JP2001343348A - コレステロール測定用センサ - Google Patents
コレステロール測定用センサInfo
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Abstract
となく、安価に簡単に製造することができ、かつ、品質
のバラツキが極めて少ないコレステロール測定用センサ
を提供すること。 【解決手段】 本発明に係るコレステロール測定用セン
サは、絶縁性基板上に少なくとも測定極と対極とを有す
る電極系を形成し、酵素、電子受容体及び試料液の反応
時の物質濃度変化を電気化学的に前記電極系で検知し前
記試料液の基質濃度を測定するセンサにおいて、前記測
定極上に、リポプロテインリパーゼ、コレステロールエ
ステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ及び界面活性
剤を保持し、かつ、試料液が通過可能な保持体を載置し
て第1層を形成し、前記対極上に、界面活性剤を保持
し、かつ、試料液が通過可能な保持体を載置して第2層
を形成したことを特徴とする。
Description
清、又は標準液等の試料液中のコレステロール成分を測
定するためのセンサに関する。
なる電極系を形成し、この電極系の上に、酵素と電子受
容体とを担持した多孔体から成る酵素反応層を設け、そ
れらを適当なカバーで一体化したバイオセンサが提案さ
れている。このバイオセンサは、血液等の試料液を酵素
反応層に滴下して酵素と電子受容体とを試料液中に溶解
させ、酵素及び電子受容体と試料液中の特定の基質との
間で酵素反応を進行させて電子受容体を還元した後、還
元された電子受容体を電気化学的に酸化させて、このと
きに得られる酸化電流値から試料液中の特定の基質の濃
度を求める。しかし、上記した構成では、電極系を含む
基板面の濡れが必ずしも一様とならないため、多孔体と
基板との間に気泡が残り、応答電流に影響を与えたり反
応速度が低下するという問題があった。上記した従来の
問題点を解決する方法として、測定極と対極とからなる
電極系の上に、親水性高分子と酵素とから成る酵素反応
層を設けることが登録第2502665号にて提案され
ている。
たように親水性高分子を用いて酵素反応層と電極との間
の気泡の残存を防ぐ方法は、親水性高分子を含む層と電
極系とを隙間なく一体化する必要があるため、始めに、
親水性高分子を溶液にして電極上に塗布した後に乾燥さ
せて親水性高分子層を形成した後に、親水性高分子層の
上に酵素を含む酵素層を形成しなければならないという
製造上の制限があるという問題があった。このような製
造方法は、親水性高分子層を形成した後でなければ、酵
素層の形成を開始することができないので製造に時間が
かかるという問題がある。また、塗布・乾燥工程を用い
た製造方法は、塗布時に塗布すべき溶液の量にバラツキ
が出やすいため、複数のセンサを製造する場合、各セン
サで親水性高分子や酵素の濃度にバラツキが生じる可能
性が高いという問題もある。また、上記した従来のバイ
オセンサは、本来、対極上には酵素反応層を設ける必要
がないにも拘わらず、測定極と対極との両方に跨って酵
素反応層を設けているため、製造コストが高くなるとい
う問題もある。酵素には、高価なものも、安価なものも
あるため、上記した問題の大きさは、測定すべき基質の
種類、即ち、酵素の種類に依存する問題ではあるが、コ
レステロールを測定する場合には、コレステロールの測
定に有効な酵素であるリポプロテインリパーゼ、コレス
テロールエステラーゼ、及びコレステロールオキシダー
ゼが高価であり、特に、コレステロールオキシダーゼと
電子受容体との反応速度が非常に遅いので、コレステロ
ールを測定するためには、大量のコレステロールオキシ
ダーゼを必要とするため大きな問題となる。この製造コ
スト上の問題を解決するためには、測定極上のみに酵素
反応層を設ける必要があるが、従来のバイオセンサは、
上記したように、始めに、親水性高分子を溶液にして塗
布し乾燥させなければならないという製造上の制限があ
り、そのため、測定極上のみに酵素反応層を設けようと
すると、始めに、親水性高分子を測定極と対極との両方
に別々に塗布・乾燥させて各々に親水性高分子層を形成
しなければならないので、塗布・乾燥工程が増えてしま
い、結局、製造コストが高くなってしまうという問題が
ある。親水性高分子層は測定極上及び対極上の両方に設
けることが望ましいので、塗布・乾燥工程を増やさない
ために、親水性高分子層だけは電極全面に形成し、酵素
を含む酵素層だけを測定極上のみに設けるという考え方
