JP2001292763A

JP2001292763A - 耐熱性乳酸菌の調製方法

Info

Publication number: JP2001292763A
Application number: JP2000111710A
Authority: JP
Inventors: Atsushi Kotani; 篤史小谷; Yuki Nakano; 雄喜中野
Original assignee: House Foods Corp
Current assignee: House Foods Corp
Priority date: 2000-04-13
Filing date: 2000-04-13
Publication date: 2001-10-23

Abstract

(57)【要約】【課題】従来より一層高い耐熱性を有する乳酸菌を調
製する方法、及びかかる乳酸菌を高収率で得る方法を提
供すること。【解決手段】有胞子性乳酸菌バチラスコアギュラン
スをｐＨ５．０〜６．９の培地で培養することを特徴と
する耐熱性乳酸菌バチラスコアギュランスの調製方
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、従来のものに比べ
て一層耐熱性に優れた胞子を形成することができる有胞
子性乳酸菌バチラスコアギュランス(Bacillus coagul
ans)を、高収率で調製する方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】乳酸菌は腸内有用菌で、食品等に入れて
摂取すれば、つまり、乳酸菌を生きた状態で腸内まで運
べれば健康によいことが知られている。しかしながら、
乳酸菌を食品に添加し、生きた状態で腸内に運ぶことが
できる食品を実用化するに当たっては、次のような問題
がある。（１）乳酸菌は本来耐熱性がなく、食品の製造時あるい
は調理時の加熱処理時に死滅してしまう。（２）食品中
に水分が多く含まれている場合には、添加した乳酸菌は
保存中に発酵を開始して死滅してしまう。（３）乳酸菌
に胞子を形成させると耐熱性が向上するので、乳酸菌の
胞子を用いた製剤の製造方法が公知である（特公昭３６
−１８２４８号公報）。しかしながら、この公報に記載
の方法により製造した製剤を食品の製造の際に用いて
も、食品を、例えば、９８℃程度で２０〜７０分間程度
の加熱処理した場合には、乳酸菌が死滅してしまう。ま
た、本願発明者らの特開平１１−７５８２９号公報に
は、上記先行技術のものに比べてより耐熱性に優れた乳
酸菌が開示されている。加熱調理する食品に入れて摂取
する場合等には、更に耐熱性の向上した乳酸菌が求めら
れており、また、そのような乳酸菌を高収率で調製でき
る方法が得られれば商業的見地からも望ましい。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、従来より一
層高い耐熱性を有する乳酸菌を調製する方法、及びかか
る乳酸菌を高収率で得る方法を提供することを目的とす
る。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、特定の乳酸菌
を培養する際に、その培地を特定のｐＨに保持すること
により、上記課題を効率的に解決することができるとの
知見に基づくものである。即ち、本発明は、有胞子性乳
酸菌バチラスコアギュランスをｐＨ５．０〜６．９の
培地で培養することを特徴とする耐熱性乳酸菌バチラス
コアギュランスの調製方法を提供するものである。ま
た、本発明は、有胞子性乳酸菌バチラスコアギュランス
を糖類を含有する培地で培養し、培地中の糖類が枯渇し
た後、ｐＨ５．０〜６．９下で培養を継続することを特
徴とする耐熱性乳酸菌バチラスコアギュランスの調製方
法を提供する。

