JP3880318B2 - Thermostable xylanase - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な耐熱性キシラナーゼ、その製造方法及びその用途、耐熱性キシラナーゼ遺伝子並びに耐熱性キシラナーゼを生産する微生物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
キシラナーゼはキシランを分解する酵素であり、製紙用パルプの漂白前処理用酵素として、又は機能性キシロオリゴ糖の製造用として用いられる有用酵素である。Viikari らがキシラナーゼによりクラフトパルプの漂白性が向上することを報告（3rd international conference on biotechnology in the pulp and paper industry 1986年講演要旨集 p.67）して以来、紙パルプ産業においてキシラナーゼが注目され始めているが、パルプ製造工程中にはクラフト蒸解や漂白工程等高温条件が多いことから、これらの工程中に効率よくキシラナーゼを用いるにあたっては耐熱性の高いキシラナーゼが求められている。耐熱性キシラナーゼを用いることで、高温での酵素反応が可能になるために冷却の設備やエネルギーが削減できると共に酵素反応中の雑菌の繁殖も防ぐことができるからである。
【０００３】
一方、微生物の有する酵素生産能力が高い方が酵素製造のコストダウンに有利であることは自明である。そこで、耐熱性の高いキシラナーゼとその酵素を高生産する微生物が求められている。キシラナーゼを生産する微生物としてはキシラナーゼの総説（Wong et al.,Microbiological Reviews, Sept.,305,1988）等によれば、アスペルギルス（Aspergillus）属、トリコデルマ（Trichoderma）属、アウレオバシデウム（Aureobasidium）属、スエヒロタケ（Schizophyllum commune）等の糸状菌、バチルス（Bacillus）属やクロストリジウム（Clostridium）属、ストレプトミセス（Streptomyces）属等の細菌類等数多くの微生物が知られている。そして、これらの微生物から生産されるキシラナーゼの反応ｐＨは酸性乃至中性、反応温度は40℃〜80℃である。また、アルカリ側で活性を有するアルカリキシラナーゼを生産する微生物も知られており、例えば、バチルス（Bacillus）属（Honda et al., System.Appl.Microbiol., 8,152,1986, Okazaki et al., Appl.Microbiol.and Biotechnol., 19,335,1984）、アエロモナス（Aeromonas）属（Ohkoshi et al.,Agric.Biol.Chem.,49,3037,1985）又はストレプトミセス（Streptomyces）属（Vyas et al.,Biotechnol.Let.,12,225,1990）に属する微生物等が知られている。
【０００４】
これらのキシラナーゼを生産する微生物のうち、糸状菌では、キシラナーゼの他にセルラーゼを生産するものが多く、紙パルプ製造工程に使用する上で紙の収率や強度の低下をきたす恐れがある等の問題点がある。しかも、糸状菌は細菌に比べて培養期間が長い。また、細菌ではキシラナーゼ生産性が低いという問題点がある。
【０００５】
近年、Viikari らは、耐アルカリ性のバチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）VTT-E-87305 株を用い、ｐＨ８〜8.5、30℃、２日間の培養で高収量（400U/ml）のキシラナーゼを生産させたことを報告している（Appl.Microbiol.Biotechnol.,37,470,1992）。しかし、この酵素についての耐熱性は明らかではなく、培養温度も30℃と低いことから、高温下での酵素反応を行うことは困難である。
【０００６】
一方、バチルス属に属する微生物の生産する耐熱性キシラナーゼの精製については、好アルカリ好熱性バチルスＷ−１およびＷ−２から、分子量21,500、等電点8.5、反応至適ｐＨ6.0、反応至適温度65℃のＷ１−Ｉ耐熱性キシラナーゼ、及び、分子量22,500、等電点8.3、反応至適ｐＨ6.0、反応至適温度65℃のＷ２−Ｉ耐熱性キシラナーゼがそれぞれ報告されている（Okazaki et al.,Agric.Biol.Chem.,49,2033,1985）。
【０００７】
また、好熱性バチルスとして知られるバチルス・ステアロテルモフィルス（Bacillus stearothermophilus)については、T.Nanmori らがStrain 21 の培養濾液から分子量39,500、等電点5.1、反応至適ｐＨ7.0、反応至適温度60℃の耐熱性キシラナーゼを精製し、生産したことを報告している（J.Bacteriol.,172,6669,1990）。しかし、その生産量は55℃、２日間の培養で1.96 U/ml に過ぎない。
【０００８】
さらに、キシラナーゼの利用法について、パルプにキシラナーゼを作用させて漂白薬品やＡＯＸ（吸着性有機ハロゲン化合物、特に有機塩素化合物）を低減させようとする試みがいくつか報告されている（例えば、特開平2-210085号公報、特開平2-210086号公報、特開平2-221482号公報、特開平2-264087号公報、特開平2-293486号公報、特開平3-40887 号公報、特開平3-505785号公報、L.S.Pederson et al.,Production of bleached chemical pulp in the future international pulp bleaching conference, Vol.2,107,1991、紙パルプ技術タイムズ,5,20,1992、S. Hogman et al.,Biotechnology in Pulp and Paper Industry, Uni Publishers Co.,Ltd.,p.107,1992、Viikari et al.,Biotechnology in Pulp and Paper Industry, Uni Publishers Co.,Ltd.,p.101,1992）。
【０００９】
しかし、これらの試みでは、紙パルプ製造工程における漂白工程では40〜100℃の高温処理が必要とされる一方、その工程中に酵素処理を組み込むために耐熱性を持たない酵素を使用しなければならないことも多く、この場合は、その反応至適温度までパルプを冷却し、また次の工程のために加温しなければならず、多大なエネルギーが必要になる。
【００１０】
従って、高温条件下で製造することによって冷却設備を不要とするか又は冷却水の節約を可能とし、しかも雑菌混入の可能性を少なくさせ、低コストで製造することが可能な酵素である耐熱性のキシラナーゼが望まれている。さらに、遺伝子組換え技術により耐熱性キシラナーゼをコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を発現させることによりキシラナーゼを大量に得ることも望まれている。
【００１１】
キシラナーゼ遺伝子については現在までに多数の報告がなされている。例えば、細菌由来についてはバチルス・サーキュランス（Bacillus circulans; YANGR.C.A. et al., NUCLEIC ACIDS RES. 16:7187-7187(1988)) 、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis; PAICE M.G. et al., ARCH.MICROBIOL.144:201-206(1986)) 、シュードモナス・フルオレッセンス (Pseudomonas fluorescens; KELLETT L.E. et al.,BIOCHEM.J.272:369-376(1990)) およびルミノコッカス・フラベファシエンス (Ruminococcus flavefaciens; ZHANG J.-X. et al., MOL.MICROBIOL. 6:1013-1023(1992) などが、カビ由来についてはクロストリジウム・アセトブチリカム (Clostridium acetobutylicum; ZAPPE. et al., NUCLEIC ACIDS RES. 18:2179-2179-(1990))、アスペルギルス・アワモリ (Aspergillus awamori; ITO K. et al., BIOSCI.BIOTECHNOL.BIOCHEM. 56:1338-1340(1992))およびストレプトミセス・リビダンス (Streptomyces lividans; SHARECK F. et al., GENE 107:75-82(1991)) などがある。しかしながら、これらの遺伝子を用いた組換え体により製造された酵素は、漂白に適したものであるか否か明らかでない。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規な耐熱性キシラナーゼ、その製造方法及びその用途、耐熱性キシラナーゼ遺伝子並びに耐熱性キシラナーゼを生産する微生物を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決しようとする手段】
本発明者らは上記課題に基づいて鋭意研究を行い、耐熱性キシラナーゼ高生産菌を求め、鋭意広範なスクリーニングを行なった結果、東京都江東区東雲の土壌中から耐熱性キシラナーゼを生産する微生物を見い出し、該微生物の培養物中から耐熱性において優れた性質を有する耐熱性キシラナーゼＸＰ１及びＸＰ２を見い出し、更に該耐熱性キシラナーゼをコードする遺伝子をクローニングし、高発現させることに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は、以下の理化学的性質を有する耐熱性キシラナーゼＸＰ１又はＸＰ２から選ばれる耐熱性キシラナーゼである。
【００１５】
（１）以下の理化学的性質を有する耐熱性キシラナーゼＸＰ１（以下、単にＸＰ１という）。
▲１▼ 作用：キシランの1,4-β-D-キシロシド結合を加水分解し、キシロオリゴ糖の還元糖を生成する。
【００１６】
▲２▼ 基質特異性：カバキシラン、小麦キシラン等の調製キシランの他、キシランを含有する広葉樹クラフトパルプ、小麦フスマ等に作用する。
▲３▼ 至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：反応の至適ｐＨ範囲はｐＨ５〜８であり、安定ｐＨ範囲は３〜９である。
【００１７】
▲４▼ 作用適温の範囲：50〜80℃の範囲にある。
▲５▼ 熱安定性：50℃、30分の処理で約90％以上の酵素活性を保持し、60℃、30分の処理でも約50％以上の残存活性を示す。
【００１８】
▲６▼ 等電点：8.1付近である。
▲７▼ 分子量：ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定した結果、約22,500である。
▲８▼ 阻害：ヨード酢酸、ＥＤＴＡにより弱く阻害を受け、Hg²+、ＳＤＳにより強く阻害される。
【００１９】
（２）以下の理化学的性質を有する耐熱性キシラナーゼＸＰ２（以下、単にＸＰ２という）。
▲１▼ 作用：キシランの1,4-β-D-キシロシド結合を加水分解し、キシロース及びキシロオリゴ糖の還元糖を生成する。
【００２０】
▲２▼ 基質特異性：カバキシラン、小麦キシラン等の調製キシランの他、キシランを含有する広葉樹クラフトパルプ、小麦フスマ等に作用する。
【００２１】
▲３▼ 至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：反応の至適ｐＨ範囲はｐＨ５〜８であり、安定ｐＨ範囲は4.5〜９である。
▲４▼ 作用適温の範囲：60〜90℃の範囲にある。
▲５▼ 熱安定性：70℃、30分の処理で約90％の残存活性を示す。
【００２２】
▲６▼ 等電点：8.5付近である。
▲７▼ 分子量：ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定した結果、約32,000である。
▲８▼ 阻害：Mn²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、ＥＤＴＡ、ヨード酢酸により弱く阻害を受け、Hg²⁺、ＳＤＳにより強く阻害される。
【００２３】
さらに、本発明は、上記耐熱性キシラナーゼを生産するバチルス（Bacillus）属に属する微生物を培地に培養し、得られる培養物から該耐熱性キシラナーゼを採取することを特徴とする前記耐熱性キシラナーゼの製造方法である。ここで、微生物としては、例えばバチルス・エスピー２１１３又はバチルス・エスピー２０８が挙げられる。
【００２４】
さらに、本発明は、耐熱性キシラーゼの生産能を有するバチルス・エスピー２１１３又はバチルス・エスピー２０８である。さらに、本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を実質的にコードする塩基配列又は配列番号２で表される塩基配列を実質的に含む耐熱性キシラナーゼ遺伝子である。
【００２５】
ここで、「実質的に」とあるのは、このペプチドが耐熱性キシラナーゼ酵素活性を有する限り、又は塩基配列が耐熱性キシラナーゼをコードするものである限り、アミノ酸若しくは塩基配列に欠失、置換又は付加等の変化があってもよいことを意味するものである。さらに、本発明は、以下の理化学的性質を有する遺伝子組換え型耐熱性キシラナーゼＸＰ１又は遺伝子組換え型耐熱性キシラナーゼＸＰ２から選ばれる耐熱性キシラナーゼである。
（１）下記の理化学的性質を有する遺伝子組換え型耐熱性キシラナーゼＸＰ１
▲１▼ 作用：キシランの1,4-β-D-キシロシド結合を加水分解し、キシロオリゴ糖の還元糖を生成する。
【００２６】
▲２▼ 基質特異性：カバキシラン、小麦キシラン等の調製キシランの他、キシランを含有する広葉樹クラフトパルプ、小麦フスマ等に作用する。
▲３▼ 至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：反応の至適ｐＨ範囲はｐＨ５〜８であり、安定ｐＨ範囲は３〜９である。
【００２７】
▲４▼ 作用適温の範囲：50〜80℃の範囲にある。
▲５▼ 熱安定性：50℃、30分の処理で約90％以上の酵素活性を保持し、60℃、30分の処理でも約50％以上の残存活性を示す。
【００２８】
▲６▼ 等電点：8.1付近である。
▲７▼ 分子量：ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定した結果、約22,500である。
▲８▼ 阻害：ヨード酢酸、ＥＤＴＡにより弱く阻害を受け、Hg²⁺、ＳＤＳにより強く阻害される。
（２）下記の理化学的性質を有する遺伝子組換え型耐熱性キシラナーゼＸＰ２
▲１▼ 作用：キシランの1,4-β-D-キシロシド結合を加水分解し、キシロース及びキシロオリゴ糖の還元糖を生成する。
【００２９】
▲２▼ 基質特異性：カバキシラン、小麦キシラン等の調製キシランの他、キシランを含有する広葉樹クラフトパルプ、小麦フスマ等に作用する。
▲３▼ 至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：反応の至適ｐＨ範囲はｐＨ５〜８であり、安定ｐＨ範囲は4.5〜９である。
【００３０】
▲４▼ 作用適温の範囲：60〜90℃の範囲にある。
▲５▼ 熱安定性：70℃、30分の処理で約90％以上の残存活性を示す。
▲６▼ 等電点：8.5付近である。
【００３１】
▲７▼ 分子量：ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定した結果、約32,000である。
▲８▼ 阻害：
Mn²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、ＥＤＴＡ、ヨード酢酸により弱く阻害を受け、Hg²⁺、ＳＤＳにより強く阻害される。
【００３２】
さらに、本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を実質的に含む遺伝子組換え型耐熱性キシラナーゼである。さらに、本発明は、前記耐熱性キシラナーゼ遺伝子を含む組換えベクターである。さらに、本発明は、前記組換えベクターによって形質転換された形質転換体である。さらに、本発明は、前記形質転換体を培地に培養し、得られる培養物から遺伝子組換え型耐熱性キシラナーゼを採取することを特徴とする遺伝子組換え型耐熱性キシラナーゼの製造方法である。さらに、本発明は、前記耐熱性キシラナーゼを生産するバチルス属に属する微生物又は前記形質転換体を培地に培養して得られる培養物、あるいは以下の理化学的性質を有する耐熱性キシラナーゼＸＰ１若しくは遺伝子組換え型耐熱性キシラナーゼＸＰ１および／又は耐熱性キシラナーゼＸＰ２若しくは遺伝子組換え型耐熱性キシラナーゼＸＰ２を有効成分として含む漂白剤である。
（１）下記の理化学的性質を有する耐熱性キシラナーゼＸＰ１又は遺伝子組換え型耐熱性キシラナーゼＸＰ１
▲１▼ 作用：キシランの1,4-β-D-キシロシド結合を加水分解し、キシロオリゴ糖の還元糖を生成する。
【００３３】
▲２▼ 基質特異性：カバキシラン、小麦キシラン等の調製キシランの他、キシランを含有する広葉樹クラフトパルプ、小麦フスマ等に作用する。
▲３▼ 至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：反応の至適ｐＨ範囲はｐＨ５〜８であり、安定ｐＨ範囲は３〜９である。
【００３４】
▲４▼ 作用適温の範囲：50〜80℃の範囲にある。
▲５▼ 熱安定性：50℃、30分の処理で約90％以上の酵素活性を保持し、60℃、30分の処理でも約50％以上の残存活性を示す。
【００３５】
▲６▼ 等電点：8.1付近である。
▲７▼ 分子量：ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定した結果、約22,500である。
▲８▼ 阻害：ヨード酢酸、ＥＤＴＡにより弱く阻害を受け、Hg²⁺、ＳＤＳにより強く阻害される。
（２）下記の理化学的性質を有する耐熱性キシラナーゼＸＰ２又は遺伝子組換え型耐熱性キシラナーゼＸＰ２
▲１▼ 作用：キシランの1,4-β-D-キシロシド結合を加水分解し、キシロース及びキシロオリゴ糖の還元糖を生成する。
【００３６】
▲２▼ 基質特異性：カバキシラン、小麦キシラン等の調製キシランの他、キシランを含有する広葉樹クラフトパルプ、小麦フスマ等に作用する。
▲３▼ 至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：反応の至適ｐＨ範囲はｐＨ５〜８であり、安定ｐＨ範囲は4.5〜９である。
【００３７】
▲４▼ 作用適温の範囲：60〜90℃の範囲にある。
▲５▼ 熱安定性：70℃、30分の処理で約90％以上の残存活性を示す。
▲６▼ 等電点：8.5付近である。
【００３８】
▲７▼ 分子量：ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定した結果、約32,000である。
▲８▼ 阻害：Mn²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、ＥＤＴＡ、ヨード酢酸により弱く阻害を受け、Hg²⁺、ＳＤＳにより強く阻害される。
【００３９】
さらに、本発明は、前記漂白剤を用いてパルプを処理することを特徴とするパルプの漂白方法である。さらに、本発明は、前記漂白剤を用いてパルプを処理するにあたり、化学漂白及び／またはアルカリ抽出を、パルプ処理前、処理後又は処理中のいずれかに行なうことを特徴とするパルプの漂白方法である。
【００４０】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）酵素の理化学的性質
先ず、本発明の耐熱性キシラナーゼＸＰ１と耐熱性キシラナーゼＸＰ２の理化学的性質について説明すると、以下の通りである。
【００４１】
▲１▼ 作用
キシラン（カバ材由来、シグマ社製）の１％溶液（ｐＨ7.０、40mＭリン酸ナトリウム緩衝液）５mlにＸＰ１及びＸＰ２をそれぞれ10 Uずつ添加し、60℃にて反応させた。所定時間反応後に煮沸して反応を停止し、10μlを薄層クロマトグラフィーに供した。薄層はメルク社製のＨＰＴＬＣ Kieselgel60 Ｆ254を用い、展開溶媒はｎ−ブタノール：酢酸：水＝10：５：１とした。発色はジフェニルアミン−アニリン試薬を噴霧し、120℃にて10分間加熱して行った。
【００４２】
結果を図１に示す。図中の時間は酵素の反応時間を表す。この結果から、キシランに作用してＸＰ１はキシロオリゴ糖を、ＸＰ２はキシロース及びキシロオリゴ糖を生成することが明らかである。
▲２▼ 基質特異性
カバキシラン、小麦キシラン等の調製キシランの他、キシランを含有する広葉樹クラフトパルプ、小麦フスマ等に作用する。
【００４３】
▲３▼ 至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲
各酵素の反応至適ｐＨ及びｐＨ安定性を、グリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３以下）、酢酸緩衝液（ｐＨ４〜５）、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６〜７）、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８〜９）、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ9.１〜10.1）を用いて測定した。それぞれのｐＨで各酵素の酵素活性を測定した。
【００４４】
結果を図２に示す。図中、「○」はＸＰ１、「■」はＸＰ２を表す。図２より、ＸＰ１、ＸＰ２ともに酵素反応の至適ｐＨは５〜８であった。また、各酵素をそれぞれ50mＭの所定緩衝液中に４℃で二晩保持した後に酵素活性を測定した。結果を図３に示す。図中、「○」はＸＰ１、「■」はＸＰ２を表す。図３より、ＸＰ１はｐＨ3.０〜9.０で安定であり、ＸＰ２はｐＨ4.５〜9.０で安定であった。
【００４５】
▲４▼ 力価の測定法
キシラナーゼ活性の測定は次のように行った。キシラン（カバ材由来、シグマ社製）の１％溶液（ｐＨ6.５、1/10 McIlvaine緩衝液）200μｌに被検液50μｌを添加し、70℃にて５分間反応させる。ＤＮＳ試薬を500μｌ添加して５分間煮沸した後、直ちに氷冷して４mlの蒸留水を加えて500nmの吸光度を測定する。検量線は濃度既知のキシロースを用いて作製する。キシラナーゼの活性単位については上記の条件で１分間に１μmolの還元糖を生成する酵素量を１Unit（ユニット：Ｕ）とした。
【００４６】
▲５▼ 作用適温の範囲
反応温度を変えて各酵素の酵素活性を測定した。結果を図４に示す。図中、「○」はＸＰ１、「■」はＸＰ２を表す。図４より、至適温度はＸＰ１では70℃、ＸＰ２では80℃であった。また、所定の温度で50mＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.２）中に各酵素を30分間放置した後に酵素活性を測定した。
【００４７】
結果を図５に示す。図中、「○」はＸＰ１、「■」はＸＰ２を表す。図５より、ＸＰ１は 50℃、30分の処理で約90％以上の酵素活性を保持し、60℃、30分の処理でも約50％以上の残存活性を示した。一方、ＸＰ２は、70℃、30分の処理で約90％以上の残存活性を示した。
▲６▼ 等電点
SERVA社製PRECOAT ｐＨ３〜10による等電点電気泳動を行った結果、ＸＰ１の等電点は8.１、ＸＰ２の等電点は8.５であった。
【００４８】
▲７▼ 分子量
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定し、ＸＰ１の分子量は約22,500、ＸＰ２の分子量は約32,000であった。
▲８▼ 金属イオン、阻害剤の影響
種々の金属塩を１mＭになるように酵素液に添加して４℃で一晩保持した後、反応液中にも同種の金属塩を１mＭになるように添加してＸＰ１及びＸＰ２の酵素活性を測定した。
【００４９】
結果を表１に示す。表１より、ＸＰ１はHg2+で強く阻害され、ＸＰ２はMn²⁺、Co²⁺、Cu²⁺により弱く阻害され、Hg²⁺で強く阻害された。
【００５０】
【表１】