もあるが、親水性高分子層を塗布・乾燥した後に、測定
極上のみに酵素が溶解した試料液を塗布・乾燥させて酵
素層を測定極上に局在するように形成するのは極めて困
難であり、このような製造方法を採るとセンサ一個体ご
とにバラツキが生じることは避けられないので現実的で
はない。さらに、上記した従来のバイオセンサのよう
に、測定極と対極との両方に渡って酵素反応層を設ける
という従来の構造は、上記したコスト面に関する問題の
他にも、対極が試料液中の基質と酵素との反応生成物と
相互作用を起こし易く、測定結果に影響を及ぼす可能性
があるという根本的な問題点もある。本発明は、上記し
た従来の問題点を解決し、測定精度を落とすことなく、
安価に簡単に製造することができ、かつ、品質のバラツ
キが極めて少ないコレステロール測定用センサを提供す
ることを目的としている。
ために本発明に係るコレステロール測定用センサは、絶
縁性基板上に少なくとも測定極と対極とを有する電極系
を形成し、酵素、電子受容体及び試料液の反応時の物質
濃度変化を電気化学的に前記電極系で検知し前記試料液
の基質濃度を測定するセンサにおいて、前記測定極上
に、リポプロテインリパーゼ、コレステロールエステラ
ーゼ、コレステロールオキシダーゼ及び界面活性剤を保
持し、かつ、試料液が通過可能な保持体を載置して第1
層を形成し、前記対極上に、界面活性剤を保持し、か
つ、試料液が通過可能な保持体を載置して第2層を形成
したことを特徴とするものである。
実施例を参照して本発明に係るコレステロール測定用セ
ンサの実施の形態について説明する。始めに、図1〜図
5を参照して本発明に係るコレステロール測定用センサ
の第1の実施例について説明していく。図1は、本発明
に係るコレステロール測定用センサの一実施例の展開
図、図2は、図1に示したコレステロール測定用センサ
の組立完成品の部分断面図、図3は、図1に示したコレ
ステロール測定用センサの中央断面図を各々示してい
る。図中符号1は、絶縁性基板を示している。この絶縁
性基板1の上には、カーボンペーストをスクリーン印刷
した後、加熱乾燥することにより第1測定極2及び第2
測定極3が形成されており、また、銀/塩化銀ペースト
をスクリーン印刷した後、加熱乾燥することにより対極
4が形成されている。前記測定極2と第2測定極3と
は、対極4を中心として左右対称となる位置に形成され
ている。また、前記測定極2、第2測定極3、及び対極
4は、測定部分2a、3a、4a及び端子部分2b、3
b、4b以外は絶縁層5で覆われる。図中符号6は、絶
縁性材料で形成された保持枠を示している。この保持枠
6は、図2に示すように前記端子部分2b、3b、4b
を残して絶縁性基板1の上面を覆える寸法に形成されて
おり、また、前記測定部分2a、3a、4aと対応する
位置には、後述する酵素反応層7、8及び界面活性剤保
持層9を保持する孔6a、6b、6cが形成されてい
る。酵素反応層7は、第1測定極2の測定部分2aの上
に載置されるよう前記保持枠6により保持される処理層
であり、リポプロテインを分解するためのリポプロテイ
ンリパーゼ、コレステロールエステルを加水分解するた
めのコレステロールエステラーゼ、コレステロールを酸
化すると共に、後述する電子受容体としてのフェリシア
ンイオンを還元してフェロシアンイオンを生成するため
のコレステロールオキシダーゼを保持させたろ紙で形成
されている。前記ろ紙としては、例えば、ポリエステル
繊維から成るろ紙を用いることができ、好ましくは、コ
ンジュゲートリリースパッドが用いられ得る。このコン
ジュゲートリリースパッドは、イムノクロマトグラフィ
ー用センサーデバイスの構成要素として開発されたろ紙
であり、ガラス繊維や高分子繊維などの表面に、必要に
応じ特殊なコーティングを施したものを材料とする。こ
のろ紙は、たんぱく質等の吸着量が低いという特徴を有
し、これを酵素反応層の保持体として適用すると、酵素
反応層に試料液が導入された際、試薬を速やかに遊離
し、反応終了までの時間が大幅に短縮するという効果を
奏する。また、繊維の微細なコンジュゲートリリースパ
ッド用いることにより、より多くの酵素を保持させるこ
とができ、それにより、さらに反応速度が短縮するとい
う効果を奏する。酵素反応層8は、第2測定極3の測定
部分3aの上に載置されるよう前記保持枠6により保持
される処理層であり、コレステロールオキシダーゼを含
んでいないこと以外は、全て、酵素反応層7と同一の条
件、即ち、リポプロテインリパーゼ及びコレステロール
エステラーゼを保持させたろ紙で形成されている。前記
ろ紙としては、例えば、ポリエステル繊維から成るろ紙
