５ＣＡ−ＧＦＰ）の生成についてプラーク検定 によりＡ５４９Ｅ１−６８を２９３細胞と比較し、等しい力価の補完ウイルス（ Ａ５４ ９Ｅ１−６８についての７Ｘ１０⁹ＰＦＵ対２９３についての９Ｘ１０⁹ＰＦＵ） を生成することが見出された。免疫沈殿及びＥ１Ａ特異的抗体（Ｍ７３、オンコ ジーン・サイエンス（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ））を用いるウェスタ ンブロットにより４６ｋｄ及び４２ｋｄの見かけの分子量を有する２つのＥ１Ａ 特異的バンドが明らかとなり、これらはＥ１Ａ １３Ｓ及び１２Ｓ ｍＲＮＡか ら予想される産生物（６）に相当し、且つ２９３細胞中に観察されるものと同じ サイズであった（図２５Ａ）。Ａ５４９Ｅ１−６８は、Ｅ１Ｂｐ５５に特異的な モノクローナルＡｂを用いて約５５ｋｄのバンドを生成した。この５５ｋｄのＥ １Ｂ特異的バンドはもちろん、二次バックグランドバンドも、同様に２９３細胞 において観察された（図２５Ｂ）。実験及び対照レーンの両者に見出される余分 な“バックグラウンド”バンドは他の著者によって観察されており、サイクリン 、ｐ５３、及びＲｂを含む様々なタンパク質の同時免疫沈殿によるものと考えら れている。Ａ５４９Ｅ１−６８及び２９３細胞とは異なり、親のＡ５４９細胞系 は４６ｋｄ、４２ｋｄ、又は５５ｋｄ Ｅ１Ａ／Ｅ１Ｂタンパク質の発現を示さ なかった。Ａ５４９Ｅ１−６８がＥ１Ａ及びＥ１Ｂを発現するだけではなくそれ らが機能的であることは、この細胞系が高力価のＥ１欠失組換えアデノウイルス の生成を補完することが可能であることから明らかである。この新規Ａｄ５ヘル パー細胞系がＲＣＡを生成すること なく補完可能であることを立証するため、Ａ５４９Ｅ１−６８細胞でＥ１欠失ア デノウイルスを連続的に継代し、継代の間に増幅したウイルスを、Ｅ１を含む複 製適格アデノウイルス（ＲＣＡ）については親Ａ５４９細胞を用いて、ＣＰＥに よってはもちろん、Ｅ１Ａ／Ｅ１Ｂ配列に特異的なＰＣＲプライマーを用いるこ とにより試験した。この細胞系は、Ｅ１欠失アデノウイルスベクターの増殖及び スケールアップの間に、製造ロットがＲＣＡを含まないことを保証するために用 いられる。 実施例４．ＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡを含む発現カセット 本発明のＡｄミニベクターの関心のある遺伝子に対する大きな収容力は、従来 のＡｄベクターのサイズ容量を大きく上回る大プロモーター及びタンパク質コー ディング領域の組み込みを許容する。本発明の目的上、このＦＶＩＩＩミニＡｄ ベクターはＦＶＩＩＩ遺伝子を肝臓に送達することが好ましい。したがって、肝 臓において作用する非常に活性の高いプロモーターを用いることが重要である。 このようなプロモーターの１つはヒトアルブミン遺伝子プロモーターである（３ ２）。ヒトアルブミンプロモーターの１２．５ｋｂ領域はカルガリー大学のＴａ ｍａｏｋｉ博士から入手した。この１２．５ｋｂプロモーター内の３つの領域が プロモーターの活性に大きく影響することが決定されている（３２）：１）ＴＡ ＴＡボックスを含む近位領域（５５０ｂｐ）；２）−１． ７ｋｂのエンハンサー領域；及び３）−６．０ｋｂの第２エンハンサー領域（図 ２６）。合わせると、これらの領域は１２．５ｋｂヒトアルブミンプロモーター 全体の強度に近づく。ｐＡｌｂ１２．５ＣＡＴの１０．５ｋｂ ＥｃｏＲＩ／Ａ ｖａＩ断片（図２）をＡｖａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ近位ヒトアルブミンプロモータ ー断片と共にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＫＳ⁺ベクターのＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位に同時ライゲートして組換えプラスミドＧＴ４０３１を生成した（図 ２７）。５’側接ＳＶ４０最初期イントロン及び３’側接ＳＶ４０ポリアデニル 化シグナルを有する７．２ｋｂ完全長ヒトＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡをプラスミドＧ Ｔ２０５１からＸｈｏＩ／ＳａｌＩ消化により切り出し、ＧＴ４０３１のＳａｌ Ｉ部位にクローン化してプラスミドＧＴ２０５３を生成した（図２８）。次に、 最小ＩＴＲ領域及びＡｄパッケージ化シグナルを含むＧＴ２０３３から誘導され るＸｈｏＩ断片をＧＴ２０５３のＳａｌＩ部位に正方向又は逆方向のいずれかに クローン化し、それぞれ、アルブミン／ｈＦＶＩＩＩミニウイルスプラスミドＧ Ｔ２０５９及びＧＴ２０６１を生成した（図２９）。このＧＴ２０５９及びＧＴ ２０６１ミニウイルスプラスミドの制限酵素消化パターンが図３０及び３１に示 されている。 ＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡはプロモーターもしくは転写制御要素に作動可能に連結 させることが可能であり、この要素は合成であっても、制御可能もしくは調節可 能であ っても、あるいは組織／細胞型に特異的であってもよい。好ましくは、産生もし くはヘルパー細胞におけるＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡの発現はウイルス生成の間抑制 され、標的細胞に送達された後に活性化する。このようにして、このミニＡｄベ クターのレポーター又はエフェクター遺伝子の弁別的発現が活性化される。この ような弁別された発現は、α₁−抗トリプシン（α₁−ＡＴ）プロモーターに作動 可能に連結する肝臓特異的エンハンサーを有するもの又はテトラサイクリンオペ ロン（ｔｅｔＯ）がサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（ｔｅｔＯ− ＣＭＶ）に作動可能に連結するもの（この場合、ｔｅｔ−ＫＲＡＢ転写リプレッ サータンパク質を発現する細胞系が用いられる）のような合成プロモーターの転 写制御の下にＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡを有するＤＮＡ分子を構築することにより達 成される。 実施例５．ＦＶＩＩＩ発現カセットの相同組換えアーム 外来性遺伝子を標的細胞のゲノムに挿入して安定な遺伝子発現を得るのに相同 組換えを用いることができる。この技術を用いて、ヒトＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡの 標的を標的細胞のゲノムＤＮＡに設定することができる。ヒトアルブミン遺伝子 又はヒトα−胎児タンパク質から誘導される細胞ＤＮＡの大セグメントを用いた （３２、３３）。ＦＶＩＩＩミニＡｄベクター中の１２．５ｋｂアルブミンプロ モーターは、６ｋｂを上回る幾つかの下流断片が 潜在的な３’組換えアームとして調製されたのに対して、上流相同組換えアーム として作用する。本発明において用いられるアルブミン遺伝子、遺伝子間領域及 びα−胎児タンパク質遺伝子領域の形状が図３１に示されている。５’末端にこ の１２．５ｋｂアルブミンプロモーターを含み、且つ３’同族組換えアームとし ての役割を果たす幾つかの領域を含むプラスミドＧＴ２０６１内の発現力セット の構造が図３２に示されている。これらのベクターは、これらのアームの方向が 正常ヒトゲノムにおける配列と同じ方向であるため、相同組換え置換ベクターと しての役割を果たす。ヒトアルブミン遺伝子から誘導される３’ＸｈｏＩ組換え アーム及びＧＴ２０６１の独自ＳａｌＩ部位にクローン化されたｐＡ１ｂ−Ｅ５ セグメントを含む構築体（ＧＴ２０６３）が図３３に示されている。３’アルブ ミン相同組換えアームに隣接するヒトアルブミンプロモーター誘導ｈＦＶＩＩＩ を構築するのに適するベクターの制限酵素消化が図３４に示されている。プラス ミドｐＥ５のＸｈｏＩアルブミン遺伝子断片をＧＴ２０６１の独自ＳａｌＩ部位 に挿入することによりプラスミドＧＴ２０６３を構築した。 実施例６．ＦＶＩＩＩミニＡｄベクターの生成 １２．５ｋｂ ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩヒトアルブミンプロモーター断片 をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ⁺（ストラタジーン、ラ・ホーヤ、ＣＡ）に挿入 した。こ れにより、ヒトアルブミンプロモーターベクターＧＴ４０３１は、ヒトＦＶＩＩ Ｉ ｃＤＮＡ（５’末端にＳＶ４０早期イントロンを、及び３’末端にＳＶ４０ ポリアデニル化シグナルを含む、ＧＴ２０５１のＸｈｏＩ乃至ＳａｌＩの領域） が挿入されている独自ＳａｌＩ部位を含む。得られたプラスミドＧＴ２０５３は 、ポリアデニル化部位の３’、に位置する独自ＳａｌＩ及びＸｈｏＩ部位を含む （図２９）。Ａｄ最小ＩＴＲ及び野生型パッケージ化シグナルをプラスミドＧＴ ２０３３からＸｈｏＩ消化により切り出し、プラスミドＧＴ２０５３のＳａｌＩ 部位にクローン化してプラスミドＧＴ２０６１を生成した。アルブミン遺伝子の ６．８ｋｂアームｐＡｌｂ−Ｅ５から単離し、ＧＴ２０６１の独自ＳａｌＩ部位 にクローン化してプラスミドＧＴ２０６３を生成した。ＧＴ２０６３をヘルパー ウイルスＤＮＡと共に２９３細胞に形質移入し、ＧＴＶ２０６３と呼ばれるミニ Ａｄ ＦＶＩＩＩミニウイルスを生成した。 ＦＶＩＩＩミニウイルスを生成するため、ヘルパーウイルスゲノム（２μｇ） をウイルス粒子から精製し、ヘルパーＡｄゲノム（０．２μｇ）と共にリン酸カ ルシウム介在形質移入（８１）により２９３細胞に同時形質移入した。ＣＰＥが 出現した後、細胞非含有凍結解凍溶解物を調製し、新鮮な２９３細胞の感染に用 いた。その細胞上清中に、コーテスト色素生成検定（ファルマシア（Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ））を用いて、ＦＶＩＩＩＧＴ２ ０６３ミニＡｄの存在を示すヒトＦＶＩＩＩが検出された。これらのデータはヘ ルパー／ＧＴ２０６３ミニＡｄベクター混合物の増殖と一致した。 さらに別のアプローチ（図３５）においては、Ａｄパッケージ化シグナル及び Ｅ１領域を欠いているがＡｄタンパク質の残部をコードするアデノウイルスヘル パープラスミドｐＢＨＧ１０をミニＡｄクローンＧＴ２０６３と共に２９３細胞 に同時形質移入した。このＡｄミニウイルスゲノムの救済は、２９３細胞の感染 の後、弱力化パッケージ化機能を有するＥ１置換ヘルパーウイルスを用いて達成 した。本発明の方法論を用いて、ヘルパーＡｄ／ミニＡｄ比は変化し得るが、こ れらのＡｄヘルパー及びミニＡｄゲノムの両者をパッケージ化することが可能で あり、いずれかのゲノムを坦持するアデノウイルス粒子を生成することが可能で ある。 ＦＶＩＩＩミニＡｄの生成及び検出がそれぞれ図３５及び３６に示されている 。ヘルパープラスミドｐＢＨＧ１０（０μｇ）及びヒトＦＶＩＩＩ遺伝子を含む ミニＡｄベクター（ＧＴ２０６３；２μｇ）を、リン酸カルシウム形質移入（８ １）により２９３細胞に同時形質移入した。２９３細胞への形質移入は、公知の 広く利用可能な技術のいずれか、例えば、リポフェクチン（すなわち、ギブコ／ ＢＲＬ製のリポフェクタミン）又は電気穿孔法（すなわち、バイオ・ラッド（Ｂ ｉｏ−Ｒａｄ）から入手可能な試薬及びエレクロトポレーター）を用いて行う ことができる。形質移入２９３細胞への弱力化ヘルパーウイルスの感染は形質移 入の３日後に行った（図３５Ｂ）。アデノウイルスの感染が十分に進行している ことを示す図３５Ｂの細胞変性効果（ＣＰＥ）は感染の４日後に観察された。そ の後、ウイルス貯蔵物（継代０、すなわちＰ０）を、感染細胞ペレットを複数回 凍結−解凍することにより調製した。次に、２９３細胞をＰ０貯蔵物に感染させ （１：１）、感染の２４時間後に集めた上清はｈＦＶＩＩＩ配列の存在に特異的 なＰＣＲで陽性であった。６日後にＣＰＥが検出され、凍結−解凍溶解物（Ｐ２ ）を調製した。次いで、このＰ２溶解物をＰＣＲによりパッケージ化ＧＴ２０６ ３ミニＡｄの存在及び機能的ｈＦＶＩＩＩについて試験した。２９３細胞におけ るｈＦＶＩＩＩの発現は、ヒトアルブミンプロモーターがこれらの細胞において は活性が低いため、最小であるものと予想された。これは、リン酸カルシウム沈 殿形質移入法を用いて２９３細胞にＧＴ２０６１を形質移入した後、ＣＡＴ検定 （６９）及びＦＶＩＩＩ色素産生検定（ヘレナ・ラボラトリーズ（Ｈｅｌｅｎａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ファルマシア）の両者を用いて測定されている 。 実施例７．ミニＡｄＦＶＩＩＩの増幅及び生成 出願人は、以前、１９９６年５月３１日に米国特許出願番号０８／６５８，９ ６１号を出願し、その出願の中 でミニＡｄＦＶＩＩＩベクターＧＴ２０６３を生成し、且つ増殖物の初期継代を 実施するための試薬及び方法論を提供した（７９、８０）。これらの増殖段階に おいて、出願人は、ヘルパーウイルスＡｄＨβに対するミニＡｄＦＶＩＩＩの比 が増殖の進行に従って増加することを見出した。本願は、いずれも当業者に公知 の通常の技術であるＰＣＲ及びサザンブロットを用いる、ヘルパーに対するベク ターの比の分析を提供する。全ての継代について、５００μｌの（感染細胞の３ 回の凍結／解凍サイクルにより得られた）ウイルス粗製抽出物を６ウェルプレー トのウェルにおける２９３細胞の新たな亜集密単層の感染に用いた。感染の１時 間後、１．５ｍｌの新鮮な培地（ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ）を添加した。細胞変 性効果（ＣＰＥ）が完了したら直ちに細胞を回収し、再度ウイルスを抽出した。 各々の継代において、２ｍｌのうちの０．５ｍｌが用いられ、そのためこの増殖 の増幅スケールは１対４である。全ての継代の清澄化した粗製溶解物を用いて、 ＳＤＳ／ＥＤＴＡ／プロテイナーゼＫ消化及びエタノール沈殿によりウイルスＤ ＮＡを精製した。このウイルスＤＮＡをＰＣＲ及びサザンブロットに用いてミニ Ａｄ及び、独立に、ヘルパーＡｄウイルスＤＮＡを検出した。 ＰＣＲはヒトＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡに特異的なプライマーを用いて行い、増幅 は、ＤＮＡ抽出の前にＤＮＡ分解酵素処理を行ってあらゆる残留非ウイルス汚染 プラス ミドＤＮＡを除去したウイルスに対して行った。ＰＣＲは、テンプレートとして の単離ウイルスＤＮＡ（単離されたウイルスＤＮＡの１／２０）、最終濃度１μ ＭのＦＶＩＩＩプライマー＃１（配列番号１；ＡＣＣＡＧＴＣＡＡＡＧＧＧＡＧ ＡＡＡＧＡＡＧＡとして記載）、最終濃度１μＭのＦＶＩＩＩプライマー＃２（ 配列番号２；ＣＧＡＴＧＧＴＴＣＣＴＣＡＣＡＡＧＡＡＡＴＧＴとして記載）、 及び以下の条件を用いて行った：５５℃で１分間のアニール、７２℃で１分間の 重合、９４℃で１分間の変性を合計３５サイクル。これらの結果は、ＦＶＩＩＩ ミニウイルスが早期継代中に存在することを示した（継代３；データは示さず） 。 図３６は、ＦＶＩＩＩミニＡｄ及び、独立に、ヘルパーＡｄのパッケージ化シ グナルのＰＣＲ増幅の結果を示す。ＰＣＲをパッケージ化シグナル領域に対して も行った。ＰＣＲは、テンプレートとしての単離ウイルスＤＮＡ（単離された全 ウイルスＤＮＡの１／２０）、最終濃度１μＭのパッケージ化シグナルプライマ ー＃１（配列番号３；ＧＧＡＡＣＡＣＡＴＧＴＡＡＧＣＧＡＣＧＧ）、最終濃度 １μＭのパッケージ化シグナルプライマー＃２（配列番号４；ＣＣＡＴＣＧＡＴ ＡＡＴＡＡＴＡＡＡＡＣＧＣＣＡＡＣＴＴＴＧＡＣＣＣＧ）及び以下の条件を用 いて行った：５５℃で１分間のアニール、７２℃で１分間の重合、９４℃で１分 間の変性を合成３５サイクル。ヘルパーＡｄのパッケージ化シグナルが部分的に 欠失し ているため、パッケージ化シグナル欠失ヘルパーからのＰＣＲ産生物は野生型パ ッケージ化シグナルを有するミニＡｄのもの（約３１０ｂｐ）より短い（１７７ ｂｐ）。初期継代においてはＦＶＩＩＩミニＡｄは検出されないが、その存在は 継代３乃至６において徐々に検出された。同じ結果がサザンブロット分析を用い て得られた（図３７）。サザンブロット分析におけるプローブとして、ＦＶＩＩ ＩミニＡｄ及びヘルパーＡｄの両者に存在する右ＩＴＲに隣接するＡｄ ＤＮＡ 断片を用いた。ミニＡｄ ＧＴ２０６３及びＡｄＨβのＰｓｔＩ消化の後に検出 される断片の予想される長さは、それぞれ、３．３及び２．２Ｋである。図３７ は、継代１乃至２１から独立に単離されたＦＶＩＩＩミニＡｄ ＤＮＡの４つの サザンブロット（Ａ−Ｄ）を編集したものである。ミニＡｄＦＶＩＩＩに相当す る３．３Ｋｂバンドが継代５−２１から単離されたＤＮＡに検出された。ＦＶＩ ＩＩミニＡｄ ＤＮＡの安定な増加が継代１０まで検出され、その後継代１２ま でＦＶＩＩＩミニＡｄが漸進的に減少した。このＦＶＩＩＩミニＡｄ ＤＮＡの 水準の増加及び減少のサイクルは４つの継代ほぼ全てに生じることが観察され、 これには僅かに早く開始するヘルパーＡｄ ＤＮＡの水準の平行なサイクルが付 随した。これらのサイクルをより十分に決定するため、サザンブロットからＦＶ ＩＩＩミニＡｄ ＤＮＡ及びヘルパーＡｄ ＤＮＡの量を濃度測定により定量し 、図３８にプロットした。等量の マーカー（ギブコ、ゲーサーズバーグ、ＭＤからの１Ｋｂラダーマーカー）から のバンドの強度を用いて、異なるブロットの結果を標準化した。観察されたサイ クルは、欠陥妨害性ウイルスに関連して生成するウイルス集団（本発明の系にお いては、このウイルス集団はＦＶＩＩＩミニＡｄを含む）及びヘルパーウイルス の公知の動態と一致する。これらのサイクルの理解及び制御は、最適力価を得る ためにどの継代でミニＡｄべクターを精製するべきであるのかを決定するのに重 要である。＃１８（Ｐ１８）のような継代は、低力価ではあるが、ＦＶＩＩＩミ ニＡｄに富むベクター調製品を生じる（すなわち、Ｐ１８はヘルパーＡｄより１ ０倍多いＦＶＩＩＩミニＡｄを含むものと考えられる）。