JP2001245665A - Alkali xylanase and method for producing the same - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain an alkali xylanase having a bleaching action on a pulp under an alkali condition of pH >=9.5 and to provide a method for producing the same. SOLUTION: This alkali xylanase is characterized in that the alkali xylanase comprises an amino acid sequence represented by a sequence number 1 (reference to the specification) or an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence and has a bleaching action on a pulp under an alkali condition of pH >=9.5. This method for producing the alkali xylanase is provided. This method for bleaching a pulp using the alkali xylanase is provided.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なアルカリ性
キシラナーゼ、その製造方法及びその用途、アルカリ性
キシラナーゼをコードするＤＮＡ、並びにアルカリ性キ
シラナーゼを生産する微生物に関する。The present invention relates to a novel alkaline xylanase, a method for producing the same and its use, a DNA encoding the alkaline xylanase, and a microorganism producing the alkaline xylanase.

【０００２】[0002]

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】キシ
ラナーゼはキシランを分解する酵素であり、製紙用パル
プの漂白前処理用酵素として、又は機能性キシロオリゴ
糖の製造用として用いられる有用酵素である。Viikari
ら（3rd International Conference on Biotechnology
in the Pulp and Paper Industry 1986年講演要旨集 p.
67）がキシラナーゼによりクラフトパルプの漂白性が向
上すること報告して以来、紙パルプ産業において漂白用
にキシラナーゼが利用されている。パルプ製造工程中に
はクラフト蒸解や漂白工程等のアルカリ性条件下で処理
する工程が多いことから、これらの工程中で効率よくキ
シラナーゼを用いるにあたっては耐熱性があり、かつア
ルカリ性で作用することが可能なキシラナーゼが求めら
れている。蒸解後の漂白工程ではその全工程が６０℃以
上の高温で実施されているため、至適温度の低い酵素で
はその失活をできる限り防止するためパルプ漂白工程中
での温度の調節が煩雑となり、よってコストがかかるた
め、６０℃以上の高温で安定に作用する酵素が望まれて
きた。また中性や酸性のキシラナーゼを用いると、ｐＨ
調整のための酸添加に伴い、ｐＨ調整、イオウバランス
の調整など操業上の繁雑な作業が必要になり、またパル
プの洗浄効果の悪化をきたすという問題がある。これに
対しアルカリ性キシラナーゼを用いることで、アルカリ
性でのパルプ処理が可能になるために操業がやりやすく
なり、またパルプの洗浄強化につながるという利点があ
る。2. Description of the Related Art Xylanase is an enzyme that degrades xylan, and is a useful enzyme used as a pretreatment for bleaching pretreatment of paper pulp or for producing a functional xylo-oligosaccharide. Viikari
(3rd International Conference on Biotechnology
in the Pulp and Paper Industry 1986 Abstracts p.
Xylanases have been used for bleaching in the pulp and paper industry since 67) reported that xylanase improves the bleachability of kraft pulp. Since many pulp production processes involve treatment under alkaline conditions such as the kraft digestion and bleaching processes, efficient use of xylanase in these processes is heat-resistant and can act in alkaline Xylanase is required. In the bleaching process after digestion, the entire process is carried out at a high temperature of 60 ° C. or higher, so that the temperature control during the pulp bleaching process becomes complicated in order to prevent the inactivation of enzymes having a low optimum temperature as much as possible. Therefore, an enzyme that can act stably at a high temperature of 60 ° C. or more has been desired because of the high cost. When neutral or acidic xylanase is used, pH
Along with the addition of acid for adjustment, complicated operations such as pH adjustment and sulfur balance adjustment are required, and the pulp washing effect is deteriorated. On the other hand, by using alkaline xylanase, there is an advantage that pulp treatment can be performed in an alkaline condition, so that the operation can be easily performed, and that washing of pulp is strengthened.

【０００３】一方、微生物の有する酵素生産能力が高い
方が酵素製造のコストダウンに有利であることは自明で
ある。そこで、耐熱アルカリ性キシラナーゼ酵素を高生
産する微生物が求められている。キシラナーゼを生産す
る微生物としてはキシラナーゼの総説（Wong et al.,Mi
crobiological Reviews, Sept.,305,1988）等によれ
ば、アスペルギルス（Aspergillus）属、トリコデルマ
（Trichoderma）属、アウレオバシデウム（Aureobasidi
um）属、スエヒロタケ（Schizophyllum commune）等の
糸状菌、バチルス（Bacillus）属やクロストリジウム
（Clostridium）属、ストレプトミセス（Streptomyce
s）属等の細菌類等数多くの微生物が知られている。そ
して、これらの微生物から生産されるキシラナーゼの反
応ｐＨは酸性〜中性、反応温度は40℃〜80℃である。ま
た、アルカリ側のｐＨ域で活性を有するアルカリ性キシ
ラナーゼを生産する微生物も知られており、例えば、バ
チルス（Bacillus）属（Honda et al., System. Appl.
Microbiol., 8, 152, 1986, Okazaki et al., Appl. M
icrobiol. Biotechnol., 19, 335, 1984）、アエロモナ
ス（Aeromonas）属（Ohkoshi et al.,Agric.Biol.Che
m.,49,3037,1985）又はストレプトミセス（Streptomyce
s）属（Vyas et al., Biotechnol. Let.,12,225,1990）
に属する微生物等が知られている。On the other hand, it is obvious that a microorganism having a higher enzyme-producing ability is advantageous in reducing the cost of enzyme production. Thus, there is a need for a microorganism that highly produces a thermostable alkaline xylanase enzyme. As a microorganism that produces xylanase, a review of xylanase (Wong et al., Mi
According to crobiological Reviews, Sept., 305, 1988), Aspergillus, Trichoderma, Aureobasidi.
um) genus, filamentous fungi such as Schizophyllum commune, genus Bacillus and genus Clostridium, and Streptomyce
s) Many microorganisms such as bacteria of the genus are known. The reaction pH of xylanase produced from these microorganisms is acidic to neutral, and the reaction temperature is 40 ° C to 80 ° C. Microorganisms that produce alkaline xylanase having activity in the alkaline pH range are also known. For example, the genus Bacillus (Honda et al., System. Appl.
Microbiol., 8 , 152, 1986, Okazaki et al., Appl. M
Biotechnol., 19 , 335, 1984), the genus Aeromonas (Ohkoshi et al., Agric. Biol. Che)
m., 49 , 3037, 1985) or Streptomyce.
s) Genus (Vyas et al., Biotechnol. Let., 12 , 225, 1990)
Are known.

【０００４】これらのキシラナーゼを生産する微生物の
うち糸状菌では、キシラナーゼの他にセルラーゼを生産
するものが多く、紙パルプ製造工程に使用する上で紙の
収率や強度の低下をきたす恐れがある等の問題点があ
る。しかも、糸状菌は細菌に比べて培養期間が長い。ま
た、細菌ではキシラナーゼ生産性が低いという問題点が
ある。[0004] Among these microorganisms that produce xylanase, many filamentous fungi produce cellulase in addition to xylanase, which may cause a decrease in paper yield and strength when used in the paper pulp production process. And so on. Moreover, filamentous fungi have a longer culture period than bacteria. In addition, bacteria have a problem that xylanase productivity is low.

【０００５】近年、Viikari らは、耐アルカリ性のバチ
ルス・サーキュランス（Bacillus circulans）VTT-E-87
305 株を用い、ｐＨ８〜8.5、30℃、２日間の培養で高
収量（400U/ml）のキシラナーゼを生産したことを報告
している（Appl. Microbiol.Biotechnol., 37, 470, 19
92）。しかし、この酵素についての耐熱性やパルプ漂白
の促進効果は明らかでない。[0005] In recent years, Viikari et al. Have proposed an alkali-resistant Bacillus circulans VTT-E-87.
It has been reported that high yield (400 U / ml) of xylanase was produced by culturing strain 305 at pH 8 to 8.5 at 30 ° C. for 2 days (Appl. Microbiol. Biotechnol., 37 , 470, 19).
92). However, the heat resistance and pulp bleaching promoting effect of this enzyme are not clear.

【０００６】バチルス属に属する微生物の生産するアル
カリ性キシラナーゼの精製については、好アルカリ好熱
性バチルスＷ−１およびＷ−２から、分子量21,500、等
電点8.5、反応至適ｐＨ6.0、反応至適温度65℃のＷ１−
Ｉ耐熱性キシラナーゼ、及び、分子量22,500、等電点8.
3、反応至適ｐＨ6.0、反応至適温度65℃のＷ２−Ｉ耐熱
性キシラナーゼがそれぞれ報告されている（Okazaki et
al.,Agric.Biol.Chem.,49,2033,1985）。[0006] Purification of alkaline xylanase produced by a microorganism belonging to the genus Bacillus is carried out from an alkaliphilic thermophilic Bacillus W-1 and W-2, a molecular weight of 21,500, an isoelectric point of 8.5, an optimal reaction pH of 6.0 and an optimal reaction of 6.0. W1- at a temperature of 65 ° C
I thermostable xylanase and molecular weight 22,500, isoelectric point 8.
3. W2-I thermostable xylanase with an optimum reaction pH of 6.0 and an optimum reaction temperature of 65 ° C has been reported (Okazaki et al.
al., Agric. Biol. Chem., 49 , 2033, 1985).

【０００７】また、好熱性バチルスとして知られるバチ
ルス・ステアロテルモフィルス（Bacillus stearotherm
ophilus)については、T.Nanmori らがStrain 21 の培養
濾液から分子量39,500、等電点5.1、反応至適ｐＨ7.0、
反応至適温度60℃の耐熱性キシラナーゼを精製し、生産
したことを報告している（J. Bacteriol., 172, 6669,
1990）。しかし、その生産量は55℃、２日間の培養で1.
96 U/ml に過ぎない。[0007] Bacillus stearothermophilus (Bacillus stearotherm) also known as thermophilic Bacillus
T. Nanmori et al. reported from the culture filtrate of Strain 21 that the molecular weight was 39,500, the isoelectric point was 5.1, the optimal pH was 7.0,
It has been reported that a thermostable xylanase with an optimal reaction temperature of 60 ° C was purified and produced (J. Bacteriol., 172 , 6669,
1990). However, its production volume is 55 ° C and it is 1.
It is only 96 U / ml.

【０００８】さらに、キシラナーゼの利用法について
は、パルプにキシラナーゼを作用させて漂白薬品やＡＯ
Ｘ（吸着性有機ハロゲン化合物、特に有機塩素化合物）
を低減させようとする試みが報告されている（例えば、
特開平2-210085号公報、特開平2-210086号公報、特開平
2-221482号公報、特開平2-264087号公報、特開平2-2934
86号公報、特開平3-40887 号公報、特開平3-505785号公
報、特開平6-101185号公報、特開平6-116889号公報、特
開平6-220786号公報、特開平7-3683号公報、特開平10-1
79155号公報、特開平10-204785号公報、特開平11-27996
8号公報、 L. S.Pedersonet al., Production of bleac
hed chemical pulp in the future international pulp
bleaching conference, Vol.2,107,1991、紙パルプ技
術タイムズ,5,20,1992、S. Hogman et al., Biotechnol
ogy in Pulp and Paper Industry,Uni Publishers Co.,
Ltd.,p.107,1992、Viikari et al., Biotechnology in
Pulp and Paper Industry, Uni Publishers Co.,Ltd.,
p.10,1992）。[0008] Further, regarding the use of xylanase, pulp is treated with xylanase to produce bleaching chemicals or AO.
X (adsorbable organic halogen compounds, especially organic chlorine compounds)
Attempts have been reported to reduce (eg,
JP-A No. 2-210085, JP-A No. 2-10086, JP-A No.
JP-A 2-221482, JP-A 2-264087, JP-A 2-2934
No. 86, JP-A-3-40887, JP-A-3-505785, JP-A-6-101185, JP-A-6-116889, JP-A-6-220786, JP-A-7-3683 Gazette, JP 10-1
No. 79155, JP-A-10-204785, JP-A-11-27996
No. 8 Gazette, LSPedersonet al., Production of bleac
hed chemical pulp in the future international pulp
bleaching conference, Vol. 2, 107, 1991, Pulp and Paper Technology Times, 5 , 20, 1992, S. Hogman et al., Biotechnol
ogy in Pulp and Paper Industry, Uni Publishers Co.,
Ltd., p.107,1992, Viikari et al., Biotechnology in
Pulp and Paper Industry, Uni Publishers Co., Ltd.,
p. 10,1992).

