CZ296600B6 - Virový vektor obsahující replikující se DNA, zpusob prípravy této DNA a farmaceutická kompozice obsahující virový vektor - Google Patents

Abstract

Resení se týká virových vektoru, obsahujících molekulu kruhové a replikativní DNA, které jsou uzitecné pro genovou terapii. Dále se týká zpusobu in vitro prípravy molekul replikativní kruhové DNA a farmaceutického prípravku, který obsahuje virový vektor nebo bunky modifikované pomocí virového vektoru.

Description

Předložený vynález se týká molekul kruhové a replikativní DNA použitelné v genové terapii. Vynález také popisuje metodu účinnou zejména pro jejich tvorbu in šitu od odpovídajícího virového vektoru.

Dosavadní stav techniky

Genová terapie spočívá v opravě snížení schopnosti nebo anomálie (mutace, aberantní exprese atd.) vložením genetické informace do buňky nebo do postiženého orgánu.

Tato informace může být vložena, buď in vitro do buněčného extraktu orgánu a potom modifikovaná buňka může být znovu vložena do organizmu, nebo informace může být vložena in vivo přímo do postižené tkáně. V druhém případě byly vytvořeny různé techniky transfekce zahrnující vektory různého původu. Jedná se zejména o chemické vektory nebo/a biochemické, přírodní nebo syntetické na jedné straně nebo vektory virové na straně druhé. Co se týče virových vektorů, mohou se uvést komplexy DNA a DEAE-dextranu (Pagano et al., J. Virol. (1967) 891), DNA a nukleových proteinů (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), DNA a lipidy (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), lipozomy (Fraley et al., J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431), atd. Jejich použití zahrnuje zejména možnost produkovat významné množství farmaceuticky čisté DNA.

Virové vektory (retrovirus, adenovirus, virus adenoassociated,...) jsou velmi účinné ve srovnání s již dříve popsanými chemickými nebo/a biochemickými vektory zejména, co se týče přechodu přes membrány. Mezi těmito viry mají zejména adenoviry významné vlastnosti pro použití v genové terapii. Mají dost široké hostitelské spektrum a jsou schopné transdukovat buňky ve fázi dělení a genom adenoviru ve formě extrachromozomální a nebyly spoj ovány s významnými patologiemi u lidí. Zato použití retrovirů, jejichž genom se začleňuje náhodně do genomu infikované buňky je omezeno buňkami ve fázi dělení. Adenoviry byly také použity pro přenos genů zájmu do svalových buněk (svalové buňky; Ragot et al., Nátuře 361 (1993) 647), hepatických (Jaffe et al., Nátuře genetics 1 (1992) 372), nervových (Akli et al., Nátuře genetics 3 (1993) 224), epitelové bronchiální (Rosenfeld et al., 1992), atd. Avšak v rychle obnovené tkáni byla pozorována postupná ztráta exprese transgenu vlivem ředění v průběhu buněčného dělení.

Zlepšení adenovirových vektorů a vývoj nových generací vektorů vedlo ke snížení potencionálního nebezpečí zbytkové patogenní schopnosti stejně jako imunogenní schopnosti spojené s replikací vektoru, rekombinací jeho genomu a expresí virových proteinů.

Aby se co nejvíce předešlo těmto nebezpečím, byly modifikovány navržené konstrukce virových vektorů tak, aby postrádaly výše uvedené vektory neschopné se replikovat autonomně v cílové buňce. Oni jsou takzvané defektní. Genom defektního viru je tedy alespoň zbaven sekvencí nezbytných pro replikaci výše uvedeného viru v infikované buňce. Také v tomto případě adenovirů odborníky popsané konstrukce jsou adenoviry deletované v oblastech Ela případně E3 na úrovni, do které jsou vloženy sekvence heterologní DNA (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; GoshChoudhury et al., Gene 50 (1986) 161). Jiné konstrukce obsahují deleci na úrovni oblasti El a deleci nepodstatné části oblasti E4 (WO94/12649) nebo modifikované genomické organizace (FR94 13355).

Nicméně zůstává, během produkce defektních virových vektorů, nebezpečí rekombinací, které vytvářejí virové replikativní částice nebo transkomplementární in vivo buněčnými funkcemi typu

El. Je jasné, že použití takto kontaminovaných vektorů v genové terapii může mít velmi neblahé

-1 CZ 296600 B6 následky, jako například vyvolávají virové propagace a vyvolání nekontrolovaného roznášení s nebezpečím zánětlivé reakce a imunitní odpovědi řízené proti virovým proteinům atd

Zvýšení stability exprese transgenu v transdukovaných buňkách adenovirovým vektorem, zejména v buňkách ve fázi dělení zbývá důležitý problém. V genové terapii zůstává nyní reálná potřeba transportních vektorů, které mají výhody dříve popsaných vektorů, totiž dobré transfekční vlastnosti například vlastnosti virových vektorů a zejména vlastnosti adenovirů a úplná neškodnost se projevuje, zejména nepřítomností generace replikativních virových částic in vivo, nebezpečí neexistující s plazmidy nebo nevirovými vektory.

Podstata vynálezu

Předložený vynález spočívá zejména v vytvoření in šitu přes virový vektor, molekul kruhové, replikativní a terapeutické DNA, výhodné z hlediska stability exprese transgenu a neškodnosti. Jsou zbaveny každé sekvence virového genomu schopného indukovat imunitní odpověď zánětlivého typu, stejně jako specifickou odpověď řízenou proti virovým proteinům, které mohou mít zhoubný účinek na organizmus a mohou omezit délku exprese transgenu.

Předložený vynález má tedy jako předmět molekuly kruhové a replikativní DNA, které obsahují alespoň:

(i) jeden nebo více genů zájmu se sekvencemi nezbytnými pro jejich replikaci, (ii) počátek replikace funkční v savčích buňkách a (iii) výslednou sekvenci regiospecifické rekombinace mezi dvěma sekvencemi rekombinasou.

Předložený vynález spočívá především v upřesnění metody a specifických konstrukcí účinných zejména pro tvorbu molekul terapeutické DNA. Postup podle vynálezu spočívá ve vytvoření molekul terapeutické DNA již dříve definovaných od virového vektoru.

Předkladatel neočekávaně prokázal, že je možné vytvořit in šitu od virového vektoru a regioselektivní rekombinací molekulu kruhové DNA terapeutického a replikativního charakteru. Ve výhodném způsobu provedení transgen a počátek replikace nejsou aktivní ve virovém vektoru, jejich aktivita je závislá na výsledku regioselektivní rekombinace. Ještě výhodněji výsledek rekombinace je vyvolán podmínečně expresí rekombinasy, což nabízí vysokou úroveň řízení na exprese genu zájmu a replikaci epizomálních molekul produktů.

Takovýto protokol je zejména výhodný z terapeutického hlediska:

- vybírá část dobrých transfekčních schopností vyjádřených všeobecně virovými vektory srovnatelnými s nevirovými vektory,

- výrazně snižuje nebezpečí virové kontaminace, místní zánětlivé reakce stejně jako antivirovou imunitní odpověď, což je přičítáno slabému množství prokázaných virových vektorů. Virový vektor je vložen jen v nezbytném množství pro vytvoření molekuly terapeutické DNA,

- umožňuje rozšířit aplikační oblast určitých virových vektorů: adenovirové vektory jsou limitovanými aplikacemi v proliferativních buňkách takových, jako jsou buňky kmene hematopoetického. Předložený vynález umožňuje využít jejich infekční schopnost pro vytvoření stabilní kruhové replikativní molekuly v proliferativních buňkách.

Molekula DNA taková, jaká je nárokovaná, má tedy schopnost účinně zajistit přenos do buněk nebo do terapeutického genu nebo terapeutických genů, které obsahuje.

-2CZ 296600 B6

Proto obsahuje počátek replikace vyznačený zejména tím, že je funkční v savčích a lidských buňkách. Použitý počátek replikace je výhodně podmínečný počátek replikace, totiž počátek replikace, jehož aktivita může být řízena. Počátek replikace je ještě výhodněji rozložen takovým způsobem, že je inaktivní ve virovém vektoru a aktivní po regiospecifícké rekombinaci.

Použitý počátek replikace je výhodně původu eukaryontního, virového nebo savčího.

Upřednostňovaný příklad počátku replikace schopný uvedení v rámci předloženého vynálezu je zejména počátek replikace viru Epstein-Barrové (EBV). Virus EBV patří k rodině Herpesviridae. Jeho počátek replikace obsahuje dva elementy: sekvenci oriP (l,7kb) odpovědnou za replikaci, jejíž aktivita je indukovaná proteinem kódovaným genem EBNA1. Tato sekvence může být nesena v trans. Tyto elementy umožňují v nich samotných zároveň replikaci, epizomální chování a segregaci 5 až 20 kopií na buňku plazmidového vektoru. Sekvence oriP je tvořena opakováním dvaceti motivů o 30bp, oddělených 960bp počátkem replikace, která je tvořena motivem obrácené repetice 65bp a obsahuje 4 úplné kopie motivu 30bp. Protein EBNA1 se fixuje na motivy 30bp na úrovni počátku replikace a umožňuje získání buněčných faktorů v momentě fáze S a replikaci, synchronní k buněčnému dělení plazmidu, který má sekvenci oriP v cis. Zejména EBNA1 pravděpodobně současnou fixací na úrovni opakovaných motivů a chromozomálních struktur umožňuje intracelulární vlastnosti a segregaci epizomu v momentě buněčného dělení. Plazmidy obsahující počátek replikace oriP genomu EBV a umožňující expresi virového proteinu EBNA1 (641 aminokyselin) jsou uchovávány stabilně epizomálně v lidských transfektovaných buňkách a jejich replikace je synchronní s buněčným dělením (Lupton et Levine, 1985).

