JPH11507240A

JPH11507240A - 組み換えアデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス、細胞株、並びに生産方法並びにその使用

Info

Publication number: JPH11507240A
Application number: JP9502258A
Authority: JP
Inventors: ウイルソン，ジエイムズ・エム; フイシヤー，クリシユナ・ジエイ; ガオ，グアング−ピング
Original assignee: University of Pennsylvania Penn
Current assignee: University of Pennsylvania Penn
Priority date: 1995-06-05
Filing date: 1996-06-04
Publication date: 1999-06-29
Also published as: AU6277996A; US20030032613A1; US6270996B1; WO1996039530A3; US6261551B1; US6281010B1; WO1996039530A2; IL122347A0; CA2222880A1; AU715533B2; EP0835321A2

Abstract

(57)【要約】Ｅ１及びＥ４の両方の遺伝子領域を欠失した組み換えアデノウイルスの作成を可能にするアデノウイルスＥ１／Ｅ４を発現するパッケージング細胞株を提供する。調節配列の制御下の選択した導入遺伝子を含んでなる組み換えＡＡＶに標的細胞を感染させることにより、標的細胞中への組み換えＡＡＶの形質導入の効率を高めるための方法を提供する。感染した細胞を一本鎖組み換えウイルスのその二本鎖型への転化を促進する因子に接触させる。

Description

【発明の詳細な説明】組み換えアデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス、細胞株、並びに生産方法並びにその使用本発明は、国立衛生研究所助成番号ＨＤ３２６４９−０１、ＤＫ４７７５７及びＤＫ４９１３６により援助された。米国政府は、本発明に権利を有する。発明の分野本発明は、一般的に、体細胞遺伝子治療に、そしてより具体的には、遺伝子疾患の治療において有用な方法及び組成物に関する。発明の背景アデノウイルスは、様々な細胞型へ治療的またはレポーター導入遺伝子を効率よく運ぶように改変することができる真核生物のＤＮＡウイルスである［例えば、Ｍ．Ｓ．Ｈｏｒｗｉｔｚ等、「ＡｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅａｎｄＴｈｅｉｒＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第二版、１７１２頁、ｅｄ．Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ等、ＲａｖｅｎＰｒｅｓｓＬｔｄ．、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９０）を参照］。組み換えアデノウイルス（ｒＡｄ）は、細胞***の状態にかかわらず実質的に全ての細胞型へ非常に高いレベルの導入遺伝子の運搬を提供することができる。遺伝的不均衡を補う治療的導入遺伝子をインビボで運ぶことにおけるこの系の有効性は、様々な疾患の動物モデルで示されている［Ｋ．Ｆ．Ｋｏｚａｒｓｋｙ等、ＳｏｍａｔｉｃＣｅｌｌＭｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．、１９：４４９−４５８（１９９３）（「Ｋｏｚａｒｓｋｙ等Ｉ」）：Ｋ．Ｆ．Ｋｏｚａｒｓｋｙ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９：１３６９５−１３７０２（１９９４）（Ｋｏｚａｒｓｋｙ等 II）等］。インビボでの肝細胞中への遺伝子の形質導入における組み換えアデノウイルスの使用は、以前に齧歯類及びウサギにおいて示されている［例えば、上に引用したＫｏｚａｒｓｋｙ II及びＳ．Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９２：８８３−８９３（１９９３）を参照］。遺伝子治療のために開発された第一世代の複製能力を欠く組み換えアデノウイルスは、全Ｅ１ａ及びＥ１ｂ領域の一部の欠失を含む。この複製能力を欠くウイルスは、トランスに作用するＥ１ａタンパク質を提供する機能的なアデノウイルスＥ１ａ遺伝子を含んでいるアデノウイルスで形質転換した相補性ヒト胚腎臓細胞株、２９３細胞［ＡＴＣＣＣＲＬ１５７３］中で増殖する。Ｅ１を欠失したウイルスは、Ｅ１ａ及びＥ１ｂ領域の遺伝子産物をトランスに与える２９３細胞中で複製し、そして感染性ウイルスを生産することができる。得られたウイルスは、多数の細胞型に感染することができ、そして導入された遺伝子を（それ自身のプロモーターを保有する場合）発現することができるが、非常に高い感染多重度で細胞を感染させなければ、Ｅ１領域ＤＮＡを保有しない細胞中で複製できない。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、体細胞遺伝子治療のための遺伝子運搬媒体としての使用を提案されているヒトＤＮＡに組込むパルボウイルスである［Ｂ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ、「ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＰａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ」中、ｅｄ．、Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｒ、ＣＲＣＰｒｅｓｓ、１５５−１６８頁（１９９０）］。この小さい非エンベロープウイルスは、ｒｅｐ及びｃａｐと呼ばれる調節及びキャプシド遺伝子群をコードする４．６ｋｂの一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡゲノムを含む。Ｒｅｐポリペプチド（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ６２及びｒｅｐ４０）は、ＡＡＶゲノムの複製、レスキュー及び組込みに関与する。ｃａｐタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３）は、ウイルス粒子のキャプシドを形成する。１４５ｂｐの逆末端反復（ＩＴＲｓ）が、ｒｅｐ及びｃａｐの読み枠に５’及び３’末端で隣接し、この最初の１２５ｂｐはＹまたはＴ形の二重構造を形成することができる。ＩＴＲに含まれる必要なシス成分を保持しながら全てのウイルスの読み枠を治療的ミニ遺伝子で置き換えることにより、ＡＡＶの組み換え型（ｒＡＡＶ）がベクターとして開発されている［例えば、米国特許番号第４，７９７，３６８号；第５，１５３，４１４号；第５，１３９，９４１号；第５，２５２，４７９号；及び第５，３５４，６７８号；並びに１９９１年１１月２８日に公開された国際公開番号ＷＯ第９１／１８０８８号；１９９３年１２月９日に公開されたＷＯ第９３／２４６４１号及び１９９４年６月２３日に公開されたＷＯ第９４／１３７８８号を参照］。しかしながら、遺伝子治療のための形質導入媒体としてＡＡＶを確立するための進展は、様々な理由のために遅れている。例えば、組み込まれるプロウイルスは、染色体１９の特定の部位を優先的に標的とする。加えて、複製能力を欠く組み換え体の大規模な生産が困難である。ｒＡＡＶを生産するために用いる細胞は、必要なヘルパー機能を与えるためにアデノウイルスまたはヘルペスウイルスと共に感染されなければならず、このことにより培養物中の混成するウイルスから組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を精製することにおける問題が生じる。培養物中のヘルパーウイルスでの同時感染からＡＡＶを精製するにつれて、ｒＡＡＶが示す遺伝子形質導入効率が下がるので、遺伝子治療ベクターとしての精製した組み換えＡＡＶでの実際の実験は期待外れであった。さらなる組み換えアデノウイルス及びｒＡＡＶ、遺伝子治療による疾患及び疾病の治療におけるこれらの組み換えウイルスの効果的な使用を可能にする治療的組成物及び方法に対して、当該技術分野における必要性が依然として存在する。発明の要約本発明の一つの特徴として、アデノウイルス遺伝子Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ及びＥ４、またはこれらの機能的フラグメント、例えばＥ４の読み枠（ＯＲＦ）６を発現するパッケージング細胞株を提供する。他の特徴として、本発明は、Ｅ１及びＥ４遺伝子領域の機能的欠失を有するアデノウイルスのゲノムの少なくとも一部のＤＮＡ、発現を導く調節配列に適切に連結された適当な遺伝子及びアデノウイルスキャプシドを含んでなるｒＡｄを提供し、このｒＡｄは哺乳類の細胞に感染し、そしてインビボまたはインビトロでその細胞中で遺伝子産物を発現することができる。本発明は、上記のｒＡｄで感染させた哺乳類の細胞も提供する。さらに他の特徴として、本発明は、Ｅ１及びＥ４遺伝子領域の機能的欠失を有するアデノウイルスのゲノムの少なくとも一部のＤＮＡを含んでなるシャトルベクターを提供する。さらなる特徴として、本発明は、上記の組み換えＡｄを生産するための方法及び上記の組み換えＡｄを用いて哺乳類細胞中へ選択した遺伝子を運搬するための方法を提供する。他の特徴として、本発明は、標的細胞への組み換えＡＡＶの形質導入の効率を高めるための方法を提供する。簡潔に言えば、発現を導く調節配列に適切に連結された導入遺伝子を含んでなるｓｓ組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）で標的細胞を感染させ、そしてｓｓｒＡＡＶのその二本鎖（ｄｓ）型への転化を促進する因子に感染細胞を接触させることにより、この方法は機能する。ｓｓｒＡＡＶのｄｓｒＡＡＶへの転化が標的細胞中で起こり、標的細胞へのｒＡＡＶの増大した形質導入をもたらす。この因子は、ｓｓｒＡＡＶのｄｓｒＡＡＶへの転化を増大することのできるポリペプチドをコードする選択した遺伝子またはその機能的フラグメントを保有し、そして同じ標的細胞に同時感染するヘルパーウイルスであることができる。因子はまた、同じ機能を達成し、そして感染した標的細胞に適応される薬剤または化学的組成物であることもできる。この方法は、エクスビボ環境及びインビボの両方で機能することができる。さらに他の特徴として、本発明は、遺伝的疾病または疾患の治療における使用を意図する導入遺伝子及び誘導性または構成的調節配列に適切に連結された少なくとも一つの付加的な遺伝子の両方を含む新規な組み換えＡＡＶを提供する。付加的な遺伝子は、発現すると、単独でまたは他の付加的な遺伝子と一緒にｓｓｒＡＡＶのそのｄｓ型への添加を促進することのできるポリペプチドをコードする。好ましい態様において、付加的な遺伝子は、アデノウイルスＥ４またはその機能的フラグメントである。また、標的細胞中への新規なｒＡＡＶの形質導入の効率を高めるための方法も開示される。本発明の新規なｒＡＡＶ及び方法は、遺伝性疾患、癌及び他の遺伝的機能障害を治療するためのエクスビボ及びインビボでの遺伝子治療処置プロトコルで使用するための製薬学的組成物においても有用である。本発明の他の特徴及び利点は、その好ましい態様の以下の詳細な説明においてさらに記述される。図面の簡単な説明図１は、ヒトＥ４ＯＲＦ６遺伝子配列を制御するそれぞれＭＭＴＶまたはヒツジＭＴプロモーター、成長ホルモン遺伝子のターミネーター配列（ＧＨ）、ＳＶ４０ｏｒｉ、ｎｅｏ^R遺伝子を含んでいるｐＢＲ３２２に基づくプラスミド配列、ＳＶ４０ポリＡ部位及びａｍｐ^R遺伝子を含む典型的なプラスミドｐＭＭＴＶＥ４ＯＲＦ６［配列番号１］またはｐＭＴＥ４ＯＲＦ６の概要図である。図２は、示した制限エンドヌクレーゼ酵素部位を有するｒＡｄＨ５．００１ＣＢｌａｃＺ［配列番号３］の図式地図である。縞のある棒はＣＢＬａｃＺミニ遺伝子を表し、黒い棒はＡｄ５ウイルスバックボーンを表し、網状線の棒はＡｄＥ４欠失を表す。図３は、Ｈ５．００１ＣＢＬａｃＺで感染したＥ４補足細胞株に対するＬａｃＺ形成単位（ＬＦＵ）／ｍｌ対時間（時間）を表す。図４Ａは、ＬＦＵ／ｍｌの単位の感染後（ｐｉ）２４時間での収量及びＯＲＦ６タンパク質（ａｂｓ．ｍｍ）対誘導因子デキサメタゾンの濃度（μＭ）を表している、２９３−２７−１８パッケージング細胞における誘導、ＯＲＦ６発現及びウイルス生産のグラフである。Ａｂｓ．ｍｍは、ウェスタンブロットにおけるタンパク質バンドの大きさの強度であり、ｍｍ²単位の吸収及びタンパク質の大きさを反映する。四角は、感染後２４時間での収量である。ひし形は、感染後２４時間で検出されたＯＲＦ６タンパク質である。図４Ｂは、パッケージング細胞が２９３−１０−３細胞であることを除いて、図４Ａのものと同様のグラフである。記号は、図４Ａに記述されたようである。図５Ａは、感染したＨｅｌａ細胞からのライセート中のβ−ガラクトシダーゼ酵素活性を表す棒グラフである。水平軸は、ｒＡＡＶ、ＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺに対するアデノウイルスの添加を示している記号「＋」と共にＨｅＬａ細胞へ感染させたアデノウイルスを示す。垂直軸は、ＯＮＰＧを用いた細胞内のβ−ガラクトシダーゼの比活性（ｍＵｎｉｔｓ／ｍｇタンパク質）を示す。各棒の下に、ＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺベクターのみを与えられた細胞に対する比活性の誘導倍率を示す。図５Ｂは、ｒＡＡＶで同時感染したＨｅＬａ細胞における野生型Ａｄ５またはＥ２突然変異体ｄ１８０２のＡｄ感染多重度（ＭＯＩ）対細胞内β−ガラクトシダーゼ比活性を表している棒グラフである。実施例１１を参照。図６Ａは、実施例１２によりｗｔＡｄ５及びｒＡＡＶで感染したＨｅＬａ細胞に対して、β−ガラクトシダーゼの比活性及び分当たりのカウント（ＣＰＭ）が垂直軸に沿って表され、そしてアデノウイルスＭＯＩが水平軸上にあるグラフである。低いＭＯＩ（１、５及び１０）感染から得られたデータが示される。図６Ｂは、細胞をＡｄ突然変異体ｄ１８０２で感染させたことを除いて図６Ａのものと同様のグラフである。図７Ａは、Ｒｅｐの存在下（＋Ｒｅｐ）またはＲｅｐの非存在下（−Ｒｅｐ）での相補的なＡＡＶ鎖のリーディング鎖合成のためのモデルを示す。Ｒｅｐは、閉じた末端を有する二重構造を開いた末端の二重構造に転化することができる末端分解活性を発現する。Ｒｅｐの非存在下では、共有結合的に閉じたヘアピン構造を元のまま残して末端の分解が正常に機能しない。レスキューされたｄｓＡＡＶゲノムの両方の鎖がウイルス粒子にパッケージされるので、これらの条件下でヘアピンは左側及び右側に見いだされると期待される。図７Ｂは、ＡＡＶＩＴＲ、ＣＭＶ即時型初期エンハンサー／プロモーター（ＣＭＶ）、ＳＶ４０スプライス供与体−スプライス受容体（ＳＤ／ＳＡ）、大腸菌β−ガラクトシダーゼｃＤＮＡ（ＬａｃＺ）及びＳＶ４０ポリＡシグナル（ｐＡ）を含む標識した領域を有する直鎖状ＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺの概要図である。ｂｐ位置１０３５及び４５０９に位置する２個のＮｏｔＩ部位が示される。図７Ｃは、ｒＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺの閉じた末端及び開いた末端のフラグメントを示す。図７Ｄ、７Ｅ及び７Ｆは、末端分解なしにｓｓＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺの位置４５０９でのＮｏｔＩ消化により生じた、開いた末端の及び共有結合的に閉じた二重構造フラグメントの混合物を示す。ＮｏｔＩ４５０９消化は、ハイブリダイゼーション標的（すなわち、ＳＶ４０ｐＡ）に関連して、右のＩＴＲを含む３６１ｂｐフラグメントを遊離する簡便な方法を提供する。末端分解があると、開いた末端の３６１ｂｐフラグメントのみがそのような消化により生じると予想される（図７Ｄ）。図８Ａは、ＡＶＣＭＶＬａｃＺで形質導入した細胞株２９３（ＭＴ−ＯＲＦ６）に対する、β−ガラクトシダーゼの比活性（ｍＵｎｉｔｓ／ｍｇタンパク質）対増加する濃度の亜鉛（μＭ）誘導因子（各棒の下第一列）を表す棒グラフである。２９３細胞に対する誘導倍率（各棒の下第二列）及び亜鉛の非存在下で維持した２９３（ＯＲＦ６）細胞に対する誘導倍率（第三列）も与えられる。図８Ｂは、ｒＡＡＶの二重構造モノマー複製分子型（ＲＦｍ）のＣＰＭ対各棒の下に誘導のために用いた亜鉛の濃度（μＭ）及び０ｍＭ亜鉛中で維持した２９３（ＯＲＦ６）細胞に対する誘導倍率を表す棒グラフである。図８Ｃは、ＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺ形質導入効率を表す誘導特性の図式的な比較である。図８Ａからの比活性データ及び図８ＢからのＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺＲＦｍのＣＰＭデータが垂直軸に沿って表され、そして実験中に用いた硫酸亜鉛の濃度が水平軸に沿って示される。図９は、硫酸亜鉛誘導因子の非存在下または５０、１００、１５０、２００もしくは２５０μＭの硫酸亜鉛誘導因子の存在下で１，０００ＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺウイルス粒子／細胞のＭＯＩで形質導入したＨｅＬａ（ＭＴ−ＯＲＦ６）細胞に対して、比活性（ミリユニットβ−ガラクトシダーゼ／ｍｇタンパク質）対誘導のために用いた亜鉛の濃度（水平軸下第一列）、ＨｅＬａ細胞に対する誘導倍率（第二列）及び亜鉛の非存在下で維持したＨｅＬａ（ＭＴ−ＯＲＦ６）細胞に対する誘導倍率（第三列）を表す棒グラフである。図１０は、プラスミドｐＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺ［配列番号４］の概要図である。図１１は、プラスミドｐＡＶ．ＣＭＶＡＬＰ．ＧＲＥ−ＯＲＦ６［配列番号５］を示す。発明の詳細な説明本発明は、Ｅ１及びＥ４遺伝子の両方を機能的に欠失した組み換えアデノウイルス（ｒＡｄ）の生産を可能にするパッケージング細胞株を提供する。そのようなｒＡｄでの疾患の治療的処置を可能にするこれらのｒＡｄ及び方法が開示される。体細胞遺伝子治療プロトコルにおける発現用導入遺伝子を含んでいる組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の形質導入効率を高めるための新規な「第二世代」ｒＡＡＶ及び方法も提供される。本発明の方法及び組成物は、骨髄移植の前の骨髄細胞の望ましい造血幹細胞プロジェニター遺伝子での形質導入のような遺伝子治療のエクスビボでの応用において有用である。本発明の態様は、嚢胞性線維症のような遺伝的疾患の患者における望ましい遺伝子の形質導入を含む、遺伝子治療ベクターによる患者の直接的なインビボ治療のための製薬学的組成物においても有用である。Ｉ．パッケージング細胞株導入遺伝子の受容量を増し、そしてｒＡｄの免疫反応を減少するために、できるだけ多くのウイルス遺伝子をアデノウイルスを不活性化するために欠失しなければならない。しかしながら、そのような欠失Ａｄの構築及び増殖のための補足細胞株を作成することは難しい。本発明の方法及び組成物は、第一世代のＥ１欠失アデノウイルスに対して遺伝子治療において以前同定されたいくつかの問題を克服し、そして特に筋肉組織への投与に利点を示す。Ａｄ血清型５の初期領域４（Ｅ４）は、ウイルスＤＮＡの複製、宿主細胞の遮断及び後期ｍＲＮＡの蓄積に関与すると考えられる７個のＯＲＦからなる。Ｅ４を欠失したｒＡｄを作成するためには、ヘルパーウイルスまたはパッケージング細胞株により、Ｅ４領域の機能がｒＡｄに提供されなければならない。しかしながら、機熊するＡｄＥ１及び機能的なＥ４の単一の細胞株における連続した発現は、通常、細胞に対して有毒であるので、有用なパッケージング細胞株はこれまで利用できないでいる。従って、そのような細胞は、ｒＡｄの増殖及び複製のために有用ではない。さらに、機能的なＡｄＥ１及びＡｄＥ４遺伝子をコードしているＤＮＡは、パッケージング細胞株中に存在する場合、ｒＡｄウイルスとの組み換えの機会を増し、ウイルスの野生型Ａｄウイルスへの復帰を引き起こす可能性がある。本発明は、Ａｄ５Ｅ１遺伝子及びＡｄ５Ｅ４遺伝子のＯＲＦ６のみを含むパッケージング細胞株を提供することにより、これらの問題を回避する。Ｅ４のＯＲＦ６のみで、ウイルスの生活環におけるＥ４に対する要件を提供することができる。本発明によると、ＯＲＦ６は、好ましくは、誘導性プロモーターの転写制御下にある。グルココルチコイド、特にデキサメタゾンにより誘導できるマウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターが現在好ましい。ＭＭＴＶプロモーターのＤＮＡ配列は、配列番号１のヌクレオチド１−１５０６に及ぶ。他の誘導性プロモーターは、亜鉛により誘導できるヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーターである［Ｍ．