【００５１】
阻害剤等種々の物質を１mＭになるように酵素液中に添加し、４℃で一晩保持した後、反応液中にも同種の物質を１mＭになるようにＸＰ１、ＸＰ２の各酵素液中に添加して活性を測定した。結果を表２に示す。表２より、ＸＰ１は、ヨード酢酸、ＥＤＴＡにより弱く阻害され、ＳＤＳで強く阻害された。また、ＸＰ２はＥＤＴＡ、ヨード酢酸により弱く阻害され、ＳＤＳで強く阻害された。
【００５２】
【表２】

【００５３】
ところで、本発明の酵素は反応至適温度が70℃以上の耐熱性キシラナーゼであって、従来のものと相違する理化学的性質を有する新規な耐熱性キシラナーゼである。従来公知の耐熱性キシラナーゼとしては以下の報告がある。Johnらはアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）Strain 21 由来の反応至適ｐＨが5.５〜６、反応至適温度が65℃〜80℃のキシラナーゼＩＡを報告（Can.J.Biochem.,57,125,1979）しているが、等電点の記載はなく、分子量は50,000である。
【００５４】
Berengerらは、クロストリジウム・ステルコラリウム（Clostridium stercorarium）由来の反応至適ｐＨが６〜７、反応至適温度が75℃のキシラナーゼを３種類（Ａ、Ｂ、Ｃ）を単離（Can.J.Microbiol.,31,635,1985）しているが、いずれも等電点が4.５付近であり、また分子量も44,000〜72,000である。Wangらはストレプトミセス・シアネウス（Streptomyces cyaneus）由来の反応至適ｐＨが8.５、反応至適温度72℃のキシラナーゼＩを単離（J.Gen.Microbiol.,139,1987,1993）しているが、分子量が37,000であり、等電点が5.1 である。
【００５５】
バチルスについては、Hondaらがバチルス（Bacillus）C-125 株から反応至適ｐＨが６〜７で反応至適温度が70℃のキシラナーゼＮと反応至適ｐＨが６〜10で反応至適温度が70℃のキシラナーゼＡを単離している（Can.J.Microbiol.,31,538,1985）が、分子量がそれぞれ16,000と43,000である。特表平6-506107号公報では、バチルス由来の反応至適ｐＨ4.８〜７の60℃で安定なキシラナーゼについて記載されているが、分子量は22,000で等電点が7.７であり、反応至適温度については記載がない。
【００５６】
以上より、これらのキシラナーゼは至適温度、至適ｐＨ、分子量、等電点等が本発明のキシラナーゼとは異なることから、本発明のＸＰ１及びＸＰ２は何れも新規な耐熱性キシラナーゼであると認定した。
本発明の酵素を従来のキシラナーゼと比較した結果を表３に示す。
【００５７】
【表３】

【００５８】
（２）微生物
次に、本発明の耐熱性キシラナーゼを生産する微生物について説明する。本発明において使用される微生物は、バチルス属に属し、耐熱性キシラナーゼ生産能を有する菌株であって、その具体例としては、バチルス・エスピー２１１３又はバチルス・エスピー２０８が挙げられる。
【００５９】
以下それぞれの微生物について説明する。
Ａ．バチルス・エスピー２１１３
バチルス・エスピー２１１３は、本発明者らが土壌中から分離した菌株であり、カバキシランまたはコムギキシラン１％、ペプトン0.５％、酵母抽出物0.５％、K₂HPO₄ 0.１％、MgSO₄・7H₂O 0.02％、ｐＨ7.０の培地を用いた45℃の培養でよく生育する。本菌株の菌学的性質は次の通りである。
【００６０】
▲１▼ 形態的性質について
i) 0.３〜0.６×２〜５μｍの運動性を有する桿菌である。２〜３連の連鎖形態を示すことがある。菌体の中央に胞子を形成する。
ii) グラム染色性は不定で抗酸性は陰性である。
▲２▼ 各種培地における生育状態等は以下に示す通りである。なお、培養温度は45℃とした。
【００６１】
i) 肉汁寒天平板培地（Difco Beef Extract １％、Bacto Peptone １％、NaCl 0.5 ％、寒天1.５％、ｐＨ7.０）では、コロニーの形はほぼ円形であり、その周縁はやや波状である。やや光沢のある半透明のコロニーである。肉汁寒天斜面培地（Difco Beef Extract １％、Bacto Peptone １％、NaCl 0.5％、寒天1.５％、ｐＨ7.０）では、やや光沢が有り、薄く拡布状に生育する。肉汁液体培地（Difco Beef Extract １％、Bacto Peptone １％、NaCl 0.5％、寒天1.５％、ｐＨ7.０）において、液面ではほとんど生育せず沈渣する。いずれも生育はあまり良くない。Difco 社のNutrient Brothを用いた肉汁寒天培地（Difco Nutrient Broth 0.8％、寒天1.５％、ｐＨ7.０）ではさらに生育は悪い。
【００６２】
ii) 肉汁寒天平板培地（Difco Beef Extract １％、Bacto Peptone １％、NaCl 0.5％、寒天1.５％、ｐＨ7.０）にNaClを２％添加した培地では生育するが、５％添加すると生育しない。
iii) 肉汁ゼラチン培地（Difco beef extract １％、ペプトン１％、NaCl 0.５％、ゼラチン12％ ｐＨ7.０）では液化しない。
【００６３】
▲３▼ 生理学的性質を表４に示す。
【００６４】
【表４】