【０００９】しかし、これらの試みでは、紙パルプ製造
工程における漂白工程ではpH9.5以上のアルカリ性での
処理が必要とされる一方、その工程中に酵素処理を組み
込むために中性域〜酸性域で作用する酵素を使用しなけ
ればならないことも多く、この場合は、その反応至適ｐ
Ｈまで硫酸などの酸を添加してpH調整するという作業が
必要となり、操作が煩雑であった。また漂白中のパルプ
を中性域から酸性域にすると可溶性のリグニンやヘミセ
ルロースが不溶性となってパルプに付着するため洗浄が
悪くなるという欠点があった。[0009] However, in these attempts, the bleaching step in the paper pulp production step requires an alkaline treatment of pH 9.5 or more, while a neutral to acidic region is required to incorporate an enzyme treatment into the step. In many cases, it is necessary to use an enzyme that acts in the reaction.
An operation of adding an acid such as sulfuric acid to H to adjust the pH was required, and the operation was complicated. Further, when the pulp during bleaching is changed from a neutral region to an acidic region, soluble lignin and hemicellulose become insoluble and adhere to the pulp, so that there is a disadvantage that washing is deteriorated.

【００１０】従って、pH9.5以上のアルカリ性条件下で
作用し、しかも雑菌混入の可能性を少なくさせ、低コス
トで製造することが可能な酵素である耐熱アルカリ性の
キシラナーゼ生産菌が望まれてきた。さらに、遺伝子組
換え技術によりアルカリ性キシラナーゼをコードする遺
伝子を単離し、該遺伝子を発現させることによりキシラ
ナーゼを大量に得ることも望まれてきた。[0010] Therefore, a thermostable alkaline xylanase-producing bacterium, which is an enzyme that operates under alkaline conditions of pH 9.5 or higher and that can reduce the possibility of contamination by various bacteria and can be produced at low cost, has been desired. . Further, it has been desired to obtain a large amount of xylanase by isolating a gene encoding alkaline xylanase by a gene recombination technique and expressing the gene.

【００１１】キシラナーゼ遺伝子については現在までに
多数の報告がなされている。例えば、細菌由来のものに
ついてはバチルス・サーキュランス（Bacillus circula
ns;YANG R.C.A. et al., NUCLEIC ACIDS RES. 16:7187-
7187(1988)） 、バチルス・ズブチリス（Bacillus subt
ilis; PAICE M.G. et al., ARCH.MICROBIOL.144: 201-2
06(1986)） 、シュードモナス・フルオレッセンス (Pse
udomonas fluorescens; KELLETT L.E. et al., BIOCHE
M.J. 272: 369-376(1990)、特開平11-318474号公報) 、
ルミノコッカス・フラベファシエンス (Ruminococcus f
lavefaciens;ZHANG J.-X. et al., MOL.MICROBIOL. 6:1
013-1023(1992) などに由来する遺伝子が、カビ由来の
ものについてはクロストリジウム・アセトブチリカム
(Clostridium acetobutylicum; ZAPPE. et al., NUCLEI
C ACIDS RES. 18:2179-2179-(1990))、アスペルギルス
・アワモリ (Aspergillus awamori; ITO K. et al., BI
OSCI.BIOTECHNOL.BIOCHEM. 56:1338-1340(1992))、スト
レプトミセス・リビダンス(Streptomyces lividans; SH
ARECK F. et al., GENE 107:75-82(1991)) などに由来
する遺伝子が報告されている。さらに、これらのクロー
ニングしたキシラナーゼ遺伝子の塩基配列を人為的に変
えて、好アルカリ性や熱安定性の付与を試みる検討も行
われている（特開平10-179155号公報）。しかしなが
ら、これらの遺伝子を含む組換え体微生物により製造さ
れた酵素は、60℃以上の高温、ｐＨ9．5を越えるアルカ
リ性条件下で実質的にクラフトパルプ漂白に適したもの
であるか否かは明らかではない。このような条件に適し
た酵素はトリコデルマ・リーセイのキシラナーゼ（エコ
パルプTX-200）（特開平11-279968号公報）があるが、
この酵素もpH9.5を超えるpHでは中性域に比べて遥かに
活性が小さくなるため、同一効果を得るためには酵素の
添加量を大幅に増加する必要がある。Many reports on the xylanase gene have been made so far. For example, for those derived from bacteria, Bacillus circula
ns; YANG RCA et al., NUCLEIC ACIDS RES. 16: 7187-
7187 (1988)), Bacillus subt.
ilis; PAICE MG et al., ARCH.MICROBIOL.144: 201-2
06 (1986)), Pseudomonas fluorescens (Pse
udomonas fluorescens; KELLETT LE et al., BIOCHE
MJ 272: 369-376 (1990), JP-A-11-318474),
Ruminococcus frubefaciens (Ruminococcus f
lavefaciens; ZHANG J.-X. et al., MOL.MICROBIOL. 6: 1
013-1023 (1992) Clostridium acetobutylicum
(Clostridium acetobutylicum; ZAPPE. Et al., NUCLEI
C ACIDS RES. 18: 2179-2179- (1990)), Aspergillus awamori; ITO K. et al., BI
OSCI.BIOTECHNOL.BIOCHEM. 56: 1338-1340 (1992)), Streptomyces lividans; SH
Genes derived from ARECK F. et al., GENE 107: 75-82 (1991)) have been reported. Further, studies have been made to artificially change the base sequences of these cloned xylanase genes to impart alkaliphilicity and thermostability (Japanese Patent Laid-Open No. 10-179155). However, it is clear whether enzymes produced by recombinant microorganisms containing these genes are substantially suitable for kraft pulp bleaching at elevated temperatures of 60 ° C. or higher and alkaline conditions exceeding pH 9.5. is not. An enzyme suitable for such conditions is Trichoderma reesei xylanase (Ecopulp TX-200) (JP-A-11-279968).
Since the activity of this enzyme is much lower than that in the neutral region at a pH exceeding pH 9.5, it is necessary to greatly increase the amount of the enzyme to obtain the same effect.

【００１２】本発明者らの検討によれば、アルカリ性の
キシラナーゼは必ずしもパルプ漂白の能力があるとは限
らないため、アルカリ性で漂白能力が低い酵素の場合に
は酵素の使用量が多くなり、酵素のコストがかかりす
ぎ、また酵素自体の色がパルプの白色度に影響するた
め、このような酵素は実用上使用できるものではない。
したがって、実用上使用可能な酵素量をもって漂白を促
進できるアルカリ性キシラナーゼの開発が必要である。According to the study of the present inventors, since alkaline xylanase does not always have pulp bleaching ability, in the case of an enzyme which is alkaline and has low bleaching ability, the amount of enzyme used increases, However, such an enzyme is not practically usable because the cost of the enzyme is too high and the color of the enzyme itself affects the whiteness of the pulp.
Therefore, it is necessary to develop an alkaline xylanase capable of promoting bleaching with a practically usable amount of enzyme.

【００１３】[0013]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために、アルカリ性キシラナーゼ高生産菌に
ついて鋭意広範なスクリーニングを行なった結果、土壌
中からアルカリ性キシラナーゼを生産する微生物の培養
物中からpH9.5以上のアルカリ性条件でパルプ漂白を促
進する能力の高いアルカリ性キシラナーゼを見い出し、
更に該アルカリ性キシラナーゼをコードするＤＮＡをク
ローニングし高発現させることに成功し、本発明を完成
するに至った。Means for Solving the Problems In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have conducted extensive and extensive screening for alkaline xylanase-producing bacteria. As a result, cultures of microorganisms producing alkaline xylanase from soil were found. Find alkaline xylanase with high ability to promote pulp bleaching under alkaline conditions of pH 9.5 or more from inside,
Furthermore, the DNA encoding the alkaline xylanase was successfully cloned and highly expressed, thereby completing the present invention.

【００１４】すなわち、本発明を、以下に要約する。本
発明は、第1の態様において、配列番号１で表されるア
ミノ酸配列からなるか、または該アミノ酸配列において
１個もしくは数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加
を有するアミノ酸配列からなりかつpH9.5以上のアルカ
リ性条件下でパルプの漂白作用をもつことを特徴とする
アルカリ性キシラナーゼを提供する。ここで「数個」と
は、１5個以下、通常１０個以下、好ましくは７個以下、
さらに好ましくは５個以下を意味する。That is, the present invention is summarized below. In a first aspect, the present invention provides an amino acid sequence comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or comprising an amino acid sequence having one or several amino acid deletions, substitutions, or additions in the amino acid sequence and having a pH of 9 An alkaline xylanase having a pulp bleaching action under alkaline conditions of .5 or more. Here, "several" means 15 or less, usually 10 or less, preferably 7 or less,
More preferably, it means 5 or less.

【００１５】本発明のキシラナーゼは、上記条件での漂
白作用ならびにクラフトパルプの漂白薬品の使用量を削
減する作用を併せもつ。後者の作用は、漂白工程中のパ
ルプに酵素を作用させ、一定時間保温した後に続いて塩
素、二酸化塩素、次亜塩素酸、オゾン、過酸化水素など
の漂白薬品の使用量を目的白色度に到達させるために必
要な量を15％以上削減できることを意味する。漂白作用
の効果は次のように試験することによって判定できる。
すなわち蒸解後のパルプをpH9.5に調整してキシラナー
ゼ処理し、引き続いてパルプ濃度を10％(重量)に調整し
てアルカリを対パルプ0．15％(重量)、次亜塩素酸ソー
ダを対パルプ添加率0．5％(重量)で60℃、２時間処理
し、脱イオン水で3回洗浄後パルプの白色度を測定す
る。そしてこの測定によって得られた値を酵素処理した
場合と酵素処理しない場合と比較することにより、本発
明の酵素の漂白作用を評価することができる。本発明の
酵素は、pH9.5のアルカリ性条件下でのパルプの白色度
を1ポイント以上、好ましくは1．5ポイント以上、より好
ましくは2．5ポイント以上上昇させる特性を有する。The xylanase of the present invention has both a bleaching action under the above conditions and an action of reducing the amount of bleaching chemicals used in kraft pulp. In the latter case, the enzyme is allowed to act on the pulp during the bleaching process, and after keeping it for a certain period of time, the amount of bleaching chemicals such as chlorine, chlorine dioxide, hypochlorous acid, ozone, and hydrogen peroxide is adjusted to the target whiteness. This means that the amount needed to reach it can be reduced by more than 15%. The effect of the bleaching action can be determined by testing as follows.
That is, the digested pulp was adjusted to pH 9.5 and treated with xylanase. Subsequently, the pulp concentration was adjusted to 10% (weight) to adjust alkali to 0.15% (weight) and sodium hypochlorite to sodium. The pulp is treated at 60 ° C. for 2 hours at a pulp addition rate of 0.5% (weight), washed with deionized water three times, and the pulp whiteness is measured. Then, by comparing the value obtained by this measurement with the enzyme treatment and the case without the enzyme treatment, the bleaching action of the enzyme of the present invention can be evaluated. The enzyme of the present invention has the property of increasing the whiteness of pulp under alkaline conditions of pH 9.5 by 1 point or more, preferably 1.5 points or more, more preferably 2.5 points or more.

【００１６】アルカリ性キシラナーゼとして特表平8−5
07221号公報記載のアルカリ性キシラナーゼがあるがpH9
でのパルプの漂白作用は示されているもののpH9.5を超
えた場合の記載はない。また、特表平8−500485号公報
記載のアルカリ性キシラナーゼも知られているが、ここ
にはpH6.0、さらに好ましくは7．0を超えてパルプに作
用させ、その後の塩素化工程で塩素の使用量を0．2以下
とすると記載されているがpH9.5を超えるアルカリ条件
での漂白効果は記載がなく明らかでない。As an alkaline xylanase, Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-5
There is an alkaline xylanase described in JP 07221, pH 9
Although the bleaching action of pulp at pH 9.5 is shown, there is no description when pH exceeds 9.5. Further, an alkaline xylanase described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-500485 is also known, in which pulp is allowed to act on pulp at a pH of more than 6.0, and more preferably more than 7.0, and chlorine is then removed in a subsequent chlorination step. It is described that the amount to be used is 0.2 or less, but the bleaching effect under alkaline conditions exceeding pH 9.5 is not described because it is not described.

