JP2001224398A - ルシフェラーゼ組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応でルシ
フェラーゼ活性由来の光生起速度を解析するための改良
方法及び組成物の提供。 【解決手段】甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応を
使用することにより甲虫ルシフェラーゼ、又はＡＴＰが
存在するサンプルをアッセイするための方法、組成物及
び試験キットを提供する。更に補酵素Ａ、甲虫ルシフェ
ラーゼ及びルシフェラーゼ−ルシフェリン反応の励起状
態のオキシルシフェリンの結合体並びに、補酵素Ａとル
シフェリン（Ｄ−（−）−２−（６’−ヒドロキシ−
２’−ベンゾチアゾリル）−チアゾリン−４−カルボン
酸）のチオエステルも提供する。図は、アッセイ中にＣ
ｏＡが単独で存在する場合、通常アッセイで何も添加し
ない場の発光曲線を示している。そしてＣｏＡ、ＤＴＴ
及びＢＳＡが添加されている場合何も添加しない場合の
１５倍以上の全光生起量が得られた。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】技術分野 本発明は全般的には生物発光に係わる。特に本発明は、
甲虫ルシフェラーゼ活性由来の優れた光生成方法及び該
方法を実施するための組成物に係わる。本発明は、所定
の生物特異的反応の生産物または発生を定量化するため
のリポーターまたはマーカーとしてルシフェラーゼを使
用するアッセイ及び試験キットに特によく適している。

【０００２】発明の背景 分子事象を定性的または定量的にモニターするためにリ
ポーター分子またはラベルを使用することは、医療診断
のため、工業環境において毒素及び他の物質を検出する
ため、並びに、生物学、生物医学及び生化学における基
礎及び応用研究のために使用されるアッセイにおいて十
分に確立されている。このようなアッセイとしては、イ
ムノアッセイ、核酸プローブハイブリダイゼーションア
ッセイ、リポーター分子の産生が特定のプロモーターか
らの転写に起因するアッセイを挙げることができる。こ
のようなアッセイ系におけるリポーター分子またはラベ
ルとしては、放射性同位元素、蛍光物質、酵素及び化学
発光物質を挙げることができる。

【０００３】問題の事象をモニターまたは測定するため
に化学発光物質が使用されるアッセイ系のなかに、生物
発光酵素ルシフェラーゼの活性を測定するものがある。
しかしながらルシフェラーゼアッセイの使用は、アッセ
イにおける発光の短時性及びパターンが原因となって、
普及していない。甲虫ルシフェラーゼでは、この発光は
極めて急速にピーク強度に達し、即ち閃光が放たれ、次
いでよりゆっくりと、しかし尚問題のあるほど急速に減
衰してから、ピーク強度の約１０％程度の“定常状態”
に至って更にゆっくりと減衰する。強い発光は短時間で
あるので、アッセイを実施する上で生物発光反応混合液
を調製するためには、通常は酵素を基質溶液に迅速に注
入するような特別の苦労を要する作業を必要とする。
“閃光”の間に発せられた光を測定する必要性は、実験
上の問題として残っている。今日のルミノメーターをも
ってしてもこのような光を正確に測定することは依然と
して困難である。

【０００４】発光系はよく知られており、ある種の細
菌、原生動物、腔腸動物、軟体動物、魚類、多足類、ハ
エ、菌類、蠕虫、甲殻類及び甲虫を含む多くの発光生
物、特にＰｈｏｔｉｎｕｓ，Ｐｈｏｔｕｒｉｓ及びＬｕ
ｃｉｏｌａ属のホタル並びにＰｙｒｏｐｈｏｒｕｓ属の
コメツキムシから単離されている。多くの上記生物にお
いて、分子を高エネルギー状態に励起するために自由エ
ネルギー交換が使用される酵素触媒酸化還元が行われて
いる。励起分子が自発的に基底状態に戻るとき、可視光
が発せられる。この発光は“生物発光”と称されてい
る。

【０００５】甲虫ルシフェラーゼ、特にホタル種Ｐｈｏ
ｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ由来のものは、初期の研究
から生物発光を理解するための範例の役目を果たしてい
る。Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼは、補欠分子団
を持たないかまたは金属イオンにしっかり結合してお
り、５５０個のアミノ酸を有し、分子量が約６０，００
０ダルトンの酵素である。この酵素は、当分野では長年
にわたって結晶形態で使用可能であった。生物発光を生
起するホタルルシフェラーゼの機構についての分子成分
の研究から、酵素の基質はホタルルシフェリン、即ち多
複素環式有機酸Ｄ−（−）−２−（６’−ヒドロキシ−
２’−ベンゾチアゾリル）−Δ^２−チアゾリン−４−カ
ルボン酸（以降は特に記載のない限り“ルシフェリン”
と表記する）であることが判っている。

【０００６】生物発光を与える甲虫ルシフェラーゼ触媒
反応（以降は単に“甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン
反応”と表記する）は、ホタルルシフェリン、アデノシ
ン三リン酸（ＡＴＰ）及び酸素分子を含む２段階プロセ
スとして記述されている。初期反応においては、反応： Ｅ＋ＬＨ_２＋ＡＴＰ＋Ｍｇ^＋２→Ｅ・ＬＨ_２−ＡＭＰ＋
ＰＰ_ｉ 〔式中、Ｅはルシフェラーゼであり、ＬＨ_２はルシフェ
リンであり、Ｍｇ^２＋はマグネシウムイオンであり、Ｐ
Ｐ_ｉはピロリン酸塩である。〕で示されるように、ルシ
フェリンとＡＴＰが反応してルシフェリルアデニレート
を形成し、無機ピロリン酸塩が放出される。ルシフェリ
ルアデニレートＬＨ_２−ＡＭＰはルシフェラーゼの触媒
部位にしっかりと結合したままである。この形態の酵素
が酸素分子に暴露されると、酵素に結合していたルシフ
ェリルアデニレートが酸化されて、電気的に励起された
状態のオキシルシフェリン（Ｌ＝０）を生じる。励起し
た酸化ルシフェリンは、反応：

【０００７】

【数１】 で示されるように、基底状態に戻るときに光を発する。
酸化されていたルシフェリン１分子ごとに１つの光子が
放出される。酸化ルシフェリンの電気的励起状態は、甲
虫ルシフェラーゼのルシフェラーゼ−ルシフェリン反応
に特徴的な状態であり、酸化ルシフェリンが基底状態に
戻るときに発せられる光の色（即ちエネルギー）は、同
じルシフェリンを有する異なる甲虫種が異なる色の光を
発することから、酵素によって決定される。

【０００８】ルシフェラーゼ、Ｍｇ^２＋及びルシフェリ
ンを含む反応混合物にＡＴＰを注入することにより発光
が開始されるとき、全ての成分が飽和濃度に近いかまた
は飽和濃度である場合、強度が急速に増大し、次いで最
初の数秒間で急速に減少し、次いで更に減衰するが、こ
の減衰は数時間も継続することがある。この反応速度の
減少は、生産物阻害によるものと考えられている。

【０００９】ルシフェラーゼは微小濃度のＡＴＰをアッ
セイする手段として使用されており、１０^−１６モルほ
どの微量のＡＴＰを、高品質の酵素調製物を用いて検出
することができる。ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応
はＡＴＰに高度に特異的なものである。例えば、デオキ
シＡＴＰは、ＡＴＰによって生成される光の２％未満し
か生成しないし、他のヌクレオシド三リン酸は０．１％
未満しか生成しない。

【００１０】ＡＴＰ濃度を他の酵素の活性と組み合わせ
ると、ルシフェラーゼは、かかる他の酵素及び他の化合
物に対する生化学リポーター分子となり得る。

【００１１】甲虫ルシフェラーゼを他のアッセイにリポ
ーターとして使用し得る可能性は十分にある。しかしな
がらこのような使用は、ルシフェラーゼ−ルシフェリン
反応の発光速度の問題によって制限されている。このよ
うな速度の問題がなければ、直ちに使用可能な甲虫ルシ
フェラーゼは、例えば酵素がリポーターとして作用する
ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎ
ｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙｓ）や、酵素がリポータ
ーとして作用する核酸プローブハイブリダイゼーション
アッセイのようなイムノアッセイのごとき用途に使用さ
れるであろう。

【００１２】甲虫の発光器官から直接単離される結晶質
ルシフェラーゼを使用し得るほかに、数種の甲虫のルシ
フェラーゼをコードするｃＤＮＡ（特に、Ｐ．ｐｙｒａ
ｌｉｓ（ホタル）のルシフェラーゼ、Ｐ．ｐｌａｇｉｏ
ｐｈｔｈａｌａｍｕｓ（コメツキムシ）の４種のルシフ
ェラーゼアイソザイム、Ｌ．ｃｒｕｃｉａｔａ（ホタ
ル）のルシフェラーゼ及びＬ．ｌａｔｅｒａｌｉｓのル
シフェラーゼを含む）〔ｄｅ Ｗｅｔ ｅｔ ａｌ．，
Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．ｂｉｏｌ．７，７２５−７３７
（１９８７）；Ｍａｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ
７７，２６５−２７０（１９８９）；Ｗｏｏｄ ｅｔ
ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４，７００−７０２
（１９８９）；欧州特許出願公開第０ ３５３ ４６４
号〕が使用可能である。更に、ルシフェラーゼを産生す
る任意の他の甲虫種のルシフェラーゼをコードするｃＤ
ＮＡが、公知の技術〔ｄｅ Ｗｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍ
ｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３３，３−１４（１９８
６）；Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４
４，７００−７０２（１９８９）〕を使用して当業者に
は容易に入手可能である。入手した甲虫ルシフェラーゼ
をコードするｃＤＮＡを用いれば、該ｃＤＮＡを発現す
るように形質転換した細菌（例えばＥ．ｃｏｌｉ）、酵
母、培養哺乳動物細胞などから単離することにより高度
に純粋な形態のルシフェラーゼを大量に製造することは
当業者には全く容易なことである。最近では、タンパク
質をコードする核酸からタンパク質を製造するために使
用可能となった種々の無細胞系を使用して甲虫ルシフェ
ラーゼを作製することもできる。