Ｇ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１７４：４１７−４２４（１９８８）］。しかしながら、ＭＴプロモーターの硫酸亜鉛誘導因子は、それ自体が細胞に対して有毒である可能性がある。１９９５年５月１８日に開示され、本明細書の参考文献に含まれる国際特許出願ＷＯ第９５／１３３９２号において同定されたもののような他の誘導性プロモーターもまた、本発明のパッケージング細胞株の生産に用いることができる。構成的Ａｄ５Ｅ４領域プロモーター、ＶＴＲのような構成的プロモーターをＯＲＦ６の発現の制御に用いることができる。誘導性プロモーターを利用する本発明のパッケージング細胞株は、Ｅ４ＯＲＦ６遺伝子の発現を調節することにより毒性の発生を制御することを可能にする。Ａｄ配列を含んでいる適切なシャトルベクターを細胞株にトランスフェクトした後、Ｅ４ＯＲＦ６の発現を適当な誘導因子により誘導することができる。従って、パッケージング細胞は、細胞が有毒になる前に、ｒＡｄの生産的な感染及び回復を可能にするのに十分な期間ｒＡｄに対してＡｄＥ１及びＡｄＥ４ＯＲＦ６の両方の遺伝子産物を提供することができる。現在のところ、細胞が毒性を感じる前の期間は約１０日である。最も好ましい形態において、パッケージング細胞株は、誘導性プロモーターの制御下のＥ４ＯＲＦ６配列を導入するヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｅ１発現細胞株である。当該技術分野の熟練した者は、選択したアデノウイルス血清型のＥ１ａ、Ｅ１ｂ及びＥ４ＯＲＦ６遺伝子を発現する新規な細胞株の作成のために他の親細胞株を選択することができることを理解するはずである。そのような親細胞株の中に、ＨｅＬａ［ＣＣＬ２］、Ａ５４９［ＣＣＬ１８５］、ＫＢ［ＣＣＬ１７］、Ｄｅｔｒｏｉｔ［例えば、Ｄｅｔｒｏｉｔ５１０、ＣＣＬ７２］及びＷＩ−３８［ＡＴＣＣＣＣＬ７５］細胞を含むことができる。これらの細胞株は、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１２３０１ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡから全て入手できる。他の適当な親細胞を他の供給者から入手することができる。そのような親細胞を改変のために選択する場合、例えば、適当なプロモーター下にＥ１ａ及びＥ１ｂ遺伝子またはそれらの機能的フラグメントを含んでいるプラスミドでのトランスフェクションによるようにこれらの遺伝子機能を、並びに本明細書に記述したようにＯＲＦ６遺伝子を、その細胞株にさらに供給する必要がある。実施例１は、Ａｄ５Ｅ４領域のＯＲＦ６のみ、または機能的な比較のために全Ｅ４領域を含んでいるパッケージング細胞株の構築を教示する。簡潔に説明すれば、Ａｄ５Ｅ４遺伝子の全Ｅ４領域及びＯＲＦ６配列が既知の技術［例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ．ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ．」、第二版。、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８９）及びその中に引用された参考文献を参照］により得られる。ＯＲＦ６領域を単離するために、固定(anchored)ＰＣＲ技術がＯＲＦ６配列をその開始コドンから終止コドンまでを増幅するために用いられた。ＯＲＦ６の開示された配列から選択したプライマーが、ＯＲＦ配列及びその配列の末端への挿入制限部位を増幅するために用いられた。Ｅ４ＯＲＦ６配列それ自体は、配列番号１のヌクレオチド１５２３から２４０８までとして再生される。全Ｅ４遺伝子配列は、Ａｄ５のジーンバンク配列［ジーンバンク登録番号Ｍ７３２６０］に開示されている。選択したプロモーターの制御下にＯＲＦ６配列を配置するミニ遺伝子が構築された。本明細書に用いられる「ミニ遺伝子」は、発現される適切な配列（この特別な例において、ＯＲＦ６配列）及びそのミニ遺伝子を含有する細胞中でその適切な配列を転写し、遺伝子産物を発現するために必要な他の調節成分の組み合わせを意味する。ＯＲＦ６配列遺伝子は、その転写を可能にするように調節成分に適切に連結される。そのような成分は、ＯＲＦ６発現を導くプロモーターのような通常の調節成分を含む。ある誘導性プロモーターは、Ｚｎ²⁺誘導性ＭＴプロモーターであり、またあるものは、配列番号１のデキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶプロモーターであった。ミニ遺伝子はまた、転写物の効率よいポリＡ付加のために必要なシグナルを与える配列（ポリ−ＡまたはｐＡ）を含む、ＯＲＦ６ウイルス配列と異種起源の核酸配列も含む。本発明に用いられる一般的なポリ−Ａ配列は、成長ホルモン（ＧＨ）遺伝子ターミネーター配列由来のものである（配列番号１のヌクレオチド２４０９−３６５４）。ポリ−Ａ配列は、通常、ＯＲＦ６配列に続いてミニ遺伝子に挿入される。実施例１に記述したＭＭＴＶ−ＯＲＦ６ミニ遺伝子に用いられたポリＡ配列［配列番号１］は、ＧＨ遺伝子ターミネーター及びＳＶ４０複製起点（ｏｒｉ）により与えられる。当該技術分野の熟練した者は、Ｅ４ＯＲＦ６配列をシャトルプラスミドに移すために、プロモーター配列、ポリＡ配列及び／またはＳＶ４０ｏｒｉの異なる同じようなミニ遺伝子も考案することができる。これら及び他の一般的なベクター成分の選択は慣例であり［例えば、上に引用したＳａｍｂｒｏｏｋ等及びその中に引用された参考文献を参照］、多くのそのような配列を商業的及び工業的供給者から、並びにジーンバンクから入手できる。ＯＲＦ６を含んでいるミニ遺伝子は、ネオマイシン耐性遺伝子を含むｐＢＲ３２２に基づくシャトルプラスミド中にサブクローン化され、図１のシャトルベクターを生じた。多数の既知のバクテリアシャトルベクターのいずれでも、そのベクターがレポーター遺伝子または多数、例えば、ネオマイシン、アンピシリンまたはプリマイシンが当該技術分野において既知である選択可能なマーカーを含むなら、ミニ遺伝子を保有するために用いることができる。当該技術分野の熟練した者は、プラスミドでトランスフェクトした細胞の染色体中にＯＲＦ６ミニ遺伝子を同様に導入することができる、他のプラスミド成分を用いた他の適当なシャトルベクターを開発することができると予想される。実施例１においてさらに説明するように、他のシャトルベクターが比較の目的のために考案され、これは内因性Ｅ４プロモーターの存在下または非存在下で構成的レトロウイルスＭＬＶＬＴＲ配列の制御下の完全なまたは実質的に完全なＡｄ５Ｅ４領域を含む。ＯＲＦ６ミニ遺伝子（または全Ｅ４領域）を保有するシャトルプラスミドが、ＡｄＥ１遺伝子産物を発現するＨＥＫ２９３細胞中に導入された。これらのＡｄＥ４またはＯＲＦ６遺伝子をそれらの内因性プロモーターまたは異種起源の誘導性プロモーターのいずれかから発現する補足細胞株が作成された。これらの細胞株は、それらの遺伝的構成、Ｅ４タンパク質合成、組み換えＡＡＶヘルパー機能、Ｈ５ｄ１１００４ウイルスの相対的プラーク効率及び組み換えＥ１／Ｅ４欠失アデノウイルスの増殖反応速度論によりさらに特徴づけられる。典型的なＥ１／Ｅ４発現パッケージング細胞株のこれらの特性は、以下の実施例において詳細に説明される。 II．組み換えアデノウイルスＥ１／Ｅ４発現細胞株は、哺乳類の細胞及び組織へ適当な遺伝子を運ぶことができるＥ１／Ｅ４欠失ｒＡｄの構築において有用である。これらのｒＡｄは、少なくともＥ１ａ、Ｅ１ｂ及びＥ４Ａｄ遺伝子領域を機能的に欠失する。「機能的に欠失する」という用語は、遺伝子領域がもはや遺伝子発現産物を生産できないように、例えば突然変異または改変により、その遺伝子領域のかなりの量が除去されるまたはそうでなければ損傷を受けることを意味する。必要な場合、全遺伝子領域を除去することができる。パッケージング細胞株中で増殖したｒＡｄを用いたインビボ実験において、Ｅ１／Ｅ４欠失ｒＡｄは、特に筋肉細胞へ導入遺伝子を導入することにおける有用性を示した。シャトルベクター、必要な場合ヘルパーウイルス、及びｒＡｄの構築に用いられるアデノウイルス配列、並びに本明細書に記述したベクター及びウイルスの構築に用いられる他の成分及び配列を、以前に開示され、記述された配列に基づき商業的または学究的供給者から容易に入手することができる。ウイルス材料も個々の患者から入手することができる。当該技術分野の熟練した者が既知であり、そして行っている標準的な組み換え分子クローニング技術と一緒に、本明細書に含まれる教示及び参考文献を用いてウイルス配列及びベクター成分を作成することができる。配列の欠失、挿入及び本明細書により教示される他の突然変異を含む、ベクターを形成している存在する核酸配列の改変を標準的な技術を用いて作成することができる。同様に、ベクター、「ミニ遺伝子」のクローニング及び構築、並びに適切なウイルスシャトルベクターへのその挿入及び組み換え感染性ウイルスの生産に有用なウイルス配列の選択のために用いる方法は、本明細書に提供される教示を与えられれば、当該技術分野の技術の範囲内である。Ａ．導入遺伝子の構築この文脈において「ミニ遺伝子」は、このミニ遺伝子の成分がエクスビボまたはインビボで遺伝子産物を発現するために設計されることを除いて上のように定義される。そのような成分は、ｒＡｄでトランスフェクトした細胞中で導入遺伝子の発現を導くために必要な通常の調節成分を含む。このミニ遺伝子のために、選択したプロモーターが導入遺伝子に適切に連結され、そして他の調節成分と共に組み換えベクターの選択したウイルス配列内に配置される。プロモータの選択は通常のことであり、本発明の制限ではない。有用なプロモータは、構成的プロモーターまたは調節された（誘導性）プロモータであることができ、これらは発現される導入遺伝子の量を制御することができる。例えば、望ましいプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時型初期プロモーター／エンハンサー［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ等、Ｃｅｌｌ、４１：５２１−５３０（１９８５）を参照］のものである。他の望ましいプロモーターは、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーター／エンハンサーを含む。さらに他のプロモーター／エンハンサー配列は、ニワトリ細胞質β−アクチン（ＣＢ）プロモーター［Ｔ．Ａ．Ｋｏｓｔ等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、１１（２３）：８２８７（１９８３）］である。当該技術分野の熟練した者は、他の適当なプロモータを選択することができる。ミニ遺伝子は、望ましくは、上記のように、ポリ−Ａ配列並びに機能的なスプライス供与体及び受容体部位を有するイントロンを含む、ウイルスベクター配列と異種起源の核酸も含むことができる。ポリ−Ａ配列は、通常、導入遺伝子配列の後でそして３’アデノウイルス配列の前でミニ遺伝子に挿入される。本発明のミニ遺伝子は、望ましくはプロモーター／エンハンサー配列及び導入遺伝子の間に配置されるイントロンも含むことができる。これらの及び他の一般的なベクター成分の選択は上記のように慣例であり、そして多くのそのような配列を商業的及び工業的供給者から、並びにジーンバンクから入手できる。上に記述したように、ミニ遺伝子は、ｒＡｄ中のあらゆる選択した欠失の部位に配置される。Ｅ１／Ｅ４欠失ｒＡｄＨ５．００１ＣＢＬａｃＺにおいて、導入遺伝子は欠失したＥ１遺伝子領域に配置される。しかしながら、要求されるように、導入遺伝子をアデノウイルス配列の他の場所に配置することができる。Ｂ．組み換えアデノウイルスの生産本発明に有用なアデノウイルス配列は、ジーンバンクから入手できる型Ａｄ５［ジーンバンク登録番号Ｍ７３２６０］を含む多数のアデノウイルス型のＤＮＡ配列を含むことができる。血清型２、３、４、７、１２及び４０のような、そしてさらに現在同定されている４１種のヒト型［例えば、上に引用したＨｏｒｗｉｔｚを参照］を含む、あらゆる既知のアデノウイルス血清型からアデノウイルス配列を得ることができる。同様に、他の動物に感染することが知られているアデノウイルスも本発明のベクター構築物に用いることができる。アデノウイルス型の選択は、以下の本発明を制限すると予想されない。様々なアデノウイルス株がＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄから入手でき、または様々な商業的及び研究所の供給者から請求により入手できる。以下の典型的な態様において、アデノウイルス型５（Ａｄ５）が便宜上用いられる。しかしながら、異なるヒトアデノウイルス血清型に基づく様々なアデノウイルスシャトルベクターを得ることが望ましい。細胞性及びおそらく体液性免疫を回避し、そして導入遺伝子発現の期間を延長し、並びに繰り返された治療的処置の結果を向上するための治療的投薬計画において、そのようなプラスミドのライブラリー及び得られたｒＡｄは有用であると予想される。加えて、様々な血清型の使用は、異なる組織標的特異性を有するｒＡｄを生産すると考えられる。さらに、本発明のｒＡｄにおけるアデノウイルス遺伝子Ｅ１及びＥ４の欠如は、Ｅ１遺伝子のみを欠失したｒＡｄの破壊を通常引き起こす不都合なＣＴＬ反応を減少または除去するはずである。本発明のｒＡｄは、Ｅ４遺伝子領域も完全にまたは機能的に欠失した、組み換えの欠損（すなわち、Ｅ１欠失）を有するアデノウイルスである。Ｅ４遺伝子領域の機能的な欠失を、他のアッセイの中で実施例２及び３のアッセイにより評価することができる。本発明に有用なｒＡｄは、場合によっては、Ｅ２ａ遺伝子領域に他の突然変異、例えば温度感受性（ｔｓ）突然変異及びＥ３遺伝子領域に欠失を有することができる。本発明のアデノウイルスは、（ｍｕ１．３ないし４．５に及ぶ）アデノウイルス初期即時型初期遺伝子Ｅ１ａ及び（ｍｕ４．６ないし１１．２に及ぶ）遅延型初期遺伝子Ｅ１ｂの機能的な欠失を含む。同様に、このアデノウイルスは、（ｍｕ９２ないし９７．２に及ぶ）全Ｅ４領域のまたはＥ４領域の少なくともＯＲＦ６の機能的な欠失を有する。本発明のＥ１／Ｅ４欠失ｒＡｄにおいて場合によっては欠失することができる遺伝子領域は、（ｍｕ７６．６ないし８６．２に及ぶ）アデノウイルス遅延型初期遺伝子Ｅ３の全てまたは一部を含む。Ｅ３の機能は、ｒＡｄの機能及び生産に無関係である。本発明のｒＡｄは、アデノウイルスタンパク質の減少した発現及び／または減少したウイルス複製をもたらす突然変異も有することができる。例えば、（ｍｕ６７．９ないし６１．５に及ぶ）アデノウイルス遅延型初期遺伝子Ｅ２ａ中にｔｓ突然変異を導入することができる。そのような突然変異の中に、Ａｄ５Ｈ５ｔｓ１２５株［Ｐ．ＶａｎｄｅｒＶｉｌｅｔ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１５：３４８−３５４（１９７５）］において６２．５ｍｕで見いだされた（ＤＢＰ）Ｅ２ａ領域におけるミスセンスｔｓ突然変異の取り込みを含む。この株のＥ２ａ遺伝子から生産される７２ｋｄタンパク質のカルボキシ末端（６２．５ｍｕ）での単一のアミノ酸置換は、ｓｓＤＮＡ結合タンパク質であり、アデノウイルスゲノムＤＮＡの複製に関与するタンパク質産物を生じる。許容温度（約３２℃）では、このｔｓ株はＨｅＬａ細胞中で完全な生活環増殖ができ、一方、非許容温度（約３８℃）ではアデノウイルスＤＮＡの複製が見られない。加えて、非許容温度では、ＨｅＬａ細胞中に減少した免疫反応性の７２ｋｄタンパク質が見られる。例えば、Ｊ．Ｆ．Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ等、Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．、５：１２１７−１２２９（１９９４）；Ｊ．Ｆ．Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１；：６１９６−６２００（１９９４）及び１９９５年５月１８日に開示され、引用することにより本明細書に取り込まれる国際特許出願ＷＯ第９５／１３３９２号を参照。しかしながら、当該技術分野または他において以前記述されたようなアデノウイルスゲノムにおける他の欠失もまた、本発明のｒＡｄに生じることができると理解されなければならない。ｒＡｄの一つの最小型は、全てのウイルス遺伝子を欠失したアデノウイルスゲノム配列を含むことができる。より詳細には、このアデノウイルス配列は、（oriとして働く）アデノウイルスのシスに作用する５’ 及び３’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、並びに直鎖状のＡｄゲノムをパッケージングするために必要な配列及びＥ１プロモーターのためのエンハンサー成分を含む天然の５’パッケージング／エンハンサー領域のみであることが可能である。５’ＩＴＲ及びパッケージング／エンハンサー領域（Ａｄ５ｍｕ０−１またはｂｐ１−３６０）を含んでいるアデノウイルス５’配列を、本発明のｒＡｄの５’アデノウイルス配列として用いることができる。アデノウイルスゲノムの約ｂｐ３５，３５３−末端または地図単位〜９８．４−１００に及ぶアデノウイルスゲノムの右末端（３’）ＩＴＲ配列を含んでいる３’アデノウイルス配列を、望ましくはｒＡｄの３’配列として用いることができる。Ｅ１及びＥ４遺伝子を明らかに欠いているこれらの配列は、ｒＡｄのミニ遺伝子に隣接またはこれと適切に結合することができる。次に、あらゆる他の必要なＡｄ遺伝子産物が、本発明のヘルパーウイルス及びＥ１／Ｅ４ＯＲＦ６発現パッケージング細胞により供給される。本発明における使用のための典型的なｒＡｄを、例えば、遺伝子治療用途のための他のｒＡｄを作成するために一般的に用いられている技術である、様々なｒＡｄからの適切なフラグメントの相同組み換えにより得ることができる。以下の実施例において、代表的なｒＡｄ、Ｈ５．００１ＣＢＬａｃＺは、アデノウイルスｄ１１００４（Ｈ５ｄｌ１００４でもある）ウイルスバックボーン及びｐＡｄＣＢＬａｃＺミニ遺伝子ＤＮＡ間の相同組み換えにより構築される。Ｈ５ｄｌ１００４は、地図単位約９２．１から地図単位９８まで、すなわち実質的に全Ｅ４遺伝子を欠失したＡｄ５ウイルスである。ｄｌ１００４ウイルスは、Ｂｒｉｄｇｅ及びＫｅｔｎｅｒ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６３２（２）：６３１−６３８（１９８９年２月）に記述されている。ｐＡｄＣＢＬａｃＺベクターは、Ａｄｍ．ｕ．０−１、以下に記述するような他の調節成分と共に、ニワトリβ−アクチンプロモーターの制御下にバクテリアのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が挿入され、そしてＡｄｍ．ｕ．９−１６が隣接するＥ１欠失、及びプラスミド配列を含んでいるｃＤＮＡプラスミドである。本発明のパッケージング細胞株における本発明のＥ１／Ｅ４ｒＡｄの生産は、通常の技術を利用する。そのような技術は、指定研究書［上に引用したＳａｍｂｒｏｏｋ等］に記述されたような通常のクローニング技術、アデノウイルスゲノムの重複するオリゴヌクレオチド配列の使用、ＰＣＲ及び適切なヌクレオチド配列を与えるあらゆる適当な方法を含む。標準的なトランスフェクション及び同時トランスフェクション技術、例えば、相補性２９３細胞株を用いたＣａＰＯ₄ トランスフェクション技術を用いる。用いる他の常法は、ウイルスゲノムの相同組み換え、寒天オーバーレイにおけるウイルスのプラーク形成、シグナル発生を測定する方法などを含む。例えば、適切なミニ遺伝子を含むプラスミドベクターｐＡｄＣＢＬａｃＺの構築及び組み立ての後、本発明のＥ１／Ｅ４発現パッケージング細胞株をヘルパーウイルスＨ５ｄｌ１００４で感染させる。次に、この感染細胞株を続いて常法によりアデノウイルスプラスミドベクターでトランスフェクトする。Ｅ４を欠失したＨ５ｄｌ１００４ヘルパー及びｐＡｄＣＢＬａｃＺベクターの間で相同組み換えが起こり、これはベクター中のアデノウイルス−導入遺伝子配列が複製され、そしてウイルス粒子キャプシド中にパッケージングされることを可能にし、ｒＡｄを生じる。トランスフェクト後約３０またはそれ以上の時間で、細胞を集め、抽出物を調製し、そしてＬａｃＺ導入遺伝子を含んているｒＡｄをＣｓＣｌ勾配中の浮遊密度超遠心により精製する。 III．遺伝子治療における組み換えウイルスの使用上記のようにアデノウイルスベクター及びＥ４を欠失したヘルパーウイルス及びパッケージング細胞株の協力により生産される導入遺伝子を含んでいるｒＡｄは、インビボまたはエクスビボで製薬学的組成物中の導入遺伝子を患者へ運び、そして哺乳類細胞中へのその遺伝子の組み込みを与えることのできる効率よい遺伝子導入媒体を提供する。ｒＡｄは、遺伝子治療のために常法でヒトに投与され、そして導入遺伝子が向けられる疾患に対する代わりのまたは補足的な遺伝子治療として働く。本発明のｒＡｄを、好ましくは、生物学的に適合する溶剤または製薬学的に受容しうる運搬賦形剤中に懸濁して患者に投与することができる。適当な賦形剤は滅菌食塩水を含む。製薬学的に受容しうる担体であることが知られ、そして当該技術分野の熟練した者によく知られている他の水性及び非水性の等張滅菌注入溶剤、並びに水性及び非水性の滅菌懸濁剤をこの目的のために用いることができる。