【００１７】近年酵素の製造は遺伝子工学を利用して大
量生産させる手法が多く用いられるようになり、酵素の
生産量は培地1Lあたり1gを超える場合もある。酵素の生
産量は重量で限界が決まるため、同一重量あたりの比活
性が高い方が好ましい。アルカリ性キシラナーゼとして
報告されているものはpH9を超えると急激に活性が低く
なる。遺伝子組換えでの酵素の製造を考慮するとpH9.5
での比活性が高いことが好ましいが、このような酵素は
これまで知られていない。In recent years, methods for producing enzymes in large quantities using genetic engineering have become widely used, and the amount of enzyme production sometimes exceeds 1 g per liter of medium. Since the production amount of the enzyme is limited by the weight, it is preferable that the specific activity per the same weight is high. Those reported as alkaline xylanase show a rapid decrease in activity above pH9. Considering the production of enzymes by genetic recombination, pH 9.5
It is preferred that the specific activity is high, but such an enzyme has not been known so far.

【００１８】本発明の上記酵素は、天然から単離された
ものであってもよいし、あるいは天然からの単離物を変
異して得られたものであってもよいし、あるいは遺伝子
組換えによって得られたものであってよい。ここで変異
処理とは、化学変異剤、紫外線等の照射などによる変
異、貯蔵の間の自然変異を意味する。The enzyme of the present invention may be one isolated from nature, one obtained by mutating an isolated product from nature, or one obtained by genetic recombination. May be obtained by Here, the mutation treatment means a mutation caused by irradiation with a chemical mutagen, ultraviolet rays or the like, and a natural mutation during storage.

【００１９】本発明の実施態様において、本発明のアル
カリ性キシラナーゼはバチルス・ハロデュランス#35株
（FERM P-17671）またはそれから誘導された変異株によ
って産生されるものである。本発明は、第2の態様にお
いて、上記定義のアルカリ性キシラナーゼをコードする
ＤＮＡを提供する。本発明の実施態様において、該ＤＮ
Ａは配列番号２のヌクレオチド配列58〜687を少なくと
も含む配列からなる。In an embodiment of the present invention, the alkaline xylanase of the present invention is produced by Bacillus halodurans strain # 35 (FERM P-17671) or a mutant derived therefrom. The present invention provides, in a second aspect, a DNA encoding an alkaline xylanase as defined above. In an embodiment of the present invention, the DN
A consists of a sequence containing at least the nucleotide sequences 58 to 687 of SEQ ID NO: 2.

【００２０】本発明は、第3の態様において、上記定義
のアルカリ性キシラナーゼを生産するバチルス（Bacill
us）属に属する微生物を培地に培養し、得られる培養物
から該アルカリ性キシラナーゼを採取することを含む、
アルカリ性キシラナーゼの製造方法を提供する。本発明
の実施態様において、該微生物はバチルス・ハロデュラ
ンス株、より具体的にはバチルス・ハロデュランス#35
株（FERM P-17671）またはその株から誘導される変異株
である。In a third aspect, the present invention relates to a Bacillus producing an alkaline xylanase as defined above.
us) culturing a microorganism belonging to the genus in a medium, and collecting the alkaline xylanase from the obtained culture.
Provided is a method for producing alkaline xylanase. In an embodiment of the invention, the microorganism is Bacillus halodurans strain, more specifically Bacillus halodurans # 35.
Strain (FERM P-17671) or a mutant derived from the strain.

【００２１】本発明は、第4の態様において、上記定義
のアルカリ性キシラナーゼを生産する能力を有する、バ
チルス・ハロデュランス#35株（FERM P-17671）または
その株から誘導される変異株を提供する。本発明は、第
5の態様において、上記のＤＮＡを含む組換えベクター
を提供する。In a fourth aspect, the present invention provides a Bacillus halodurans strain # 35 (FERM P-17671) or a mutant derived therefrom, which has an ability to produce an alkaline xylanase as defined above. . The present invention
In a fifth aspect, there is provided a recombinant vector comprising the above DNA.

【００２２】本発明は、第6の態様において、上記の組
換えベクターによって形質転換された宿主細胞を提供す
る。本発明での宿主細胞は原核または真核細胞のいずれ
でもよい。本発明の実施態様において、宿主細胞は大腸
菌である。The present invention provides, in a sixth aspect, a host cell transformed with the above-described recombinant vector. The host cell in the present invention may be either prokaryotic or eukaryotic. In an embodiment of the present invention, the host cell is E. coli.

【００２３】本発明は、第7の態様において、上記の宿
主細胞を培地に培養し、得られる培養物から上記定義の
アルカリ性キシラナーゼを採取することを含む、遺伝子
組換え型アルカリ性キシラナーゼの製造方法を提供す
る。The present invention provides a method for producing a recombinant alkaline xylanase according to the seventh aspect, which comprises culturing the above host cell in a medium and collecting the alkaline xylanase as defined above from the resulting culture. provide.

【００２４】本発明は、第8の態様において、上記定義
のアルカリ性キシラナーゼを生産するバチルス属に属す
る微生物、あるいは上記定義の宿主細胞、を培地に培養
して得られるアルカリ性キシラナーゼ酵素または該酵素
を含有する培養処理物を有効成分として含む漂白剤を提
供する。[0024] In the eighth aspect, the present invention provides an alkaline xylanase enzyme obtained by culturing a microorganism belonging to the genus Bacillus which produces an alkaline xylanase as defined above or a host cell as defined above in a medium, or comprising the enzyme. A bleaching agent containing the cultured product as an active ingredient.

【００２５】ここで、培養処理物には、微生物の培養ろ
液もしくは上清、培養細胞破砕液もしくは溶解液、これ
らの乾燥物(例えば凍結乾燥物)などが含まれる。酵素は
精製、部分精製もしくは粗製の形態で天然もしくは合成
高分子物質に慣用法により固定化されてもよい。Here, the culture-treated product includes a culture filtrate or supernatant of a microorganism, a crushed or lysed solution of cultured cells, and a dried product thereof (eg, a lyophilized product). The enzyme may be immobilized in a purified, partially purified or crude form on a natural or synthetic polymer in a conventional manner.

【００２６】本発明は、第9の態様において、上記の漂
白剤を用いてパルプを処理することを含む、パルプの漂
白方法を提供する。本方法はさらに、化学漂白および／
またはアルカリ抽出を、パルプ処理前、処理後又は処理
中のいずれかに行なうことを含むことができる。In a ninth aspect, the present invention provides a method for bleaching pulp, comprising treating pulp with the above-mentioned bleaching agent. The method may further comprise chemical bleaching and / or
Alternatively, it can include performing the alkali extraction either before, after or during the pulping.

【００２７】[0027]

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のキシラナーゼは、ｐＨ６〜１０の範囲、特にｐ
Ｈ9．5〜約10のアルカリ性条件下でさえ、50％以上の残
存活性を保持し、クラフトパルプに作用してキシロオリ
ゴ糖を生じさせる能力をもつ(図1)。例えば蒸解後、酸
素脱リグニンした広葉樹クラフトパルプに硫酸を加えて
pH 9.5とし、１〜１０％(重量)のスラリーとして酵素を
含む培養液もしくは漂白剤を添加し、６０℃で１時間保
温した後、パルプを搾った上清中の全糖をフェノール−
硫酸法により測定すると、対パルプ0.5〜3％(重量)の糖
を検出することができる。この上清をイオンクロマトグ
ラフィー（例えばダイオネックス社製）により分析する
と、キシロース、キシロビオース、キシロトリオースな
どのオリゴ糖のピークを検出することができる。これは
キシラナーゼが主にリグノセルロース材料をクラフト蒸
解した際に、蒸解後期ないしブロー時に繊維表面に再吸
着するキシランを加水分解するために生じるものである
と考えられている。再吸着キシランを分解除去すること
によって、後段の漂白シーケンス中で薬品の浸透性が上
がることが、漂白薬品を削減できる理由の１つと考えら
れている。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The xylanase of the present invention has a pH in the range of 6 to 10, especially p
It retains more than 50% residual activity, even under alkaline conditions of H9.5 to about 10, and has the ability to act on kraft pulp to produce xylo-oligosaccharides (FIG. 1). For example, after cooking, add sulfuric acid to oxygen delignified hardwood kraft pulp.
After adjusting the pH to 9.5, adding a culture solution containing an enzyme or a bleaching agent as a slurry of 1 to 10% (weight), keeping the mixture at 60 ° C for 1 hour, and removing the total sugar in the supernatant obtained by squeezing the pulp,
When measured by the sulfuric acid method, it is possible to detect 0.5 to 3% (by weight) of sugar relative to pulp. When the supernatant is analyzed by ion chromatography (for example, manufactured by Dionex), peaks of oligosaccharides such as xylose, xylobiose, and xylotriose can be detected. It is believed that this occurs because xylanase mainly hydrolyzes xylan that re-adsorbs to the fiber surface at the end of cooking or during blowing when lignocellulosic material is kraft cooked. It is considered that one of the reasons for reducing the amount of the bleaching chemical is that the chemical permeability is increased in the subsequent bleaching sequence by decomposing and removing the re-adsorbed xylan.

【００２８】ｐＨ９を越えてパルプの漂白に実質的に効
果のあるキシラナーゼは実際には少なく、これはパルプ
表面の固体のキシランに作用できる酵素が多くないため
であると考えられる。キシラナーゼの至適ｐＨがアルカ
リ側にある酵素でも、必ずしもパルプの漂白に効果があ
るものではない。本発明の酵素は9.5以上の高いｐＨで
もパルプ中のキシランを分解する能力があり、これによ
って実用的漂白効果を達成でき、かつ漂白薬品を削減す
ることができる。There are actually few xylanases that are substantially effective in pulp bleaching above pH 9, probably because not many enzymes can act on solid xylan on the pulp surface. An enzyme having an optimum pH of xylanase on the alkaline side is not necessarily effective in bleaching pulp. The enzyme of the present invention is capable of decomposing xylan in pulp even at a high pH of 9.5 or more, thereby achieving a practical bleaching effect and reducing bleaching chemicals.

【００２９】本発明のアルカリ性キシラナーゼは、配列
番号１で表されるアミノ酸配列からなる配列を有する。
このような配列を有する酵素は例えばバチルス・ハロデ
ュランス＃35株によって産生されうる。この菌株は、以
下に述べるように、今回本発明者らによって土壌から分
離された野生株であり、工業技術院生命工学工業技術研
究所(茨城県つくば市東１−１−３)に平成11年12月3日
付けで受託番号FERM P-17671として寄託されている。The alkaline xylanase of the present invention has a sequence consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
An enzyme having such a sequence can be produced, for example, by Bacillus halodurans strain # 35. As described below, this strain is a wild strain isolated from the soil by the present inventors this time, and was sent to the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (1-1-3 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture) in 1999. Deposited on December 3 under accession number FERM P-17671.

【００３０】バチルス・ハロデュランス#35株は、カバ
キシランまたはコムギキシラン１％、ペプトン0.５％、
酵母抽出物0.５％、K₂HPO₄ 0.１％、MgSO₄・7H₂O 0.02
％、ｐＨ7.０の培地を用いた45℃の培養でよく生育す
る。本菌株の菌学的性質は次の通りである。Bacillus halodurans strain # 35 contains 1% of birch silane or wheat xylan, 0.5% of peptone,
Yeast extract 0.5%, K ₂ HPO ₄ 0.1%, MgSO ₄ .7H ₂ O 0.02
It grows well by culturing at 45 ° C. in a medium having a pH of 7.0%. The mycological properties of this strain are as follows.