Počátek replikace může být také odvozen od papilomviru. Papilomviry používají systém virové latence se zachováváním epizomu genomu analogickému viru Epstein-Barrové (EBV). Tento systém byl zejména studován pro hovězí papilomvirus typu 1 (BPV-1). Počátek replikace BPV je aktivní v přítomnosti proteinů El a E2. Jako v případě EBV episomální chování je nezávislé na replikaci a je zajištěno fixací E2 na úrovni sekvence MME (minichromosome maintenance element), ale vyžaduje také přítomnost El. Zato naopak v rozporu se systémem oriP/EBNAl EBV replikace epizomu není synchronní s buněčným dělením (Piirsoo et al., 1996).

Počátek replikace může být také tvořen sekvencemi schopnými autonomní replikace nebo ARS (autonomously replicating sequences). ARS byly izolovány od savčích chromozomů zejména lidských a myších. Může se uvést zejména sekvence ARS umístěna proti směru lokusu c-myc u lidí (Ariga et al., 1988) a fragment 4kb lokusu genu adenosideaminasy myši (Virta-Pearlman et al., 1993).

Co se týče genu zájmu může se jednat o terapeutický, vakcinální, agronomický nebo veterinární gen. Obsahuje také oblast promotoru transkripce funkční v buňce nebo v cílovém organizmu, stejně jako oblast umístěná na 3 'konci, specifikuje terminační signál transkripce a polyadenilace. Co se týče oblasti promotoru může se jednat o oblast promotoru přirozeně odpovědnou za expresi požadovaného genu, když tato je schopná fungovat v buňce nebo určitém organizmu. Může se také jednat o oblasti různého původu (odpovědných za expresi jiných proteinů nebo stejných syntetických). Zejména se může jednat o sekvence promotorů eukaryontních genů nebo virových genů. Například se může jednat o sekvence promotorů vzniklých z genomu cílové buňky. Mezi množinou eukaryontních promotorů se může použít každý promotor nebo odvozená sekvence stimulující nebo potlačující transkripci genu specificky nebo nespecificky, induktivně nebo neinduktivně, silně nebo slabě. Může se zejména jednat o ubikvitinové promotory (promotor genů HPRT, PGK, α-aktin, tubulin atd.) promotorů středních filament (promotor genů GFAP, desmin vimentin, neurofilamenty, keratin atd.) promotorů terapeutických genů (například promotory genů MDR, CFTR, faktor VIII, ApoAI atd.) specifické tkáňové promotory (promotor genu pyruvát-kinasy, vilinu, vazebný střevní protein mastných kyselin, α-aktin hladkého svalstva atd.) nebo také promotory odpovídající stimulům (receptor steroidních hormonů, receptor kyseliny retinové atd.). Stejně tak se může jednat o sekvence promotorů pocházející z genomu virů

-3CZ 296600 B6 takových, jako jsou například promotory genů El A a MLP adenovirů, raný promotor CMV nebo také promotor LTR RSA atd. Mimoto tyto oblasti promotorů mohou být modifikovány adici aktivačních sekvencí, regulačních nebo sekvencí umožňujících expresi tkáňově specifickou nebo majoritní. Jinak gen zájmu může také obsahovat signální sekvenci řídící syntetický produkt v sekrečních cestách cílové buňky. Tato signální sekvence může být přírodní signální sekvencí syntetického produktu, ale může se také jednat o každou jinou funkční signální sekvenci nebo umělou signální sekvenci.

Výhodně se používá promotor virového původu vybraný mezi raným promotorem CMV nebo LRT retroviru nebo savčím promotorem.

Mimo počátek replikace a gen zájmu molekuly DNA podle vynálezu obsahují oblast, která je výsledkem specifické rekombinace mezi dvěma sekvencemi. Tato regioselektivní rekombinace může být získána od různých systémů, které mají za následek regiospecifickou rekombinaci mezi sekvencemi.

Systém specifické rekombinace uvedený v rámci předloženého vynálezu z pohledu tvorby in šitu nárokované molekuly DNA může být různého původu. Specifické sekvence a použité rekombhasy mohou náležet k různým strukturním třídám, zejména k rodině rekombinasy bakteriofága Pl.

Použitá regiospecifická rekombinace podle postupu vynálezu je získána prostřednictvím dvou specifických sekvencí, které jsou schopné rekombinace mezi sebou v přítomnosti specifického proteinu, všeobecně označeného jako rekombinasa. To je z tohoto důvodu, že molekuly kruhové DNA podle vynálezu obsahují mimo jiné sekvence vzniklé touto regioselektivní rekombinaci. Sekvence umožňující rekombinaci použité v rámci předloženého vynálezu obsahují všeobecně od 5 do 100 párů bází, zejména méně než 5 0 párů bází.

Mezi rekombinasy patřící k rodině intergras bakteriofága 1 se může uvést zejména integrasa fága lambda (Landy et al., Science 197 (1977) 1147), P22 a F8O (Leong et al., J. Biol. Chem. 260 (1985) 4468), HP1 Haemophilus influenzae (Hauser et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 6859), integrasa Cre fágu Pl, integrasa plazmidu pSAM2 (EP 350 341) nebo také FLP rekombinasa plazmidu 2m kvasinky Saccharomyces cerevisiae. Když molekuly DNA podle vynálezu jsou připraveny rekombinaci prostřednictvím regiospecifického systému rodiny integrasy bakteriofága lambda, molekuly DNA podle vynálezu obsahují všeobecně mimo jiné sekvenci, která je výsledkem rekombinace mezi dvěma sekvencemi att bakteriofága nebo odpovídajícího plazmidu.

Mezi rekombinasami patřícími do rodiny transpozomu Tn3 se může uvést zejména resolvasa transpozomu Tn3 nebo transpozomy gd. Tn21 a Tn522 (Stark et al., 1992); invertasa Gin bakteriofága mu nebo také resolvasa plazmidů takových, jako resolvasa fragmentu par RP4 (Abert et al., Mol. Microbiol. 12 (1994) 131). Když jsou připraveny molekuly DNA podle vynálezu prostřednictvím regiospecifického systému rodiny transpozonu Tn3, molekuly DNA podle vynálezu všeobecně obsahují mimo jiné sekvenci, která je výsledkem rekombinace mezi dvěma rozpoznávacími sekvencemi resolvasy požadovaného transpozonu.

Podle upřednostňovaného způsobu provedení vynálezu v genetických konstrukcích předloženého vynálezu sekvence umožňující regiospecifickou rekombinaci jsou odvozeny od bakteriofágu. Může se zejména jednat o sekvence att (sekvence attP a attB) bakteriofágu nebo o odvozené sekvence. Tyto sekvence jsou schopné se stereospecificky rekombinovat mezi sebou v přítomnosti rekombinasy označené integrasa. Termín odvozená sekvence zahrnuje sekvence získané modifikacemi či modifikacemi sekvencí att bakteriofágů, které zachovávají schopnost se specificky rekombinovat v přítomnosti vhodné rekombinasy. Může se také jednat o omezené fragmenty těchto sekvencí nebo naopak o rozsáhlé fragmenty adicí jiných sekvencí (restrikční místa atd.). Může se také jednat o varianty získané mutací či mutacemi, zejména mutací či mutacemi bodovými. Podle vynálezu se označuje sekvencemi attP a attB bakteriofágu nebo plazmidu sek-4CZ 296600 B6 vence systému specifické rekombinace uvedeného bakteriofágu nebo plazmidu, totiž sekvence attP přítomné v uvedeném fágu nebo plazmidu a odpovídající chromozomální sekvenci attB.

Jako upřednostňovaný příklad se mohou zejména uvést sekvence att fágu lambda. P22, F8O, Pl, HP1 Haemophilus influenzae nebo také plazmidu pSAM2 nebo 2 m.

Podle upřednostňovaného způsobu provedení vynálezu sekvence umožňující regiospecifickou rekombinaci jsou odvozeny od systému rekombinace fágu Pl. Tento fág Pl má rekombinasu nazvanou Cre, která specificky rozpozná nukleotidovou sekvenci o 34 párech bází nazvanou loxP. Tato sekvence je tvořena dvěma palindronovými sekvencemi 13pb oddělenými zachovanou sekvencí 8pb.

Ve speciální variantě se vynález týká tedy molekuly kruhové a replikativní DNA obsahující (a) sekvenci vzniklou z regiospecifické rekombinace mezi dvěma oblastmi loxP bakteriofága Pl, gen zájmu a počátek replikace funkční v savčích buňkách a lidských, která podle upřednostňovaného způsobu má podmínečný účinek.

V tomto ohledu se přeložený vynález týká také genetických konstrukcí zvláště vhodných pro produkci molekul terapeutické DNA, již dříve definovaných. Tyto genetické konstrukce nebo rekombinantní DNA podle vynálezu obsahují zejména gen nebo geny zájmu, počátek replikace a gen proteinu EBNA1 lemovaný dvěma sekvencemi umožňujícími regispecifickou rekombinaci umístěnou v přímé orientaci. Tyto sekvence mohou být klonovány ve formě kazet v bakteriálních plazmidech. Plazmidová DNA může být nejprve transfektovaná v lidských buňkách, aby byla testována účinnost těchto sekvencí. Tyto kazety jsou potom použity pro konstrukcí virových vektorů, které mají tyto stejné sekvence začleněné do svého genomu.

Jak je již naznačeno, jiný pohled předloženého vynálezu spočívá v postupu tvorby molekul terapeutických DNA in šitu již dříve definovaných od virového vektoru regioselektivní rekombinaci. Použití takového vektoru výhodně umožňuje optimalizovat podávání nárokované molekuly DNA do buňky určené k ošetření.