【００６５】
以上の菌学的性質をもとにバーギーズマニュアルシステマティックバクテリオロジー（Bergey's Manual of Systematic Bacteriology）を参考にして本菌株の同定を行った。その結果、本菌株は胞子を形成するグラム染色性不定の桿菌であり、カタラーゼ陽性であることからバチルス（Bacillus）属に属することは明らかである。種についてはバチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）に近いが、本発明の菌株はオキシダーゼが陽性であり、55℃でも生育できるのに対し、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）はオキシダーゼが陰性であり、50℃以上では生育できないことから、本発明の菌株はバチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）とは異なる。
【００６６】
耐熱性キシラナーゼの報告（T.Nanmori et al.,J.Bacteriol.,172 ,6669,1990）があるバチルス・ステアロテルモフィルス（Bacillus stearothermophilus）と比較しても、本発明の菌株は胞子の位置が中央であり、ゼラチンを加水分解できず、65℃では生育できないのに対し、バチルス・ステアロテルモフィルス（Bacillus stearothermophilus）は胞子の位置が端であり、ゼラチンを加水分解でき、65℃でも生育できることから、本発明の菌株はバチルス・ステアロテルモフィルス（Bacillus stearothermophilus）とは異なる。
【００６７】
また、特表平6-506107号公報に記載のキシラナーゼを生産するバチルス（Bacillus）No.I-1017 及びNo.I-1018 は、生育至適温度が62℃であり、フルクトース、アラビノースを利用しない。これに対し、本発明の菌株は生育至適温度が35〜50℃であり、またフルクトース、アラビノースを利用することから、本発明の菌株はバチルス（Bacillus）No.I-1017 及びNo.I-1018 とは異なる。
【００６８】
以上のことから、本発明の菌株に該当する菌種が無いため該菌株を新菌株と判断し、バチルス・エスピー２１１３と命名した。該バチルス・エスピー２１１３は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に、FERM BP-5264として寄託されている。
Ｂ．バチルス・エスピー２０８
バチルス・エスピー２０８は、カバキシランまたはコムギキシラン１％、ペプトン 0.5％、酵母抽出物 0.5％、K₂HPO₄ 0.1 ％、MgSO₄・7H₂O 0.02％、pH 7.0の培地を用いた45℃の培養でよく生育する。本菌の菌学的性質は次の通りである。
▲１▼ 形態的性質について
1) 0.3〜0.6 × 2〜5μmの運動性を有する桿菌である。２〜３連の連鎖形態を示すことがある。菌体の中央に胞子を形成する。
2)グラム染色性は不定で抗酸性は陰性である。
▲２▼ 各種培地における成育状況等は以下に示す通りである。なお培養温度は45℃とした。
【００６９】
1) 肉汁寒天培地(Difco Nutrient Broth 0.8％, 寒天 1.5％, pH 7.0) ではコロニーの形はほぼ円形であり、その周縁はやや波状である。やや光沢のある半透明のコロニーであり生育はよい。
2) 肉汁寒天平板培地(Difco Nutrient Broth 0.8 ％, 寒天 1.5％, pH 7) にNaClを２％添加した培地では生育するが、５％添加すると生育しない。
【００７０】
3) 肉汁ゼラチン培地(Difco Beef Extract 1%, ゼラチン 12%, pH7.0）では液化しない。
▲３▼生理学的性質を表５に示す。
【００７１】
【表５】