を用いることができ、好ましくは、前記コンジュゲート
リリースパッドが用いられ得る。界面活性剤保持層9
は、対極4の測定部分4aの上に載置されるよう前記保
持枠6により保持される処理層であり、界面活性剤を保
持させたろ紙、例えば、ポリエステル繊維ろ紙で形成さ
れている。前記界面活性剤としては、例えば、トリトン
X−100(製品名)等)を用いることができる。図
中、符号10は、界面活性剤(例えば、トリトンX−1
00(製品名))及び電子受容体としてのフェリシアン
イオンを保持させたろ紙(例えば、ポリエステル繊維ろ
紙)から成る界面活性剤及び電子受容体保持層を示して
いる。この界面活性剤及び電子受容体保持層10は、前
記酵素反応層7、8及び界面活性剤保持層9の上面に、
これらを覆うように載置される処理層であり、その中心
軸に対して左右対称の形状を持ち、前記界面活性剤保持
層9の同軸上に配置された時に、前記酵素反応層7及び
8を覆うことができるよう寸法決めされている。図中、
符号12は、カバーを示している。図4は、カバー12
を底面から見た斜視図である。図4に示すように、この
カバー12は、絶縁性材料、例えば、適当な樹脂で形成
された底面が開口した箱体から成る。カバー12は、そ
の上壁12aの内面12bに、前記界面活性剤及び電子
受容体保持層10を嵌め込むことができる凹部12cが
形成されている。前記凹部12cの深さの寸法は、前記
界面活性剤及び電子受容体保持層10の厚みに合わせら
れ、組み立てた時に、上壁12aの内面12bと、前記
保持枠6の上面とが当たるようにされており、また、そ
の形状は、前記界面活性剤及び電子受容体保持層10を
位置決めできるように、保持層10の形状に合わせられ
ている(図2及び図3参照)。また、カバー12の上壁
12aには、試料液を導入するための開口12dが設け
られている。この開口12dの位置及び大きさは、試料
液の導入位置を制限して、試料液を保持層10の中心に
導入できるように決められ、これにより、前記第1測定
極2と第2測定極3との中間位置に試料液が導入できる
ようになる(図3参照)。さらに、カバー12の前壁1
2eには、切り欠き12fが形成されており(図4参
照)、組み立てた時に、基板1の上の端子部分2b、3
b、4bが、この切り欠き12fから突出するようにさ
れている(図2参照)。
基板1上に、酵素反応層7,8及び界面活性剤保持層9
を保持した保持枠6を載置し、保持枠6の上に、界面活
性剤及び電子受容体保持層10を積層し、さらに、カバ
ー12を被せて、カバー12と基板1とを適当な方法で
固定することにより、基板1とカバー12との間に、酵
素反応層7,8及び界面活性剤保持層9を保持した保持
枠6と、界面活性剤及び電子受容体保持層10とを挟み
込んで固定することで組み立てられる。尚、組み立て順
序及び方法は前記の方法に限定されるものではなく、任
意の方法でよく、例えば、カバー12側から組み立てて
もよいことは勿論である。基板1とカバー12とを固定
する方法は、任意の方法でよく、例えば、保持枠6の上
面及び下面に接着剤を塗布して保持枠6を介して基板1
とカバー12とを固定してもよく、また、基板1及び/
又はカバー12に適当な係止部材を設けて固定してもよ
く、さらにまた、カバー12に基板1をスライド嵌合可
能な溝を設けて固定してもよい。
ール測定用センサの開口12dから試料液を滴下する
と、試料液が界面活性剤及び電子受容体保持層10を通
過する際に試料液中に界面活性剤及び電子受容体として
のフェリシアン塩が溶解する。次いで、酵素反応層7を
通過する試料液には、リポプロテインリパーゼ、コレス
テロールエステラーゼ、及びコレステロールオキシダー
ゼが溶解し、これらの酵素が試料液中のコレステロール
エステルを加水分解してコレステロールを生成し、さら
に、コレステロールオキシダーゼがコレステロールを酸
化し、試料液中に溶解したフェリシアンイオンを還元し
てコレステ−4-エン−3−オン及びフェロシアンイオ
ンを生成する。一方、酵素反応層8を通過する試料液
は、リポプロテインリパーゼ及びコレステロールエステ
ラーゼが溶解してコレステロールエステルからコレステ
ロールが生成される。しかし、酵素反応層8には、コレ
ステロールオキシダーゼは保持されていないので、フェ
ロシアンイオンは生成されない。次いで、第1測定極2
及び第2測定極3と、対極4との間に、適当な電圧を印
加し、その時に、第1測定極2と対極4との間に流れる
電極応答電流の値Aと、第2測定極3と対極4との間に
流れる電極応答電流の値Bとを測定し、電流値Aから電
流値Bを引いた値からコレステロール成分の濃度を算出