ｒＡｄは、適切な標的細胞、例えば、筋肉、肝臓、上皮等をトランスフェクトし、そして医学の当該技術分野の熟練した者が決定することのできる過度に不都合でないまたは医学的に受容しうる生理学的効果を有して治療利益を提供するのに十分なレベルの導入遺伝子の導入及び発現を与えるために十分な量で投与される。通常のそして製薬学的に受容しうる投与経路は、筋肉または他の選択した細胞への直接運搬、鼻内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、経口及び他の非経口投与経路を含む。要求される場合、投与経路を組み合わせることができる。ｒＡｄの服用量は、主に、治療される状態、患者の年齢、体重及び健康のような因子により決まり、従って患者間で変わる可能性がある。例えば、ｒＡｄの治療的に有効なヒト服用量は、通常、約１ｘ１０⁹から１ｘ１０¹¹ｐｆｕ／ｍｌまでの濃度のウイルスを含んでいる食塩水溶液の約２０から約１００ｍｌまでの範囲である。好ましいヒト服用量は、２ｘ１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌで約５０ｍｌの食塩水溶液であると概算される。服用量は、あらゆる副作用と治療利益を比較検討して調整される。投与の頻度を決定するために導入遺伝子の発現レベルを調べることができる。場合によっては、方法工程は、ｒＡｄの投与と同時にまたはその前もしくは後のいずれかに適量の短時間作用形の免疫調節剤を患者へ共投与することを含む。選択される免疫調節剤は、本明細書において、本発明の組み換えベクターに対して誘導される中和抗体の形成を阻止することができる、またはベクターの細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）除去を阻止もしくは実質的に遅らせることのできる因子として定義される。望ましい免疫調節剤の中には、インターロイキン−１２［欧州特許出願番号第４４１，９００号］；γ−インターフェロン［Ｓ．Ｃ．Ｍｏｒｒｉｓ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５２：１０４７（１９９４）］；インターロイキン−４［米国特許番号第５，０１７，６９１号］；抗−ＯＫＴ³⁺［例えば、米国特許番号４，６５８，０１９号を参照］または抗体ＧＫ１．５（ＡＴＣＣ受託番号ＴＩＢ２０７）のようなＣＤ４タンパク質に対する抗体；可溶性ＣＤ４０分子またはＣＤ４０リガンドに対する抗体（Ｂｒｉｓｔｏｌ−ＭｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂＣｏ）［１９９３年８月１８日に公開された欧州特許出願第５５５，８８０号］；Ｂ７の可溶性形またはＣＤ２８もしくはＣＴＬＡ４に対する抗体［ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−ＭｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂＣｏ）、１９９４年７月２０日に公開された欧州特許出願６０６，２１７号］、あるいはシクロスポリンＡまたはシクロホスファミドのような薬剤がある。従って、本発明の製薬学的組成物及び方法は望ましい遺伝子治療処置を提供する。 IV．組み換えアデノ随伴ウイルス以下の文脈において、「導入遺伝子」という用語は、目的のポリペプチドまたはタンパク質をコードする、ＡＡＶ配列と異種起源の核酸配列またはその逆転写産物を意味する。導入遺伝子の転写ができるように導入遺伝子を調節成分に適切に連結することができ、すなわち、プロモーター並びにＳＶ４０イントロンまたはポリＡ配列のような導入遺伝子の調節のために有用な他の調節配列と適切に結合して導入遺伝子を配置する。導入遺伝子のその調節配列との合成結合物を本明細書においてミニカセットまたはミニ遺伝子という。導入遺伝子またはミニカセット配列の組成は、得られるｒＡＡＶが用いられる用途による。例えば、導入遺伝子配列の一つの型は、発現すると検出できるシグナルを生じるレポーター配列を含む。そのようなレポーター配列は、制限を含まずに、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）ｃＤＮＡ、アルカリホスファターゼ遺伝子（ＡＬＰ）及び緑色蛍光タンパク質遺伝子を含む。これらの配列は、発現を導く調節成分と結合した場合、常法、例えば、紫外線波長吸収、目に見える色の変化などにより検出できるシグナルを与える。導入遺伝子配列の他の型は、宿主細胞において適切な遺伝子産物を発現する治療的遺伝子を含む。これらの治療的核酸配列は、典型的に、先天性または非先天性の遺伝的欠損を置換または修正する、あるいは後成的な疾患または疾病を治療するためにインビボまたはエクスビボで患者に投与されそして発現する産物をコードする。当該技術分野の熟練した者は、そのような導入遺伝子を容易に選択することができ、そしてｒＡＡＶへの挿入のための導入遺伝子またはミニカセットの設計は本発明の制限ではない。「ｒＡＡＶ」という用語は、１９９６年５月９日に公開された国際公開特許出願番号ＷＯ第９６／１３５９８号に記述されたＡｄＡＡＶハイブリッドウイルスを含む、先行する技術のあらゆる組み換えＡＡＶ遺伝子治療媒体を包含する。より詳細には、ｒＡＡＶは、（ａ）ＡＡＶのゲノムの少なくとも一部で、細胞*** なしに少なくとも一つの選択した遺伝子を標的細胞中へ形質導入することができる部分のＤＮＡ、（ｂ）（ａ）のＤＮＡに隣接し、そしてインビボまたはインビトロで標的細胞中で発現できる、発現を導く調節配列に適切に連結された少なくとも一つの選択した遺伝子（または導入遺伝子）を含んでなるｒＡＡＶを定義する。他のｒＡＡＶは、当該技術分野において記述されている。本発明の方法は、最小で５’及び３’の両方のＡＡＶ逆末端反復が存在すれば、ｒＡＡＶにおいて用いられるＡＡＶ配列の厳密な性質により制限されない。従って、当該技術分野の熟練した者はｒＡＡＶを選択することができ、ｒＡＡＶ自体は本発明における制限ではない。本明細書に特に開示されるｒＡＡＶは、具体的に説明するためのものである。「形質導入」という用語は、本発明の実施により生産されるｒＡＡＶが、適切な標的細胞に感染し、そして細胞の機構を利用することにより細胞中で導入遺伝子を発現することができることを意味する。形質導入は、ウイルスＤＮＡを標的細胞の染色体中へ安定に組み込むことを含むことができる。「増大した形質導入］は、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスヘルパーで同時感染した培養物中で生産され、そしてそれから精製された典型的な先行する技術のｒＡＡＶより高い効率で、インビトロ、エクスビボまたはインビボのいずれかで、転化因子の存在下で標的細胞に形質導入するｒＡＡＶの能力として定義される。この方法は、遺伝子治療のためのｒＡＡＶが介在する細胞の形質導入における制限する工程が、ｓｓウイルスゲノムの内在化または導入ではなく、むしろそれに続く一本鎖（ｓｓ）ウイルスゲノムの転写的に活性のある二本鎖（ｄｓ）型への転化であるという所見に基づく。ｄｓＤＮＡ中間体の形成は、組み換え遺伝子発現のために必要であり、これは転写後の機構を通してウイルス及び細胞の因子により調節されると思われる。本発明者等は、この律速段階を克服し、それによりｒＡＡＶの形質導入能力を、そして最終的に遺伝子治療プロトコルにおけるｒＡＡＶの使用を増大する方法を考案した。本発明のこの方法は、慣例的に調製された導入遺伝子を含むｓｓｒＡＡＶを用いることができる。先行する技術は、ヘルパーのアデノウイルスまたはヘルペスウイルスを培養物に同時感染させ、続いてヘルパーウイルスを含んでいる培養混成物からｒＡＡＶを精製し、そしてｒＡＡＶだけで標的細胞を感染することにより、ｓｓｒＡＡＶを生産する。本発明は、ｓｓｒＡＡＶで標的細胞を感染することを提供する。しかしながら、いったん標的細胞が感染すると、その感染細胞をｒＡＡＶのｄｓ型へのｓｓｒＡＡＶの転化を促進する因子と接触させる。この「促進因子」または「転化因子」の作用は、標的細胞においてｓｓからｄｓへの転化が起こることを引き起こし、標的細胞中への組み換えＡＡＶの増大した形質導入をもたらす。標的細胞中でｓｓからｄｓｒＡＡＶへの転化を促進することにより、本発明の方法は、形質導入及び該宿主細胞の染色体中へのｒＡＡＶの安定な染色体組込みの両方をもたらすこともできる。好ましくは、本発明の使用のために、「促進または転化因子」は、いくつかの形態を取ることができる。Ａ．転化因子がヘルパーウイルスである。一つの態様において、因子はヘルパーウイルスであり、その方法は、標的細胞をヘルパーウイルスに感染させる付加的な工程を含む。この方法に有用なヘルパーウイルスは、ｓｓｒＡＡＶのｄｓｒＡＡＶへの転化を促進することができる選択した遺伝子を含む。選択した遺伝子は、転化を増大する遺伝子産物またはポリペプチド（または全長のポリペプチドの生物学的活性を共有するポリペプチドの機能的フラグメント）をコードすることができる。代わりに、選択した遺伝子は、通常ｒＡＡＶのｓｓからｄｓへの転化を防ぐ細胞の遺伝子を阻止または阻害するように細胞中で働くアンチセンスまたはリボザイムを発現することができる。これらの遺伝子を以下に記述する第二世代ｒＡＡＶに用いることもできる。ヘルパーウイルスは、細胞***していない標的細胞中で選択した遺伝子産物を発現することができる。ヘルパーウイルスは、野生型または突然変異体のアデノウイルスであることができる。ヘルパーウイルスは、代わりに、野生型または突然変異体のヘルペスウイルスであることができる。好ましくは、促進因子としての使用のために、そのようなウイルスは、ヘルパーウイルス及び／またはそれらの発現した遺伝子産物が患者において疾病を引き起こさないようにいくつかの正常な遺伝子を欠失した突然変異体である。例えば、本発明において有用なヘルパーアデノウィルスは、単一のアデノウイルス初期遺伝子の遺伝子産物のみを発現することができる。ｓｓｒＡＡＶがＡｄ初期遺伝子産物にさらされることは、形質導入効率の同等の増加を伴ってｄｓｒＡＡＶゲノムの形成を実質的に増大するのに十分である。この効果を生じるのに有用なＡｄ初期遺伝子は、Ｅ１、Ｅ２ａ、Ｅ４及びこれらの機能的フラグメントである。しかしながら、以下の実施例により示されるように、アデノウイルスは、アデノウイルスのＥ１及びＥ４遺伝子の発現に依存し、そしてｒＡＡＶのｄｓ複製分子型の出現に直接比例するように、インビトロで組み換えＡＡＶ形質導入を実質的に増大する。ヘルパーウイルスの一つの例は、野生型の初期遺伝子の大部分を欠失し、そしてＥ４遺伝子またはその機能的フラグメントのみを標的細胞中で発現することのできるアデノウイルスである。そのような機能的フラグメントの中にＥ４遺伝子のＯＲＦ６がある。実施例において以下に記述するように、細胞株における実験は、アデノウイルスＥ４遺伝子座のＯＲＦ６がｒＡＡＶ形質導入を顕著に増大するのに十分であることを示す。アデノウイルスのＥ４−ＯＲＦ６の選択的な発現は、Ｅ１及びＥ４遺伝子産物の組み合わせにさらすことにより生じたものに比較して、類似するが、いくぶん減じられた形質導入効率の増加を伴う。すなわち、Ｅ４のＯＲＦ６産物はｒＡＡＶ形質導入の増加を高めるのに十分であるが、この効果は、Ｅ１遺伝子産物により実質的に増幅される。従って、より好ましくは、発現されたＥ１及びＥ４遺伝子産物の両方にｒＡＡＶをさらすことが、上記の律速工程の実質的な増大をもたらす。従って、他の典型的なヘルパーウイルスは、発現するとｓｓからｄｓへの転化を促進する一つ以上の遺伝子を含むこともできる。そのようなヘルパーウイルスの例は、Ｅ１及びＥ４遺伝子の両方またはこれらの機能的フラグメントを発現するアデノウイルスである。ウイルスが、標的細胞を提供する患者において疾病を引き起こさないように十分に損なわれるなら、さらに他のＡｄ遺伝子をヘルパーウイルスにより発現することができる。ｓｓのｄｓｒＡＡＶへの転化を促進する因子がヘルパーウイルスである場合、本発明の方法は、ｒＡＡＶ及びヘルパーウイルスに標的細胞を同時感染させることを含んでなる。そのような同時感染は、エクスビボ治療、すなわち、患者から抽出した細胞に対して行われる操作で、これらの細胞はこの方法が行われた後に患者に再び挿入される、に関連して起こることができる。代わりに、常法により２種のウイルスに患者を直接同時感染させることができる。２種のウイルスの患者への運搬を特定の器官または一般的な循環系に向けることができる。そのような運搬法は、例えば嚢胞性線維症の遺伝子治療に対して当該技術分野において記述されている［例えば、米国特許番号５，２４０，８４６号を参照］。Ｂ．転化因子が化学薬品、薬剤またはｒＡＡＶ形質導入を活性化できる他の存在である。本発明の方法の他の態様において、ｒＡＡＶに感染させた細胞に接触させる転化因子を以下の種類の既知の化合物または方法、１）ヒドロキシウレア、過酸化水素のようなＤＮＡ合成のインヒビター及びＤＮＡポリメラーゼの他の直接または間接のインヒビター、２）シクロホスファミド、アルキル化剤、プリン類似体、例えば６−チオグアニン等のようなＤＮＡ損傷を引き起こす化学療法剤、３）トポイソメラーゼ、ＤＮＡリガーセ、エキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼのインヒビターのようなＤＮＡ改変酵素を妨害する薬剤、及び４）酪酸ナトリウムのような非特異的に転写を増大する因子またはＤＭＳＯのような細胞を安定化する因子から選択することができる。また、発癌物質のような遺伝子に有毒な因子を転化因子として用いることもできる。照射のような物理的方法を含む、ＤＮＡに分断または損傷を引き起こす他の方法もまた、ｒＡＡＶのｓｓからｄｓへの転化を促進することができる因子として有用であることができ、そしておそらく当該技術分野の熟練した者はこれらを選択することができる。これらの種類の化合物及び方法は、ｓｓからｄｓｒＡＡＶへの転化をもたらすと考えられる。本発明の方法のこの態様により、ｒＡＡＶはまた慣例的に生産されるが、ヘルパーウイルスと同時感染されない。ｓｓｒＡＡＶに標的細胞を感染させ、そして感染した細胞を因子の特質により適切な方法で因子に接触させる。細胞への直接添加により、これらの転化増大因子をｒＡＡＶに感染した標的細胞のエクスビボ治療に用いることができる。そのような添加は、ｒＡＡＶ遺伝子治療媒体の添加と同時にまたは連続して起こることができる。例えば、感染した標的細胞を上に挙げた化合物または薬剤の一つに適切な期間供することができる。当該技術分野の熟練した者は、感染細胞を因子に接触させるためのパラメーターを容易に決定することができる。これらのパラメーターは、この方法をエクスビボまたはインビボのいずれで行うかによる。例えば、処理されるエクスビボの感染細胞の数が、投与量及びそのような処理のタイミングのために考慮される。同様に、患者の身体の状態がインビボで患者へ因子を運搬するパラメーターを決定することができる。従って、当該技術分野の熟練した者は、服用量及び損傷因子の量を調整することができる。因子がヒトまたは動物における使用を認められた典型的な化学治療剤である場合、その因子、すなわち化学療法剤及びｒＡＡＶ遺伝子治療媒体を患者に同時投与することにより、ｒＡＡＶのそのような増大した転化がインビボでも起こることができる。本発明のこの特徴により、化学療法剤は、ｒＡＡＶが投与される時にのみ投与される。化学療法剤及び組み換え遺伝子治療媒体の適切な服用量及び量、並びにそのような量を決定するための方法は、当該技術分野の技術の範囲内である。しかしながら、化学療法剤の効果はｒＡＡＶのｓｓからｄｓへの転化を増大し、従って標的細胞中への形質導入の効率を増大するので、薬剤及びｒＡＡＶのいずれかまたは両方の通常の服用量より低い服用量を効率よく投与することができると予想される。Ｃ．転化因子はｒＡＡＶの一部であることができる。本発明のさらに他の態様において、導入遺伝子及び転化因子の両方が標的細胞中で同時に発現されるように、新規な「第二世代」ｒＡＡＶをウイルス中に転化因子を組み込むように設計することができる。そのような新規な組み換えアデノ随伴ウイルスは、以下の成分、（ａ）アデノ随伴ウイルスのゲノムの少なくとも一部で、細胞***していない標的細胞中へ少なくとも２つの選択した遺伝子またはこれらの機能的フラグメントを形質導入することのできる部分のＤＮＡ、（ｂ）第一の選択した遺伝子、すなわち、発現を導く調節配列に適切に連結された所望する導入遺伝子及び（ｃ）第二の選択した遺伝子、すなわち、該第二の遺伝子の発現を導くことのできる調節配列に適切に連結された「転化遺伝子」を含んでなる。「転化遺伝子」は、発現時に、ｓｓｒＡＡＶのそのｄｓ型への転化を促進できる。このｒＡＡＶ中の第一及び第二の遺伝子は、ＡＡＶＤＮＡ、好ましくは５’及び３’ＩＴＲに隣接する。そのような第二世代ｒＡＡＶの態様は、図１１に図式的に与えられる。そのＤＮＡ配列は、配列番号５に与えられる。そのような新規なｒＡＡＶの他の態様は、発現時に、標的細胞中でｓｓからｄｓｒＡＡＶへの転化を促進する能力を有する一つ以上の遺伝子を含むことができる。例えば、上記の新規なｒＡＡＶは、発現を導くことのできる調節配列に適切に連結された付加的な選択した遺伝子を含むことができ、その付加的な遺伝子及び上記の該第二の「転化」遺伝子は、第二及び付加的な遺伝子の両方の発現時に、ｓｓｒＡＡＶのそのｄｓ型への転化を一緒に促進することができる。このｒＡＡＶにおいて、３つの遺伝子全て、すなわち、導入遺伝子、第二の「転化」遺伝子及び付加的な遺伝子はＡＡＶＤＮＡに隣接する。新規なｒＡＡＶの一つの望ましい態様において、ＡＡＶＩＴＲは選択した導入遺伝子及びアデノウイルスＥ４遺伝子またはその機能的フラグメント（例えば、ＯＲＦ６配列）である転化遺伝子に隣接する。他の態様において、新規な組み換え体は、３つの遺伝子、導入遺伝子、アデノウイルスＥ４遺伝子またはその機能的フラグメント及びアデノウイルスＥ１遺伝子またはその機能的フラグメントを発現する。導入遺伝子と共に標的細胞中で発現されたＥ１及びＥ４遺伝子産物は、ｒＡＡＶのｓｓのｄｓ型への転化を促進するように一緒に作用する。新規なｒＡＡＶ及びその使用のさらに他の態様において、例えば、転化遺伝子が単一の第二の遺伝子であろうとまたは一つより多い付加的な遺伝子であろうと、その発現を導く調節配列は誘導性のプロモーターを含むことができる。従って、転化遺伝子の発現は、誘導因子の存在下でのみ起こる。多数の誘導性プロモーター及びコンパニオン誘導因子、例えば、グルココルチコイドのようなステロイドが当該技術分野に知られており、そしてこの記述を用いて当該技術分野の熟練した者は、本発明のｒＡＡＶ及び方法に組み込むためにこれらを容易に選択することができる。少なくとも一つの「転化遺伝子」を保有するそのような「第二世代」のｒＡＡＶを用いる本発明の方法は、このｓｓｒＡＡＶで標的細胞を感染させることを提供する。導入遺伝子及び転化遺伝子の両方の発現を導くプロモーターが構成的である場合、感染した標的細胞機構が導入遺伝子産物及び転化遺伝子産物の発現を導く。導入遺伝子及び「転化遺伝子」の標的細胞中での同時発現は、さらなる方法工程なしに、その細胞中でのｓｓｒＡＡＶのｄｓｒＡＡＶへの転化を促進し、そして形質導入効率及びおそらく安定な染色体組込みを増加する。この方法に用いる第二世代ｒＡＡＶが誘導性プロモーターの制御下に「転化遺伝子」を含む場合、この方法はわずかに改変される。ｒＡＡＶによる標的細胞の感染後に、誘導性プロモーターが転化遺伝子産物の生産を「始める」ことを引き起こす適当な誘導因子に感染した標的細胞を接触させる。誘導因子が除去または停止される,と、転化遺伝子産物の発現は「止まる」。上記のように、遺伝子治療のための導入遺伝子を含んでいるあらゆる先行する技術のｒＡＡＶを上の方法の少なくとも一つの態様において用いることができる。上記の新規なｒＡＡＶを含むｒＡＡＶを作成するための様々な成分の供給源、選択及び組み立てはすでに慣例であり、そして本明細書に含まれる開示を与えられれば、当該技術分野の熟練した者は容易に達成できる。そのような方法は通常の遺伝子工学技術［例えば、上に引用したＳａｍｂｒｏｏｋ等を参照］を用いる。本発明の新規なｒＡＡＶウイルス及び方法は、体細胞遺伝子治療のための効率よい遺伝子導入媒体を提供し、そしてエクスビボでの用途及びインビボでの使用のための製薬学的組成物に適している。本明細書に記述されるｒＡＡＶ及び方法を用いることにより、ｒＡＡＶが、例えば、代表的なｒＡＡＶ、ＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺにおいて示されたＬａｃＺ導入遺伝子の場所に治療的遺伝子を含む場合、その治療的導入遺伝子をインビボまたはエクスビボで患者へ運ぶことができ、標的細胞中への適切な遺伝子の効率よい形質導入及びおそらく安定な組込みを与える。従って、本明細書に記述されるこれらの新規なｒＡＡＶ及び方法を遺伝的欠損または障害を修正するために用いることができる。ＡＡＶがそのゲノムを非分裂細胞中へ効率よく組込む能力は、造血幹細胞のエクスビボ形質導入に基づく遺伝子治療の開発において現在利用されている。ｒＡＡＶのインビボでの用途は、伝達気道の最終的に分化した上皮細胞に形質導入するために精製したウイルスのストックを気道中に注入する、ＣＦの治療のために主に開発されている。本明細書に記述する方法及び組成物を遺伝子治療の両方の型で用いることができる。そのような使用のために適した他の状態は、家族性高コレステロール血症の治療のための低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レセプター遺伝子の肝細胞中への形質導入を含む。