【００７２】
以上の菌学的性質についてバーギーズマニュアルシステマティックバクテリオロジー（Bergey's Manual of Systematic Bacteriology）を参考にして同定を行った。その結果、本発明菌株は胞子を形成する好気性のグラム染色不定の桿菌であり、カタラーゼ陽性であることからバチルス（Bacillus）属に属することは明らかである。
【００７３】
種については、バチルス・サーキュランス(Bacillus circulans)の持つ性質と類似するが、バチルス・サーキュランス(Bacillus circulans)の生育温度範囲は10〜40℃であり、オキシダーゼが陰性であるのに対し、本発明菌の菌株バチルス・エスピー２０８の生育温度は、バチルス・サーキュランス(Bacillus circulans)では生育することができない高温下（40〜60℃）でも生育可能であり、オキシダーゼ陽性であることから、本発明菌株は、バチルス・サーキュランス(Bacillus circulans)とは異なる。
【００７４】
また、耐熱性キシラナーゼ生産の報告(T.Nanmori et al., J. Bacteriol., 172, 6669, 1990）があるバチルス・ステアロテルモフィルス(Bacillus stearothermophilus)と比較すると、本発明菌株は胞子の位置が中央であり、ゼラチンを加水分解できないことに対し、バチルス・ステアロテルモフィルス(Bacillus stearothermophilus)は胞子の位置が端であり、ゼラチンを加水分解できることから本発明菌株は、バチルス・ステアロテルモフィルス(Bacillus stearothermophilus)とは異なる。
【００７５】
また、特表平6-506107号公報に記載のキシラナーゼを生産するバチルス(Bacillus) NO.■-1017及びNO.■-1018は、アラビノースを利用しないのに対し、本発明菌株はアラビノースを利用することから本発明菌株はバチルス(Bacillus) NO.■-1017及びNO.■-1018とは異なる。従って、本発明菌株は、前記バチルス・エスピー２１１３に類似する菌株である。但し、バチルス・エスピー２１１３株は肉汁培地(Nutrient Broth 0.8%, 寒天 1.5%)で生育が悪いのに対し、本菌株は肉汁培地で生育が良いことから、本菌株はバチルス・エスピー２１１３株と区別し得ると考え、本菌株を新菌株として判断し、バチルス・エスピー２０８と命名した。
【００７６】
バチルス・エスピー２０８は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号FERM BP-5321として寄託されている。
【００７７】
（３）耐熱性キシラナーゼ遺伝子のクローニング
キシラナーゼ遺伝子をクローニングするためにＤＮＡライブラリーの作製を行う。ＤＮＡライブラリーは、バチルス・エスピー２１１３株又は２０８株から染色体ＤＮＡを抽出し、適当な制限酵素で処理したものを適当なベクターにつないだ後、適合する宿主に導入することで作製することができる。
【００７８】
バチルス・エスピー２１１３株又は２０８株から染色体ＤＮＡを抽出するには、通常の方法を用いることができる（例えば、Molecular Cloning; Cold Spring Harbor Laboratory (1982)1のBlinとStaffordの方法) 。次に、得られた染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で処理し、部分消化を行った後、ショ糖密度勾配遠心法により３〜５kbp の断片画分を得る。同じ接着末端を生じさせる制限酵素で処理したクローニングベクターに、上記で得られたＤＮＡ断片を挿入する。ライブラリー作製に用いられるベクターとしては、例えばプラスミドベクター、ファージベクター等が挙げられ、宿主としては、例えば大腸菌、酵母等が挙げられる。
【００７９】
また、クローニングベクターとしては、例えばｐＵＣ系クローニングベクターを用いることができる。上記で得られたＤＮＡライブラリーからの目的とする遺伝子の単離にあたっては、前記ＤＮＡライブラリーを用いて大腸菌を形質転換した後、キシラン培地に塗布し、ハローの形成を指標に行う。このようにしてクローニングされたＤＮＡの塩基配列は、放射標識又は蛍光標識を用いるジデオキシ法、マキサム−ギルバート法等により解析することができる。
（４）酵素の製造方法
次に、本発明の酵素の製造方法について説明する。
【００８０】
▲１▼ 耐熱性キシラナーゼ生産菌の培養液からの本発明の酵素の精製
本発明のバチルス・エスピー２１１３株又は２０８株を培養することにより耐熱性キシラナーゼを生産することができる。培養のための炭素源、窒素源には、資化して耐熱性キシラナーゼを生産することのできるものであればいずれも用いることができる。例えば、炭素源としては、キシラン若しくはキシランを含む小麦ふすま、パルプ、バガス、コーンファイバー、稲わら等の農産廃棄物又は植物繊維等を使用することができる。窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、各種アミノ酸、大豆、コーンスティープリカー、各種無機窒素等の窒素化合物を用いることができる。また、各種の塩類やビタミン、ミネラル等を適宜用いることができる。
【００８１】
培養温度およびｐＨは、菌が生育して耐熱性キシラナーゼを生産する範囲であればいずれでも良く、培養温度は20〜55℃、好ましくは35〜50℃、ｐＨは５〜９、好ましくは６〜８である。本発明の微生物を培養した後、菌体を分離し、培養濾液をそのまま耐熱性キシラナーゼ粗酵素液として使用することができる。かかる耐熱性キシラナーゼ粗酵素液は、反応至適温度が60〜80℃、至適ｐＨが５〜７である。
【００８２】
また、透析、塩析、限外濾過、凍結乾燥等により、耐熱性キシラナーゼを濃縮又は固体化することができる。さらに、培養濾液を硫安分画、ゲル濾過による分子量分画や各種イオン交換樹脂、ハイドロキシアパタイト、等電点分画等を適宜組み合わせ、また繰り返すことにより耐熱性キシラナーゼＸＰ１とＸＰ２を精製することができる。具体的な精製方法については、実施例に示す。
【００８３】
▲２▼ 遺伝子工学的手法による遺伝子組換え型耐熱性キシラナーゼの精製
本発明の耐熱性キシラナーゼは、クローニングされた遺伝子を発現させることにより精製することもできる（本発明において、遺伝子を発現させて得られた酵素を「遺伝子組換え型耐熱性キシラナーゼ」という）。その手法は、前記(3) によって得られたキシラナーゼ遺伝子を、適当な宿主・ベクターを用いて発現することにより高生産することができる。発現に用いられるベクターとしては、プラスミドベクター、ファージベクター等が主に使われる。宿主として、大腸菌、枯草菌、酵母等が主に使われる。培養のための炭素源、窒素源には、資化して耐熱性キシラナーゼを生産することができるものであればいずれも用いることができる。例えば、炭素源としては、キシラン若しくはキシランを含む小麦ふすま、パルプ、バカス、コーンファイバー、稲わら等の農業廃棄物又は植物繊維等を使用することができる。窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、各種アミノ酸、大豆、コーンスティープリカー、各種無機窒素等の窒素化合物を用いることができる。また、各種塩類、ビタミン、ミネラル等を適宜用いることができる。培養温度及びpHは、菌が耐熱性キシラナーゼを生産する範囲であればいずれでも良く、培養温度は好ましくは37℃、pHは好ましくは７である。酵素の精製方法としては、硫安分画、ゲル濾過による分子量分画や各種イオン交換樹脂、ハイドロキシアパタイト、等電点分画等を適宜組み合わせ、また繰り返すことにより精製することができる。得られた精製酵素が求めるキシラナーゼであるかの確認は、得られた精製酵素の分子量、至適pH、至適温度、Ｎ末端アミノ酸配列等をバチルス・エスピー２１１３株の生産した耐熱性キシラナーゼと比較することにより判断できる。具体的な酵素の取得については、実施例に示す。
【００８４】
（５）パルプの漂白方法
次に、本発明の酵素を用いたパルプの漂白方法について説明する。化学パルプ及び機械パルプ製造工程において、本発明の耐熱性キシラナーゼＸＰ１（遺伝子組換え型を含む）及び／またはＸＰ２（遺伝子組換え型を含む）及び／またはバチルス（Bacillus）属に属する菌株バチルス・エスピー２１１３若しくはバチルス・エスピー２０８の培養物でパルプを処理することで漂白を行なうことができる。さらに酵素処理の前後、あるいは途中に化学漂白及び／またはアルカリ抽出を行なうことでパルプの漂白を行なうことができる。
【００８５】
パルプに処理する培養物又は酵素量については、耐熱性キシラナーゼ単位としてパルプの絶乾重量１ｇあたり0.１〜５Ｕ、好ましくは0.５〜３Ｕ添加すればよい。反応条件は培養濾液（粗酵素液）の場合、反応温度50〜90℃、ｐＨ５〜８であり、精製酵素の場合はＸＰ１では反応温度50〜80℃、ｐＨ５〜８である。ＸＰ２では反応温度60〜90℃、ｐＨ５〜８である。反応時間は、0.２〜24時間、好ましくは0.５〜８時間である。化学漂白に用いる試薬としては、塩素、二酸化塩素、二酸化窒素、次亜塩素酸塩、酸素、過酸化水素、オゾン等が挙げられる。またアルカリ抽出には、当業者として公知の多くのアルカリ性化合物を用いることができる。アルカリ抽出には、水酸化ナトリウム換算で0.５〜３％（対絶乾パルプ）のアルカリを用い、酸素や過酸化水素等を添加しながらアルカリ処理を行うことができる。
【００８６】
【発明の実施の形態】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されない。
【００８７】
〔実施例１〕粗酵素液の調製(1)
キシラン（カバ材由来、シグマ社製）0.６％、ペプトン0.５％、酵母抽出物0.５％、K₂HPO₄ 0.1％、MgSO₄・7H₂O 0.02％を含む液体培地10ml（ｐＨ7.0 ）を、内径25mm試験管に採り、紙栓をした後121℃で15分間蒸気滅菌した。これにバチルス・エスピー２１１３を１白金耳植菌し、45℃で往復振盪培養した（振幅25mm、300往復／分）。培養終了後、遠心分離（10,000rpm ×10分）して培養上清を分離し、耐熱性キシラナーゼの粗酵素液を得た。
【００８８】
１％キシラン溶液（ブナ材キシラン、シグマ社製 1/10 McIlvaine Buffer pH6.5）200μlに酵素溶液50μlを添加し、70℃にて５分間反応させた。DNS試薬を500μl添加して５分間煮沸した後直ちに氷冷し、４mlの蒸留水を加えて500nmの吸光度を測定した。検量線は濃度既知のキシロースを用いて作成した。
【００８９】
キシラナーゼ活性は、上記の条件で１分間に１μmolの還元糖を生成する酵素量を１ユニット（Unit）とした。その結果、培養上清中の耐熱性キシラナーゼ活性は、培養開始後24時間で400U/ml、48時間で500 U/mlであった。
【００９０】
〔実施例２〕粗酵素液の調製(2)
キシラン（カバ材由来、シグマ社製）0.6％、ペプトン0.5％、酵母抽出物0.５％、K₂HPO₄ 0.1 ％、MgSO₄・7H₂O 0.02％を含む液体培地(pH 7)10mlを内径25mmの試験管に採り、紙栓をした後121℃で15分間蒸気滅菌した。これにバチルス・エスピー２０８を１白金耳植菌し、45℃で往復振盪培養した（振幅25mm、300往復／分）。培養終了後、遠心分離(10,000rpm×10分）して培養上清を分離し、耐熱性キシラナーゼの粗酵素液を得た。培養上清中の耐熱性キシラナーゼ活性を次の方法により測定した。
【００９１】
１％キシラン溶液（ブナ材キシラン、シグマ社製 1/10 McIlvaine Buffer pH6.3）200μlに酵素溶液50μlを添加し、70℃にて５分間反応させる。DNS試薬を500μl添加して５分間煮沸した後直ちに氷冷し、４mlの蒸留水を加えて500nmの吸光度を測定した。検量線は濃度既知のキシロースを用いて作成した。
【００９２】
キシラナーゼ活性は、上記の条件で１分間に１μmolの還元糖を生成する酵素量を１ユニット（Unit）とした。その結果、培養上清中の耐熱性キシラナーゼ活性は、培養開始後24時間で400U/ml、48時間後で500U/mlであった。
【００９３】
〔実施例３〕耐熱性キシラナーゼの精製
キシラン（カバ材由来、シグマ社製）0.6 ％、ペプトン0.5 ％、酵母抽出物0.5 ％、K₂HPO₄ 0.1％、MgSO₄・7H₂O 0.02 ％、ｐＨ7.0 の液体培地50mlを500 ml容坂口フラスコに取り綿栓をした後、121 ℃で15分間蒸気滅菌した。これに実施例１で得られた培養液を１ml加え、45℃、３日往復振盪培養（振幅10cm、100 往復／分）した。培養終了後、遠心分離（8,000rpm×10分) により培養上清を得た。この培養上清を硫安分画し、20〜60％画分を遠心分離（20,000rpm ×10分）にて回収した後、20mＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.２）を外液として透析を行った。得られた粗酵素液について、20mＭ酢酸緩衝液（ｐＨ5.０）で平衡化したＣＭトヨパール650-C （直径2.5cm ×30cm）を用いてイオン交換クロマトグラフィーを行った。
【００９４】
吸着画分を０Ｍ〜0.３Ｍまでの濃度勾配でNaClを含む該緩衝液にて溶出し、5.３mlずつ分画した。その結果、キシラナーゼ活性は２つのピークに分かれて溶出し、前半に溶出した活性画分をキシラナーゼＸＰ１、後半に溶出した活性画分をキシラナーゼＸＰ２とした。
【００９５】
それぞれの活性画分を集め、再度硫安分画を行い、20〜60％画分を遠心分離（20,000rpm ×10分）により回収した後、20mＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.２）に50mＭのNaClを含む緩衝液で平衡化したSephacryl S-200（直径2.５cm×93cm）を用いて該緩衝液により溶出し、ゲル濾過を行った。ＸＰ１については流速34ml/hr とし、５mlずつ分画した。また、ＸＰ２については流速34ml/hr とし、6.７mlずつ分画した。
【００９６】
それぞれ活性画分を集め、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、均一に精製されていることが確認できた。培養濾液に対する各精製酵素の収率はＸＰ１が47.8％、ＸＰ２が7.８％であった。また比活性はＸＰ１が1420 U/mg、ＸＰ２が919 U/mgであった。
【００９７】
〔実施例４〕耐熱性キシラナーゼ遺伝子のクローニング
(1) 染色体遺伝子ライブラリーの作製
キシラン（カバ材由来、シグマ社製）０.６％、ペプトン０.５％、酵母抽出物０.５％、K₂HPO₄ ０.１％、MgSO₄・7H₂O 0.02％、ｐＨ7.０の液体培地50mlを500ml 容坂口フラスコに取り綿栓をした後、121℃で15分間蒸気滅菌した。これにバチルス・エスピー２１１３株を１白金耳植菌し、45℃で一晩往復振盪培養（振幅10cm、100 往復／分）した。培養終了後、遠心分離（10,000 rpm×10分）により菌体を得た。
【００９８】
本菌体を５mlのグルコース−リゾチーム溶液（50mMグルコース、10mM EDTA 、25mM Tris-HCl 緩衝液（pH8.0）、４mg/ml リゾチーム）に懸濁し、室温で15分放置した。５mlのアルカリ溶液（０２N NaOH、１％ SDS）を加え、穏やかに混ぜ、氷中にて15分間冷却した。この後、フェノール抽出、クロロホルム抽出を行ない、抽出した水層部分にエタノールを徐々に添加しＤＮＡが析出したところで染色体ＤＮＡをガラス棒にて巻取り、ＴＥ溶液に懸濁した。得られた染色体ＤＮＡ 100μg を制限酵素ＥcoＲＩで部分消化し、３〜20％ショ糖密度勾配超遠心分離法（22,500rpm, 16 時間）により分画し、３〜５kbp 断片画分をエタノール沈澱により回収した。
【００９９】
(2) 耐熱性遺伝子の大腸菌への形質転換
大腸菌クローニングベクターpUC19 （宝酒造社製）、１μｇを制限酵素ＥcoＲＩで完全消化した後、アルカリホスファターゼ（Calf intestine由来）により脱リン酸化し、上記エタノール沈澱後のＤＮＡ500ng 及びT4 DNAリガーゼ2.５ユニットを含むライゲーションバッファー中で16℃、16時間反応させ、本発明の遺伝子とベクターとを連結した。
【０１００】
得られたＤＮＡライブラリーを用いて、塩化カルシウム法により大腸菌JM109株を形質転換した。
(3) ＤＮＡライブラリーからのキシラナーゼ遺伝子の単離
ＸＰ１遺伝子のクローニング
上記染色体ＤＮＡライブラリーからのＸＰ１キシラナーゼ遺伝子を含むクローンの選抜は、該ＤＮＡライブラリーを用いて大腸菌を形質転換した後、キシラン培地に塗布し、コロニー周辺のハロー形成を指標に行った。すなわち、該ＤＮＡライブラリーを用いて大腸菌を形質転換した後、100 μg/mlのアンピシリンを含むキシラン培地（１％キシラン（コムギ由来；シグマ社製）、１％ペプトン、０.５％酵母抽出物、０.５％ NaCl、２％寒天（pH 7.0））に塗布し、37℃で一晩培養し、ハロー形成を観察した。得られたクローンよりプラスミドＤＮＡをアルカリ抽出法により大量に調製し、超遠心分離（16時間, 20℃）により精製し、塩基配列を決定した。塩基配列の決定はUnited States Biochemical 社製のシーケナーゼのキットを用いて行なった。
【０１０１】
その結果を配列番号２に示す。上記ＸＰ１キシラナーゼ遺伝子の塩基配列からＸＰ１キシラナーゼのアミノ酸配列を推定した結果を配列番号１に示す。また、上記クローニングにより得られたキシラナーゼ（ＸＰ１）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片の制限酵素地図を図６に示す。
【０１０２】
なお、得られたＸＰ１キシラナーゼ遺伝子を含む大腸菌形質転換株E. coli JM109/pUCXP1は、工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM BP-5320として寄託されている。
(4) ＸＰ１のＮ末端配列の決定
ＸＰ１のＮ末端アミノ酸配列の決定は、バチルス・エスピー２１１３の培養上清より精製したＸＰ１を試料とし、プロテインシーケンサー（Applied Biosystems（パーキンエルマー社）477A）及びＰＴＨアナライザー（Applied Biosystems（パーキンエルマー社）120A）を用いて行った。その結果、成熟型キシラナーゼＸＰ１のＮ末端配列は配列番号３に示す通りであった。
【０１０３】
〔実施例５〕遺伝子組換え型耐熱性キシラナーゼの製造
本実施例では、遺伝子組換え型耐熱性キシラナーゼＸＰ１の製造を行った。プラスミドｐＵＣＸＰ１を、ＥcoＲＩ消化して得られた本発明の遺伝子ＥcoＲＩ断片500 ngと制限酵素ＥcoＲＩで完全消化した後、アルカリフォスファターゼ（Calf Intestine由来）により脱リン酸化した大腸菌・枯草菌シャトルベクターｐＨＹ3000ＰＬＫ（宝酒造社製）１μgと、Ｔ４リガーゼ2.5 ユニットとをライゲーションバッファー中、16℃、２時間反応させ、連結させた。これを用いて塩化カルシウム法にて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。
【０１０４】
50μg/ml のテトラサイクリンを含むＬ培地（１％ペプトン、0.5 ％酵母エキス、0.5 ％NaCl(pH7.0))中に植菌し、37℃、一晩培養した。得られた形質転換体よりアルカリ抽出法にてプラスミドＤＮＡを大量調製した。これをｐＨＹＸＰ１とし、その結果を図８に示す。上記プラスミドＤＮＡを用いて枯草菌ＩＳＷ１２１４株をプロトプラスト法にて形質転換した。得られた形質転換体を500 ml容坂口フラスコにて50μg/mlのテトラサイクリンを含む50ml液体キシラン培地（0.6 ％カバキシラン（シグマ社製）、１％ペプトン、0.5 ％酵母エキス、0.5 ％ NaCl(pH7.0)) 中に植菌し、37℃、３日間培養した。培養終了後、遠心分離（10,000rpm ×10分) を行い培養上清を回収した。培養上清中の耐熱性キシラナーゼの活性は、培養開始後48時間で160U/ml であった。
【０１０５】
この培養上清を硫安分画し、20〜60％画分を遠心分離（20,000rpm ×10分) にて回収した後、20mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.2 ）を外液として透析を行った。得られた粗酵素液について、20mM酢酸緩衝液（ｐＨ5.0 ）で平衡化したＣＭトヨパール650-C(直径1.0cm ×17cm) を用いてイオン交換クロマトグラフィーを行った。
【０１０６】
吸着画分を０M 〜0.3Mまでの濃度勾配でNaClを含む20mM酢酸緩衝液（ｐＨ5.0）にて溶出し、1.5 mlずつ分画した。活性画分を集め、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を行い、均一に精製されていることを確認した。本酵素は、分子量約22,500、反応至適ｐＨ５〜８、安定ｐＨ範囲３〜９、作用適温範囲50〜80℃であり、ＸＰ１であると断定した。
【０１０７】
〔実施例６〕パルプの漂白(1)
広葉樹酸素晒クラフトパルプ（カッパー価8.５、白色度46.0％）に実施例１で得られたバチルス・エスピー２１１３の培養上清（500 U/mlの耐熱性キシラナーゼを含む）をパルプ絶乾重量１ｇあたり２μｌ添加してパルプ濃度３％、ｐＨ7.０、70℃にて２時間反応させた。反応終了後、パルプ濃度を10％に調製して塩素−アルカリ−次亜塩素酸塩−二酸化塩素の順で漂白を行なった。なお、培養上清を添加せずに同様に処理したものを対照の漂白パルプとした。漂白の標準条件は次の通りである。
【０１０８】
塩素処理：添加率はパルプ絶乾重量あたり1.６％で40℃、30分間処理
アルカリ抽出：アルカリ添加率は絶乾パルプあたり1.０％で60℃、100分間処理
次亜塩素酸塩処理：添加率は0.５％で45℃、120分間処理
二酸化塩素処理：添加率は0.２％で70℃、180分間処理
この標準の漂白条件に対し、塩素およびアルカリ、あるいは次亜塩素酸塩の添加量を減らして漂白した。その結果、対照の漂白パルプと同等の白色度（85.6％）を得るために必要な塩素及びアルカリ量を25％減添することができた。また、次亜塩素酸塩については、50％削減することができた。
【０１０９】
また、漂白排水中のＡＯＸ量をハロゲン分析装置ＴＯＸ−10（三菱化学製）を用いて定量した結果、培養上清処理によりＡＯＸを25％減らすことができた。塩素、次亜塩素酸塩、アルカリ又はＡＯＸ等を削減できたことは、本酵素の作用によりパルプの漂白性が改善されたことを示すものであり、このことによって薬品コストを削減できるとともに、有機塩素化合物の生成を抑制することができる点で有用である。
【０１１０】
〔実施例７〕パルプの漂白(2)
広葉樹酸素晒しクラフトパルプ（カッパー価8.5、白色度46.0％）に、実施例２で得られたバチルス・エスピー２０８の培養上清（500U/mlの耐熱キシラナーゼを含む）をパルプ絶乾重量１ｇあたり２μl添加してパルプ濃度３％、pH7.0、70℃にて２時間反応させた。反応終了後、パルプ濃度を10％に調整して塩素−アルカリ抽出−次亜塩素酸−二酸化塩素の順で常法により漂白を行った。なお、培養上清を添加せずに同様に処理したものを対照の漂白パルプとした。漂白の標準条件は次の通りである。
【０１１１】
塩素処理：塩素添加率はパルプ絶乾重量あたり1.6％で40℃、30分間処理
アルカリ抽出：アルカリ添加率は絶乾パルプあたり1.0 ％で60℃、100分間処理
次亜塩素酸処理：次亜塩素酸添加率は0.5 ％で45℃、120分間処理
二酸化塩素処理：二酸化塩素添加率は0.2 ％で70℃、180分間処理
この標準の漂白条件に対し、酵素前処理パルプの漂白では、塩素及びアルカリ、あるいは次亜塩素酸の添加量を減らして漂白した。その結果、酵素無処理の対照の漂白パルプと同等の白色度(85.6 ％）を得るために必要な塩素及びアルカリの量を27％軽減することができた。また次亜塩素酸塩については、53％削減することができた。
【０１１２】
また漂白排水中のAOX量をハロゲン分析装置TOX-10（三菱化学製）を用いて定量した結果、培養上清処理によりAOXを28％減らすことができた。
〔比較例１〜５〕パルプの漂白（市販酵素との比較）
各種市販酵素を用いてパルプの酵素処理及び漂白処理を行い、塩素、次亜塩素酸塩及びＡＯＸの削減率を実施例６及び７の結果と比較した。比較例１としてチバガイギー（Chiba-Geigy)社製のIrgazyme 40-X4、比較例２として同社のIrgazyme 10A-X4 、比較例３としてノボ（Novo) 社製のPulpzyme HC 、比較例４としてアルコ（Alko) 社製のEcopulp 、比較例５としてサンド（Sandoz) 社製のCartazyme HSを用い、実施例６及び７で行った処理と同様の処理を行った。実施例６及び７で得られた結果並びに各比較例の結果を表６に示す。
【０１１３】
【表６】