＃２０（ｐ２０）のよ うな継代は、１：１の望ましくないＦＶＩＩＩミニＡｄ対ヘルパーＡｄ比ではあ るが、高濃度のＦＶＩＩＩミニＡｄ及びヘルパーＡｄを含む。 大規模増幅をｐ２０で行った。各々約１０⁹個の感染２９３細胞（ＡＴＣＣ＃ ＣＲＬ１５７３）を収容する１００の１５ｃｍ皿をＣＰＥが完了したら直ちに回 収した。その後、粗製溶解物を３回の凍結／解凍サイクルによって調製してウイ ルスを抽出した。この粗製溶解物を遠心によって清澄化し、ＣｓＣｌの段階濃度 勾配（１．５、１．３５、及び１．２５ｇ／ｍｌの３層）にのせて３５０００Ｘ ｇで１時間遠心した。ミニＡｄ及びヘルパーＡｄに相当するバンドを、１．３５ ｇ／ｍｌの第２連続Ｃ ｓＣｌ勾配を用いてさらに精製した。３５，０００ｒｐｍ（１５０，０００Ｘｇ ）で１６時間遠心した後に類似の強度を有する２つのバンドが観察され、それら を別々に単離して１０％グリセロールを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中 に透析した。各々のバンドの一定分量からウイルスＤＮＡを精製し、ミニＡｄＦ ＶＩＩＩ及びヘルパーの量をサザンブロットにより分析した。上部バンド（より 軽量）は主としてミニＡｄを含み、下部バンドは主としてヘルパーＡｄを含むも のと思われた。これらの結果はＦＶＩＩＩミニＡｄゲノム（ＧＴ２０６３＝３１ Ｋｂ）がヘルパーＡｄゲノム（ＡｄＨβ＝３７．１Ｋｂ）より小さいことから予 想されたことであり、本願の親出願（１９９６年５月３１日出願の米国０８／６ ５９，９６１号）において示されるＭ３２ミニＡｄについての以前のＣｓＣｌ分 画結果と一致する。 実施例８．細胞系におけるミニＡｄＦＶＩＩＩの試験 ＦＶＩＩＩミニＡｄ（ＧＴ２０６３）を上述の通りＣｓＣｌにより精製し、こ のベクターで感染した宿主細胞におけるＦＶＩＩＩの生成を示すのに用いた。こ の目的を達成するため、２９３及びＨｅｐＧ２細胞を、アルブミンプロモーター を用いるそれらの能力のために用いた。これらの細胞におけるＦＶＩＩＩの生成 は感染の２４時間後に免疫組織化学及び機能的検定により検定した。精製ＦＶＩ ＩＩミニＡｄベクターを０．５ｍｌの培地に添 加し、４ｃｍ²ウェルにおける６Ｘ１０⁵個の２９３及びＨｅｐＧ２細胞の感染に 用いた。４時間インキュベートしでウイルス粒子を宿主細胞に吸着させた後、そ の感染培地を新鮮な培地に置き換えた。ＦＶＩＩＩミニＡｄを含むより軽量の画 分の１／１００希釈液０．１μｌで２９３細胞を感染させ、これらの細胞をヒト ＦＶＩＩＩの存在について免疫組織科学的分析を行った後、これらの細胞の約１ ０％がＦＶＩＩＩの発現について陽性に染色された（図４０、パネルＡ−Ｄ）。 ミリリットル当たりの形質導入単位での見積もり力価は６Ｘ１０⁹形質導入単位 ／ｍｌと決定された。４時間の吸着時間、４ｃｍ²に０．５ｍｌの吸着容積、及 び非振盪吸着を考慮に入れた場合、見積もり力価はそれぞれ０．４２、０．５６ 、及び０．５３の因子だけ減少し得る（４９）。したがって、ミニＡｄＦＶＩＩ Ｉベクターの実際の力価は、４．６Ｘ１０¹⁰形質導入因子／ｍｌと見積もられる 。ミリリットル当たりのウイルス粒子の数を反映する２６０ｎｍでの光学吸収に よって決定される力価は、ＦＶＩＩＩミニＡｄの軽量画分について３．６Ｘ１０¹² 粒子／ｍｌと決定された。したがって、ＦＶＩＩＩミニＡｄの生物活性は７８ ウイルス粒子毎に１ＦＶＩＩＩ形質導入単位と算出することができ、これは食品 医薬品局が推奨する許容度の水準内に入る。 形質導入細胞の上清中の機能的ＦＶＩＩＩの量を色素産生コースターＦＶＩＩ Ｉ試験（ファルマシア、ピスカ タウェイ、ＮＪ）を用いて測定した。１００万個の２９３細胞又は、独立に、Ｈ ｅｐＧ２細胞に、１００％の形質導入を達成するため、過剰量の精製ベクターを 感染させた。感染条件は上述の通りであり、感染の２４時間後に上清（２ｍｌ） を集めた。標準曲線を作成するため、標準ヒト血漿試料を細胞培養培地で連続的 に希釈して６２．５乃至４０００ｎｇ／ｍｌの最終ＦＶＩＩＩ濃度範囲を得た。 これらの結果が図４１に示される。ＨｅｐＧ２及び２９３上清中に検出されたＦ ＶＩＩＩの量は、それぞれ、０．８及び０．２３ｎｇ／ｍｌであった。したがっ て、２４時間で生成したＦＶＩＩＩの総量は１００万個のＨｅｐＧ２細胞当たり １．６ｎｇ、１００万個の２９３細胞当たり０．４６ｎｇであった。 実施例９．イン・ビボでのミニＡｄＦＶＩＩＩの改善 様々な発現カセットをクローン化することができるベクターを生成することに よりベクター系の改善を達成した。近位アルブミンプロモーター領域並びにＰｍ ｅＩ及びＳａｌＩ部位の間に位置するヒトＦＶＩＩＩ遺伝子を切除することによ りベクターＧＴ２０６３を改変した。これは、まず、ＳａｌＩリンカーをＰｍｅ 部位にライゲートすることによってＧＴ２０６３のＰｍｅＩ部位をＳａｌＩ部位 に変換することにより達成した。得られたクローンＧＴ２０７２をＳａｌＩで処 理し、再ライゲートして近位アルブミンプロモーター／ｈＦＶＩＩＩ遺伝子 を除去し、それにより様々な発現カセットを挿入するための独自ＳａｌＩクロー ニング部位を有するミニＡｄベクターを作製した。このようなカセットからの発 現は上流に位置するアルブミン遺伝子エンハンサーの影響を受ける可能性がある 。各々のクローンを分析して導入遺伝子の発現の水準を決定した。 この改善されたベクターＧＴ２０７２に挿入するため、発現カセットを調製し た。この例の発現カセットは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモー ター、伸長因子Ｉ（ＥＦ−Ｉ）プロモーター（これは様々な細胞型で作用するこ とが知られている）又はピルビン酸ホスホエノールカルボキシキナーゼ（ＰＥＰ ＣＫ）遺伝子の肝臓特異的プロモーターを含む。ＥＦ−Ｉ及びＣＭＶプロモータ ーは、各々別々に、完全長ＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡ又はＢドメイン欠失（ＢＤＤ） 第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡのいずれかの発現を駆動するのに用いた（それぞれ、図 ４２及び４３）。次に、ＳａｌＩ部位が隣接するＥＦ−１ ＢＤＤ ＦＶＩＩＩ カセットをＧＴ２０７３のＳａｌＩ部位にクローン化し、図４２に示されるプラ スミドを生成した。完全長ヒトＦＶＩＩＩコーディング領域をＣＭＶプロモータ ーの制御の下に含む発現ベクターも構築し、これは図４３に示される。 実施例１０．組み込み可能なＡＡＶ−ＩＴＲ／Ｒｅｐ系ベースのベクターの構築 アデノ関連ウイルスは、アデノウイルス又はヘルペスウイルスのようなヘルパ ーウイルスの存在下においてのみ複製する、ヒト非病原性一本鎖直鎖パルボウイ ルスである。しかしながら、ヘルパーが存在しない状況では、ＡＡＶは宿主細胞 ゲノムに特異的に組み込まれ、潜在的なプロウイルスとして維持される（３４） 。ＡＡＶが組み込まれる特定の遺伝子座は染色体１９ｑ１３．３−ｑｔｅｒに位 置しており、ＡＡＶＳ１と呼ばれる（２２−２５、３５）。 ＡＡＶ組み込みの機構は完全には解明されていない。しかしながら、２つのウ イルス要素がこのプロセスに関連付けられている：ＡＡＶ ＩＴＲ及び２つの形 態のＲｅｐウイルスタンパク質（Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８）。ＡＡＶ ＩＴＲ （逆末端反復）はＡＡＶゲノムの両端に存在する回文構造配列であり、これはヘ アピン構造に折り畳まれ、複製起点として作用する。Ｒｅｐ７８／６８タンパク 質については、配列特異的ＤＮＡ結合（３６、３７）、配列及び鎖特異的エンド ヌクレアーゼ活性（３８）、及びＡＴＰ依存性ヘリカーゼ活性（３８−４０）を 含む幾つかの活性が記述されている。これらのタンパク質はＩＴＲ ＤＮＡの特 定の配列に結合することが可能であり、それによってＩＴＲヘアピンに切れ目が 入って複製が行われる末端分解と呼ばれるプロセスを促進する。Ｒｅｐ結合モチ ーフ及び末端分解部位（ｔｒｓ）はＡＡＶ ＩＴＲ及びＡＡＶＳ１の両者におい て同定され ており、Ｒｅｐの存在下においてイン・ビトロＤＮＡ複製を促進することが示さ れている（２８）。また、Ｒｅｐ６．８タンパク質がイン・ビトロでのＡＡＶ ＩＴＲとＡＡＶＳ１部位との複合体形成に介在し得ることも示されている（４１ ）。これらの発見は、ＩＴＲ及びＡＡＶＳ１部位でのＲｅｐのＤＮＡ結合及びエ ンドヌクレアーゼ活性が、制限されたＤＮＡシンターゼと共に、ＩＴＲの間に含 まれる配列の標的設定された組み込みを可能にすることを示唆する（２７）。 ＡＡＶは遺伝子治療の候補ベクターとして考えられている。しかしながら、そ れが受け入れることができる外来性ＤＮＡのサイズの制限（４．２Ｋｂ）、大規 模調製において高力価を得ることの困難性、及び組換えＡＡＶの特異的組み込み の喪失がこのウイルスを遺伝子治療ベクターとして用いる上での問題を引き起こ す。 １０．１ ＡＡＶ／ＩＴＲ−Ｒｅｐ組み込み系を試験するためのプラスミドの 構築 ミニＡｄベクターへのＡＡＶ組み込み機構の取り込みに向けて（図４４）、出 願人は組み込みに必要なアデノ関連ウイルス要素を含むプラスミドベクターを開 発して試験している。本発明の設計（図４５）において、このベクターは（ウイ ルス内在性プロモーターを含む）Ｒｅｐ発現カセットに加えて２つのＡＡＶ Ｉ ＴＲが隣接するレポーター遺伝子の発現のためのカセットからなる。このＲｅｐ 発現カセットは、プラスミドｐＳＵＢ２０１ （４１）に由来するＡＡＶゲノムの配列１９３乃至２２１６のＰＣＲ増幅の後に 得られた。この断片はＩＴＲの後の右側から始まり、ｐ５プロモーター及びＲｅ ｐ７８コーディング領域を通して延びる。 １０．２ 培養細胞におけるＡＡＶ／ＩＴＲ−Ｒｅｐ組み込み系の試験 一時的に形質移入した２９３細胞及びＥ１非発現細胞系（チャン肝細胞）にお けるこのプラスミドからのＲｅｐの発現を、免疫沈殿に加えて、特異的抗体を用 いるウェスタンブロットにより試験した。それらの結果（図４６）は、２種類の 異なる形態のＲｅｐが２９３及びチャン肝細胞に生成されることを示す。Ｒｅｐ ７８は二重の白色として現れ、Ｒｅｐ５２、ｐ１９プロモーターの産生物は単一 のバンドとして現れる。チャン肝細胞においては、信号は２９３細胞のほうがよ り強いものの、２種類の主要な形態、同様に二重線としてのＲｅｐ７８及びＲｅ ｐ５２、が検出される。 これらのプラスミドの特異的組み込み能力を試験するため、Ｒｅｐ発現カセッ トを除去し、しかしながらレポーター遺伝子発現カセットは２つのＡＡＶ ＩＴ Ｒの間に配置したままにすることにより対照プラスミドを構築した。２９３細胞 にプラスミドＧＴ９００３又はＧＴ９００４を形質移入した後、Ｇ４１８（０． ５ｍｇ／ｍｌ）で１２日間選択した。Ｇ４１８耐性コロニーを単離して増殖させ 、ゲノムＤＮＡを異なるコロニーから塩沈殿法 （１２５）により抽出した。ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、ＡＡＶＳ１に 対するプローブを用いるサザンブロットにより分析した。ＥｃｏＲＩは、ＡＡＶ Ｓ１遺伝子座が８ＫｂのＥｃｏＲ１−ＥｃｏＲ１断片内に含まれることから選択 した。図４７（パネルＡ）は、正常な配列に相当する８ｋｂのバンドに加えてシ フトしたバンドの存在により示されるように、プラスミドＧＴ９００３（Ｒｅｐ 発現プラスミド）から誘導した分析済の耐性コロニーの５０％が少なくとも１つ のＡＡＶＳ１遺伝子座の再配置を見せたことを示す。プラスミドＧＴ９００４か ら誘導されるコロニーにおいては再配置は観察されず、これは、この現象がＲｅ ｐの発現に依存することを示す。これらの結果は、Ｒｅｐが導入遺伝子の特異的 組み込みを駆動し得ることを示唆していた。次に、これらのメンブランをｎｅｏ に対する特異的プローブと再度ハイブリダイズさせた（図４８、パネルＢ）。得 られたバンドのパターンは、幾つかのＡＡＶＳ１の再配置がｎｅ０に相当する（ 例えば、クローン２Ｌ２）ことを示したが、おそらくは適用した選択圧のために 分析したクローンにおいて無作為組換え現象が頻繁に生じることをも示唆してい た。 １０．３ 選択圧のないＡＡＶ／ＩＴＲ−Ｒｅｐ組み込み系の試験 この可能性を除外するため、プラスミドＧＴ９０１２及びＧＴ９０１３を用い て別の一組の実験を行った。こ れらのプラスミドにおいては、レポーター遺伝子はＧＦＰ（エクオレア・ビクト リア緑色蛍光タンパク質）である。このレポーターは細胞を、フローサイトメト リーによる仕分け及び単細胞クローン化を含むがこれに限定されるものではない 方法を用いる単離に適するものとし、それによりｎｅｏ発現カセットによって付 与される選択圧の効果を排除する。２９３細胞にいずれかのプラスミドを形質移 入した。形質移入の１日後、所定の蛍光範囲に入る（それにより形質移入性の相 違による可変性を除去する）細胞をフローサイトメトリーにより仕分け、単細胞 を９６ウェルプレートにおいてクローン化した。仕分けの２乃至３週間後、コロ ニーを蛍光について採点した。３回の独立の実験を行い、それらの結果が表２− ｌに示されている。クローン化効率（播種ウェルの総数当たりの発生したコロニ ーの数）はＧＴ９１３誘導細胞について幾らかの可変性を示したが、プラスミド ＧＴ９０１２を形質移入したものについては一般に一定であった。プラスミドＧ Ｔ９０１２から誘導されるコロニーは約５０％が蛍光を発し、且つ引き続く継代 においてそれらの蛍光を維持し、それに対してプラスミドＧＴ９０１３から誘導 されるものは８％が幾らかの蛍光を示した。蛍光強度は微かであり、観察は宿主 細胞ゲノムへの１もしくは数コピーのＧＦＰ発現カセットの組み込みと一致する 。興味深いことに、幾つかのコロニーはＧＦＰ発現のモザイク現象を示した。こ れの説明の１つは、仕分けされた 細胞が***を始めた後に組み込み現象が生じ、これが２種類の異なる集団を発生 させたとするものであり得る。平行する実験においては、ＧＦＰ発現カセットを 単独で含むプラスミドｐＣＡ−ＧＦＰ（ウイルス配列を含まない）を細胞に形質 移入した。仕分けに加えて単細胞クローン化の後、蛍光を発するコロニーは検出 されなかった（表２−１）。考え合わせると、これらの結果は、組み込みの効率 はＡＡＶ ＩＴＲの存在によって高められるが、Ｒｅｐが発現する場合には４− ５倍高いことを示す。ＡＡＶＳ１におけるＧＦＰの標的設定された組み込みをさ らに分析するため、幾つかのコロニー（蛍光性及び非蛍光性）を成長させ、ゲノ ムＤＮＡを上述の通りに抽出した。図４８（パネルＡ）は、ＡＡＶＳ１に対する プローブを用いるサザンブロットによって得られた結果を示す。プラスミドＧＴ ９０１２から誘導される幾つかのコロニーにおいてはＡＡＳＶ１の再配置が実際 に検出され、これに対してＧＴ９０１３誘導コロニーにおいては再配置は検出さ れず、これは、Ｒｅｐの存在が標的設定された組み込みに必要であることを示す 。次に、このメンブランをＧＦＰについて探索し、再配置されたバンドとの一致 をチェックした（図４８、パネルＢ）。親細胞系２９３は予想通り陰性であった 。５つのコロニーがＡＡＶＳ１で得られるものに一致する８Ｋｂ上回るバンドを 示し、したがって、ＡＡＶＳ１におけるＧＦＰの特異的組み込みを示す。全体的 に見て、上に示される結果は、Ａ ＡＶ ＩＴＲ及びＲｅｐを含むプラスミドが宿主ゲノムＤＮＡに高頻度で組み込 まれ得ることを示し、且つこの設計がアデノウイルスベクターによって送達され る配列の組み込みに有用であることを示唆する（図４４）。 表２−１．単細胞クローン化実験の結果 ^*播種したウェルの数当たりのコロニー数を示す。 ^**コロニーの数当たりの、仕分けの２週間後に蛍光性細胞を示すコロニーの数 を示す。 実施例１１．ＦＶＩＩＩ発現カセットの部位特異的組み込み Ｒｅｐ７８の発現と結び付けられるプラスミドへのＩ ＴＲ ＤＮＡ配列の導入が関心のあるＤＮＡ配列の細胞ゲノムへの組み込みを増 強することは、本願の親出願（１９９６年５月３１日に出願された米国０８／６ ５９，９６１号）において本出願人らによって以前に示されている（５６）。こ の以前の発明は、ＡＡＶ ＩＴＲ配列が隣接するレポーター遺伝子［すなわち、 ｎｅｏ又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子］を有する発現カ セット（以下、組み込みカセットと称する）を上流Ｒｅｐ発現カセットと組み合 わせて含む複数のプラスミドを包含する（図４４、パネルＡ−Ｄ）。実験の結果 は、これらのプラスミド（すなわち、ＧＴ９００３及びＧＴ９０１２）の組み込 み効率がＲｅｐ活性を欠くプラスミド（すなわち、ＧＴ９００４及びＧＴ９０１ ３）よりも約１０倍高いことを示す。このデータは、さらに、Ｒｅｐが宿主細胞 ゲノムへの外来性ＤＮＡの効率的な標的設定された組み込みに必須であることを 示す。これらの結果を鑑みて、本発明は、Ａｄベクターの利点（高力価調製品、 外来性ＤＮＡに対する大きな収容力、複数の細胞型の高水準の感染性）及びＡＡ Ｖの組み込み能力を兼ね備えるハイブリッドベクターを提供する。本発明のこの ハイブリッドウイルスはアデノウイルスとして複製し、組み込みに十分なＡＡＶ 要素を含む。 本発明は、Ｒｅｐ発現カセット及びＡＡＶ ＩＴＲが隣接するＦＶＩＩＩ発現 カセットを有するミニＡｄベクターを含む（図４４）。さらなる外来性ＤＮＡ（ ３６ｋ ｂまで）をこのベクターに挿入することができる。このベクターのさらなる外来 性ＤＮＡはヒトアルブミンゲノム配列（非コーディング）に相当する。Ｒｅｐ発 現カセットはＡＡＶゲノムの１９３乃至２２１６ｂｐを含む。この断片はＩＴＲ の直後で始まり、ｐ５プロモーター及びＲｅｐ７８コーディング配列を通して延 びる。以下に記載される理由により、７つのｔｅｔオペレーターを含む断片をｐ ５プロモーターの上流に導入し、ｔｅｔ−ＫＲＡＢリプレッサー（４２）による ｒｅｐ遺伝子の転写抑制を可能とするために含めた。 細胞内の高濃度のＲｅｐタンパク質が細胞成長抑制性であり、ことによるとミ ニＡｄベクターの複製を妨害する可能性がある。そこで、ウイルスベクターの生 成の間Ｒｅｐの発現を阻止するため、ｔｅｔ−ＫＲＡＶリプレッサーを転写スイ ッチとして提供することができる。