【０００５】

【発明の実施の形態】本発明において用いる有胞子性乳
酸菌バチラスコアギュランス(Bacillus coagulans)
は、特定の菌株に限定されることはないが、例えば、三
共株式会社製の有胞子性乳酸菌（ラクリス菌）製剤から
単離した菌、及び乳酸菌バチラスコアギュランスＣ０
０１であってもよい。尚、上記乳酸菌バチラスコアギ
ュランスＣ００１は、通商産業省工業技術生命工学工業
技術研究所に平成９年６月３日付けでＦＥＲＭＢＰ−
５９５８として寄託されている。また、培養時の種菌に
は、凍結保存されたバチラスコアギュランス芽胞を用
いてもよく、あるいは事前に液体培地にて発芽させたバ
チラスコアギュランス栄養菌体を用いてもよい。種菌
は、通常、培地に１０²〜１０⁹程度、より好ましくは１
０⁵〜１０⁷程度の濃度になるように植菌するのが好まし
いが、本発明において、種菌の初期濃度は特に限定され
る訳ではない。本発明では、上記有胞子性乳酸菌バチラ
スコアギュランスを、ｐＨが５．０〜６．９の培地で
培養することを必須とする。通常は、培養が進行するに
つれ、培地のｐＨが大きく変動するが、本発明において
は、培地のｐＨを上記範囲に調整する。培地のｐＨは、
好ましくは５．５〜６．５とするのがよく、より好まし
くは５．８〜６．０である。このような培地中のｐＨ調
整は、アルカリ（例えばＮａＯＨ水溶液等）及び酸（例
えばＨＣｌ水溶液等）を用いて行うことができる。ある
いは、緩衝剤、例えばモルホリノエタンスルホン酸（Ｍ
ＥＳ）バッファーを用いてｐＨ調整を行うこともでき
る。アルカリ及び酸を用いてｐＨを調整する場合には、
例えば、それらを、培養の進行に伴うｐＨの変動時に滴
下することにより行うことができる。この際のｐＨ調整
は、例えば、ｐＨコントローラ（丸菱バイオエンジ社製
ＭＤＬ−６Ｃ）を用いて行うことができる。ここで、ｐ
Ｈ調整は、培地中の糖類が枯渇した後に行うのが望まし
いが、糖類の枯渇前から行ってもよい。また、ＭＥＳバ
ッファー等の緩衝剤を用いてｐＨ調整を行う場合には、
それらを培養前に添加することで培養中の培地のｐＨを
調整することができる。このようなｐＨ調整により上記
有胞子性乳酸菌の耐熱性を向上させることができる。ま
た、上記培養に用いる培地は、糖類を、好ましくは０．
０５〜２．５質量％（以下、％と略称する）、より好ま
しくは０．１〜１．５％、酵母エキスを、好ましくは
０．１〜２．５％、より好ましくは０．１〜１．５％、
マンガン塩を、好ましくは１０〜５００ｐｐｍ、より好
ましくは１０〜１００ｐｐｍ、及び／又はカルシウム塩
を、好ましくは１０〜５００ｐｐｍ、好ましくは１０〜
１００ｐｐｍ含有し、残部が水である液体培地であるの
がよい。また、糖類としては還元糖（例えばグルコー
ス）、マンガン塩としては硫酸マンガン及び塩化マンガ
ン、並びに、カルシウム塩としては、塩化カルシウム、
炭酸カルシウム及びリン酸カルシウムが好適に例示さ
れ、還元糖が好ましい。尚、マンガン塩とカルシウム塩
の両方を含有する培地を用いるのが好ましい。また、本
発明においては、従来より一層多くの糖類を含む培地で
培養することができ、これにより調製される菌の収率を
高めることができる。培養温度は、３５〜５５℃とする
のが好ましく、より好ましくは４５〜５５℃、最も好ま
しくは約５０℃である。培養時間は、１２〜４８時間で
あるのが好ましく、より好ましくは２０〜４８時間、最
も好ましくは約２４時間である。尚、本発明では、上記
培養の際、培地に含まれる糖類が生菌により消費され、
枯渇して以降のｐＨ調整時間に注目した場合、糖類が枯
渇して以後少なくとも４時間以上、好ましくは４〜４８
時間、より好ましくは４〜２４時間、培養を継続するの
がよい。

【０００６】本発明では、上記培養で耐熱性を付与する
前に、酵母エキスとグルコースとを含有する液体培地で
増殖させておく前工程を設けるのが商業的見地から好ま
しい。前工程は、常法通り行うことができるが、前工程
に用いる培地としては、酵母エキスを、好ましくは０．
０５〜１％、より好ましくは０．５％、グルコースを、
好ましくは０．０５〜１％、より好ましくは０．５％含
有し、残部が水である液体培地を用いるのが好ましい。
培養温度は、３０〜６５℃が好ましく、より好ましくは
４５〜５５℃、最も好ましくは約５０℃である。培養時
間は、好ましくは６〜２４時間であり、より好ましくは
８〜１２時間である。