表６より、本発明の酵素は、従来の酵素と比較して、ｐＨ7.0 、70℃という条件では塩素及び二酸化塩素、ＡＯＸの削減率が高いことがわかった。特に、このような高い温度では活性がほとんどない酵素もあり、本発明の酵素は耐熱性において優れていることがわかった。
【０１１４】
【発明の効果】
本発明により、新規な耐熱性キシラナーゼ及びその遺伝子、耐熱性キシラナーゼのその製造方法並びにその用途を提供することができる。本発明により、耐熱性キシラナーゼを生産することが可能になり、耐熱性キシラナーゼの工業的生産に貢献するものである。また、本発明の耐熱性キシラナーゼ及び／または本発明の菌株の培養物をパルプに処理することにより、パルプの漂白性を向上させ、紙パルプ製造において塩素等の薬品低減、排水中のＡＯＸ低減等に貢献するものである。
【０１１５】
【配列表】

【０１１６】

【０１１７】

【図面の簡単な説明】
【図１】カバキシランに本発明の酵素を作用させたときの反応生成物の薄層クロマトグラフィー分析の結果を示す図である。
【図２】本発明の酵素の反応至適ｐＨを示す図である。
【図３】本発明の酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図４】本発明の酵素の反応至適温度を示す図である。
【図５】本発明の酵素の熱安定性を示す図である。
【図６】キシラナーゼＸＰ１をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片の制限酵素地図である。
【図７】プラスミドｐＵＣＸＰ１の構築図である。
【図８】プラスミドｐＨＹＸＰ１の構築図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel thermostable xylanase, a production method and use thereof, a thermostable xylanase gene, and a microorganism that produces the thermostable xylanase.
[0002]
[Prior art]
Xylanase is an enzyme that degrades xylan, and is a useful enzyme used as an enzyme for pre-bleaching treatment of paper pulp or for the production of functional xylo-oligosaccharides. Viikari et al. Have reported that xylanase can improve the bleachability of kraft pulp (3rd international conference on biotechnology in the pulp and paper industry, p.67). However, since there are many high-temperature conditions such as kraft cooking and bleaching during the pulp manufacturing process, a highly heat-resistant xylanase is required to efficiently use xylanase during these processes. This is because the use of a thermostable xylanase enables an enzyme reaction at a high temperature, thereby reducing the cooling equipment and energy and preventing the propagation of various bacteria during the enzyme reaction.
[0003]
On the other hand, it is self-evident that the higher the enzyme production capacity of the microorganism is, the more advantageous for the cost reduction of the enzyme production. Therefore, there is a demand for a xylanase with high heat resistance and a microorganism that produces the enzyme at a high level. According to a review of xylanase (Wong et al., Microbiological Reviews, Sept., 305, 1988) and the like, microorganisms producing xylanase include Aspergillus genus, Trichoderma genus, Aureobasidium genus Many microorganisms such as filamentous fungi such as Schizophyllum commune, bacteria such as Bacillus genus, Clostridium genus, and Streptomyces genus are known. The reaction pH of xylanase produced from these microorganisms is acidic to neutral, and the reaction temperature is 40 ° C to 80 ° C. Also known are microorganisms that produce an alkaline xylanase having activity on the alkaline side, for example, the genus Bacillus (Honda et al., System.Appl.Microbiol., 8,152,1986, Okazaki et al., Appl Microbiol. And Biotechnol., 19,335,1984), Aeromonas (Ohkoshi et al., Agric. Biol. Chem., 49, 3037, 1985) or Streptomyces (Vyas et al., Biotechnol) .Let., 12, 225, 1990).
[0004]
Among these xylanase-producing microorganisms, filamentous fungi often produce cellulase in addition to xylanase, which may reduce paper yield and strength when used in the paper pulp manufacturing process. There is a problem. Moreover, filamentous fungi have a longer culture period than bacteria. In addition, bacteria have a problem that xylanase productivity is low.
[0005]
Recently, Viikari et al. Produced a high yield (400 U / ml) of xylanase by culturing at pH 8 to 8.5 at 30 ° C. for 2 days using an alkali-resistant Bacillus circulans VTT-E-87305 strain. (Appl. Microbiol. Biotechnol., 37, 470, 1992). However, the heat resistance of this enzyme is not clear and the culture temperature is as low as 30 ° C., so it is difficult to carry out the enzyme reaction at high temperature.
[0006]
On the other hand, for the purification of thermostable xylanase produced by microorganisms belonging to the genus Bacillus, molecular weight 21,500, isoelectric point 8.5, reaction optimum pH 6.0, reaction optimum from alkali thermophilic thermophilic Bacillus W-1 and W-2 A W1-I thermostable xylanase having a temperature of 65 ° C. and a W2-I thermostable xylanase having a molecular weight of 22,500, an isoelectric point of 8.3, an optimum pH of 6.0, and an optimum temperature of 65 ° C. have been reported (Okazaki et al. al., Agric. Biol. Chem., 49, 2033, 1985).
[0007]
For Bacillus stearothermophilus, also known as thermophilic Bacillus, T. Nanmori et al. From Strain 21 culture filtrate had a molecular weight of 39,500, isoelectric point 5.1, optimum reaction pH 7.0, optimum reaction. It has been reported that a thermostable xylanase with a temperature of 60 ° C. has been purified and produced (J. Bacteriol., 172, 6669, 1990). However, its production is only 1.96 U / ml at 55 ° C for 2 days.
[0008]
Furthermore, regarding the use of xylanase, several attempts have been reported to reduce bleaching chemicals and AOX (adsorptive organohalogen compounds, especially organochlorine compounds) by allowing xylanase to act on the pulp (for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei. No. 2-210085, JP-A-2-10086, JP-A-2-221482, JP-A-2-64087, JP-A-2-93486, JP-A-3-40887, JP-A-3- No. 505785, LSPederson et al., Production of bleached chemical pulp in the future international pulp bleaching conference, Vol.2,107,1991, Pulp and Paper Technology Times, 5,20,1992, S. Hogman et al., Biotechnology in Pulp and Paper Industry, Uni Publishers Co., Ltd., p. 107, 1992, Viikari et al., Biotechnology in Pulp and Paper Industry, Uni Publishers Co., Ltd., p. 101, 1992).
[0009]
However, in these attempts, the bleaching process in the pulp and paper manufacturing process requires a high temperature treatment of 40 to 100 ° C., but an enzyme that does not have heat resistance must be used in order to incorporate the enzyme treatment in the process. In many cases, the pulp must be cooled to the optimum reaction temperature and heated for the next step, which requires a lot of energy.
[0010]
Therefore, heat resistance is an enzyme that can be manufactured at a low cost by making cooling equipment unnecessary by making it manufactured under high temperature conditions or making it possible to save cooling water and reducing the possibility of contamination. Xylanases are desired. It is also desired to obtain a large amount of xylanase by isolating a gene encoding a thermostable xylanase by gene recombination technology and expressing the gene.
[0011]
Many reports on the xylanase gene have been made so far. For example, regarding bacterial origin, Bacillus circulans (Bacillus circulans; YANGR.CA et al., NUCLEIC ACIDS RES. 16: 7187-7187 (1988)), Bacillus subtilis (PAICE MG et al., ARCH. MICROBIOL. 144: 201-206 (1986)), Pseudomonas fluorescens; KELLETT LE et al., BIOCHEM.J.272: 369-376 (1990)) and Ruminococcus flavefaciens; ZHANG J.-X. et al., MOL.MICROBIOL. 6: 1013-1023 (1992) etc., but for mold origin, Clostridium acetobutylicum (ZAPPE. Et al., NUCLEIC ACIDS RES. 18: 2179- 2179- (1990)), Aspergillus awamori; ITO K. et al., BIOSCI.BIOTECHNOL.BIOCHEM. 56: 1338-1340 (1992)) and Streptomyces lividans; SHARECK F. et al ., GENE 107: 75-82 (1991)), however, Enzymes produced by recombinant using is not clear whether or not suitable for bleaching.
[0012]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a novel thermostable xylanase, a production method and use thereof, a thermostable xylanase gene, and a microorganism that produces the thermostable xylanase.
[0013]
[Means to solve the problem]
Based on the above-mentioned problems, the present inventors have intensively studied to obtain a thermostable xylanase high-producing bacterium, and as a result of extensive screening, a microorganism that produces thermostable xylanase from soil in Shinonome, Koto-ku, Tokyo. Discovered, found thermostable xylanases XP1 and XP2 having excellent thermostability in the culture of the microorganism, and succeeded in cloning and highly expressing the gene encoding the thermostable xylanase. It came to be completed.
[0014]
That is, the present invention is a thermostable xylanase selected from thermostable xylanase XP1 or XP2 having the following physicochemical properties.
[0015]
(1) Thermostable xylanase XP1 (hereinafter simply referred to as XP1) having the following physicochemical properties.
(1) Action: Hydrolyzes the 1,4-β-D-xyloside bond of xylan to produce a reducing sugar of xylo-oligosaccharide.
[0016]
(2) Substrate specificity: Preparation of birch silane, wheat xylan, etc. In addition to xylan, it acts on hardwood kraft pulp, wheat bran and the like containing xylan.
(3) Optimum pH and stable pH range: The optimum pH range for the reaction is pH 5-8, and the stable pH range is 3-9.
[0017]
(4) Optimal temperature range: 50 to 80 ° C.
(5) Thermal stability: Retains about 90% or more of the enzyme activity after treatment at 50 ° C. for 30 minutes, and shows about 50% or more of the residual activity even after treatment at 60 ° C. for 30 minutes.
[0018]
(6) Isoelectric point: around 8.1.
(7) Molecular weight: As a result of measurement by SDS polyacrylamide gel electrophoresis, it is about 22,500.
(8) Inhibition: weakly inhibited by iodoacetic acid and EDTA, Hg ² +, Strongly inhibited by SDS.
[0019]
(2) Thermostable xylanase XP2 (hereinafter simply referred to as XP2) having the following physicochemical properties.
(1) Action: Hydrolyzes 1,4-β-D-xyloside bond of xylan to produce reducing sugar of xylose and xylooligosaccharide.
[0020]
(2) Substrate specificity: Preparation of birch silane, wheat xylan, etc. In addition to xylan, it acts on hardwood kraft pulp, wheat bran and the like containing xylan.
[0021]
(3) Optimum pH and stable pH range: The optimum pH range for the reaction is pH 5 to 8, and the stable pH range is 4.5 to 9.
(4) Optimal temperature range: 60-90 ° C.
(5) Thermal stability: about 90% residual activity after treatment at 70 ° C. for 30 minutes.
[0022]
(6) Isoelectric point: around 8.5.
(7) Molecular weight: As measured by SDS polyacrylamide gel electrophoresis, it is about 32,000.
(8) Inhibition: Mn ²⁺ , Co ²⁺ , Cu ²⁺ Weakly inhibited by EDTA, iodoacetic acid, Hg ²⁺ It is strongly inhibited by SDS.
[0023]
Furthermore, the present invention provides the production of the thermostable xylanase, characterized by culturing a microorganism belonging to the genus Bacillus that produces the thermostable xylanase in a medium, and collecting the thermostable xylanase from the obtained culture. Is the method. Here, examples of the microorganism include Bacillus sp 2113 and Bacillus sp 208.
[0024]
Furthermore, the present invention is Bacillus sp 2113 or Bacillus sp 208 having the ability to produce thermostable xylase. Furthermore, the present invention is a thermostable xylanase gene substantially comprising the base sequence substantially encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
[0025]
Here, “substantially” means that as long as this peptide has thermostable xylanase enzyme activity, or as long as the base sequence encodes a thermostable xylanase, the amino acid or base sequence has a deletion, substitution, or It means that there may be changes such as addition. Furthermore, the present invention is a thermostable xylanase selected from the recombinant thermostable xylanase XP1 or the recombinant thermostable xylanase XP2 having the following physicochemical properties.
(1) Recombinant thermostable xylanase XP1 having the following physicochemical properties
(1) Action: Hydrolyzes the 1,4-β-D-xyloside bond of xylan to produce a reducing sugar of xylo-oligosaccharide.
[0026]
(2) Substrate specificity: Preparation of birch silane, wheat xylan, etc. In addition to xylan, it acts on hardwood kraft pulp, wheat bran and the like containing xylan.
(3) Optimum pH and stable pH range: The optimum pH range for the reaction is pH 5-8, and the stable pH range is 3-9.
[0027]
(4) Optimal temperature range: 50 to 80 ° C.
(5) Thermal stability: Retains about 90% or more of the enzyme activity after treatment at 50 ° C. for 30 minutes, and shows about 50% or more of the residual activity even after treatment at 60 ° C. for 30 minutes.
[0028]
(6) Isoelectric point: around 8.1.
(7) Molecular weight: As a result of measurement by SDS polyacrylamide gel electrophoresis, it is about 22,500.
(8) Inhibition: weakly inhibited by iodoacetic acid and EDTA, Hg ²⁺ It is strongly inhibited by SDS.
(2) Recombinant thermostable xylanase XP2 having the following physicochemical properties
(1) Action: Hydrolyzes 1,4-β-D-xyloside bond of xylan to produce reducing sugar of xylose and xylooligosaccharide.
[0029]
(2) Substrate specificity: Preparation of birch silane, wheat xylan, etc. In addition to xylan, it acts on hardwood kraft pulp, wheat bran and the like containing xylan.
(3) Optimum pH and stable pH range: The optimum pH range for the reaction is pH 5-8, and the stable pH range is 4.5-9.
[0030]
(4) Optimal temperature range: 60-90 ° C.
(5) Thermal stability: Shows a residual activity of about 90% or more after treatment at 70 ° C. for 30 minutes.
(6) Isoelectric point: around 8.5.
[0031]
(7) Molecular weight: As measured by SDS polyacrylamide gel electrophoresis, it is about 32,000.
(8) Inhibition:
Mn ²⁺ , Co ²⁺ , Cu ²⁺ Weakly inhibited by EDTA, iodoacetic acid, Hg ²⁺ It is strongly inhibited by SDS.
[0032]
Furthermore, the present invention is a recombinant thermostable xylanase substantially comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Furthermore, the present invention is a recombinant vector containing the thermostable xylanase gene. Furthermore, the present invention is a transformant transformed with the recombinant vector. Furthermore, the present invention is a method for producing a recombinant thermostable xylanase, comprising culturing the transformant in a medium and collecting the recombinant thermostable xylanase from the resulting culture. Furthermore, the present invention provides a culture obtained by culturing a microorganism belonging to the genus Bacillus that produces the thermostable xylanase or the transformant in a medium, or a thermostable xylanase XP1 or genetic recombination having the following physicochemical properties: Type thermostable xylanase XP1 and / or thermostable xylanase XP2 or recombinant thermostable xylanase XP2 as an active ingredient.
(1) Thermostable xylanase XP1 or recombinant thermostable xylanase XP1 having the following physicochemical properties
(1) Action: Hydrolyzes the 1,4-β-D-xyloside bond of xylan to produce a reducing sugar of xylo-oligosaccharide.
[0033]
(2) Substrate specificity: Preparation of birch silane, wheat xylan, etc. In addition to xylan, it acts on hardwood kraft pulp, wheat bran and the like containing xylan.
(3) Optimum pH and stable pH range: The optimum pH range for the reaction is pH 5-8, and the stable pH range is 3-9.
[0034]
(4) Optimal temperature range: 50 to 80 ° C.
(5) Thermal stability: Retains about 90% or more of the enzyme activity after treatment at 50 ° C. for 30 minutes, and shows about 50% or more of the residual activity even after treatment at 60 ° C. for 30 minutes.
[0035]
(6) Isoelectric point: around 8.1.
(7) Molecular weight: As a result of measurement by SDS polyacrylamide gel electrophoresis, it is about 22,500.
(8) Inhibition: weakly inhibited by iodoacetic acid and EDTA, Hg ²⁺ It is strongly inhibited by SDS.
(2) Thermostable xylanase XP2 or genetically modified thermostable xylanase XP2 having the following physicochemical properties
(1) Action: Hydrolyzes 1,4-β-D-xyloside bond of xylan to produce reducing sugar of xylose and xylooligosaccharide.
[0036]
(2) Substrate specificity: Preparation of birch silane, wheat xylan, etc. In addition to xylan, it acts on hardwood kraft pulp, wheat bran and the like containing xylan.
(3) Optimum pH and stable pH range: The optimum pH range for the reaction is pH 5-8, and the stable pH range is 4.5-9.
[0037]
(4) Optimal temperature range: 60-90 ° C.
(5) Thermal stability: Shows a residual activity of about 90% or more after treatment at 70 ° C. for 30 minutes.
(6) Isoelectric point: around 8.5.
[0038]
(7) Molecular weight: As measured by SDS polyacrylamide gel electrophoresis, it is about 32,000.
(8) Inhibition: Mn ²⁺ , Co ²⁺ , Cu ²⁺ Weakly inhibited by EDTA, iodoacetic acid, Hg ²⁺ It is strongly inhibited by SDS.
[0039]
Furthermore, the present invention is a method for bleaching a pulp, wherein the pulp is treated with the bleaching agent. Furthermore, the present invention provides a bleaching method for pulp, characterized in that chemical bleaching and / or alkali extraction is carried out before, after or during pulp processing when pulp is treated with the bleaching agent. It is.
[0040]
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
(1) Physicochemical properties of enzymes
First, the physicochemical properties of the thermostable xylanase XP1 and thermostable xylanase XP2 of the present invention will be described as follows.
[0041]
(1) Action
10 U each of XP1 and XP2 was added to 5 ml of a 1% solution (pH 7.0, 40 mM sodium phosphate buffer) of xylan (derived from hippo material, manufactured by Sigma), and reacted at 60 ° C. After the reaction for a predetermined time, the reaction was stopped by boiling, and 10 μl was subjected to thin layer chromatography. The thin layer was HPLC Cieselgel 60 F254 manufactured by Merck and the developing solvent was n-butanol: acetic acid: water = 10: 5: 1. Color development was performed by spraying diphenylamine-aniline reagent and heating at 120 ° C. for 10 minutes.
[0042]
The results are shown in FIG. The time in the figure represents the reaction time of the enzyme. From this result, it is clear that XP1 produces xylooligosaccharide and XP2 produces xylose and xylooligosaccharide by acting on xylan.
(2) Substrate specificity
Acts on hardwood kraft pulp, wheat bran and the like containing xylan in addition to preparation xylan such as birch xylan and wheat xylan.
[0043]
(3) Optimum pH and stable pH range
The optimum reaction pH and pH stability of each enzyme were determined by glycine-hydrochloric acid buffer (pH 3 or lower), acetic acid buffer (pH 4-5), sodium phosphate buffer (pH 6-7), Tris-hydrochloric acid buffer (pH 8). -9) and glycine-sodium hydroxide buffer (pH 9.1 to 10.1). The enzyme activity of each enzyme was measured at each pH.
[0044]
The results are shown in FIG. In the figure, “◯” represents XP1, and “■” represents XP2. From FIG. 2, the optimum pH of the enzyme reaction was 5 to 8 for both XP1 and XP2. In addition, each enzyme was kept in a predetermined buffer solution of 50 mM for 2 nights at 4 ° C., and then the enzyme activity was measured. The results are shown in FIG. In the figure, “◯” represents XP1, and “■” represents XP2. From FIG. 3, XP1 was stable at pH 3.0 to 9.0, and XP2 was stable at pH 4.5 to 9.0.
[0045]
(4) Method for measuring titer
Measurement of xylanase activity was performed as follows. 50 μl of a test solution is added to 200 μl of a 1% solution (pH 6.5, 1/10 McIlvaine buffer solution) of xylan (derived from hippo material, manufactured by Sigma), and reacted at 70 ° C. for 5 minutes. Add 500 μl of DNS reagent and boil for 5 minutes. Immediately cool on ice, add 4 ml of distilled water, and measure the absorbance at 500 nm. A calibration curve is prepared using xylose with a known concentration. With respect to the activity unit of xylanase, the amount of enzyme that produces 1 μmol of reducing sugar per minute under the above conditions was set to 1 Unit (unit: U).
[0046]
(5) Optimum temperature range
The enzyme activity of each enzyme was measured by changing the reaction temperature. The results are shown in FIG. In the figure, “◯” represents XP1, and “■” represents XP2. From FIG. 4, the optimum temperature was 70 ° C. for XP1 and 80 ° C. for XP2. In addition, each enzyme was allowed to stand for 30 minutes in a 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.2) at a predetermined temperature, and then the enzyme activity was measured.
[0047]
The results are shown in FIG. In the figure, “◯” represents XP1, and “■” represents XP2. From FIG. 5, XP1 retained about 90% or more of the enzyme activity after treatment at 50 ° C. for 30 minutes, and showed about 50% or more of the residual activity even after treatment at 60 ° C. for 30 minutes. On the other hand, XP2 showed a residual activity of about 90% or more after treatment at 70 ° C. for 30 minutes.
▲ 6 ▼ Isoelectric point
As a result of isoelectric focusing by PRECOAT pH 3 to 10 manufactured by SERVA, the isoelectric point of XP1 was 8.1 and the isoelectric point of XP2 was 8.5.
[0048]
▲ 7 ▼ Molecular weight
As measured by SDS polyacrylamide gel electrophoresis, the molecular weight of XP1 was about 22,500, and the molecular weight of XP2 was about 32,000.
(8) Effects of metal ions and inhibitors
Various metal salts are added to the enzyme solution to 1 mM and kept at 4 ° C. overnight, and then the same kind of metal salt is added to the reaction solution to 1 mM to increase the enzyme activity of XP1 and XP2. It was measured.
[0049]
The results are shown in Table 1. From Table 1, XP1 is strongly inhibited by Hg2 + and XP2 is Mn. ²⁺ , Co ²⁺ , Cu ²⁺ Weakly inhibited by Hg ²⁺ Was strongly inhibited.
[0050]
[Table 1]