V tomto ohledu předložený vynález má také za předmět virový vektor obsahující, vloženou ve svém genomu, oblast DNA lemovanou dvěma sekvencemi, které umožňují regiospecifickou rekombinaci, umístěnými v přímé orientaci, výše uvedenou oblast DNA obsahující alespoň počátek replikace a gen zájmu.

Podle upřednostněného způsobu provedení vynálezu počátek replikace, stejně jako gen zájmu začleněný do virového vektoru, jsou přítomny v inaktivní formě, promotor je klonován v přímé orientaci k jednomu z konců kazety exprese (Obrázek 1). Po rekombinaci mezi dvěma místy LoxP promotor se nachází před genem zájmu a oddělený od tohoto genu místem LoxP, prvni ATG transkriptu odpovídá iniciačnímu kodonu transgenu. Sekvence oriP je aktivní jen v přítomnosti proteinu EBNA1 je exprimovaná pod řízením stejného promotoru jako transgen ve mediátorové bicistronické formě. Translace je iniciována interním iniciačním mechanizmem na úrovni sekvence IRES odvozené od viru encefalomyokardidu (ECMV) rodiny pikomavirus. Exprese transgenu a proteinuEBNAl stejně jako replikace plazmidu jsou tedy přímo podmíněné výsledkem rekombinace mezi dvěma místy LoxP.

Podle jiné varianty vynálezu oblast enkapsidace viru je zahrnuta do replikonu (oblast DNA lemovaná sekvencemi, které umožňují regiospecifickou rekombinaci). Tento způsob provedení nabízí dodatečnou bezpečnost systému, jak je vysvětleno dále.

Použitý virový vektor může být různého původu, když je schopný transdukovat zvířecí buňky, přednostně lidské buňky. V upřednostňovaném způsobu provedení vynálezu se používají vektory odvozené od adenovirů, viru adeno-associated (AAV), viru herpes (HSV) nebo retroviru. Je pře-5CZ 296600 B6 devším výhodné použít adenovirus pro přímé podávání nebo pro modifikaci ex vivo určených buněk a potom být implantován nebo použít retrovirus pro implantaci produkovaných buněk.

Viry podle vynálezu jsou defektní totiž jsou neschopné se replikovat autonomním způsobem v cílové buňce. Genom defektního viru použitého v rámci předloženého vynálezu je tedy zbaven alespoň sekvencí nezbytných pro replikaci výše uvedeného viru v infikované buňce. Tyto oblasti mohou být buď vyloučeny (úplně nebo částečně), nebo mohou být zbaveny funkčnosti substituci jiných sekvencí, zejména heterologní nukleovou sekvencí zájmu. Defektní virus nicméně zachovává sekvence svého genomu, které jsou nezbytné pro enkapsidaci virových částic.

Co se týče zejména adenoviru, v rámci předloženého vynálezu se přednostně používá lidský adenovirus typu 2 nebo 5 (Ad2 nebo Ad5) nebo adenovirus zvířecího původu (viz WO94/26914). Mezi adenoviry zvířecího původu použitelnými v rámci předloženého vynálezu se mohou uvést adenoviry psího, hovězího, myšího původu (například: Mávl, Beart et al., Virology 75 (1990) 81), ovčího, prasečího, ptačího nebo opičího původu (například: SAV).

Virové vektory podle vynálezu jsou defektní adenoviry obsahující, vloženou do svého genomu, genetickou sekvenci obsahující alespoň počátek replikace a gen zájmu a lemovanou dvěma sekvencemi umístěnými v přímé orientaci. Toto umožňuje indukovat podmínečnou aktivitu počátku replikace a transgenu vzájemnou regiospecifíckou rekombinací závislou na přítomnosti rekombinasy.

Výhodně je v genomu těchto adenovirů podle vynálezu alespoň oblast El zbavena funkčnosti. Zejména gen El a alespoň jeden z genů E2, E4, L1-L5 je nefunkční. Mohou být také modifikovány další oblasti, zejména oblast E3 (WO95/02697), E2 (WO94/28938), E4 (WO94/28152, WO94/12649, WO95/02697) a L5 (WO95/02697).

Podle upřednostňovaného způsobu adenovirus podle vynálezu obsahuje deleci v oblasti El a E4 a oblast DNA lemovanou dvěma sekvencemi umožňujícími regiospecifíckou rekombinací vloženou na úrovni oblasti neaktivní El. Podle jiného upřednostňovaného způsobu provedení adenovirus obsahuje deleci v oblastech El a E4 a oblast DNA lemovanou dvěma sekvencemi umožňujícími regiospecifíckou rekombinací vloženou na úrovni oblasti neaktivní E4. Jak je již naznačeno, podle způsobu provedení vynálezu adenovirus obsahuje také kazetu exprese genu rekombinasy.

Nárokované vektory jsou získány rekombinací s plazmidy takovými, jaké jsou dříve definovány, totiž charakterizovány tím, že obsahují mezi dvěma oblastmi regiospecifické rekombinace alespoň počátek replikace a gen zájmu podmínečné aktivity.

Co se týče zejména definice počátku replikace, dvou sekvencí umožňujících regiospecifíckou rekombinací a genu zájmu přítomných v oblasti DNA integrované do virového nárokovaného vektoru bude se odvolávat na přesné definice.

Defektní rekombinantní adenoviry podle vynálezu mohou být připraveny všemi odborníky známými technikami (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573, Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). Mohou být připraveny homologní rekombinací mezi adenovirem a plazmidem nesoucím mezi jiným sekvence DNA podle vynálezu nebo konstrukcí virového genomu u E. coli. Homologní rekombinace se provádí po společné transfekci výše uvedeného adenoviru a plazmidu ve vhodné buněčné linii. Použitá buněčná linie musí přednostně (i) být transformovatelná výše uvedenými elementy a (ii) obsahovat sekvence schopné doplnit část genomu defektního adenoviru přednostně ve formě integrované pro vyhnutí se nebezpečí rekombinace. Jako příklad linie se může uvést ledvinová linie lidského embrya 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), která obsahuje, začleněnou ve svém genomu, levou část genomu adenoviru Ad5 (12 %) nebo linie schopné doplnit funkce El a E4 tak, jak je popsáno zejména v přihláškách vynálezů WO94/26914 a WO95/02697.

-6CZ 296600 B6

Adenoviry, které jsou rozmnoženy, jsou získány a purifíkovány podle klasických technik molekulární biologie, jak je naznačeno v příkladech.

Co se týče viru adeno-associated (AAV), jedná se o virus DNA relativně malé velikosti, který se začleňuje do genomu buněk, které infikuje stabilně a stereospecificky. Tyto viry jsou schopné infikovat široké spektrum buněk bez vyvolání účinku na růst, morfologii nebo buněčné dělení. Nezdá se, že jsou zahrnuty do patologií u člověka. Genom viru AAV byl klonován, sekvenován a charakterizován. Obsahuje okolo 4700 bází a obsahuje na každém konci oblast obrácené repetice (ITR) se 145 bázemi, sloužící jako počátek replikace pro virus. Zbytek genomu je rozdělen na dvě základní oblasti nesoucí enkapsidační funkce: na levou část genomu, která obsahuje gen rep zahrnutý do virové replikace a exprese virových genů; a na pravou část genomu, která obsahuje gen cap, který kóduje kapsidové proteiny viru.

Použití vektorů odvozených od AAV pro přenos genů in vitro a in vivo bylo popsáno v literatuře (viz zejména WO 91/18088; WO 93/09239; US 4 797 368, US 5 139 941, EP 488 528). Tyto přihlášky vynálezů popisují různé konstrukce odvozené od AAV, ve kterých geny rep nebo/a cap jsou deletovány a nahrazeny genem zájmu a popisují jejich použití pro přenos in vitro (na buněčné kultuře) nebo in vivo (přímo do organizmu) výše uvedeného genu zájmu. Defektní rekombinantní AAV podle vynálezu mohou být připraveny společnou transfekci v infikované buněčné linii pomocným humánním virem (například adenovirem) plazmidu obsahujícího kazetu exprese podle vynálezu lemovanou dvěma oblastmi obrácené repetice (ITR) AAV a plazmidu, který nese geny enkapsidace (geny rep a cap) AAV. Rekombinantní produkty AAV jsou potom purifíkovány klasickými technikami.

Co se týče viru herpes a retrovirů, byla široce popsána konstrukce rekombinantních vektorů v literatuře: viz zejména Breakfíeld et al., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242, EPI78220, Bemstein et al., Genet. Eng. 7 (1995) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689 atd.

Retroviry jsou integrativní viry, které selektivně infikují buňky ve fázi buněčného dělení. Tvoří tedy vektory zájmu pro rakovinové aplikace. Genom retrovirů obsahuje zejména dvě LTR, sekvenci enkapsidace a tři kódující oblasti (gag, pol a env). V rekombinantních vektorech odvozených od retrovirů jsou všeobecně deletovány geny gag, pol a env úplně nebo částečně a nahrazeny sekvencí heterologní nukleové kyseliny zájmu. Tyto vektory mohou být uskutečněny od různých typů retrovirů zejména MOMuLV („murine moloney leukemia virus“, také označený MOMLV), MSV („murine moloney sarcoma virus“), HaSV („harvey sarcoma virus“), SNV („spleen necrosis virus“), RSV („rouš sarcoma virus“) nebo také Friendova viru.