当該技術分野の熟練した者は、これら及び他の疾患の治療のために上の方法により用いることができる多数のｒＡＡＶを作成することができる。エクスビボまたはインビボ治療に対して、生物学的に適合した溶剤または製薬学的に受容しうる運搬賦形剤中にウイルス粒子を懸濁することにより、ｒＡＡＶを標的細胞を感染するために用いることができる。適当な賦形剤は滅菌食塩水を含む。製薬学的に受容しうる担体であることが知られ、そして当該技術分野の熟練した者によく知られている他の水性及び非水性の等張滅菌注入溶剤並びに水性及び非水性の滅菌懸濁剤をこの目的のために用いることができる。ｒＡＡＶは、適切な細胞をトランスフェクトし、そして医学の当該技術分野の熟練した者が決定することができる、過度に不都合でないまたは医学的に受容しうる生理学的効果を有する治療的利益を与えるのに十分なレベルの選択した導入遺伝子の発現を与えるために十分な量で投与される。インビボ投与の通常のそして製薬学的に受容しうる経路は、標的器官、組織または部位への直接運搬、鼻内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、経口及び他の非経口投与を含む。要求される場合、投与の経路を組み合わせることができる。この方法の感染工程のためのｒＡＡＶの服用量は、主に、治療的環境、すなわちエクスビボまたはインビボ、治療される状態、選択した遺伝子、患者の年齢、体重及び健康のような因子により決定され、従って、患者間で変わる可能性がある。エクスビボ治療のなめの治療的に効果のあるｒＡＡＶの服用量は、約１から約１０までの間の形質導入粒子／細胞の範囲にあると思われる感染多重度に基づく。本発明によるインビボ感染のための治療的に有効なｒＡＡＶのヒト服用量は、約１ｘ１０⁷から１ｘ１０¹⁰形質導入粒子／ｍｌの濃度のウイルスを含んでいる約２０から約５０ｍｌまでの食塩水溶液の範囲にあると考えられる。好ましいヒト服用量は、上の濃度で約２０ｍｌの食塩水溶液である。服用量は、あらゆる副作用と治療的利益を比較検討して調整される。服用量投与の選択、調整または頻度を決定するために、選択した遺伝子の発現のレベルを調べることができる。投与される促進因子の有効量は、決定する当該技術分野の技術の範囲内であり、そして因子の特質による。上記の化学薬品及び製薬のある種の既知の服用量を、ＤＮＡに損傷を与え、そしてｒＡＡＶのｓｓからｄｓへの転化を促進するこの方法に用いることができる。因子がヘルパーウイルスにより発現される遺伝子である場合、感染するウイルスの量は、ｒＡＡＶに対して上に記述した量と同様でなければならない。もちろん、因子が第二世代ｒＡＡＶ中に存在する遺伝子である場合、ｒＡＡＶに対して上に記述した同一の服用量が適用される。本発明の上記の方法のいくつかの態様は、肺及び肝臓の両方へのｒＡＡＶが介在する遺伝子導入のネズミのモデルにおいて確かめられた。これらの実験は、ｒＡＡＶによるインビボでの同様に低いレベルの遺伝子導入を示し、これは、Ｅ１及びＥ４を発現するアデノウイルスでの同時感染により数桁の大きさ増加された。要約すると、アデノウイルスが培養細胞においてｒＡＡＶ形質導入を増大することを示すために実験が行われた。Ｅ１欠失ウイルスで同時感染した２９３細胞において作られたＬａｃＺ組み換えＡＡＶの生産及び特性化の間に、ライセートからのｒＡＡＶの精製が、２９３細胞においてアッセイした場合にＬａｃＺ形質導入活性のかなりの喪失と関連することが見られた。ｒＡＡＶ活性のこの減少は、残余の混成しているヘルパーアデノウイルスが熱による不活性化により除去される最終工程において特に明らかであった。ＬａｃＺ形質導入活性は、ｒＡＡＶの精製したストックにアデノウイルスを戻して加えることにより回復された。これらのデータは、アデノウイルスがｒＡＡＶの形質導入効率を実質的に増大できることを初めて示した。実施例１０に記述するように、異なるアデノウイルス初期遺伝子突然変異体をＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺと呼ばれる精製したＬａｃＺｒＡＡＶと混合することにより、一連の相補性群を作成した（実施例２を参照）。これらの特定したウイルスの混合物をＨｅＬａ細胞においてＬａｃＺ形質導入に関して分析した（実施例１２及び１３を参照）。Ｅ１欠失ｒＡｄＨ５．ＣＢＡＬＰ及びＥ４欠失突然変異体ｄｌ１００４は、ＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺの形質導入の顕著な増加を与えなかった（図５Ａ）。しかしながら、より少ない重大な欠失を有するＥ１及びＥ４突然変異体で部分的な活性を達成することができた。ｄｌ１１０（Ｅ１Ｂ−５５ｋＤａ欠失）及びｄｌ１０１０（ＯＲＦ６欠失）の両方が、陽性の青色細胞の数に関してＡｄ５、ｔｓ１２５及びｄｌ８０２のものに匹敵するレベルまで形質導入を増大したが、全β−ガラクトシダーゼ活性はかなり低かった（図５Ａ）。これらの結果は、ｒＡＡＶ形質導入の増大に初期領域Ｅ１及びＥ４を結び付ける。以下に記述する実験も、転化遺伝子としてＥ４のようなＡｄ遺伝子を含む新規なｒＡＡＶが、ヘルパーウイルスの非存在下でｒＡＡＶの形質導入効率を増加することができることを示す。以下の実施例１５においてより詳細に記述するように、２９３細胞がＥ４に広がるＡｄ５のゲノムフラグメントで安定にトランスフェクトされた。このＥ１／Ｅ４発現細胞株及び親のＥ１発現細胞株（２９３）をｒＡＡＶで感染させ、形質導入に関して分析した。これらの実験は、ｒＡＡＶ形質導入のアデノウイルスが介在する増大におけるＥ１及びＥ４（ＯＲＦ６）の合わせた発現の重要性を示した。Ｅ１及びＥ４発現の存在下で、ｒＡＡＶ形質導入はｄｓＲＦモノマー及びダイマーの出現を常に伴った（実施例１４）。重要なことには、ｒＡＡＶベクター形質導入及び二重構造型の蓄積の間の密接な相互関係を、２つの異なる実験環境、すなわち、Ｅ１／Ｅ４発現アデノウイルスで感染した細胞（図８Ａ及び８Ｂ）または補足細胞株（図８Ｃ）において得ることができた。以下の実施例は、新規なパッケージング細胞株の構築及び試験、本発明のＥ１／Ｅ４欠失ｒＡｄ及びその使用、本発明の遺伝子治療のための改善した方法及び第二世代組み換えＡＡＶ生産を例示する。これらの実施例は、具体的説明のためだけに提供し、本発明の範囲を制限しない。実施例１−新規なＥ１ａ／Ｅ１ｂ及びＥ４発現パッケージング細胞株Ａ．Ｅ４ＯＲＦ６発現プラスミドの構築Ａｄ５からの全Ｅ４領域またはＯＲＦ６ミニ遺伝子を、ネオマイシン耐性遺伝子を含むシャトルプラスミド中にサブクローン化した。プロモーター成分が異なる２種のＯＲＦ６ミニ遺伝子を開発した。第一のものは、ＯＲＦ６発現を導くためにＺｎ⁺²誘導性ヒツジメタロチオネイン（ＭＴ）プロモーターを用いた。第二のものは、デキサメタゾン誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターを用いた。本発明のパッケージング細胞株の構築のために有用な典型的なプラスミドは、ｐＭＭＴＶＥ４ＯＲＦ６である。このプラスミドに含まれるミニ遺伝子は、配列番号１に配置され、そしてヒトＥ４ＯＲＦ６遺伝子配列（配列番号１のヌクレオチド１５２３−２４０８）の転写を制御するマウス乳癌ウイルスプロモーター（ＭＭＴＶ）（配列番号１のヌクレオチド１−１５０６）、成長ホルモンターミネーター（ＧＨ）（配列番号１のヌクレオチド２４０９−３６５４）、ＳＶ４０複製起点、ネオマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドｐＢＲ３２２からのプラスミド配列及びアンピシリン耐性遺伝子を含む。ＯＲＦ６のアミノ酸配列を配列番号２に示す。このプラスミドの様々な機能的フラグメントを他の通常使用される配列で容易に置き換えることができ、これらはプラスミドの設計に対して重要ではない。本発明のパッケージング細胞株の構築のために有用な他のプラスミドは、ｐＭＴＥ４ＯＲＦ６である。このプラスミドに含まれるミニ遺伝子のＤＮＡ配列は、プロモーターがヒツジメタロチオネインプロモーター（ＭＴプロモーター）［上に引用したＭ．Ｇ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ等］であることを除いて、配列番号１のものと同様である。本発明のパッケージング細胞株の構築のためのコントロールとして用いるプラスミドは、ｐＬＴＲ．Ｅ４（−）である。このプラスミドは、内在性の構成的レトロウイルスＭＬＶＬＴＲ並びに内在性Ｅ４プロモーター及びＥ４ＯＲＦ１の一部を欠いていることを除いてＡｄＥ４遺伝子領域の大部分を含む。他のプラスミド配烈は、上記のものと同じままである。本発明の方法の研究のために有用なさらに他のプラスミドは、構成的ＭＬＶＬＴＲ及び内在性Ｅ４プロモーターび完全なＥ４遺伝子を含むｐＬＴＲ．Ｅ４である。他のプラスミド配列は、上記のものと同じままである。ＯＲＦ６発現がｒＡＡＶ形質導入を増大するために十分であるかどうかを決定するために、誘導性メタロチオネイン（ＭＴ）−ＯＲＦ６ミニ遺伝子をＨｅＬａ細胞中に安定にトランスフェクトした。この新しい細胞株、ＨｅＬａ（ＭＴ−ＯＲＦ６）を以下に記述するようにＯＲＦ６誘導に反応したＬａｃＺｒＡＡＶ形質導入に関して評価した。細胞株２９３（ＭＴ−ＯＲＦ６）は、ベースラインでは比較的不活性であるが二価の陽イオンで誘導することのできるメタロチオネインプロモーターからＡｄ５のＥ４遺伝子のＯＲＦ−６を発現する。これらの２９３細胞をベースライン形質導入効率を確立するために含んだ。Ｂ．トランスフェクション及びクローンの選択リン酸カルシウム沈殿技術により、１００ｍｍプレートに接種した、アデノウイルスＥ１遺伝子の産物を発現するヒト胚腎臓細胞株２９３［ＡＴＣＣＣＲＬ１５７３］中またはＨｅＬａ細胞中に上記のプラスミドの各々をトランスフェクトした（１０μｇプラスミド／プレート）。トランスフェクション後２４時間で細胞を集め、１００ｍｍプレートに異なる希釈（１：１０−１：１００）で約１０日間接種した。接種培地は、１ｍｇ／ｍｌでＧ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ、ＢＲＬ）を含む。以下のアッセイを用いて生じた耐性のコロニーを選択し、そして広げた。クローンの予備的な分析は、以下の実施例に記述するような組み換えアデノ随伴ウイルスＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺの増大された形質導入効率及びＡｄＥ４タンパク質の免疫蛍光位置測定に基づいた。実施例２−組み換えＡＡＶ及びＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺ形質導入増大アッセイＥ１及びＥ４遺伝子産物は、組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）機能のために必要とされる。この予備的なアッセイは、９６ウェル３５ｍｍ培養プレート中に実施例１のパッケージング細胞株を接種（２ｘ１０⁶細胞／ウェル）し、そしてこれらの細胞を精製し熱処理したＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺで１０００ウイルス粒子／細胞のＭＯＩて感染させることを含む。Ａ．組み換えＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺの調製この実験の目的ための通常の遺伝子工学技術により、組み換えＡＡＶウイルスを調製した。ヘルパーアデノウイルスの存在下でのプラスミドトランスフェクション［Ｓａｍｕｌｓｋｉ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６３：３８２２−３８２８（１９８９）］により、組み換えＡＡＶを作成した。シスに作用するプラスミドｐＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺ［配列番号４］（図１０を参照）はｐｓｕｂ２１０［Ｓａｍｕｌｓｋｉ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６１：３０９６−３１０１（１９８７）］に由来し、ＡＡＶＲｅｐ及びＣａｐ遺伝子の位置に大腸菌β−ガラクトシダーゼミニ遺伝子を含む。組み換えＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺゲノム（４．９ｋｂ）［配列番号４］の５’ないし３’の構成は、（ａ）ｐＡＶ２［Ｃ．Ａ．Ｌａｕｇｈｌｉｎ等、Ｇｅｎｅ、２３：６５−７３（１９８３）］を鋳型として用いたＰＣＲにより得られた５’ＡＡＶＩＴＲ（ｂｐ１−１７３）［ヌクレオチト５３−２１９］、（ｂ）ＣＭＶ即時型初期エンハンサー／プロモーター［Ｂｏｓｈａｒｔ等、Ｃｅｌｌ、４１：５２１−５３０（１９８５）］（ヌクレオチド２４６− ８３９）、（ｃ）ＳＶ４０イントロン（ヌクレオチド８５６−９８７）、（ｄ）大腸菌β−ガラクトシダーゼｃＤＮＡ（ヌクレオチド１０３９−４５１２）、（ｅ）ＳＶ４０ポリＡ付加シグナル（初期及び後期転写単位の両方からの切断／ポリ−Ａシグナルを含む２３７ＢａｍＨＩ−ＢｃｌＩ制限フラグメント）（ヌクレオチド４５２２−４７１９）、及び、（ｆ）ｐＡＶ２からＳｎａＢＩ−ＢｇｌIIフラグメントとして得られた３’ＡＡＶＩＴＲ（ヌクレオチド４７５９−４９２５）、を含む。全ての他のヌクレオチドはプラスミド由来である。Ｒｅｐ及びＣａｐ遺伝子は、トランスに作用するプラスミドｐＡＡＶ／Ａｄ［上に引用したＳａｍｕｌｓｋｉ等］により供給された。１５０ｍｍ培養皿で９０％融合まで生育した２９３細胞の単層（５ｘ１０⁷細胞／プレート）を１０のＭＯＩでＨ５．ＣＢＡＬＰで感染させた。（Ｈ５．０１０ＡＬＰとも呼ばれる）Ｈ５．ＣＢＡＬＰは、アデノウイルスＥ１ａ及びＥ１ｂ遺伝子配列（ジーンバンクのＡｄ５配列［ジーンバンク登録番号Ｍ７３２６０］の地図単位１−９．２）の位置にアルカリホスファターゼミニ遺伝子を含むｒＡｄである。アルカリホスファターゼｃＤＮＡは、このウイルスのＣＭＶで強められるβ−アクチンププロモーターの転写制御下にある。このヘルパーウイルスは、Ｇｏｌｄｍａｎ等、Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．、６：８３９−８５１（１９９５年７月）；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ等、Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．、５：１２１７−１２２９（１９９４年１０月）；に記載されており、そして引用することにより本明細書に取り込まれる。２０ｍｌ培地／１５０ｍｍプレートで２％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）で補足したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で感染を行った。感染後２時間で、各プレートに２．５ｍｌのトランスフェクションカクテル中５０μｇのプラスミドＤＮＡ（３７．５μｇのトランス作用性及び１２．５μｇのシス作用性）を加え、均一に分配した。トランスフェクションは、記述されたような［Ｂ．Ｃｕｌｌｅｎ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５２：６８４−７０４（１９８７）］リン酸カルシウムに基づいたものであった。細胞をこの状態に１０−１４時間放置し、その後感染／トランスフェクション培地を２０ｍｌの新しいＤＭＥＭ／２％ＦＢＳで置き換えた。トランスフェクション後４０ないし５０時間で細胞を集め、１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）バッファーに懸濁し（０．５ｍｌ／１５０ｍｍプレート）、そして超音波処理によりライセートを調製した。このライセートを１０ｍＭ塩化マンガンにし、その後ウシ膵臓ＤＮａｓｅＩ（２０，０００ユニット）及びＲＮａｓｅ（０．２ｍｇ／ｍｌの最終濃度）を加え、反応を３７℃で３０分間インキュベートした。デオキシコール酸ナトリウムを１％の最終濃度まで加え、３７℃でさらに１０分間インキュベートした。処理したライセートを氷上で１０分間冷却し、固体ＣｓＣｌを１．３ｇ／ｍｌの最終密度まで加える。このライセートを１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）中１．３ｇ／ｍｌのＣｓＣｌ溶液で６０ｍｌの最終容量にし、３つの等しいアリコートに分けた。各２０ｍｌサンプルを、密度１．４５ｇ／ｍｌ及び１．６０ｇ／ｍｌの２つの９．０ｍｌの層からなるＣｓＣｌの段階勾配上に重ねた。ＢｅｃｋｍａｎＳＷ−２８ローター中２５，０００ｒｐｍで４℃で２４時間遠心を行った。管の底から１ｍｌの画分を集め、ＬａｃＺ形質導入に関して２９３または２９３（Ｅ４）で分析した。機能的なＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺウイルスの最大の力価を含んでいる画分を合わせ、連続して３回ＣｓＣｌ中の平衡沈降に供した。ローターの選択は、ＢｅｃｋｍａｎＮＶＴ−９０（８０，０００ｒｐｍで４時間）及びＳＷ−４１（３５，０００ｒｐｍで２０時間）を含んだ。平衡で、ＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺは、１．４０−１．４１ｇ／ｍｌＣｓＣｌで乳白色のバンドとして現れた。屈折率測定から密度を計算した。透析により精製したベクターを１５０ｍＭＮａＣｌを含んでいる２０ｍＭＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．８）（ＨＢＳ）に交換し、１０％グリセロールの存在下で−８０℃に凍結してまたはＨＢＳ／４０％グリセロール中−２０℃で液体ストックとして保存した。混成しているＨ５．ＣＢＡＬＰヘルパーウイルス及びＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺ力価に関して精製したウイルスを試験した。レポーターアルカリホスファターゼ活性に対する組織化学染色によりヘルパーウイルスを調べた。最終生成物の１．０％に相当する精製したウイルスのサンプルを６０ｍｍプレートに接種した２９３細胞の生育している単層に加えた。４８時間後に、細胞を０．５％グルタルアルデヒド／リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で室温で１０分間固定し、ＰＢＳ中で洗浄し（３ｘ１０分）、そして内因性のアルカリホスファターゼ活性を不活性化するために６５℃で４０分間インキュベートした。この単層を室温に冷却させ、１００ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ９．５）／１００ｍＭＮａＣｌ／５ｍＭＭｇＣｌ中で短時間一回すすぎ、そして０．３３ｍｇ／ｍｌニトロブルー塩化テトラゾリウム（ＮＢＴ）及び０．１６５ｍｇ／ｍ１５−ブロモ−４− クロロ−３−インドリルリン酸ｐ−トルイジン塩（ＢＣＩＰ）を含んでいる同じバッファー中で３７℃で３０分間インキュベートした。単層を１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）／５ｍＭＥＤＴＡ中で洗浄することにより顕色を停止させた。通常、上記の精製方法は、３回の浮遊密度超遠心により、全ての検出できるＨ５．ＣＢＡＬＰヘルパーウイルスを除去した。ゲノムコピー数（ウイルス粒子／ｍｌ）、２６０ｎｍでの吸収（Ａ₂₆₀粒子／ｍｌ）及びＬａｃＺ形成単位（ＬＦＵ／ｍｌ）によりＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺ力価を測定した。ウイルス粒子濃度はサザンブロッティングに基づいた。簡潔に言えば、精製したＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺのサンプルをキャプシド消化バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０／１．０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０／０．５％ＳＤＳ／プロテイナーゼＫ１．０ｍｇ／ｍｌ）で５０℃で一時間処理し、ウイルスＤＮＡを遊離した。反応物を室温に冷却させ、ローディング色素を加え、１．２％アガロースゲルで電気泳動した。基準量のｄｓＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺゲノムもゲル上で分離した。ＤＮＡをナイロン膜上へ電気ブロットし、³²Ｐランダムプライマー標識した制限フラグメントでハイブリダイズし、そして得られたブロットをＰｈｏｓｐｈｏｒｌｍａｇｅｒ４４５ＳＩ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ）上で走査した。二重構造型から標準曲線を作成し、サンプル中のウイルスゲノムの数を推定するために用いた。指示細胞をウイルスサンプルの限界希釈で感染させることにより、ＬＦＵ力価を出した。指示細胞はＨｅＬａ及び２９３及び（以下の実施例１０に記述した）２９３（Ｅ４）系を含んだ。