[0051]
Various substances such as inhibitors are added to the enzyme solution to 1 mM, and kept at 4 ° C. overnight, and then the same kind of substance is also added to the XP1 and XP2 enzyme solutions in the reaction solution to 1 mM. And the activity was measured. The results are shown in Table 2. From Table 2, XP1 was weakly inhibited by iodoacetic acid and EDTA, and strongly inhibited by SDS. XP2 was weakly inhibited by EDTA and iodoacetic acid and strongly inhibited by SDS.
[0052]
[Table 2]

[0053]
By the way, the enzyme of the present invention is a thermostable xylanase having an optimum reaction temperature of 70 ° C. or higher, and is a novel thermostable xylanase having physicochemical properties different from the conventional ones. Conventionally known thermostable xylanases are reported as follows. John et al. Reported xylanase IA derived from Aspergillus niger Strain 21 with an optimum pH of 5.5-6 and an optimum temperature of 65-80 ° C. (Can. J. Biochem., 57, 125, 1979), but there is no description of the isoelectric point, and the molecular weight is 50,000.
[0054]
Berenger et al. Isolated three types (A, B, C) of xylanases (A, B, C) with an optimum pH of 6-7 and an optimum temperature of 75 ° C. derived from Clostridium stercorarium (Can. J Microbiol., 31, 635, 1985), all of which have an isoelectric point of around 4.5 and a molecular weight of 44,000-72,000. Wang et al. Isolated xylanase I from Streptomyces cyaneus with an optimum pH of 8.5 and an optimum temperature of 72 ° C. (J. Gen. Microbiol., 139, 1987, 1993). However, it has a molecular weight of 37,000 and an isoelectric point of 5.1.
[0055]
As for Bacillus, Honda et al., From Bacillus C-125 strain, the optimal reaction pH was 6-7 and the optimal reaction temperature was 70 ° C, and the optimal reaction temperature was 6-10 and the optimal reaction temperature was 6-10. Isolation of xylanase A at 70 ° C. (Can. J. Microbiol., 31,538, 1985) has molecular weights of 16,000 and 43,000, respectively. JP-A-6-506107 describes a xylanase that is stable at 60 ° C. and has an optimum pH of 4.8 to 7 derived from Bacillus, but has a molecular weight of 22,000 and an isoelectric point of 7.7. The optimum temperature is not described.
[0056]
As described above, these xylanases are different from the xylanase of the present invention in the optimum temperature, optimum pH, molecular weight, isoelectric point, etc., so that both XP1 and XP2 of the present invention are recognized as novel thermostable xylanases. did.
The results of comparing the enzyme of the present invention with a conventional xylanase are shown in Table 3.
[0057]
[Table 3]

[0058]
(2) Microorganisms
Next, the microorganism that produces the thermostable xylanase of the present invention will be described. The microorganism used in the present invention is a strain belonging to the genus Bacillus and capable of producing a thermostable xylanase, and specific examples thereof include Bacillus sp 2113 and Bacillus sp 208.
[0059]
Each microorganism will be described below.
A. Bacillus SP 2113
Bacillus sp. 2113 is a strain isolated by the present inventors from the soil, and is 1% kabukilan or wheat xylan, 0.5% peptone, 0.5% yeast extract, K ₂ HPO _Four 0.1% MgSO _Four ・ 7H ₂ It grows well in culture at 45 ° C using medium with 0.02% pH 7.0. The mycological properties of this strain are as follows.
[0060]
(1) Morphological properties
i) Bacillus having a motility of 0.3 to 0.6 × 2 to 5 μm. May show 2 to 3 chain form. A spore is formed in the center of the cell.
ii) Gram stainability is indeterminate and acidity is negative.
(2) Growth conditions and the like in various media are as shown below. The culture temperature was 45 ° C.
[0061]
i) In the broth agar plate (Difco Beef Extract 1%, Bacto Peptone 1%, NaCl 0.5%, agar 1.5%, pH 7.0), the colony is almost circular and its periphery is slightly wavy. . A semi-transparent colony with a slight gloss. Meat broth agar slant medium (Difco Beef Extract 1%, Bacto Peptone 1%, NaCl 0.5%, agar 1.5%, pH 7.0) is slightly glossy and grows thinly in a spread. In a broth liquid medium (Difco Beef Extract 1%, Bacto Peptone 1%, NaCl 0.5%, agar 1.5%, pH 7.0), the liquid surface hardly grows and sediments. Neither growth is very good. Difco Nutrient Broth broth agar (Difco Nutrient Broth 0.8%, agar 1.5%, pH 7.0) grows worse.
[0062]
ii) It grows in a medium with 2% NaCl added to a broth agar plate medium (Difco Beef Extract 1%, Bacto Peptone 1%, NaCl 0.5%, agar 1.5%, pH 7.0), but grows when 5% is added. do not do.
iii) Do not liquefy in broth gelatin medium (Difco beef extract 1%, peptone 1%, NaCl 0.5%, gelatin 12% pH 7.0).
[0063]
(3) Physiological properties are shown in Table 4.
[0064]
[Table 4]