この目的を達成するため、本発明は、ｔｅｔ −ＫＲＡＢリプレッサータンパク質を安定に発現する２９３細胞系を提供する。 ｔｅｔ−ＫＲＡＢリプレッサータンパク質を発現しない宿主細胞にウイルスが侵 入すると、それらの細胞内にリプレッサーが存在しないためＲｅｐの発現が生じ 、それによりＡＡＶ ＩＴＲが隣接する配列の細胞ゲノムへの組み込みが促進さ れる。このようにして生成するウイルスベクターは、イン・ビトロ及びイン・ビ ボで、組み込みの頻度及び特異性について試験することができる。 実施例１２． ＡＡＶＳ１のクローン化及びベクターの構築 本発明の態様の１つは、イン・ビボ動物モデルとして用いられる、ヒトＡＡＶ Ｓ１組み込み部位を有するトランスジェニックマウスを生成するための方法論で ある。この動物モデルは、上述のＡＡＶ組み込み機構を含むウイルスベクターの 部位特異的組み込みの試験に用いられる。この動物モデルの開発を目指す第１の 段階は、ＡＡＶＳ１部位のクローン化及びその配列の哺乳動物発現ベクターへの 挿入である。 ＡＡＶＳ１ヒト組み込み部位は、最初に、Ｋｏｔｉｎら（５０）によって８． ２ｋｂのＥｃｏＲＩ断片としてクローン化され、その最初の４０６７ｂｐは配列 決定されでいる。このＤＮＡ配列情報を用いて２種類のオリゴヌクレオチドプラ イマーを設計し、続いてそれらを、ＡＡＶＳ１特異的プローブとして用いるため の２５３ｂｐＰＣＲ産生物の生成に用いた。上方プライマーＵ２４９３（配列番 号５：ＧＣＴＧＴＣＴＧＧＴＧＣＧＴＴＴＣＡＣＴＧＡＴ）はＡＡＶＳ１配列の 塩基対２４９２−２５１５に延びる２３量体であり、下方プライマーＬ２７２２ （配列番号６：ＴＣＡＣＡＡＡＧＧＧＡＧＴＴＴＴＣＣＡＣＡＣＧ）もＡＡＶＳ １配列の塩基対２７２２−２７５４に延びる２３量体である。ＰＣＲ増幅は、テ ンプレートとしての１００ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ並びに 最終濃度１μＭのＵ２４９２及びＬ２７２２プライマー（それぞれ、配列番号５ 及び配列番号６）を用いて以下の通りに行った：９５℃、４分−１サイクル；９ ５℃、０．５分、５５℃、０．５分、７２℃、１分−３５サイクル；７２℃、７ 分−１サイクル。２５３ｂｐのＡＡＶＳ１特異的ＰＣＲ産生物をゲノム・システ ム（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ）（セントルイス、ＭＯ）に送り、そこでヒト Ｐ１ゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いた。８０−１２０ｋｂの サイズ範囲の４つのＰ１クローン（＃６５７６、６５７７、６５７８、６５７９ ）を正しい２５３ｂｐ ＡＡＶＳ１ ＰＣＲ断片を生じるものと同定した。これ らのクローンがＡＡＶＳ１配列を含むことを確認するため、これら４つのＰ１ク ローンからＤＮＡを単離し、ＥｃｏＲＩ単独で、又はＥｃｏＲＩをＥｃｏＲＶと 組み合わせて消化し、サザンブロット分析に用いた。２５３ｂｐのＡＡＶＳ１特 異的ＰＣＲ産生物をプローブとして用いるブロットのハイブリダイゼーションに より、全てのクローンが予想される８．２ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片（図４９Ａ）及 び予想される５．２ｋｂ ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶ断片（図４９Ｂ）を含むこと が明らかとなり、これは、これらがヒトＡＡＶＳ１配列の無傷の完全長コピーを 含むことを示す。８．２ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片をＰ１クローン＃６５７６から単 離し、哺乳動物発現ベクターｐＧＫｎｅｏのＥｃｏＲＩ部位にクローン化した。 得られた１２．９ｋｂのプラス ミドｐＡＡＶＳ１−Ｎｅｏは、ヒトＡＡＶＳ１配列に加えて、哺乳動物細胞での 選択のためのネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏ）有する（図５０）。 実施例１３．ＡＡＶＳ１（＋）ＥＳ細胞系の生成及び特徴付け ＡＡＶＳ１トランスジェニックマウスの生成において用いられるＡＡＳＶ１配 列を含むマウス胚幹（ＥＳ）細胞系を生成するため、ｐＡＡＶＳ１−Ｎｅｏプラ スミドをマウスＥＳ細胞（１２９Ｓｖアグーチ、ゲノム・システムズ）に形質移 入した（図５１）。２５μｇのｐＡＡＶＳ１−ＮｅｏプラスミドＤＮＡをＸｂａ Ｉで直線化し、バイオラッド・ジーン・パルサー（Ｂｉｏｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐ ｕｌｓｅｒ）を用いて電気穿孔法（９７５μＦｄ、２５２ｖ）によりＥＳ細胞に 形質移入した。形質移入細胞を２５０μｇ／ｍｌ Ｇ４１８において１週間選択 した。２４のｎｅｏ−耐性（Ｎｅｏ^R）コロニーが単離され、分化全能性表現型 を維持する細胞系を富化させるため、それらを増殖させ、形態により特徴付けて ＞９５％が“非微分化”であるクローンを得た。１７のＮｅｏ^R ＥＳクローン に加えて非形質移入親ＥＳ細胞系からゲノムＤＮＡを単離し、そのＤＮＡ １０ ０ｎｇをテンプレートとして、プライマーＵ２４９２及びＬ２７２２（それぞれ 、配列番号５及び配列番号６；最終濃度１μＭ）を用いて、ＡＡＶＳ１特異的Ｐ ＣＲに用いた。ＰＣＲの条件は：９５℃、４分−１サイクル；９５℃、０． ５分、５５℃、０．５分、７２℃、１分−３５サイクル；７２℃、７分−１サイ クルであった。図５２に示されるように、１７／１７Ｎｅｏ^R ＥＳクローンに 由来するＤＮＡのＰＣＲでは予想される２５３ｂｐのＡＡＶＳ１ ＰＣＲ産生物 が生成し、一方、非形質移入対照ＥＳ細胞に由来するＤＮＡのＰＣＲ分析では検 出可能なＰＣＲ産生物は生成しなかった。サザンブロット分析を対照及びＡＡＶ Ｓ１（＋）ＥＳ細胞系に対して行い、機能的ＡＡＶＳ１配列が形質移入及びゲノ ム組み込みの後に保存されていることを確認した（図５３）。（ＰＣＲによる検 定で）ＡＡＶＳ１陽性のＥＳ細胞系（ＡＡＶＳ１ ＥＳ＃４及びＥＳ＃３．１６ ）をＥｃｏＲＩにＥｃｏＲＶを組み合わせて消化し、電気泳動してブロットし、 ８．２ｋｂ ＡＡＶＳ１プローブとハイブリダイズさせた。ＥＳ＃４及びＥＳ＃ ３．１６細胞系の両者は予想される５．２ｋｂ及び３．０ｋｂ ＥｃｏＲＩ／Ｅ ｃｏＲＶ断片を含み、これは８．２ｋｂ ＡＡＶＳ１配列全体の組み込みを示す （図５３）。非形質移入親ＥＳ細胞は、このヒトＡＡＶＳ１特異的プローブを用 いてハイブリダイズするバンドを示さなかった。ＡＡＶウイルスはヒトに加えて マウスゲノムに組み込まれるが、ＡＡＶＳ１のマウス相同体（これは未だ同定さ れていない）はヒトの配列とは大きく相違するはずでヒトＡＡＶＳ１プローブと は交差ハイブリダイズしないことが知られているため、対照マウスＥＳ細胞に幾 らかのハイブリダイゼーション が検出されることが予想されていた。これらのＡＡＶＳ１（＋）細胞系ＥＳ＃４ 及びＥＳ＃３．１６の各々を、ＡＡＶＳ１トランスジェニックマウスの生成を目 指す次の胚盤胞微量注入実験に用いた。 実施例１４．ＡＡＶＳ１トランスジェニックマウスの生成 未分化の分化全能性表現型を保存するため、ＡＡＶＳ１陽性ＥＳクローンＥＳ ＃４及びＥＳ＃３．１６を白血病抑制因子（ＬＩＦ−抗分化因子）の存在下にお いて１°ネズミ胚性線維芽細胞支持層上で成長させ、非常に低い継代（Ｐ．２− Ｐ．７）で維持した。第３．５ｐ．ｃ．に胚盤胞段階の胚を過剰***Ｃ５７ＢＬ ／６マウスから集め、Ｍ１６胚培地において維持した。１５−２０個のＥＳ細胞 （ＡＡＶＳ１ ＥＳ＃４又はＥＳ＃３．１６）を３．５日の胚の胞胚腔にライツ （Ｌｉｅｔｚ）ＤＭ−ＩＬＢマイクロインジェクション・ワークステーション（ Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ）を用いて微量注入し た。微量注入に続いて、これらの胚をＭ１６培地に戻し、５％ＣＯ₂中３７℃で ２時間インキュベートして胚盤胞に再度腔を形成させた。続いて、１０−１５個 の注入胚盤胞を、交尾後（ｐ．ｃ．）第２．５日の偽妊娠ＣＧ６Ｆ₁仮母の子宮 に移した。子宮に移入された後、それらの胚盤胞は子宮壁に植え付けられ、ＡＡ ＶＳ１陽性ＥＳ細胞が胚の内部細胞塊に取り込 まれてそれらの遺伝情報を胚の発生に渡し、その結果約１７日後にトランスジェ ニック（キメラ）子孫が誕生する。現在までに４０を上回る高率で雄キメラ（始 祖）が生成されている。ＥＳ細胞誘導アグーチ（茶色）毛皮色遺伝子の高率の寄 与を示すこれらのキメラ始祖の幾つかの例が図５４に示されている。キメラマウ スにおいてＡＡＶＳ１導入遺伝子を検出するためにＰＣＲ分析を行った。ゲノム ＤＮＡをＡＡＶＳ１キメラ及び非キメラ同腹子の尾から単離し、これらのＤＮＡ １００ｎｇを、ＡＡＶＳ１特異的プライマーＵ２４９２及びＬ２７２２（それ ぞれ、配列番号５及び配列番号６）を最終濃度１μＭで用いるＰＣＲ分析により スクリーニングした。ＰＣＲの条件は：９５℃、４分−１サイクル；９５℃、０ ．５分、５５℃、０．５分、７２℃、１分−３５サイクル；７２℃、７分−１サ イクルであった。正しい２５３ｂｐ ＡＡＶＳ１ ＰＣＲ産生物が高率キメラに 由来する尾ＤＮＡにおいては実際に検出された（図５７、レーン７）が、非キメ ラ同腹子の尾ＤＮＡ又は１０％未満のアグーチ毛皮色キメラ現象を示す低率キメ ラにおいては検出されなかった（図５５、それぞれレーン５及び６）。したがっ て、ヒトＡＡＶＳ１組み込み配列をクローン化し、それをマウス胚性幹細胞に形 質移入し、これらのＥＳ細胞を胚盤胞段階の胚に微量注入し、得られたトランス ジェニックマウスのゲノム内にこのヒト導入遺伝子の存在を示すことに成功して いる。これらのキメラ始祖は、 現在、ヒトＡＡＶＳ１導入遺伝子の生殖系列伝達を得るために野生型Ｃ５７ＢＬ ／６の雌と共に飼育されている。ひとたび生殖系列伝達が達成されると、そのＦ １ヘテロ接合体子孫を飼育することでホモ接合ＡＡＶＳ１トランスジェニックマ ウス系が得られる。次に、このホモ接合系を用いてＡＡＶウイルスベクター、ハ イブリッドアデノウイルス／ＡＡＶウイルスベクター、又はＡＡＶＳ１部位での 組み込みに必要とされるＡＡＶ ＩＴＲ及びＲｅｐ７８／６８遺伝子を含む他の あらゆるプラスミドベクターのいずれかのＡＡＶＳ１部位特異的組み込みの試験 に用いることができる。このＡＡＶ導入遺伝子は、ウイルスの感染（Ｉ．Ｖ．注 入の後）により、又はリガンド介在ＤＮＡ／リポソーム複合体を用いることによ り、イン・ビボでＡＡＶＳ１トランスジェニックマウスに送達することができる 。部位特異的組み込みの頻度、組み込まれた導入遺伝子の安定性及び安定なタン パク質発現の持続期間（すなわち、ヒト第ＶＩＩＩ因子又は第IX因子）は標的細 胞への組み込みの後に評価することができる。 ゲノムにＡＡＶＳ１配列が組み込まれているトランスジェニックマウスへのア デノ関連組み込み要素を含むウイルスベクターのイン・ビボ送達の効率は以下の 方法で試験することができる。本発明のウイルスベクターをトランスジェニック マウスの静脈内又は門脈に注射する。このベクターは医薬組成物の一部であって もよく、且つ リポフェクタミン（ギブコ／ＢＲＬ）のような脂質及び／又は肝臓特異的リガン ド（７９、８０）と複合体を形成していてもいなくてもよい。マウスにウイルス ベクターを投与した後、血液試料を１年まで、もしくはそれ以上、毎週尾の静脈 から採取して導入遺伝子の発現の持続を評価する。ウイルスベクターのエフェク ター又はレポーター遺伝子の発現水準は、ノーザンブロット、ＲＮＡ分解酵素保 護検定、又はＰＣＲのような技術を用いて測定する。ＦＶＩＩＩミニＡｄの試験 において、ＦＶＩＩＩはＥＬＩＳＡ検定により検出する。導入遺伝子の発現の持 続を決定するため、各血液試料中のエフェクター又はレポーター遺伝子の発現水 準を互いに比較する。また、ベクターの部位特異的組み込みを決定するため、そ の動物の肝臓組織からゲノムＤＮＡを単離する。その後、ＡＡＶＳ１特異的プラ イマー及びこのベクターの配列と相同の配列を含むプライマーを用いるゲノムＤ ＮＡのＰＣＲ分析を行う。このベクターの、トランスジェニック動物ゲノムのＡ ＡＶＳ１部位での部位特異的組み込みにより、ＡＡＶＳ１及びベクター配列の両 者を含む産生物が生じる。増幅したＰＣＲ産生物は、ウイルスベクターがその動 物のＡＡＶＳ１部位に組み込まれているのであれば、ベクター配列を含む。 実施例１１． Ａ．ヒトＡＡＶＳ１組み込み配列を有するＦＶＩＩＩ トランスジェニックマウス ｎｅｏ又はＧＦＰレポーター遺伝子のいずれかを含むＡＡＶ／ＩＴＲ−Ｒｅｐ ベクター（それぞれ、ＧＴ９００３及びＧＴ９０１２）をヒト２９３細胞に形質 移入した。次に、これらの細胞の抽出物を、サザンブロットにより、内在性ＡＡ ＶＳ１部位でのこのベクターの部位特異的組み込みについて検定した。ＡＡＶＳ １での組み込みは、ＡＡＶ−ＩＴＲ／Ｒｅｐベクターのｎｅｏ又はＧＦＰ）バー ジョン（それぞれ、ＧＴ９００３又はＧＴ９０１２）のいずれかを形質移入した 後に得られた試料においで５０％の頻度で観察された。これらの結果は、これら のＡＡＶ ＩＴＲ及びＲｅｐコーディング領域がＡＡＶＳ１での高効率の部位特 異的組み込みを導くのに十分なものであることを示す（５６）。ＡＡＶ−ＩＴＲ ／Ｒｅｐ組み込み要素を含むミニＡｄ−ｈＦＶＩＩＩベクターがイン・ビボでＡ ＡＶＳ１を標的とし、部位特異的な様式で組み込まれ、且つｈＦＶＩＩＩの長期 間の発現を維持することを示すため、動物モデル系を開発した。 本発明は、そのゲノム内にヒトＡＡＶＳ１組み込み部位を有するトランスジェ ニックマウスを包含する。このトランスジェニックマウスは、図５１に示される 胚幹細胞操作技術（４３）を用いて生成される。８．２ｋｂヒトＡＡＶＳ１配列 全体及びｎｅｏ（もしくはＮｅｏ）選択マーカーを含む発現ベクターを構築する 。このＡＡＶＳ１／Ｎｅｏベクターを分化全能性マウス胚幹（ＥＳ） 細胞に移入してＮｅｏＲ、ＡＡＶＳ１⁺ＥＳ細胞クローンを得、続いてこれをマ ウス胚盤胞段階の胚に微量注入しで仮母の子宮に移植する。移植の後、このＡＡ ＶＳ１⁺ ＥＳ細胞は正常な胚発生を再開し、それらのゲノム情報（ヒトＡＡＶ Ｓ１配列を含む）を発生する胚に渡す。キメラ（トランスジェニック）子孫はＥ Ｓ細胞誘導アグーチ茶毛皮色の存在によって同定する。次に、キメラ始祖を野生 型Ｃ５７ＢＬ／６マウスと共に飼育して導入遺伝子の生殖系列伝達を得る。Ｆ１ ヘテロ接合体を飼育して、そのゲノムにヒトＡＡＶＳ１組み込み配列が安定に取 り込まれているホモ接合マウス系を得る。次いで、このマウスモデルに尾の静脈 又は門脈を介してＡＡＶ−ＩＴＲ／ミニＡｄ−ＦＶＩＩＩベクターを注射し、イ ン・ビボ形質導入効率、ヒトＡＡＶＳ１配列での組み込み、及び導入遺伝子発現 の持続を評価する。 Ｂ．ヒトＦＶＩＩＩに対して寛容化されたトランスジェニックマウス ＦＶＩＩＩ寛容化マウスモデル系も本発明によって提供される。過去、ＦＶＩ ＩＩ寛容化は、新生児マウスにＦＶＩＩＩを一時的に注入することにより達成さ れている（４４）。本発明は、発生期特異的な様式で作用するプロモーターの制 御下にヒトＦＶＩＩＩ遺伝子を有するマウスを包含する。このようなプロモータ ーにはα−胎児タンパク質遺伝子又は胚性グロビン遺伝子、イプシロンのものが 含まれ得るが、これらに限定されるものでは ない。α−胎児タンパク質プロモーターは、成熟動物においては不活性である早 期発生段階特異的プロモーターの例である（４５）。胚性グロビン遺伝子、イプ シロンは、本発明において用いることができる発生的に調節される遺伝子の別の 例である。α−胎児タンパク質プロモーターの制御下において、遺伝子の発現は 肝臓に限定され、活性化については肝臓特異的転写因子に依存する（４６、４７ ）。ＦＶＩＩＩ発現の正常部位及びＦＶＩＩＩ遺伝子送達の好ましい標的臓器が 肝臓であるため、同様に発生的に調節される肝臓特異的プロモーター要素が好ま しい。α−胎児タンパク質プロモーター（ＡＦＰ）はこれらの基準の両者を満た す。α−胎児タンパク質プロモーターは未分化ＥＳ細胞においては作用しないが 、分化の間に誘発される（４８）；これは、そのようなものとして、トランスジ ェニックマウスにおけるｈＦＶＩＩＩの発現の制御に用いることができる。 本発明の目的の１つは、異種間ヒトＦＶＩＩＩタンパク質に対して寛容化され ているトランスジェニックマウスを提供することである。このトランスジェニッ クマウスは、アデノウイルスもしくはＡＡＶベクター系を用いて、又は免疫単離 装置内でＦＶＩＩＩ分泌細胞を用いて、イン・ビボでのヒトＦＶＩＩＩの送達の 試験に用いることができる。この系においては、ヒトＦＶＩＩＩは、発生するト ランスジェニックマウスにおいてＡＦＰプロモーターの制御の下に胚性に発現す る。これにより、ＨＦ ＶＩＩＩがマウスから“自己”と見なされ、寛容が生じる。マウスがｈＦＶＩＩ Ｉに対して寛容であるため、異種間ヒトＦＶＩＩＩ導入遺伝子が治療用ベクター （すなわち、ＡＡＶ−ミニＡｄ−ＦＶＩＩＩ）によって送達されたときに、それ に対する免疫反応は生じない。このようにして、ウイルスベクター主鎖の抗原性 の正確な評価が、イン・ビボでの遺伝子発現の持続の信頼のおける測定に加えて なされる。また、ＡＦＰ−ＦＶＩＩＩ導入遺伝子は胚形成の間にのみ発現する（ 動物が成熟した後には発現しない）ため、正確な濃度のｈＦＶＩＩＩが成熟トラ ンスジェニックマウスの肝臓に送達される。 実施例１６．ＡＦＰ−ＦＶＩＩＩ−Ｎｅｏベクターの構築 トランスジェニックマウスの子宮内寛容化を達成するため、細胞において時間 的に調節された胚特異的な様式でヒト第ＶＩＩＩ因子の発現を駆動することが可 能なベクターを生成するのにマウスα−胎児タンパク質（ＡＦＰ）プロモーター を用いた。プラスミドＧＴ２０５７は７．５ｋｂ ＡＦＰプロモーター配列を含 み、この配列は最初にＵｒａｎｏらによって特徴付けられた（３３）。完全長ヒ ト第ＶＩＩＩ因子遺伝子を含む７．