【０００７】本発明の方法により得られる有胞子性耐熱
性乳酸菌の耐熱性に関しては、例えば、１０２℃で３０
分間放置した後の生存率が５．０％以上、好ましくは
７．０％以上、より好ましくは９．０％以上であるのが
よい。耐熱性は、水系中、より具体的にはリン酸緩衝液
中でのものが基準となる。尚、耐熱性は、ＴＤＴタンク
法で評価することができる。即ち、ＴＤＴタンク内に試
料を入れて一定温度で保持し、経時的に（例えば１０分
毎に）タンク内の試料をサンプリングし、試料中の生菌
数を標準寒天培地（ニッスイ社製）を用い、４５℃、４
８時間培養することにより測定することができる。ま
た、収率に関しては、本発明の方法においては、１０⁷
／ｍｌ以上となるのが好ましく、より好ましくは１０⁸
／ｍｌ以上、更に好ましくは１０⁹／ｍｌ以上である。

【０００８】本発明では、上記方法により得た有胞子性
耐熱性乳酸菌を、食品、医薬品等に含有させることがで
きるが、特に、胞子の状態で含有させるのがよい。本発
明の製造方法により得られた有胞子性耐熱性乳酸菌を含
有させることができる食品としては、特に限定される訳
ではないが、例えば、ルウ、麺類、調味料（各種料理の
調味ベースを含む）、菓子等を例示することができる。
また、ルウとしては、カレールウ、シチュールウ、ハヤ
シルウ、ハッシュドビーフルウ、ビーフストロガノフル
ウ等を例示することができる。これらの製品は、固形
状、粉末状、顆粒状、ペースト状、液状等のいずれの形
態であってもよい。

【０００９】次に、上記ルウのうち、固形ルウを一例と
して、本発明の有胞子性耐熱性乳酸菌を含有する食品の
製造方法を説明する。まず、小麦粉と食用油脂を加熱混
合して小麦粉ルウを得る。この場合の加熱条件は、温度
が１００〜１３０℃で時間が３０〜６０分間を例示でき
る。得られた小麦粉ルウに、小麦粉、コーンスターチ、
食塩、グラニュー糖、粉乳、各種調味料、各種香料等の
粉体原料や各種エキス類、各種ペースト類、各種香味
油、乳化剤等の液体原料を添加混合し、８５〜１２０℃
程度に加熱し、攪拌（加熱攪拌工程）してルウを得る。
ルウの最終形態が固形状、粉末状、顆粒状、ペースト
状、液状等によって、上記原料組成等を適宜調整する。
例えば、ルウの最終形態が固形状の場合は、食用油脂は
硬化油を使用することになり、得られたルウは適宜容器
に充填され、冷却することによって、成形された固形ル
ウを得ることになる。

【００１０】上記した固形ルウの場合、本発明の方法に
より得られた有胞子性耐熱性乳酸菌は、加熱攪拌工程前
のいずれかの段階で添加する。従って、上記原料のいず
れに添加してもよく、あるいは上記各原料を混合する時
点で添加してもよいが、芽胞乳酸菌の生存率を高く維持
するためには水との接触が少ない粉体原料に添加するの
が好ましい。また、製造時の乳酸菌の加熱によるダメー
ジを回避するために、加熱工程のできるだけ後段に添加
するのが好ましい。このようにして、芽胞乳酸菌を含有
する固形ルウを得ることができる。尚、有胞子性耐熱性
乳酸菌のルウへの添加量は任意とすることができるが、
ルウ全体に対して０．０００５〜０．００５重量％程度
添加するのがよい。このようにして得たルウを用いて、
調理済食品を提供することができる。このような調理済
食品としては、カレーライス、カレーシチュー、カレー
ソース、シチュー、ハヤシライス、ハッシュドビーフ及
びビーフストロガノフ等が挙げられる。