【００１３】更に、甲虫ルシフェラーゼをコードするｃ
ＤＮＡを入手できることと、ルシフェラーゼ−ルシフェ
リン反応を触媒する酵素をコードするｃＤＮＡを迅速に
スクリーニングできること〔ｄｅ Ｗｅｔ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，上掲 及びＷｏｏｄ ｅｔ
ａｌ．，上掲 参照〕から、当業者は、ルシフェラー
ゼ−ルシフェリン反応による生物発光を触媒する活性を
保持する突然変異ルシフェラーゼを、大量に且つ純粋な
形態で製造及び入手し得る。このような突然変異ルシフ
ェラーゼは、天然甲虫ルシフェラーゼの配列と１カ所以
上で異なるアミノ酸配列を有する。本明細書中の“甲虫
ルシフェラーゼ”なる用語は、甲虫に天然に存在するル
シフェラーゼのみならず、ルシフェラーゼ−ルシフェリ
ン反応を触媒することにより生物発光を提供する活性を
保持する、天然ルシフェラーゼの突然変異体をも含むと
理解されたい。

【００１４】甲虫ルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡ
を容易に入手し得ることで、このようなｃＤＮＡの発
現、結果的には該酵素の産生をかかる遺伝事象と組み合
わせることにより、転写及び翻訳に関係する遺伝事象を
シグナル分析、モニターまたは測定するのに使用される
アッセイに、ルシフェラーゼをリポーターとして使用す
ることができる。

【００１５】甲虫ルシフェラーゼをリポーター分子とし
て使用し得る可能性は益々重要となると共にかなり変化
している一方で、実際には、酵素によって生じる発光の
短時性及びパターンがそれらの使用を制限している。甲
虫ルシフェラーゼを用いてより効率的な光生成、即ちよ
り継続的でしかも高い速度で発光を行なうことにより、
甲虫ルシフェラーゼのリポーターとしての有用性を増強
することが望まれる。

【００１６】ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応の速度
及び閃光の間に放出される光を正確に測定することの関
連問題を解決するための、幾分普及している１つの方法
は、閃光が発生するのを防いだり、光生成を延長すると
報告されている種々の酵素阻害剤を使用することであ
る。酵素阻害剤の１例としてヒ酸塩がある。ヒ酸塩は閃
光の強度（ｈｅｉｇｈｔ）を下げ、所与の量のＡＴＰに
対する発光を延長する傾向にあるが、ＡＴＰを検出する
感度を低下させる。ヒ酸塩を含むルシフェラーゼ調製物
は最近まで市販されていたが、このような調製物の使用
はもはや好まれていない。それは一部には、用途によっ
ては精巧な光測定装置を使用して、ヒ酸塩を使用する必
要性が避けられ得るからである。

【００１７】しかしながら、そのような精巧な装置を用
いてさえ、酵素と基質を迅速に混合するための注入方式
のような特定の実験作業は依然として必要とされてい
る。このような特定のやっかいな作業の必要性を回避す
るため、酵素反応における光生成速度を改善すること
は、ルシフェラーゼのリポーターとしての有用性を大幅
に拡大する。

【００１８】ヒ酸塩のほかにも多数の化合物が、甲虫ル
シフェラーゼ−ルシフェリン反応による光生成パターン
に影響すると報告されている。ヒ酸塩と同じ目的でリン
酸塩が使用されたが、リン酸塩を使用する場合にはアッ
セイにマグネシウムイオンを存在させることが必要とな
り、不本意にもリン酸マグネシウムが沈澱するという結
果となるため、歓迎されなかった。

【００１９】補因子、即ち補酵素Ａ（ＣｏＡ）も、ルシ
フェリン−ルシフェラーゼ反応における発光パターンに
影響すると報告されている。Ａｉｒｔｈ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉ
ｃａ Ａｃｔａ，ｖｏｌ．２７（１９５８）ｐｐ．５１
９−５３２は、ＣｏＡをホタルルシフェリン−ホタルル
シフェラーゼ混合物に加えると、光強度の初期ピークに
は影響しないが、発光がより高いレベルで、加えた合計
ＣｏＡに比例する時間だけ継続すると報告している。Ａ
ｉｒｔｈらは、全発光量がＣｏＡの不在下よりも存在下
でより大きいことも示した。

【００２０】Ａｉｒｔｈらは更に、システイン及びグル
タチオンは発光を刺激せず、詳細は与えていないが、ヒ
ドロキシルアミンはＣｏＡと同様に発光を刺激し、チオ
エタノールアミンは僅かに刺激すると報告している。

【００２１】ルシフェリン、ＡＴＰ及び酸素の甲虫ルシ
フェラーゼ触媒反応による発光に及ぼすＣｏＡの影響に
係わるＡｉｒｔｈらの教示は疑わしい。Ａｉｒｔｈらの
報告に続き、ルシフェラーゼに及ぼすＣｏＡの影響が、
デヒドロルシフェリンによる酵素阻害をＣｏＡが防ぐこ
とに基づいて説明された。デヒドロルシフェリンは、ホ
タル由来のルシフェリンを精製したＡｉｒｔｈら及びこ
れに続く研究者によって使用されたルシフェリンの有意
な夾雑物であると考えられている化合物である。より最
近及び今日使用されているルシフェリンは合成によって
製造されており、従ってそれ自体はデヒドロルシフェリ
ンを実質的に含まない。ルシフェリンの合成調製物に
は、ルシフェリンに対して典型的には１重量％未満、好
ましくは０．３重量％未満のデヒドロルシフェリンしか
混入していない。従ってＣｏＡは、合成によって製造さ
れたルシフェリンにおいてはルシフェラーゼ活性に影響
しないと推定される。甲虫ルシフェラーゼによる発光を
ＣｏＡ（及びＡｉｒｔｈらの文献に記載されている他の
化合物）が刺激するというＡｉｒｔｈら及びそれに続く
研究者らの教示は、ルシフェラーゼ触媒発光に基づくア
ッセイの実用性を拡張しようという努力において３０年
以上も完全に無視されてきた。例えば、ヒ酸塩は望まし
くないと認識されているにも拘わらず、ＣｏＡがヒ酸塩
の代替物として示唆されたことはない。

【００２２】更に、他のスルフヒドリル化合物が、酵素
の調製及び貯蔵の際のルシフェラーゼの安定性に貢献す
ると報告されている。米国特許第４，８３３，０７５号
は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）が、新たに調製した
ルシフェラーゼ溶液と比較して、ＤＴＴなしではたった
１０％の残留酵素活性しか持たないであろう熟成Ｐｈｏ
ｔｉｎｕｓ Ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ溶液中で、
ルシフェラーゼ活性を５０％レベルに維持することを開
示している。米国特許第４，６１４，７１２号は、細菌
ルシフェラーゼがジスルフィド形成によって失活された
とき、ＤＴＴ、β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）
または他の還元剤を加えることにより酵素活性を回復し
得ると記載している。甲虫ルシフェラーゼと細菌ルシフ
ェラーゼとは構造及び作用が異なるが、いずれも、所定
の還元剤により通常酸化から保護され得る反応性スルフ
ヒドリル基を有するとみられている。

【００２３】しかしながら当分野においては、ジチオト
レイトール（ＤＴＴ）及び同様のチオール試薬は、約５
ｍＭ以上の濃度ではルシフェラーゼによって触媒される
発光を阻害すると考えられている。

【００２４】ルシフェラーゼの化学的機構（ｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ）の種々の局面が認識及び研究されているにも
拘わらず、従来技術は、実用的技術面で、検出モードと
しての得られる発光の有用性を増大するようなルシフェ
ラーゼ−ルシフェリン反応による、より効果的な光生成
をほとんど提供していない。

【００２５】発明の要約 本発明は、甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応にお
ける光生成速度を改善し、かかる光生成の化学的機構に
係わる種々の新規知見をもたらす。光生成速度の改善
は、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応におけるルシフ
ェラーゼの生産物阻害を減速または低減し、光生成触媒
反応の間に起こるルシフェラーゼ失活を減速する化学的
機構に関係する。

【００２６】速度改善は、一部には、これまで認識され
ていなかった２種類の組成物、即ちＣｏＡ及びルシフェ
リンのチオエステルと、ＣｏＡ、ルシフェラーゼ及び励
起状態の酸化ルシフェリンの結合体との作用による。本
発明はこれらの組成物をも含む。

【００２７】甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応混
合液に、ＣｏＡもしくはＤＴＴのようなチオール試薬ま
たはこれら両方を含めると、反応による光生成速度及び
反応による全発光量が驚くほど向上することが見い出さ
れた。更に、甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応混
合物にＣｏＡを含め、次いで混合物を、反応による生物
発光のピーク強度を少量だけ低下させる何等かの他の化
学的または物理化学的条件に暴露すると、反応による生
物発光の全発光量を増大するという有利な効果があるこ
とも見い出された。従って本発明は、甲虫ルシフェラー
ゼの存在について、試料（例えば細胞）中で甲虫ルシフ
ェラーゼの生成をもたらす遺伝事象について、ＡＴＰの
存在について、またはＡＴＰの生成をもたらす化学的も
しくは生化学的事象について、試料を試験またはアッセ
イするために、甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応
及びそれによって生起される生物発光を使用するための
優れた方法と、該方法を実施するための組成物及び試験
キットとを提供する。本発明の方法においては、本発明
の組成物及び試験キットを用いて、かかる光の全発光量
に対するピーク強度の比を小さくすると共に全発光量を
増大することにより、またはピーク強度に達した後に強
度が低下する速度を遅くすることにより、甲虫ルシフェ
ラーゼ−ルシフェリン反応による光生成速度を改善す
る。