【００３１】形態学的性質 i) 0.6〜0.8×2〜3μｍの運動性を有する桿菌である。
菌体のほぼ中央に胞子を形成する。 ii) グラム染色性は陽性で抗酸性は陰性である。各種培
地における生育状態等は以下に示す通りである。なお、
培養温度は45℃とした。生理学的性質 下記の表１〜３に示す。 Morphological properties i) Bacilli having a motility of 0.6 to 0.8 × 2 to 3 μm.
A spore is formed in the center of the cell. ii) Gram stain is positive and acid resistance is negative. The growth state and the like in various media are as shown below. In addition,
The culture temperature was 45 ° C. Physiological properties are shown in Tables 1-3 below.

【００３２】[0032]

【表１】 [Table 1]

【００３３】[0033]

【表２】 [Table 2]

【００３４】[0034]

【表３】 [Table 3]

【００３５】以上の菌学的性質をもとに本菌株の同定を
行った。本菌株は好アルカリ性好塩菌であり、"Bergey'
s Manual of Systematic Bacteriology" Vol. 2(1986)
Williams & WilkinsおよびMicrobiology, Vol. 141, 17
45-1761の文献によりバチルス・ハロデュランス(Bacill
us halodurans)と同定し、バチルス・ハロデュランス#3
5と命名した。The present strain was identified based on the above mycological properties. This strain is an alkalophilic halophilic bacterium, "Bergey '
s Manual of Systematic Bacteriology "Vol. 2 (1986)
Williams & Wilkins and Microbiology, Vol. 141, 17
45-1761, Bacillus halodurans (Bacill
us halodurans) and Bacillus halodurans # 3
Named 5.

【００３６】本発明のバチルス・ハロデュランス#35株
を培養することによりアルカリ性キシラナーゼを生産す
ることができる。培養のための炭素源、窒素源には、資
化してアルカリ性キシラナーゼを生産することのできる
ものであればいずれも用いることができる。例えば、炭
素源としては、キシラン若しくはキシランを含む小麦ふ
すま、パルプ、バガス、コーンファイバー、稲わら等の
農産廃棄物又は植物繊維等を使用することができる。窒
素源としては、酵母エキス、ペプトン、各種アミノ酸、
大豆、コーンスティープリカー、各種無機窒素等の窒素
化合物を用いることができる。また、各種の塩類やビタ
ミン、ミネラル等を適宜用いることができる。培養温度
およびｐＨは、菌が生育してアルカリ性キシラナーゼを
生産する範囲であればいずれでもよく、培養温度は30〜
55℃、好ましくは35〜55℃、ｐＨは８〜１０である。本
発明の微生物を培養した後、菌体を分離し、培養濾液を
そのままアルカリ性キシラナーゼ粗酵素液として使用す
ることができる。かかるアルカリ性キシラナーゼ粗酵素
液は、反応至適温度が60℃、至適ｐＨが7〜9である。The alkaline xylanase can be produced by culturing the Bacillus halodurans strain # 35 of the present invention. As the carbon source and the nitrogen source for cultivation, any source capable of assimilating and producing alkaline xylanase can be used. For example, as the carbon source, xylan or xylan-containing wheat bran, pulp, bagasse, corn fiber, agricultural waste such as rice straw, plant fiber, or the like can be used. Nitrogen sources include yeast extract, peptone, various amino acids,
Nitrogen compounds such as soybean, corn steep liquor and various inorganic nitrogens can be used. In addition, various salts, vitamins, minerals, and the like can be appropriately used. The culture temperature and pH may be any range as long as the bacteria grow and produce alkaline xylanase.
55 ° C., preferably 35-55 ° C., pH 8-10. After culturing the microorganism of the present invention, the cells are separated, and the culture filtrate can be used as it is as a crude alkaline xylanase enzyme solution. Such an alkaline xylanase crude enzyme solution has an optimum reaction temperature of 60 ° C. and an optimum pH of 7 to 9.

【００３７】必要に応じて、該粗酵素液から目的の酵素
を精製することもできる。この場合、一般的に酵素精製
に使用される種々の手法(例えば塩沈殿、溶媒沈殿、ゲ
ルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティ
クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィ
ー、ＨＰＬＣなど)を単独かまたは組み合わせて、酵素
を精製することができる。いずれにしても、本発明の目
的であるパルプの漂白方法に本酵素を使用することにお
いては、粗酵素液あるいは部分もしくは完全精製酵素の
いずれも使用可能である。[0037] If necessary, the desired enzyme can be purified from the crude enzyme solution. In this case, various techniques generally used for enzyme purification (for example, salt precipitation, solvent precipitation, gel filtration, ion exchange chromatography, affinity chromatography, hydrophobic interaction chromatography, HPLC, etc.) alone or in combination Thus, the enzyme can be purified. In any case, in using the present enzyme in the pulp bleaching method of the present invention, either a crude enzyme solution or a partially or completely purified enzyme can be used.

【００３８】本発明のアルカリ性キシラナーゼは、ｐＨ
9．5以上のアルカリ性条件下でパルプ(例えばクラフト
パルプ)の漂白作用をもつ限り、配列番号１で表される
アミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸の欠
失、置換、付加または挿入を有していてもよい。このよ
うな変異配列をもつ本発明のキシラナーゼは、天然から
単離されたものであってもよいし、天然単離物の変異処
理によって得られたものであってもよいし、あるいは遺
伝子組換えによって得られたものであってもよい。その
ような酵素は、例えばバチルス・ハロデュランス#35株
を化学変異剤処理、例えばN-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロ
ソグアニジン、エチルメタンスルフォン酸などのアルキ
ル化剤、アクリジン色素などによる処理、紫外線照射処
理などの変異処理によって得られる変異株が産生するも
の、または、以下に述べる遺伝子クローニングによって
取得されるアルカリ性キシラナーゼ遺伝子(例えば配列
番号２のヌクレオチド配列58〜687を有する遺伝子)に例
えば部位特異的突然変異誘発法、カセット変異法などの
通常の変異技術を、必要ならばポリメラーゼ連鎖反応
（PCR）技術と組み合わせて、適用して遺伝子に変異を
導入し適切な宿主内で発現させて得られるもの、などで
ある。あるいは、配列番号２に示されるコーディング配
列にストリンジェント条件下でハイブリダイズする遺伝
子を例えばバチルス属細菌、特にバチルス・ハロデュラ
ンスの任意の株からスクリーニングし、相同性が90％以
上、通常95％以上、好ましくは97％以上、さらに好ましく
は98％以上のものを識別し、遺伝子組換え法によって目
的の酵素を得ることもできる。なお、遺伝子組換え法、
変異導入法、ストリンジェント条件下でのハイブリダイ
ゼーションなどについての一般的な手法は、例えばSamb
rook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manua
l, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory P
ress (1989)やShort Protocols In Molecular Biology,
Third Edition, John Wiley & Sons, Inc.に記載され
ており、これらの手法を使用することができる。ここで
ハイブリダイゼーション条件は温度、イオン強度などの
因子を考慮して決定されるが、通常温度が高いほど、ま
たイオン強度が低いほどストリンジェンシィが高まるこ
とが知られている。また、低もしくは中ストリンジェン
トな条件でハイブリダイゼーションを行なった後で、高
ストリンジェントな条件で洗浄処理を行なう手法も採用
可能である。例えばストリンジェント条件として、６×
SSC中６８℃でのハイブリダイゼーションおよびその後
の0.1×SSC中65℃での洗浄が例示できる。The alkaline xylanase of the present invention has a pH
As long as the pulp (eg, kraft pulp) has a bleaching action under an alkaline condition of 9.5 or more, one or several amino acids may be deleted, substituted, added or inserted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. It may be. The xylanase of the present invention having such a mutant sequence may be one isolated from nature, one obtained by mutation treatment of a natural isolate, or genetic recombination. May be obtained by Such enzymes are, for example, Bacillus halodurans strain # 35 treated with a chemical mutagen, for example, treatment with an alkylating agent such as N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, ethyl methanesulfonic acid, an acridine dye, or the like. For example, a site produced by a mutant obtained by a mutation treatment such as ultraviolet irradiation treatment, or an alkaline xylanase gene (for example, a gene having nucleotide sequence 58 to 687 of SEQ ID NO: 2) obtained by gene cloning described below. Conventional mutagenesis techniques, such as directed mutagenesis and cassette mutagenesis, can be combined with polymerase chain reaction (PCR) techniques, if necessary, to apply mutations to the gene and express it in a suitable host. , Etc. Alternatively, a gene that hybridizes to the coding sequence shown in SEQ ID NO: 2 under stringent conditions is screened, for example, from any strain of Bacillus bacterium, in particular, any strain of Bacillus halodurans, and has a homology of 90% or more, usually 95% or more. , Preferably 97% or more, more preferably 98% or more, and the target enzyme can be obtained by genetic recombination. In addition, the gene recombination method,
General techniques for mutagenesis, hybridization under stringent conditions, etc.
rook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manua
l, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory P
ress (1989) and Short Protocols In Molecular Biology,
Third Edition, John Wiley & Sons, Inc., and these techniques can be used. Here, the hybridization conditions are determined in consideration of factors such as temperature and ionic strength. It is known that the higher the temperature and the lower the ionic strength, the higher the stringency. In addition, a method in which hybridization is performed under conditions of low or medium stringency followed by washing under conditions of high stringency can also be adopted. For example, as a stringent condition, 6 ×
Examples include hybridization at 68 ° C. in SSC and subsequent washing at 65 ° C. in 0.1 × SSC.

【００３９】本発明はまた、上記のアルカリ性キシラナ
ーゼをコードするＤＮＡに関する。該酵素をコードする
遺伝子は、バチルス属細菌、特にバチルス・ハロデュラ
ンス、さらに具体的にバチルス・ハロデュランス＃35株
由来のＤＮＡライブラリーからクローニングすることが
できる。ＤＮＡライブラリーは、バチルス・ハロデュラ
ンス#35株から染色体ＤＮＡを抽出し、常法により適当
な制限酵素で処理したものを適当なベクターにつないだ
後、適合する宿主に導入することで作製することができ
る。ライブラリー作製に用いられるベクターとしては、
例えばプラスミドベクター(例えばpUC 系、pQE系、pBlu
escript、pSG5（ストラタジーン）など)、ファージベク
ター（例えばラムダファージ）等が挙げられ、宿主とし
ては、例えば細菌、酵母(例えば大腸菌、枯草菌などの
細菌、Saccharomyces属、 Schizophyllum属などの酵母)
等が主に挙げられる。得られたＤＮＡライブラリーから
の目的とする遺伝子の単離にあたっては、前記ＤＮＡラ
イブラリーを用いて大腸菌等の細菌を形質転換した後、
キシラン培地に塗布し、ハローの形成を指標に行う。こ
のようにしてクローニングされたＤＮＡの塩基配列は、
常法の例えば蛍光標識を用いるジデオキシ法により解析
することができる。The present invention also relates to a DNA encoding the above-mentioned alkaline xylanase. The gene encoding the enzyme can be cloned from a DNA library derived from a bacterium belonging to the genus Bacillus, in particular, Bacillus halodurans, more specifically, Bacillus halodurans strain # 35. A DNA library is prepared by extracting chromosomal DNA from Bacillus halodurans strain # 35, treating it with an appropriate restriction enzyme in a conventional manner, ligating it into an appropriate vector, and introducing it into a compatible host. Can be. As a vector used for library production,
For example, plasmid vectors (for example, pUC, pQE, pBlu
escript, pSG5 (Stratagene, etc.), phage vectors (eg, lambda phage), and the like. Examples of hosts include bacteria, yeasts (eg, bacteria such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, and yeasts such as Saccharomyces and Schizophyllum).
And the like. In isolating a target gene from the obtained DNA library, after transforming bacteria such as Escherichia coli using the DNA library,
It is applied to a xylan medium, and halo formation is used as an index. The nucleotide sequence of the DNA thus cloned is
Analysis can be performed by a conventional method such as the dideoxy method using a fluorescent label.