２４時間後に、細胞をグルタルアルデヒド中で固定し、Ｊ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：３０１４−３０１８（１９８８）に記述されたように大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）活性に対して細胞を組織化学的に染色した。１ＬＦＵは、感染後２４時間で１個の細胞中に視覚的に検出できるβ−ガラクトシダーゼ発現を生じるのに十分なウイルスの量として記述される。Ｂ．ＯＲＦ６発現の誘導１０μＭデキサメタゾンまたは１５０μＭ硫酸亜鉛（陰性コントロールに対しては誘導因子を用いない）でのＯＲＦ６発現の誘導をウイルスの添加の２時間前に開始し、そして実験の期間中続けた。ウイルスの添加後２４時間で細胞を集め、超音波処理によりライセートを作成し、そしてβ−ガラクトシダーゼ発現（すなわち、β−ガラクトシダーゼ活性）及びウイルスＤＮＡに関して上記のように分析した。Ｈｉｒｔ抽出物を細胞抽出物からの低分子量ＤＮＡから調製した。Ｈｉｒｔ抽出物の調製及びそれに続くサザンハイブリダイゼーションによる分析を当該技術分野の熟練した者に知られている常法を用いて行った。誘導因子の非存在下で、パッケージング細胞株は、ｒＡＡＶ感染細胞中でより低いレベルのβ−ガラクトシダーゼを生じる。誘導因子デキサメタゾンでのＯＲＦ６発現の誘導は、親の２９３系よりかなり高いレベルまでのＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺ細胞形質導入の付随する増加をもたらす。Ｅ１のみの発現は、アデノウイルスが介在するｒＡＡＶ形質導入の増大に効果を有するのに不十分であった。ある陽性クローンの結果を以下の表Ｉに示す（実施例４を参照）。しかしながら、ＭＭＴＶプロモーター及びＯＲＦ６配列を有する３０の細胞株に対して、４つ、すなわち２９３−２７−６、２９３−２７−１７、２９３−２７− １８及び２９３−２７−２８が、デキサメタゾンの存在下でＬａｃＺ生産を示す９０％以上の青色細胞を示した。実施例３−Ａｄ５後期タンパク質の免疫蛍光位置測定実施例２のアッセイからの陽性クローンを組み換えＥ４欠失アデノウイルスＨ５ｄｌ１００４で感染させ、後期遺伝子発現に対する免疫蛍光アッセイを用いてＥ４相補性に関して選別した。Ｈ５ｄｌ１００４ウイルスをジョンズホプキンス大学のＤｒ．Ｋｅｔｈｎｅｒから入手し、そしてこれは本明細書の引用文献に含まれるＢｒｉｄｇｅ及びＫｅｔｎｅｒ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６３２（２）：６３１−６３８（１９８９年２月）に記述されている。Ｅ４のＯＲＦ６は後期Ａｄ遺伝子発現、特にアデノウイルスのヘキソン及びペントン繊維の形成を補足するので、ＯＲＦ６を含んでいる細胞株はこれらのタンパク質に対する抗体と結合することができる。実施例１の各細胞株を０．１のＭＯＩでＥ４欠失ウイルスＨ５ｄｌ１００４ウイルスで感染させる。これらの細胞を、１：１０希釈のヘキソンまたはペントン繊維のいずれかに対するマウス抗−アデノウイルスＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体（ＣｈｅｍｉｃｏｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＩｎｃ．、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）で処理した。抗体との反応により陽性クローンを同定した。実施例４−相対的プラーク形成効率実施例３において強い相補性能力を示している実施例１の細胞株をＷ１６２細胞（Ｅ１を発現しないＥ４補足Ｖｅｒｏ細胞株［Ｗｅｉｎｂｅｒｇ及びＫｅｔｎｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０（１７）：５３８３−５３８６（１９８３）］に比較したＨ５ｄｌ１００４の相対的なプラーク形成効率に関して選別した。以下の表IIにおいて、ＲＰＥ％、すなわち相対的プラーク形成効率は、試験した細胞株におけるＨ５ｄｌ１００４の力価／Ｗ１６２細胞におけるＨ５ｄｌ１００４の力価を表す。例えば、２９３細胞のＲＰＥは０である。全ての規準により選択した陽性の細胞株を、実施例２、３及び４のアッセイの結果と共に以下の表Ｉに明らかにする。実施例５−Ｈ５．００１ＣＢＬａｃＺの構築及び精製プラスミドｐＡｄ．ＣＢＬａｃＺを、引用することにより本明細書に取り込まれるＫ．Ｋｏｚａｒｓｋｙ等、Ｓｏｍ．ＣｅｌｌＭｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．、１９（５）：４４９−４５８（１９９３）に詳細に記述されたように構築した。このプラスミドは、５’隣接ＮｈｅＩ制限部位、それに続くＡｄ５配列ｍ．ｕ．０−１、それに続く後ろのバクテリアβ−ガラクトシダーゼの転写を制御するＣＭＶエンハンサー／ニワトリβ−アクチンプロモーター配列［Ｔ．Ａ．Ｋｏｓｔ等、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．、１１（２３）：８２８７（１９８３）］が挿入されるＥ１欠失、それに続くポリＡ配列及び３’で隣接するＡｄｍ．ｕ．９−１６並びにもう一つのＮｈｅＩ部位を含んでなるミニ遺伝子を含んだ。このプラスミドにおいて、薬剤耐性マーカーを含んでいるプラスミド配列がミニ遺伝子の両側に位置する。プラスミドｐＡｄ．ＣＢＬａｃＺをＮｈｅＩで直鎖状にし、そしてＣｌａＩ消化したＨ５ｄｌ１００４（実質的に全Ｅ４遺伝子に相当する地図単位約９２．１から地図単位９８までを欠失したＡｄ５配列）と共に実施例１の新規なパッケージング細胞株にリン酸カルシウム同時トランスフェクション法により同時にトランスフェクトした。細胞株中でＡｄ地図単位９−１６の間で、相同組み換えがこれらの２つのウイルス構築物間で起こり、Ｈ５．００１ＣＢＬａｃＺ［配列番号３］（図２）と命名されたｒＡｄを生じた。このｒＡｄは、（Ａｄ地図単位０−１（ヌクレオチド１−３３０）；ＣＭＶエンハンサー／ニワトリβ−アクチンプロモーター（ＣＢ）（ヌクレオチド３７０−９２８）；大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ヌクレオチド９４５−４４２９）；ポリＡ（ヌクレオチド４４２９−４６２８）；並びにＨ５ｄｌ１００４からのＡｄ５地図単位９−９２．１及び９７．３ないし１００（ヌクレオチド４６７１−３５４０８）を含んでいる）ｐＡｄ．ＣＢＬａｃＺからの配列を含む。従って、このｒＡｄは、ＡｄＥ１及びＥ４遺伝子を機能的に欠失し、そして実質的に構造的に欠失している。ウイルスプラークを選択し、β−ガラクトシダーゼアッセイ［上に引用したＷｉｌｓｏｎ（１９８８）］により選別し、そして３回のプラーク精製後にＨ５．００１ＣＢＬａｃＺを単離した。精製したウイルスを塩化セシウム密度遠心分離及び大規模生産にも供した。以下のマウスでの実験のために、ウイルスをカラム精製後に用い、そしてグリセロールを１０％（ｖ／ｖ）の最終濃度まで加えた。ウイルスを使用するまで− ７０℃で保存した。実施例６−パッケージング細胞株におけるＨ５．００１ＣＢＬａｃＺの増殖反応速度論表Ｉに同定された細胞株を５のＭＯＩで組み換え体Ｈ５．００１ＣＢＬａｃＺで感染させる。Ｅ４補足細胞株におけるこのウイルスの増殖反応速度論を図３に示す。最大ウイルス収量を以下の表IIにＬＦＵ／ｍｌとして報告する。２９３−２７−１８細胞（デキサメタゾンにより誘導できるＭＭＴＶプロモーターを有するＥ４ＯＲＦ６細胞株）で増殖する場合、このウイルスの最大収量は２．９ｘ１０¹⁰ＬＦＵ／ｍｌである。いくつかの細胞株を５及び２０回の間培養し、そしてこれらの培養のウイルス生産は安定なままであった。しかしながら、ＲＰＥは細胞の繰り返された培養後減少した。実施例７−他の組み換えアデノウイルスｐＡｄＣＢＬａｃＺ及び他のヘルパーウイルス間の相同組み換えによりＨ５．００１ＣＢＬａｃＺと同様に他の関連するｒＡｄを調製した。一つの例として、Ｈ５．０００ＣＢＬａｃＺは、Ｈ５．００１ＣＢＬａｃＺと同じミニ遺伝子を含むが、完全なＥ４遺伝子を有する組み換えＥ１欠失Ａｄ５である。このｒＡｄを、ｐＡｄＣＢＬａｃＺ及び野生型Ａｄ５間の相同組み換えにより記述したように調製した。他の例として、Ｈ５．０１０ＣＢＬａｃＺは、Ｅ３遺伝子に小さい欠失を有して（Ａｄ５ｓｕｂ３６０バックボーン）、アデノウイルス地図単位０−１、それに続くＣＭＶが強めるニワトリ細胞質β−アクチンプロモーター、大腸菌β− ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、ポリＡ付加シグナル（ｐＡ）及びアデノウイルス型５地図単位９−１００を含む。このｒＡｄを、ｐＡｄＣＢＬａｃＺベクター及びＥ３遺伝子の１４．６ｋＤタンパク質内に１５０ｂｐの欠失を含むＡｄ５ウイルスｓｕｂ３６０間の相同組み換えにより調製することができる。例えば、両方とも引用することにより本明細書に取り込まれるＪ．Ｆ．Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：６１９６ −６２００（１９９４年６月）；及びＥｎｇｅｌｈａｒｄｔ等、Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．、５：１２１７−１２２９（１９９４年１０月）を参照。これらのｒＡｄをトランスフェクション後に単離し［Ｇｒａｈａｍ、Ｖｉｒｏｌ．、５２：４５６−４６７（１９７４）］、そして２回のプラーク精製に供した。以前に記述された［Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：１１１９２−１１１９６（１９９１）］ように塩化セシウム密度遠心分離によりライセートを精製した。リン酸緩衝食塩水を用いてＢｉｏＲａｄＤＧ１０カラムにウイルスを通すことにより塩化セシウムを除いた。実施例８−マウスへのＬａｃＺ遺伝子の導入Ａ．マウス筋肉への導入５ないし６週年齢のオスのＣ５７Ｂ／６マウスに麻酔をかけた。前脛骨の筋肉を露出させ、以下のようにｒＡｄＨ５．０００ＣＢＬａｃＺ、Ｈ５．０１０ＣＢＬａｃＺまたはＨ５．００１ＣＢＬａｃＺのいずれかを直接注入した。すなわち、筋肉の筋腹中へ１００μＬＨａｍｉｌｔｏｎ注射器の３３ゲージ針の先を挿入することにより、５ｘ１０¹¹ウイルス粒子／ｍＬのストック濃度で２５μＬの精製したウイルス懸濁液を注入した。注入後４、１４、２８及び６０日目に動物を殺した。筋肉を解離させ、液体窒素で冷却したイソペンタン中で凍結した。６μＭ切片をクリオスタットで切断し、固定し、そしてβ−ガラクトシダーゼ活性に対して３７℃で６時間染色した。４日目及び１４日目（最も大量）の染色において各ウイルスに対して青く染色されたｒＡｄが見られたが、２８日目までに、Ｈ５．００１ＣＢＬａｃＺは２８日目により多いウイルスを明らかに示した。６０日目まで、陽性に染色された唯一のウイルスはＨ５．００１ＣＢＬａｃＺであった。Ｂ．マウス肺及び血液循環への導入ｒＡｄＨ５．０００ＣＢＬａｃＺ（コントロール）及びＨ５．００１ＣＢＬａｃＺ（１ｘ１０¹¹ウイルス粒子）を６週年齢のＣ５７Ｂ／６メスマウスに尾の静脈注入及び気管注入により投与した。投与後４、９、２１、２８及び３５日目にこれらの動物を殺し、肝臓及び肺組織を集めた。導入遺伝子及びウイルス後期遺伝子発現を比較した。治療的服用量のウイルスで、導入遺伝子と比較して全ての時点で後期ウイルスタンパク質の減少した発現があった。Ｃ．肝臓における服用量への反応Ｃ５７ＢＬ／６マウスの肝臓におけるＥ４を欠失した及びＥ４が完全なｒＡｄの服用量に対する反応を、１．５ｘ１０¹¹、５ｘ１０¹⁰、１．７ｘ１０¹⁰、５．６ｘ１０⁹及び１．９ｘ１０⁹ウイルス粒子を尾の静脈に投与し、投与後４、２１、２８、３５及び４２日目に導入遺伝子及びウイルス後期遺伝子発現を比較することにより調べた。治療的服用量のウイルスで、導入遺伝子と比較して全ての時点で後期ウイルスタンパク質の減少した発現があった。実施例９−他の遺伝子導入Ａ．ヒトＯＴＣ遺伝子の導入ヒトＯＴＣ遺伝子［Ａ．Ｌ．Ｈｏｒｗｉｃｈ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２４：１０６８−１７４（１９８４）］またはヒトＣＦＴＲ遺伝子［Ｒｉｏｒｄａｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４５：１０６６−１０７３（１９８９）］を、上記のＬａｃＺベクターの構築に類似した技術を用いて、上記の組み換えＥ１／Ｅ４欠失アデノウイルス中の導入遺伝子としてＬａｃＺと置き換えるために用いた。得られたヒトＯＴＣ含有ｒＡｄをヒトの肝細胞に１０ないし３０のＭＯＩで投与した。Ｅ１／Ｅ４欠失ｒＡｄは、上の実施例に記述したように、Ｅ１／Ｅ４欠失ｒＡｄを筋肉に投与した場合より少ない複製及び少ない後期遺伝子発現を示した。しかしながら、この遺伝子導入の結果は、Ｅ１遺伝子中の欠失のみまたはＥ１遺伝子中の欠失及びＥ２ａ遺伝子中の点突然変異を含んでいるｒＡｄでの同様の導入よりよい。導入遺伝子がＣＦＴＲであり、投与方法が肺への気管内投与である場合に同様の結果が示される。実施例１０−Ａｄ突然変異体で感染されたＨｅＬａ細胞におけるｒＡＡＶＬａｃＺ（ＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺ）の形質導入効率Ａ．ウイルス以下のウイルス、（１）２９３細胞中で増殖した野生型Ａｄ５、（２）２９３細胞中で増殖したＡｄｄｌ１１０（５５ｋｂＥ１Ｂ遺伝子を欠失したＡｄ）［Ｂａｂｉｓｓ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、５２（２）：３８９−３９５（１９８４）並びにＢａｂｉｓｓ及びＧｉｎｓｂｅｒｇ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、５０（１）：２０２−２１２（１９８４）］、（３）２９３細胞中で増殖したＨ５．ＣＢＡＬＰ（上記のように、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子を欠失し、ＣＭＶが強めるβ−アクチンプロモーターからアルカリホスファターゼを発現するミニ遺伝子を含んでいるＡｄ）、（４）２９３細胞中で増殖したＡｄｔｓ１２５（ＤＮＡ結合タンパク質をコードするＥ２Ａ遺伝子中に温度感受性突然変異を有するＡｄ）［Ｅｎｓｉｎｇｅｒ及びＧｉｎｓｂｅｒｇ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１０（３）：３２８−３３９（１９７２）］、（５）Ｒｉｃｅ及びＫｌｅｓｓｉｇ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、５６（３）：７６７ −７７８（１９８５）に記述されたようなＥ２Ａ−補足ｇｍＤＢＰ細胞中で増殖したＡｄｄｌ８０２（Ｅ２ａ遺伝子を欠失したＡｄ）、（６）Ｅ４−補足ＶｅｒｏＷ１６２細胞［Ｗｅｉｎｂｅｒｇ及びＫｅｔｎｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０（１７）：５３８３ −５３８６（１９８３）］中で増殖したＡｄｄｌ１００４（Ｅ４遺伝子を欠失したＡｄ）、及び、（７）Ｅ４−補足ＶｅｒｏＷ１６２細胞［上に引用したＷｅｉｎｂｅｒｇ及びＫｅｔｎｅｒ］中で増殖したＡｄｄｌ１０１０（Ｅ４遺伝子のＯＲＦ６を欠失したＡｄ）、をこの実験に用いた。全てのウイルスを２回の連続したＣｓＣｌ中の浮遊密度超遠心により精製した。Ｂ．実験方法６ウェルの３６ｍｍ培養プレートに接種したＨｅＬａ細胞（２ｘ１０⁶細胞／ウェル）を、１０ｐｆｕ／ウェルのＭＯＩで野生型Ａｄ５または部分Ａに記述したようなアデノウイルス初期遺伝子突然変異体で感染させた。感染を１．０ｍｌＤＭＥＭ／２％ＦＢＳ中で行った。感染後６時間で単層を洗浄し、そして４ｘ１０⁹ウイルス粒子／ｍｌでＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺを含んでいる１．０ｍｌの新しいＤＭＥＭ／２％ＦＢＳ培地を加えた。これらの実験に用いたＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺウイルスロットは、組織化学染色によりＨ５．ＣＢＡＬＰヘルパーウイルスを含まないことが示されたけれども、混成するアデノウイルスがないことを確かにするために使用前にウイルスサンプルを熱処理（２０分間６０℃）に供した。２時間後に１．０ｍｌのＤＭＥＭ／１１５％ＦＢＳを各ウェルに加えた。ＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺの添加後２４時間で細胞を集めた。ウイルス形質導入を３種のデータ、すなわち、β−ガラクトシダーゼ活性に対する組織化学染色（以下）、細胞内β−ガラクトシダーゼの比活性（実施例１１）及びウイルスＤＮＡの分子形態（実施例１２）に関して評価するために各試験条件を三重に行った。Ｈｅｌａ細胞を、Ｊ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：３０１４−３０１８（１９８８）に記述されたように大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）活性に関して組織化学的に染色した。試験する異なる組み合わせは、ＡＡＶベクターのみ（ＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺ）、ベクター及び野生型Ａｄ５（＋Ａｄ５）、ベクター及びｄｌ１１０（＋ｄｌ１１０）、ベクター及びＡｄ突然変異体Ｈ５．ＣＢＡＬＰ（＋Ｈ５．ＣＢＡＬＰ）、ベクター及びＡｄ突然変異体ｔｓ１２５（＋ｔｓ１２５）、ベクター及びＡｄ突然変異体ｄ１８０２（＋ｄ１８０２）、ベクター及びＡｄ突然変異体ｄｌ１００４（＋ｄｌ１００４）並びにベクター及びＡｄ突然変異体ｄｌ１０１０（＋ｄｌ１０１０）でトランスフェクトした細胞を含んだ。組み換えβ−ガラクトシダーゼ活性に対する組織化学染色の倍率１０ｘでの顕微鏡写真（示さない）において結果を観察した。これらの結果は、野生型Ａｄ５並びにＥ２ａ突然変異体ｔｓ１２５及びｄｌ８０２が、陽性の青色細胞の数及び染色強度の度合いにより測定されるようにＬａｃＺｒＡＡＶ形質導入の顕著な減少を引き起こすことを示した。ｄｌ１１０（Ｅ１Ｂ−５５ｋＤａ）及びｄｌ１０１０（ＯＲＦ６）の両方は、陽性の青色細胞の数に関してＡｄ５、ｔｓ１２５及びｄｌ８０２のものに匹敵するレベルまで形質導入を高めた。Ｅ１欠失組み換え体Ｈ５．ＣＢＡＬＰは、ＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺ形質導入のいかなる顕著な増加も与えなかった。Ｅ４欠失突然変異体ｄｌ１００４で感染させたＨｅＬａ細胞で得られた形質導入の顕著な増加の欠如により明らかなように、Ｅ１のみの発現は、アデノウイルスが介在するｒＡＡＶ形質導入の増大において効果を有するのには不十分であった。形質導入の著しい減少が、同時感染するアデノウイルスのＥ４領域からのＯＲＦ６の除去の結果起こった（図５Ａ）。これらの結果は、アデノウイルス遺伝子産物Ｅ４及びＥ１が、転写的に活性のあるｄｓＤＮＡ中間体の形成を間接的に促進することを示すと考えられる。実施例１１−増大したベクター形質導入の定量（Ａ）実施例１０Ｂに記述したＨｅＬａ細胞の二重の組をこの実験に用いた。ＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺ組み換え体の添加後２４時間で、細胞内β−ガラクトシダーゼアッセイのために細胞ペレットを０．５ｍｌのＰＢＳに懸濁し、超音波処理した。細胞残渣を遠心分離（１５，０００Ｘｇ、１０分間）により除き、澄んだ抽出物を全タンパク質［Ｍ．Ｂｒａｄｆｏｒｄ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、７２（１−２）：２４８−２５４（１９７６）及びＭ．Ｂｒａｄｆｏｒｄ等、Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．、３５（３）：２７４（１９７６）］及びｏ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）を基質として用いたβ−ガラクトシダーゼ活性［上に引用したＳａｍｂｒｏｏｋ等］に関してアッセイした。図５Ａは、感染したＨｅＬａ細胞からのライセート中のβ−ガラクトシダーゼ酵素活性を測定することにより定量し、そして全タンパク質に関してもアッセイした形質導入効率を示す。図５Ａにおいて、試験条件を水平軸に沿って示し、そしてＯＮＰＧを基質として用いた細胞内β−ガラクトシダーゼ比活性（ミリユニット／ｍｇタンパク質）を垂直軸上に表した。各棒の下に、ＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺベクターのみを与えられた細胞に対する比活性の誘導倍率を示す。図５Ａの結果は、精製したｒＡＡＶのみで得られたものに比較して、Ｅ２ａ突然変異体ｔｓ１２５及びｄｌ８０２が、それぞれ、β−ガラクトシダーゼ活性の１３４倍及び２２５倍の増加を生じたことを示す。それに比較して、ｗｔＡｄ５で感染させた細胞は、β−ガラクトシダーゼ活性の１０７倍の増加を生じた。（Ｂ）他の実験において、ＨｅＬａ細胞（２ｘ１０⁶）を野生型Ａｄ５またはＥ２突然変異体ｄｌ８０２の増加する多重度で感染させた。感染後６時間で単層を洗浄し、そして１０００ウイルス粒子／細胞でＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺで感染させた。ＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺの添加後２４時間で細胞を集め、全タンパク質及び β−ガラクトシダーゼ活性に関してアッセイした。結果を図５Ｂの棒グラフに示し、この中で、アデノウイルスのＭＯＩを水平軸に沿って、そして細胞内β−ガラクトシダーゼ比活性を垂直軸に沿って示す。ｒＡＡＶ形質導入の増大は、野生型Ａｄ５及びｄｌ８０２の両方に対して１から５０までＭＯＩで投入したヘルパーアデノウイルスに比例した。ウイルスのより多い投入量は細胞変性であり、β−ガラクトシダーゼ発現の減少をもたらした。ｒＡＡＶ感染の前または感染時に細胞を感染させた場合に増大した形質導入が得られた。Ｅ１欠失組み換えＨ５．ＣＢＡＬＰ及びＥ４欠失突然変異体ｄｌ１００４は、ＡＶＣＭＶＬａｃＺ形質導入のいかなる顕著な増幅も与えなかった。ｄｌ１１０（Ｅ１Ｂ−５５ｋＤａ）及びｄｌ１０１０（ＯＲＦ６）で感染された両方の細胞が、Ａｄ５、ｔｓ１２５またはｄｌ８０２で感染されたものよりかなり低い全β−ガラクトシダーゼ活性を示した。実施例１２−ＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺ形質導入細胞における低分子量ＤＮＡの分析これらのアデノウイルスの初期遺伝子突然変異体を用いた研究は、ウイルス粒子自体よりむしろアデノウイルス遺伝子の発現がｒＡＡＶ形質導入の増大を招くことを示唆した。これらの機構をさらに調べ、そしてｓｓのｄｓゲノムへの転化がｒＡＡＶの形質導入効率を制限するかどうかを決定するために、ｒＡＡＶゲノムの分子状態を感染した細胞におい特徴づけた。ＲＦｍ形成及びｌａｃＺｒＡＡＶ形質導入の間の関係を同時染するウイルスの投入量を変える（ＭＯＩ＝１、５または１０）実験において調べた。（Ａ）実施例１０に記述したようなＨｅＬａ単層の二重の組を、組み換え体ＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺで形質導入し、そしてヘルパーアデノウイルスを含んでまたはこれを含まずに培養した後２４時間で集めた。Ｂ．Ｈｉｒｔ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６：３６５−３６９（１９６７）により最初に記述された方法の修正を用いて、エピゾームＤＮＡを細胞ペレットから抽出した。簡潔に言えば、細胞を３２０ｍｌＴｒｉｓ− Ｃｌ（ｐＨ８．０）／１０ｍＭＥＤＴＡに懸濁し、そしてＳＤＳを１％の最終濃度まで加えた。この混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。プロナーゼ及びプロテイナーゼＫをそれぞれ５００μｇ／ｍｌ及び２０μｇ／ｍｌの最終濃度まで加え、反応を３７℃で２時間インキュベートした。塩化ナトリウムを１．１Ｍの最終濃度まで加え、４℃で一晩インキュベートした。４℃のインキュベーション中に生じた沈殿物を３０分間２０，０００ｘｇでペレットとし、そして澄んだ上清を注意深く取り除いた。この上清をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で一回、続いてクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で抽出した。核酸をエタノールで沈殿させた。最終ペレットを５０μｌＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）／１．０ｍＭＥＤＴＡに懸濁した。これらのＨｉｒｔ抽出物をサザンブロットハイブリダイゼーションにより分析した。各Ｈｉｒｔ抽出物のサンプル（５μｌ）を１．２％アガロースゲルで分離し、ナイロン膜上に電気ブロットし、そしてＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺに用いたＳＶ４０ポリＡシグナルの³²Ｐランダムプライマー標識したｃＤＮＡでハイズリダイズした。実施例１２の実験のオートラジオグラム（示さない）は、ｓｓＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺゲノム（ＳＳ）、モノマー複製分子型（ＲＦｍ）及びコンカテマー複製分子型（ＲＦｄ）に対応するバンドを同定し、標識する。ｓｓＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺ（ＳＳ）、モノマー複製分子型（ＲＦｍ）及びコンカテマー複製分子型（ＲＦｄ）に対応するバンドを同定し、標識した。ＲＦｍバンドの基準とするために、ＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺを保有しているプラスミドを全ゲノムを遊離するように消化した。オートラジオグラムの露出時間は１４時間及び６９時間であった。このオートラジオグラムにおいて、溶解感染の間に存在する分子種の完全な範囲が、ＬａｃＺｒＡＡＶ及び野生型アデノウイルスの両方で感染された細胞において示された。投入したｓｓゲノム（ＳＳ）並びにｄｓ複製分子中間体のモノマー及びダイマー型（ＲＦｍ及びＲＦｄ）の両方が存在する。これは、ｓｓゲノムが検出される唯一の分子型である、精製したｒＡＡＶのみで感染させた細胞と対照的である。アデノウイルス初期遺伝子突然変異体で同時感染させた細胞の分析は、ｒＡＡＶゲノムのｄｓ型の形成及びＬａｃＺ形質導入の増大の間の直接の相関関係を示した。ｒＡＡＶ形質導入を増大することに効果のない突然変異体アデノウイルス（すなわち、Ｅ１欠失突然変異体Ｈ５．ＣＢＡＬＰ及びＥ４欠失突然変異体ｄｌ１００４）は、ＡＡＶのｄｓ型の形成を促進することができなかった。Ｅ２ａ（ｄｌ８０２）を欠失したまたはＥ１（ｄｌ１１０）もしくはＥ４（ｄｌ１０１０）を部分的に欠失したアデノウイルスで感染された細胞は、大きさがｌａｃＺｒＡＡＶゲノムのｄｓ複製分子モノマー（ＲＦｍ）に同一であり、そして存在量がβ−ガラクトシダーゼ活性の発現に直接相関関係があるバンドをさらに示した（これらの記述した結果を実施例１４の結果と比較せよ）。よりゆっくり移動する二重構造ｒＡＡＶのダイマーのようなコンカテマーもまた、上記のオートラジオグラムにおいて検出した。Ｅ１及びＥ４発現の存在下で、ｒＡｄ形質導入はｄｓＲＦモノマー及びダイマーの出現を常に伴った。サンプルレーン＋Ｈ５．ＣＢＡＬＰの高分子量のバンドは、ヘルパーウイルスＤＮＡである。ＣＢＡＬＰミニ遺伝子もＳＶ４０ポリＡシグナルを用いるので、ヘルパーウイルスＤＮＡがＳＶ４０プローブにより認識される。（Ｂ）別の実験において、実施例１０Ｂに記述したようにＨｅＬａ細胞をｗｔＡｄ５またはＥ２欠失突然変異体ｄ１８０２で感染させた。単層を２４時間後に集め、β−ガラクトシダーゼ活性及びＲＦｍ合成に関して分析した。上記のオートラジオグラムに示されたものと同様のモノマーバンドをＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ４４５ＳＩで定量し、値（ＣＰＭ）を特定した。結果を図８Ａ及び８Ｂのグラフに示し、この中で、β−ガラクトシダーゼ比活性及びＣＰＭを各図の垂直軸に沿って表す。アデノウイルスＭ０１を各図の水平軸に沿って示す。低いＭＯＩ感染（１、５及び１０）から得られたデータを示す。重要なことには、Ｅ１／Ｅ４発現アデノウイルスで感染させた細胞において、ｒＡＡＶベクター形質導入及び二重構造型の蓄積の間の密接な相関関係を得ることができた。β−ガラクトシダーゼのレベル及びＲＦｍ型の存在量は、感染する野生型Ａｄ（図６Ａ）及びｄｌ８０２（図６Ｂ）の量に比例して増加した。これらのデータは、エピゾーム二重構造中間体の合成が形質導入における絶対的な事象であることを示唆する。実施例１３−二重構造末端の分析以下は、Ｒｅｐの存在下（＋Ｒｅｐ）またはＲｅｐの非存在下（−Ｒｅｐ）での相補的ＡＡＶ鎖のリーディング鎖合成のモデルの説明である。図７Ａ−７Ｆを参照。Ｒｅｐは、閉じた末端を有する二重構造を開いた末端の二重構造に転化できる末端分解活性を発現する。Ｒｅｐの非存在下では、共有結合的に閉じたヘアピン構造をそのまま残して、末端分解が損なわれる。レスキューされたｄｓＡＡＶゲノムの両方の鎖がウイルス粒子内にパッケージされるので、これらの条件下で、ヘアピンは左側及び右側に見いだされると予想される。図７Ｂ−７Ｆは、アデノウイルス遺伝子発現に反応してｓｓＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺから合成される二重構造ＲＦｍの末端構造を同定するための方法を示すフローチャートである。図７Ｃは、ｒＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺの閉じた末端及び開いた末端のフラグメントを示す。図７Ｄ、７Ｅ及び７Ｆは、末端分解なしに位置４５０９でのＮｏｔＩ消化により生じた開いた末端の及び共有結合的に閉じた二重構造フラグメントの混合物を示す。ＮｏｔＩ４５０９消化は、ハイブリダイゼーションの標的（すなわち、ＳＶ４０ｐＡ）に関連して右のＩＴＲを含む３６１ｂｐフラグメントを遊離する簡便な方法を提供する。末端分解があると、開いた末端の３６１ｂｐフラグメントのみがそのような消化により生じる（図７Ｄ）と予想される。得られた電気泳動ゲル（示さない）は、レーン（１）に、ＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺｃＤＮＡを保有しているプラスミドのｒＡＡＶベクターを遊離する消化及びそれに続く右末端の３６１ｂｐフラグメントを遊離するＮｏｔＩでの消化の結果を示した。レーン（２）において、野生型Ａｄ５で感染させ、そしてＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺで形質導入したＨｅＬａ細胞から抽出したＮｏｔＩ消化したＨｉｒｔＤＮＡのサンプルが、２つのフラグメント、標識された型Ｉ及び型IIの遊離を生じた（図８Ａ及び８Ｂも参照）。ｓｓＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺ（ＳＳ）及びＲＦｍの移動も見られた。アデノウイルスで感染させた細胞中に蓄積したｄｓＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺ中間体は、ベクターＩＴＲの二重構造領域から開始するリーディング鎖ＤＮＡ合成の結果であると思われる。Ｒｅｐの非存在下で、この転化事象は、一方の末端が開き、そしてもう一方が共有結合的に閉じた分子を生じると予想される（図７Ａ）。このｄｓ中間体の構造をさらに特徴づけるために、ｒＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺ及びＡｄ５で同時感染させた細胞からのＨｉｒｔ抽出物をＮｏｔＩで消化し、開いたままの場合約３６１ｂｐの長さであるｄｓ中間体の末端を遊離させた。得られたフィルターを右側のＩＴＲのすぐ上流に位置するＳＶ４０ポリＡ付加シグナルに特異的なプローブでハイブリダイズした。少なくとも２つの型、開いた末端の構造（型II）を予示するゲルの位置に移動するもの及びもう一つのよりゆっくりと移動する種（型Ｉ）が二重構造ゲノムの右末端から遊離された。この結果はモデル（図７Ａ−７Ｆ）と一致したけれども、型Ｉの構造を確かに予示することは困難であった。しかしながら、その遅れた移動性は、開いた末端の型IIと異なる構造を示唆する。実施例１４−誘導性のＥ４ＯＲＦ６ｃＤＮＡで安定にトランスフェクトした２９３細胞におけるＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺ形質導入効率の分析このアッセイに用いた細胞株を実施例１に記述したように調製した。６ウェル３５ｍｍ培養プレートに２９３（ＭＴ−ＯＲＦ６）細胞及びＨｅＬａ（ＭＴ−ＯＲＦ６）細胞を接種し（２ｘ１０⁶細胞／ウェル）、そして１０００ウイルス粒子／細胞のＭＯＩで精製し熱処理したＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺで感染させた。０から増加する濃度までの硫酸亜鉛でのＯＲＦ６発現の誘導をウイルスの添加前２時間に開始し、そして実験の期間中続けた。ウイルスの添加後２４時間で細胞を集め、超音波処理によりライセートを作成し、そして先行する実施例に記述したようにβ−ガラクトシダーゼ発現（すなわち、β−ガラクトシダーゼ活性）及びウイルスＤＮＡに関して分析した。細胞抽出物からの低分子量ＤＮＡからＨｉｒｔ抽出物を調製した。Ｈｉｒｔ抽出物の調製及びそれに続くサザンハイブリダイゼーションによる分析を上の実施例に記述したものと同様に行った。この実験の結果は、以下のとおりであった。（１）比活性結果を図８Ａの棒グラフに示す。比活性（ミリユニットβ−ガラクトシダーゼ／ｍｇタンパク質）を垂直軸に沿って表す。各棒の下に、誘導のために用いた亜鉛の濃度、２９３細胞に対する誘導倍率及び亜鉛の非存在下で維持された２９３（ＯＲＦ６）細胞に対する誘導倍率を示す。図８Ａに示すように、Ｚｎ⁺²の非存在下で、２９３（ＭＴ−ＯＲＦ６）細胞株は、ｒＡＡＶに感染した２９３細胞において３９倍高いレベルのβ−ガラクトシダーゼを生じた。増加する量のＺｎ⁺² でのＯＲＦ６発現の誘導は、親の２９３系より４４５倍高いレベルまでのＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺ細胞形質導入の付随する増加をもたらした。Ｅ１のみの発現は、アデノウイルスが介在するｒＡＡＶ形質導入の増大における効果を有するのに不十分であった。 β−ガラクトシダーゼの比活性は、Ｅ１遺伝子のみを発現した２９３細胞における１．０ｍＵｎｉｔｓ／ｍｇに比較して、Ｅ１／Ｅ４を発現する２９３細胞において１９６．２ｍＵｎｉｔｓ／ｍｇであった。これらの実験は、Ｅ１及びＥ４の両方のアデノウイルス遺伝子の合わせた発現に依存するｒＡＡＶ形質導入を高めるための機構を支持する。（２）ＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺゲノムの分子の分析二重構造モノマー複製分子型（ＲＦｍ）を定量し、その値（ＣＰＭ）を図８Ｂの棒グラフの垂直軸に表した。誘導のために用いた亜鉛の濃度及び０ｍＭ亜鉛中で維持した２９３（ＯＲＦ６）細胞に対する誘導倍率を各棒の下に示す。オートラジオグラム（示さない）は、上記のＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺ形質導入細胞からのＨｉｒｔ抽出物を分離したアガロースゲルを示す。全配列を遊離するためにＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺｃＤＮＡを保有しているプラスミドを消化し、そしてオートラジオグラムのレーンに添加した。従って、このレーンに現れたバンドは、モノマー二重構造複製分子型（ＲＦｍ）の移動を示した。ｓｓＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺゲノム（ＳＳ）、ＲＦｍ及び二重構造複製分子型のダイマー（ＲＦｄ）の移動も示した。（０）、（５０）、（１００）、（１５０）、（２００）及び（２５０）と標識したオートラジオグラムのレーンは、示した濃度の亜鉛で誘導した２９３（ＭＴ−ＯＲＦ６）細胞からのサンプルを含んだ。ＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺで形質導入した２９３細胞からのＨｉｒｔ抽出物（２９３と標識したレーン）も示した。Ｈｉｒｔ抽出物の分析は、ｒＡＡＶで感染させた２９３（ＭＴ−ＯＲＦ６）細胞において、同様に感染させた２９３細胞に存在しないＲＦｍの存在を示した。ＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺ形質導入効率を説明する誘導特性（図８Ａ及び８Ｂ）を比較した場合、それらの結果を図Ｃに表した。図８Ａからの比活性（ミリユニット β−ガラク，トシダーゼ／ｍｇタンパク質）データ及び図８ＢからのＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺの１分当たりのカウント（ＣＰＭ）のデータを垂直軸に沿って表し、そして実験の間に用いた硫酸亜鉛の濃度を水平軸に沿って示す。２つの特性は、ほとんど鏡像である。重要なことには、ＯＲＦ−６発現をＺｎ⁺² で誘導した時に生じるＬａｃＺ形質導入活性の増加に比例して、ＲＦｍが増加した（図８Ｃ）。同様の結果が、グルココルチコイド反応性ＭＭＴＶプロモーターからＯＲＦ６を発現する２９３由来の細胞株で得られた。実施例１５−誘導性ＯＲＦ６ミニ遺伝子を保有するＨｅＬａ細胞における高められたＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺ形質導入形質導入中培地に硫酸亜鉛誘導因子の非存在下で、または５０、１００、１５０、２００もしくは２５０μＭ硫酸亜鉛誘導因子の存在下で、ＨｅＬａ（ＭＴ− ＯＲＦ６）細胞（２ｘ１０⁶）を１，０００ＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺ組み換え粒子／細胞のＭＯＩで形質導入した。２４時間後に細胞を集め、超音波処理により細胞抽出物を調製し、そして導入遺伝子発現（すなわち、β−ガラクトシダーゼ活性）に関して分析した。細胞単層をβ−ガラクトシダーゼ活性に関して組織化学的に染色した。得られた顕微鏡写真（示さない）は、組織化学染色が培地中のＺｎ⁺²の濃度を０から２００ｍＭまで上げるにつれてｌａｃＺ陽性と記録される細胞の数が増加することを表すことを示した。２５０ｍＭの濃度の亜鉛は、細胞に対して有毒であることが見いだされた。比活性（ミリユニットβ−ガラクトシダーゼ／ｍｇタンパク質）を図９に垂直軸に沿って表す。各棒の下に、誘導のために用いた亜鉛の濃度、ＨｅＬａ細胞に対する誘導倍率及び亜鉛の非存在下で維持したＨｅＬａ（ＭＴ−ＯＲＦ６）細胞に対する誘導倍率を示す。組織化学染色は、培地中のＺｎ⁺²の濃度を０から２００ｍＭまで上げるにつれてライセート中のβ− ガラクトシダーゼの量が増加することを示した。実施例１６−Ｅ４ＯＲＦ６の誘導後のＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺで形質導入したＨｅＬａ（ＭＴ−ＯＲＦ６）細胞からの低分子量ＤＮＡのサザンブロット分析二重構造中間体の合成がＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺ形質導入の増大に寄与するかどうかを決定するために、増加する濃度のＺｎ²⁺の存在下で実施例１５に記述したようにＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺで形質導入したＨｅＬａ（ＭＴ−ＯＲＦ６）細胞からＨｉｒｔ抽出物を調製した。硫酸亜鉛の濃度（０、５０、１００、１５０、２００及び２５０）で誘導したＨｅＬａ（ＭＴ−ＯＲＦ６）細胞のサンプルを１．２％アガロースサザンゲル（示さない）で分離し、ナイロン膜へ移し、そしてＬａｃＺ特異的プローブでハイブリダイズした。一つのレーンは、全ゲノムを遊離するように消化したＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺをコードしているプラスミドを含んだ。ｓｓＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺ（ＳＳ）、二重構造モノマー（ＲＦｍ）及び二重構造ダイマー（ＲＦｄ）に対応するバンドをゲル上に示した。サザン分析は、ＨｅＬａ及び非誘導ＨｅＬａ（ＭＴ−ＯＲＦ６）細胞がｓｓゲノムと一緒に移動する単一のバンドをサザンブロット上で表すことを示した。ＯＲＦ６の誘導は、検出できるレベルのｄｓモノマーの出現をもたらしたが、より高い濃度のＺｎ⁺²でだけであった。ＲＦｄと一緒に移動するバンドが全ての細胞調製物に存在し、モノマーがおそらくダイマーの前駆物質であるので、この関連性ははっきりしない。実施例１７−ネズミ肝臓へのインビボＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺ標的効率に対するアデノウイルス感染の効果ネズミ肝臓におけるｒＡＡＶ形質導入に対するアデノウイルス遺伝子発現の影響を、肝門静脈中へアデノウイルスの初期遺伝子突然変異体続いてｒＡＡＶを連続して注入することにより調べた。ケタミン（７０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射により４ないし６週年齢のＢａｌｂ／ｃマウス［ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＢａｒＨａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ］に麻酔をかけた。肝臓を調べるために、１ｃｍの左側腹切開を行い、脾臓を露出した。５０μｌＨＢＳ中の精製し、熱処理したＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺのサンプル（１ｘ１０¹¹ウイルス粒子）を単独でまたは５０μｌの最終容量に２ｘ１０¹⁰Ａ₂₆ ₀ 粒子の精製したｄｌ１００４、Ｈ５．ＣＢＡＬＰまたはｔｓ１２５を含んでいるヘルパーウイルスを加えて用いた。