Pro konstrukci rekombinantních retrovirů podle vynálezu byl konstruován plazmid obsahující zejména LTR, sekvenci enkapsidace a sekvence vynálezu, potom použit pro transfekci buněčné linie řečené enkapsidační schopné nést v trans retrovirální deficientní funkce v plazmidu. Linie enkapsidace jsou tedy schopné exprimovat geny gag, pol a env. Takovéto enkapsidační linie byly popsány ve vedlejších oborech zejména linie PA317 (US 4 861 719); linie PsiCRIP (WO 90/02806) a linie GP+envAm-12 (WOB9/07150). Rekombinantní retroviry mohou obsahovat modifikace na úrovni LTR pro potlačení transkripční aktivity stejně jako rozsáhlé sekvence enkapsidace zahrnující část genu gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). Produkty rekombinantních retrovirů jsou potom purifíkovány klasickými technikami.

Jako příklad upřednostňovaného vektoru podle vynálezu se mohou navrhnout adenoviry obsahující ve svém genomu oblast DNA shodnou s vynálezem a lemovanou sekvencemi obrácené repetice bakteriofága Pl (Oblast loxP) umístěnou v přímé orientaci.

-7CZ 296600 B6

Jako příklad tohoto typu vektorů se může zejména uvést následující konstrukce s genem Pgalactosidasy (LacZ) nebo s genu thymidinkinasy viru Herpes (TK), (Obrázek 1). Gen zájmu může být každý gen (cDNA, gDNA, RNA, syntetická nukleová kyselina nebo semi-syntetická nukleová kyselina) kódující RNA nebo terapeutický nebo vakcinační protein takový jako enzymy, krevní deriváty, hormony, lymfokyny: interleukiny, interferony. TNF, atd. (FR 9203120), růstové faktory, neuronosiče nebo jejich prekurzory nebo enzymy syntézy, trofícké faktory: BDNF, CNTF, NFG, IGF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, atd.; apolipoproteiny: ApoAI, ApoAIV, ApoE, atd. (FR 93 05125), distrofín nebo minidistrofin (FR 9111947) supresorové geny tumorů: p53, Rb. RaplA, DCC, k-rev, atd. (FR 93 04745), geny kódující faktory zahrnuté do koagulace: Faktory VII, VIII, IX atd. nebo také celek nebo část přírodního nebo umělého imunoglobulinu (Fab, ScFv atd.), ligand RNA (WO91/19813) atd.

Gen zájmu může také být antisensovou sekvencí, jejíž exprese v cílové buňce umožňuje řídit expresi genů nebo transkripci buněčné mRNA. Takovéto sekvence mohou například být transkriptovány v cílové buňce v RNA komplementární buněčné mRNA a tak blokovat jejich translaci v proteinu podle technik popsaných v EP 140 308.

Vektory podle vynálezu jsou zejména přizpůsobeny expresi sekvencí kódujících toxické faktory. Může se zejména jednat o buněčné jedy (toxin difterický, toxin pseudomonas, ricin A atd.) produktu indukujících citlivost k externím činitelům (sebevražedné geny: Thymidinkinasa, cytosindesaminasa atd.) nebo také k vražedným genům schopným indukovat buněčnou smrt (Grb3-3 (PCT/FR94/00542), ScFv anti-ras (WO94/29446), atd.). Systém vynálezu umožňuje produkci zejména virových vektorů obsahujících tyto sekvence bez toxicity pro produkci buněk potom také umožňuje selektivně indukovat expresi těchto toxických molekul v cílových buňkách po regiospecifické rekombinaci. Tento typ konstrukce je tedy zejména přizpůsobený strategiím antitumorální terapie například strategiím, ve kterých je cílem selektivně zničit zasažené buňky. Tento systém je zejména zajímavý pro expresi cytokinů, interferonů. TNF nebo TGF, jejichž neřízená produkce může mít velmi viditelný sekundární účinek.

Předložený vynález se také týká každé eukaryontní buňky transfektované alespoň virovým vektorem nebo molekulou DNA podle vynálezu takovou, jaká je již definovaná.

Jiný předmět vynálezu spočívá v postupu produkce molekuly DNA takové, jaká je již definovaná podle kterého hostitelská buněčná kultura obsahující virový vektor podle vynálezu je uvedena do kontaktu s rekombinasou umožňující indukovat regiospecifickou rekombinaci.

Předložený vynález se týká každého postupu přípravy vyznačeného tím, že uplatňuje:

(i) modifikované hostitelské buňky obsahující alespoň virový vektor, uvedený vektor obsahující ve svém genomu alespoň oblast DNA lemovanou dvěma sekvencemi umožňujícími regiospecifickou rekombinaci a umístěnými v přímé orientaci, uvedenou oblast obsahující alespoň počátek replikace a gen zájmu a (ii) rekombinasu umožňující indukovat in sítu regiospecifickou rekombinaci, z pohledu tvorby uvedených molekul kruhové a replikativní DNA.

V rámci předloženého vynálezu byly navrženy různé postupy pro uskutečnění uvedení v kontakt virový vektor se specifickou rekombinasou. Tento kontakt může být zejména proveden na úrovni hostitelské buňky společnou transfekci s plazmidem nebo společnou transfekci s virovým vektorem obsahujícím gen výše uvedené rekombinasy; a to indukcí exprese genu kódujícího uvedené rekombinasy přímo přítomné v genomu výše uvedené hostitelské buňky. Gen kódující rekombinasu může tedy být přítomný v hostitelské buňce v integrované formě genomu na plazmidů nebo také na vedlejším virovém vektoru například typu adenoviru. V tomto případě virový vektor uplatněný pro vytvoření molekuly DNA podle vynálezu je použit takový, jaký je již definován.

-8CZ 296600 B6

Podle jiné metody je kazeta exprese genu nesena na virovém vektoru také odpovědná za expresi genu zájmu.

Zejména v tomto případě postup podle vynálezu uplatňuje virový vektor, obsahující ve svém genomu, mimo oblasti DNA vymezené dvěma sekvencemi kódujícími místa specifické rekombinace a obsahující alespoň počátek replikace a gen zájmu kazetu exprese genu rekombinasy.

Takovýto vektor představuje jiný předmět předloženého vynálezu.

V tomto ohledu podle zvláštní varianty předložený vynález se týká adenoviru obsahujícího první deleci v oblasti El, do které je vložen replikon (oblast DNA lemovaná dvěma sekvencemi regiospecifické rekombinace) a deleci realizovanou v E4 nebo/a v E3 na úrovni, ve které je vložena kazeta exprese proteinu rekombinasy.

Replikon může být vložen do deletované části odpovídající oblasti E3 nebo E4, zatímco kazeta exprese rekombinasy je vložena na úrovni deletované oblasti El.

Podle jiné varianty replikon, stejně jako kazeta exprese rekombinasy, je vložen na úrovni defektní oblasti El.

Jak je již dříve naznačeno, sekvence umožňující regiospecifickou rekombinaci jsou sekvence LoxP a rekombinasa je protein Cre, jehož způsob působení na uvedené sekvence rekombinace byl již výše popsán.

Podle upřednostňovaného způsobu provedení bude žádoucí, aby se mohla řídit a zejména indukovat exprese této rekombinasy uvnitř hostitelské buňky. V rámci předloženého vynálezu bylo výhodně navrženo řízení exprese genu kódujícího rekombinasu. Pro toto provedení bylo navrženo umístěni exprese uvedeného genu pod kontrolou regulačního elementu. Může se zejména jednat o indukovatelný promotor umožňující řízení úrovni nebo/a period exprese tohoto genu, například se může jednat o promotor LTR MMTV (Pharmacia), který je indukovaný dexamethasonem nebo promotor indukovaný tetracyklinem (WO94/29442; WO94/04672). Je pochopitelné, že mohou být použity i další promotory, zejména varianty LTR MMTV, které nesou například heterologní oblasti regulace (zejména oblasti „enhancer“).

V jiném způsobu provedení exprese genu, který kóduje rekombinasu je pod řízením promotorů, aby se zamezilo buď konstitutivní akumulaci uvedeného proteinu v hostitelské buňce, nebo „unikání“ skrz buněčnou stěnu a jisté toxicitě. Mohou také být jimi spojeny elementy, které fungují jako oblasti transaktivace transkripce. Jako příklad tohoto typu elementů se mohou uvést receptory hormonů receptory steroidů, kyselinu retinovou a thyroidy, mezi kterými lze uvést zejména glukokortikoidy, mineralokortikoidy, thyroidy, oestragen, aldosteron a kyselinu retinovou. Tento typ konstrukcí mezi rekombinasou Cre a vazebnou oblastí DNA receptoru glukokortikoidu byl popsán například v Feil et al., (PNAS 93 (1996) 10887).

Možnost regulovat expresi rekombinasy je zejména důležitá v případě vektorů podle vynálezu nesoucích zároveň replikon a kazetu exprese rekombinasy. Vskutku v tomto způsobu provedení jestliže je rekombinasa exprimována například když během produkce virových vektorů, bude replikon odstraněn z virového genomu před svou enkapsidací. Z tohoto důvodu je prospěšné moci uspořádat systém, ve kterém exprese proteinu rekombinasy je potlačena v buňkách virové produkce. Toto je zajištěno, jak je již dříve naznačeno, za použití řízeného promotoru (typ tetracyklin nebo MMTV) nebo/a elemenu typu receptoru hormonu, který spojený s rekombinasou udržuje expresi rekombinace v extranukleárních odděleních v nepřítomnosti uvedeného hormonu (Obrázek 6 a 7). Proto v nepřítomnosti hormonu rekombinasa nemůže být účinná v přítomnosti hormonu je tedy transportovaná skrz nukleární oddělení, kde vykonává svou aktivitu.