【００４０】バチルス・ハロデュランス#35株のＤＮＡ
ライブラリーからスクリーニング、配列決定された本発
明の酵素をコードするＤＮＡは配列番号２に示す配列を
有しており、コーディング配列はヌクレオチド番号58〜
687に相当する配列である。また、このコーディング配
列から決定されたキシラナーゼ酵素のアミノ酸配列は以
下のとおりである： MFKFVTKVLT VVIAATISFC LSAVPASANT YWQYWTDGGG TVNATNGPGG NYSVTWRDTG NFVVGKGWEI GSPNRTIHYN AGVWEPSGNG YLTLYGWTRN QLIEYYVVDN WGTYRPTGTH RGTVVSDGGT YDIYTTMRYN APSIDGTQTF QQFWSVRQSK RPTGNNVSIT FSNHVNAWRN AGMNLGSSWS YQVLATEGYQ SSGRSNVTVW（配列番号１）。DNA of Bacillus halodurans strain # 35
DNA encoding the enzyme of the present invention screened and sequenced from the library has the sequence shown in SEQ ID NO: 2, and the coding sequence is nucleotides 58 to
This is the sequence corresponding to 687. The amino acid sequence of the xylanase enzyme determined from the coding sequence is as follows: MFKFVTKVLT VVIAATISFC LSAVPASANT YWQYWTDGGG TVNATNGPGG NYSVTWRDTG NFVVGKGWEI GSPNRTIHYN AGVWEPSGNG YLTLYGWTRN QLIEYYVVDN WGTYRPTGTH RGTVVSDGGT YDIYTTMRYN APSIDGTQTF QQFWSVRQSK RPTGNNVSIT FSNHVNAWRN AGMNLGSSWS YQVLATEGYQ SSGRSNVTVW (SEQ ID NO: 1).

【００４１】この遺伝子を含むプラスミドで形質転換し
た大腸菌(E. coli) pBSX35-2株は工業技術院生命工学工
業技術研究所に平成11年12月3日付けで寄託番号FERM P-
17670として寄託されている。該酵素遺伝子は国立遺伝
学研究所（静岡県三島市）の遺伝子バンクに登録されて
いる遺伝子と相同性検索を行ったところ、キシラナーゼ
との相同性が高いが、一致するものは無く、新規なキシ
ラナーゼであることが判明した。最も相同性が高いもの
は好熱性バチルスであるバチルス・ステアロサーモフィ
ルス（B. stearothermophilus）のxyl A遺伝子（アミノ
酸配列レベルでの相同性80％）であり、次いで枯草菌
（B. subtilis ）のxyl A遺伝子であった。これら相同
性の高いキシラナーゼのアルカリ性でのパルプ漂白効果
については記載がないので不明である。Escherichia coli (E. coli) pBSX35-2 strain transformed with the plasmid containing this gene was deposited on December 3, 1999 with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under the deposit number FERM P-
Deposited as 17670. When a homology search was performed for the enzyme gene with a gene registered in the gene bank of the National Institute of Genetics (Mishima City, Shizuoka Prefecture), the homology with xylanase was high, but there was no match, and a new gene was found. It was found to be xylanase. The most homologous is the xyl A gene (80% homology at the amino acid sequence level) of the thermophilic bacillus Bacillus stearothermophilus, followed by the B. subtilis. xyl A gene. The pulp bleaching effect of these highly homologous xylanases in alkaline conditions is unknown because it is not described.

【００４２】遺伝子工学的手法による遺伝子組換え型ア
ルカリ性キシラナーゼは、クローニングされた遺伝子を
適切な培養条件下に発現させることにより生成し、必要
に応じて精製することができる。その手法は、前記によ
って得られたキシラナーゼ遺伝子を、適当な宿主・ベク
ターを用いて発現することにより高生産することができ
る。発現に用いられるベクターとしては、プラスミドベ
クター、ファージベクター等が主に使われる。ベクター
はプロモーターを含んでおり、必要に応じてエンハンサ
ー、選択マーカー、複製起点、リボソーム結合部位、転
写終結部位、ポリリンカー、ターミネーターなどを含む
ことができる。このようなベクターは市販されており、
適するものを入手し使用できる。宿主として、大腸菌、
枯草菌、Saccharomyces属、 Schizophyllum属などの酵
母等、必要に応じて動物、植物、昆虫細胞などを使うこ
とができる。形質転換法はこの分野で一般的に行なわれ
ているものを使用できる。培養のための炭素源、窒素源
には、資化してアルカリ性キシラナーゼを生産すること
ができるものであればいずれも用いることができる。例
えば、炭素源としては、ブドウ糖、糖蜜、キシラン若し
くはキシランを含む小麦ふすま、パルプ、バカス、コー
ンファイバー、稲わら等の農業廃棄物又は植物繊維等
を、菌の資化性に応じて使用することができる。窒素源
としては、酵母エキス、ペプトン、各種アミノ酸、大
豆、コーンスティープリカー、各種無機窒素等の窒素化
合物を、菌の資化性に応じて用いることができる。ま
た、各種塩類、ビタミン、ミネラル等を適宜用いること
ができる。培養温度及びpHは、菌がアルカリ性キシラナ
ーゼを生産する範囲であればいずれでもよく、培養温
度、ｐＨは宿主細胞の種類に依存して変化しうるが、大
腸菌を宿主とする場合好ましくは35〜40℃、pHは好まし
くは７前後である。The recombinant alkaline xylanase by a genetic engineering technique is produced by expressing the cloned gene under appropriate culture conditions, and can be purified if necessary. According to the technique, high production can be achieved by expressing the xylanase gene obtained as described above using an appropriate host vector. As a vector used for expression, a plasmid vector, a phage vector and the like are mainly used. The vector contains a promoter, and if necessary, may contain an enhancer, a selection marker, an origin of replication, a ribosome binding site, a transcription termination site, a polylinker, a terminator, and the like. Such vectors are commercially available,
You can obtain and use suitable ones. E. coli,
Bacillus subtilis, yeast of the genus Saccharomyces, genus Schizophyllum, and the like, as well as animal, plant, and insect cells can be used as necessary. The transformation method generally used in this field can be used. As the carbon source and the nitrogen source for cultivation, any one can be used as long as it can assimilate and produce alkaline xylanase. For example, as a carbon source, glucose, molasses, xylan or wheat bran containing xylan, pulp, bacas, corn fiber, agricultural waste such as rice straw, or plant fiber, etc., may be used depending on the assimilation of the fungus. Can be. As the nitrogen source, nitrogen compounds such as yeast extract, peptone, various amino acids, soybean, corn steep liquor, and various inorganic nitrogens can be used according to the assimilation property of the bacteria. In addition, various salts, vitamins, minerals, and the like can be appropriately used. The culture temperature and pH may be any as long as the bacterium produces alkaline xylanase, and the culture temperature and pH may vary depending on the type of host cell, but preferably 35 to 40 when E. coli is used as a host. C and pH are preferably around 7.

【００４３】本発明の酵素はパルプの漂白方法に使用で
きる。化学パルプ及び機械パルプ製造工程において、本
発明の部分精製もしくは完全精製アルカリ性キシラナー
ゼ、この酵素を含む培養処理物(培養ろ液、培養上清、
培養細胞破砕液、培養細胞溶解液、これらの乾燥物、固
定化酵素など)でパルプを処理することで漂白を行なう
ことができる。さらに酵素処理の前後、あるいは途中に
化学漂白および／またはアルカリ抽出を行なうことでパ
ルプの漂白を行なうことができる。The enzyme of the present invention can be used in a method for bleaching pulp. In the chemical pulp and mechanical pulp production process, partially purified or fully purified alkaline xylanase of the present invention, a culture treatment containing this enzyme (culture filtrate, culture supernatant,
Bleaching can be performed by treating the pulp with a cultured cell lysate, a cultured cell lysate, a dried product thereof, or an immobilized enzyme. Further, bleaching of the pulp can be performed by performing chemical bleaching and / or alkali extraction before, during, or during the enzymatic treatment.

【００４４】本発明酵素のパルプの漂白促進効果を次の
ようにして評価することができる。国内産広葉樹チップ
７０％、ユーカリ材３０％からなる混合広葉樹チップを
原料として、クラフト蒸解を行い、次いで酸素脱リグニ
ンを行ってカッパー価１０．０、白色度４６．４の酸素
脱リグニン処理パルプを得る。このパルプをあらかじめ
10％に純水で調製し60℃に調温しておき硫酸またはアル
カリ（苛性ソーダ）でｐＨを調節する。パルプに処理す
る培養物又は酵素量については、アルカリ性キシラナー
ゼ単位としてパルプの絶乾重量１ｇあたり0.１〜１０
Ｕ、好ましくは0.５〜５Ｕ添加すればよい。反応条件は
培養濾液（粗酵素液）の場合、反応温度50〜80℃、ｐＨ
７〜１０であり、反応時間は、0.２〜24時間、好ましく
は0.５〜８時間である。次いで漂白シーケンス、塩素段
（Ｃ）−アルカリ抽出段（Ｅ／Ｏ）−二酸化塩素段（ｄ
ｎＤ）で漂白する。各薬品添加量は一定で処理しＤ後の
白色度で漂白性を判断する。酵素段後のシーケンスの添
加量を一定にしたのは酵素段での漂白効果（ΔＫα価、
白色度）が判断しやすいためである。The bleaching promoting effect of the enzyme of the present invention on pulp can be evaluated as follows. Kraft cooking is performed using mixed hardwood chips consisting of 70% domestic hardwood chips and 30% eucalyptus wood as raw materials, followed by oxygen delignification to obtain oxygen delignified pulp having a kappa number of 10.0 and a brightness of 46.4. obtain. This pulp in advance
Adjust to 10% with pure water, adjust the temperature to 60 ° C, and adjust the pH with sulfuric acid or alkali (caustic soda). Regarding the amount of culture or enzyme to be processed into pulp, 0.1 to 10 per gram of absolute dry weight of pulp as alkaline xylanase unit.
U, preferably 0.5 to 5 U may be added. The reaction conditions are as follows: for the culture filtrate (crude enzyme solution), the reaction temperature is
The reaction time is 0.2 to 24 hours, preferably 0.5 to 8 hours. Then, the bleaching sequence, chlorine stage (C) -alkali extraction stage (E / O) -chlorine dioxide stage (d
bleach at nD). The amount of each chemical added is kept constant, and the bleachability is determined by the whiteness after D. The constant addition amount of the sequence after the enzyme stage is due to the bleaching effect (ΔKα value,
This is because the degree of whiteness is easy to determine.

【００４５】各段の処理条件は以下の通りである。 Ｃ段：塩素添加率 1.2 %、５５℃、３０分、 Ｅ／ＯＨ段：苛性ソーダ 0.64 %、酸素添加1.5kg/cm²、
次亜塩素酸ソーダ 0.45%、60℃、90分、 ｄ段：二酸化塩素 0.11 %、７０℃、８分、 ｎ段：苛性ソーダ 0.08 %、７０℃、２分、 Ｄ段：二酸化塩素 0.14 %、７０℃、１８０分。 薬品添加率は対パルプ添加率を示す。The processing conditions of each stage are as follows. Stage C: chlorine addition rate 1.2%, 55 ° C, 30 minutes, E / OH stage: caustic soda 0.64%, oxygen addition 1.5kg / cm ² ,
Sodium hypochlorite 0.45%, 60 ° C, 90 minutes, stage d: chlorine dioxide 0.11%, 70 ° C, 8 minutes, stage n: caustic soda 0.08%, 70 ° C, 2 minutes, stage D: chlorine dioxide 0.14%, 70 ° C, 180 minutes. The chemical addition rate indicates the pulp addition rate.

【００４６】このように漂白したパルプの白色度を酵素
処理をしない場合と比較すると、表４（下記）に示すよ
うに本発明の酵素で処理した場合は白色度が酵素処理の
ｐＨがｐＨ８．５で3．7ポイント、ｐＨ9.5で2.6ポイン
ト、ｐＨ10．2で1．9ポイント向上していることが分
る。本酵素は、pH9.5以上で約２ポイントを超える白色
度向上率を有する点で優れた漂白能をもつ。When the whiteness of the bleached pulp is compared with the case where the enzyme treatment is not performed, as shown in Table 4 (below), the whiteness of the enzyme treated with the enzyme of the present invention is pH8. It can be seen that 3.7 points was improved at 5, pH 9.5 was improved at 2.6 points, and pH 10.2 was improved at 1.9 points. This enzyme has excellent bleaching ability in that it has a whiteness improvement rate exceeding about 2 points at pH 9.5 or more.