【００１１】以上のように、本発明の方法により得られ
た有胞子耐熱性乳酸菌を用いることにより、該乳酸菌を
含有する各種食品、医薬品（例えば腸整用医薬等）を提
供することができるが、食品等が次のような形態である
のが特に好ましい。即ち、食品等が、ｐＨ７以下で、水
分活性０．８８以下、また、ｐＨ４以下で、水分活性
０．９６以下（共に３５℃において）のものであること
が望ましい。これらにより、保存中の乳酸菌の発酵を抑
止し、摂食時まで製品中に乳酸菌を維持できるからであ
る。また、食品等が摂食時に加熱するもの、例えば、前
記のルウを用いた食品、麺類、料理用の調味ベース等の
場合には、上記加熱の際における乳酸菌の死滅を抑え、
より多くの乳酸菌を生きた状態で摂食することが可能と
なる。

【００１２】

【発明の効果】本発明によれば、有胞子性乳酸菌の耐熱
性を向上させることができ、また、有胞子性乳酸菌の培
養時の収率を顕著に高めることが可能となる。

【００１３】

【実施例】実施例１１）種菌の調整（前工程）下記の成分を１リットルの水に溶解して調整して増殖用
培地を調製した。上記培地１０ｍｌを１００ｍｌの三角フラスコに分注
し、殺菌後、三共株式会社製の有胞子性乳酸菌（ラクリ
ス菌）製剤から単離したバチラスコアギュランスを１
白金耳接種し、５０℃にて１２時間振とう培養し、さら
に上記培地４００mlを２リットルのフラスコに分注し、
殺菌したものに先の培養物を全て植え継ぎ、５０℃にて
１２時間振とう培養したものを種菌とした。

【００１４】２）耐熱性の付与酵母エキス５ｇ、グルコース１ｇ、ＣａＣｌ₂５０ｐｐ
ｍ、ＭｎＳＯ₄５０ｐｐｍ及びモルホリノエタンスルホ
ン酸（ＭＥＳ）バッファー１００ｍＭを水１リットルに
溶解して、増殖及び芽胞形成用培地（ｐＨ５．９）を作
成した。前記培地１０ｍｌを１００ｍｌの三角フラスコ
に分注し、オートクレーブにて１２１℃で１５分間の条
件下で加熱加圧殺菌した。その後、この培地中に、上記
種菌を１０ ⁶／ｍｌの濃度で植菌した。種菌の植菌後、
５０℃にて２０〜４８時間、１００ｒｐｍの振とう条件
で、振とう培養を行った。尚、培養中の培地のｐＨは
５．９±０．５の範囲内に維持されていた。上記培養方
法における収率は、２．０×１０⁸／ｍｌであった。得
られた有胞子性耐熱性乳酸菌バチルスコアギュランス
の耐熱性をＴＤＴタンク法により、１０２℃のリン酸緩
衝液中での生菌数（個）を経時的に測定した。即ち、上
記方法により得られた試料をＴＤＴタンク内に入れて１
０２℃で保持し、３分毎にタンク内の試料をサンプリン
グし、試料中の生菌数を標準寒天培地（ニッスイ社製）
を用い、３５℃、４８〜７２時間培養することにより測
定した。結果は次の通りである。

【００１５】尚、測定開始時の菌数は６．０×１０⁵個であった。以
上から、本発明の方法により得られた有胞子性乳酸菌
は、顕著に高い耐熱性を有することが分かった。

【００１６】比較例１ＭＥＳバッファーを用いずに培地を作成した以外は、実
施例１と同様にして前工程及び耐熱性付与工程、並びに
耐熱性測定を行った。結果は次の通りである。尚、培養
中の培地のｐＨは４．６〜８．０の範囲で変動した。尚、測定開始時の菌数は６．２×１０³個であった。

【００１７】比較例２実施例１で用いた三共株式会社製の有胞子性乳酸菌自体
の耐熱性測定を、実施例１と同様の方法により行った。
結果は次の通りである。（Ｎ．Ｄ＝検出できず）尚、測定開始時の菌数は７．８×１０²個であった。