-9CZ 296600 B6

Zajímavý přístup pro řízení exprese rekombinasy spočívá v použití fůzní rekombinasy v hormonálním receptorů (oblast vázání DNA), tedy rekombinasy neaktivní v nepřítomnosti uvedeného hormonu, potom spočívá v umístění uvedeného genu do virového vektoru takového druhu, který bude pod kontrolou promotoru replikonu. Tento způsob provedení je vyjádřený například na

Obrázku 6b.

Jinak pro zvýšení bezpečnosti systému je také možné, jak je již naznačeno, vložit do replikonu oblast enkapsidace virového vektoru (Obrázek 7). To umožňuje vyhnout se nahromadění vytvořeného viru kontaminovaného vektorem, který ztratil replikon. Jestliže navzdory systému regulace, připomenuté dále, exprese aktivní rekombinasy působí v průběhu produkce viru, bude pohánět vyjmutí replikonu z virového genomu, a tak generace virových genomů se zbaví replikonu. Jestliže oblast enkapsidace viru je nesena uvedeným replikonem, virové genomy takto vytvořené nebudou enkapsidovány. Samotné virové genomy nesoucí zároveň replikon a kazetu exprese rekombinasy mohou být enkapsidovány.

Předložený vynález má také za předmět farmaceutické kompozice obsahující alespoň jeden virový vektor podle vynálezu nebo transfektovanou buňku podle vynálezu. Farmaceutické kompozice podle vynálezu mohou být formulovány z pohledu podávání, a to orálně, parenterálně, intranasálně, intravenózně, intramuskulámě, podkožně, intaokulárně atd. Farmaceutická kompozice podle vynálezu obsahuje vhodné farmaceutické vehikulum pro injektovatelnou formu. Může se jednat zejména o roztoky solí (dihydrogenfosforečnan sodný, hydrogenfosforečnan sodný, chlorid sodný, draselný, vápenatý nebo hořečnatý atd. nebo směs těchto solí), sterilní, izotonické nebo kompozice suché zejména lyofílizované, které po přídavku, podle případu, sterilované vody nebo fyziologického séra umožňují injektovatelnou formu kompozice. Co se týče retrovirů mohou být výhodně použity přímo buňky enkapsidace nebo buňky infikované ex vivo z pohledu jejich reimplantace in vivo, případně ve formě neoorgánů (WO94/24298).

Dávka vektoru použitá pro injekci může být přizpůsobena různým parametrům, zejména použitého způsobu podávání, patologii, genu určeného k exprimování nebo také délce léčení. Všeobecně rekombinantní adenoviry podle vynálezu jsou formulovány a podávány ve formě dávek, které obsahují mezi 10⁴ a 10¹⁴ pfu/ml. Pro AAV a adenovirus může být také použita dávka 10⁶ až 10¹⁰ pf/mlu. Termín pfu („plaque forming units“) odpovídá infekční schopnosti suspenze virionů a je určena infekcí určité buněčné kultury a následným měřením po 48 hodinách počtu plaků infikovaných buněk. Techniky určení velikosti pfu virového roztoku jsou dobře popsány v odborné literatuře.

Podle genu zájmu přítomného v molekulách DNA podle vynálezu nebo oblasti integrované v genomu uvedených virových vektorů mohou být použity pro léčení nebo prevenci počtu patologií, které zahrnují genetická onemocnění (myodistrophie, mucoviscidose atd.), neurodegenerativní onemocnění (Alzheimer, Parkinson, ALS, atd.), rakoviny, patologie spojené s desorganizací koagulace nebo s dyslipoproteinémií, patologie spojené s virovou infekcí (hepatitida. AIDS atd.), nebo onemocnění v oblastech agronomických nebo veterinárních atd.

Následující obrázky a příklady blíže ilustrují vynález, aniž by však v jakémkoliv směru omezovaly jeho rozsah.

Přehled obrázků na výkresech

Tabulka 1: Původ sekvencí použitých pro konstrukci epizomu

Obrázek 1: Schéma konstrukce epizomu.

Obrázek 2: Vyjádření struktury epizomu.

-10CZ 296600 B6

Obrázek 3: Sekvence mezi promotorem (P-RSV) a kazetou exprese (TK-CITE-EBNA1) v plazmidu pLoxP-ori-TK-EBNAl (A) a v epizomu po rekombinaci (B, C a D) - SEQ ID n°3.

Obrázek 4 : Schéma etap klonování kazety LoxP-ori-TK-EBNAl

Obrázek 5: Schéma etap klonování kazety LoxP-ori-LacZ-EBNAl

Obrázek 6: Vyjádření adenovirového vektoru, který nese replikon a regulační kazetu exprese Cre: CRE_r: Cre regulační, buď na úrovni promotoru nebo fúzí, nebo těchto dvou. V (b) orientace replikonu umožňuje umístit kazetu CRT_r pod řízením promotoru přítomného v replikonu. Šedý box odpovídá místům LoxP.

Obrázek 7: Vyjádření adenovirového vektoru, který nese replikon a regulační kazetu exprese Cre, oblast virové enkapsidace Psi (Δ), která je začleněna do replikonu. Šedý box odpovídá místům LoxP.

Všeobecné techniky klonování a molekulární biologie

Klasické metody molekulární biologie takové, jako jsou odstřeďování plazmidové DNA v gradientu chloridu cesnatého/ethidiumbromidu, digesce restrikčními enzymy, elektroforéza na gelu, elektroeluce fragmentů DNA z agarosových gelů, transformace v E.coli, srážení nukleových kyselin atd. jsou popsány v odborné literatuře (Maniatis et al., 1989, Ausubel et al., 1987). Nukleotidové sekvence byly určeny metodou terminace řetězce dále v protokolu uvedenou (Ausubel et al., 1987).

Restrikční enzymy byly dodány firmou New-England Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) nebo Amersham Ltd (Amersham).

Pro ligací byly fragmenty DNA rozděleny na základě velikosti na 0,75 % agarosovém gelu nebo 8 % akrylamidovém gelu, purifikovány elektroforeticky potom elektroelucí, extrahovány fenolem, sráženy ethanolem a inkubovány v pufru 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 2 mM ATP v přítomnosti DNA-ligasy fágu T4. Oligonukleotidy chráněné v β skupinou kianoethylovou byly syntetizovány za použití fosforamidové chemie (Sinha et al., 1984, Giles 1985) automatickým syntetizátorem DNA Biosearch 8600 podle doporučení dodavatele.

Plazmidové DNA byly purifikovány následující technikou alkalické lysy (Maniatis et al., 1989).

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Popis vektoru potvrzuje vynález (Obrázek 1-3)

Obrázek 1 popisuje všeobecnou strukturu vektoru podle vynálezu, zejména oblast obsaženou mezi sekvencemi, které umožňují regiospecifíckou rekombinaci. Na Obrázku 2 je znázorněna konstrukce ještě podrobněji.

Orientace promotoru (P) a kazety exprese transgenu (TG) a proteinu EBNA1 je naznačena šipkami a umožňuje tedy expresi těchto dvou genů jen po rekombinaci v přítomnosti rekombinasy Cre. Na Obrázku 3 je uveden detail sekvencí mezi promotorem (P) a genem po rekombinaci. Na tomto Obrázku je promotor LTR viru RSV (P-RSV) a gen je gen thymidin-kinasy TK. Je zdůrazněn první ATG kyseliny mRNA, který odpovídá prvnímu ATG genu TK. Jak je naznačeno na Obrázku 1, exprese EBNA-1 je získána od polycistronického messangeru interní iniciací translace za použití sekvence IRES (Internal Ribosome Entry Sítě) také nazvané sekvence CITE („Cap Independent Translation Entry“) viru Encephalomyocardite (ECMV). Signální sekvence terminace transkripce a polyadenilace viru SV40 (pA) byla vložena na 3'konec sekvence kódující EBNA1. Sekvence oriP je umístěna mezi kazetou exprese TK-EBNA-1 a promotorem RSV. Tato

-11 CZ 296600 B6 sekvence je aktivní pro replikaci jen v přítomnosti EBNA-1, tudíž je funkční jen po rekombinaci a tvorbě epizomu.

Příklad 2: Konstrukce plazmidů LoxP-oriP-TK-EBNAl a LoxP-ori-LacZ-EBNAl

Na Obrázku 4 a 5 jsou uvedeny etapy konstrukce plazmidů, původ použitých sekvencí je uveden v Tabulce 1.

2.1 Konstrukce plazmidů LoxP-oriP-TK-EBNAl (Obrázek 4)

1. Plazmid pSLori byl digerován restrikčními enzymy Hpal a EcORI a získaný fragment 1817 bp, který odpovídá sekvenci oriP, byl klonován mezi místy Smál a EcoRI plazmidů pIC19H a předem defosforylován pro získáni plazmidů plC-ori (Obrázek 4A).

2. Plazmid pSLori byl digerován v místech HindlII a BglIII, defosforylován a fragment 1900 pb byl klonován mezi místy HindlII (174) a BamHI (208) vektoru pBS246 pro získání vektoru pLox-ori (Obrázek 4A).

3. Fragment BamHI-SalI 399bp vektoru pCEP4, který odpovídá signální sekvenci terminace transkripce a polyadenylace viru sv40 byl odstraněn dna-polymerasou podle Klenowa, potom klonován mezi místy Smál a Sáli (odstraněn dna-polymerasou podle Klenowa) vektoru pIC20r a předem defosforylován pro získání vektoru pICpA (obrázek4A).