【００４７】化学漂白に用いる試薬としては、塩素、二
酸化塩素、二酸化窒素、次亜塩素酸塩、酸素、過酸化水
素、オゾン等が挙げられる。またアルカリ抽出には、当
業者として公知の多くのアルカリ性化合物を用いること
ができる。アルカリ抽出には、水酸化ナトリウム換算で
0.５〜３％（対絶乾パルプ）のアルカリを用い、酸素や
過酸化水素等を添加しながらアルカリ処理を行うことが
できる。The reagents used for chemical bleaching include chlorine, chlorine dioxide, nitrogen dioxide, hypochlorite, oxygen, hydrogen peroxide, ozone and the like. Many alkaline compounds known to those skilled in the art can be used for the alkali extraction. For alkali extraction, in terms of sodium hydroxide
Alkali treatment can be performed using an alkali of 0.5 to 3% (vs. dry pulp) while adding oxygen, hydrogen peroxide and the like.

【００４８】また、漂白排水中のＡＯＸ量をハロゲン分
析装置ＴＯＸ−10（三菱化学製）を用いて定量した結
果、培養上清処理によりＡＯＸを25％減らすことができ
た。塩素、次亜塩素酸塩、アルカリ又はＡＯＸ等を削減
できたことは、本酵素の作用によりパルプの漂白性が改
善されたことを示すものであり、このことによって薬品
コストを削減できるとともに、有機塩素化合物の生成を
抑制することができる点で有用である。In addition, as a result of quantifying the amount of AOX in the bleaching waste water using a halogen analyzer TOX-10 (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation), AOX could be reduced by 25% by the treatment of the culture supernatant. The fact that chlorine, hypochlorite, alkali, AOX, and the like could be reduced indicates that the bleaching property of pulp was improved by the action of the present enzyme. This is useful in that the generation of chlorine compounds can be suppressed.

【００４９】[0049]

【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されないも
のとする。 〔実施例１〕粗酵素液の調製 広葉樹パルプ１.1％、大豆粕蛋白１.1％、コーンスティ
ープリカー0.55％を含む液体培地（ｐＨ7.0 ）を、内径
25mm試験管に採り、紙栓をした後121℃で15分間蒸気滅
菌した。これに10%炭酸ナトリウムを1/10容加え、バチ
ルス・ハロデュランス#35株(FERM P-17671)を１白金耳
植菌し、45℃で往復振盪培養した（振幅25mm、300往復
／分）。培養終了後、遠心分離（10,000rpm ×10分）し
て培養上清を分離し、アルカリ性キシラナーゼの粗酵素
液を得た。EXAMPLES The present invention will be described more specifically with reference to the following examples. However, the present invention is not limited to these examples. Example 1 Preparation of Crude Enzyme Solution A liquid medium (pH 7.0) containing 1.1% of hardwood pulp, 1.1% of soybean meal protein, and 0.55% of corn steep liquor was used.
It was taken in a 25 mm test tube, stoppered with paper, and then steam sterilized at 121 ° C. for 15 minutes. One-tenth volume of 10% sodium carbonate was added thereto, and one loopful of Bacillus halodurans strain # 35 (FERM P-17671) was inoculated and cultured at 45 ° C with reciprocal shaking (amplitude 25 mm, 300 reciprocations / min). . After completion of the culture, the culture supernatant was separated by centrifugation (10,000 rpm × 10 minutes) to obtain a crude enzyme solution of alkaline xylanase.

【００５０】１％キシラン溶液（カバ材キシラン、シグ
マ社製 100 mM トリス−塩酸緩衝液 pH 10）1 mlに酵
素溶液100μlを添加し、60℃にて５分間反応させた。DN
S試薬を2 ml添加して５分間煮沸した後直ちに氷冷し、5
40nmの吸光度を測定した。検量線は濃度既知のキシロー
スを用いて作成した。キシラナーゼ活性は、上記の条件
で１分間に１μmolの還元糖を生成する酵素量を１ユニ
ット（Unit）とした。その結果、培養上清中のアルカリ
性キシラナーゼ活性は、培養開始後24時間で40 U/mlで
あった。100 μl of the enzyme solution was added to 1 ml of a 1% xylan solution (birch xylan, 100 mM Tris-HCl buffer, pH 10 manufactured by Sigma) and reacted at 60 ° C. for 5 minutes. DN
Add 2 ml of S reagent, boil for 5 minutes and immediately cool on ice.
The absorbance at 40 nm was measured. The calibration curve was prepared using xylose of known concentration. The xylanase activity was defined as the amount of the enzyme that produces 1 μmol of reducing sugar per minute under the above conditions as one unit (Unit). As a result, the alkaline xylanase activity in the culture supernatant was 40 U / ml 24 hours after the start of the culture.

【００５１】酵素反応のｐＨを変えて、得られた酵素の
酵素活性を上記のように測定した。用いた緩衝液は、ｐ
Ｈ５（酢酸ソーダ）、ｐＨ６（マックイルベイン）、ｐ
Ｈ７（リン酸カリウム）、ｐＨ８，９（トリス-塩
酸）、ｐＨ１０，１１（グリシン-NaOH）である。結果
を図１に示す。図１より、至適ｐＨは約７〜約９、特に
８付近であった。また、酵素反応の温度を変えて酵素活
性を測定し、上記で得られた本酵素の熱安定性を調べた
結果、本酵素は７0℃まで安定であった。The pH of the enzyme reaction was changed, and the enzyme activity of the obtained enzyme was measured as described above. The buffer used was p
H5 (sodium acetate), pH 6 (Macilbain), p
H7 (potassium phosphate), pH 8,9 (Tris-hydrochloric acid), pH 10,11 (glycine-NaOH). The results are shown in FIG. As shown in FIG. 1, the optimum pH was about 7 to about 9, especially about 8. In addition, the enzyme activity was measured while changing the temperature of the enzyme reaction, and the thermostability of the enzyme obtained above was examined. As a result, the enzyme was stable up to 70 ° C.

【００５２】〔実施例２〕アルカリ性キシラナーゼ遺伝
子のクローニング (1) 染色体遺伝子ライブラリーの作製 ブドウ糖0.６％、ペプトン0.５％、酵母抽出物0.５％、
K₂HPO₄0.１％、MgSO₄・7H₂O 0.02％、ｐＨ7.０の液体培
地50mlを500ml容坂口フラスコに取り綿栓をした後、121
℃で15分間蒸気滅菌した。これにバチルス・ハロデュラ
ンス#35株株を１白金耳植菌し、45℃で一晩往復振盪培
養（振幅10cm、100 往復／分）した。培養終了後、遠心
分離（10,000 rpm×10分）により菌体を得た。Example 2 Cloning of Alkaline Xylanase Gene (1) Preparation of Chromosome Gene Library Glucose 0.6%, Peptone 0.5%, Yeast Extract 0.5%,
0.1 ml of K ₂ HPO ₄ 0.1%, 0.02% of MgSO ₄ .7H ₂ O, pH 7.0, 50 ml of a liquid medium was placed in a 500 ml Sakaguchi flask, and the cotton stopper was added.
Steam sterilized at 150C for 15 minutes. One platinum loop of Bacillus halodurans strain # 35 was inoculated into this, and cultured at 45 ° C overnight with reciprocal shaking (amplitude 10 cm, 100 reciprocations / min). After completion of the culture, cells were obtained by centrifugation (10,000 rpm × 10 minutes).

【００５３】本菌体を５mlのグルコース−リゾチーム溶
液（50mMグルコース、10mM EDTA 、25mM Tris-HCl 緩衝
液（pH8.０）、４mg/ml リゾチーム）に懸濁し、室温で
15分放置した。５mlのアルカリ溶液（0.２N NaOH、１％
SDS）を加え、穏やかに混ぜ、氷中にて15分間冷却し
た。この後、フェノール抽出、クロロホルム抽出を行な
い、抽出した水層部分にエタノールを徐々に添加しＤＮ
Ａが析出したところで染色体ＤＮＡをガラス棒にて巻取
り、ＴＥ（Tris-HCl/EDTA）溶液に懸濁した。得られた
染色体ＤＮＡ100μg を制限酵素ＥcoＲＩで部分消化
し、３〜20％ショ糖密度勾配超遠心分離法（22,500rpm,
16 時間）により分画し、３〜５kbp 断片画分をエタノ
ール沈澱により回収した。The cells were suspended in 5 ml of a glucose-lysozyme solution (50 mM glucose, 10 mM EDTA, 25 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 4 mg / ml lysozyme) and allowed to stand at room temperature.
Left for 15 minutes. 5 ml of alkaline solution (0.2N NaOH, 1%
SDS) was added, mixed gently, and cooled in ice for 15 minutes. Thereafter, phenol extraction and chloroform extraction were performed, and ethanol was gradually added to the extracted aqueous layer to add DN.
When A precipitated, the chromosomal DNA was wound up with a glass rod and suspended in a TE (Tris-HCl / EDTA) solution. 100 μg of the obtained chromosomal DNA was partially digested with a restriction enzyme EcoRI, and subjected to a 3 to 20% sucrose density gradient ultracentrifugation (22,500 rpm,
16 h), and the 3-5 kbp fragment was recovered by ethanol precipitation.

【００５４】(2) アルカリ性遺伝子の大腸菌への形質転
換 大腸菌クローニングベクターpUC19 （宝酒造社製）１μ
ｇを制限酵素ＥcoＲＩで完全消化した後、アルカリホス
ファターゼ（Calf intestine由来）により脱リン酸化
し、上記エタノール沈澱後のＤＮＡ500ng 及びT4 DNAリ
ガーゼ2.５ユニットを含むライゲーションバッファー中
で16℃、16時間反応させ、本発明の遺伝子とベクターと
を連結した。得られたプラスミドで常法により大腸菌JM
109株を形質転換した。(2) Transformation of alkaline gene into Escherichia coli Escherichia coli cloning vector pUC19 (Takara Shuzo)
g was completely digested with the restriction enzyme EcoRI, dephosphorylated with alkaline phosphatase (derived from Calf intestine), and reacted at 16 ° C. for 16 hours in a ligation buffer containing 500 ng of DNA after ethanol precipitation and 2.5 units of T4 DNA ligase. Then, the gene of the present invention and the vector were ligated. Escherichia coli JM using the obtained plasmid
109 strains were transformed.

【００５５】(3) ＤＮＡライブラリーからのキシラナー
ゼ遺伝子の単離 上記染色体ＤＮＡライブラリーからのアルカリ性キシラ
ナーゼ遺伝子を含むクローンの選抜は、該ＤＮＡライブ
ラリーを用いて大腸菌を形質転換した後、キシラン培地
に塗布し、コロニー周辺のハロー形成を指標に行った。
すなわち、該ＤＮＡライブラリーを用いて大腸菌を形質
転換した後、100 μg/mlのアンピシリンを含むキシラン
培地（１％キシラン（コムギ由来；シグマ社製）、１％
ペプトン、0.５％酵母抽出物、0.５％ NaCl、２％寒天
（pH 7.0））に塗布し、37℃で一晩培養し、ハロー形成
を観察した。得られたクローンよりプラスミドＤＮＡを
アルカリ抽出法により大量に調製し、超遠心分離（16時
間, 20℃）により精製し、塩基配列を決定した。塩基配
列の決定はPerkin-Elmer社製のキットを用いて行なっ
た。(3) Isolation of Xylanase Gene from DNA Library Selection of a clone containing the alkaline xylanase gene from the chromosomal DNA library was performed by transforming Escherichia coli using the DNA library and then transforming it into a xylan medium. The coating was performed, and halo formation around the colony was performed as an index.
That is, after transforming E. coli using the DNA library, a xylan medium containing 100 μg / ml ampicillin (1% xylan (derived from wheat; Sigma), 1%
Peptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl, 2% agar (pH 7.0)), and cultured at 37 ° C. overnight to observe halo formation. A large amount of plasmid DNA was prepared from the obtained clones by an alkali extraction method, purified by ultracentrifugation (16 hours, 20 ° C.), and the nucleotide sequence was determined. The nucleotide sequence was determined using a Perkin-Elmer kit.