【００２８】本発明の利点は、従来技術において反応に
災いしていた“閃光”は著しく低減されるが、全発光量
は著しく増大、典型的には従来秘術におけるかかる反応
の１０倍以上に増大する光生成速度を有する甲虫ルシフ
ェラーゼ−ルシフェリン反応を提供することである。甲
虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応において生成され
る光の生成速度及び全光量の向上によって、ルシフェラ
ーゼを、またはルシフェラーゼを使用してＡＴＰをアッ
セイすることが、従来の方法よりずっと単純に、しかも
より高感度になる。例えば本発明の方法及び組成物また
は試験キットを用いると、通常のルシフェラーゼ−ルシ
フェリン反応の急激な閃光において発せられる光を測定
するための、迅速に試料を注入するような特別の作業や
精巧なルミノメーターのような特別の装置が、アッセイ
に必要ではなくなる。

【００２９】実際、本発明の方法及び組成物またはキッ
トを使用し、他のタイプの測定のために実験室で既に使
用可能であるシンチレーションカウンターのような装置
を、甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応において生
成される光を測定する必要があるアッセイに使用するこ
とができる。これは、ルミノメーターはないがシンチレ
ーションカウンターまたは他の光生成を測定する装置は
所有する実験室において該アッセイの使用を容易にする
ことにより、科学及び技術分野におけるこのようなアッ
セイの適用を著しく拡張し得る。以前は、ルシフェラー
ゼ−ルシフェリン反応による光生成速度は、このような
光を測定する必要があるアッセイにおけるシンチレーシ
ョンカウンターの使用を阻んでいた。

【００３０】本発明によれば、甲虫ルシフェラーゼをマ
ーカーまたはリポーター分子として使用し得る全可能性
が実際に実現され得る。

【００３１】特定の適応、組成物の変形態様及び物理的
属性の他の利点及び更なる理解は、添付の図面を参照し
て与えられる以下の本発明の詳細説明を検討することに
より得られるであろう。

【００３２】図面の簡単な説明 以下、本発明を添付の図面を参照して説明する。全図面
を通して、同じ参照符号は同じエレメントを指す。

【００３３】図１は、補酵素Ａの存在下及び不在下での
甲虫ルシフェラーゼ活性による発光を比較したグラフで
ある。

【００３４】図２は、ジチオトレイトールの存在下及び
不在下での甲虫ルシフェラーゼ活性による発光を比較し
たグラフである。

【００３５】図３ａ及び図３ｂは、甲虫ルシフェラーゼ
−ルシフェリン反応による光生成の触媒の不在下及び触
媒中の、甲虫ルシフェラーゼ安定性に及ぼすジチオトレ
イトール濃度の変化の影響を示すグラフである。

【００３６】図４は、補酵素Ａ、ジチオトレイトール及
びウシ血清アルブミンの存在下での甲虫ルシフェラーゼ
活性による発光を、補酵素Ａ、ジチオトレイトール及び
ウシ血清アルブミンの不在下での同活性による発光と比
較したグラフである。

【００３７】図５は、酵素をコードするｃＤＮＡの発現
によりルシフェラーゼが産生された培養哺乳動物細胞由
来の抽出物における甲虫ルシフェラーゼ活性による発光
を、本発明のアッセイと慣用の従来技術のアッセイとに
おいて比較したグラフである。

【００３８】図６は、（１）甲虫ルシフェラーゼ濃度の
対数値と、本発明に従って実施したアッセイにおける甲
虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応において生成され
た光の対数値との一次相関と、（２）甲虫ルシフェラー
ゼを検出するアッセイの感度とを示すグラフである。

【００３９】図７は、ＣｏＡの存在下に実施した甲虫ル
シフェラーゼ−ルシフェリン反応による光生成に、３６
ｍＭ ２−アミノエタノールは影響するが３６ｍＭ エ
タノールは影響しないことを示すグラフである。

【００４０】図８は、ＣｏＡの存在下に実施した甲虫ル
シフェラーゼ−ルシフェリン反応による光生成に及ぼす
種々のリン酸塩濃度の影響を示すグラフである。グラフ
中、リン酸濃度が増加するにつれてピーク強度は低下し
ている。

【００４１】発明の詳細 以下の説明においては、特に記載のない限り、室温（約
２０℃〜約２５℃）及び大気圧下で処理ステップを実施
し且つ濃度を測定した。

【００４２】本明細書中“ルシフェラーゼ”なる用語
は、特に記載のない限り、天然または突然変異甲虫ルシ
フェラーゼを指す。ルシフェラーゼは、天然である場合
には、甲虫自体、特にその発光器官から当業者は容易に
入手することができる。ルシフェラーゼが、天然に存在
するもの、またはルシフェラーゼ−ルシフェリン反応に
おいて活性を保持する天然ルシフェラーゼの突然変異体
であるならば、ルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡを
発現するように形質転換された細菌、酵母、哺乳動物細
胞、植物細胞などの培養体から、またはルシフェラーゼ
をコードする核酸からルシフェラーゼを作製するための
ｉｎ ｖｉｔｒｏ無細胞系から、容易に入手し得る。好
ましいルシフェラーゼはホタルＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙ
ｒａｌｉｓのものである。

【００４３】“ルシフェリン”なる用語は先に定義して
ある。

【００４４】本発明は、その態様の１つにおいて、ルシ
フェラーゼを含むと推定される試料において甲虫ルシフ
ェラーゼの存在を検出する方法であって、（ａ）前記試
料のアリコートを用いて、ルシフェラーゼ−ルシフェリ
ン反応におけるルシフェラーゼの活性に有効な濃度の、
ルシフェリン、アデノシン三リン酸、チオール試薬及び
Ｍｇ^２＋を含む溶液を調製し、（ｂ）ステップ（ａ）で
得られた溶液からの発光を測定することからなる方法を
提供する。この本発明の第１態様は、単に、分析すべき
試料（例えば、その細胞中で、ルシフェラーゼ発現を制
御するプロモーターが活性または不活性であった場合に
それぞれルシフェラーゼが発現されたまたはされなかっ
たと推定される哺乳動物細胞培養体の抽出物）の一部
（即ちアリコート）を取り、該アリコートを、存在する
とすればその中でルシフェラーゼがルシフェラーゼ−ル
シフェリン反応において活性である、チオール試薬を含
む溶液と混合し、溶液（またはその一部）を測定して、
生物発光がその中で行われているか確認することを含
む。試料のアリコートをこのような溶液と混合すること
は、好ましくは、また一般的には、アリコートの全ての
成分を溶液中に単純に溶解するだけでよい。どんな場合
でも混合は、ルシフェラーゼがアリコート中に存在する
ならば、それが、アッセイ法の基礎をなす反応がその中
で起こる溶液中に溶解するようなものである必要があ
る。当業者には理解されるように、アッセイ法である本
発明の方法は通常は適当な対照または基準と一緒に実施
され（例えば分析される試料がルシフェラーゼを含まな
い溶液及び既知濃度のルシフェラーゼを含む溶液と並行
して分析される）、適当な基準をもってして該方法は、
試験試料（即ち分析されている試料）中の甲虫ルシフェ
ラーゼの濃度を定量化するのに適合され得る。

【００４５】後述するように、本発明によってルシフェ
ラーゼ−ルシフェリン反応による光生成速度が改善され
るが故に、本発明のルシフェラーゼアッセイ法は、約１
０^{− １８}Ｍ〜約１０^−６Ｍの酵素を検出することがで
き、下限は、使用可能な最高の検出装置においてさえノ
イズによってのみ制限される。

【００４６】甲虫ルシフェラーゼは、ルシフェラーゼ−
ルシフェリン反応においてルシフェラーゼが活性である
ｐＨ、イオン強度、温度、ＡＴＰ濃度、マグネシウムイ
オン濃度、ルシフェリン濃度などの条件の範囲が幾分異
なる。しかしながら、任意の特定の甲虫ルシフェラーゼ
に対するかかる範囲、場合によっては最適範囲でさえ確
定することは当業者には簡単なことである。

【００４７】当業者は、例えば酵素の活性を維持または
増強するために、またはアッセイ作業を行なう試料アリ
コートを入手するのに使用する手順に必要なものとし
て、特に上述したもの以外の組成物もアッセイ反応混合
液中に存在させ得ることに気付くであろう。例えばトリ
シン、ＨＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、Ｔｒｉｓ、
グリシルグリシン、リン酸塩などの典型的な緩衝剤を、
ｐＨ及びイオン強度を維持するために存在させ、ルシフ
ェラーゼ−ルシフェリン反応におけるルシフェラーゼの
活性を増強するタンパク質性材料、例えば哺乳動物血清
アルブミン（好ましくはウシ血清アルブミン）またはラ
クトアルブミンもしくはオボアルブミンを存在させるこ
ともでき、アッセイすべきルシフェラーゼを抽出する系
（例えば細胞）中に存在し得て且つルシフェラーゼまた
はＡＴＰに悪影響を及ぼし得る金属含有プロテアーゼま
たはホスファターゼの活性を抑制するためには、ＥＤＴ
ＡまたはＣＤＴＡ（シクロヘキシレンジアミンテトラア
セテート）などを存在させ得る。ルシフェラーゼを安定
化するグルセロールまたはエチレングリコールを存在さ
せることもできる。同様に、洗剤または界面活性剤、特
に非イオン性洗剤、例えばオクトキシノール（Ｔｒｉｔ
ｏｎ Ｘ−１００のようなＲｏｈｍ＆Ｈａａｓの商品名
“Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ”で販売されているもの）を、典型
的にはルシフェラーゼをアッセイ用に抽出する細胞を溶
解するのに使用する溶液の、本発明のアッセイに使用す
る溶液に混合される残りの部分として含めることができ
る。マグネシウムに対する対イオンは勿論存在させる。
当業者には理解されるように、かかる対イオンの化学的
特性及び濃度は、マグネシウムイオンを与えるのに使用
されるマグネシウム塩、使用する緩衝液、溶液のｐＨ、
ｐＨ調節に使用される物質（酸または塩基）、並びに、
マグネシウム塩、緩衝液及びｐＨ調節に使用する酸また
は塩以外の資源から出た溶液中に存在するアニオンに従
って、広範に変化し得る。１つの方法においては、所望
のマグネシウムイオン濃度を与えるために、使用する緩
衝液（例えばトリシン）の溶液中の炭酸塩としてマグネ
シウムイオンを供給し、次いで緩衝溶液のｐＨを強酸、
例えば硫酸を加えることにより調節することができ、そ
うするとほとんどの炭酸塩（及び重炭酸塩）が二酸化炭
素として失われ、かかるアニオンをスルフェート、ビス
ルフェート、トリシンアニオン、場合によっては（溶液
中に存在し得て、アニオンを与える他の物質（例えばリ
ン酸塩）によって）他のタイプのアニオンで置き換える
結果となる。アッセイ法を実施する溶液の空気からの酸
素飽和は、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応に必要と
される酸素分子を与えるに十分である。どんな場合で
も、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応におけるルシフ
ェラーゼの活性に有効である該方法の説明において特に
上述した成分を含む、アッセイ反応混合液中の種々の成
分の濃度を容易に確定することは、十分に当業者の技術
の範囲内である。光生成速度向上に必須の成分はチオー
ル試薬である。