２ｋｂ ＮｏｔＩ断片をｐＣＭＶ−ＦＶＩＩ Ｉ（ＧＴ２０５１）から単離し、ＧＴ２０５７のＡＦＰプロモーターの後ろのＮ ｏｔＩ部位にクローン化した（図５６）。続いて、Ａ ＦＰプロモーター及びｈＦＶＩＩＩ遺伝子を含むカセットをＡａｔＩＩ／Ｓａｌ Ｉ断片としてＮｅｏ発現ベクターｐ；ＧＫＮｅｏのＡａｔＩＩ／ＸｈｏＩにクロ ーン化した。得られた２０．２ｋｂのベクター、ｍＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ−ｐＧ ＫＮｅｏ（図５６）はｈＦＶＩＩＩ遺伝子を胚性プロモーター（ＡＦＰ）の制御 の下に有し、且つ哺乳動物細胞における選択のためのＮｅｏ発現カセットを有す る。 実施例１７．ＡＦＰ−ＦＶＩＩＩ（＋）ＥＳ細胞クローンの生成及び特徴付け トランスジェニックマウスの生成において用いられる、ＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ 配列を含むマウス胚幹（ＥＳ）細胞を生成するため、ｍＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ− ｐＧＫＮｅｏベクターをマウスＥＳ細胞に安定に形質移入した。２０μｇのＡＦ Ｐ−ＦＶＩＩＩ−Ｎｅｏ ＤＮＡをＡａｔＩＩで直線化し、バイオラッド・ジー ン・パルサーを用いて電気穿孔によりＥＳ細胞に移入した（９７５μＦｄ、２５ ２ｖ）。電気穿孔の後、ＥＳ細胞を胚性線維芽細胞支持層上で２５０μｇ／ｍｌ Ｇ４１８中において増殖させてＮｅｏ^Rクローンについて選択した。４８のＮ ｅｏ^Rクローンを取り出し、増殖させ、コーテストキットを用いて機能的第ＶＩ ＩＩ因子タンパク質について分析した。これらの４８のクローンのいずれの組織 培養上清においてもＦＶＩＩＩは検出されなかった。ゲノムＤＮ Ａを１３のＮｅｏ^R ＥＳクローン及び非形質移入親ＥＳ細胞から単離し、Ｘｂ ａＩで消化して、ＧＴ２０５１に由来する７．２ｋｂ ＦＶＩＩＩ ＮｏｔＩ断 片をプローブとして用いるサザンブロット分析によりスクリーニングした。１１ ／１３の形質移入クローンが予想される７．８ｋｂ ＸｂａＩ断片を含んでおり 、ｈＦＶＩＩＩ配列はもちろん、ＡＦＰプロモーターの３’末端の５００ｂｐの 存在も確認された。これらのＡＦＰ−ＦＶＩＩＩ（＋）ＥＳクローンのうちの４ つに加えて親ＥＳ細胞対照の分析が図５７に示されている。これらの結果は、ｈ ＦＶＩＩＩ導入遺伝子がＮｅｏ^Rクローン内に存在していたことを示す。 ＡＦＰプロモーターがＥＳ細胞内において機能的であったかどうかを試験する ため、ＡＦＰプロモーターをＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ断片としてレポータープラス ミドｐＥＧＦＰ−１（クローンテック）にクローン化し、緑色蛍光タンパク質（ ＧＦＰ；図５８を参照）の発現を駆動させた。このｐＡＦＰ−ＥＧＦＰ−１プラ スミドをＥＳ細胞及びＨｅｐＧ２細胞（高水準のα−胎児タンパク質を発現する ことが知られる肝細胞系）の両者に一時的に形質移入し、ＦＩＴＣフィルターを 備えるニコン・ディアフォト（Ｎｉｋｏｎ Ｄｉａｐｈｏｔ）広範囲顕微鏡を用 いる直接可視化により、２４時間後に緑色蛍光性細胞について検査した。ＧＦＰ の発現はＨｅｐＧ２細胞系においては検出されたがマウスＥＳ細胞においては検 出 されず（データは示さず）、ＡＦＰプロモーターは未分化ＥＳ細胞においては作 用しないが分化した肝細胞系においては作用することが確認された。これらの結 果は、ＡＦＰプロモーターが末分化Ｆ９胚幹細胞において活動休止状態であり、 レチノイン酸で処理された後に分化するように誘発されたときに活性化されるこ とを示すＶｏｇｔら（４８）のものと一致する。発現が期待される細胞系におい てｍＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ−ｐＧＫＮｅｏベクターが機能的であったことを確認 するため、ｍＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ−ｐＧＫＮｅｏベクターをＨｅｐＧ２細胞に 形質移入し、１０ラ濃縮上清を色素生成コーテストＦＶＩＩＩ検定（ファルマシ ア、ピスカタウェイ、ＮＪ）を用いてｈＦＶＩＩＩタンパク質の発現について分 析した。ヒトＦＶＩＩＩが３．０ｎｇ／１０⁶細胞／２４時間の濃度で検出され 、これによりＡＦＰ−ＦＶＩＩＩ構築体が機能的であり、且つ７．５ｋｂ ＡＦ Ｐプロモーター／エンハンサー要素の組織特異的及び発生特異的発現パターンが 保存されていたことが確認された。ＡＰＦ−ＦＶＩＩＩベクターが相応に機能性 であることが示されたこととで、ＡＦＰ−ＦＶＩＩＩ（＋）ＥＳクローンのうち の１つ、クローン＃２２（図５７、レーン３）をその未分化成長表現型に基づい て選択し、胚盤胞微量注入実験に用いた。 実施例１８．ｈＦＶＩＩＩ寛容化トランスジェニックマ ウスの生成 本発明は、異種間ヒト第ＶＩＩＩ因子タンパク質に対しで子宮内で寛容化され ているトランスジェニックマウスを提供する。このトランスジェニックマウスは 、アデノウイルスもしくはＡＡＶベクター系を用い、又は米国特許５，３１４， ４１７号；５，３４４，４５４号；５，４２１９２３号；５，４５３，２７８号 ；５，５４５，２２３号；もしくは５，５６９，４６２号に記述されるもののよ うなセラサイト（ＴｈｅｒａＣｙｔｅ）免疫単離装置においてＦＶＩＩＩ分泌細 胞を用いるイン・ビボでのヒトＦＶＩＩＩの送達の試験に用いられる。ｈＦＶＩ ＩＩが発生中のトランスジェニックマウスにおいてＡＦＰプロモーターの制御の 下で胚性に発現するため、治療用ベクター（すなわち、ＡＡＶ−ミニＡｄ−ｈＦ ＶＩＩＩ）によって送達されるｈＦＶＩＩＩはマウスの免疫系によって梼ウ己剥R 原として認識される。そのようなものとして、ｈＦＶＩＩＩタンパク質に対する 寛容が生じる。このトランスジェニックマウスはｈＦＶＩＩＩに対しで寛容化さ れているため、“異種間”ヒトＦＶＩＩＩタンパク質に対する免疫反応が生じる ことはなく、ウイルスベクター主鎖の抗原性の正確な評価及びイン・ビボでの遺 伝子発現の持続の現実的な測定を決定することができる。また、ＡＦＰ−ＦＶＩ ＩＩ導入遺伝子は主として胚形成の間に発現するため、成熟トランスジェニック マウスにおいてこのベクターによる形質導入の結果とし て肝臓が発現するｈＦＶＩＩＩタンパク質の量を正確に定量することができる。 ｈＦＶＩＩＩ寛容化トランスジェニックマウスを生成するためのスキームはそ の概要が図５９に記されている。ＡＦＰ−ＦＶＩＩＩ（＋）ＥＳクローン＃２２ からのＥＳ細胞をＣ５７ＢＬ／６胚盤胞に微量注入し、仮母の子宮内に移植した 。現在までに、ＥＳクローン＃２２を用いで４匹のキメラ子孫が生み出されてい る。それらを野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスとつがわせて生殖系列伝達について試 験し、生殖系列始祖を飼育してホモ接合ＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩトランスジェニッ クマウス系を得る。このキメラ子孫は、定義上、それらの組織の全てにおいてＡ ＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ導入遺伝子のモザイク発現を示すため、ホモ接合系の生成を 待つことなく、イン・ビボ遺伝子送達実験にも直接用いられる。このスキームに よって生成されるトランスジェニック動物に、最初にｈＦＶＩＩＩタンパク質を 注射することにより抗原投与して飼育し、ヒトタンパタ質に対する抗体について スクリーニングしてｈＦＶＩＩＩに対する寛容化を確かなものとする。また、こ のＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ寛容化トランスジェニックマウスを、成体動物における ｈＦＶＩＩＩの“漏出性”出現についても試験する。少量のｈＦＶＩＩＩタンパ ク質が成体トランスジェニック動物において生成される場合には、治療用ベクタ ー又はタンパク質送達装置によって送達されるｈＦＶＩＩＩの濃度から減ずるこ とができるようにそれを正確に定量する。トランスジェニック動物がｈＦＶＩＩ Ｉに対して寛容化され、且つ有意の水準で内在性ヒトタンパク質を発現すること がないのであれば、それをｈＦＶＩＩＩのイン・ビボ送達の効率の試験に用いる ことが可能であり、遺伝子発現の持続、組織分布、及び導入遺伝子以外の送達系 の要素（すなわち、ベクター主鎖、ウイルス被覆タンパク質）に対する免疫反応 を分析することができる。他のパラメータもこのトランスジェニック動物を用い て試験することができる。 実施例１５．第２世代トランスジェニック動物モデル ａ．ＦＶＩＩＩノックアウトマウスとのＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ寛容化マウスの 飼育 マウス第ＶＩＩＩ因子遺伝子の標的設定破壊（遺伝子ノックアウト）が行われ ているトランスジェニックマウス株が、ジョンホプキンス大学及びペンシルバニ ア大学と結ばれた非排他的使用制限付きライセンスにより得られでいる。このマ ウス系はｍＦＶＩＩＩの欠乏が深刻であり、したがって血友病Ａの有用なモデル である（５１）。ヒト第ＶＩＩＩ因子に対して寛容化された我々のトランスジェ ニックマウスを全体に的にマウス第ＶＩＩＩ因子が欠乏するマウスと交雑させる ことにより、ｈＦＶＩＩＩのイン・ビボ送達を試験するための“クリーン”モデ ルを生成することが可能である。ｈＦＶＩＩＩと交差反 応する潜在能力を有するマウスＦＶＩＩＩが存在しない状況において、ｈＦＶＩ ＩＩの正確な定量。加えて、この二重トランスジェニックマウスは、遺伝子治療 を用いる血友病Ａの表現型修正の有用なモデルを提供する。 ｂ．三重トランスジェニックマウス 本発明のさらなる態様は、上記３種類のトランスジェニック動物全てを交雑さ せて“三重トランスジェニック”マウスモデルを生成することを含む。ヒトＦＶ ＩＩＩに対して寛容化され、且つマウスＦＶＩＩＩが欠乏する、前項に記述され るマウスをＡＡＶＳ１トランスジェニックマウス系と交雑飼育する。この三重ト ランスジェニックマウスモデルは、ＡＡＶ ＩＴＲ／Ｒｅｐ組換え系によるＡＡ ＶＳ１での部位特異的組み込み；寛容化された導入遺伝子に対する免疫反応を伴 わないヒトＦＶＩＩＩ導入遺伝子の送達及び長期間の発現；ヒトＦＶＩＩＩの成 体発現の欠如に加えて交差反応性マウスＦＶＩＩＩタンパク質の欠如による送達 されたｈＦＶＩＩＩの正確な定量；並びに、最後に、深刻なＦＶＩＩＩの欠乏（ 血友病Ａ）の遺伝上及び表現型上の修正を含む我々のＡＡＶ−ミニＡｄ−ｈＦＶ ＩＩＩベクター系の全ての側面の試験に好ましく適する。 ｃ．緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に対して寛容化されたトランスジェニック マウス ＧＦＰ発現カセットを様々なウイルスベクターにレポーター遺伝子として組み 込み、新規ミニＡｄベクター、 ＡＡＶベクター、及び新規バージョンのヘルパーウイルスを開発することが好都 合である。ウイルス感染、増殖、ヘルパー補完及び標的細胞へのイン・ビボ送達 は緑色蛍光の目視検出により容易に理解される。導入遺伝子によってコードされ るタンパク質に対する免疫応答が、アデノウイルスベクターの注入後の遺伝子発 現の安定性に負に衝撃を与え得ることが示されている（３０）。マウスに注入し た後のＧＦＰ発現の持続期間を短くし得る、ベクターに組み込まれるＧＦＰ導入 遺伝子に対する免疫応答を排除するため、ＧＦＰ寛容化トランスジェニックマウ スを開発する。図５８に示されるＡＦＰ−ＥＧＦＰ−１ベクター、又はＧＦＰの 膵臓特異的発現のためのラットインシュリンプロモーター（ＲＩＰ）を含む類似 のベクターをこの目的で用いることができる。 安定なＮｅｏ^R ＲＩＰ−ＧＦＰ ＥＳ細胞系［ＲＩＰ−ＧＦＰ（＋）ＥＳ］ を開発するため、ＲＩＰ−ＥＧＦＰ−１ベクター（図６０）をマウスＥＳ細胞の 形質移入に用いた。ＲＩＰ−ＧＦＰ（＋）ＥＳ細胞を、ＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ寛 容化マウスモデルの生成について説明されるもの（図５９）と同じ様式で、ＡＦ Ｐ−ｈＦＶＩＩＩベクターの代わりにＲＩＰ−ＥＧＦＰ−１ベクターを用いて、 ＧＦＰ寛容化トランスジェニックマウスの生成に用いる。このようにして生成し たＲＩＰ−ＧＦＰ寛容化マウスは、新規アデノウイルスベクター又はＧＦＰ導入 遺伝子をレポーターとして用いる他の送達系を開発す るための有用な研究手段を提供する。 実施例１２に提供されるＡＡＶＳ１トランスジェニックマウス、実施例１５の ｈＦＶＩＩＩ寛容化トランスジェニックマウス、及び実施例１９ＣのＧＦＰ寛容 化トランスジェニックマウスを含む上述のトランスジェニック動物モデルは全て 、導入遺伝子（それぞれ、ｐＡＡＶＳ１−Ｎｅｏ、ｍＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ−ｐ ＧＫＮｅｏ及びＲＩＰ−ＥＧＦＰ−１）の直接ＤＮＡ注入により代わりに生成さ せることができる。これは、上述のＥＳ細胞技術を用いる代わりに、導入遺伝子 をマウス単細胞卵子の雄性前核に注入してトランスジェニックマウスを生成する ことにより達成される。当業者にとっては、これはトランスジェニックマウスを 生成するための明白な代替法である。したがって、本発明は、本願において論じ られる方法のいずれかによって生成することができる（５７−６１）。 実施例２０．エピソームミニＡｄウイルスの設計 ミニウイルスベクターによって送達される導入遺伝子の長期間の発現を可能に する要素を提供する別のアプローチとして、本発明は、標的細胞の感染の際にミ ニウイルス配列から自己複製エピソームを切除することを可能にする部位特異的 リコンビナーゼベースの系の設計を提供する。 部位特異的リコンビナーゼはＤＮＡの操作に広く用い られている。部位特異的リコンビナーゼは２つの適切な標的配列の間の正確な組 換えを触媒するもので、ＤＮＡ特定の部位で開裂させ、それを開裂されたＤＮＡ の第２部位にライゲートする（再検討のためには、参考文献１１１を参照）。バ クテリオファージＰ１に由来するｃｒｅ／ｌｏｘＰ系（１１１）又は酵母に由来 するＦＬＰ／ＦＲＴ（１１２）のような幾つかの系が同定され、特徴付けられて いる。両リコンビナーゼ（ｃｒｅ及びＦＬＰ）の認識部位（ｌｏｘＰ及びＦＲＴ ）は共通の構造を共有する：これらは中央コア領域（乗換え部位）に隣接する２ つの逆反復要素（リコンビナーゼ結合部位）を有する。（コア領域によって決定 される）これらの標的部位の方向は最終的な結果に影響を及ぼす：同じ分子上の ２つの平行な部位の間の組換えは介在する配列の切除を生じ、各々標的部位を有 する２つの分子を生成する。２つの逆平行部位の間の組換えは介在配列の逆転を 生じる。異なる分子における２つの平行な部位の間の組換えは標的部位が隣接す る配列の組み込みを生じる。切除は分子内の現象であるため、組み込みよりも好 ましい。 本発明の設計において、リコンビナーゼは真核細胞複製起点（ｏｒｉ）を有す る配列の切除に用いられる。哺乳動物ｏｒｉ配列及び結合因子は現在までには特 徴付けられていない。しかしながら、幾つかのウイルスｏｒｉ配列及び複製の開 始に必要とされるウイルスタンパク質が特徴付けられ、プラスミドベクターに組 み込まれてお り、その例の幾つかにはシミアンウイルス４０に由来するＳＶ４０ ｏｒｉ／Ｔ −Ａｇ（１１３）及びエプスタイン・バーウイルスに由来するｏｒｉＰ／ＥＢＮ Ａ−１（１１４）が含まれるがこれらに限定されるものではない。これらの要素 は真核細胞において自立的に複製し、且つ選択圧に対して安定に維持されるプラ スミドの生成を可能にしている。ｏｒｉＰを含み、且つＥＢＮＡ−１を発現する プラスミドは細胞サイクル当たり１回複製し（１１５、１１６）、培養において 細胞から選択圧が除去されると失われる。しかしながら、肝細胞のような非*** 細胞におけるエピソームブラスミドの安定性に関するイン・ビボデータは存在し ない。非***細胞（すなわち、分化した細胞）において、且つ選択なしで、エピ ソームが長期間安定のままであり得ることが予想される。本発明者らは、ミニウ イルスＤＮＡにｏｒｉ配列を組み込むことにより非***細胞における導入遺伝子 の発現を長期化することが可能であるものと信じる。 エピソームミニウイルスには以下のものが含まれるがこれらに限定されるもの ではない（図６１）： ａ）リコンビナーゼ発現カセット：ウイルスの生成に用いられる細胞における 不適切な発現は２つの組換え部位の間に含まれる配列の切除を促進するため、リ コンビナーゼは標的細胞内でのみ発現しなければならない。このため、発現は、 プロモーターの上流に転写リプレッサーの結合配列を加えるか（例えば、ｔｅｔ Ｏ）、又は組 織特異的プロモーター（例えば、アルブミンプロモーター、第ＶＩＩＩ因子プロ モーター）を用いることにより厳密に制御される。 ｂ）複製起点（ｏｒｉ）：これはＤＮＡの複製を開始させるための配列及び複 製に必要とされる他のあらゆる要素（例えば、起点の配列を認識するＤＮＡ結合 タンパク質）を含んでいなければならない。 ｃ）導入遺伝子：これは組換え部位（５秩ｊ及びポリＡシグナル配列（３秩ｊ が隣接するあらゆる治療用又はレポーター遺伝子であり得る。これは、そのＤＮ Ａの環化の際に標的細胞内でのみ発現する。 ｄ）リコンビナーゼ標的部位：平行な方向の２つの部位が必要であり、一方は プロモーターとリコンビナーゼｃＤＮＡとの間に配置され、他方は治療用遺伝子 ｃＤＮＡの上流に配置される。 ｅ）アデノウイルスＩＴＲ：これはミニウイルスの複製及びパッケージ化に必 要である。 ｆ）スタファーＤＮＡ配列：ミニウイルスのサイズをパッケージ化可能な長さ まで増加させる必要がある場合。スタファーＤＮＡ配列はいかなる長さのいかな るＤＮＡ断片であってもよい。 この設計で、ミニウイルスが増幅する間リコンビナーゼは発現しない。ミニウ イルスベクターが標的細胞に送達されると、プロモーターが機能的になってリコ ンビナーゼが発現し、２つのリコンビナーゼ標的部位の間に含 まれる配列を切除して環化する。