【００５６】その結果を配列番号2に示す。このキシラ
ナーゼ遺伝子の塩基配列からキシラナーゼのアミノ酸配
列を推定した結果を配列番号１に示す。なお、得られた
アルカリ性キシラナーゼ遺伝子を含む大腸菌形質転換株
E. coli JM109/pBS35-2は、平成11年12月3日に工業技術
院生命工学工業技術研究所(茨城県つくば市東1丁目１の
３)にFERM P-17670として寄託されている。The result is shown in SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO: 1 shows the result of estimating the amino acid sequence of xylanase from the base sequence of this xylanase gene. In addition, Escherichia coli transformed strain containing the obtained alkaline xylanase gene
E. coli JM109 / pBS35-2 has been deposited as FERM P-17670 with the Institute of Biotechnology and Industrial Technology (1-3-3, Higashi, Tsukuba, Ibaraki) on December 3, 1999.

【００５７】〔実施例 ３〕遺伝子組換え型アルカリ性
キシラナーゼの製造 本実施例では、遺伝子組換え型アルカリ性キシラナーゼ
の製造を行った。実施例２で構築したプラスミドpBS35-
2を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。得られた
形質転換体を、100 μg/mlのアンピシリンを含むキシラ
ン培地（１％キシラン（コムギ由来；シグマ社製）、１
％ペプトン、0.５％酵母抽出物、0.５％NaCl（pH 7.
0））中で37℃で一晩振盪培養した後、遠心分離（10,00
0rpm ×10分） を行い培養上清を回収した。培養上清中
のアルカリ性キシラナーゼの活性は、培養開始後48時間
で20U/ml であった。得られた組換え型キシラナーゼを
＃35−2と称し、下記実施例４〜７のパルプの漂白に使
用した。Example 3 Production of Recombinant Alkaline Xylanase In this example, a recombinant alkaline xylanase was produced. Plasmid pBS35- constructed in Example 2
2 was used to transform Escherichia coli JM109. The obtained transformant was transformed into a xylan medium (1% xylan (derived from wheat; Sigma), containing 100 μg / ml ampicillin,
% Peptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl (pH 7.
0)), shake culture at 37 ° C overnight, and then centrifuge (10,00
(0 rpm × 10 minutes) to collect the culture supernatant. The activity of alkaline xylanase in the culture supernatant was 20 U / ml 48 hours after the start of the culture. The obtained recombinant xylanase was called # 35-2 and was used for bleaching the pulp of Examples 4 to 7 below.

【００５８】〔実施例 ４〕パルプの漂白 広葉樹酸素晒クラフトパルプ（カッパー価8.５、白色度
46.0％）に実施例３で得られた組換え型アルカリキシラ
ナーゼを含む培養上清をパルプ絶乾重量１ｇあたり２ユ
ニット（U）添加してパルプ濃度３％、pH9.5、60℃にて
1時間反応させた。反応終了後、パルプから搾った上清
の全糖量をフェノール−硫酸法で測定したところ全糖濃
度は2.4 mg/mlであった。続いてこの上清をダイオネッ
クス社製のイオン交換クロマトグラフィーにより分析し
た。検出はインテグレーテッドアンペロメトリーで行っ
た。結果を図2に示すが、図２から明らかなように、パ
ルプから酵素処理によってキシロオリゴ糖が生成してい
ることが判る。Example 4 Bleaching of Pulp Hardwood oxygen bleached kraft pulp (Kappa number 8.5, whiteness)
46.0%) and the culture supernatant containing the recombinant alkaline xylanase obtained in Example 3 was added at 2 units (U) per 1 g of absolute pulp dry weight, and the pulp concentration was 3%, pH 9.5, and 60 ° C.
The reaction was performed for 1 hour. After the reaction was completed, the total sugar content of the supernatant squeezed from the pulp was measured by the phenol-sulfuric acid method, and the total sugar concentration was 2.4 mg / ml. Subsequently, the supernatant was analyzed by ion exchange chromatography manufactured by Dionex. Detection was performed by integrated amperometry. The results are shown in FIG. 2. As is clear from FIG. 2, it can be seen that xylo-oligosaccharide was produced from the pulp by the enzyme treatment.

【００５９】搾ったパルプは濃度を10％に調製して、次
いで漂白シーケンス、塩素段（Ｃ）−アルカリ抽出段
（Ｅ／Ｏ）−二酸化塩素段（ｄｎＤ）で漂白する。各薬
品添加量は一定で処理しＤ後の白色度で漂白性を判断す
る。酵素段後のシーケンスの添加量を一定にしたのは酵
素段での漂白効果（ΔＫα価、白色度）が判断しやすい
ためである。各段の処理条件は以下の通りである。 Ｃ段：塩素添加率 1.2 %、５５℃、３０分、 Ｅ／Ｏ段：苛性ソーダ 0.64 %、酸素添加1.5kg/cm²、 ｄ段：二酸化塩素 0.11 %、７０℃、８分、 ｎ段：苛性ソーダ 0.08 %、７０℃、２分、 Ｄ段：二酸化塩素 0.14 %、７０℃、１８０分。 薬品添加率は対パルプ添加率を示す。The squeezed pulp is adjusted to a concentration of 10% and then bleached in a bleaching sequence, chlorine stage (C) -alkali extraction stage (E / O) -chlorine dioxide stage (dnD). The amount of each chemical added is kept constant, and the bleachability is determined by the whiteness after D. The reason why the amount of the sequence added after the enzyme stage was kept constant is that the bleaching effect (ΔKα value, whiteness) at the enzyme stage can be easily determined. The processing conditions of each stage are as follows. Stage C: chlorine addition rate 1.2%, 55 ° C, 30 minutes, E / O stage: caustic soda 0.64%, oxygen addition 1.5kg / cm ² , stage d: chlorine dioxide 0.11%, 70 ° C, 8 minutes, n stage: caustic soda 0.08%, 70 ° C, 2 minutes, D stage: chlorine dioxide 0.14%, 70 ° C, 180 minutes. The chemical addition rate indicates the pulp addition rate.

【００６０】このように漂白したパルプの白色度を酵素
処理をしない場合と比較すると、表４(下記)に示したよ
うに本発明の酵素で処理した場合は白色度（Ｄ後白色
度）が比較例の値よりも2.6ポイント向上した。When the whiteness of the pulp bleached in this way is compared with the case where the enzyme treatment is not performed, the whiteness (whiteness after D) is higher when the pulp is treated with the enzyme of the present invention as shown in Table 4 (below). 2.6 points higher than the value of the comparative example.

【００６１】〔実施例５〕パルプの漂白 パルプの酵素処理のpHを8.0で行った以外は実施例４と
同様に行った。結果は表４(下記)に示したように白色度
（Ｄ後白色度）が比較例の値よりも3.2ポイント向上し
た。[Example 5] Bleaching of pulp The pulp was treated in the same manner as in Example 4 except that the pH of the enzyme treatment was set to 8.0. As a result, as shown in Table 4 (below), the whiteness (whiteness after D) was improved by 3.2 points from the value of the comparative example.

【００６２】〔実施例６〕パルプの漂白 パルプの酵素処理のpHを8.5で行った以外は実施例４と
同様に行った。結果は表４(下記)示したように白色度が
（Ｄ後白色度）比較例の値よりも3.7ポイント向上して
いた。[Example 6] Bleaching of pulp The pulp was treated in the same manner as in Example 4 except that the enzyme treatment of the pulp was performed at pH 8.5. As a result, as shown in Table 4 (below), the whiteness (whiteness after D) was improved by 3.7 points from the value of the comparative example.

【００６３】〔実施例７〕パルプの漂白 パルプの酵素処理のpHを10.2で行った以外は実施例４と
同様に行った。結果は表４(下記)に示したように白色度
（Ｄ後白色度）が比較例の値よも1.9ポイント向上して
いた。[Example 7] Bleaching of pulp The same procedure as in Example 4 was carried out except that the pH of the enzyme treatment of the pulp was changed to 10.2. As a result, as shown in Table 4 (below), the whiteness (whiteness after D) was improved by 1.9 points from the value of the comparative example.

【００６４】〔比較例〕パルプの漂白 パルプの酵素処理を行わずに実施例４と同様に行った。
結果は表４（下記）に示したように白色度（Ｄ後白色
度）が82.1ポイントであり、この値は本発明の酵素で処
理した場合の白色度(84〜85.8ポイント)より低い。上記
実施例４〜７の結果から、本発明の酵素はpH9.5以上の
アルカリ性条件において優れたパルプの漂白効果を示す
ことが判った。[Comparative Example] Bleaching of pulp The same procedure as in Example 4 was carried out, except that the pulp was not treated with an enzyme.
As a result, as shown in Table 4 (below), the whiteness (whiteness after D) was 82.1 points, which was lower than the whiteness when treated with the enzyme of the present invention (84 to 85.8 points). From the results of Examples 4 to 7, it was found that the enzyme of the present invention exhibited excellent pulp bleaching effect under alkaline conditions of pH 9.5 or more.

【００６５】[0065]

【表４】 [Table 4]

【００６６】[0066]

【発明の効果】本発明により、新規なアルカリ性キシラ
ナーゼおよびその遺伝子、アルカリ性キシラナーゼの製
造方法、並びにその用途を提供することができる。した
がって本発明は、アルカリ性キシラナーゼの工業的生産
に寄与するものである。また本発明のアルカリ性キシラ
ナーゼおよび／または本発明の菌株（バチルス・ハロデ
ジュランス＃35）の培養菌体もしくはその培養処理物を
用いてパルプに処理することにより、パルプの漂白性を
向上させ、紙パルプ製造において塩素等の薬品低減、排
水中のＡＯＸ低減等に貢献するものである。According to the present invention, a novel alkaline xylanase and its gene, a method for producing alkaline xylanase, and its use can be provided. Therefore, the present invention contributes to the industrial production of alkaline xylanase. Further, the pulp is treated with the cultured bacterium of the alkaline xylanase of the present invention and / or the bacterial strain of the present invention (Bacillus halodedurans # 35) or a cultured product thereof, thereby improving the bleachability of the pulp and producing paper pulp. And contributes to the reduction of chemicals such as chlorine and the reduction of AOX in wastewater.

【００６７】[0067]