[0065]
Based on the above bacteriological properties, the strain was identified with reference to Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. As a result, it is clear that this strain belongs to the genus Bacillus because it is a gram-staining gonococcus that forms spores and is positive for catalase. The species is close to Bacillus circulans, but the strain of the present invention is positive for oxidase and can grow at 55 ° C, whereas Bacillus circulans is negative for oxidase, The strain of the present invention is different from Bacillus circulans because it cannot grow above 50 ° C.
[0066]
Compared with Bacillus stearothermophilus, which has a report of thermostable xylanase (T. Nanmori et al., J. Bacteriol., 172, 6669, 1990), the strain of the present invention has a spore position. Is in the middle and cannot hydrolyze gelatin and cannot grow at 65 ° C, whereas Bacillus stearothermophilus has a spore position at the end and can hydrolyze gelatin and grow at 65 ° C. Because of this, the strain of the present invention is different from Bacillus stearothermophilus.
[0067]
Also, Bacillus No.I-1017 and No.I-1018 producing xylanase described in JP-A-6-506107 have an optimum growth temperature of 62 ° C. and do not use fructose or arabinose. . On the other hand, the strain of the present invention has an optimum growth temperature of 35-50 ° C. and utilizes fructose and arabinose, so that the strain of the present invention is Bacillus No.I-1017 and No.I- Different from 1018.
[0068]
From the above, since there is no bacterial species corresponding to the strain of the present invention, the strain was judged to be a new strain and named Bacillus sp 2113. The Bacillus sp 2113 is deposited as FERM BP-5264 at the Institute of Biotechnology, Ministry of International Trade and Industry.
B. Bacillus SP 208
Bacillus sp 208 consists of 1% Kabukilan or wheat xylan, 0.5% peptone, 0.5% yeast extract, K ₂ HPO _Four 0.1% MgSO _Four ・ 7H ₂ It grows well in 45 ° C culture using 0.02%, pH 7.0 medium. The bacteriological properties of this bacterium are as follows.
(1) Morphological properties
1) It is a koji mold having a motility of 0.3 to 0.6 × 2 to 5 μm. May show 2 to 3 chain form. A spore is formed in the center of the cell.
2) Gram stainability is indeterminate and acidity is negative.
{Circle around (2)} The growth status, etc. in various media are as shown below. The culture temperature was 45 ° C.
[0069]
1) In the broth agar medium (Difco Nutrient Broth 0.8%, agar 1.5%, pH 7.0), the colony shape is almost circular and its periphery is slightly wavy. It is a slightly glossy translucent colony that grows well.
2) It grows in a medium of 2% NaCl added to a broth agar plate medium (Difco Nutrient Broth 0.8%, agar 1.5%, pH 7), but does not grow when 5% is added.
[0070]
3) Does not liquefy in gravy gelatin medium (Difco Beef Extract 1%, gelatin 12%, pH 7.0).
(3) Physiological properties are shown in Table 5.
[0071]
[Table 5]

[0072]
The above bacteriological properties were identified with reference to Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. As a result, the strain of the present invention is an aerobic Gram-stained gonococcus that forms spores, and is positive for catalase, and thus clearly belongs to the genus Bacillus.
[0073]
The species is similar to the nature of Bacillus circulans, but the growth temperature range of Bacillus circulans is 10-40 ° C, whereas oxidase is negative. The growth temperature of the invented bacterial strain Bacillus sp. 208 is capable of growing even at high temperatures (40-60 ° C.) where it cannot grow on Bacillus circulans, and is positive for oxidase. The strain is different from Bacillus circulans.
[0074]
In addition, compared with Bacillus stearothermophilus, which has a report of thermostable xylanase production (T. Nanmori et al., J. Bacteriol., 172, 6669, 1990), Is the center and cannot hydrolyze gelatin, whereas Bacillus stearothermophilus has a spore position at the end and can hydrolyze gelatin, so that the strain of the present invention is Bacillus stearothermophilus. (Bacillus stearothermophilus) is different.
[0075]
Further, Bacillus NO. ■ -1017 and NO. ■ -1018 producing xylanase described in JP-A-6-506107 do not use arabinose, whereas the strain of the present invention uses arabinose. Therefore, the strain of the present invention is different from Bacillus NO. ■ -1017 and NO. ■ -1018. Therefore, the strain of the present invention is a strain similar to the Bacillus sp 2113. However, since the Bacillus sp. 2113 strain does not grow well on the broth medium (Nutrient Broth 0.8%, agar 1.5%), this strain is distinguished from the Bacillus sp. Strain 2113 because it grows well on the broth medium. This strain was judged as a new strain and named Bacillus sp 208.
[0076]
Bacillus SP 208 is deposited at the Biotechnology Institute of Industrial Technology, Ministry of International Trade and Industry under the accession number FERM BP-5321.
[0077]
(3) Cloning of thermostable xylanase gene
In order to clone the xylanase gene, a DNA library is prepared. A DNA library can be prepared by extracting chromosomal DNA from the Bacillus sp. Strain 2113 or 208, treating it with an appropriate restriction enzyme, connecting it to an appropriate vector, and introducing it into a suitable host. .
[0078]
In order to extract chromosomal DNA from the Bacillus sp. Strain 2113 or 208, a usual method can be used (for example, Molecular Cloning; Cold Spring Harbor Laboratory (1982) 1 Blin and Stafford method). Next, the obtained chromosomal DNA is treated with an appropriate restriction enzyme, and after partial digestion, a 3 to 5 kbp fragment fraction is obtained by sucrose density gradient centrifugation. The DNA fragment obtained above is inserted into a cloning vector treated with a restriction enzyme that produces the same sticky end. Examples of vectors used for library preparation include plasmid vectors and phage vectors. Examples of hosts include Escherichia coli and yeast.
[0079]
As a cloning vector, for example, a pUC cloning vector can be used. In isolation of the target gene from the DNA library obtained above, Escherichia coli is transformed using the DNA library, and then applied to a xylan medium, and halo formation is used as an indicator. The base sequence of the DNA thus cloned can be analyzed by a dideoxy method using a radiolabel or a fluorescent label, a Maxam-Gilbert method, or the like.
(4) Enzyme production method
Next, the method for producing the enzyme of the present invention will be described.
[0080]
(1) Purification of the enzyme of the present invention from a culture solution of a thermostable xylanase-producing bacterium
A thermostable xylanase can be produced by culturing the Bacillus sp. 2113 strain or 208 strain of the present invention. Any carbon source and nitrogen source can be used as long as they can be assimilated to produce a thermostable xylanase. For example, as the carbon source, xylan or wheat bran containing xylan, pulp, bagasse, corn fiber, rice straw and other agricultural wastes or plant fiber can be used. As the nitrogen source, nitrogen compounds such as yeast extract, peptone, various amino acids, soybean, corn steep liquor, various inorganic nitrogen can be used. Various salts, vitamins, minerals, and the like can be used as appropriate.
[0081]
The culture temperature and pH may be any as long as the bacteria grow and produce a thermostable xylanase. The culture temperature is 20 to 55 ° C, preferably 35 to 50 ° C, and the pH is 5 to 9, preferably 6 to 6. 8. After culturing the microorganism of the present invention, the cells are separated, and the culture filtrate can be used as it is as a heat-resistant xylanase crude enzyme solution. Such a thermostable xylanase crude enzyme solution has an optimum reaction temperature of 60 to 80 ° C. and an optimum pH of 5 to 7.
[0082]
Further, the thermostable xylanase can be concentrated or solidified by dialysis, salting out, ultrafiltration, lyophilization or the like. Furthermore, the thermostable xylanases XP1 and XP2 can be purified by appropriately combining and repeating the culture filtrate with ammonium sulfate fractionation, molecular weight fractionation by gel filtration, various ion exchange resins, hydroxyapatite, isoelectric point fractionation, and the like. . Specific purification methods are shown in the examples.
[0083]
(2) Purification of genetically modified thermostable xylanase by genetic engineering techniques
The thermostable xylanase of the present invention can also be purified by expressing a cloned gene (in the present invention, an enzyme obtained by expressing a gene is referred to as “gene recombinant thermostable xylanase”). According to the technique, the xylanase gene obtained by the above (3) can be highly produced by expressing it using an appropriate host / vector. As vectors used for expression, plasmid vectors, phage vectors and the like are mainly used. As the host, Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast and the like are mainly used. Any carbon source and nitrogen source can be used as long as they can be assimilated to produce a thermostable xylanase. For example, as the carbon source, xylan or wheat bran containing xylan, pulp, bacus, corn fiber, rice straw or other agricultural waste, or plant fiber can be used. As the nitrogen source, nitrogen compounds such as yeast extract, peptone, various amino acids, soybean, corn steep liquor, various inorganic nitrogen can be used. Various salts, vitamins, minerals, and the like can be used as appropriate. The culture temperature and pH may be any as long as the bacteria produce thermostable xylanase. The culture temperature is preferably 37 ° C. and the pH is preferably 7. As an enzyme purification method, it can be purified by appropriately combining and repeating ammonium sulfate fractionation, molecular weight fractionation by gel filtration, various ion exchange resins, hydroxyapatite, isoelectric point fractionation, and the like. Confirmation of whether the obtained purified enzyme is the desired xylanase is based on comparison of the molecular weight, optimum pH, optimum temperature, N-terminal amino acid sequence, etc. of the obtained purified enzyme with the thermostable xylanase produced by Bacillus sp. It can be judged by doing. Specific examples of enzyme acquisition are shown in the Examples.
[0084]
(5) Pulp bleaching method
Next, a pulp bleaching method using the enzyme of the present invention will be described. In the chemical pulp and mechanical pulp manufacturing process, the strain Bacillus sp belonging to the genus Bacillus and / or thermostable xylanase XP1 (including gene recombinant type) and / or XP2 (including gene recombinant type) of the present invention Bleaching can be performed by treating the pulp with 2113 or Bacillus sp. 208 culture. Further, the pulp can be bleached by performing chemical bleaching and / or alkali extraction before, during or after the enzyme treatment.
[0085]
About the culture | cultivation or enzyme amount processed to a pulp, what is necessary is just to add 0.1-5U per 1g of dry weight of a pulp as a thermostable xylanase unit, Preferably 0.5-3U should be added. In the case of a culture filtrate (crude enzyme solution), the reaction conditions are a reaction temperature of 50 to 90 ° C. and pH 5 to 8, and in the case of purified enzyme, the reaction temperature is 50 to 80 ° C. and pH 5 to 8 for XP1. In XP2, the reaction temperature is 60 to 90 ° C. and the pH is 5 to 8. The reaction time is 0.2 to 24 hours, preferably 0.5 to 8 hours. Reagents used for chemical bleaching include chlorine, chlorine dioxide, nitrogen dioxide, hypochlorite, oxygen, hydrogen peroxide, ozone and the like. In addition, many alkaline compounds known to those skilled in the art can be used for alkali extraction. For alkali extraction, 0.5 to 3% (absolute dry pulp) alkali in terms of sodium hydroxide can be used, and alkali treatment can be performed while adding oxygen, hydrogen peroxide, or the like.
[0086]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
[0087]
[Example 1] Preparation of crude enzyme solution (1)
Xylan (derived from hippo wood, manufactured by Sigma) 0.6%, peptone 0.5%, yeast extract 0.5%, K ₂ HPO _Four 0.1% MgSO _Four ・ 7H ₂ 10 ml (pH 7.0) of a liquid medium containing 0.02% O was placed in a test tube having an inner diameter of 25 mm, sealed with a paper stopper and steam-sterilized at 121 ° C. for 15 minutes. One platinum ear of Bacillus sp 2113 was inoculated into this, and reciprocally shake-cultured at 45 ° C. (amplitude 25 mm, 300 reciprocations / min). After completion of the culture, the culture supernatant was separated by centrifugation (10,000 rpm × 10 minutes) to obtain a crude enzyme solution of thermostable xylanase.
[0088]
50 μl of enzyme solution was added to 200 μl of a 1% xylan solution (beech wood xylan, Sigma 1/10 McIlvaine Buffer pH 6.5) and reacted at 70 ° C. for 5 minutes. After 500 μl of DNS reagent was added and boiled for 5 minutes, it was immediately ice-cooled, 4 ml of distilled water was added, and the absorbance at 500 nm was measured. A calibration curve was prepared using xylose with a known concentration.
[0089]
For xylanase activity, the amount of enzyme that produced 1 μmol of reducing sugar per minute under the above conditions was defined as 1 unit. As a result, the thermostable xylanase activity in the culture supernatant was 400 U / ml at 24 hours and 500 U / ml at 48 hours after the start of the culture.
[0090]
[Example 2] Preparation of crude enzyme solution (2)
Xylan (derived from hippo wood, manufactured by Sigma) 0.6%, peptone 0.5%, yeast extract 0.5%, K ₂ HPO _Four 0.1% MgSO _Four ・ 7H ₂ 10 ml of a liquid medium (pH 7) containing 0.02% O was placed in a test tube having an inner diameter of 25 mm, sealed with a paper stopper and steam sterilized at 121 ° C. for 15 minutes. One platinum ear of Bacillus sp 208 was inoculated into this, followed by reciprocal shaking culture at 45 ° C. (amplitude 25 mm, 300 reciprocations / min). After completion of the culture, the culture supernatant was separated by centrifugation (10,000 rpm × 10 minutes) to obtain a crude enzyme solution of thermostable xylanase. The thermostable xylanase activity in the culture supernatant was measured by the following method.
[0091]
Add 50 μl of enzyme solution to 200 μl of 1% xylan solution (beech wood xylan, Sigma 1/10 McIlvaine Buffer pH 6.3), and react at 70 ° C. for 5 minutes. After 500 μl of DNS reagent was added and boiled for 5 minutes, it was immediately ice-cooled, 4 ml of distilled water was added, and the absorbance at 500 nm was measured. A calibration curve was prepared using xylose with a known concentration.
[0092]
For xylanase activity, the amount of enzyme that produced 1 μmol of reducing sugar per minute under the above conditions was defined as 1 unit. As a result, the thermostable xylanase activity in the culture supernatant was 400 U / ml after 24 hours and 500 U / ml after 48 hours.
[0093]
[Example 3] Purification of thermostable xylanase
Xylan (derived from birch, Sigma) 0.6%, peptone 0.5%, yeast extract 0.5%, K ₂ HPO _Four 0.1% MgSO _Four ・ 7H ₂ 50 ml of a 0.02%, pH 7.0 liquid medium was placed in a 500 ml Sakaguchi flask, sealed with a cotton plug, and then steam sterilized at 121 ° C. for 15 minutes. To this, 1 ml of the culture solution obtained in Example 1 was added, followed by reciprocal shaking culture at 45 ° C. for 3 days (amplitude 10 cm, 100 reciprocations / min). After completion of the culture, the culture supernatant was obtained by centrifugation (8,000 rpm × 10 minutes). The culture supernatant was fractionated with ammonium sulfate, and the 20-60% fraction was collected by centrifugation (20,000 rpm × 10 minutes), followed by dialysis using 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.2) as an external solution. It was. The resulting crude enzyme solution was subjected to ion exchange chromatography using CM Toyopearl 650-C (diameter 2.5 cm × 30 cm) equilibrated with 20 mM acetate buffer (pH 5.0).
[0094]
The adsorbed fraction was eluted with the buffer containing NaCl at a concentration gradient from 0 M to 0.3 M, and fractionated by 5.3 ml. As a result, the xylanase activity was separated into two peaks and eluted, and the active fraction eluted in the first half was designated as xylanase XP1, and the active fraction eluted in the second half was designated as xylanase XP2.
[0095]
Each active fraction was collected, and ammonium sulfate fractionation was performed again. After collecting 20 to 60% fraction by centrifugation (20,000 rpm × 10 minutes), 50 mM was added to 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.2). Gel filtration was performed by elution with Sephacryl S-200 (diameter 2.5 cm × 93 cm) equilibrated with NaCl-containing buffer. For XP1, the flow rate was 34 ml / hr, and 5 ml was fractionated. XP2 was fractionated by 6.7 ml at a flow rate of 34 ml / hr.
[0096]
The active fractions were collected and subjected to SDS polyacrylamide gel electrophoresis, confirming that they were uniformly purified. The yield of each purified enzyme with respect to the culture filtrate was 47.8% for XP1 and 7.8% for XP2. The specific activity was 1420 U / mg for XP1 and 919 U / mg for XP2.
[0097]
[Example 4] Cloning of thermostable xylanase gene
(1) Preparation of chromosomal gene library
Xylan (derived from hippo wood, manufactured by Sigma) 0.6%, peptone 0.5%, yeast extract 0.5%, K ₂ HPO _Four 0.1% MgSO _Four ・ 7H ₂ O A 50 ml liquid medium of 0.02%, pH 7.0 was placed in a 500 ml Sakaguchi flask and sealed with a cotton plug, followed by steam sterilization at 121 ° C for 15 minutes. Bacillus sp. 2113 strain was inoculated with 1 platinum ear, and reciprocal shaking culture was performed at 45 ° C. overnight (amplitude 10 cm, 100 reciprocations / min). After completion of the culture, the cells were obtained by centrifugation (10,000 rpm × 10 minutes).
[0098]
The cells were suspended in 5 ml of glucose-lysozyme solution (50 mM glucose, 10 mM EDTA, 25 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 4 mg / ml lysozyme) and left at room temperature for 15 minutes. 5 ml alkaline solution (02N NaOH, 1% SDS) was added, gently mixed and cooled in ice for 15 minutes. Thereafter, phenol extraction and chloroform extraction were performed. Ethanol was gradually added to the extracted aqueous layer portion, and when DNA precipitated, the chromosomal DNA was wound with a glass rod and suspended in a TE solution. 100 μg of the obtained chromosomal DNA was partially digested with the restriction enzyme EcoRI and fractionated by 3-20% sucrose density gradient ultracentrifugation (22,500 rpm, 16 hours), and the 3-5 kbp fragment fraction was recovered by ethanol precipitation. did.
[0099]
(2) Transformation of heat resistance gene into E. coli
E. coli cloning vector pUC19 (Takara Shuzo) 1 μg is completely digested with restriction enzyme EcoRI, dephosphorylated with alkaline phosphatase (derived from Calf intestine), and contains 500 ng of DNA after ethanol precipitation and 2.5 units of T4 DNA ligase The reaction was carried out in a ligation buffer at 16 ° C. for 16 hours to ligate the gene of the present invention and the vector.
[0100]
Escherichia coli JM109 strain was transformed by the calcium chloride method using the obtained DNA library.
(3) Isolation of xylanase gene from DNA library
Cloning of the XP1 gene
Selection of clones containing the XP1 xylanase gene from the chromosomal DNA library was performed by transforming Escherichia coli using the DNA library, and then applying it to a xylan medium, using halo formation around the colony as an index. That is, after transforming Escherichia coli using the DNA library, xylan medium (1% xylan (from wheat; manufactured by Sigma)), 1% peptone, 0.5% yeast extract containing 100 μg / ml ampicillin. , 0.5% NaCl, 2% agar (pH 7.0)) and cultured at 37 ° C. overnight, and halo formation was observed. A large amount of plasmid DNA was prepared from the obtained clones by alkaline extraction, purified by ultracentrifugation (16 hours, 20 ° C.), and the nucleotide sequence was determined. The nucleotide sequence was determined using a Sequenase kit manufactured by United States Biochemical.
[0101]
The result is shown in SEQ ID NO: 2. The result of estimating the amino acid sequence of XP1 xylanase from the base sequence of the XP1 xylanase gene is shown in SEQ ID NO: 1. In addition, FIG. 6 shows a restriction enzyme map of a DNA fragment containing a gene encoding xylanase (XP1) obtained by the above cloning.
[0102]
The obtained E. coli JM109 / pUCXP1 containing the XP1 xylanase gene was deposited as FERM BP-5320 at the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
(4) Determination of the N-terminal sequence of XP1
The N-terminal amino acid sequence of XP1 was determined by using a protein sequencer (Applied Biosystems (Perkin Elmer) 477A) and a PTH analyzer (Applied Biosystems (Perkin Elmer)) 120A using XP1 purified from the culture supernatant of Bacillus sp 2113 as a sample. ). As a result, the N-terminal sequence of mature xylanase XP1 was as shown in SEQ ID NO: 3.
[0103]
[Example 5] Production of recombinant thermostable xylanase
In this example, recombinant thermostable xylanase XP1 was produced. Plasmid pUCXP1 was completely digested with the EcoRI fragment 500 ng of the present invention obtained by digestion with EcoRI and the restriction enzyme EcoRI, and then dephosphorylated with alkaline phosphatase (derived from Calf Intestine). E. coli / B. Subtilis shuttle vector pHY3000PLK (Takara Shuzo) 1 μg) and T4 ligase 2.5 unit were reacted in a ligation buffer at 16 ° C. for 2 hours and ligated. Using this, Escherichia coli JM109 was transformed by the calcium chloride method.
[0104]
The cells were inoculated in L medium (1% peptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl (pH 7.0)) containing 50 μg / ml tetracycline and cultured at 37 ° C. overnight. A large amount of plasmid DNA was prepared from the obtained transformant by an alkali extraction method. This is designated as pHYXP1, and the results are shown in FIG. Bacillus subtilis ISW1214 strain was transformed with the plasmid DNA by the protoplast method. The obtained transformant was placed in a 50 ml Sakaguchi flask in a 50 ml liquid xylan medium (0.6% Kabukilan (Sigma), 1% peptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl (pH 7. 5) containing 50 μg / ml tetracycline. 0)) Inoculated and cultured at 37 ° C for 3 days. After completion of the culture, the culture supernatant was collected by centrifugation (10,000 rpm × 10 minutes). The activity of thermostable xylanase in the culture supernatant was 160 U / ml 48 hours after the start of the culture.
[0105]
The culture supernatant was fractionated with ammonium sulfate, and the 20-60% fraction was collected by centrifugation (20,000 rpm x 10 minutes), and then dialyzed using 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.2) as an external solution. It was. The resulting crude enzyme solution was subjected to ion exchange chromatography using CM Toyopearl 650-C (diameter: 1.0 cm × 17 cm) equilibrated with 20 mM acetate buffer (pH 5.0).
[0106]
The adsorbed fraction was eluted with a 20 mM acetate buffer solution (pH 5.0) containing NaCl at a concentration gradient from 0 M to 0.3 M, and fractionated in 1.5 ml portions. The active fractions were collected and subjected to SDS polyacrylamide electrophoresis, and confirmed to be uniformly purified. This enzyme has a molecular weight of about 22,500, an optimum reaction pH of 5 to 8, a stable pH range of 3 to 9, an optimum temperature range of action of 50 to 80 ° C., and was determined to be XP1.
[0107]
[Example 6] Bleaching of pulp (1)
The culture supernatant of Bacillus sp 2113 obtained in Example 1 (containing 500 U / ml thermostable xylanase) on hardwood oxygen-bleached kraft pulp (kappa number 8.5, whiteness 46.0%) 2 μl per gram was added and reacted at a pulp concentration of 3%, pH 7.0, and 70 ° C. for 2 hours. After completion of the reaction, the pulp concentration was adjusted to 10% and bleaching was performed in the order of chlorine-alkali-hypochlorite-chlorine dioxide. In addition, what was processed similarly without adding culture supernatant was made into the control | bleached bleached pulp. The standard conditions for bleaching are as follows.
[0108]
Chlorine treatment: Addition rate is 1.6% per pulp dry weight at 40 ° C for 30 minutes
Alkali extraction: Alkaline addition rate is 1.0% per dry pulp at 60 ° C for 100 minutes
Hypochlorite treatment: treatment at 45 ° C for 120 minutes at 0.5% addition rate
Chlorine dioxide treatment: Addition rate is 0.2%, treatment at 70 ° C for 180 minutes
Bleaching was performed with the addition amount of chlorine and alkali or hypochlorite reduced with respect to this standard bleaching condition. As a result, it was possible to reduce the amount of chlorine and alkali necessary to obtain the same whiteness (85.6%) as that of the control bleached pulp by 25%. In addition, hypochlorite was reduced by 50%.
[0109]
Moreover, as a result of quantifying the amount of AOX in the bleaching wastewater using a halogen analyzer TOX-10 (manufactured by Mitsubishi Chemical), AOX could be reduced by 25% by the culture supernatant treatment. The reduction of chlorine, hypochlorite, alkali, AOX, etc. indicates that the bleaching property of the pulp has been improved by the action of this enzyme, which can reduce the chemical cost and organic This is useful in that the production of chlorine compounds can be suppressed.
[0110]
[Example 7] Bleaching of pulp (2)
The culture supernatant of Bacillus sp 208 obtained in Example 2 (containing 500 U / ml of heat-resistant xylanase) is added to kraft pulp exposed to hardwood oxygen (kappa number 8.5, whiteness 46.0%) at 2 μl per gram of dry pulp weight. The mixture was added and reacted at a pulp concentration of 3%, pH 7.0, 70 ° C. for 2 hours. After completion of the reaction, the pulp concentration was adjusted to 10%, and bleaching was performed in the order of chlorine-alkali extraction-hypochlorous acid-chlorine dioxide in the usual manner. In addition, what was processed similarly without adding culture supernatant was made into the control | bleached bleached pulp. The standard conditions for bleaching are as follows.
[0111]
Chlorine treatment: Chlorine added at 1.6% per pulp dry weight at 40 ° C for 30 minutes
Alkali extraction: Alkaline addition rate is 1.0% per dry pulp at 60 ° C for 100 minutes
Hypochlorous acid treatment: Hypochlorous acid addition rate is 0.5% at 45 ° C for 120 minutes
Chlorine dioxide treatment: Chlorine dioxide addition rate is 0.2%, treated at 70 ° C for 180 minutes
In contrast to this standard bleaching condition, in the bleaching of enzyme pretreated pulp, the amount of chlorine and alkali or hypochlorous acid added was reduced. As a result, it was possible to reduce the amount of chlorine and alkali required to obtain the same whiteness (85.6%) as the control bleached pulp without enzyme treatment by 27%. Hypochlorite was reduced by 53%.
[0112]
The amount of AOX in the bleaching effluent was quantified using a halogen analyzer TOX-10 (manufactured by Mitsubishi Chemical). As a result, AOX was reduced by 28% by treatment with the culture supernatant.
[Comparative Examples 1-5] Bleaching of pulp (comparison with commercially available enzyme)
The pulp was subjected to enzyme treatment and bleaching treatment using various commercially available enzymes, and the reduction rates of chlorine, hypochlorite and AOX were compared with the results of Examples 6 and 7. Comparative Example 1 is Irgazyme 40-X4 manufactured by Chiba-Geigy, Comparative Example 2 is Irgazyme 10A-X4, Comparative Example 3 is Pulpzyme HC manufactured by Novo, and Comparative Example 4 is Alko. ) Ecopulp made by the company and Cartazyme HS made by Sandoz as the comparative example 5 were used, and the same treatment as in Examples 6 and 7 was performed. Table 6 shows the results obtained in Examples 6 and 7 and the results of the comparative examples.
[0113]
[Table 6]