する。第1測定極2に達する試料液中にはコレステロー
ルの酸化反応によって生じたフェロシアンイオンが含ま
れているため、対極4との間には、フェロシアンイオン
が電気化学的に酸化する時に生じる酸化電流が流れる
が、第2測定極3に達する血液中にはコレステロールの
酸化反応によって生じたフェロシアンイオンが含まれて
いないので、フェロシアンイオンが電気化学的に酸化す
る時に生じる酸化電流は流れない。しかし、第1測定極
2と第2測定極3とは、酵素反応層8にコレステロール
オキシダーゼが保持されていないこと以外の条件は同一
である。従って、上記したように、電極応答電流値Aか
ら電極応答電流値Bを引くと、フェロシアンイオンの酸
化時に生じる酸化電流値のみが残るので、その値からコ
レステロール成分の濃度を算出することが可能になる。
尚、上記したように、酵素反応層7,8及び界面活性剤
保持層9は、それぞれ、第1測定極2、第2測定極3、
及び対極4上に載置された後、基板1とカバー12とで
挟まれて固定されているだけなので、各層7,8,9と
各極2,3,4とは、完全に一体化しているわけではな
い。従って、層7,8,9と各極2,3,4との間に
は、必ず、微小な隙間が生じてしまい、その隙間に空気
が残存してしまうが、第1測定極2、第2測定極3及び
対極4に達する試料液中には、界面活性剤が溶解してい
るので、この界面活性剤が、疎水性の第1測定極2、第
2測定極3、及び対極4と、試料液との界面に顕著な吸
着を生じさせるので、各極2,3,4と、血液との間に
気泡の残存はなくなり、各極2,3,4の濡れが一様に
なり、測定値が安定する。
シ血清アルブミン7%、リン酸緩衝液50mM(pH
7.5)、塩化ナトリウム150mMの組成の水溶液に
て希釈し、コレステロール濃度を適当に調整した4つの
試料液a〜dを開口12dより滴下したときの測定結果
を図5に示す。 ・電子受容体・界面活性剤保持層10 フェリシアン化カリウム 1.33mg トリトンX−100 0.03mg ポリエステル繊維ろ紙 直径6.8mm ・酵素反応層7 リポプロテインリパーゼ 0.54ユニット コレステロールエステラーゼ 1.09ユニット コレステロールオキシダーゼ 0.54ユニット コンジュゲートリリースパッド直径1.5mm ・酵素反応層8 リポプロテインリパーゼ 0.54ユニット コレステロールエステラーゼ 1.09ユニット コンジュゲートリリースパッド直径1.5mm ・界面活性剤保持層9 トリトンX−100 5μg ポリエステル繊維ろ紙 直径2mm 図5の測定結果に示すように試料液a〜dの測定結果
は、1直線上に乗っており、安定したコレステロール濃
度が測定できることが分かる。
テロール測定用センサの第2の実施例を説明する。図6
は、上記した第1実施例のコレステロール測定用センサ
に、さらに、中性脂肪測定機能を加え、かつ全血測定を
も可能としたコレステロール及び中性脂肪測定用センサ
の展開図を示している。図中、符号1は絶縁性基板を、
符号2はコレステロール用第1測定極、符号3はコレス
テロール用第2測定極、符号4は対極、符号5は絶縁
層、符号6は保持枠、符号7及び8は酵素反応層、符号
9は界面活性剤保持層、符号10は界面活性剤、塩化マ
グネシウム及び電子受容体を保持する保持層、及び符号
12はカバーを各々示している。前記第1測定極2及び
第2測定極3は、対極4を中心として左右対称に配置さ
れ、酵素反応層7、8及び界面活性剤保持層9は、組立
時に保持枠6により第1測定極、第2測定極3及び対極
4上の保持される。これらの構成部材は、基本的に上記
した第1の実施例と同じ構成なので、重複する説明はこ
こでは省略する。
第3測定極20及び第4測定極21が、前記対極4を中
心として左右対称となる位置に形成されている。これら
の中性脂肪測定用の測定極20及び21は、コレステロ
ール測定用の測定極と同様、カーボンペーストをスクリ
ーン印刷した後、加熱乾燥することにより形成されてお
り、また、その測定部分20a及び21a並びに端子部
分20b及び21b以外の部分は絶縁層5で覆われてい
る。前記保持枠6は、端子部分2b,3b,4b,20
b,21bを残して絶縁性基板1の上面を覆える寸法に
形成されており、また、孔6a〜6cに加えて、前記中
性脂肪測定用の測定極20及び21と対応する位置に、
後述する酵素反応層22及び23を保持する孔6d,6
eが形成されている。酵素反応層22は、第3測定極2
0の測定部分20aの上に載置されるよう前記保持枠6
により保持される処理層であり、リポタンパク中の中性
脂肪を分解し、中性脂肪由来のグリセロールを生成する