【００４８】本発明の方法及び組成物に使用されるチオ
ール試薬は、ＣｏＡまたはＣｏＡ以外のチオール試薬で
ある。ＣｏＡ以外のチオール試薬は、ルシフェラーゼ−
ルシフェリン反応が起こる温度、ｐＨ、イオン強度、化
学組成などの条件下で空気飽和水溶液中の還元剤として
有効となり得る遊離スルフヒドリル基を有する試薬であ
る。かかる試薬のなかで好ましいのはジチオトレイトー
ルである。使用し得る他の試薬としては、β−メルカプ
トエタノール（β−ＭＥ）、２−メルカプトプロパノー
ル（鏡像異性体または両鏡像異性体の任意の組合せ）、
３−メルカプトプロパノール、２，３−ジチオプロパノ
ール及びグルタチオンを挙げることができる。

【００４９】本発明の方法に従ってルシフェラーゼをア
ッセイし得る試料のタイプとしては、特に、イムノアッ
セイにリポーターとして使用されたルシフェラーゼを含
む試料、または、核酸プローブハイブリダイゼーション
アッセイにリポーターとして使用されたルシフェラーゼ
を含む試料を挙げることができる。イムノアッセイ及び
核酸プローブ技術において理解されているように、本発
明に従ってアッセイされたルシフェラーゼは、それぞれ
イムノアッセイまたは核酸プローブハイブリダイゼーシ
ョンアッセイにおいて被分析物質（ａｎａｌｙｔｅ）を
検出するのに使用される抗体または核酸プローブに化学
的に、該技術においては公知の多数の方法のいずれかに
よって結合されている。次いで、やはりよく知られた方
法に従って、ルシフェラーゼ標識抗体または核酸プロー
ブを分析すべき試料と混合し、試料中に存在する可能性
があり検出が求められている被分析物質（例えばイムノ
アッセイの場合には抗原または抗抗原抗体、核酸プロー
ブハイブリダイゼーションアッセイの場合にはターゲッ
ト核酸）に結合させ、次いで、被分析物質と結合しなか
ったルシフェラーゼ標識抗体または核酸プローブを、も
しあれば結合したものから分離する。本発明に従ってア
ッセイすべき試料は、ルシフェラーゼ標識抗体または核
酸プローブの被分析物質に結合したかかる抗体またはプ
ローブ上のラベルであったルシフェラーゼである。ルシ
フェラーゼは、本発明に従ってルシフェラーゼをアッセ
イする間、標識抗体またはプローブに化学的に結合した
ままとすることもできるし、ここでも公知の方法によっ
て、本発明に従ってルシフェラーゼをアッセイする前に
標識抗体または核酸プローブから分離することもでき
る。甲虫ルシフェラーゼをリポーターまたはラベルとし
て使用し得るイムノアッセイ及び核酸プローブハイブリ
ダイゼーションアッセイは、生物学、バイオテクノロジ
ー、並びに病原体の検出、遺伝子異常の検出、疾患の診
断などを含む医学の分野で多数の実用及び研究用途を有
する。

【００５０】本発明の方法に従ってルシフェラーゼの存
在をアッセイし得る別のタイプの試料は、ルシフェラー
ゼをコードするＤＮＡ断片に結合されたプロモーターま
たは他の転写調節エレメントによる転写の活性化に応答
して、またはルシフェラーゼをコードするＲＮＡの転写
の結果として、ルシフェラーゼが発現した細胞の抽出物
である。このような細胞においてはルシフェラーゼは、
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼまた
はβ−ガラクトシダーゼのような他の酵素が、転写また
は転写調節のような遺伝事象をモニターするのに使用さ
れるのと同様に使用される。このような甲虫ルシフェラ
ーゼの使用は分子生物学及び生物医学において重要であ
り、例えば、特定のプロモーターまたは他の転写調節エ
レメントにおける転写活性化または転写抑制活性によっ
て、治療作用に対して化合物をスクリーニングすること
に使用され得る。

【００５１】本発明は、別の態様においては、ＡＴＰを
検出する方法を提供する。この方法は、生物発光の生起
にＡＴＰが必要であるという事実から、ルシフェラーゼ
をアッセイする方法からなる本発明の態様から派生した
ものであり、ＡＴＰではなくて甲虫ルシフェラーゼがア
ッセイ反応混合液の必須成分であることだけが、ルシフ
ェラーゼをアッセイする方法とは異なる。アデノシン三
リン酸を含むと推定される試料中の該化合物の存在を検
出する本発明の方法は、（ａ）前記試料のアリコートを
用いて、甲虫ルシフェラーゼ、ルシフェリン、チオール
試薬及び^{Ｍｇ２ ＋}を、全てがルシフェラーゼ−ルシフェ
リン反応におけるルシフェラーゼ活性に有効な濃度で含
む溶液を調製し、（ｂ）ステップ（ａ）で得られた溶液
からの発光を測定することからなる。当業者には容易に
理解されるように、ＡＴＰ濃度が既知の適当な可変基準
と、ＡＴＰ濃度が未知の試料とを用いて本発明の方法を
実施することにより、該方法は、未知濃度の試料中のＡ
ＴＰ濃度を決定するように適合し得る。分析されている
試料中のＡＴＰは、種々の生化学的事象または反応、例
えば血小板凝集によって上昇し得る。従って本発明のＡ
ＴＰをアッセイする方法は、ＡＴＰを生成する事象また
は反応をモニターすることにも使用し得る。

【００５２】好ましくは、本発明の方法（及び組成物）
においては、使用するルシフェラーゼは合成によって製
造し、ＣｏＡ及びＣｏＡ以外のチオール試薬の両方を使
用または存在させ、溶液である本発明の組成物において
は、ＣｏＡは約０．１ｍＭ〜約１．０ｍＭの濃度で存在
させ、ＣｏＡ以外のチオール試薬は約２０ｍＭ〜１００
ｍＭの濃度で存在させる。

【００５３】本発明は、更に別の態様において、ルシフ
ェラーゼ−ルシフェリン反応を触媒し得る甲虫ルシフェ
ラーゼ、ＣｏＡ及びＣｏＡ以外のチオール試薬を含む組
成物を提供する。かかる組成物は好ましくは水溶液であ
るが、例えば凍結乾燥成分混合物とすることもできる。
“ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応を触媒し得る”な
る表現は、組成物中の酵素がそのままで反応を触媒でき
るか、または、酵素が反応を触媒することにおいて活性
となるように組成物を再構成、溶解、またはその他化学
的もしくは物理的に処理し得ることを意味する。酵素が
不可逆的に失活または阻害されるならば、それは、“ル
シフェラーゼ−ルシフェリン反応を触媒し得る”とは言
えない。本発明の組成物は、ルシフェラーゼ−ルシフェ
リン反応における光生成速度を著しく改善し、本発明の
アッセイに、本発明の試験キットに、本発明のアッセイ
及び試験キットにおける基準に、並びに、本発明のアッ
セイ混合液及び試験キットと混合液及びキットに使用す
るための基準を調製することに使用される。本明細書中
に詳細に記載したように、本発明の組成物は、上述のご
とき作用する能力のある甲虫ルシフェラーゼ、ＣｏＡ、
及びＣｏＡ以外のチオール試薬の３種の必須成分のほか
に多数の他の成分を含むことができる。

【００５４】本発明は更に、本発明のアッセイ法を実施
するための試験キットをも提供する。かかるキットは、
通常はアッセイに使用するのを容易にするよう都合良く
パッケージされている１つ以上の容器内に、本発明のア
ッセイを実施するのに必須の種々の成分を所定量で含
む。即ち、ルシフェラーゼをアッセイするためのキット
内には、反応に不可欠であることがよく知られているマ
グネシウムイオン、ＡＴＰ及びルシフェリンに加えて、
チオール試薬をも含む、“ルシフェラーゼ−ルシフェリ
ン反応組成物”と称される組成物が含まれる。かかる組
成物は、ＣｏＡと、ＣｏＡ以外のチオール試薬、例えば
ＤＴＴとの両方を含むのが好ましく、例えばタンパク質
性ルシフェラーゼ活性エンハンサー（例えばウシ血清ア
ルブミン）、ＥＤＴＡもしくはＣＤＴＡ、リン酸塩もし
くは２−アミノエタノール（下記参照）のような他の成
分、または、甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応が
適当な速度で進行するｐＨ及びイオン強度の溶液を与え
るための緩衝液を含み得る。キット内のルシフェリンは
合成によって製造されているのが好ましい。既に述べた
ように、種々の成分は例えば、溶液または凍結乾燥混合
物で組合されていてもよいし、単一容器内またはそれぞ
れを含む複数容器内で組合されてもよい。ルシフェラー
ゼが発現される細胞中のルシフェラーゼをアッセイする
ための好ましいキットには、細胞は溶解するが、活性形
態または活性になり得る形態で細胞中に存在し得るルシ
フェラーゼを（溶解の際に放出される種々の酵素の作用
に対して）保存するのに有効な溶液（または溶液を調製
するための成分）も含まれる。