リコンビナーセプロモーターは導入遺伝子プロ モーターとなり、複製起点が存在することでそのプラスミドの安定な維持が可能 となり、したがって、導入遺伝子の安定な発現が保証される。 実施例２１．癌治療のためのミニＡｄの設計 現在、遺伝子治療を用いる癌の治療に対する最も有効なアプローチの１つは、 腫瘍−宿主の関係を変化させ、免疫系を用いて悪性細胞の認識及び破壊を容易に することである。腫瘍を有する個人において、有効な免疫応答の欠如は、部分的 には、腫瘍細胞の弱い免疫原性、免疫同時刺激の欠如、又は腫瘍特異的免疫抑制 環境のいずれかのためである可能性がある。腫瘍細胞のサイトカイン介在遺伝子 移入は、免疫系を増強してより有効な抗腫瘍応答を導く方策の１つを提供する（ １１７）。近年、多くのサイトカイン遺伝子が単離され、クローン化され、特徴 付けられている。これらの免疫調節因子の特定のもの、例えばＩＬ−２、の全身 投与により一定の割合の抗腫瘍応答が生じている。しかしながら、臨床効果を生 成させるのに必要とされる高い濃度のため、これらの生物製剤の多くはその使用 に毒性が伴う。極めて望ましくない効果と全身投与による最低限の治療結果との 組み合わせは、腫瘍細胞を遺伝的に加工してサイトカインそれ自体を生成させる 努力を刺激している（１１８）。 動物モデルにおいて、遺伝子改変腫瘍細胞がワクチン として抗腫瘍応答の刺激に用いられている（１１７、１１９）。腫瘍指向サイト カイン遺伝子移入の訴求点は、局部的に生成されるサイトカインが免疫学的によ り効率的であり、全身的な毒性を生じないことである。このサイトカイン（１種 もしくは複数）の高い局所濃度で示される、新生物細胞上に発現する腫瘍抗原は 、外来性サイトカインの投与では再現することができない免疫学的微小環境を創 出する。サイトカイン生成性腫瘍細胞によって創出されるこの免疫学的微小環境 は細胞毒性Ｔリンパ球の生成に有効である。幾つかの異なる動物モデルにおいで 、サイトカイン生成性腫瘍細胞は腫瘍原性の低下及び免疫学的に重要な分子の発 現の増加に有効であることが示されている（１１７、１１９）。初期抗腫瘍拒絶 には非特異的炎症応答が付随するように思われる。しかしながら、サイトカイン 分泌腫瘍細胞の拒絶は、ほとんどの場合、Ｔ細胞依存性の全身性腫瘍特異的免疫 の生成につながった。 予め存在する腫瘍免疫原性に対する要求はほとんどの遺伝子移入モデルで確立 されていない；しかしながら、多くの十分に特徴付けられている腫瘍細胞系は高 度に分化し、且つ免疫原性である。幾つかの系において、非免疫原性腫瘍がサイ トカイン遺伝子移入の後に免疫を生成することが示されている。さらに、腫瘍指 向遺伝子移入モデルの大部分は、これらの悪性物の急速な成長が免疫治療が介入 する時間をほとんど与えないため、それ自体 では既存腫瘍負荷の存在下において宿主を治療する研究の役に立たない（１１９ ）。 近年の研究は、腫瘍細胞によるＴＧＦβの分泌の低下が癌遺伝子治療の重要な アプローチであり得ることを示している（１２０、１２１）。一組の実験におい て、Ｆａｋｈｒａｉらは、ラットグリアサルコーマ（ｇｌｉｏｓａｒｃｏｍａ） 細胞系におけるそのサイトカインの発現の阻害にＴＧＦβのアンチセンスを用い た。このアンチセンス改変肺瘍細胞での腫瘍坦持ラットの免疫は、対照ベクター で改変した腫瘍細胞での動物の免疫と比較して動物の高い生存を生じた。異なる アプローチを用いて、Ｉｓａｋａらは、骨格筋にｃＤＮＡコーディングデコリン を形質移入することにより、ラットにおける繊維性疾患の量を低下させることが 可能であった。デコリンはＴＧＦβの発現を阻害する小プロテオグリカンである 。したがって、ＴＧＦｂの発現を阻害する２つの異なるアプローチが癌又は前癌 の２種類の異なるモデルにおける効力を示している。 加えて、Ｂ７によるＴ細胞の同時刺激がＴ細胞の活性化に対する正及び負の両 者の効果を有することが新たな証拠により示されている（１２２）。Ｔ細胞の他 の同時刺激性分子、例えば、ＩＣＡＭ−Ｉ、ＬＦＡ−３及びＶＣＡＭ−Ｉも適切 な抗腫瘍応答の誘発に関連付けられている（１２３）。当業者の間での一般的な 総意は、これらの同時刺激性信号のうちの最も重要なものがＴ細胞上 のＣＤ２８とその一次リガンドＢ７−１（ＣＤ８０）及び抗原提示細胞表面上の Ｂ７−２（ＣＤ８６）との相互作用によってもたらされるものであるというもの である（１２４）。様々なモデル系において、Ｂ７ｃＤＮＡが形質移入された腫 瘍細胞が、改変及び非改変腫瘍細胞の両者に対する強力な抗腫瘍応答を誘発した 。同様にＴ細胞上に発現する分子であるＣＴＬＡ−４は、ＣＤ２８よりも非常に 高い親和性でＢ７−１及びＢ７−２を結合する。幾つかの研究の結果は、ＣＴＬ Ａ−４がＴ細胞応答性の負の調節因子として作用し、ＣＴＬＡ−４−Ｂ７相互作 用によってもたらされる阻害の遮断が腫瘍細胞に対するＴ細胞応答を増強し、且 つ抗腫瘍活性を高める可能性を生じることを示す。Ｌｅａｃｈらは、ＣＴＬＡ− ４に抗体を注入した結果、マウスモデルにおける予め確立された腫瘍を含む腫瘍 の拒絶が生じることを示した（１２４）。これは、遺伝子移入実験の設計におい ては、所望の効果が他の潜在的な有害効果によって覆い隠されないように注意を 払わなければならないことを示す。 癌の遺伝的基礎には癌遺伝子及び／又は腫瘍抑制遺伝子における異常が含まれ る。両方の型が癌遺伝子治療の標的になっている。腫瘍抑制遺伝子の癌関連欠陥 が通常突然変異又は欠失であるため、これまで開発されている腫瘍抑制遺伝子治 療における方策は遺伝子置換治療であり、この治療では野生型腫瘍抑制遺伝子を 癌細胞に移入して欠陥遺伝子の正常な機能を回復させ、又は殺腫瘍性 効果を誘発する（１２４）。クローン化されて特徴付けられているヒト腫瘍抑制 遺伝子には、小児癌に関与するＲｂ、ウィルムス（Ｗｉｌｍｓ）腫瘍（ＷＴ１） 、及び神経線維腫症（ＮＦ１）；結腸直腸癌に寄与する腺腫ポリープ症ｃｏｌｉ （ＡＰＣ）及び結腸癌における欠失（ＤＣＣ）；広範囲のヒト癌において変異形 態で見出されるｐ５３が含まれる（再検討のためには、参考文献１２５を参照） 。近年、新たな腫瘍抑制因子又は癌感受性遺伝子の同定の領域において２つの大 きな事件が発生した。第１に、ｐ１６（主要腫瘍抑制因子１、ＭＴＳ１）及びｐ １５（ＭＴＳ２）と呼ばれるサイクリン依存性キナーゼ（ｃｄｋ）阻害因子集団 の２つの高度に関連するメンバーが、染色体領域９ｐ２１から単離された（１２ ６−１２８）。第２に、乳癌及び卵巣癌感受性遺伝子ＢＲＣＡ１の強力な候補が 単離された（１２９）。ｐ１６は広範囲の癌細胞系において欠失もしくは変異を 受けていることが示されたが、ｐ１５はＴＧＦ−β誘発細胞サイクル停止の強力 なエフェクターであることが示された（１３０）。これら全ての腫瘍抑制遺伝子 の中で、これまでに癌の遺伝子治療に用いられているものはｐ５３遺伝子である （１３１）。 癌の遺伝子治療に対する我々の現在の努力は、腫瘍抑制遺伝子及び癌の免疫調 節遺伝子治療を他の分子、例えば、腫瘍抗原、ＭＨＣ分子、細胞接着分子及び他 の免疫調節因子の導入と組み合わせることである。以下は、抗 癌超Ａｄベクターの２つの設計の一般的な説明である。 ２１．１ 第１バージョンの抗癌超Ａｄベクターの構築 免疫分子の幾つかの組み合わせを抗癌超Ａｄベクターの構築に用いることがで きる。このミニＡｄベクターは、腫瘍の成長を抑制し、又は宿主の抗癌免疫応答 を誘発するように作用する複数の遺伝子を坦持することができる。この型のベク ターは抗癌超Ａｄベクターと呼ばれる。この超Ａｄベクターの第１バージョンは 、ヒトｐ５３ ｃＤＮＡ、ＧＦＰマーカー遺伝子、ヒトＩＬ２ ｃＤＮＡ、ヒト ＧＭ−ＣＳＦ ｃＤＮＡ、ヒトＢ７−１ ｃＤＮＡ、ヒトＩＬ７ ｃＤＮＡ並び にヒトＩＬ１２ ｐ３５及びｐ４０ ｃＤＮＡの４つの二重発現カセットを坦持 する。また、これは、左及び右Ａｄ５ ＩＴＲ及びＡｄ５パッケージ化配列の最 小配列（合計６６０ｂｐ）並びにヒトａ−胎児タンパク質遺伝子の約１８ｋｂゲ ノム配列をも有し、３０ｋｂを超えるサイズに到達する（図６２）。カセット１ はＣＭＶプロモーター、ヒトｐ５３ ｃＤＮＡ、ＥＭＣ−ＩＲＥＳ、ＧＦＰ遺伝 子及びＳＶ４０ｐＡを含む。カセット２はＥＦプロモーター、ヒトＧＭ−ＣＳＦ ｃＤＮＡ、ＥＭＣ−ＩＲＥＳ、ヒトＩＬ１２ ｃＤＮＡ及びウシ成長ホルモン ｐＡを含む。カセット３はＳＶ４０プロモーター、ヒトＢ７−１ ｃＤＮＡ、Ｅ ＭＣ−ＩＲＥＳ、ヒトＩＬ７ ｃＤＮＡ及びＳＶ４０ｐＡを含む。カセット４は ｔｋプロモーター、ヒトＩＬ１２ ｐ３５ ｃＤＮＡ、ＥＭＣ−ＩＲＥＳ、ヒトＩＬ１２ ｐ４０ ｃＤＮＡ及び ウシ成長ホルモンｐＡを含む（図６４）。 ２１．２ 第２バージョンの抗癌超Ａｄベクターの構築 抗癌超Ａｄベクターの第２バージョンは第１バージョンに類似する構造を有し 、５’及び３’末端の両者にアデノウイルス逆末端反復を含み、且つ４つの別々 の発現カセットを含む。調節分子及び遺伝子の幾つかの組み合わせを抗癌超Ａｄ ベクターの構築において用いることができる。以下に説明される例は、腫瘍細胞 の成長を調節するために構築することが可能なミニＡｄベクターの型をいかなる 点においても限定するものではない。各々の発現カセットには５’末端に独自プ ロモーターが隣接する。加えて、各々の発現カセットは、“末端”遺伝子の独立 の翻訳を完了させるための、脳心筋炎ウイルス内部リボソームエントリ部位配列 で連結された２つの遺伝子を含む。このベクターのために示される遺伝子には、 ＩＬ−２、ＩＬ−７、及びＧＭ−ＣＳＦによって代表されるサイトカイン遺伝子 ；ｐ５３に代表される腫瘍抑制遺伝子；Ｂ７−１及びＩＣＡＭ−１に代表される 免疫細胞同時刺激性分子；並びに、しばしば癌に関連する免疫抑制を保存するこ とが可能な分子、抗−ＴＧＦβ及びＳＣＡ乃至ＣＴＬＡ−４が含まれる。ベクタ ーのサイズを増加させて子孫ウイルス内に効率的にパッケージ化させる ため、ヒトα−胎児タンパク質の“スタファーＤＮＡ”が含められている。スタ ファーＤＮＡは、いかなる長さのＤＮＡフラグメントを含んでいてもよい。第２ バージョンの抗癌超Ａｄベクターの一般構造が図６３に示されている。 実施例２２．系を改善するための他の設計 １．標的設定能力を有するミニＡｄベクター。遺伝子発現の標的を特定の細胞 型又は組織に設定するのに、複数の機構を用いることができる。そのような機構 の１つは、細胞型、細胞型サブセット又は特定の組織の転写ターゲティングに関 与する。転写ターゲティングは特定の型の細胞又は組織においてのみ遺伝子の発 現を駆動する転写調節単位の使用を含む。このような転写調節単位は組織特異的 と呼ばれる。ミニａｄベクターは、レポーター又はエフェクター遺伝子の発現を 駆動する組織特異的転写調節単位を含めるように設計される。このようにして、 組織特異的転写調節単位の制御の下にあるレポーター又はエフェクター遺伝子の 発現は、この転写調節単位が活性である特定の組織において高水準で検出される 。遺伝子の発現を特定の細胞型又は組織に限定することが好ましいことがある。 治療用遺伝子は、多量に発現する場合、しばしば毒性である。そのため、遺伝子 の発現の特定の組織への調節は、特定の治療用遺伝子の高水準の遺伝子発現の悪 影響から宿主を保護する役割を果たし得る。 組織特異的な遺伝子発現を導くさらなる方法は、関心のある細胞型上のリガン ドに対して反応性の細胞表面タンパク質をコードするヘルパーウイルスを用いる ことである。例えば、ヘルパーウイルスを、細胞表面受容体に対するリガンドを 発現するように加工することができる。本発明の組換えパッケージ化適格ＤＮＡ 構築体のパッケージ化により、細胞表面上の受容体に結合する組換えアデノウイ ルス粒子が生成する。さらなる例は、そのウイルス外被の表面上に抗体又は抗体 断片を発現する組換えアデノウイルスを含む。このような組換えウイルスは、パ ッケージ化不全ヘルパーウイルスを、そのウイルス外被上に抗体又は抗体断片を 融合タンパク質又は別々のタンパク質として発現するように加工することにより 生成することができる。少なくとも１つのアデノウイルスパッケージ化配列及び 少なくとも１つのレポーター又はエフェクター遺伝子をコードするＤＮＡ分子を 形質移入した細胞の感染により、標的細胞上の細胞表面分子に対して反応性の抗 体又は抗体断片を有する組換えアデノウイルス粒子が生成する。このようにして 、組換えアデノウイルス粒子は、その抗体又は抗体断片に対して反応性の細胞表 面分子を発現する宿主中の細胞に特異的に結合する。 ２．局所免疫抑制機能を有するミニＡｄベクター。特定の自己免疫疾患は不適 切な免疫反応から生じる。この自己免疫反応を妨げ、停止させ、又は遅らせるの に用い ることができる方法の１つはそのような反応の部位に免疫調節タンパク質を導く ことである。これは、本願で示されるように、ミニＡｄゲノムから構築されるア デノウイルス粒子を適用することにより達成することができる。特定のサイトカ イン又はケモカインをコードする遺伝子を発現させることが可能であり、そのよ うな発現は免疫応答の弱力化を生じ得る。この免疫応答における弱力化は自己免 疫反応の症状の緩和につながる。さらなる例には、アレルギー反応の弱力化が含 まれ得る。アレルギー反応を引き起こすことが知られる抗原をミニＡｄベクター でコードすることができる。組換えアデノウイルス粒子によって細胞に送達され たこのミニＡｄベクターで駆動される、低濃度もしくは極端に高濃度の抗原のい ずれかの発現により寛容が生じ得る。さらに、この抗原の発現を、この抗原の発 現が寛容を誘発し得る組織に向けることができる。このような組織には発生中の 胸腺が含まれ得る。脱感作の後、組換えアデノウイルス粒子が送達された宿主は その抗原との相互作用でアレルギー反応を示すことがない。このようにして、加 工されたミニＡｄ ＤＮＡ分子を坦持する組換えアデノウイルス粒子を投与する ことにより、免疫抑制の一形態が達成される。 ３．他の要素とハイブリダイズするミニＡｄベクター。本願において説明され るミニＡｄベクターを宿主内でのウイルス感染及び複製の予防又は排除に用いる ことも可能である。ミニＡｄベクターは、ウイルスの特定の遺伝 的プロセスが妨害もしくは排除され得るように設計することができる。ミニＡｄ ベクターは、感染の転写又は翻訳段階でウイルスの複製を妨害するアンチセンス 核酸を発現するように設計することができる。妨害は、伝令ＲＮＡに結合し、又 はウイルスゲノムへの組み込みの後にＤＮＡに結合して転写を妨げるものを含む アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡの発現により促進することができる。さらに、特 定のウイルス転写体を破壊の標的に設定するリボザイムを設計することができる 。ミニＡｄベクターによって“おとり”分子をコードすることもできる。このよ うなおとりは、ウイルスの転写に必要とされる転写因子に、ウイルス遺伝子の発 現及び複製に必要とされる遺伝子への結合及びその転写の駆動にその転写因子が もはや利用可能ではなくなるように結合することにより作用し得る。 ４．ワクチン接種に用いることができるミニＡｄベクター。発現が生じる生物 において免疫を生成するように働く特定の抗原又は免疫源の発現を駆動するよう にミニＡｄベクターを加工することができる。免疫反応を誘発し、それにより免 疫を生じる細菌又はウイルス遺伝子の発現を駆動するミニＡｄベクターを設計す ることができる。例えば、ＨＩＶのようなレトロウイルスに由来する外被タンパ ク質をミニＡｄベクターでコードすることができる。このミニＡｄベクターを含 む組換えアデノウイルス粒子で宿主の細胞を感染させることにより、ＨＩＶ ウイルスに対する免疫を確実なものとすることができる。また、癌特異的抗原の 発現を駆動するようにミニＡｄベクターを設計することもできる。癌抗原の発現 を導くミニＡｄベクターを含む組換えアデノウイルス粒子で宿主の細胞を感染さ せることにより、その型の癌に対する免疫が生じる。最適には、このような免疫 は、その原発腫瘍はもちろんのこと、治療した生物全体にわたって存在する他の 転移及び微小転移をも広範囲にわたって根絶する。加えて、寄生虫から誘導され る抗原性分子をコードするミニＡｄベクターを設計することができる。このミニ Ａｄベクターを含む組換えアデノウイルスベクターの投与に続いて、この寄生虫 による感染に対する免疫が生じる。 本発明の好ましい形態が図面に示され、かつ記述されているが、この好ましい 形態の変形が当該技術分野における熟練者に明らかであるため、本発明は図示さ れ、かつ記述される特定の形態に限定されるものと解釈されるべきではなく、そ の代わりに請求の範囲に記載される通りのものである。