ためのリポプロテインリパーゼ、グリセロールをリン酸
化するためのグリセロールキナーゼ、グリセロール−3
−リン酸を酸化すると共に、後述する電子受容体として
のフェリシアンイオンを還元してフェロシアンイオンを
生成するためのグリセロリン酸オキシダーゼを保持させ
たろ紙で形成されている。前記ろ紙としては、例えば、
ポリエステル繊維から成るろ紙を用いることができ、好
ましくは、前記コンジュゲートリリースパッドが用いら
れ得る。酵素反応層23は、第4測定極21の測定部分
21aの上に載置されるよう前記保持枠6により保持さ
れる処理層であり、リポプロテインリパーゼを含んでい
ないこと以外は、全て、酵素反応層22と同一の条件、
即ち、グリセロールキナーゼ及びグリセロリン酸オキシ
ダーゼを保持させたろ紙で形成されている。前記ろ紙と
しては、例えば、ポリエステル繊維から成るろ紙を用い
ることができ、好ましくは、前記コンジュゲートリリー
スパッドが用いられ得る。図中、符号24は、血球分離
膜を示している。この血球分離膜24は、グリセロール
キナーゼの補酵素としてのアデノシン3リン酸(以下、
ATPと称します。)を保持させたろ紙(例えば、ガラ
ス繊維ろ紙)から成り、前記保持層10と同様、その中
心軸に対して左右対称の形状を持ち、前記界面活性剤保
持層9の同軸上に配置され時に、前記保持層10を覆う
ことができるよう寸法決めされている。カバー12は、
その上壁の内面に設けられた凹部12c(図4参照)の
深さが、前記保持層10及び血球分離膜24を重ねて嵌
め込むことができる寸法にされていること以外は第1実
施例におけるカバー12と同じように構成されている。
用センサは、前記第1実施例に挙げたコレステロール測
定用センサと同様に組み立てられる。
ール及び中性脂肪測定用センサの作用について説明す
る。開口12dから試料液を滴下すると、試料液が血球
分離膜24、前記保持層10を通過する際に試料液中に
ATP、塩化マグネシウム、界面活性剤及び電子受容体
としてのフェリシアンイオンが溶解する。前記した処理
層24及び10を通過した試料液は、酵素反応層7及び
8を通過し、第1測定極2、第2測定極3、及び対極4
に至り、これらの電極間に適当な電圧をかけることによ
り、その時の電極応答電流の値からコレステロール成分
の濃度が算出され得る。酵素反応層7及び8における反
応は、先に説明した第1実施例と同じなのでここでは、
その説明は省略する。一方、酵素反応層22を通過する
試料液には、リポプロテインリパーゼが溶解し、この酵
素により試料液のリポたんぱく中の中性脂肪が分解さ
れ、グリセロール及び脂肪酸が生成される。さらに、酵
素反応層22において、試料液中にグリセロールキナー
ゼが溶解し、この酵素とATPとによりグリセロール−
3−リン酸及びADPが生成される。さらに、グリセロ
リン酸オキシダーゼが、グリセロール−3−リン酸を酸
化すると共に、試料液中に溶解したフェリシアンイオン
を還元してジヒドロキシアセトン−3−リン酸及びフェ
ロシアンイオンを生成する。この酵素反応層22では、
前記したようにリポプロテインリパーゼによりリポ蛋白
中の中性脂肪から生成されたグリセロールが含まれてい
るので、ここで生成されるフェロシアンイオンの値は、
遊離グリセロールと中性脂肪由来のグリセロールとの両
方から得られた値になる。他方、酵素反応層23を通過
する試料液には、グリセロールキナーゼ及びグリセロリ
ン酸オキシダーゼが溶解し、これらの酵素によりフェロ
シアンイオンが生成されるが、この酵素反応層23に
は、リポプロテインリパーゼが含まれていないので、中
性脂肪由来のグリセロールは生成されず、従って、この
酵素反応層23で生成するフェロシアンイオンの量は、
遊離グリセロールの量に相当する量となる。次いで、第
3測定極20及び第4測定極21と、対極4との間に、
適当な電圧をかけ、その時に、第3測定極20と対極4
との間に流れる電極応答電流の値から中性脂肪由来のグ
リセロール及び遊離グリセロールの合計の濃度が算出さ
れ、第4測定極21と対極4との間に流れる電極応答電
流の値から遊離グリセロールの濃度が算出され、これら
の差をとり適当な演算処理を施すことにより、中性脂肪
濃度を算出することができる。尚、各酵素反応層7,
8,22,23、界面活性剤保持層9は、それぞれ、各
測定極2,3,20,21及び対極4上に載置された
後、基板1とカバー12とで挟まれて固定されているだ
けなので、各層7,8,22,23,9と各極2,3,
20,21,4とは、完全に一体化しているわけではな
いが、各極2,3,20,21,4に達する試料液中に