4. Sekvence IRES obsažená mezi nukleotidy 16 a 518 vektoru pCITE-2 byla amplifíkována PCR pomocí syntetických oligonukleotidů 5 '-GGCCTCTAGACAGCTGGTTATTTTCC-3' (SEQ ID n°l) a 5 -GGCCGGATCCCATATTATCATCG-3' (SEQ ID n°2), které obsahují místa Xbal a PvuII (oligo 1) a BamHI (oligo 2) a jejich 5'konec. Získaný produkt byl digerován restrikčními enzymy Xbal a BmHI a klonován mezi místy Xbal a Pstl vektoru pCMV-EBNAl a předem defosforylován pro získání vektoru pCITE-EBNAl. Sekvence obsahuje mezi ATG 12 IRES odpovídající iniciačnímu kodonu translace a kodon šeřinu následující kodon methioninu proteinu EBNA1 byl deletován řízenou mutagenezí pomocí techniky PCR (ex-site PCR). Úplná sekvence IRES a EBNA1 získaná po PCR byla úplně sekvenována (Obrázek 4A).

5. Fragment Xbal-Pstl vektoru pCITE-EBNAl (2546 bp) byl klonován mezi místy Xbal a Pstl plazmidů pICpA a předem defosforylován pro získání vektoru pCITE-EBNAl-pA (Obrázek 4A).

6. Fragment Clal-EcoRI vektoru pCITE-EBNAl-pA (2945 bp) byl klonován ve vektoru pLoxori, částečně digerován v místě EcORI umístěného na konci ori, potom digerován Clal a defosforylován pro získání vektoru pLox-ori-CITE-EBNAl-pA (Obrázek 4B).

7. Fragment Clal-BsaWl (1270pb) vektoru pCMV-TK získaný částečnou digescí BsaWl a odstraněním místa BsaWl DNA-polymerasou podle Klenowa byl klonován mezi místy Clal a PvuII vektoru pLox-ori-CITE-EBNAl-pA pro získání vektoru pLox-ori-CITE-TK-EBNAl-pA (Obrázek 4B).

8. Fragment BamHI-SalI (600 pb) plazmidů pRSV-TK, odpovídající sekvenci promotoru LTR RSV byl klonován mezi místy BamHI a Sáli vektoru pLox-ori-CITE-TK-EBNAl-pA a předem defosforylován pro získání plazmidů pLox-ori-pRSV-TK-CITE-EBNAl-pA (Obrázek 48).

2.2 Konstrukce plazmidů pLoxP-oriP-LacZ-EBNAl (Obrázek 5)

Klony 1-6 popsané v příkladu 2.1 a vyjádřené na Obrázku 4A jsou společné pro konstrukci vektorů pLox-ori-pRSV-TK-CITE-EBNAl-pA a pLox-ori-pRSV-LacZ-CITE-EBNAl-pA.

- 12CZ 296600 B6

7. Klonování promotoru LTR RSV bylo provedeno podle bodu 7 v příkladu 2.1 (Obrázek 5).

8. Fragment BamHI-StuI (3205 pb) vektoru pRSV-Gall odpovídající genu LacZ předcházející signálu nukleární lokalizace (NSL) byl klonován mezi místy Smáli a BglII vektoru pIC20H a předem defosforylován pro získání plazmidu pICLacZ (Obrázek5).

9. Fragment Xbal-Nrul (3205 pb) vektoru pICLacZ byl klonován mezi místy Xbal a PvuII vektoru pLox-ori-pRSV-CITE-EBNAl-pA pro získání vektoru pLox-ori-pRSV-LacZ-CITE-EBNAlpA (Obrázek 5).

Příklad 3: Potvrzení systému společnou transfekcí lidských buněk (Hela-EBNAl; 143-TK-) pomocí plazmidů CMV-Cre (pBSIB5) a LoxP-oriP-TK-EBNAl nebo LoxP-oriP-LacZ-EBNAl.

3.1 Potvrzení in vitro

Buněčná linie Hela stabilně exprimující gen EBNA1 byla transfektována s plazmidem pLoxoriP-LacZ-EBNAl a plazmidem exprimujícím gen rekombinasy Cre pod řízením promotoru cytomegaloviru (pBSIB5). Účinnost rekombinace a funkce kazety exprese genu LacZ byla potvrzena aktivitou Pgalactosidasy v buňkách pozorovanou v přítomnosti rekombinasy Cre. Získané výsledky ukazují účinek tvorby replikonu pod vlivem rekombinasy Cre, prokázání aktivací exprese genu LacZ po rekombinaci mezi místy LoxP a tvorbu epizomu. Po třech týdnech kultivace kotransfektovaných buněk (pasážování jednou týdně (ředění 1:10)) bylo pozorováno zachování proporcí buněk exprimujících gen LacZ tak, že exprese LacZ zmizela v transfektovaných buňkách s kontrolním plazmidem, který nemá počátek replikace oriP, což ukazuje funkční vlastnost oriP v konstrukci.

Stejným způsobem byla kotransfektovaná buněčná linie TK- (143TK ) plazmidy LoxP-ori-TKEBNA1 a pBS185. Transfektované buňky exprimující gen TK jsou selektovány v prostředí HAT. Stabilita exprese genu TK v průběhu buněčného dělení, a tedy aktivita systému oriPEBNA1, je ověřena imunofluorescencí pomocí specifické monoklonální protilátky proteinu TK viru Herpes. Přítomnost epozomu a jeho replikace v průběhu buněčného dělení je prokázána technikou Hirt následovanou amplifikací epizomické DNA technikou PCR pomocí specifických nástrojů.

3.2 Potvrzení in vivo

Aktivita těchto konstrukcí in vivo byla testována intratumorální injekcí (elekroporace) DNA plazmidů pLoxP-ori-TK-EBNAl a pLoxP-ori-LacZ-EBNAl a pBS185 do tumorů indukovaných podkožní injekcí buněk Hela nebo Hela-EBNAl u myši. Injekce buněk předem kotransfektovaných těmito stejnými plazmidy je provedeno paralelně. Zachování transgenů (TK nebo LacZ) v tumorech transdukovány těmito konstrukcemi bylo analyzováno imunohistochemicky porovnáním s kontrolním plazmidem, který nemá počátek replikace.

Příklad 4: Analýza rekombinačního systému a epizomálního chování

4.1 Konstrukce plazmidu pCre

Plazmid pCre obsahuje gen fůzní rekombinasy Cre na 5' konci signálu nukleární lokalizace antigenu T viru SV40 a exprimovaný od promotoru thymidin-kinasy (TK) viru herpes. Byla uskutečněna podobná konstrukce nesoucí v místě promotoru TK promotor řízený tetracyklinem nebo promotor MMTV. Byla také realizována kazeta nesoucí fúzi Cre-ER.

- 13 CZ 296600 B6

4.2 Konstrukce plazmidu pRep

Plazmid replikonu (pRep) obsahující fúzi genu k phleomycinu s genem β-galaktosidasy (ZéoLacZ), oriP a raný promotor cytomegaloviru (P.CMV), bez proteinu EBNA1 byl konstruován tak, jak je dále naznačeno.

Fragment Stul-clal (1149-4553) plazmidu pRSV-Gal-IX obsahující gen LacZ a polyadenilační signál viru SV40 byl klonován mezi místy Clal a EcoRV (2029-2032) pLox-ori (Příklad 2a Obrázek 4) pro získání plazmidu pLox-ori-LacZ.

Fragment BglII-BglII pCEP4 obsahující raný promotor CMV byl klonován v místě BamHI pLoxori-LacZ pro získání pLX2.

5' konec genu LacZ v pLX2 (fragment Xbal-Clal) byl substituován fragmentem Ncol-clall plazmidu pUT651 (CAYLA, Tabulka 1). Pro ulehčení klonování tohoto fragmentu byl předem podklonován mezi místy EcpRV a clal plazmidu pIC20RpA potom digerován Xbal a clal a klonován mezi místy Xbal a Clal pLX2.

Kontrolní plazmid obsahuje stejnou strukturu jako pRep zbavený počátku replikace (OriP).

4.3 Konstrukce plazmidu pRep-EBNAl

Kazeta umožňující expresi EBNA1 od IRES ECMV byla konstruována mutagenezí řízenou od plazmidu pCITE-BNAl-pA a klonována do kyvadlového vektoru Adenoviru pAdLX2 (5-2-2) pro získání pAdLX2-EBNAl nebo pRep-EBNAl. IRES stejně jako počátek EBNA1 byl úplně sekvenován. Exprese EBNA1 od IRES byla analyzována Westem-Blotem v buňkách Hela transfektovaných pRep-EBNAl. Plazmid pCMV-EBNAl, který umožňuje konstrukci pCITEEBNAlpA byl použit jako kontrola.

4.4 Potvrzení in vivo

4.4.1 Analýza rekombinace a epizomálního chování v buňkách Hela-EBNAl

V první etapě pokusy transfekce buněk Hela, které exprimují protein EBNA1 konstitutivně (Hela-EBNAl) s pRep samotným nebo s pCre bylo ukázáno, že kotransfekce dvou plazmidů umožňuje vyjmutí replikonu a indukci exprese genu pgalactosidasy. Transfektované kontrolní buňky s plazmidem replikonu vykazují stálý šum pozadí, ale obsahující téměř zanedbatelnou aktivitu Pgalactosidasy. Exprese transgenu byla sledována v průběhu pasážování vhodných buněk při 2 přesazování každý týden během jednoho měsíce, což je ekvivalentní k 24 buněčném dělení. V buňkách transfektovaných pRep+pCre exprese Pgalactosidasy se zachovává během celé délky pokusu tak, že rychle vymizela (po jakémkoliv buněčném dělení) v buňkách kotransfektovaných s kontrolním plazmidem, který nenese počátek replikace oriP.