【００５５】ＡＴＰをアッセイするための試験キット
は、ルシフェラーゼをアッセイするためのものと類似で
あるが、但し、かかるキットはＡＴＰの代わりに甲虫ル
シフェラーゼを含む。

【００５６】本発明の試験キットは更に、当業者には良
く知られているように、該キットを使用して実施される
アッセイの信頼性及び精度を保証するため、及びキット
の被分析物質（例えばルシフェラーゼ、ＡＴＰ）に対し
て試料を定量分析し得るように、種々の対照及び基準、
即ちルシフェラーゼまたはＡＴＰを含まないもの（負の
対照）含むルシフェラーゼまたはＡＴＰ濃度が既知の溶
液を含むことができる。

【００５７】本発明は、別の態様においては、甲虫ルシ
フェラーゼ−ルシフェリン反応において生成される光を
測定することからなる、試料中の物質（例えばＡＴＰ、
ＡＴＰを生成する結果となる物質、ルシフェラーゼ）の
存在をアッセイする方法の改良を含む。改良は、ルシフ
ェラーゼ−ルシフェリン反応をＣｏＡの存在下に、該反
応において生成される光のピーク強度を少量だけ（例え
ばかかる条件の不在下でのピーク強度に対して約３％〜
約３０％）低下させる条件下に実施することからなる。
本発明のこの態様は、ＣｏＡの存在下でルシフェラーゼ
−ルシフェリン反応が進行する条件を反応による光生成
のピーク強度が少量だけ低下するように変更すると、反
応において放出される全光量（即ち強度対時間の曲線を
積分することにより測定される量）が増大する結果とな
るという新規知見に基づいている。これは、反応におい
て生成された光についての強度対時間の曲線を平坦化
し、それによって全光出力をより単純に且つより正確に
測定し得るという利点がある。勿論、同じ条件を各系に
適用してもピーク強度を低下するのに使用される条件が
種々の程度に変更されるが故にピーク強度が種々の程度
に低下されることを除いては同じ一連の反応系におい
て、条件が適用されず従ってピーク強度が低下されなか
った系からの全出力と比較して、（強度対時間の曲線を
反応開始から積分することにより測定される）全光出力
の増加が実現されるには、ピーク強度がより大きく低下
したならばルシフェラーゼ−ルシフェリン反応はより長
い時間進行する必要がある〔例えば図８参照〕。種々の
条件を変更してピーク強度を少し低下させることができ
る。例えば反応のｐＨ、イオン強度または温度を、当業
者には容易に確定され、また関与する特定の甲虫ルシフ
ェラーゼに幾分従う方法で、ピーク強度が低下するよう
に変更することができる。また、ルシフェラーゼの阻害
物質である種々の物質を、ルシフェラーゼ−ルシフェリ
ン反応が行われる溶液中に、適当な濃度で含めることも
できる。このような物質としては、約１０ｍＭ〜約１０
０ｍＭの濃度の２−アミノエタノール、約５ｍＭ〜約６
０ｍＭの濃度のリン酸塩を挙げることができる〔図７及
び図８参照〕。この改良は本発明の新規の方法にも適用
され、例えば３６ｍＭ ２−アミノエタノールまたは２
５ｍＭリン酸塩を、ＣｏＡだけでなく、ＣｏＡ以外のチ
オール試薬をも存在するルシフェラーゼ−ルシフェリン
反応混合液中に含めることができる。

【００５８】本発明の基礎をなすと考えられる機構は完
全には理解されていないが、本明細書においてかかる機
構に言及したことが本発明の範囲を制限すると解釈され
るべきではない。

【００５９】ＣｏＡは、ルシフェラーゼ−ルシフェリン
反応を触媒する際に酵素及び電気的に励起されたオキシ
ルシフェリンと相互作用し、この相互反応の１つの結果
として、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応の過程で酵
素の生産物阻害を低下させる（本明細書中“酸化ルシフ
ェリン（ｏｘｉｄｉｚｅｄ ｌｕｃｉｆｅｌｉｎ）”と
も称するオキシルシフェリンは、ルシフェリンのチアゾ
リン環の４位置に水素及びカルボキシレートの代わりに
酸素を有することでルシフェリンとは異なる）。従って
本発明の１つの態様は、ＣｏＡ、甲虫ルシフェラーゼ、
及び酵素上で励起状態にあるオキシルシフェリンの結合
体である。

【００６０】ＣｏＡ−甲虫ルシフェラーゼ−励起オキシ
ルシフェリン結合体の存在はこれまで認識されていなか
った。かかる結合体は、ルシフェラーゼ−ルシフェリン
反応において生物発光が生起されるｉｎ ｖｉｔｒｏ
（例えばアッセイに使用されているルシフェラーゼ溶液
中）及び甲虫の発光器官細胞中を含む、ＣｏＡ、ルシフ
ェリン、ＡＴＰ、酸素及び酵素的活性形態の甲虫ルシフ
ェラーゼが共在する任意の溶液中に存在する。本発明に
おいては、結合体が実際に存在する環境の外、即ち甲虫
においてルシフェラーゼが天然に存在する細胞の外にあ
る甲虫ルシフェラーゼのみの、ＣｏＡ−酵素−励起オキ
シルシフェリン結合体を特許請求する。甲虫ルシフェラ
ーゼは、ＣｏＡ及びルシフェリンのチオエステル、ルシ
フェリル−ＣｏＡの形成を触媒する。この化合物の存在
もこれまでに認識されていない。従ってこのチオエステ
ルは本発明の別の態様である。

【００６１】ＣｏＡ−甲虫ルシフェラーゼ−励起オキシ
ルシフェリン結合体と同様に、ルシフェリル−ＣｏＡ
は、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応において生物発
光が生起されるｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えばアッセイに使
用されているルシフェラーゼ溶液中）及び甲虫の発光器
官細胞中を含む、ルシフェリン、ＡＴＰ、ＣｏＡ及び酵
素的活性形態の甲虫ルシフェラーゼが共在する任意の溶
液中に存在する。本発明においては、化合物が実際に存
在する環境の外、即ちルシフェラーゼが天然に存在する
細胞の外にあるルシフェリル−ＣｏＡのみを特許請求す
る。ルシフェリル−ＣｏＡは、甲虫ルシフェラーゼ−ル
シフェリン反応における光生成速度に及ぼすＣｏＡの有
益な効果を仲介することにおいて重要な化合物である。
チオエステルの形成は、ＣｏＡの存在下での、ルシフェ
ラーゼ−ルシフェリン反応における生産物阻害の低下に
関与する。

【００６２】ルシフェリル−ＣｏＡが生成された後のそ
の行末は明らかではないが、チオエステルは酵素に結合
したままであること、甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリ
ン反応を触媒する過程でチオエステルからＣｏＡが再生
されることが考えられる。

【００６３】還元剤として機能する遊離チオール基を有
するチオール試薬、即ちＤＴＴまたはβ−ＭＥなどの物
質は、甲虫ルシフェラーゼと、または酵素による触媒反
応生成物と何等かの方法で相互作用する一方で、発光生
起を触媒する。ルシフェラーゼに及ぼすこれらの試薬の
作用は、触媒反応の間のこの相互作用によって、ＣｏＡ
の作用が飽和する濃度の約１０倍〜約１００倍の濃度で
飽和するようである。触媒反応の間のチオール試薬と酵
素または酵素による触媒反応生成物との相互作用によっ
て、試薬は、チオール試薬の不在下で失活が生じるであ
ろう速度より酵素の失活を遅らせる。

【００６４】ＣｏＡは、上記役割に関係する特定の結合
部位を有する酵素の基質でもあり、関係酵素活性安定化
特性を有するチオール試薬でもある。ＣｏＡを用いる
と、恐らくはルシフェラーゼ−ルシフェリン反応の際の
生産物阻害の速度を減速することに関係して反応の間に
生じる酵素失活速度をＣｏＡが増大するので、状況はよ
り複雑となり得る。触媒反応の間にＣｏＡ基質結合部位
を飽和するのに必要とされるより過剰な濃度のＣｏＡ
は、他のチオール試薬と同様に、失活速度を減速する。

【００６５】甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応速
度に及ぼすＣｏＡの作用は、基質によって酵素に結合す
る飽和に典型的な範囲である約０．１ｍＭ〜約１ｍＭの
比較的低いＣｏＡ濃度で飽和する。

【００６６】甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応の
速度に及ぼすＣｏＡ以外のチオール試薬の作用は従来技
術によって示されていない。作用は、タンパク質を製造
及び貯蔵の間の失活から保護するために当分野において
示されている１ｍＭ〜５ｍＭよりはるかに高く、またか
かる速度に及ぼすＣｏＡの作用が飽和する０．１ｍＭ〜
１ｍＭよりもずっと高い、約３０ｍＭ〜約８０ｍＭで飽
和する。チオール試薬の安定化作用は、従来技術によっ
て示されているような通常の、単に酵素を酸化から保護
することによるものではない。５ｍＭ以上でチオール試
薬は、生物発光触媒反応のないところでは、安定化が単
に酵素上の基を酸化から普通に保護することによるもの
であるならば該試薬が持つであろうような安定化作用は
酵素に及ぼさないが、かかる触媒反応が進行している間
は酵素を安定化する。