は、界面活性剤が溶解しているので、この界面活性剤
が、疎水性の各極2,3,20,21,4と試料液との
界面に顕著な吸着を生じさせるので、各極2,3,2
0,21,4と、血液との間に気泡の残存はなくなり、
各極2,3,20,21,4の濡れが一様になり、測定
値が安定する。
1〜6を開口12dより滴下したときのコレステロール
並びに中性脂肪の測定結果を図7(a)及び(b)に各
々示す。 (各層の構成) ・血球分離膜24 アデノシン3リン酸・2ナトリウム塩 0.13mg ガラス繊維ろ紙 直径6.8mm ・電子受容体・塩化マグネシウム及び界面活性剤保持層10 フェリシアン化カリウム 1.33mg 塩化マグネシウム 0.2mg トリトンX−100 0.03mg ポリエステル繊維ろ紙 直径6.8mm ・酵素反応層7 リポプロテインリパーゼ 0.54ユニット コレステロールエステラーゼ 1.09ユニット コレステロールオキシダーゼ 0.54ユニット コンジュゲートリリースパッド 直径1.5mm ・酵素反応層8 リポプロテインリパーゼ 0.54ユニット コレステロールエステラーゼ 1.09ユニット コンジュゲートリリースパッド 直径1.5mm ・酵素反応層20 リポプロテインリパーゼ 1.13ユニット グリセロールキナーゼ 0.28ユニット グリセロリン酸オキシダーゼ 0.28ユニット コンジュゲートリリースパッド 直径1.5mm ・酵素反応層21 グリセロールキナーゼ 0.28ユニット グリセロリン酸オキシダーゼ 0.28ユニット コンジュゲートリリースパッド 直径1.5mm ・界面活性剤保持層9 トリトンX−100 5μg ポリエステル繊維ろ紙 直径2mm (人血清) 試料番号 総コレステロール濃度(mg/dL) トリク゛リセリト゛濃度(mg/dL) 1 51 60 2 274 43 3 192 207 4 122 24 5 142 148 6 175 102 図7の測定結果に示すように試料液1〜6の測定結果
は、好適な値を示しており、安定したコレステロール濃
度並びに中性脂肪濃度の測定を同時に行うことができる
ことが分かる。一般的に、健康診断では患者の血液から
コレステロール濃度と中性脂肪濃度との両方を測定する
ことが多く、このように、コレステロールと中性脂肪と
を同時に測定できるように構成することにより、2度測
定する必要がなくなるので診療の効率化を図ることがで
き、また、検体の量を減らすことができるので患者に与
える負担を軽減させることができるようになる。
は、第1実施例及び第2実施例共に、第1測定極2及び
第2測定極3を対極4を中心として対称に配置し、さら
に、試料液を、第1測定極2と第2測定極3との中間位
置に導入できるようにカバー12の開口12dを形成し
ているので、第1測定極2と第2測定極3とに到達する
試料液を均等にすることができ、これにより、第1測定
極2及び第2測定極3の条件を、コレステロールオキシ
ダーゼ以外の部分で同一にすることができるようにな
り、第1測定極2の値を第2測定極3の値で補正するこ
とによる測定の精度をより上げることが可能になる。ま
た、以上説明したコレステロール測定用センサは、界面
活性剤を用いることにより、各処理層を基板と別体に構
成することを可能にしており、その結果、各処理層をろ
紙で形成できるようにしている。ろ紙で各処理層を形成
する場合、一つのろ紙に必要な試薬を保持させた後、そ
こから、複数個の処理層を切り出して、複数のセンサの
製造に用いることができる。このように製造すること
で、各処理層の条件を合わせやすくなるので、処理層を
塗布・乾燥して製造する場合に比べて、センサの性能の
バラツキを小さくすることができる。また、このように
製造することで、処理層の製造工程と、センサの組み立
て工程とを分離することができるので、センサを効率的
に製造することができるようになる。さらに、このよう
に各処理層をろ紙で製造することにより、対極上の処理
層と測定極上の処理層を分けることができるようにな
り、その結果、高価なコレステロールオキシダーゼを、
必要もないのに対極上に設ける必要がなくなるので、製
造コストを安価にすることができる。特に、コレステロ
ールオキシダーゼを媒体としたコレステロールの酸化反
応及びフェリシアンイオンの還元反応は遅く、その結
果、電気的に、コレステロール濃度を測定するには比較
的多くのコレステロールオキシダーゼが必要になるの
で、上記した効果は、コレステロール測定用センサにお
いて顕著に現れる。また、酵素の保持体としてコンジュ
ゲートリリースパッドを用いることにより、酵素量あた
りの反応速度は更に向上する。このことは、測定時間の