アデノウイルスの投与量は、＞２５％の肝細胞に形質導入するのに十分であった。ウイルス混合物を脾臓被膜のちょうど下に注入し、そして３−０ｖｉｃｒｙｌで腹を閉じた。感染後３日目に解剖を行い、組織をＯ．Ｃ．Ｔ．包埋化合物中で凍結した。凍結切片（６μｍ）（ＬａｃＺ＋ＡＬＰ）を調製し、そしてβ−ガラクトシダーゼ酵素及びアルカリホスファターゼ活性に対して組織化学的に染色した。切片をニュートラルレッドで対比染色し、スライドに載せた。倍率２０ｘでＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺで標的とされたβ−ガラクトシダーゼ陽性肝細胞を得た。遺伝子導入後３日目に集めた肝臓組織の組織化学分析は、１０¹¹ 粒子の精製したｒＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺのみの肝門静脈への投与が、感知できる遺伝子導入と結びつかない（細胞の＜０．０１％）ことを示し、これは、ｒＡＡＶ系の本来備わっている非効率性を確かめた。Ｅ４欠失ウイルスの前もった注入は、マウス肝臓におけるｒＡＡＶ形質導入に対して何の影響も有さず、一方、Ｅ１欠失ウイルスは、ｌａｃＺ陽性肝細胞の約０．１％までのわずかな増加を示した。ｒＡＡＶ形質導入の最も顕著な増加は、１０−２５％の肝細胞において検出されるｌａｃＺ発現を有するＥ２ａアデノウイルス突然変異体ｔｓ１２５の注入の結果生じた。アデノウイルス遺伝子発現及びｒＡＡＶ形質導入の間の直接の関係は、ｌａｃＺｒＡＡＶ及びＡＬＰを発現するＥ１欠失ウイルスの両方を注入した動物において示された。同時感染の偶然の発生を最小限にするために、アデノウイルスの投与量を１０倍減少した。組織化学研究は、β−ガラクトシダーゼを発現する肝細胞の大部分においてＡＬＰ及びβ−ガラクトシダーゼの同時局在化を示した。実施例１８−ネズミ肺へのインビボＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺ標的効率に対するアデノウイルス感染の効果マウス肺へのｒＡＡＶが介在する遺伝子導入の研究のために、マウス肝臓に対して実施例１７に記述した実験を適応した。肺実験のために、ＤｅＭａｔｔｅｏ等、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）、５９（５）：７８７−７８９（１９９５）に記述されたように麻酔をかけたＢａｌｂ／ｃ動物に挿管した。簡潔に言えば、気管を露出するために首に正中線２ｃｍ皮膚切開を行った。２インチ１８ゲージの血管カテーテルを口を通って通し、気管の真ん中部分に位置させ、そして齧歯類の人口呼吸装置（＃５５−３４３８Ｈａｒｖａｒｄ）に連結した。ポリエチレン（ＰＥ＃１０、Ｉｎｔｒａｍｅｄｉｃ）を側開口部（ｓｉｄｅｐｏｒｔ）からカテーテルを通して与え、気管の分岐点を越えて進めた。Ｈａｍｉｌｔｏｎ注射器を用いて、ウイルスサンプル（３０μＬ）をポリエチレン管を通して肺へゆっくりと注入した。サンプルは、肝臓注入に対して記述したような、ヘルパーアデノウイルスを含んだ、またはこれを含まない精製し熱処理したＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺの同じ調整物を含んだ。感染後７２時間で組織を集めた。凍結切片をβ−ガラクトシダーゼ活性に対して組織化学的に染色し、ニュートラルレッドで対比染色した。肺からの凍結切片（ＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺ）は、ＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺで標的とされたβ−ガラクトシダーゼ陽性の気道上皮細胞を示した。同様の研究を肺への遺伝子導入のネズミモデルにおいて行った。アデノウイルスをｒＡＡＶの注入前に気管へ注入した。３日後の肺組織の分析は、ｒＡＡＶのみを注入した動物において非常にまばらなβ−ガラクトシダーゼ陽性細胞を示した。Ｅ１またはＥ４のいずれかを欠失したアデノウイルスを前もって注入した動物において、ｒＡＡＶ形質導入の検出できる増大は認められなかった。形質導入の実質的な増大は、Ｅ２ａ突然変異体アデノウイルスを投与した動物の伝達気道及び肺細胞において得られた。肝臓及び肺への遺伝子治療のネズミモデルにおけるこれらの実験は、ｒＡＡＶ形質導入の効率が、投入したｓｓゲノムの転写的に活性のあるｄｓ中間体への限られた転化のために低いこと、及びこの転化がアデノウイルスＥ１及びＥ４遺伝子産物の発現により促進されることを確かめた。実施例１９−形質導入を増大することのできる制御されたミニ遺伝子を含む第二世代ｒＡＡＶ先行する実施例に記述した実験は、以下の原則、すなわち、（１）精製したｒＡＡＶはインビトロ及びインビボにおける比較的効率の悪い遺伝子導入媒体であり、そして、２）形質導入の律速段階は、ウイルスの侵入ではなくむしろウイルス粒子のｓｓＤＮＡゲノムの転写的に活性のあるｄｓＤＮＡゲノムへの転化である、を示した。アデノウイルスは、その遺伝子のサブセットの発現を通して実質的に形質導入を増大することができる。アデノウイルスは、ウイルス粒子ゲノムのそのｄｓ型への転化を促進することによりこれを行う。これを達成するための一つの方法は、形質導入を増大するために必要な最小のアデノウイルス遺伝子、すなわち、Ｅ４のＯＲＦ６領域を発現するミニ遺伝子を組み換えＡＡＶゲノム中に含むことである。この改変ｒＡＡＶを設計することにおいて２つの方法が考えられた。第一の方法は、連続した２つの転写単位、治療的遺伝子を発現するもの及び構成的プロモーターからＥ４ＯＲＦ６を発現するものを有するｒＡＡＶゲノムに基づく。これは実際多くの状況において有用であることができるけれども、ＯＲＦ６の構成的発現は、細胞に対して有害な可能性があり、そしておそらく破壊的な免疫反応を引き起こす可能性がある。このｒＡＡＶの第二の型は、この場合誘導性のプロモーターから発現されるＯＲＦ６転写単位に加えて治療的ミニ遺伝子を含む。この第二の遺伝子ｒＡＡＶが細胞（エクスビボ法）または患者（インビボ法）に投与される場合、誘導因子は遺伝子導入時にまたはそのすぐ後に投与される。ｄｓゲノム型またはその組み込まれた誘導体が安定であるなら、ＯＲＦ６の誘導は受容体細胞への遺伝子導入時に必要であるだけである。この後、その誘導因子を取り去り、そしてＯＲＦ６遺伝子を止める。この誘導性ＯＲＦ６の概念を示すｒＡＡＶを構築し、インビトロで試験した。ベクターｐＡＶ．ＣＭＶＡＬＰ．ＧＲＥ−ＯＲＦ６の概要図を図１１に示し、その配列を配列番号５に示す。この第二世代構築物は、隣接する５’及び３’ＡＡＶＩＴＲ配列を含む。ヒト胎盤アルカリホスファターゼｃＤＮＡ（ＡＬＰ）をミニ遺伝子中に含み、その中でサイトメガロウイルスの即時型初期遺伝子からのプロモーターが転写を誘導する。第二の転写単位をＩＴＲの間にアルカリホスファターゼミニ遺伝子と連続して同方向にクローン化した。第二の転写単位は、ＳＶ４０ポリＡ付加シグナルを有してグルココルチコイド依存性プロモーター（ＧＲＥ）からＡｄ５−Ｅ４−ＯＲＦ６を発現する。これを第二世代ｒＡＡＶ構築物と呼ぶ。より詳細には、ｐＡＶ．ＣＭＶＡＬＰ．ＧＲＥ−ＯＲＦ６［配列番号５］は、ＬａｃＺ導入遺伝子及びｒＡＡＶのｓｓからｄｓへの転化を促進するＡｄＥ４ＯＲＦ６を含んでいる新規なｒＡＡＶを生じる。このプラスミドは、隣接するＡＡＶ５’ＩＴＲ配列（ヌクレオチド５３−２１９）、ＣＭＶエンハンサー／プロモーター（ヌクレオチド２５５−８４８）、ヒト胎盤アルカリホスファターゼｃＤＮＡ（ＡＬＰ）（ヌクレオチド９１４−２８９２）、ＳＶ４０ポリＡ（ヌクレオチド２８９３−３０９０）、ＧＲＥプロモーター（ヌクレオチド３１１４−３３９３）、Ａｄ５Ｅ４−ＯＲＦ６ｃＤＮＡ（ヌクレオチド３４０２−４２８６）、ＳＶ４０ポリＡ（ヌクレオチド４３１５−４５１２）及び３’ＡＡＶＩＴＲ（ヌクレオチド４５４７−４７１３）を含む。全ての他のヌクレオチドはプラスミド由来である。第二世代ｒＡＡＶ構築物をｒＡＡＶウイルス粒子を生産し、そして精製するために用い、これを未処理のままの、またはデキサメタゾンと共にインキュベートしたＨｅＬａ細胞にさらした。デキサメタゾンの非存在下（ＯＲＦ６がほとんど発現されないはずの条件）で、アルカリホスファターゼ遺伝子の発現により測定されるように形質導入がほとんど見られなかった。デキサメタゾン中でインキュベートした細胞は、ＯＲＦ６遺伝子を発現し、そして形質導入効率は少なくとも５倍高められた。このことは、ｒＡＡＶから発現された遺伝子産物が導入遺伝子の発現を増大するためにシスに働くことができることを支持する証拠を提供する。実施例２０−骨髄への遺伝子治療への応用骨髄への遺伝子治療は、標的細胞が造血幹細胞であるエクスビボ遺伝子治療の実例を表す。基本的な方法は、治療的ミニ遺伝子を造血幹細胞の染色体ＤＮＡ中に含み（すなわち、組み込み）、これを骨髄を除去した受容体患者中へ移植することであり、遺伝的に修正された幹細胞の子孫でリンパ造血系の再集団を可能にする。この方法の問題は、幹細胞中へ効率よくトランスフェクトする遺伝子であった。骨髄への遺伝子治療の大部分の研究は、あまり効率のよくない組み換えレトロウイルスを利用してきた。一つの問題は、レトロウイルスがそれらのプロウイルスを標的細胞が***している時にだけ組み込むことである。残念ながら、インビトロで大部分の幹細胞は不活発で***していない。ｒＡＡＶは非***幹細胞へより効率よくプロウイルスを組み込む見込みを有する。しかしながら、精製したｒＡＡＶは、単独で用いた場合組み込みに関してあまり効率がよくない。培養した細胞において、組み込みは１％未満の細胞において見られる。ｓｓからｄｓゲノムへの転化を活性化する同じ条件が、染色体ＤＮＡへのｄｓ中間体の組み込みも増大する。従って、本発明の方法及び組成物の望ましい応用は骨髄への遺伝子治療においてである。本発明により、幹細胞を上記の構築物及び方法（例えば、実施例１９を参照）を用いてエクスビボでｒＡＡＶ及び誘導因子で遺伝的に修正する。遺伝的に修正された幹細胞を続いて通常の技術により移植する。本発明の多数の修正及び変形が、上に同定した明細書に含まれ、そして当該技術分野の熟練した者にとって明らかであると予想される。パッケージング細胞株及びｒＡｄの構築のための異なる導入遺伝子及びプラスミドの選択またはウイルスもしくは免疫調節剤の選択もしくは投与量のような本発明の組成物及び方法のそのような修正及び改変は、本明細書に付加した請求の範囲に含まれると考えられる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９６年１２月２３日【補正内容】本発明の態様は、嚢胞性線維症（ＣＦ）のような遺伝的疾患の患者における望ましい遺伝子の形質導入を含む、遺伝子治療ベクターによる患者の直接的なインビボ治療のための製薬学的組成物においても有用である。Ｉ．パッケージング細胞株導入遺伝子の受容量を増し、そしてｒＡｄの免疫反応を減少するために、できるだけ多くのウイルス遺伝子をアデノウイルスを不活性化するために欠失しなければならない。しかしながら、そのような欠失Ａｄの構築及び増殖のための補足細胞株を作成することは難しい。本発明の方法及び組成物は、第一世代のＥ１欠失アデノウイルスに対して遺伝子治療において以前同定されたいくつかの問題を克服し、そして特に筋肉組織への投与に利点を示す。Ａｄ血清型５の初期領域４（Ｅ４）は、ウイルスＤＮＡの複製、宿主細胞の遮断及び後期ｍＲＮＡの蓄積に関与すると考えられる７個のＯＲＦからなる。Ｅ４を欠失したｒＡｄを作成するためには、ヘルパーウイルスまたはパッケージング細胞株により、Ｅ４領域の機能がｒＡｄに提供されなければならない。しかしながら、機能するＡｄＥ１及び機能的なＥ４の単一の細胞株における連続じた発現は、通常、細胞に対して有毒であるので、有用なパッケージング細胞株はこれまで利用できないでいる。従って、そのような細胞は、ｒＡｄの増殖及び複製のために有用ではない。さらに、機能的なＡｄＥ１及びＡｄＥ４遺伝子をコードしているＤＮＡは、パッケージング細胞株中に存在する場合、ｒＡｄウイルスとの組み換えの機会を増し、ウイルスの野生型Ａｄウイルスへの復帰を引き起こす可能牲がある。本発明は、Ａｄ５Ｅ１遺伝子及びＡｄ５Ｅ４遺伝子のＯＲＦ６のみを含むパッケージング細胞株を提供することにより、これらの問題を回避する。Ｅ４のＯＲＦ６のみで、ウイルスの生活環におけるＥ４に対する要件を提供することができる。多数の既知のバクテリアシャトルベクターのいずれでも、そのベクターがレポーター遺伝子または多数、例えば、ネオマイシン、アンピシリンまたはプリマイシンが当該技術分野において既知である選択可能なマーカーを含むなら、ミニ遺伝子を保有するために用いることができる。当該技術分野の熟練した者は、プラスミドでトランスフェクトした細胞の染色体中にＯＲＦ６ミニ遺伝子を同様に導入することができる、他のプラスミド成分を用いた他の適当なシャトルベクターを開発することができると予想される。実施例１においてさらに説明するように、他のシャトルベクターが比較の目的のために考案され、これは内因性Ｅ４プロモーターの存在下または非存在下で構成的レトロウイルスＭＬＶＬＴＲ配列の制御下の完全なまたは実質的に完全なＡｄ５Ｅ４領域を含む。ＯＲＦ６ミニ遺伝子（または全Ｅ４領域）を保有するシャトルプラスミドが、ＡｄＥ１遺伝子産物を発現するＨＥＫ２９３細胞中に導入された。これらのＡｄＥ４またはＯＲＦ６遺伝子をそれらの内因性プロモーターまたは異種起源の誘導性プロモーターのいずれかから発現する補足細胞株が作成された。これらの細胞株は、それらの遺伝的構成、Ｅ４タンパク質合成、組み換えＡＡＶヘルパー機能、Ｈ５ｄｌ１００４ウイルスの相対的プラーク効率及び組み換えＥ１／Ｅ４欠失アデノウイルスの増殖反応速度論によりさらに特徴づけられる。典型的なＥ１／Ｅ４発現パッケージング細胞株のこれらの特性は、以下の実施例において詳細に説明される。 II．組み換えアデノウイルスＥ１／Ｅ４発現細胞株は、哺乳類の細胞及び組織へ適当な遺伝子を運ぶことができるＥ１／Ｅ４欠失ｒＡｄの構築において有用である。これらのｒＡｄは、少なくともＥ１ａ、Ｅ１ｂ及びＥ４Ａｄ遺伝子領域を機能的に欠失する。「機能的に欠失する」という用語は、遺伝子領域がもはら遺伝子発現産物を生産できないように、例えば突然変異または改変により、その遺伝子領域のかなりの量が除去されるまたはそうでなければ損傷を受けることを意味する。Ｂ．組み換えアデノウイルスの生産本発明に有用なアデノウイルス配列は、ジーンバンクから入手できる型Ａｄ５［ジーンバンク登録番号Ｍ７３２６０］を含む多数のアデノウイルス型のＤＮＡ配列を含むことができる。血清型２、３、４、７、１２及び４０のような、そしてさらに現在同定されている４１種のヒト型［例えば、上に引用したＨｏｒｗｉｔｚを参照］を含む、あらゆる既知のアデノウイルス血清型からアデノウイルス配列を得ることができる。同様に、他の動物に感染することが知られているアデノウイルスも本発明のベクター構築物に用いることができる。アデノウイルス型の選択は、以下の本発明を制限すると予想されない。様々なアデノウイルス株がＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄから入手でき、または様々な商業的及び研究所の供給者から請求により入手できる。以下の典型的な態様において、アデノウイルス型５（Ａｄ５）が便宜上用いられる。しかしながら、異なるヒトアデノウイルス血清型に基づく様々なアデノウイルスシャトルベクターを得ることが望ましい。細胞性及びおそらく体液性免疫を回避し、そして導入遺伝子発現の期間を延長し、並びに繰り返された治療的処置の結果を向上するための治療的投薬計画において、そのようなプラスミドのライブラリー及び得られたｒＡｄは有用であると予想される。加えて、様々な血清型の使用は、異なる組織標的特異性を有するｒＡｄを生産すると考えられる。さらに、本発明のｒＡｄにおけるアデノウイルス遺伝子Ｅ１及びＥ４の欠如は、Ｅ１遺伝子のみを欠失したｒＡｄの破壊を通常引き起こす不都合なＣＴＬ反応を減少または除去するはずである。本発明のｒＡｄは、Ｅ４遺伝子領域も完全にまたは機能的に欠失した、組み換えの欠損（すなわち、Ｅ１欠失）を有するアデノウイルスである。加えて、非許容温度では、ＨｅＬａ細胞中に減少した免疫反応性の７２ｋｄタンパク質が見られる。例えば、Ｊ．Ｆ．Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ等、Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．、５：１２１７−１２２９（１９９４）；Ｊ．Ｆ．Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：６１９６ −６２００（１９９４）及び１９９５年５月１８日に開示され、引用することにより本明細書に取り込まれる国際特許出願ＷＯ第９５／１３３９２号を参照。しかしながら、当該技術分野または他において以前記述されたようなアデノウイルスゲノムにおける他の欠失もまた、本発明のｒＡｄに生じることができると理解されなければならない。ｒＡｄの一つの最小型は、全てのウイルス遺伝子を欠失したアデノウイルスゲノム配列を含むことができる。より詳細には、このアデノウイルス配列は、（ｏｒｉとして働く）アデノウイルスのシスに作用する５ ’及び３’逆末端反復（ＩＴＲ）配列、並びに直鎖状のＡｄゲノムをパッケージングするために必要な配列及びＥ１プロモーターのためのエンハンサー成分を含む天然の５’ＩＴＲ及びパッケージング／エンハンサー領域（Ａｄ５ｍｕ０− １またはｂｐ１−３６０）を含んでいるアデノウイルス５’配列を、本発明のｒＡｄの５’アデノウイルス配列として用いることができる。アデノウイルスゲノムの約ｂｐ３５、３５３−末端または地図単位〜９８．４−１００に及びアデノウイルスゲノムの右末端（３’）ＩＴＲ配列を含んでいる３’アデノウイルス配列を、望ましくはｒＡｄの３’配列として用いることができる。Ｅ１及びＥ４遺伝子を明らかに欠いているこれらの配列は、ｒＡｄのミニ遺伝子に隣接またはこれと適切に結合することができる。次に、あらゆる他の必要なＡｄ遺伝子産物が、本発明のヘルパーウイルス及びＥ１／Ｅ４ＯＲＦ６発現パッケージング細胞により供給される。本発明における使用のために典型的なｒＡｄを、例えば、遺伝子治療用途のための他のｒＡｄを作成するための一般的に用いられている技術である、様々なｒＡｄからの適切なフラグメントの相同組み換えにより得ることができる。。Ｅ４を欠失したＨ５ｄｌ１００４ヘルパー及びｐＡｄＣＢＬａｃＺベクターの間で相同組み換えが起こり、これはベクター中のアデノウイルス−導入遺伝子配列が複製され、そしてウイルス粒子キャプシド中にパッケージングされることを可能にし、ｒＡｄを生じる。トランスフェクト後約３０またはそれ以上の時間で、細胞を集め、抽出物を調製し、そしてＬａｃＺ導入遺伝子を含んでいるｒＡｄをＣｓＣｌ勾配中の浮遊密度超遠心により精製する。 III．遺伝子治療における組み換えウイルスの使用上記のようにアデノウイルスベクター及びＥ４を欠失したヘルパーウイルス及びパッケージング細胞株の協力により生産される導入遺伝子を含んでいるｒＡｄは、インビボまたはエクスビボで製薬学的組成物中の導入遺伝子を患者へ運び、そして哺乳類細胞中へのその遺伝子の組み込みを与えることのできる効率よい遺伝子導入媒体を提供する。ｒＡｄは、遺伝子治療のために常法でヒトに投与され、そして導入遺伝子が向けられる疾患に対する代わりのまたは補足的な遺伝子治療として働く。本発明のｒＡｄを、好ましくは、生物学的に適合する溶剤または製薬学的に受容しうる運搬賦形剤中に懸濁して患者に投与することができる。適当な賦形剤は滅菌食塩水を含む。製薬学的に受容しうる担体であることが知られ、そして当該技術分野の熟練した者によく知られている他の水性及び非水性の等張滅菌注入溶剤、並びに水性及び非水性の滅菌懸濁剤をこの目的のために用いることができる。ｒＡｄは、適切な標的細胞、例えば、筋肉、肝臓、上皮等をトランスフェクトし、そして医学の当該技術分野の熟練した者が決定することのできる過度に不都合でないまたは医学的に受容しうる生理学的効果を有して治療利益を提供するのに十分なレベルの導入遺伝子の導入及び発現を与えるために十分な量で投与される。この効果を生じるのに有用なＡｄ初期遺伝子は、Ｅ１、Ｅ２ａ、Ｅ４及びこれらの機能的フラグメントである。しかしながら、以下の実施例により示されるように、アデノウイルスは、アデノウイルスのＥ１及びＥ４遺伝子の発現に依存し、そしてｒＡＡＶのｄｓ複製分子型の出現に直接比例するように、インビトロで組み換えＡＡＶ形質導入を実質的に増大する。ヘルパーウイルスの一つの例は、野生型の初期遺伝子の大部分を欠失し、そしてＥ４遺伝子またはその機能的フラグメントのみを標的細胞中で発現することのできるアデノウイルスである。そのような機能的フラグメントん中にＥ４遺伝子のＯＲＦ６がある。実施例において以下に記述するように、細胞株における実験は、アデノウイルスＥ４遺伝子座のＯＲＦ６がｒＡＡＶ形質導入を顕著に増大するのに十分であることを示す。アデノウイルスのＥ４−ＯＲＦ６の選択的な発現は、Ｅ１及びＥ４遺伝子産物の組み合わせにさらすことにより生じたものに比較して、類似するが、いくぶん減じられた形質導入効率の増加を伴う。すなわち、Ｅ４のＯＲＦ６産物はｒＡＡＶ形質導入の増加を高めるのに十分であるが、この効果は、Ｅ１遺伝子産物により実質的に増幅される。従って、より好ましくは、発現されたＥ１及びＥ４遺伝子産物の両方にｒＡＡＶをさらすことが、上記の律速工程の実質的な増大もたらす。