Ve druhé etapě kotransfektované buňky (pRep+pCre) byly selektovány v přítomnosti phleomycinu. Epizomální DNA byla izolována technikou Hirt, linearizovaná nebo nelinearizovaná digescí na úrovni jediného místa Xhol, potom případně digerovaná Mbol pro prokázání, že DNA byla replikovaná v eukaryontních buňkách. Analýza Southem-Blotem takto získaných vzorků umožnila prokázat přítomnost replikonu očekávané velikosti. Počtu kopií buněk bylo 1 až 10. Selektované buňky byly potom uchovány v přítomnosti nebo v nepřítomnosti selekčním tlaku. Za těchto dvou podmínek bylo pozorováno podobné chování exprese Pgalactosidasy s pomalým konstantním úbytkem v průběhu buněčného dělení. Po 27 dělení aktivita pgalactosidasy je ještě detekovatelná u 25 % buněk přímým barvením in vitro. Tyto výsledky odpovídají segregační stabilitě epizomu v 97 % dělení. Tyto výsledky jsou v souhlase s výsledky uvedenými v odborné literatu- 14CZ 296600 B6 ře, kde hodnota ztráty 1 až 5 % na dělení byla již publikována (Simpson et al., 1996).

4.4.2 Analýza účinku EBNA1 v buňkách Hela

Pokusy kotransfekce buněk Hela s pRep-EBNAl a pCRE umožňuje testovat, že EBNAÍ je správně exprimovaný od IRES a ze zachovává chování exprese Pgalactosidasy v průběhu postupného pasážování. Buňky Hela-EBNAl transfektované se stejným plazmidem tvoří kontrolu.

4.5 Potvrzení in vivo v modelu tumoru indukovaného u myší

Buňky Hela a Hela-EBNAl jsou tumorogenní pro myši podkožní injekce 10⁶ buněk indukuje tvorbu tumoru detekovatelného po 8 dnech velmi rychlého růstu může být sledováno měsíc. V prvním příkladu byly injektovány buňky Hela EBNA1 transfektované pRep a pCre potom selektované in vitro v přítomnosti phleomycinu. Analýza tumorů (3 cm v průměru) po 21 dnech po zabarvení X-gal ukazuje na chování replikonu in vivo v této molekule.

Ve druhém příkladě byly injektovány buňky Hela-EBNAl transfektované pRep potom infikovány AdCre (viz Příklad 5.2). Transfektované buňky dvěma plazmidy odvozenými od pRep umožňujícími expresi lacZ v nepřítomnosti rekombinace, nesoucími nebo nenesoucími oriP, současně injektované byly použity jako kontrola. Analýza tumorů po 21 dnech ukazuje, že adenovirus Cre třetí generace umožňuje vyjmutí replikonu a že jeho přítomnost nemění ani buněčnou životaschopnost ani první etapy tvorby epizomu. Lze zaznamenat, že žádná aktivita pgalactosidasy není detekovatelná v transfektovaných buňkách s kontrolním plazmidem, který nenese oriP. Tyto výsledky jasně ukazují, že konstrukce podle vynálezu jsou funkční in vivo v tumorálních buňkách lze také zaznamenat stabilitu epizomů po 21 dnech.

Příklad 5: Konstrukce rekombinantních adenovirů první a třetí generace

Tento příklad popisuje konstrukci virového vektoru podle vynálezu, který obsahuje oblast, která může tvořit regiospecifickou rekombinací kruhovou a replikativní molekulu in vivo. Tyto virové vektory obsahují mimo jiné sekvenci kódující rekombinasu umožňující rekombinací.

5.1 Příprava adenovirů první generace (od plazmidů pBS185, pLoxP-oriP-TK-EBNAl a pLoxPoriP-LacZ-EBNAl)

Kazeta exprese rekombinasy Cre a úplná sekvence replikonu zahrnující místa LoxP byly klonovány od vektorů pBS185 a pLox-oriP-TK-EBNAl nebo pLoxP-oriP-LacZ-EBNAl v oblasti El adenovirových vektorů obsahujících úplnou nebo částečnou deleci oblasti El (Addl327; ΔΕ1ΔΕ3). Rekombinantní adenoviry byly izolovány klasickými technikami homologní rekombinace z buněk 293. Virové vektory mohou také být připraveny dvounásobnou rekombinací v E. coli pomocí plazmidů obsahujících genom Adeno 5 ΔΕΙ ΔΕ5, virový genom, který je potom enkapsidován do adenovirové částice ve vhodné linii. Z důvodů schopnosti klonování byl gen LacZ výhodně nahrazen menším značeným genem.

5.2 Příprava adenovirů druhé generace

Použití adenovirů třetí generace vyjadřuje určité výhody vzhledem k použití adenovirů první generace; nejen z hlediska neškodnosti, ale také z hlediska snížení zánětlivé odpovědi a zvýšení stability exprese transgenu. Tyto vektory vyjadřují mimo jiné zvýšenou schopnost klonování a nepřítomnost přímého cytopatického účinku in vitro nebo in vivo.

-15 CZ 296600 B6

Vektory třetí generace (AdI1007; ΔΕ1ΔΕ3ΔΕ4) mohou být připraveny klasickými technikami homologní rekombinace v vhodných zabalených buňkách (WO 96/22378) nebo dvounásobnou rekombinací v E. coli potom zabaleny.

Byly konstruovány dva adenoviry dvounásobnou rekombinací pomocí skeletu E. coli obsahující Genom adenoviru třetí generace pXL2811 (pRSV-bGal- ΔΕΙ, ΔΕ3, AE4-dll007-SspI) a pXL2789 (ΔΕΙ, ΔΕ3, AE4-dll007-SspI) a sebevražedné plazmidy (Kana-SacB) pMA37 nebo pXL3048 cílené k modifikaci oblasti El podle strategie dříve popsané (Crouzet et al., 1997 PNAS, 94:1414; WO96/25506).

5.2.1 Příprava adenoviru Cre (Ad-Cre)

Fragment Xhol-BamHI (451-2057) plazmidu pMC-Cre (Tabulka 1) byl odstraněn Klenowen a klonován v místě EcoRV sebevražedného plazmidu pMA37.

Genom získaného adenoviru dvounásobnou rekombinací s plazmidem pXL2811 byl linearizován digescí Pac a transfektován do buněk IGRP2 (WO96/22378) pomocí Lipofektaminu (GIBCO). Takto vytvořený Ad-Cre byl amplifíkován do stejných buněk potom purifíkován podle klasických technik (chlorid cesnatý) nebo chromatografícky (FR96/08164).

Struktura genomu adenoviru Cre byla potvrzena enzymovou digescí.

5.2.2 Příprava adenoviru Rep (Ad-Rep)

Plazmid pLX2 byl digerován BamHl potom recirkularizován, aby se vyloučil polyadenylační signál SV40 na 5' konci genu LacZ. Fragment Notl-Notl (1-6145) plazmidu takto získaného byl štěpen Klenowovým fragmentem, potom klonován v místě EcoRV sebevražedného vektoru pXL3048, předem digerovaného BamHl a Sall, štěpen Klenowovým fragmentem potom recirkularizován pro zničení těchto dvou míst, aby se získal plazmid pAdLX2. Fragment Xhol-Sall (441-3457) plazmidu pCITE-EBNAlpA-mutagenní byl klonován v místě Xhol plazmidu pAdLX2 předem získaného, aby se získal plazmid pAdLX2-EBNAl (pRep-EBNAl).

Ad-Rep byl získán rekombinací s plazmidy pAdLX2-EBNAl apXL2789 podle technik již dříve popsaných pro Ad-Cre.

5.2.3 Příprava adenoviru Rep/Cre (Obrázek 6)

Byl konstruován adenovirus Rep-Cre nesoucí zároveň replikon a gen rekombinasy Cre. Tato strategie umožňuje zvýšit účinek přenosu replikonu zejména in vivo. Kazeta exprese Cre byla vožena do genomu adenoviru v oblastech El, E3 nebo E4. Úplná exprese řízená rekombinasou je zkoumána, aby se zabránilo zničení replikonu od genomu adenoviru během jeho propagace v buňkách IGRP2.

Byla pozorována regulace exprese rekombinasy na transkripční úrovni (tkáňově specifický promotor aktivní in vivo nebo indukovatelný promotor) nebo na úrovni posttranskripční (fúze Cre s oblastí vázání receptoru stereoidních hormonů Cre-ER).

Pro konstrukci těchto adenovirů je replikon vložen do plazmidu pXL2789 tak, jak je popsáno v předchozím příkladě. Kazeta exprese Cre nesoucí promotor tet nebo MMTV nebo fúzy Cre-ER je potom vložena dvounásobnou homologní rekombinací u E. coli do výše uvedeného plazmidu, aby se vytvořily plazmidy pRep-Crel (Rep a Cre v El) a pRep-Cre2 (Rep v El a Cre v E4). Tyto plazmidy byly potom upraveny Pacl pro vyjmutí virového rekombinantního genomu, který je vložen do buněk IGRP2 pro produkci odpovídajících virů.

-16CZ 296600 B6

5.2.4 Příprava adenoviru Rep/Psi (Obrázek 7)

Tato konstrukce umožňuje výhodně vyhnout se kontaminaci Ad-Rep-Cre adenovirem s delecí replikonu nebo úplná regulace aktivity Cre nemůže být získán. Strategie se zakládá na vložení enkapsidačního signálu Psi do replikonu. Vektor pXL3048 byl modifikován řízenou mutagenezí na úrovni oblasti IRT, aby deletoval enkapsidační signál a vložil místo LoxP pro vznik plazmidu pXL3048-APsi-LoxP. Sekvence replikonu deletovaného v místě „levý LoxP“ je izolována enzymovou digescí od plazmidů pAdLX2 nebo pAdLX2-EBNAl a klonována v místě EcoRV plazmidu pXL3048-APsi-LoxP.