短縮、または測定時間を変化させることなく酵素の使用
量を節減することによるコストダウンの手段として有効
である。さらにまた、親水性高分子を用いて各処理層
を、塗布・乾燥して形成する場合、製造コストの高騰を
防ぐために、測定極と対極とに跨って親水性高分子層を
形成する必要があるので、上記した実施例のように、測
定極を二つ設け、一方の測定極(即ち、第1測定極)に
コレステロールオキシダーゼを含む酵素反応層を形成
し、他方の測定極(即ち、第2測定極)にコレステロー
ルオキシダーゼを含まない酵素反応層を形成し、二つの
測定極間に生じる電流値の差に基づいてコレステロール
濃度を測定するように構成するセンサを塗布・乾燥が必
要な親水性高分子層を用いて製造する場合には、親水性
高分子層を介して一方の測定極上の酵素反応層から、他
方の測定極に酵素が混入しないように、二つの測定極上
の親水性高分子層を完全に分離する必要がある。そのた
め、対極と測定極とからなる電極を二つ形成し、その各
々に別個に親水性高分子層を形成する必要があるので、
上記したコレステロール測定用センサに比べて対極が一
つ多くなり、材料費や製造工程が増え、製造コストが高
くなるという問題が生じると共に、二つの測定極間の条
件を合わせることが難しくなるという問題がある。この
ような観点からみると、本発明に係るコレステロール測
定用センサは、測定極を二つ設けて、各測定極間に生じ
る電流値の差に基づいて基質濃度を測定するセンサを、
従来のバイオセンサに比べて、より、安価に、かつ、精
度よく製造することができるよういう効果も奏する。ま
た、以上説明したセンサは、酵素反応層を測定極上のみ
に設けることができるように構成し、かつ、酵素反応層
の保持体としてコンジュゲートリリースパッドを用いて
いるので、無駄に酵素を使用することなく酵素濃度を高
めることができるという効果を奏し、酵素濃度を高める
ことにより、反応速度をより高めることができるように
なるという効果を奏する。
の構成は上記した実施例に限定されるものではなく、特
許請求の範囲に記載された発明の概念内で任意に変更す
ることができる。具体的には、上記した第1の実施例で
は、電子受容体、界面活性剤及び酵素を各処理層に分離
しているが、これらは、一つのろ紙に保持させて構成し
てもよく、また、図8〜図10に示すようにろ紙に保持
される試薬の組合せも任意に決めることができ、さら
に、積層順序も任意に変更することができる。さらに、
第1実施例及び第2実施例における第2測定極3上の保
持層に、第1測定極2のコレステロールオキシダーゼに
相当する量のたんぱく質を保持させることにより、ま
た、第2実施例における第4測定極21上に、第3測定
極20のリポプロテインリパーゼに相当する量のたんぱ
く質を保持させることにより、第2測定極3上の保持層
にコレステロールオキシダーゼがないことによる第1測
定極2との試料反応時の粘性の違いや、第4測定極20
上にリポプロテインリパーゼがないことによる第3測定
極20との試料反応時の粘性の違いを補完してもよく、
このように構成することにより測定精度はさらに高ま
る。
ステロール測定用センサは、絶縁性基板上に少なくとも
測定極と対極とを有する電極系を形成し、酵素、電子受
容体及び試料液の反応時の物質濃度変化を電気化学的に
前記電極系で検知し前記試料液の基質濃度を測定するセ
ンサにおいて、前記測定極上に、リポプロテインリパー
ゼ、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキ
シダーゼ及び界面活性剤を保持し、かつ、試料液が通過
可能な保持体を載置して第1層を形成し、前記対極上
に、界面活性剤を保持し、かつ、試料液が通過可能な保
持体を載置して第2層を形成しているので、測定精度を
落とすことなく、安価に簡単に製造することができ、か
つ、品質のバラツキが極めて少ないコレステロール測定
用センサを提供することが可能になるという効果を奏す
る。また、前記第1層にリポプロテインリパーゼ、コレ
ステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ
を保持し、かつ、試料液が通過可能な保持体で形成され
た酵素反応層と、界面活性剤を保持し、かつ、試料液が
通過可能な保持体で形成された界面活性剤保持層とで形
成することにより、測定極と対極とに共通に必要な界面
活性剤を保持する処理層を一体化することが可能にな
り、製造及び組み立て工程をより簡略化することができ
るようになるという効果を奏する。さらに、前記酵素反
応層に、コンジュゲートリリースパッドを用いることに