Table 6 shows that the enzyme of the present invention has a higher reduction rate of chlorine, chlorine dioxide, and AOX under the conditions of pH 7.0 and 70 ° C. than the conventional enzyme. In particular, some enzymes have little activity at such high temperatures, and it has been found that the enzyme of the present invention is excellent in heat resistance.
[0114]
【The invention's effect】
According to the present invention, it is possible to provide a novel thermostable xylanase and its gene, a method for producing the thermostable xylanase and its use. The present invention makes it possible to produce a thermostable xylanase, and contributes to the industrial production of the thermostable xylanase. Moreover, the pulp of the heat-stable xylanase of the present invention and / or the culture of the strain of the present invention is improved to improve the bleachability of the pulp, reducing chemicals such as chlorine in paper pulp production, reducing AOX in wastewater, etc. It contributes to.
[0115]
[Sequence Listing]

[0116]

[0117]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the results of thin-layer chromatography analysis of a reaction product when an enzyme of the present invention is allowed to act on birch silane.
FIG. 2 is a graph showing an optimum reaction pH of the enzyme of the present invention.
FIG. 3 shows the pH stability of the enzyme of the present invention.
FIG. 4 is a view showing the optimum reaction temperature of the enzyme of the present invention.
FIG. 5 is a graph showing the thermal stability of the enzyme of the present invention.
FIG. 6 is a restriction map of a DNA fragment containing a gene encoding xylanase XP1.
FIG. 7 is a construction diagram of plasmid pUCXP1.
FIG. 8 is a construction diagram of plasmid pHYXP1.

Claims (2)

配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる耐熱性キシラナーゼＸＰ１遺伝子。Thermostable xylanase XP1 gene comprising a nucleotide sequence encoding a amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. 配列番号２で表される塩基配列からなる耐熱性キシラナーゼＸＰ１遺伝子。  The thermostable xylanase XP1 gene consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.

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