【手続補正書】 【提出日】平成１０年１２月３日（１９９８．１２．３） 【補正内容】 請求の範囲 １． アデノウイルス逆末端反復（ＩＴＲ）、パッケージ化シグナル、転写制御 領域、エフェクター又はレポーター遺伝子、及びゲノム組み込み配列又はエピソ ーム維持配列のいずれかを含み、これらの全てが感染性複製不全組換えアデノウ イルスベクターの生成に作用的に関連する単離ＤＮＡ分子であって、該ＤＮＡ分 子の残部はアデノウイルスタンパク質をコードしない単離ＤＮＡ分子。 ２． 前記ゲノム組み込み配列が相同組換えアームを含む、請求項１に記載の単 離ＤＮＡ分子。 ３． 前記相同組換えアームがアルブミンゲノム配列及びα−胎児タンパタ質ゲ ノム配列からなる群より選択される、請求項２に記載の単離ＤＮＡ分子。 ４． 前記相同組換えアームがＡｌｂ−Ｅ５、ＡＦＰ−３、又はＥＢＢ１４から なる群より選択される、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子。 ５． 前記ゲノム組換え配列がアデノ関連ウイルス逆末端反復（ＡＡＶ−ＩＴＲ ）を含む、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子。 ６． 前記エピソーム維持配列がヒトＤＮＡ複製基点配列を含む、請求項１に記 載の単離ＤＮＡ分子。 ７． ヒトテロメア配列をさらに含み、かつ前記エピソーム維持配列がヒトＤＮ Ａ複製基点配列を含む、請求項 １に記載の単離ＤＮＡ分子。 ８． 前記エピソーム維持配列がアルフォイドＤＮＡを含む、請求項１に記載の 単離ＤＮＡ分子。 ９． 前記エピソーム維持配列がウイルス複製基点及び該ウイルス複製基点の活 性化に必要なタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載 の単離ＤＮＡ分子。 １０． 前記エピソーム維持配列がＳＶ４０複製基点及びＴ抗原（Ｔ−Ａｇ）を コードする遺伝子を含む、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子。 １１． 前記エピソーム維持配列がウイルス複製基点ｏｒｉＰ及びＥＢＮＡ−１ をコードする遺伝子を含む、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子。 １２． 前記転写制御領域がヒトアルブミンプロモーターを含む、請求項１に記 載の単離ＤＮＡ分子。 １３． 前記転写制御領域がα₁−抗トリプシンプロモーターを含む、請求項１ に記載の単離ＤＮＡ分子。 １４． 前記転写制御領域が肝臓特異的エンハンサーを含む、請求項１に記載の 単離ＤＮＡ分子。 １５． 前記転写制御領域がα−抗トリプシンプロモーターに作動可能に連結す る肝臓特異的エンハンサーを含む、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子。 １６． 前記転写制御領域がサイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ）に作 動可能に連結するｔｅｔ−オペロン（ｔｅｔＯ）を含む、請求項１に記載の単離 ＤＮＡ 分子。 １７． 前記レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質をコードする、請求項１に 記載の単離ＤＮＡ分子。 １８． 前記エフェクター遺伝子がＦＶＩＩＩ様活性を有するタンパク質をコー ドする、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子。 １９． 前記エフェクター遺伝子がヒトＦＶＩＩＩをコードする、請求項１に記 載の単離ＤＮＡ分子。 ２０． 前記アデノウイルスＩＴＲがアデノウイルス５型（Ａｄ５）右ＩＴＲ及 びＡｄ５左逆末端反復を含む、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子。 ２１． 前記アデノウイルス逆末端反復がＡｄ５右ＩＴＲ及びＡｄ５左ＩＴＲを 含み、前記転写制御領域がヒトアルブミンプロモーターを含み、かつ前記エフェ クター遺伝子がＦＶＩＩＩ様活性を有するタンパク質をコードする、請求項１に 記載の単離ＤＮＡ分子。 ２２． 前記アデノウイルス逆末端反復がＡｄ５右ＩＴＲ及びＡｄ５左ＩＴＲを 含み、前記転写制御領域がヒトアルブミンプロモーターを含み、かつ前記エフェ クター遺伝子がヒトＦＶＩＩＩをコードする、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子 。 ２３． 前記パッケージ化シグナルがパッケージ化の足場点を含む、請求項１に 記載の単離ＤＮＡ分子。 ２４． 複数のパッケージ化シグナルを含む、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子 。 ２５． 複数の合成パッケージ化シグナルを含む、請求項１に記載の単離ＤＮＡ 分子。 ２６． 標的細胞膜に結合することが可能な改変Ａｄエンベロープタンパク質を コードする遺伝子をさらに含む、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子。 ２７． 野生型の遺伝子産生物と比較した場合に変更された機能又は構造を有す る遺伝子産生物をコードする改変アデノウイルス遺伝子をさらに含む、請求項１ に記載の単離ＤＮＡ分子。 ２８． 転写制御領域に作動可能に連結するＥ４遺伝子をさらに含む、請求項１ に記載の単離ＤＮＡ分子。 ２９． 上流及び下流にＡＡＶ−ＩＴＲが隣接するレポーター又はエフェクター 遺伝子カセットを含む、感染性複製不全組換えアデノウイルスベクターの生成に 有用な単離ＤＮＡ分子。 ３０． 前記レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質をコードする、請求項１に 記載の単離ＤＮＡ分子。 ３１． 前記エフェクター遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子、ＦＶＩＩＩ様活性 を有するタンパク質をコードする遺伝子、及びヒトＦＶＩＩＩタンパク質をコー ドする核酸からなる群より選択される、請求項２９に記載の単離ＤＮＡ分子。 ３２． アデノウイルスＩＴＲ配列、パッケージ化シグナル、ＡＡＶ ＩＴＲ配 列、転写制御領域、レポーター又はエフェクター遺伝子、及びＲｅｐ発現カセッ トを含 み、これらの全てが感染性複製不全組換えアデノウイルスベクターの生成に作用 的に関連する単離ＤＮＡ分子であって、該ＤＮＡ分子の残部はアデノウイルスタ ンパク質をコードしない単離ＤＮＡ分子。 ３３． 前記レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質をコードする、請求項３２ に記載の単離ＤＮＡ分子。 ３４． 前記エフェクター遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子、ＦＶＩＩＩ様活性 を有するタンパク質をコードする遺伝子、及びヒトＦＶＩＩＩタンパク質をコー ドする遺伝子からなる群より選択される、請求項３２に記載の単離ＤＮＡ分子。 ３５． 前記転写制御領域がヒトアルブミンプロモーターを含む、請求項３２に 記載の単離ＤＮＡ分子。 ３６． 前記転写制御領域がα₁−抗トリプシンプロモーターを含む、請求項３ ２に記載の単離ＤＮＡ分子。 ３７． 前記転写制御領域が肝臓特異的エンハンサーを含む、請求項３２に記載 の単離ＤＮＡ分子。 ３８． 前記転写制御領域がα₁−抗トリプシンプロモーターに作動可能に連結 する肝臓特異的エンハンサーを含む、請求項３２に記載の単離ＤＮＡ分子。 ３９． 前記転写制御領域がサイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ）に作 動可能に連結するｔｅｔ−オペロン（ｔｅｔＯ）を含む、請求項３２に記載の単 離ＤＮＡ分子。 ４０． 前記パッケージ化シグナルがパッケージ化の足 場点を含む、請求項３２に記載の単離ＤＮＡ分子。 ４１． 複数のパッケージ化シグナルを含む、請求項３２に記載の単離ＤＮＡ分 子。 ４２． 複数の合成パッケージ化シグナルを含む、請求項３２に記載の単離ＤＮ Ａ分子。 ４３． 標的細胞膜に結合することが可能な改変Ａｄエンベロープタンパク質を コードする遺伝子をさらに含む、請求項３２に記載の単離ＤＮＡ分子。 ４４． 野生型の遺伝子産生物と比較した場合に変更された機能又は構造を有す る遺伝子産生物をコードする改変アデノウイルス遺伝子をさらに含む、請求項３ ２に記載の単離ＤＮＡ分子。 ４５． 転写制御領域に作動可能に連結するＥ４遺伝子をさらに含む、請求項３ ２に記載の単離ＤＮＡ分子。 ４６． Ｅ１欠失ヘルパーＡｄゲノムを含む単離ＤＮＡ分子であって、該Ｅ１欠 失ヘルパーＡｄゲノムが野生型ヘルパーＡｄゲノムよりも低い頻度でパッケージ 化されるように変更されたパッケージ化シグナルを該Ｅ１欠失ヘルパーＡｄゲノ ムが含む単離ＤＮＡ分子。 ４７． 前記弱力化パッケージ化シグナルがアデノ富化モチーフ（Ａ反復）の部 分的な欠失を含む、請求項４６に記載の単離ＤＮＡ分子。 ４８． 前記弱力化パッケージ化シグナルが、該弱力化パッケージ化シグナルに 対するパッケージ化タンパク質の親和性が低下するように直接反復を含む、請求 項４６ に記載の単離ＤＮＡ分子。 ４９． 前記弱力化パッケージ化シグナルが、該弱力化パッケージ化シグナルに 対するパッケージ化タンパク質の親和性が低下するようにＡ反復配列の直列反復 を含む、請求項４６に記載の単離ＤＮＡ分子。 ５０． 請求項４６に記載の単離ＤＮＡ分子であって、前記弱力化パッケージ化 シグナルが該ＤＮＡ分子上のタンパク結合部位に隣接して位置し、それにより該 タンパク質の該タンパク結合部位への結合がパッケージ化タンパク質と該弱力化 パッケージ化シグナルとの会合を妨げる単離ＤＮＡ分子。 ５１． 前記パッケージ化シグナルが前記Ｅ１欠失ヘルパーＡｄゲノム内の野生 型ヘルパーＡｄゲノムに見出されるもの以外の位置に位置する、請求項４６に記 載の単離ＤＮＡ分子。 ５２． 前記パッケージ化シグナルが、パッケージ化タンパク質に対する親和性 が野生型パッケージ化タンパク質よりも低い合成パッケージ化シグナルである、 請求項４６に記載の単離ＤＮＡ分子。 ５３． 前記アデノウイルスゲノムがＥ１に加えてアデノウイルス遺伝子の欠失 を含む、請求項４６に記載の単離ＤＮＡ分子。 ５４． Ａｄ Ｅ１遺伝子配列を含むＤＮＡ分子が安定に形質移入されている細 胞であって、該配列がＥ１欠失ヘルパーＡｄゲノムのゲノムと重複する配列を持 たない 細胞。 ５５． 組換えアデノウイルスベクターを生成する方法であって、 Ｅ１欠失ヘルパーＡｄゲノムのゲノムと重複する配列を持たないＡｄ Ｅ１遺 伝子配列を含むＤＮＡ分子が安定に形質移入されている細胞に、アデノウイルス 逆末端反復（ＩＴＲ）、パッケージ化シグナル、転写制御領域、エフェクター又 はレポーター遺伝子、及びゲノム組み込み配列又はエピソーム維持配列のいずれ かを含み、これらの全てが感染性複製不全組換えアデノウイルスベクターの生成 に作用的に関連する第１単離ＤＮＡ分子であって、該ＤＮＡ分子の残部はアデノ ウイルスタンパク質をコードしない第１単離ＤＮＡ分子、並びにＡｄヘルパーゲ ノムを含む第２単離ＤＮＡ分子を同時形質移入する工程； 該細胞の細胞非含有溶解物を調製する工程； を組み合わせてなり、 該細胞非含有溶解物が、該第ＩＤＮＡ分子を含む感染性複製障害組換えアデノ ウイルスベクター粒子を含む方法。 ５６． 組換えアデノウイルスベクターを生成する方法であって、 Ｅ１欠失ヘルパーＡｄゲノムのゲノムと重複する配列を持たないＡｄ Ｅ１遺 伝子配列を含むＤＮＡ分子が安定に形質移入されている細胞に、アデノウイルス 逆末端 反復（ＩＴＲ）、パッケージ化シグナル、転写制御領域、エフェクター又はレポ ーター遺伝子、及びゲノム組み込み配列又はエピソーム維持配列のいずれかを含 み、これらの全てが感染性複製不全組換えアデノウイルスベクターの生成に作用 的に関連する単離ＤＮＡ分子であって、該ＤＮＡ分子の残部はアデノウイルスタ ンパク質をコードしない単離ＤＮＡ分子を形質移入する工程； 該細胞を、Ａｄヘルパーゲノムを含むＡｄヘルパーウイルスに感染させる工程 ；及び 該細胞の細胞非含有溶解物を調製する工程； を組み合わせてなり、 該細胞非含有溶解物が、該ＤＮＡ分子を含む感染性複製障害組換えアデノウイ ルスベクター粒子を含む方法。 ５７． 前記ＤＮＡ分子がＡＡＶ−ＩＴＲ及びＲｅｐ発現カセットをさらに含む 、請求項５５又は５６による方法。 ５８． 前記ＤＮＡ分子がＡＡＶ−ＩＴＲ及びＲｅｐ発現カセットをさらに含み 、かつ前記細胞がｔｅｔ−ＫＲＡＢリプレッサータンパク質を発現する、請求項 ５５又は５６項による方法。 ５９． 前記転写制御領域が前記細胞内よりも標的細胞内においてより活性であ る、請求項５５又は５６による方法。 ６０． 前記転写制御領域が肝臓特異的エンハンサー／α−抗トリプシンプロモ ーター；及びｔｅｔＯ／ＣＭＶ プロモーターからなる群より選択され、前記細胞がｔｅｔ−ＫＲＡＢリプレッサ ータンパク質を発現する、請求項５５又は５６による方法。 ６１． 前記レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質をコードする、請求項５５ 又は５６による方法。 ６２． 前記エフェクター遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子、ＦＶＩＩＩ様活性 を有するタンパク質をコードする遺伝子、又はヒトＦＶＩＩＩ遺伝子からなる群 より選択される、請求項５５又は５６による方法。 ６３． 前記ＤＮＡ分子がＧＴ２０６３と呼ばれるプラスミドである、請求項５ ５又は５６による方法。 ６４． アデノウイルス逆末端反復（ＩＴＲ）、パッケージ化シグナル、転写制 御領域、エフェクター又はレポーター遺伝子、及びゲノム組み込み配列又はエピ ソーム維持配列のいずれかを含み、これらの全てが感染性複製不全組換えアデノ ウイルスベクターの生成に作用的に関連するＤＮＡ分子を含む組換えアデノウイ ルス粒子であって、該ＤＮＡ分子の残部はアデノウイルスタンパク質をコードし ない組換えアデノウイルス粒子。 ６５． 前記レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質をコードする、請求項６４ に記載の組換えアデノウイルス粒子。 ６６． 前記エフェクター遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子、ＦＶＩＩＩ様活性 を有するタンパク質、及びヒトＦＶＩＩＩをコードする、請求項６４に記載の組 換えア デノウイルス粒子。 ６７． 前記ＤＮＡ分子がＧＴ２０６３である、請求項６４に記載の組換えアデ ノウイルス粒子。 ６８． 前記ＤＮＡ分子がＡＡＶ−ＩＴＲ及びＲｅｐ発現カセットをさらに含む 、請求項６４に記載の組換えアデノウイルス粒子。 ６９． アデノウイルス逆末端反復（ＩＴＲ）、パッケージ化シグナル、転写制 御領域、エフェクター又はレポーター遺伝子、及びゲノム組み込み配列又はエピ ソーム維持配列のいずれかを含み、これらの全てが感染性複製不全組換えアデノ ウイルスベクターの生成に作用的に関連するＤＮＡ分子を生理学的に許容し得る バッファ中に含む医薬組成物であって、該ＤＮＡ分子の残部はアデノウイルスタ ンパク質をコードしない医薬組成物。 ７０． 前記レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質をコードする、請求項６９ に記載の医薬組成物。 ７１． 前記エフェクター遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子、ＦＶＩＩＩ様活性 を有するタンパク質をコードする遺伝子、及びヒトＦＶＩＩＩ遺伝子からなる群 より選択される、請求項６９に記載の医薬組成物。 ７２． 前記ＤＮＡ分子がＧＴ２０６３である、請求項６９に記載の医薬組成物 。 ７３． 治療上有効な量の請求項６９に記載の医薬組成物を患者に投与すること を包含する、血友病の治療方法。 ７４． 非ヒトトランスジェニック動物の生成方法であって、 胚幹細胞に、ＡＡＶＳ１配列及び薬剤選択マーカー遺伝子を含むＤＮＡ分子を 形質移入する工程； 該薬剤選択マーカー遺伝子の発現により耐性が付与される薬剤の存在下におい て成長させることにより、そのゲノム内に該ＤＮＡ分子を含む胚幹細胞を選択す る工程； 該胚幹細胞を胚盤胞に微量注入する工程； 該胚盤胞を仮母に移植する工程； 得られた子孫を飼育する工程； 該子孫をＡＡＶＳ１配列の存在について検定する工程；及び ＡＡＶＳ１配列が検出されている子孫をホモ接合まで飼育する工程； を組み合わせて包含し、 それによりそのゲノムにＡＡＶＳ１配列が組み込まれているトランスジェニッ ク動物が生じる方法。 ７５． 前記非ヒトトランスジェニック動物がマウスである、請求項７４に記載 の方法。 ７６． 前記ＤＮＡ分子が図５０に示されるｐＡＡＶＳ１−Ｎｅｏである、請求 項７４に記載の方法。 ７７． そのゲノムに安定に組み込まれているＡＡＶＳ１配列を有する非ヒトト ランスジェニック動物。 ７８． そのゲノムに安定に組み込まれているＡＡＶＳ １配列を有する非ヒトトランスジェニック動物であって、該動物がマウスである 非ヒトトランスジェニック動物。 ７９． 前記動物が、該動物のゲノムに安定に組み込まれている、ＦＶＩＩＩ様 活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をさらに有する、請求項７８に記載 の非ヒトトランスジェニック動物。 ８０． 前記動物が、該動物のゲノムに安定に組み込まれている、ヒトＦＶＩＩ Ｉをコードする核酸をさらに有する、請求項７８に記載の非ヒトトランスジェニ ック動物。 ８１． 前記動物が血友病表現型、及び該動物のゲノムに安定に組み込まれてい る、ＦＶＩＩＩ様活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を有する、請求項 ７８に記載の非ヒトトランスジェニック動物。 ８２． 前記動物が血友病表現型及び該動物のゲノムに安定に組み込まれている ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子を有する、請求項７８に記載の非ヒトトランスジェニック 動物。 ８３． そのゲノムに安定に組み込まれているＤＮＡ分子ｐＡＡＶＳ１−Ｎｅｏ 又はそれらの断片を有する、非ヒトトランスジェニックマウス。 ８４． 前記動物がマウスである、請求項８３に記載の非ヒトトランスジェニッ ク動物。 ８５． そのゲノムにＡＡＶＳ１配列が組み込まれている非ヒトトランスジェニ ック動物への、ＡＡＶ−ＩＴＲ を含むウイルスベクターのイン・ビボ送達を試験するための方法であって、 生理学的に許容し得るバッファ中の、ＡＡＶ−ＩＴＲ配列を有するＤＮＡ分子 を含み、かつレポーター又はエフェクター遺伝子をコードするベクターを該動物 の静脈内又は門脈に注射する工程； 該動物から複数の血液試料を得る工程； 該血液試料における遺伝子発現の水準を測定して導入遺伝子の発現の持続を決 定する工程；及び 該動物の肝臓組織からゲノムＤＮＡを単離する工程；及び ＡＡＶＳ１特異的プライマーを用いて該組織のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ ）分析を行って該動物のゲノムへの該ベクターの組み込みを検出する工程； を組み合わせて包含する方法。 ８６． 