【００６７】従って本発明は、ルシフェラーゼ−ルシフ
ェリン反応において、生産物阻害の低下またはルシフェ
ラーゼ失活の低下の結果として光生成速度が改善される
ルシフェラーゼ組成物を提供する。１つのこのような組
成物は、甲虫ルシフェラーゼ、約０．１ｍＭ〜１．０ｍ
ＭのＣｏＡ、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭのＣｏＡ以外の
チオール試薬を含む水溶液である。組成物は、約０．１
ｍＭ〜１．０ｍＭのＡＴＰ；約０．１ｍＭ〜１．０ｍＭ
のルシフェリン；約２ｍＭ〜約１５ｍＭのＭｇ＋２イオ
ン；ピーク強度を最高約３０％だけ低下させるのに有効
な濃度のホスフェートイオン、２−アミノエタノールま
たは他のピーク強度低下用化合物；溶液のｐＨ及びイオ
ン強度を、甲虫ルシフェラーゼがルシフェラーゼ−ルシ
フェリン反応において活性である範囲に維持するため
の、トリシン、ＨＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、Ｔ
ｒｉｓ、グリシルグリシン、リン酸塩などの緩衝液；約
１０μｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの、哺乳動物血清アルブ
ミンまたはラクトアルブミンまたはオボアルブミン、好
ましくはウシ血清アルブミンのようなタンパク質性ルシ
フェラーゼ活性エンハンサー；約０．１ｍＭ〜約１ｍＭ
のＥＤＴＡまたはＣＤＴＡのような他の物質を含むこと
もできる。本発明の組成物におけるルシフェリンは合成
であるのが好ましい。

【００６８】更に別の態様においては本発明は、化合物
を含むと考えられる試料中のＡＴＰを検出する方法及び
試験キットを提供する。本発明の方法及びキットは、甲
虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応による生物発光に
依存しており、本発明に従って、かかる反応による光生
成速度が改善される組成物を使用する。

【００６９】その中にルシフェリンが存在する水溶液で
ある本発明の組成物、即ち本発明の方法に使用される組
成物中には、ルシフェリンが典型的には約０．１ｍＭ〜
約１ｍＭ、好ましくは約１ｍＭの濃度で存在する。同様
に、ＡＴＰが存在するかかる組成物中のＡＴＰ濃度は、
約０．１ｍＭ〜約５ｍＭ、好ましくは約０．５ｍＭであ
る。水溶液である本発明のかかる組成物、即ち本発明に
使用されるかかる組成物中にＣｏＡが存在する場合は、
ＣｏＡ濃度は約０．００１ｍＭ〜約１ｍＭ、好ましくは
約１ｍＭである。同様に、存在するＤＴＴ濃度は約２０
ｍＭ〜約２００ｍＭ、好ましくは約３０〜４０ｍＭであ
り、ＢＳＡ濃度は約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍ
ｌ、好ましくは約１ｍｇ／ｍｌである。

【００７０】ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の発光
は、市販のルミノメーター、シンチレーションカウンタ
ー、光増幅器、光度計またはフォトエマルジョンフィル
ム（ｐｈｏｔｏｅｍｕｌｓｉｏｎ ｆｉｌｍ）を使用し
て測定することができる。

【００７１】反応溶液中で本発明のルシフェラーゼ−ル
シフェリン反応を開始するためには、（通常は２種類
の）溶液を単純に混合するか、または一方の溶液を他方
の溶液中に注入して２つの溶液を迅速に混合することに
より、反応溶液を調製することができる。本発明に従っ
てチオール試薬を使用すると、迅速な混合（注入）方式
の必要性がほとんどの場合に回避される。

【００７２】通常のルシフェラーゼアッセイによる光生
成を、本発明のアッセイ方法と比較するように計画され
た種々の実験によって、本発明の方法を試験した。

【００７３】また、光生成に及ぼすＣｏＡの作用を、そ
れが不在の場合の光生成と比較した。混合前に、この補
因子を酵素に加えた。かかる試験においては、２５ｍＭ
トリシン、７ｍＭ Ｍｇ^２＋及び１ｍＭ ＥＤＴＡか
らなる緩衝液中の３ｍＭ ＣｏＡを含むまたは含まな
い、３ｍＭ ルシフェリン及び３ｍＭ ＡＴＰを含む溶
液１００μｌを、ルシフェリン溶液について上記したの
と同じ緩衝液中に０．８Ｎｍ ルシフェラーゼを含む溶
液２００μｌ中に注入した。図１は、ＣｏＡの存在する
場合及びしない場合のルシフェラーゼの発光を示してい
る。反応によって放出された全光量は、無限時間まで外
挿した指数関数的減衰強度を積分することにより推定し
た。かかるデータは、アッセイ混合液にＣｏＡを加える
とより大きい初期光強度を与え、初期減衰速度はより小
さく、全発光量は２倍以上に増大することを示してい
る。特に合成ルシフェリンを使用したことから見て、こ
のようなデータは予想外であった。

【００７４】スルフヒドリル基を有する他の試薬の作用
を試験した。図２は、３３．３ｍＭＤＴＴがアッセイ混
合液中に存在する場合の発光曲線を示す。この試験にお
いては、ＣｏＡを用いた実験について上述したのと同じ
緩衝液中に３ｍＭ ルシフェリン、３ｍＭ ＡＴＰ及び
１００ｍＭ ＤＴＴを含む溶液１００μｌを、同じ緩衝
液中に０．８ｎＭ ルシフェラーゼを含む溶液２００μ
ｌ中に注入した。曲線ははるかに高い“定常状態”を示
しおり、全光生成はＤＴＴが存在しない場合の６．３倍
に増大した。酵素を用いてＤＴＴをプレインキュベーシ
ョンした場合も試験した。アッセイ前に１０ｍＭのＤＴ
Ｔを酵素に加えても、光生成に有意な増加はなかった。
他のチオール試薬を用いた結果もＤＴＴに見られたもの
と同様であった。

【００７５】更に、従来技術において広く報告されてい
るチオールの保護作用と比較したＤＴＴの作用モードを
テストする試験を実施した。かかる試験においては、２
０ｍＭ トリシン（ｐＨ７．８）、８ｍＭ Ｍｇ^２＋、
０．１３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５３ｍＭ ＡＴＰ及び
０．２７ｍＭ ＣｏＡを含み、更に、一方の溶液は５ｍ
Ｍ ＤＴＴを含むが他方は４０ｍＭ ＤＴＴを含む２種
類の溶液をそれぞれ１０００μｌずつ調製した。同量の
ルシフェラーゼアリコートをそれぞれに加えた。種々の
時点で、２００μｌの溶液を取り出し、ルシフェリンを
濃度０．４７ｍＭまで加えて酵素活性を生起させた。ル
シフェラーゼ溶液の条件は、ルシフェリンが存在しない
ので触媒反応が進行できないことを除いては、反応条件
と同じである。光出力を１０分間測定した。結果を図３
ａ及び図３ｂに示す。これらの結果から２つの結論を引
き出すことができる。第一に、酵素活性の安定性は触媒
反応の間はずっと低下し、第二に、ＤＴＴ濃度が５ｍＭ
以上に増加しても触媒反応の不在下ではルシフェラーゼ
の安定性を増大しないが、触媒反応の間の安定性が増大
される。ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応を触媒しな
いとき及び該反応を触媒するときで、ＤＴＴは酵素に異
なるモードで作用するらしい。

【００７６】他の添加物の作用をテストする試験も実施
した。例えば、ＢＳＡは光強度を約２０％増大したが、
減衰速度は変えなかった。非イオン性界面活性剤、Ｔｒ
ｉｔｏｎ Ｘ−１００を加えた場合は初期光強度の増大
が認められたが、減衰速度も増大した。他の非イオン性
界面活性剤は酵素活性にわずかな作用しか示さなかっ
た。

【００７７】図４は、ＣｏＡ、ＤＴＴ及びＢＳＡが混在
したアッセイ、ＣｏＡが単独で存在したアッセイ、何も
加えていない通常のアッセイにおける発光曲線を示す。
ＣｏＡ、ＤＴＴ及びＢＳＡの併用効果は、何も添加しな
い場合の１５倍以上大きい全光生成量をもたらした。

【００７８】本発明の方法の驚くべき結果は、チオール
試薬及び酵素安定化剤の不在下の発光と比較して、１０
分間の全発光が１５〜１７倍に増大し得ることである。
上記物質の併用効果は、ルシフェラーゼのリポーターと
しての有用性を増大している。優れた光生成によって、
所定の生物特異反応における生産物または事象を検出す
る高度に感受性で迅速な方法が可能となる。

【００７９】以下の実施例によって本発明を更に説明す
る。これらの実施例は本発明の範囲を制限するものでは
ない。

【００８０】実施例１ 外来宿主中のルシフェラーゼ合成を検出するための、溶
解剤及びアッセイ試薬からなるキットを製造した。溶解
剤は、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−リン酸塩（ｐＨ７．８）、
１０％グリセロール（エチレングリコールで置換し得
る）、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００［商標；Ｒｏｈ
ｍ ＆ Ｈａａｓ Ｃｏｒｐ．製．１分子当たり９〜１
０個の平均エチレニルオキシ（−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−）ユ
ニット数を有するオクトキシノール混合物である非イオ
ン洗剤］、１ｍｇ／ｍｌウシ胎児血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）、２ｍＭ ＣＤＴＡ（シクロヘキシレンジアミン四
酢酸塩）及び２ｍＭ ＤＴＴからなっていた。アッセイ
試薬は、２０ｍＭトリシン（Ｎ−トリス（ヒドロキシメ
チル）メチルグリシン）緩衝液（ｐＨ ７．８）、３
３．３ｍＭ ＤＴＴ、８ｍＭ Ｍｇ^＋２、０．１３ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．５３ｍＭ ＡＴＰ、０．４７ｍＭ ル
シフェリン及び０．２７ｍＭ ＣｏＡからなっていた。