Příklad 6: Prokázání systému společnou infekcí se dvěma rekombinantními adencviry

Funkčnost virových vektorů podle vynálezu je řízena in vitro a in vivo:

6.1 Prokázání in vitro infekcí rozdílných buněčných linií

Aktivita rekombinasy adenoviru Cre byla prokázána in vitro v buňkách Hela-EBNAl transfektovaných pRep stejně jako v linii myších embryonárních buněk (Lox-bgal), ve kterých exprese lacZ může být aktivovaná rekombinací mezi dvěma místy loxP.

Účinek excize replikonu od adenovirového genomu byl studován v buňkách IGRP2 společně infikovaných Ad-Rep a Ad-Cre.

Přímá analýza virové DNA izolované technikou Hirt a digerované Xhol odhaluje úplné vymizení fragmentu odpovídajícího replikonu neexcizováného genomu Ad-Rep, což ukazuje účinek rekombinace mezi dvěma místy LoxP. Analýza Southern stejného vzorku umožnila prokázat fragment 9,2 kb odpovídající replikonu.

V buňkách společně infikovaných Ad-Rep a Ad-Cre lze pozorovat po 48 hodinách aktivitu Pgalactosidasy v 50 % buněk zatímco nebyla detekovaná žádná aktivita Bgalactosidasy v infikovaných buňkách samotným adeno-Rep. V 96. hodině počet buněk exprimujících lacZ se zvýšil s buněčným dělením. Po pasáži buněk exprese lacZ se udržela ještě po dobu 20 dnů po společné infekci. Tyto výsledky ukazují, že (i) replikon může být účinně odstraněn v buňce společnou infekcí se dvěma adenoviry, že (ii) rekombinace uvolňuje replikon a aktivuje expresi transgenu a že (iii) replikon umožňuje zajistit stabilní expresi transgenu v průběhu buněčného dělení.

6.2 Prokázání in vivo

Prokázání in vivo bylo provedeno přenosem normálních lidských buněk (keratinocyty, hepatopoetické buňky (CD34+), buňky kmene epitelového bronchiálního, myoblasty...) nebo rakovinových buněk (MDA, HT29...) předem společně infikovaných Ad-Rep a Ad-Cre na myši.

Exprese transgenu a stabilita epizomu v průběhu buněčného dělení jsou ověřeny předem popsanými technikami.

Seznam sekvencí (1) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 1:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 26 párů bází (B) typ: nukleotid

-17CZ 296600 B6 (C) počet vláken:jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (ix) popis sekvence SEQ ID NO: 1:

GGCCTCTAGA CAGCTGGTTA TTTTCC 26 (1) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 2 :

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 23 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (ix) popis sekvence SEQ ID NO: 2 :

GGCCGGATCC CATATTATCA TCG 23 (1) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 3:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 147 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: dvě (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (ix) popis sekvence SEQ ID NO: 3:

CAGCTGGACG TCGGTTCGAA CCGACCTGCA TTTGAGGAGA AGTCTGGATT 50 ATTGAAGCAT ATCGTATGTA ATATGCTTCA ATATAATTCC CAAGGCCTAG 100 TAGCGCTCGA GCTCTAGATC TATAGCTAAC GGCGGTGGTA CCGAAGC 147

-18CZ 296600 B6

Tabulka 1: Původ sekvencích použitých pro konstrukcí epizomu

sekvence	fragment	velikost (pb)	původ
LoxP	Notl (1-296)	34	pBS246 (GIBCO-BRL)
LTR RSV	BamHI-SalI (478-1080)	602	pRSV-TK (WO95/14101)
oriP	EcoRI-Hpal (5052-3235)	1 817	pSLori (WO95/14101)
SV40polyA	BamHI-SalI (406-7)	399	pCEP-4 (In Vitrogen)
ENBA-1	BamHI-Pstl (759-2803)	2 044	pCMV-EBNA (Clontech)
IRES	(16-518)	502	pCITE 2a (Novagen)
TK	clal-BsawI (1721-556)	1 165	pCMV-TK-El Gene Therapy 3 (1996) 315
pIC19H		2 700	Marsh et al., Gene 32 (1984) 481
pIC20H		2 700
pIC20R		2 700
pBluescripitII-KS		2 850	(Stratagene)
hCMV	BglII—BglII (473-1226)	753	pCEP4 (In Vitrogen)
LacZ	StuI-BamHl (1149-4354)	3 205	pRSVGalIXÍL.Strat ford-Perricaudet, JLClin.Invest 1992 ?626)
hCMV-Cre-MTpA	HindlII-Hind III (0-3400)	3 400	pBS185 (GIBCO-BRL)
zéo-Lac	Ncol-Clal (750-1980)	1 230	PUT641 (CAYLA)

- 19CZ 296600 B6

Claims (26)

1. Virový vektor obsahující oblast DNA lemovanou dvěma sekvencemi, které umožňují regiospecifickou rekombinaci a jsou umístěny v přímé orientaci, přičemž oblast DNA obsahuje, následně seřazené, promotor funkční v savčích buňkách, sekvenci OriP z viru EBV, expresní kazetu obsahující gen zájmu a gen pro protein EBNA1 oddělené sekvencí IRES pocházející z viru ECMV, a přičemž promotor a expresní kazeta jsou orientovány tak, že exprese obou genů je možná pouze po regiospecifícké rekombinaci.

2. Virový vektor podle nároku 1, kde exprese genu zájmu je závislá na regiospecifícké rekombinaci.

3. Virový vektor podle kteréhokoliv z nároků 1 až 2, kde sekvence umožňující regiospecifíckou rekombinaci jsou sekvence schopné specificky rekombinovat v přítomnosti rekombinasy. (8)

4. Virový vektor podle nároku 3, kde sekvence umožňující regiospecifíckou rekombinaci jsou odvozeny z bakteriofágu.

5. Virový vektor podle nároku 4, kde sekvence umožňující regiospecifíckou rekombinaci jsou odvozeny z bakteriofágu PÍ.

6. Virový vektor podle nároku 5, kde sekvence odvozené z bakteriofágu PÍ jsou sekvence obrácené repetice bakteriofágu PÍ (oblast loxP), jejichž rekombinace je indukována rekombinasou Cre.

7. Virový vektor podle nároku 3, který dále obsahuje, mimo oblast omezenou dvěma sekvencemi umožňujícími regiospecifíckou rekombinaci, gen kódující odpovídající rekombinasu

8. Virový vektor podle nároku 7, kde gen kódující rekombinasu je umístěn pod kontrolu indukovatelného promotoru.

9. Virový vektor podle nároku 7, kde promotor je vybrán z promotoru MMTV indukovatelného dexamethasonem a promotoru indukovatelného tetracyklinem.

10. Virový vektor podle nároku 8, kde gen rekombinasy dále obsahuje regulační element kódující vazebnou doménu receptoru hormonu.

11. Virový vektor podle nároku 10, kde receptor je vybraný z receptorů pro glukokortikoidové, mineralokortikoidové a thyroidní hormony, estrogen, aldosteron a kyselinu retinovou.

12. Virový vektor podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, kde virová oblast enkapsidace je začleněna do oblasti DNA lemované dvěma sekvencemi umožňujícími regiospecifíckou rekombinaci.

13. Virový vektor podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, kterým je defektní rekombinantní adenovirus.

14. Virový vektor podle nároku 13, kterým je adenovirus obsahující úplnou nebo částečnou delecí oblasti El.

-20CZ 296600 B6

15. Virový vektor podle nároku 14, kterým je adenovirus obsahující dále úplnou nebo částečnou deleci oblasti E4.

16. Virový vektor podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12, kterým je defektní rekombinantní retro virus.

17. Virový vektor podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12, kterým je defektní rekombinantní AAV.

18. Buňka modifikovaná vložením virového vektoru podle kteréhokoliv z nároků 1 až 17.

19. Buňka podle nároku 18, která je eukaryontní buňkou.

20. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden virový vektor podle kteréhokoliv z nároků 1 až 17 nebo buňku podle nároku 18.

21. Způsob in vitro přípravy molekul replikativní kruhové DNA, vyznačující se tím, že zahrnuje krok, kdy se populace buněk obsahujících virový vektor podle nároku 3 přivede do kontaktu s rekombinasou, která indukuje regiospecifickou rekombinaci in šitu.

22. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že krok přivedení do kontaktu s rekombinasou je proveden transfekcí nebo infekcí buněk užitím plazmidu nebo virového vektoru, které obsahují gen rekombinasy.

23. Způsob in šitu přípravy molekul replikativní kruhové DNA, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:

(i) transformace buněk prostřednictvím virového vektoru obsahujícího:

- oblast DNA lemovanou dvěma sekvencemi, které umožňují regiospecifickou rekombinaci a jsou umístěny v přímé orientaci, přičemž oblast DNA obsahuje, následně seřazené, promotor funkční v savčích buňkách, sekvenci OriP z viru EBV, expresní kazetu obsahující gen zájmu a gen pro protein EBNA1 oddělené sekvencí IRES pocházející z viru ECMV, a přičemž promotor a expresní kazeta jsou orientovány tak, že exprese obou genů je možná pouze po regiospecifické rekombinaci.

- gen kódující rekombinasu pod kontrolou indukovatelného promotoru, a (ii) indukce exprese rekombinasy.

24. Použití virového vektoru podle kteréhokoliv z nároků 1 až 17 pro in vitro přípravu molekul replikativní kruhové DNA.

25. Virový vektor podle kteréhokoliv z nároků 1 až 17 pro použití jako léčivo pro genovou terapii.

26. Použití virového vektoru podle kteréhokoliv z nároků 1 až 17 pro výrobu léčiva pro genovou terapii.

7 výkresů