より、酵素反応層に試料液が導入された際、試薬を速や
かに遊離し、反応終了までの時間が大幅に短縮するとい
う効果を奏する。また、絶縁性基板上の前記対極を挟ん
で前記測定極と対応する位置に第2測定極を設け、前記
第2測定上に、コレステロールオキシダーゼを含有して
いないこと以外は、前記測定極と同一の条件の層を、前
記測定極と同一条件で設けることで、コレステロール濃
度に依存する目的の電流のみを正確に測定することが可
能になり、より測定精度を向上させることができるよう
になるという効果を奏する。さらに、試料液を前記測定
極と前記第2測定極との中間位置に導入できるように、
試料液の滴下位置を制限可能な案内手段を設けること
で、使用者が試料液の滴下位置を意識する必要がなくな
るので、測定が簡単に行えるようになるという効果を奏
する。
第一実施例の展開図
組立完成品の部分断面図
中央横断面図
ンサを用いたコレステロール濃度の測定結果を示すグラ
フである。
構造を適用したコレステロール及び中性脂肪測定用セン
サの展開図である。
センサを用いたコレステロール濃度の測定結果を示すグ
ラフであり、(b)は同センサを用いた中性脂肪濃度の
測定結果を示すグラフである。
各処理層の組合せの別の実施例を示す概略図
各処理層の組合せの別の実施例を示す概略図
の各処理層の組合せの別の実施例を示す概略図
用) 8 酵素反応層(コレステロール測定用の第2測定極
用) 9 界面活性剤保持層 10 界面活性剤及び電子受容体保持層 12 カバー 12a 上壁 12b 上壁の内面 12c 凹部 12d 開口(試料液滴下用) 12e 前壁 12f 切り欠き 20 第3測定極(中性脂肪測定用) 20a 測定部分 20b 端子部分 21 第4測定極(中性脂肪測定用) 21a 測定部分 21b 端子部分 22 酵素反応層(中性脂肪測定用) 23 酵素反応層(中性脂肪測定用) 24 血球分離膜
Claims (10)
- 【請求項1】 絶縁性基板上に少なくとも測定極と対極
とを有する電極系を形成し、酵素、電子受容体及び試料
液の反応時の物質濃度変化を電気化学的に前記電極系で
検知し前記試料液の基質濃度を測定するセンサにおい
て、 前記測定極上に、リポプロテインリパーゼ、コレステロ
ールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ及び界
面活性剤を保持し、かつ、試料液が通過可能な保持体を
載置して第1層を形成し、 前記対極上に、界面活性剤を保持し、かつ、試料液が通
過可能な保持体を載置して第2層を形成したことを特徴
とするコレステロール測定用センサ。 - 【請求項2】 前記第1層が、 リポプロテインリパーゼ、コレステロールエステラー
ゼ、コレステロールオキシダーゼを保持し、かつ、試料
液が通過可能な保持体で形成された酵素反応層と、 界面活性剤を保持し、かつ、試料液が通過可能な保持体
で形成された界面活性剤保持層とから形成されているこ
とを特徴とする請求項1に記載のセンサ。 - 【請求項3】 前記酵素反応層を構成する保持体をコン
ジュゲートリリースパッドで形成したことを特徴とする
請求項2に記載のセンサ。 - 【請求項4】 測定極上に前記酵素反応層を、前記酵素
反応層上に前記界面活性剤保持層を順次積層してなるこ
とを特徴とする請求項2又は3に記載のセンサ。 - 【請求項5】 前記界面活性剤保持層と前記第2層とが
一つの保持体で形成されていることを特徴とする請求項
4に記載のセンサ。 - 【請求項6】 前記第1層を構成する界面活性剤層が、
コレステロールオキシダーゼを触媒としてコレステロー
ルと反応する電子受容体を保持していることを特徴とす
る請求項1〜5の何れか一項に記載のセンサ。 - 【請求項7】 前記電子受容体保持層が、前記第1層と
第2層とに跨って載置されることを特徴とする請求項6
に記載のセンサ。 - 【請求項8】 前記電子受容体が、フェリシアンイオン
であることを特徴とする請求項6又は7に記載のセン
サ。 - 【請求項9】 絶縁性基板上の前記対極を挟んで前記測
定極と対応する位置に第2測定極を設け、 前記第2測定上に、コレステロールオキシダーゼを含有
していないこと以外は、前記測定極と同一の条件の層
を、前記測定極と同一条件で設けたことを特徴とする請
求項1〜8の何れか一項に記載のセンサ。 - 【請求項10】 試料液を前記測定極と前記第2測定極
との中間位置に導入できるように、試料液の滴下位置を
制限可能な案内手段を設けたことを特徴とする請求項9
に記載のセンサ。
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