【００８１】細胞質抽出物を、プラスミドｐＲＳＶＬを
含むＮＩＨ ３Ｔ３細胞、Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓホタルル
シフェラーゼをコードするｃＤＮＡを含むプラスミドか
ら、ラウス肉腫ウイルスゲノムに対応するプロウイルス
ＤＮＡの５’−ＬＴＲの転写制御下で誘導した。細胞を
１００ｍｍペトリ皿の約１／３に生長させた。次いで細
胞を当業界で公知の標準リン酸カルシウム法を使用して
１０μｇプラスミドＤＮＡで形質転換させ、さらに４８
時間生長させた。

【００８２】培養した細胞に溶解剤１ｍｌを添加して室
温で２〜５分溶解した。溶解後、細胞破片を簡単に遠心
分離（約１０秒）して除去し、ルシフェラーゼ活性に関
して上清（即ち、細胞質抽出物溶液）を試験した。

【００８３】細胞質抽出物：アッセイ試薬約１：５〜
１：２５の割合でアッセイ試薬と細胞質抽出物を混合
し、酵素活性を試験した。混合する際に注入法は使用し
なかった。

【００８４】本発明のアッセイの細胞抽出物−ルシフェ
リン反応の発光を、ルシフェラーゼ活性に関する通常の
アッセイと比較した。本発明のアッセイは注入方法が必
要ないが、通常の従来のアッセイで必要な混合用に注入
−型フォーマットを使用して比較を実施した。これらの
比較では、２０ｍＭ トリシン、８ｍＭ Ｍｇ^＋２、
０．１３ｍＭ ＥＤＴＡの緩衝液（ｐＨ ７．８）中、
０．８ｍＭ ＣｏＡ、１．４ｍＭ ルシフェリン、１．
５ｍＭ ＡＴＰ及び９０ｍＭ ＤＴＴを含む溶液１００
μｌを、２０μｌ細胞質抽出物と２００μｌ緩衝液（２
０ｍＭトリシン、０．８ｍＭ Ｍｇ^＋２、０．１３ｍＭ
ＥＤＴＡ；ｐＨ７．８）とを混合することにより作成
した溶液２２０μｌに注入し、次いで発光を標準ルミノ
メーター（例えば、Ｔｕｒｎｅｒモデル２０ルミノメー
ター）を使用して測定した。遺伝学的事象［例えば、転
写（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７，７２５−７３
７：１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４，８５６−８５
９（１９８６））］のリポーターとして使用されるルシ
フェラーゼの最初の報告に記載されているアッセイを適
用する通常の比較アッセイは、２５ｍＭ グリシルグリ
シン、１２ｍＭ Ｍｇ^{＋ ２}の緩衝液（ｐＨ７．８）中
０．６７ｍＭ ルシフェリンを含む溶液１００μｌを、
２０μｌ細胞質抽出物と５．８３ｍＭ ＡＴＰを含む２
００μｌ緩衝液（２５ｍＭ グリシルグリシン、１２ｍ
Ｍ Ｍｇ^＋２，ｐＨ７．８）を混合して作成した溶液２
２０μｌに注入することからなる。

【００８５】図５は、これらの試験結果を示している。
図５のグラフに於いて、発光強度が注入時間からの時間
の関数としてプロットされている。この結果は、０〜６
０秒で強度対時間曲線の積分により出力を決定すると、
本発明のアッセイが従来のアッセイの１０倍の光の出力
（即ち、生起した発光）を出すことを示し、０〜５０分
で強度対時間曲線の積分により出力を決定すると、従来
のアッセイと比較して生起した発光が１７倍増加するこ
とを示している。従来のアッセイと比較して、本発明の
方法のアッセイでの強度に強いピークがないことは、図
５から明らかである。

【００８６】実施例２ １ｍｇ／ｍｌストックルシフェラーゼ溶液を、１０％硫
酸アンモニウム及び１０％グリセロール中の結晶質の純
粋なＰ．ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼから調製した。
反応に使用するルシフェラーゼ溶液を、実施例１に記載
の溶解剤を１００倍に希釈してストック溶液から調製し
た。各希釈液から２０μｌを実施例１に記載のアッセイ
試薬２００μｌに（注入せずに）添加し、発光を測定す
るために標準ルミノメーターにセットした。

【００８７】図６は、種々のサンプルに関してルシフェ
ラーゼ濃度の対数の関数として生起した発光量（６０秒
間の発光強度の積分により決定した）の対数をプロット
したものである。図６の曲線は、ルシフェラーゼ濃度に
関して８オーダーにわたって良好な直線性を示してい
る。このような最低濃度を示す図６のグラフ上のデータ
ポイントのルシフェラーゼ濃度は、従来報告されたルシ
フェラーゼの最高感度のアッセイで検出可能のルシフェ
ラーゼの最低濃度よりも５０倍も低い。従来法のシステ
ムと比較して生起した発光量が多く、光測定装置中のラ
ンダムノイズの作用を平均化させる“平坦”機構によ
り、本発明の方法は高感度となる。

【００８８】この実施例に記載の実験では、ルシフェラ
ーゼの全濃度に於いて光生起機構は殆ど平坦である。
又、各濃度（５レプリカ）に於ける測定の変動係数は、
ルミノメーター中のノイズ由来のシグナルが顕著である
最低濃度以外では、１．５％よりも良い。この精度レベ
ルは、従来法即ち、注入型アッセイで通常報告されるレ
ベルと等しいかまたはそれ以上に良好である。

【００８９】図６の曲線により表された直線性、曲線の
データポイントが測定され得る精度、及び比較的ルシフ
ェラーゼ濃度の高い溶液（約１Ｍ）を使用して実施例４
で報告された実験に基づいて、本発明のアッセイに関す
るルシフェラーゼ濃度の実際の範囲は、起こり得る最低
のバックグラウンドを有する光検出方法が検出し得る最
低濃度（現在、溶液２００μｌ容積中約１０^−１８〜１
０^−１７Ｍ即ち、酵素約２００分子）から約１０μＭま
でに広がる。実際、重要な総てのサンプル中のルシフェ
ラーゼ濃度はこの範囲内に十分入る。

【００９０】実施例３ この実施例に於いては、ＣｏＡの存在下、ルシフェラー
ゼ−ルシフェリン反応由来の全発光に於ける反応由来の
発光のピーク強度を少し減少させる好都合な作用を提供
する。

【００９１】図７は、ＣｏＡを含むルシフェラーゼ−ル
シフェリン混合物中に３６ｍＭのルシフェラーゼインヒ
ビター（２−アミノエタノール）を含むと、発光のピー
ク強度を約１２％減少させ、反応の開始から約３分以上
の発光強度の積分で測定した場合、発光生起量を増加さ
せることを示している。

【００９２】同様に、図８は、ＣｏＡを含むルシフェラ
ーゼ−ルシフェリン反応混合物中にルシフェラーゼイン
ヒビター（リン酸塩）も含むと、発光のピーク強度は
（リン酸塩濃度に依存して）下がるが、リン酸塩イオン
濃度によって異なるが発光強度を時間で積分して決定し
た全発光量は増加する。リン酸塩濃度が高いとピーク強
度はかなり下がり、長時間にわたって強度の積分する
と、全発光量の増加が顕著である。

【００９３】図７及び８のデータは、０．８ｍＭ Ｃｏ
Ａ、 １．４ｍＭ ルシフェリン、１．５ｍＭ ＡＴ
Ｐ， ８ｍＭ Ｍｇ^＋２、 ０．１３ｍＭ ＥＤＴＡ、
５．５ｍＭ ＤＴＴ、 ２０ｍＭ トリシン、さらに
（１）他の化合物なしまたは（２）１１０ｍＭ ２−ア
ミノエタノールまたは（３）１１０ｍＭ エタノールま
たは（４）１１０ｍＭ エタノールと３０ｍＭ，７５ｍ
Ｍ若しくは５０ｍＭリン酸ナトリウムを含む溶液（ｐＨ
７．８）１００μｌを緩衝液（２０ｍＭ トリシン、８
ｍＭＭｇ^＋２、０．１３ｍＭ ＥＤＴＡ；ｐＨ７．８）
２００μｌと細胞質抽出物２０μｌとを混合して製造し
た溶液２２０μｌに注入し、標準ルミノメーターを使用
して発光を測定した以外には、細胞質抽出物中のルシフ
ェラーゼに関する慣用の、従来アッセイと本発明のアッ
セイを比較する実施例１に記載の方法を使用して得た。
図７及び８に記載の如く、３６ｍＭエタノールはＣｏＡ
の存在下のルシフェラーゼ−ルシフェリン反応での発光
の生起には効果がない。

【００９４】実施例４ この実施例に於いては、ＣｏＡの存在下、甲虫ルシフェ
ラーゼ−ルシフェリン反応に於いて、（１）ルシフェリ
ンのカルボキシルとＣｏＡのチオール基の硫黄との間
に、ルシフェリル−ＣｏＡ、即ちチオエステルが形成す
る、及び（２）ＣｏＡと励起状態の酸化ルシフェリンと
ルシフェラーゼの結合体も形成するということが確認で
きる。

【００９５】甲虫ルシフェラーゼのアミノ酸配列と他の
蛋白質のアミノ酸配列とを比較するとこれらは殆ど相同
であり、従って植物酵素、４−クマレート：ＣｏＡリガ
ーゼ及び酵素長鎖アシル−ＣｏＡシンセターゼと共通の
祖先であることが明らかになった。他の２種類の酵素と
ルシフェラーゼを比較するＨｙｄｒｏ−ｐａｔｈｙプロ
ット［Ｋｙｔｅ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．１５７，１０５−１３２（１９８２），各点
毎の１５残基値の平均］では、４−クマレート：ＣｏＡ
リガーゼとの類似は特に顕著であるという類似点を示
す。４−クマレート：ＣｏＡリガーゼ及び長鎖アシル−
ＣｏＡ−シンセターゼの両方は、ＣｏＡとその個々の置
換体のカルボキシル基との間のチオエステル形成を触媒
する。両方の酵素に関して、ＡＴＰは基質と反応してチ
オエステルの形成中にアシル−ＡＭＰ中間体を形成す
る。上記記載の如く、ルシフェラーゼも同様に、ＡＴＰ
とルシフェリンからルシフェリルアデニレートを形成す
る。