従って、他の典型的なヘルパーウイルスは、発現するとｓｓからｄｓへの転化を促進する一つ以上の遺伝子を含むこともできる。そのようなヘルパーウイルスの例は、Ｅ１及びＥ４遺伝子の両方またはこれらの機能的フラグメントを発現するアデノウイルスである。ウイルスが、標的細胞を提供する患者において疾病を引き起こさないように十分に損なわれるなら、さらに他のＡｄ遺伝子をヘルパーウイルスにより発現することができる。そのような新規なｒＡＡＶの他の態様は、発現時に、標的細胞中でｓｓからｄｓｒＡＡＶへの転化を促進する能力を有する一つ以上の遺伝子を含むことができる。例えば、上記の新規なｒＡＡＶは、発現を導くことのできる調節配列に適切に連結された付加的な選択した遺伝子を含むことができ、その付加的な遺伝子及び上記の該第二の「転化」遺伝子は、第二及び付加的な遺伝子の両方の発現時に、ｓｓｒＡＡＶのそのｄｓ型への転化を一緒に促進することができる。このｒＡＡＶにおいて、３つの遺伝子全て、すなわち、導入遺伝子、第二の「転化」遺伝子及び付加的な遺伝子は、ＡＡＶＤＮＡに隣接する。新規なｒＡＡＶの一つの望ましい態様において、ＡＡＶＩＴＲは選択した導入遺伝子及びアデノウイルスＥ４遺伝子またはその機能的フラグメント（例えば、ＯＲＦ６配列）である転化遺伝子に隣接する。他の態様において、新規な組み換え体は、３つの遺伝子、導入遺伝子、アデノウイルスＥ４遺伝子またはその機能的フラグメント及びアデノウイルスＥ１遺伝子またはその機能的フラグメントを発現する。導入遺伝子と共に標的細胞中で発現されたＥ１及びＥ４遺伝子産物は、ｒＡＡＶのｓｓのｄｓ型への転化を促進するように一緒に作用する。新規なｒＡＡＶ及びその使用のさらに他の態様において、例えば、転化遺伝子が単一の第二の遺伝子であろうとまたは一つより多い付加的な遺伝子であろうと、その発現を導く調節配列は誘導性のプロモーターを含むことができる。従って、転化遺伝子の発現は、誘導因子の存在下でのみ起こる。多数の誘導性プロモーター及びコンパニオン誘導因子、例えば、グルココルチコイドのようなステロイドが当該技術分野に知られており、そしてこの記述を用いて当該技術分野の熟練した者は、本発明のｒＡＡＶ及び方法に組み込むためにこれらを容易に選択することができる。少なくとも一つの「転化遺伝子」を保有するそのような「第二世代」のｒＡＡＶを用いる本発明の方法は、このｓｓｒＡＡＶで標的細胞を感染させることを提供する。本発明の新規なｒＡＡＶウイルス及び方法は、体細胞遺伝子治療のための効率よい遺伝子導入媒体を提供し、そしてエクスビボでの用途及びインビボでの使用のための製薬学的組成物に適している。本明細書に記述されるｒＡＡＶ及び方法を用いることにより、ｒＡＡＶが、例えば、代表的なｒＡＡＶ、ＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺにおいて示されたＬａｃＺ導入遺伝子の場所に治療的遺伝子を含む場合、その治療的導入遺伝子をインビボまたはエクスビボで患者へ運ぶことができ、標的細胞中への適切な遺伝子の効率よい形質導入及びおそらく安定な組込みを与える。従って、本明細書に記述されるこれらの新規なｒＡＡＶ及び方法を遺伝的欠損または障害を修正するために用いることができる。ＡＡＶがそのゲノムを非分裂細胞中へ効率よく組込む能力は、造血幹細胞のエクスビボ形質導入に基づく遺伝子治療の開発において現在利用されている。ｒＡＡＶのインビボでの用途は、伝達気道の最終的に分化した上皮細胞に形質導入するために精製したウイルスのストックを気道中に注入する、ＣＦの治療のために主に開発されている。本明細書に記述する方法及び組成物を遺伝子治療の両方の型で用いることができる。そのような使用のために適した他の状態は、家族性高コレステロール血症の治療のために低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レセプター遺伝子の肝細胞中への形質導入を含む。当該技術分野の熟練した者は、これら及び他の疾患の治療のために上の方法により用いることができる多数のｒＡＡＶを作成することができる。エクスビボまたはインビボ治療に対して、生物学的に適合した溶剤または製薬学的に受容しうる運搬賦形剤中にウイルス粒子を懸濁することにより、ｒＡＡＶを標的細胞を感染するために用いることができる。適当な賦形剤は滅菌食塩水を含む。製薬学的に受容しうる担体であることが知られ、そして当該技術分野の熟練した者によく知られている他の水性及び非水性の等張滅菌注入溶剤並びに水性及び非水性の滅菌懸濁剤をこの目的のために用いることができる。ｒＡＡＶは、適切な細胞をトランスフェクトし、そして医学の当該技術分野の熟練した者が決定することができる、過度に不都合でないまたは医学的に受容しうる生理学的効果を有する治療的利益を与えるのに十分なレベルの選択した導入遺伝子の発現を与えるために十分な量で投与される。インビボ投与の通常のそして製薬学的に受容しうる経路は、標的器官、組織または部位への直接運搬、鼻内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、経口及び他の非経口投与を含む。要求される場合、投与の経路を組み合わせることができる。この方法の感染工程のためのｒＡＡＶの服用量は、主に、治療的環境、すなわちエクスビボまたはインビボ、治療される状態、選択した遺伝子、患者の年齢、体重及び健康のような因子により決定され、従って、患者間で変わる可能性がある。エクスビボ治療のための治療的に効果のあるｒＡＡＶの服用量は、約１から約１０までの間の形質導入粒子／細胞の範囲にあると思われる感染多重度に基づく。本発明によるインビボ感染のための治療的に有効なｒＡＡＶのヒト服用量は、約１ｘ１０⁷から１ｘ１０¹⁰形質導入粒子／ｍｌの濃度のウイルスを含んでいる約２０から約５０ｍｌまでの食塩水溶液の範囲にあると考えられる。好ましいヒト服用量は、上の濃度で約２０ｍｌの食塩水溶液である。服用量は、あらゆる副作用と治療的利益を比較検討して調整される。服用量投与の選択、調整または頻度を決定するために、選択した遺伝子の発現のレベルを調べることができる。実施例１０に記述するように、異なるアデノウイルス初期遺伝子突然変異体をＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺと呼ばれる精製したＬａｃＺｒＡＡＶと混合することにより、一連の相補性群を作成した（実施例２を参照）。これらの特定したウイルスの混合物をＨｅＬａ細胞においてＬａｃＺ形質導入に関して分析した（実施例１２及び１３を参照）。Ｅ１欠失ｒＡｄＨ５．ＣＢＡＬＰ及びＥ４欠失突然変異体ｄｌ１００４は、ＡＶ．ＣＭＶＬａｃＺの形質導入の顕著な増加を与えなかった（図５Ａ）。しかしながら、より少ない重大な欠失を有するＥ１及びＥ４突然変異体で部分的な活性を達成することができた。ｄｌ１１０（Ｅ１Ｂ−５５ｋＤａ欠失）及びＤｌ１０１０（ＯＲＦ６欠失）の両方が、陽性の青色細胞の数に関してＡｄ５、ｔｓ１２５及びｄｌ８０２のものに匹敵するレベルまで形質導入を増大したが、全β−ガラクトシダーゼ活性はかなり低かった（図５Ａ）。これらの結果は、ｒＡＡＶ形質導入の増大に初期領域Ｅ１及びＥ４を結び付ける。以下に記述する実験も、転化遺伝子としてＥ４のようなＡｄ遺伝子を含む新規なｒＡＡＶが、ヘルパーウイルスの非存在下でｒＡＡＶの形質導入効率を増加することができることを示す。以下の実施例１５においてより詳細に記述するように、２９３細胞がＥ４に広がるＡｄ５のゲノムフラグメントで安定にトランスフェクトされた。このＥ１／Ｅ４発現細胞株及び親のＥ１発現細胞株（２９３）をｒＡＡＶで感染させ、形質導入に関して分析した。これらの実験は、ｒＡＡＶ形質導入のアデノウイルスが介在する増大におけるＥ１及びＥ４（ＯＲＦ６）の合わせた発現の重要性を示した。Ｅ１及びＥ４発現の存在下で、ｒＡＡＶ形質導入はｄｓＲＦモノマー及びダイマーの出現を常に伴った（実施例１４）。重要なことには、ｒＡＡＶベクター形質導入及び二重構造型の蓄積の間の密接な相互関係を、２つの異なる実験環境、すなわち、Ｅ１／Ｅ４発現アデノウイルスで感染した細胞（図８Ａ及び８Ｂ）または補足細胞株（図８Ｃ）において得ることができた。実施例４−相対的プラーク形成効率実施例３において強い相補性能力を示している実施例１の細胞株をＷ１６２細胞（Ｅ１を発現しないＥ４補足Ｖｅｒｏ細胞株［Ｗｅｉｎｂｅｒｇ及びＫｅｔｎｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０（１７）：５３８３−５３８６（１９８３）］に比較したＨ５ｄｌ１００４の相対的なプラーク形成効率に関して選別した。以下の表IIにおいて、ＲＰＥ％、すなわち相対的プラーク形成効率は、試験した細胞株におけるＨ５ｄｌ１００４の力価／Ｗ１６２細胞におけるＨ５ｄｌ１００４の力価を表す。例えば、２９３細胞のＲＰＥは０である。全ての規準により選択した陽性の細胞株を、実施例２、３及び４のアッセイの結果と共に以下の表Ｉに明らかにする。実施例５−Ｈ５．００１ＣＢＬａｃＺの構築及び精製プラスミドｐＡｄ．ＣＢＬａｃＺを、引用することにより本明細書に取り込まれるＫ．Ｋｏｚａｒｓｋｙ等、Ｓｏｍ．ＣｅｌｌＭｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．、１９（５）：４４９−４５８（１９９３）に詳細に記述されたように構築した。このプラスミドは、５’ 【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年７月１７日【補正内容】請求の範囲１．アデノウイルスとの混成から精製し、そして（ａ）形質導入のために必要なアデノ随伴ウイルス逆末端反復配列、（ｂ）（ａ）の配列に隣接する、発現を導く調節配列に適切に連結された選択遺伝子を含んでなる組み換えアデノ随伴ウイルスに標的細胞を感染させ、該標的細胞ヘアデノウイルスＥ４遺伝子産物を運ぶ非天然に生じる因子を該標的細胞中に導入する工程を含んでなる標的細胞中への組み換えＡＡＶの形質導入の効率を増大するための方法。２．該因子が、標的細胞中ヘアデノウイルスＥ１遺伝子産物をさらに運ぶ請求の範囲１に記載の方法。３．該因子が、アデノウイルスＥ４遺伝子またはその機能的フラグメントを含んでなる組み換えヘルパーウイルスである請求の範囲１に記載の方法。４．該組み換えヘルパーウイルスがアデノウイルスである請求の範囲３または６に記載の方法。５．該組み換えヘルパーウイルスがさらにアデノウイルスＥ１遺伝子またはその機能的フラグメントを含んでなる請求の範囲３に記載の方法。６．該Ｅ４遺伝子の該機能的フラグメントがＥ４の読み枠６を含んでなる請求の範囲３に記載の方法。７．該非天然に生じる因子が、該標的細胞中で該アデノウイルスＥ４遺伝子産物の発現を導く調節配列に適切に連結された該Ｅ４遺伝子産物をコードしているＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ分子である請求の範囲１に記載の方法。８．該ＤＮＡ分子が、さらに該標的細胞中でアデノウイルスＥ１遺伝子産物の発現を導く調節配列に適切に連結された、該Ｅ１遺伝子産物をコードしているＤＮＡ配列を含んでなる請求の範囲７に記載の方法。９．該アデノウイルスＥ４遺伝子産物及び／または該Ｅ１遺伝子産物の発現を導く該調節配列が構成的プロモーターを含んでなる請求の範囲７または８に記載の方法。１０．該アデノウイルスＥ４遺伝子産物及び／または該アデノウイルスＥ１遺伝子産物の発現を導く該調節配列が誘導性プロモーターを含んでなり、そして該細胞が誘導因子にさらされる、請求の範囲７または８に記載の方法。１１．アデノウイルスとの混成から精製し、そして（ａ）形質導入のために必要なアデノ随伴ウイルス逆方向末端反復配列、（ｂ）選択した遺伝子産物の発現を導く調節配列に適切に連結された選択した遺伝子及び（ｃ）アデノウイルスＥ４遺伝子産物の発現を導く調節配列に適切に連結されたアデノウイルスＥ４遺伝子またはその機能的フラグメントを含んでなり、該選択した遺伝子及び該Ｅ４遺伝子が（ａ）の配列に隣接する組み換えアデノ随伴ウイルスに標的細胞を感染させることを含んでなる該標的細胞中への組み換えＡＡＶの形質導入の効率を増大するための方法。１２．該組み換えアデノ随伴ウイルスが、さらにアデノウイルスＥ１遺伝子産物の発現を導く調節配列に適切に連結されたアデノウイルスＥ１遺伝子またはその機能的フラグメントを含んでなり、該標的細胞中で該選択した遺伝子、Ｅ４遺伝子及びＥ１遺伝子が（ａ）の配列に隣接する請求の範囲１１に記載の方法。１３．該Ｅ４の機能的フラグメントがＯＲＦ６配列である請求の範囲１１に記載の方法。１４．該Ｅ１遺伝子産物の発現を導く該調節配列が誘導性プロモーターを含んでなり、そして該細胞が誘導因子にさらされる、請求の範囲１２に記載の方法。１５．該アデノウイルスＥ１遺伝子産物の発現を導く該調節配列が構成的プロモーターを含んでなる請求の範囲１２に記載の方法。１６．該アデノウイルスＥ４遺伝子産物の発現を導く該調節配列が誘導性プロモーターを含んでなり、そして細胞が誘導因子にさらされる、請求の範囲１１に記載の方法。１７．該アデノウイルスＥ４遺伝子産物の発現を導く該調節配列が構成的プロモーターを含んでなる請求の範囲１１に記載の方法。１８．（ａ）形質導入のために必要なアデノ随伴ウイルス逆末端反復配列、（ｂ）発現を導く調節配列に適切に連結された選択した遺伝子、及び、（ｃ）アデノウィルスＥ４遺伝子産物の発現を導く調節配列に適切に連結されたアデノウイルスＥ４遺伝子またはその機能的フラグメントを含んでなり、該選択した遺伝子及び該アデノウイルスＥ４遺伝子が（ａ）の配列に隣接する組み換えアデノ随伴ウイルス。１９．該機能的フラグメントがＥ４のＯＲＦ６である請求の範囲１８に記載の組み換えアデノ随伴ウイルス。２０．該アデノウイルスＥ４遺伝子産物の発現を導く該調節配列が誘導性プロモーターを含んでなる請求の範囲１８に記載の組み換えアデノ随伴ウイルス。２１．該アデノウイルスＥ４遺伝子産物の発現を導く該調節配列が構成的プロモーターを含んでなる請求の範囲１８に記載の組み換えアデノ随伴ウイルス。２２．Ｅ１遺伝子産物の発現を導く調節配列に適切に連結されたアデノウイルスＥ１遺伝子またはその機能的フラグメントをさらに含んでなり、該選択した遺伝子、Ｅ４遺伝子及びＥ１遺伝子が（ａ）の配列に隣接する請求の範囲１８に記載の組み換えアデノ随伴ウイルス。２３．該Ｅ１遺伝子産物の発現を導く該調節配列が誘導性プロモーターを含んでなる請求の範囲２２に記載の組み換えアデノ随伴ウイルス。２４．該Ｅ１遺伝子産物の発現を導く該調節配列が構成的プロモーターを含んでなる請求の範囲２２に記載の組み換えアデノ随伴ウイルス。２５．組み換えアデノ随伴ウイルス及び標的産物へアデノウイルスＥ４遺伝子産物を運ぶ非天然に生じる因子を含んでなる製薬学的組成物。２６．該ウイルスが請求の範囲１８−２４の組み換えウイルスからなる群から選択される請求の範囲２５に記載の組成物。２７．該組み換えウイルス中の該Ｅ４またはＥ１遺伝子産物の発現を誘導する誘導因子をさらに含んでなる請求の範囲２６に記載の組成物。２８．請求の範囲１８−２４の組み換えアデノ随伴ウイルスで形質導入した哺乳類細胞。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ガオ，グアング−ピングアメリカ合衆国ペンシルベニア州19083ハバータウン・ローレンスロード1925・ロビンデイルアパートメントエフ５

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）アデノ随伴ウイルスのゲノムの少なくとも一部であって、細胞分裂をしていない標的細胞中へ選択した遺伝子を形質導入することのできる部分のＤＮＡ、及び（ｂ）発現を導く調節配列に適切に連結され、（ａ）のＤＮＡに隣接し、そして標的細胞中で発現することのできる選択した遺伝子を含んでなる組み換えアデノ随伴ウイルスを提供し、該標的細胞を該組み換えアデノ随伴ウイルスに感染させ、該感染細胞を該ｓｓ組み換えウイルスのその二本鎖型への転化を促進する因子と接触させ、その場合、該転化が該標的細胞中で起こり、該標的細胞中への該組み換えウイルスの増大した形質転換をもたらす工程を含んでなるエクスビボでの標的細胞中への組み換えＡＡＶの形質導入の効率を増大するための方法。２．該因子が、該一本鎖組み換えウイルスの二本鎖組み換えウイルスへの転化を増大することのできるポリペプチドまたはその機能的フラグメントをコードする選択した遺伝子を含んでなるヘルパーウイルスであり、該ヘルパーウイルスが細胞***をしていない標的細胞中へ該選択した遺伝子を形質導入することができる、請求の範囲１に記載の方法。３．該接触工程が該標的細胞を該ヘルパーウイルスに同時感染させことを含んでなる請求の範囲２に記載の方法。４．該ヘルパーウイルスがアデノウイルスである請求の範囲３に記載の方法。５．該選択した遺伝子がアデノウイルスＥ４遺伝子またはその機能的フラグメントである請求の範囲２に記載の方法。６．該アデノウイルスが２つの選択した遺伝子またはそれらの機能的フラグメントを含み、該遺伝子がアデノウイルスＥ４遺伝子及びＥ１遺伝子である、請求の範囲２に記載の方法。７．該Ｅ４遺伝子の該機能的フラグメントがＥ４の読み枠６を含んでなる請求の範囲５または６に記載の方法。８．該組み換えアデノ随伴ウイルスが、さらに二番目に選択した遺伝子の発現を導くことのできる調節配列に適切に連結された該第二の遺伝子を含んでなり、該第二の遺伝子が発現時に該一本鎖組み換えウイルスのその二本鎖型への転化を促進することができ、そして標的細胞中で該第一の選択した遺伝子と同時発現することができ、それにより第二の遺伝子産物が標的細胞中で発現され、その場合、該転化が該標的細胞中で起こり、該標的細胞中に該組み換えウイルスの増大した形質導入をもたらす、請求の範囲１に記載の方法。９．該第二の遺伝子の発現を導く調節配列が誘導性プロモーターを含んでなり、そして該第二の遺伝子の発現が誘導因子の存在下で起こる、請求の範囲８に記載の方法。１０．（ａ）アデノ随伴ウイルスのゲノムの少なくとも一部であって、細胞 ***をしていない標的細胞中へ少なくとも２つの選択した遺伝子またはそれらの機能的フラグメントを形質導入することのできる部分のＤＮＡ、（ｂ）発現を導く調節配列に適切に連結された第一の選択した遺伝子、（ｃ）発現を導くことのできる調節配列に適切に連結された第二の選択した遺伝子を含んでなり、該第二の遺伝子が発現時に該一本鎖組み換えウイルスのその二本鎖型への転化を促進することができ、該第一及び該第二の遺伝子が（ａ）のＤＮＡに隣接し、該第一及び第二の遺伝子が標的細胞中で同時発現することができる、組み換えアデノ随伴ウイルス。１１．該第二の遺伝子がアデノウイルスＥ４遺伝子、Ｅ４のＯＲＦ６及びこれらの機能的フラグメントからなる群から選択される請求の範囲１０に記載の組み換えウイルス。１２．該第二の遺伝子がアデノウイルスＥ１遺伝子またはその機能的フラグメントである請求の範囲１０に記載の組み換えウイルス。１３．該第二の遺伝子の発現を導く調節配列が誘導性プロモーターを含んでなり、そして該第二の遺伝子の発現が誘導因子の存在下で起こる請求の範囲１０に記載の組み換えウイルス。１４．さらに（ｄ）発現を誘導することのできる調節配列に適切に連結された付加的な選択した遺伝子を含んでなり、該付加的な遺伝子及び該第二の遺伝子が該第二及び付加的な遺伝子の両方の発現時に該一本鎖組み換えウイルスのその二本鎖型への転化を一緒に促進することができ、該第一、第二及び付加的な遺伝子が（ａ）のＤＮＡに隣接し、そして標的細胞中で同時発現することができる、請求の範囲１０に記載の組み換えウイルス。１５．該第二の遺伝子がアデノウイルスＥ４遺伝子またはその機能的フラグメントであり、そして該付加的な遺伝子がアデノウイルスＥ１遺伝子またはその機能的フラグメントである、請求の範囲１４に記載の組み換えウイルス。１６．該Ｅ４の機能的フラグメントがＯＲＦ６配列である請求の範囲１５に記載の組み換えウイルス。１７．該付加的な遺伝子の発現を導く調簡配列が誘導性プロモーターを含んでなり、そして該付加的な遺伝子の発現が誘導因子の存在下で起こる、請求の範囲１５に記載の組み換えウイルス。１８．請求の範囲１０から１６までの組み換えアデノ随伴ウイルスを提供し、標的細胞を該組み換えウイルスに感染させ、そして該標的細胞中での該選択した遺伝子の発現を可能にする条件下で該感染細胞を培養し、該転化が該標的細胞中で起こり、該標的細胞中での該組み換えウイルスの増大した形質導入をもたらす工程を含んでなる該標的細胞中への組み換えＡＡＶの形質導入の効率を増大するための方法。１９．請求の範囲１７の組み換えアデノ随伴ウイルスを提供し、標的細胞を該組み換えウイルスで感染させ、そして該標的細胞中で該第二または付加的な遺伝子の発現を誘導する誘導因子に該標的細胞を接触させ、該転化が該評定細胞中で起こり、該標的細胞中での該組み換えウイルスの増大した形質導入をもたらす工程を含んでなる該標的細胞中への組み換えＡＡＶの形質導入の効率を増大するための方法。２０．組み換えアデノ随伴ウイルス及び標的細胞中で該ｓｓ組み換えウイルスのその二本鎖型への転化を促進する因子を含んでなる製薬学的組成物。２１．該ウイルスが請求の範囲１０−１６の組み換えウイルスからなる群から選択される請求の範囲２０に記載の組成物。２２．該ウイルスが請求の範囲１７の組み換えウイルスであり、そしてさらに該組み換えウイルス中の該第二または付加的な遺伝子の発現を誘導する誘導因子を含んでなる請求の範囲２０に記載の組成物。２３．請求の範囲１０−１７の組み換えアデノ随伴ウイルスで形質導入した哺乳類細胞。