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110>Oji Paper Co., Ltd. <120>Alkaline Xylanase and Process for Preparing the Same <130>P00-0011 <140> <141> <160>2 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210>1 <211>210 <212>PRT <213>Bacillus halodurans #35 <400>1 Met Phe Lys Phe Val Thr Lys Val Leu Thr Val Val Ile Ala Ala Thr 1 5 10 15 Ile Ser Phe Cys Leu Ser Ala Val Pro Ala Ser Ala Asn Thr Tyr Trp 20 25 30 Gln Tyr Trp Thr Asp Gly Gly Gly Thr Val Asn Ala Thr Asn Gly Pro 35 40 45 Gly Gly Asn Tyr Ser Val Thr Trp Arg Asp Thr Gly Asn Phe Val Val 50 55 60 Gly Lys Gly Trp Glu Ile Gly Ser Pro Asn Arg Thr Ile His Tyr Asn 65 70 75 80 Ala Gly Val Trp Glu Pro Ser Gly Asn Gly Tyr Leu Thr Leu Tyr Gly 85 90 95 Trp Thr Arg Asn Gln Leu Ile Glu Tyr Tyr Val Val Asp Asn Trp Gly 100 105 110 Thr Tyr Arg Pro Thr Gly Thr His Arg Gly Thr Val Val Ser Asp Gly 115 120 125 Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Thr Thr Met Arg Tyr Asn Ala Pro Ser Ile 130 135 140 Asp Gly Thr Gln Thr Phe Gln Gln Phe Trp Ser Val Arg Gln Ser Lys 145 150 155 160 Arg Pro Thr Gly Asn Asn Val Ser Ile Thr Phe Ser Asn His Val Asn 165 170 175 Ala Trp Arg Asn Ala Gly Met Asn Leu Gly Ser Ser Trp Ser Tyr Gln 180 185 190 Val Leu Ala Thr Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Arg Ser Asn Val Thr 195 200 205 Val Trp 210 <210>2 <211>801 <212>DNA <213>Bacillus halodurans #35 <220> <221>mat peptide <222>(58)..(687) <400>2 aatcgacaac aaacgtgtaa ataagtagta cgataaaaat tttgaggagg acgaatcatg 60 tttaagttcg ttacgaaagt tttgacggta gtaattgcag ctacaattag tttttgtttg 120 agtgcagtac cggcaagtgc taatacctat tggcaatatt ggaccgatgg tggtggaaca 180 gtaaatgcta caaatggacc tggtggaaat tacagtgtga catggagaga tacagggaac 240 tttgttgtcg gtaaaggctg ggaaatcggt tcaccaaatc gaacgatcca ttacaatgct 300 ggtgtctggg aaccgtctgg aaatggatat ttgactctct atgggtggac aaggaatcag 360 ctcatagaat attatgtcgt tgataattgg ggaacttaca gacctactgg aacccatcga 420 ggcaccgttg tcagtgatgg gggaacatat gacatctata cgactatgcg atacaatgca 480 ccttccattg atgggacaca aacgttccaa cagttctgga gtgtgaggca atcgaagaga 540 ccgactggaa ataacgttag cattacgttt agcaaccacg tgaatgcgtg gagaaatgca 600 ggaatgaatc tgggaagtag ttggtcttac caggtattag caacagaagg ctatcaaagt 660 agcgggagat cgaatgtaac ggtttggtag aacgagaaag acggaattaa ctttctgaat 720 atttaaaaat aaatctattg ttgtgacgaa cttaagattt actcattaag aagaatgaag 780 cggagcggtc aggggctcga g 801[Sequence List] SEQUENCE LISTING <110> Oji Paper Co., Ltd. <120> Alkaline Xylanase and Process for Preparing the Same <130> P00-0011 <140><141><160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 210 <212> PRT <213> Bacillus halodurans # 35 <400> 1 Met Phe Lys Phe Val Thr Lys Val Leu Thr Val Val Ile Ala Ala Thr1 5 10 15 Ile Ser Phe Cys Leu Ser Ala Val Pro Ala Ser Ala Asn Thr Tyr Trp 20 25 30 Gln Tyr Trp Thr Asp Gly Gly Gly Thr Val Asn Ala Thr Asn Gly Pro 35 40 45 Gly Gly Asn Tyr Ser Val Thr Trp Arg Asp Thr Gly Asn Phe Val Val 50 55 60 Gly Lys Gly Trp Glu Ile Gly Ser Pro Asn Arg Thr Ile His Tyr Asn 65 70 75 80 Ala Gly Val Trp Glu Pro Ser Gly Asn Gly Tyr Leu Thr Leu Tyr Gly 85 90 95 Trp Thr Arg Asn Gln Leu Ile Glu Tyr Tyr Val Val Asp Asn Trp Gly 100 105 110 Thr Tyr Arg Pro Thr Gly Thr His Arg Gly Thr Val Val Ser Asp Gly 115 120 125 Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Thr Thr Met Arg Tyr Asn Ala Pro Ser Ile 130 135 140 Asp Gly Thr Gln Thr Phe Gln Gln Phe Trp Ser Val Arg Gln Ser Lys 145 150 155 160 Arg Pro Thr Gly Asn Asn Val Ser Ile Thr Phe Ser Asn His Val Asn 165 170 175 Ala Trp Arg Asn Ala Gly Met Asn Leu Gly Ser Ser Trp Ser Tyr Gln 180 185 190 Val Leu Ala Thr Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Arg Ser Asn Val Thr 195 200 205 Val Trp 210 <210> 2 <211> 801 <212> DNA <213> Bacillus halodurans # 35 <220><221> mat peptide <222> (58) .. (687) <400> 2 aatcgacaac aaacgtgtaa ataagtagta cgataaaaat tttgaggagg acgaatcatg 60 tttaagttcg ttacgaaagt tttgacggta gtaattgcag ctacaattag tttttgtttg 120 agtgcagtac cggcaagtgc taatacctat tggcaatatt ggaccgatgg tggtggaaca 180 gtaaatgcta caaatggacc tggtggaaat tacagtgtga catggagaga tacagggaac 240 tttgttgtcg gtaaaggctg ggaaatcggt tcaccaaatc gaacgatcca ttacaatgct 300 ggtgtctggg aaccgtctgg aaatggatat ttgactctct atgggtggac aaggaatcag 360 ctcatagaat attatgtcgt tgataattgg ggaacttaca gacctactgg aacccatcga 420 ggcaccgttg tcagtgatgg gggaacatat gacatctata cgactatgcg atacaatgca 480 ccttccattg atgggacaca aacgttccaa cagttctgga gtgtgaggca atcgaagaga 540 ccgactggaa ataacgttag cattacgttt agcaaccacg tgaatgcgtg gagaaatgca 600 ggaatgaatc tgggaagtag ttggtcttac caggtattag caacagaagg ctatcaaagt 660 agcgggagat cgaatgtaac ggtttggtag aacgagaaag acggaattaa ctttctgaat 720 atttaaaaat aaatctattg ttgtgacgaa cttaagattt actcattaag aagaatgaag 780 cggagcggtc aggggctcga g 801

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図1】本発明の酵素の至適pHを示す。FIG. 1 shows the optimum pH of the enzyme of the present invention.

【図2】カバキシランに本発明の酵素を作用させたとき
の反応生成物のイオンクロマトグラフィー分析の結果を
示す図である。図中、縦軸はインテグレーテッドアンペ
ロメトリーで検出した数値nCを、横軸は保持時間(分)を
示す。６分のピークがキシロースおよびグルコース、９
分以降のピークが溶出の早い方から順にキシロビオー
ス、キシロトリオース、キシロテトラオースと続くキシ
ロオリゴ糖のピークである。FIG. 2 is a graph showing the results of ion chromatography analysis of a reaction product when the enzyme of the present invention is allowed to act on birch silane. In the figure, the vertical axis indicates the numerical value nC detected by integrated amperometry, and the horizontal axis indicates the retention time (minute). The 6 minute peak is xylose and glucose, 9
The peaks after the minute are xylobiose, xylotriose, and xylotetraose, followed by the xylooligosaccharide peak in the order of elution.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 中村 幸爾 鳥取県米子市吉岡373 王子製紙株式会社 米子工場内 (72)発明者 塚本 晃 東京都江東区東雲一丁目10番６号 王子製 紙株式会社新技術研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA12 CA04 DA06 EA04 GA11 HA01 HA06 4B050 CC03 DD02 LL10 4B065 AA15X AA26Y AB01 AC02 AC06 AC14 BA02 CA31 CA60 4L055 AD17 AD20 BB22 BB25 FA05──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C12R 1:07) C12R 1:07) (C12N 1/21 (C12N 9/24 C12R 1:07) C12R 1 : 07) (C12N 9/24 C12N 15/00 ZNAA C12R 1:07) C12R 1:07) (72) Inventor Koji Nakamura 373 Yoshioka, Yonago, Tottori Oji Paper Co., Ltd. Yonago Mill (72) Inventor Tsukamoto Akira 1-10-6 Shinonome, Koto-ku, Tokyo Oji Paper Co., Ltd. New Technology Laboratory F-term (reference) AD17 AD20 BB22 BB25 FA05

Claims (16)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 配列番号１で表されるアミノ酸配列から
なるか、または該アミノ酸配列において１個もしくは数
個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加を有するアミノ
酸配列からなりかつpH9.5以上のアルカリ性条件下でパ
ルプの漂白作用をもつことを特徴とするアルカリ性キシ
ラナーゼ。An alkaline solution having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having one or several amino acid deletions, substitutions or additions in the amino acid sequence and having a pH of 9.5 or more. An alkaline xylanase having a pulp bleaching action under conditions. 【請求項２】 天然から単離されたものであるか、天然
単離物の変異によって得られたものであるか、あるいは
遺伝子組換えによって得られたものである、請求項１に
記載のアルカリ性キシラナーゼ。2. The alkaline composition according to claim 1, which is isolated from nature, obtained by mutation of a natural isolate, or obtained by genetic recombination. Xylanase. 【請求項３】 バチルス・ハロデュランス#35株（FERM
P-17671）またはそれから誘導された変異株が産生する
ものである、請求項１または２に記載のアルカリ性キシ
ラナーゼ。3. A Bacillus halodurans strain # 35 (FERM)
The alkaline xylanase according to claim 1 or 2, which is produced by P-17671) or a mutant derived therefrom. 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか１項に記載され
たアルカリ性キシラナーゼをコードするＤＮＡ。4. A DNA encoding the alkaline xylanase according to any one of claims 1 to 3. 【請求項５】 配列番号２のヌクレオチド配列58〜687
を少なくとも含む配列からなる、請求項４に記載のＤＮ
Ａ。5. The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 from 58 to 687.
5. The DN according to claim 4, comprising a sequence comprising at least
A. 【請求項６】 請求項１〜３のいずれか1項に記載のア
ルカリ性キシラナーゼを生産するバチルス（Bacillus）
属に属する微生物を培地に培養し、得られる培養物から
該アルカリ性キシラナーゼを採取することを含む、アル
カリ性キシラナーゼの製造方法。6. A Bacillus which produces the alkaline xylanase according to any one of claims 1 to 3.
A method for producing alkaline xylanase, comprising culturing a microorganism belonging to the genus in a medium and collecting the alkaline xylanase from the resulting culture. 【請求項７】 微生物がバチルス・ハロデュランス株で
ある、請求項６に記載の方法。7. The method according to claim 6, wherein the microorganism is a Bacillus halodurans strain. 【請求項８】 微生物がバチルス・ハロデュランス#35
株（FERM P-17671）またはその株から誘導される変異株
である、請求項７に記載の方法。The microorganism may be Bacillus halodurans # 35.
The method according to claim 7, which is a strain (FERM P-17671) or a mutant derived from the strain. 【請求項９】 請求項１に記載のアルカリ性キシラナー
ゼを生産する能力を有する、バチルス・ハロデュランス
#35株またはその株から誘導される変異株。9. A Bacillus halodurans having an ability to produce the alkaline xylanase according to claim 1.
# 35 strain or a mutant derived from the strain. 【請求項１０】 請求項４または５に記載のＤＮＡを含
む組換えベクター。A recombinant vector comprising the DNA according to claim 4 or 5. 【請求項１１】 請求項10に記載の組換えベクターによ
って形質転換された宿主細胞。11. A host cell transformed by the recombinant vector according to claim 10. 【請求項１２】 宿主細胞が大腸菌である、請求項11に
記載の宿主細胞。12. The host cell according to claim 11, wherein the host cell is Escherichia coli. 【請求項１３】 請求項11または12に記載の宿主細胞を
培地に培養し、得られる培養物から請求項1〜３のいず
れかに記載のアルカリ性キシラナーゼを採取することを
含む、遺伝子組換え型アルカリ性キシラナーゼの製造方
法。13. A genetically modified type comprising culturing the host cell according to claim 11 or 12 in a medium and collecting the alkaline xylanase according to claim 1 from the resulting culture. A method for producing alkaline xylanase. 【請求項１４】 請求項１〜３のいずれかに記載のアル
カリ性キシラナーゼを生産するバチルス属に属する微生
物、あるいは請求項11または12に記載の宿主細胞、を培
地に培養して得られるアルカリ性キシラナーゼ酵素また
は該酵素を含む培養処理物を有効成分として含む漂白
剤。14. An alkaline xylanase enzyme obtained by culturing a microorganism belonging to the genus Bacillus producing the alkaline xylanase according to any one of claims 1 to 3 or the host cell according to claim 11 or 12 in a medium. Alternatively, a bleach containing a culture product containing the enzyme as an active ingredient. 【請求項１５】 請求項14記載の漂白剤を用いてパルプ
を処理することを含む、パルプの漂白方法。15. A method for bleaching pulp, comprising treating pulp with the bleaching agent according to claim 14. 【請求項１６】 化学漂白および／またはアルカリ抽出
を、前記パルプの処理前、処理後又は処理中のいずれか
に行なうことをさらに含む、請求項15に記載の方法。16. The method according to claim 15, further comprising performing chemical bleaching and / or alkali extraction either before, after or during the treatment of the pulp.