前記ゲノムＤＮＡに対する蛍光インサイツ・ハイブリダイゼーション分 析を行って、前記ＡＡＶＳ１配列の染色***置を決定し、かつ前記ＡＡＶＳ１配 列での前記レポーター又はエフェクター遺伝子の組み込みを検出する工程をさら に含む、請求項８５に記載の方法。 ８７． 前記ＤＮＡ分子がアデノウイルスＩＴＲ配列、ＡＡＶ ＩＴＲ配列、転 写制御領域、レポーター又はエフェクター遺伝子、及びＲｅｐ発現カセットを含 み、これらの全てが感染性複製不全組換えアデノウイルスベクターの生成に作用 的に関連し、該ＤＮＡ分子の残部はア デノウイルスタンパク質をコードしない、請求項８５に記載の方法。 ８８． 前記ＤＮＡ分子がアデノウイルスＩＴＲ配列、ＡＡＶ ＩＴＲ配列、転 写制御領域、ＦＶＩＩＩ様活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、及びＲ ｅｐ発現カセットを含み、これらの全てが感染性複製不全組換えアデノウイルス ベクターの生成に作用的に関連し、該ＤＮＡ分子の残部はアデノウイルスタンパ ク質をコードしない、請求項８５に記載の方法。 ８９． 前記ＤＮＡ分子がアデノウイルスＩＴＲ配列、ＡＡＶ ＩＴＲ配列、転 写制御領域、ヒトＦＶＩＩＩをコードする核酸、及びＲｅｐ発現カセットを含み 、これらの全てが感染性複製不全組換えアデノウイルスベクターの生成に作用的 に関連し、該ＤＮＡ分子の残部はアデノウイルスタンパク質をコードしない、請 求項８７に記載の方法。 ９０． ヒトＦＶＩＩＩに対して寛容化されている非ヒトトランスジェニック動 物の生成方法であって、 胚幹細胞にヒトＦＶＩＩＩをコードする核酸及び薬剤選択マーカー遺伝子を含 むＤＮＡ分子を形質移入する工程； 該薬剤選択マーカー遺伝子によってコードされるタンパク質の発現により耐性 が付与される薬剤の存在下において該細胞を成長させることにより、そのゲノム 内に該ＤＮＡ分子を含む胚幹細胞を選択する工程； 該胚幹細胞を胚盤胞に微量注入する工程； 該胚盤胞を仮母に移植する工程； 得られた子孫を飼育する工程； 該子孫を、該子孫のゲノム内の該ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子の存在について検定す る工程；及び 該ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子が検出されている子孫をホモ接合まで飼育する工程； を組み合わせて包含し、 それによりヒトＦＶＩＩＩに対して寛容化されたトランスジェニック動物が生 じる方法。 ９１． 前記ＤＮＡ分子が、合成プロモーター、発生的に調節されるプロモータ ー又は組織特異的プロモーターからなる群より選択されるプロモーターの転写制 御の下にヒトＦＶＩＩＩ遺伝子を含む、請求項９０に記載の方法。 ９２． 前記ＤＮＡ分子が、α−胎児タンパク質プロモーター、アルブミンプロ モーター及びα−抗トリプシンプロモーターからなる群より選択されるプロモー ターの制御の下にヒトＦＶＩＩＩ遺伝子を含む、請求項９０に記載の方法。 ９３． 前記ＤＮＡ分子が図５７に示されるｍＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ／ｐＧＫＮ ｅｏを含む、請求項９０に記載の方法。 ９４． 前記動物がマウスである、請求項９０に記載の方法。 ９５． ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子を肝臓特異的プロモーターの転写制御の下に含む ＤＮＡ分子を含む胚幹細胞であっで、該ＤＮＡ分子が薬剤選択マーカー遺伝子を さらに含む胚幹細胞。 ９６． ヒトＦＶＩＩＩに対して寛容化されているトランスジェニックマウス。 ９７． α−胎児タンパク質プロモーター、アルブミンプロモーター及びα−抗 トリプシンプロモーターからなる群より選択されるプロモーターの転写制御の下 に、そのゲノムに組み込まれているヒトＦＶＩＩＩ遺伝子を有する、ヒトＦＶＩ ＩＩに対して寛容化されているトランスジェニックマウス。 ９８． 図５７に示されるＤＮＡ分子ｍＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ／ｐＧＫＮｅｏ又 は、それらの断片を有し、前期マウスのゲノムに組み込まれているトランスジェ ニックマウス。 ９９． 緑色蛍光タンパク質に対して寛容化されている非ヒトトランスジェニッ ク動物の生成方法であって、 胚幹細胞に、合成プロモーター、組織特異的プロモーター及び発生的に調節さ れるプロモーターからなる群より選択されるプロモーターの転写制御の下に緑色 蛍光タンパク質遺伝子を含むＤＮＡ分子を形質移入する工程； 該薬剤選択マーカー遺伝子のタンパク質産生物の発現により耐性が付与される 薬剤の存在下において成長させることにより、そのゲノム内に該ＤＮＡ分子を含 む胚幹 細胞を選択する工程； 該胚幹細胞を胚盤胞に微量注入する工程； 該胚盤胞を仮母に移植する工程； 得られた子孫を飼育する工程； 該子孫を緑色蛍光タンパク質遺伝子配列の存在について検定する工程；及び そのゲノム内に緑色蛍光タンパク質遺伝子配列が検出されている子孫をホモ接 合まで飼育する工程； を組み合わせて包含し、 それにより緑色蛍光タンパク質に対して寛容化されたトランスジェニック動物 が生じる方法。 １００． 前記動物がマウスである請求項９９に記載の方法。 １０１． 前記組織特異的プロモーターが肝臓特異的である、請求項９９に記載 の方法。 １０２． 前記組織特異的プロモーターがα−胎児タンパク質プロモーター、ア ルブミンプロモーター及びα₁−抗トリプシンプロモーターからなる群より選択 される、請求項９９に記載の方法。 １０３． 前記ＤＮＡ分子が図６０に示されるＢＳ由来ＲＩＰ−ｐＥＧＦＰ及び図５９ に示されるＡＦＰ−ｐＥＧＦＰ−１からなる群より選択される、請求項９ ９に記載の方法。 １０４． 緑色蛍光タンパク質に対して寛容化されているトランスジェニックマ ウス。 １０５． そのゲノムに安定に組み込まれている、図６０に示されるＢＳ由来Ｒ ＩＰ−ｐＥＧＦＰ及び図５９に示されるＡＦＰ−ｐＥＧＦＰ−１からなる群より 選択されるＤＮＡ分子を有するトランスジェニックマウス。 １０６． そのゲノム内にＡＡＶＳ１配列を含む非ヒトトランスジェニック緑色 蛍光タンパク質寛容化動物への、ＡＡＶ−ＩＴＲ及び緑色蛍光タンパク質遺伝子 を含むベクターのイン・ビボ送達を試験する方法であって、 該ベクターを該動物に注射する工程； 該動物から血液試料を単離し、該血液試料を緑色タンパク質の存在について分 析する工程； 該動物から肝臓組織を単離する工程； ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析により、緑色蛍光タンパク質遺伝子配列 をコードする核酸の存在について該肝臓組織を分析する工程； 該肝臓組織の凍結切片を調製し、蛍光顕微鏡技術を用いて該凍結切片を緑色蛍 光タンパク質の存在について分析する工程； を組み合わせて包含し、 緑色蛍光タンパク質の存在は該トランスジェニック動物内で検出される方法。 １０７． 前記非ヒトトランスジェニック動物がマウスである、請求項１０６に 記載の方法。 １０８． 図４２に示される、ＧＴ２０７４と呼ばれるＤＮＡ分子。 １０９． 図４３に示される、ｐＣＭＶ−ｈＦＶＩＩＩミニと呼ばれるＤＮＡ分 子。 １１０． 図６０に示される、ＡＦＰ−ｐＥＧＦＰ−１と呼ばれるＤＮＡ分子。 １１１． 図５６に示される、ｍＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ／ｐＧＫＮｅｏと呼ばれ るＤＮＡ分子。 １１２． 図６０に示される、ＢＳ由来ＲＩＰ−ｐＥＧＦＰと呼ばれるＤＮＡ分 子。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 7/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/465 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者 アレマニー、ラモン アメリカ合衆国 60030 イリノイ州 グ レイスレイク ナンバー204 カントリー ドライブ 1904 (72)発明者 ダイ、イファン アメリカ合衆国 60030 イリノイ州 グ レイスレイク ナンバー304 カントリー ドライブ 1908 (72)発明者 ジョゼフス、スティーヴン アメリカ合衆国 60030 イリノイ州 グ レイスレイク クレアウッド サークル 366 (72)発明者 バラーグ、クリスティナ アメリカ合衆国 60030 イリノイ州 グ レイスレイク ナンバー204 カントリー ドライブ 1904 (72)発明者 アヤレス、デイヴィッド アメリカ合衆国 60046 イリノイ州 リ ンデンハースト ハイ ポイント ドライ ブ 2186 (72)発明者 シュナイダーマン、リチャード アメリカ合衆国 60074 イリノイ州 パ ラタイン ナンバー６ ペンシルヴェニア ドライブ 638 【要約の続き】 増幅させることができる。また、本発明は、ミニＡｄの イン・ビボ試験に用いることができるトランスジェニッ クマウスモデルを生成するための設計及び方法も報告す る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． アデノウイルス逆末端反復（ＩＴＲ）、パッケージ化シグナル、転写制御 領域、エフェクター又はレポーター遺伝子、及びゲノム組み込み配列又はエピソ ーム維持配列のいずれかを含み、これらの全てが感染性複製不全組換えアデノウ イルスベクターの生成に作用的に関連する単離ＤＮＡ分子であって、該ＤＮＡ分 子の残部はアデノウイルスタンパク質をコードしない単離ＤＮＡ分子。 ２． 前記ゲノム組み込み配列が相同組換えアームを含む、請求項１に記載の単 離ＤＮＡ分子。 ３． 前記相同組換えアームがアルブミンゲノム配列及びα−胎児タンパク質ゲ ノム配列からなる群より選択される、請求項２に記載の単離ＤＮＡ分子。 ４． 前記相同組換えアームがＡｌｂ−Ｅ５、ＡＦＰ−３、又はＥＢＢ１４から なる群より選択される、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子。 ５． 前記ゲノム組換え配列がアデノ関連ウイルス逆末端反復（ＡＡＶ−ＩＴＲ ）を含む、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子。 ６． 前記エピソーム維持配列がヒトＤＮＡ複製基点配列を含む、請求項１に記 載の単離ＤＮＡ分子。 ７． ヒトテロメア配列をさらに含み、かつ前記エピソーム維持配列がヒトＤＮ Ａ複製基点配列を含む、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子。 ８． 前記エピソーム維持配列がアルフォイドＤＮＡを含む、請求項１に記載の 単離ＤＮＡ分子。 ９． 前記エピソーム維持配列がウイルス複製基点及び該ウイルス複製基点の活 性化に必要なタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載 の単離ＤＮＡ分子。 １０． 前記エピソーム維持配列がＳＶ４０複製基点及びＴ抗原（Ｔ−Ａｇ）を コードする遺伝子を含む、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子。 １１． 前記エピソーム維持配列がウイルス複製基点ｏｒｉＰ及びＥＢＮＡ−１ をコードする遺伝子を含む、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子。 １２． 前記転写制御領域がヒトアルブミンプロモーターを含む、請求項１に記 載の単離ＤＮＡ分子。 １３． 前記転写制御領域がα₁−抗トリプシンプロモーターを含む、請求項１ に記載の単離ＤＮＡ分子。 １４． 前記転写制御領域が肝臓特異的エンハンサーを含む、請求項１に記載の 単離ＤＮＡ分子。 １５． 前記転写制御領域がα−抗トリプシンプロモーターに作動可能に連結す る肝臓特異的エンハンサーを含む、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子。 １６． 前記転写制御領域がサイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ）に作 動可能に連結するｔｅｔ−オペロン（ｔｅｔＯ）を含む、請求項１に記載の単離 ＤＮＡ分子。 １７． 前記レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質をコードする、請求項１に 記載の単離ＤＮＡ分子。 １８． 前記エフェクター遺伝子がＦＶＩＩＩ様活性を有するタンパク質をコー ドする、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子。 １９． 前記エフェクター遺伝子がヒトＦＶＩＩＩをコードする、請求項１に記 載の単離ＤＮＡ分子。 ２０． 前記アデノウイルスＩＴＲがアデノウイルス５型（Ａｄ５）右ＩＴＲ及 びＡｄ５左逆末端反復を含む、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子。 ２１． 前記アデノウイルス逆末端反復がＡｄ５右ＩＴＲ及びＡｄ５左ＩＴＲを 含み、前記転写制御領域がヒトアルブミンプロモーターを含み、かつ前記エフェ クター遺伝子がＦＶＩＩＩ様活性を有するタンパク質をコードする、請求項１に 記載の単離ＤＮＡ分子。 ２２． 前記アデノウイルス逆末端反復がＡｄ５右ＩＴＲ及びＡｄ５左ＩＴＲを 含み、前記転写制御領域がヒトアルブミンプロモーターを含み、かつ前記エフェ クター遺伝子がヒトＦＶＩＩＩをコードする、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子 。 ２３． 前記パッケージ化シグナルがパッケージ化の足場点を含む、請求項１に 記載の単離ＤＮＡ分子。 ２４． 複数のパッケージ化シグナルを含む、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子 。 ２５． 複数の合成パッケージ化シグナルを含む、請求 項１に記載の単離ＤＮＡ分子。 ２６． 標的細胞膜に結合することが可能な改変Ａｄエンベロープタンパク質を コードする遺伝子をさらに含む、請求項１に記載の単離ＤＮＡ分子。 ２７． 野生型の遺伝子産生物と比較した場合に変更された機能又は構造を有す る遺伝子産生物をコードする改変アデノウイルス遺伝子をさらに含む、請求項１ に記載の単離ＤＮＡ分子。 ２８． 転写制御領域に作動可能に連結するＥ４遺伝子をさらに含む、請求項１ に記載の単離ＤＮＡ分子。 ２９． 上流及び下流にＡＡＶ−ＩＴＲが隣接するレポーター又はエフェクター 遺伝子カセットを含む、感染性複製不全組換えアデノウイルスベクターの生成に 有用な単離ＤＮＡ分子。 ３０． 前記レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質をコードする、請求項１に 記載の単離ＤＮＡ分子。 ３１． 前記エフェクター遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子、ＦＶＩＩＩ様活性 を有するタンパク質をコードする遺伝子、及びヒトＦＶＩＩＩタンパク質をコー ドする核酸からなる群より選択される、請求項２９に記載の単離ＤＮＡ分子。 ３２． アデノウイルスＩＴＲ配列、パッケージ化シグナル、ＡＡＶ ＩＴＲ配 列、転写制御領域、レポーター又はエフェクター遺伝子、及びＲｅｐ発現カセッ トを含み、これらの全てが感染性複製不全組換えアデノウイル スベクターの生成に作用的に関連する単離ＤＮＡ分子であって、該ＤＮＡ分子の 残部はアデノウイルスタンパク質をコードしない単離ＤＮＡ分子。 ３３． 前記レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質をコードする、請求項３２ に記載の単離ＤＮＡ分子。 ３４． 前記エフェクター遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子、ＦＶＩＩＩ様活性 を有するタンパク質をコードする遺伝子、及びヒトＦＶＩＩＩタンパク質をコー ドする遺伝子からなる群より選択される、請求項３２に記載の単離ＤＮＡ分子。 ３５． 前記転写制御領域がヒトアルブミンプロモーターを含む、請求項３２に 記載の単離ＤＮＡ分子。 ３６． 前記転写制御領域がα₁−抗トリブシンプロモーターを含む、請求項３ ２に記載の単離ＤＮＡ分子。 ３７． 前記転写制御領域が肝臓特異的エンハンサーを含む、請求項３２に記載 の単離ＤＮＡ分子。 ３８． 前記転写制御領域がα₁−抗トリプシンプロモーターに作動可能に連結 する肝臓特異的エンハンサーを含む、請求項３２に記載の単離ＤＮＡ分子。 ３９． 前記転写制御領域がサイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ）に作 動可能に連結するｔｅｔ−オペロン（ｔｅｔＯ）を含む、請求項３２に記載の単 離ＤＮＡ分子。 ４０． 前記パッケージ化シグナルがパッケージ化の足場点を含む、請求項３２ に記載の単離ＤＮＡ分子。 ４１． 複数のパッケージ化シグナルを含む、請求項３２に記載の単離ＤＮＡ分 子。 ４２． 複数の合成パッケージ化シグナルを含む、請求項３２に記載の単離ＤＮ Ａ分子。 ４３． 標的細胞膜に結合することが可能な改変Ａｄエンベロープタンパク質を コードする遺伝子をさらに含む、請求項３２に記載の単離ＤＮＡ分子。 ４４． 野生型の遺伝子産生物と比較した場合に変更された機能又は構造を有す る遺伝子産生物をコードする改変アデノウイルス遺伝子をさらに含む、請求項３ ２に記載の単離ＤＮＡ分子。 ４５． 転写制御領域に作動可能に連結するＥ４遺伝子をさらに含む、請求項３ ２に記載の単離ＤＮＡ分子。 ４６． Ｅ１欠失ヘルパーＡｄゲノムを含む単離ＤＮＡ分子であって、該Ｅ１欠 失ヘルパーＡｄゲノムが野生型ヘルパーＡｄゲノムよりも低い頻度でパッケージ 化されるように変更されたパッケージ化シグナルを該Ｅ１欠失ヘルパーＡｄゲノ ムが含む単離ＤＮＡ分子。 ４７． 前記弱力化パッケージ化シグナルがアデノ富化モチーフ（Ａ反復）の部 分的な欠失を含む、請求項４６に記載の単離ＤＮＡ分子。 ４８． 前記弱力化パッケージ化シグナルが、該弱力化パッケージ化シグナルに 対するパッケージ化タンパク質の親和性が低下するように直接反復を含む、請求 項４６に記載の単離ＤＮＡ分子。 ４９． 前記弱力化パッケージ化シグナルが、該弱力化パッケージ化シグナルに 対するパッケージ化タンパク質の親和性が低下するようにＡ反復配列の直列反復 を含む、請求項４６に記載の単離ＤＮＡ分子。 ５０． 請求項４６に記載の単離ＤＮＡ分子であって、前記弱力化パッケージ化 シグナルが該ＤＮＡ分子上のタンパク結合部位に隣接して位置し、それにより該 タンパク質の該タンパク結合部位への結合がパッケージ化タンパク質と該弱力化 パッケージ化シグナルとの会合を妨げる単離ＤＮＡ分子。 ５１． 前記パッケージ化シグナルが前記Ｅ１欠失ヘルパーＡｄゲノム内の野生 型ヘルパーＡｄゲノムに見出されるもの以外の位置に位置する、請求項４６に記 載の単離ＤＮＡ分子。 ５２． 前記パッケージ化シグナルが、パッケージ化タンパク質に対する親和性 が野生型パッケージ化タンパク質よりも低い合成パッケージ化シグナルである、 請求項４６に記載の単離ＤＮＡ分子。 ５３． 前記アデノウイルスゲノムがＥ１に加えてアデノウイルス遺伝子の欠失 を含む、請求項４６に記載の単離ＤＮＡ分子。 ５４． Ａｄ Ｅ１遺伝子配列を含むＤＮＡ分子が安定に形質移入されている細 胞であって、該配列がＥ１欠失ヘルパーＡｄゲノムのゲノムと重複する配列を持 たない細胞。 ５５． 組換えアデノウイルスベクターを生成する方法であって、 Ｅ１欠失ヘルパーＡｄゲノムのゲノムと重複する配列を持たないＡｄ Ｅ１遺 伝子配列を含むＤＮＡ分子が安定に形質移入されている細胞に、アデノウイルス 逆末端反復（ＩＴＲ）、パッケージ化シグナル、転写制御領域、エフェクター又 はレポーター遺伝子、及びゲノム組み込み配列又はエピソーム維持配列のいずれ かを含み、これらの全てが感染性複製不全組換えアデノウイルスベクターの生成 に作用的に関連する第１単離ＤＮＡ分子であって、該ＤＮＡ分子の残部はアデノ ウイルスタンパク質をコードしない第１単離ＤＮＡ分子、並びにＡｄヘルパーゲ ノムを含む第２単離ＤＮＡ分子を同時形質移入する工程； 該細胞の細胞非含有溶解物を調製する工程； を組み合わせてなり、 該細胞非含有溶解物が、該第１ＤＮＡ分子を含む感染性複製障害組換えアデノ ウイルスベクター粒子を含む方法。 ５６． 組換えアデノウイルスベクターを生成する方法であって、 Ｅ１欠失ヘルパーＡｄゲノムのゲノムと重複する配列を持たないＡｄ Ｅ１遺 伝子配列を含むＤＮＡ分子が安定に形質移入されている細胞に、アデノウイルス 逆末端反復（ＩＴＲ）、パッケージ化シグナル、転写制御領域、 エフェクター又はレポーター遺伝子、及びゲノム組み込み配列又はエピソーム維 持配列のいずれかを含み、これらの全てが感染性複製不全組換えアデノウイルス ベクターの生成に作用的に関連する単離ＤＮＡ分子であって、該ＤＮＡ分子の残 部はアデノウイルスタンパク質をコードしない単離ＤＮＡ分子を形質移入する工 程； 該細胞を、Ａｄヘルパーゲノムを含むＡｄヘルパーウイルスに感染させる工程 ；及び 該細胞の細胞非含有溶解物を調製する工程； を組み合わせてなり、 該細胞非含有溶解物が、該ＤＮＡ分子を含む感染性複製障害組換えアデノウイ ルスベクター粒子を含む方法。 ５７． 前記ＤＮＡ分子がＡＡＶ−ＩＴＲ及びＲｅｐ発現カセットをさらに含む 、請求項５５又は５６による方法。 ５８． 前記ＤＮＡ分子がＡＡＶ−ＩＴＲ及びＲｅｐ発現カセットをさらに含み 、かつ前記細胞がｔｅｔ−ＫＲＡＢリプレッサータンパク質を発現する、請求項 ５５又は５６項による方法。 ５９． 前記転写制御領域が前記細胞内よりも標的細胞内においてより活性であ る、請求項５５又は５６による方法。 ６０． 前記転写制御領域が肝臓特異的エンハンサー／α−抗トリプシンプロモ ーター；及びｔｅｔＯ／ＣＭＶプロモーターからなる群より選択され、前記細胞 がｔｅ ｔ−ＫＲＡＢリプレッサータンパク質を発現する、請求項５５又は５６による方 法。 ６１． 前記レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質をコードする、請求項５５ 又は５６による方法。 ６２． 前記エフェクター遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子、ＦＶＩＩＩ様活性 を有するタンパク質をコードする遺伝子、又はヒトＦＶＩＩＩ遺伝子からなる群 より選択される、請求項５５又は５６による方法。 ６３． 前記ＤＮＡ分子がＧＴ２０６３と呼ばれるプラスミドである、請求項５ ５又は５６による方法。 ６４． アデノウイルス逆末端反復（ＩＴＲ）、パッケージ化シグナル、転写制 御領域、エフェクター又はレポーター遺伝子、及びゲノム組み込み配列又はエピ ソーム維持配列のいずれかを含み、これらの全てが感染性複製不全組換えアデノ ウイルスベクターの生成に作用的に関連するＤＮＡ分子を含む組換えアデノウイ ルス粒子であって、該ＤＮＡ分子の残部はアデノウイルスタンパク質をコードし ない組換えアデノウイルス粒子。 ６５． 前記レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質をコードする、請求項６４ に記載の組換えアデノウイルス粒子。 ６６． 前記エフェクター遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子、ＦＶＩＩＩ様活性 を有するタンパク質、及びヒトＦＶＩＩＩをコードする、請求項６４に記載の組 換えアデノウイルス粒子。 ６７． 前記ＤＮＡ分子がＧＴ２０６３である、請求項６４に記載の組換えアデ ノウイルス粒子。 ６８． 前記ＤＮＡ分子がＡＡＶ−ＩＴＲ及びＲｅｐ発現カセットをさらに含む 、請求項６４に記載の組換えアデノウイルス粒子。 ６９． アデノウイルス逆末端反復（ＩＴＲ）、パッケージ化シグナル、転写制 御領域、エフェクター又はレポーター遺伝子、及びゲノム組み込み配列又はエピ ソーム維持配列のいずれかを含み、これらの全てが感染性複製不全組換えアデノ ウイルスベクターの生成に作用的に関連するＤＮＡ分子を生理学的に許容し得る バッファ中に含む医薬組成物であって、該ＤＮＡ分子の残部はアデノウイルスタ ンパク質をコードしない医薬組成物。 ７０． 前記レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質をコードする、請求項６９ に記載の医薬組成物。 ７１． 前記エフェクター遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子、ＦＶＩＩＩ様活性 を有するタンパク質をコードする遺伝子、及びヒトＦＶＩＩＩ遺伝子からなる群 より選択される、請求項６９に記載の医薬組成物。 ７２． 前記ＤＮＡ分子がＧＴ２０６３である、請求項６９に記載の医薬組成物 。 ７３． 治療上有効な量の請求項６９に記載の医薬組成物を患者に投与すること を包含する、血友病の治療方法。 ７４． 非ヒトトランスジェニック動物の生成方法であって、 胚幹細胞に、ＡＡＶＳ１配列及び薬剤選択マーカー遺伝子を含むＤＮＡ分子を 形質移入する工程； 該薬剤選択マーカー遺伝子の発現により耐性が付与される薬剤の存在下におい て成長させることにより、そのゲノム内に該ＤＮＡ分子を含む胚幹細胞を選択す る工程， 該胚幹細胞を胚盤胞に微量注入する工程； 該胚盤胞を仮母に移植する工程； 得られた子孫を飼育する工程； 該子孫をＡＡＶＳ１配列の存在について検定する工程；及び ＡＡＶＳ１配列が検出されている子孫をホモ接合まで飼育する工程； を組み合わせて包含し、 それによりそのゲノムにＡＡＶＳ１配列が組み込まれているトランスジェニッ ク動物が生じる方法。 ７５． 前記非ヒトトランスジェニック動物がマウスである、請求項７４に記載 の方法。 ７６． 前記ＤＮＡ分子が図５２に示されるｐＡＡＶＳ１−Ｎｅｏである、請求 項７４に記載の方法。 ７７． そのゲノムに安定に組み込まれているＡＡＶＳ１配列を有する非ヒトト ランスジェニック動物。 ７８． そのゲノムに安定に組み込まれているＡＡＶＳ１配列を有する非ヒトト ランスジェニック動物であって、該動物がマウスである非ヒトトランスジェニッ ク動物。 ７９． 前記動物が、該動物のゲノムに安定に組み込まれている、ＦＶＩＩＩ様 活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をさらに有する、請求項７８に記載 の非ヒトトランスジェニック動物。 ８０． 前記動物が、該動物のゲノムに安定に組み込まれている、ヒトＦＶＩＩ Ｉをコードする核酸をさらに有する、請求項７８に記載の非ヒトトランスジェニ ック動物。 ８１． 前記動物が血友病表現型、及び該動物のゲノムに安定に組み込まれてい る、ＦＶＩＩＩ様活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を有する、請求項 ７８に記載の非ヒトトランスジェニック動物。 ８２． 前記動物が血友病表現型及び該動物のゲノムに安定に組み込まれている ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子を有する、請求項７８に記載の非ヒトトランスジェニック 動物。 ８３． そのゲノムに安定に組み込まれているＤＮＡ分子ｐＡＡＶＳ１−Ｎｅｏ 又はそれらの断片を有する、非ヒトトランスジェニックマウス。 ８４． 前記動物がマウスである、請求項８３に記載の非ヒトトランスジェニッ ク動物。 ８５． そのゲノムにＡＡＶＳ１配列が組み込まれている非ヒトトランスジェニ ック動物への、ＡＡＶ−ＩＴＲを含むウイルスベクターのイン・ビボ送達を試験 するための方法であって、 生理学的に許容し得るバッファ中の、ＡＡＶ−ＩＴＲ 配列を有するＤＮＡ分子を含み、かつレポーター又はエフェクター遺伝子をコー ドするベクターを該動物の静脈内又は門脈に注射する工程； 該動物から複数の血液試料を得る工程； 該血液試料における遺伝子発現の水準を測定して導入遺伝子の発現の持続を決 定する工程；及び 該動物の肝臓組織からゲノムＤＮＡを単離する工程；及び ＡＡＶＳ１特異的プライマーを用いて該組織のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ ）分析を行って該動物のゲノムへの該ベクターの組み込みを検出する工程； を組み合わせて包含する方法。 ８６． 前記ゲノムＤＮＡに対する蛍光インサイツ・ハイブリダイゼーション分 析を行って、前記ＡＡＶＳ１配列の染色***置を決定し、かつ前記ＡＡＶＳ１配 列での前記レポーター又はエフェクター遺伝子の組み込みを検出する工程をさら に含む、請求項８５に記載の方法。 ８７． 前記ＤＮＡ分子がアデノウイルスＩＴＲ配列、ＡＡＶ ＩＴＲ配列、転 写制御領域、レポーター又はエフェクター遺伝子、及びＲｅｐ発現カセットを含 み、これらの全てが感染性複製不全組換えアデノウイルスベクターの生成に作用 的に関連し、該ＤＮＡ分子の残部はアデノウイルスタンパク質をコードしない、 請求項８５に記載の方法。 ８８． 前記ＤＮＡ分子がアデノウイルスＩＴＲ配列、 ＡＡＶ ＩＴＲ配列、転写制御領域、ＦＶＩＩＩ様活性を有するタンパク質をコ ードする遺伝子、及びＲｅｐ発現カセットを含み、これらの全てが感染性複製不 全組換えアデノウイルスベクターの生成に作用的に関連し、該ＤＮＡ分子の残部 はアデノウイルスタンパク質をコードしない、請求項８５に記載の方法。 ８９． 前記ＤＮＡ分子がアデノウイルスＩＴＲ配列、ＡＡＶ ＩＴＲ配列、転 写制御領域、ヒトＦＶＩＩＩをコードする核酸、及びＲｅｐ発現カセットを含み 、これらの全てが感染性複製不全組換えアデノウイルスベクターの生成に作用的 に関連し、該ＤＮＡ分子の残部はアデノウイルスタンパク質をコードしない、請 求項８７に記載の方法。 ９０． ヒトＦＶＩＩＩに対して寛容化されている非ヒトトランスジェニック動 物の生成方法であって、 胚幹細胞にヒトＦＶＩＩＩをコードする核酸及び薬剤選択マーカー遺伝子を含 むＤＮＡ分子を形質移入する工程； 該薬剤選択マーカー遺伝子によってコードされるタンパク質の発現により耐性 が付与される薬剤の存在下において該細胞を成長させることにより、そのゲノム 内に該ＤＮＡ分子を含む胚幹細胞を選択する工程； 該胚幹細胞を胚盤胞に微量注入する工程； 該胚盤胞を仮母に移植する工程； 得られた子孫を飼育する工程； 該子孫を、該子孫のゲノム内の該ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子の存在について検定す る工程；及び 該ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子が検出されている子孫をホモ接合まで飼育する工程； を組み合わせて包含し、 それによりヒトＦＶＩＩＩに対して寛容化されたトランスジェニック動物が生 じる方法。 ９１． 前記ＤＮＡ分子が、合成プロモーター、発生的に調節されるプロモータ ー又は組織特異的プロモーターからなる群より選択されるプロモーターの転写制 御の下にヒトＦＶＩＩＩ遺伝子を含む、請求項９０に記載の方法。 ９２． 前記ＤＮＡ分子が、α−胎児タンパク質プロモーター、アルブミンプロ モーター及びα−抗トリプシンプロモーターからなる群より選択されるプロモー ターの制御の下にヒトＦＶＩＩＩ遺伝子を含む、請求項９０に記載の方法。 ９３． 前記ＤＮＡ分子が図５８に示されるｍＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ／ｐＧＫＮ ｅｏを含む、請求項９０に記載の方法。 ９４． 前記動物がマウスである、請求項９０に記載の方法。 ９５． ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子を肝臓特異的プロモーターの転写制御の下に含む ＤＮＡ分子を含む胚幹細胞であって、該ＤＮＡ分子が薬剤選択マーカー遺伝子を さらに 含む胚幹細胞。 ９６． ヒトＦＶＩＩＩに対して寛容化されているトランスジェニックマウス。 ９７． α−胎児タンパク質プロモーター、アルブミンプロモーター及びα−抗 トリプシンプロモーターからなる群より選択されるプロモーターの転写制御の下 に、そのゲノムに組み込まれているヒトＦＶＩＩＩ遺伝子を有する、ヒトＦＶＩ ＩＩに対して寛容化されているトランスジェニックマウス。 ９８． そのゲノムに組み込まれているＤＮＡ分子ｍＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ／ｐ ＧＫＮｅｏ又はそれらの断片を有するトランスジェニックマウス。 ９９． 緑色蛍光タンパク質に対して寛容化されている非ヒトトランスジェニッ ク動物の生成方法であって、 胚幹細胞に、合成プロモーター、組織特異的プロモーター及び発生的に調節さ れるプロモーターからなる群より選択されるプロモーターの転写制御の下に緑色 蛍光タンパク質遺伝子を含むＤＮＡ分子を形質移入する工程； 該薬剤選択マーカー遺伝子のタンパク質産生物の発現により耐性が付与される 薬剤の存在下において成長させることにより、そのゲノム内に該ＤＮＡ分子を含 む胚幹細胞を選択する工程； 該胚幹細胞を胚盤胞に微量注入する工程； 該胚盤胞を仮母に移植する工程； 得られた子孫を飼育する工程； 該子孫を緑色蛍光タンパク質遺伝子配列の存在について検定する工程；及び そのゲノム内に緑色蛍光タンパク質遺伝子配列が検出されている子孫をホモ接 合まで飼育する工程； を組み合わせて包含し、 それにより緑色蛍光タンパク質に対して寛容化されたトランスジェニック動物 が生じる方法。 １００． 前記動物がマウスである請求項９９に記載の方法。 １０１． 前記組織特異的プロモーターが肝臓特異的である、請求項９９に記載 の方法。 １０２． 前記組織特異的プロモーターがα−胎児タンパク質プロモーター、ア ルブミンプロモーター及びα₁−抗トリプシンプロモーターからなる群より選択 される、請求項９９に記載の方法。 １０３． 前記ＤＮＡ分子が図６２に示されるＢＳ由来ＲＩＰ−ｐＥＧＦＰ及び 図６０に示されるＡＦＰ−ｐＥＧＦＰ−１からなる群より選択される、請求項９ ９に記載の方法。 １０４． 緑色蛍光タンパク質に対して寛容化されているトランスジェニックマ ウス。 １０５． そのゲノムに安定に組み込まれている、図６２に示されるＢＳ由来Ｒ ＩＰ−ｐＥＧＦＰ及び図６０に示されるＡＦＰ−ｐＥＧＦＰ−１からなる群より 選択されるＤＮＡ分子を有するトランスジェニックマウス。 １０６． そのゲノム内にＡＡＶＳ１配列を含む非ヒトトランスジェニック緑色 蛍光タンパク質寛容化動物への、ＡＡＶ−ＩＴＲ及び緑色蛍光タンパク質遺伝子 を含むベクターのイン・ビボ送達を試験する方法であって、 該ベクターを該動物に注射する工程； 該動物から血液試料を単離し、該血液試料を緑色タンパク質の存在について分 析する工程； 該動物から肝臓組織を単離する工程； ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析により、緑色蛍光タンパク質遺伝子配列 をコードする核酸の存在について該肝臓組織を分析する工程； 該肝臓組織の凍結切片を調製し、蛍光顕微鏡技術を用いて該凍結切片を緑色蛍 光タンパク質の存在について分析する工程； を組み合わせて包含し、 緑色蛍光タンパク質の存在は該トランスジェニック動物内で検出される方法。 １０７． 前記非ヒトトランスジェニック動物がマウスである、請求項１０６に 記載の方法。 １０８． 図４２に示される、ＧＴ２０７４と呼ばれるＤＮＡ分子。 １０９． 図４３に示される、ｐＣＭＶ−ｈＦＶＩＩＩミニと呼ばれるＤＮＡ分 子。 １１０． 図６０に示される、ＡＦＰ−ｐＥＧＦＰ−１と呼ばれるＤＮＡ分子。 １１１． 図５８に示される、ｍＡＦＰ−ｈＦＶＩＩＩ／ｐＧＫＮｅｏと呼ばれ るＤＮＡ分子。 １１２． 図６２に示される、ＢＳ由来ＲＩＰ−ｐＥＧＦＰと呼ばれるＤＮＡ分 子。