【００１８】実施例２１）種菌の調整（前工程）実施例１に記載したと同様にして種菌を得た。２）耐熱性の付与水１リットルに対して、酵母エキス１５ｇ、グルコース
１５ｇ、ＣａＣｌ₂５０ｐｐｍ及びＭｎＳＯ₄５０ｐｐｍ
を溶解させて、増殖及び芽胞形成用培地１．２リットル
を、２リットルのジャーファーメンターにて作成した。
その後、これを、オートクレーブを用いて、１２１℃で
２０分間の条件下で加熱加圧殺菌した。このようにして
製造した培地に、実施例１記載の菌体を１０⁶／ｍｌの
濃度で植菌した。種菌の植菌後、５０℃にて２０〜４８
時間、３００〜１０００ｒｐｍ、通気条件０．２リット
ル／分で通気撹拌培養を行った。尚、培養中の培地のｐ
Ｈは、ＮａＯＨ水溶液及びＨＣｌ水溶液を用いて５．９
±０．５の範囲内で制御した。上記培養方法における収率は、３．１×１０⁹／ｍｌで
あった。以上から、本発明によれば、従来より一層高い
収率で、かつ、商業的規模で、有胞子性耐熱性乳酸菌を
調製することができることが分かった。

【００１９】比較例３ＮａＯＨ水溶液及びＨＣＬ水溶液を用いなかった、即
ち、培養中の培地のｐＨを制御しなかった以外は、実施
例２と同様にして培養を行った。この培養方法において
有胞子性耐熱性乳酸菌は調製することができなかった。

【００２０】実施例３１）菌学的性質の確認実施例１及び２で得られた本発明の有胞子性乳酸菌の菌
学的性質を確認したところ、次の結果が得られた。（１）菌の形態（２）生理学的性質

【００２１】２）菌学的性質における従来の菌との差異公知菌であるバチルスコアギュランス (IFO No.1258
3:下記の表ではＡとして示す）と実施例１及び２で得ら
れた有胞子性耐熱性乳酸菌バチルスコアギュランス
（下記の表ではＢとして示す）の菌学的性質の差異につ
いて、ミニテックの試験法に基づく実験を行った。結果
は次の通りである。

【００２２】

【表１】

【００２３】上記試験結果から、 Bergey's Manual of
Systematic Biologyに基づき、実施例１及び２で得られ
た有胞子性耐熱性乳酸菌バチルスコアギュランスが、
乳酸菌バチラスコアギュランス(Bacillus coagulans)
であることを確認した。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】有胞子性乳酸菌バチラスコアギュラン
スをｐＨ５．０〜６．９の培地で培養することを特徴と
する耐熱性乳酸菌バチラスコアギュランスの調製方
法。
【請求項２】有胞子性乳酸菌バチラスコアギュラン
スを糖類を含有する培地で培養し、培地中の糖類が枯渇
した後、ｐＨ５．０〜６．９下で培養を継続することを
特徴とする耐熱性乳酸菌バチラスコアギュランスの調
製方法。
【請求項３】糖類が枯渇した後の培養を少なくとも４
時間以上行う請求項２記載の調製方法。
【請求項４】培養を行う培地が液体培地である請求項
１又は２記載の調製方法。
【請求項５】ｐＨの調整を、アルカリ及び酸、又は緩
衝剤を用いて行う請求項４記載の調製方法。
【請求項６】培養に用いる培地として、糖類を０．０
５〜２．５質量％含有する培地を用いる請求項１又は２
記載の調製方法。
【請求項７】請求項１〜６のいずれか１項記載の培養
を行う前に、有胞子性乳酸菌バチラスコアギュランス
を酵母エキスとグルコースを含有するｐＨ５．０〜６．
９の培地で増殖させる前工程を設ける請求項１〜６のい
ずれか１項に記載の調製方法。
【請求項８】有胞子性乳酸菌がバチラスコアギュラ
ンスＣ００１（国際寄託番号：ＦＥＲＭＢＰ−５９５
８）である請求項１又は２記載の調製方法。