【００９６】１９５０年代の研究では、甲虫ルシフェラ
ーゼ−ルシフェリン反応に於ける光生起速度でのＣｏＡ
の作用に関して、酸化できないルシフェリン類似物、即
ちデヒドロルシフェリンはＣｏＡとそのカルボキシル基
を介してチオエステル結合を形成し得たことが示されて
いる。

【００９７】甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応に
於ける光生起速度に影響するＣｏＡの活性は、特にその
チオール基によって仲介されることが知見された。デチ
オＣｏＡは、硫黄原子の無いＣｏＡと同一である。Ｃｏ
ＡでなくデチオＣｏＡをルシフェラーゼ−ルシフェリン
反応混合物に添加すると、反応由来の光生起速度には全
く影響がない。さらにこのようにＣｏＡにより生じた反
応での光生起量の増加は、デチオＣｏＡにより特異的に
阻害される。一定濃度でデチオＣｏＡが存在する場合及
び存在しない場合のＣｏＡ濃度の逆数の関数として光生
起に於ける増加の逆数の逆数プロットに於いて、デチオ
ＣｏＡはＣｏＡの競合インヒビターとして活性を示し
た。従って、デチオＣｏＡ及びＣｏＡはルシフェラーゼ
の同一部位に結合するが、チオール基を欠失しているデ
チオＣｏＡはＣｏＡ様の活性を持たない。

【００９８】逆数プロットを求めるための実験に於い
て、発光アッセイ用の緩衝液は３０ｍＭトリシン、８ｍ
Ｍ 炭酸マグネシウム、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．２ｍＭ
ＥＤＴＡ（ｐＨ７．８）であった。（１０％ 硫酸ア
ンモニウム及び５０％グリセロール中）結晶質Ｐ．ｐｙ
ｒａｌｉｓルシフェラーゼ１０ｍｇ／ｍｌを、１０％
（ｖ／ｖ）グリセロール及び１ｍｇ／ｍｌウシ胎児血清
アルブミンを補った緩衝液で１０，０００倍に希釈し
た。次いで、アッセイ用に、１０μｌ酵素希釈液（酵素
１μｇ／ｍｌ）を２００μｌ緩衝液と混合し、３ｍＭ
ルシフェリン、１．５ｍＭ ＡＴＰ及び種々の濃度のＣ
ｏＡ及びデチオＣｏＡ（３ｍＭ デチオＣｏＡ：０．０
１２ｍＭ，０．０６ｍＭ及び０．３ｍＭ ＣｏＡ；デチ
オＣｏＡなし：０．０１２ｍＭ，０．０６ｍＭ，０．３
ｍＭ ＣｏＡ及び１．０ｍＭ ＣｏＡ）を補った緩衝液
１００μｌを得られた２１０μｌに注入すると発光が開
始する。Ｔｕｒｎｅｒモデル２０ルミノメーターで発光
を測定した。

【００９９】甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応に
より光が生起する溶液中にＣｏＡが存在すると、生起し
た光の色を短波長にシフトすることが知見された。この
光の色は、励起状態の酵素が結合した酸化ルシフェリン
と、基底状態の酵素が結合した酸化ルシフェリンとの間
のエネルギーの差により決定される。短波長へのシフト
は、概して酸化ルシフェリンとルシフェラーゼの結合体
中、エネルギーの差がＣｏＡにより増加されることを意
味する。エネルギーがこのように増加するには、酵素と
励起状態の酸化ルシフェリン及びＣｏＡの結合体が存在
しなければならず、これによりＣｏＡが存在しない場合
の増加に対し、励起状態のオキシルシフェリンと酵素の
結合体のフラクション中でエネルギーが増加し、励起状
態と基底状態のオキシルシフェリンとの間のエネルギー
差がより高くなる。このような結合体中でのＣｏＡの作
用がルシフェラーゼ−オキシルシフェリン結合体の構造
を変えることは、異なるアミノ酸配列のルシフェラーゼ
及びそれゆえ少なくともやや異なる三次元構造（例え
ば、甲虫の異種由来）が、種々の色の生物発光の生起を
触媒する上記記載の観察と一致している。

【０１００】ＣｏＡが甲虫のルシフェラーゼ−ルシフェ
リン反応中に生起した光の波長を減少させるということ
は、Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼに関する以下の
実験で発見された。これらの比較に於いて、第１の溶液
を０．８ｍＭ ＣｏＡ、１．４ｍＭルシフェリン、１．
５ｍＭ ＡＴＰ及び９０ｍＭ ＤＴＴを含む溶液２５０
μｌと、Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ（１０％
硫酸アンモニウム，５０％ グリセロール中１０ｍｇ／
ｍｌ）の溶液０．５μｌと５００μｌ緩衝液（２０ｍＭ
トリシン、８ｍＭ Ｍｇ^＋２、０．１３ｍＭ ＥＤＴ
Ａ：ｐＨ７．８）を混合することにより作成した溶液と
を混合することにより製造した。第２の溶液を、ＣｏＡ
もＤＴＴも使用しない以外には同様にして製造した。第
１及び第２の溶液を、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反
応からの光が生成したら目視で観察した。第１の溶液は
いくらかだがはっきりと、第２の溶液よりも緑がかって
いた。

【０１０１】本発明の範囲から逸脱することなく本発明
を以下説明及び例示するが、当業者には、変化、付加及
び省略を含む種々の変形が考えられ得よう。従って、こ
れらの変形は本発明に包含され、本発明の範囲は付記請
求項によってのみ限定され得る。

【図面の簡単な説明】

【図１】補酵素Ａの存在下及び不在下での甲虫ルシフェ
ラーゼ活性による発光を比較したグラフである。

【図２】ジチオトレイトールの存在下及び不在下での甲
虫ルシフェラーゼ活性による発光を比較したグラフであ
る。

【図３ａ】甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応によ
る光生成の触媒の不在下及び触媒中の、甲虫ルシフェラ
ーゼ安定性に及ぼすジチオトレイトール濃度の変化の影
響を示すグラフである。

【図３ｂ】甲虫ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応によ
る光生成の触媒の不在下及び触媒中の、甲虫ルシフェラ
ーゼ安定性に及ぼすジチオトレイトール濃度の変化の影
響を示すグラフである。

【図４】補酵素Ａ、ジチオトレイトール及びウシ血清ア
ルブミンの存在下での甲虫ルシフェラーゼ活性による発
光を、補酵素Ａ、ジチオトレイトール及びウシ血清アル
ブミンの不在下での同活性による発光と比較したグラフ
である。

【図５】酵素をコードするｃＤＮＡの発現によりルシフ
ェラーゼが産生された培養哺乳動物細胞由来の抽出物に
おける甲虫ルシフェラーゼ活性による発光を、本発明の
アッセイと慣用の従来技術のアッセイとにおいて比較し
たグラフである。

【図６】（１）甲虫ルシフェラーゼ濃度の対数値と、本
発明に従って実施したアッセイにおける甲虫ルシフェラ
ーゼ−ルシフェリン反応において生成された光の対数値
との一次相関と、（２）甲虫ルシフェラーゼを検出する
アッセイの感度とを示すグラフである。

【図７】ＣｏＡの存在下に実施した甲虫ルシフェラーゼ
−ルシフェリン反応による光生成に、３６ｍＭ ２−ア
ミノエタノールは影響するが３６ｍＭ エタノールは影
響しないことを示すグラフである。

【図８】ＣｏＡの存在下に実施した甲虫ルシフェラーゼ
−ルシフェリン反応による光生成に及ぼす種々のリン酸
塩濃度の影響を示すグラフである。グラフ中、リン酸濃
度が増加するにつれてピーク強度は低下している。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アデノシン三リン酸を含んでいると思わ
   れるサンプル中のアデノシン三リン酸を検出する方法で
   あって、（ａ）該サンプルと、ルシフェリン−ルシフェ
   ラーゼ反応において有効な活性を示すために十分な濃度
   の甲虫ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びマグネシウム
   イオン、更に５ｍＭから２００ｍＭの濃度の補酵素Ａ以
   外のチオール試薬を含む水溶液とを混和する工程；
   （ｂ）得られた混合液からの発光を測定する工程；から
   成る検出方法。
2. 【請求項２】 得られた混合液が更に補酵素Ａを含む、
   請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 補酵素Ａが０．１ｍＭ〜１．０ｍＭの濃
   度範囲で存在する、請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】 以下の成分を含む、ルシフェラーゼ−ル
   シフェリン反応を触媒し得る分析試薬； （ａ）甲虫ルシフェリン、（ｂ）マグネシウムイオン、
   （ｃ）ルシフェリン、及び（ｄ）５ｍＭから２００ｍＭ
   の濃度の補酵素Ａ以外のチオール試薬。
5. 【請求項５】 更に補酵素Ａを含む、請求項４に記載の
   分析試薬。
6. 【請求項６】 補酵素Ａが０．１ｍＭ〜１．０ｍＭの濃
   度範囲で存在する、請求項５に記載の分析試薬。
7. 【請求項７】 一種類以上の溶液として存在する反応組
   成物を含み、該反応組成物は甲虫ルシフェラーゼ、５ｍ
   Ｍから２００ｍＭの濃度の補酵素Ａ以外のチオール試
   薬、ルシフェリン及びマグネシウムイオンを含む、アデ
   ノシン三リン酸を含んでいると思われるサンプル中のア
   デノシン三リン酸を検出するための検査キット。
8. 【請求項８】 反応組成物が更に補酵素Ａを含む、請求
   項７に記載の試薬キット。
9. 【請求項９】 補酵素Ａが０．１ｍＭ〜１．０ｍＭの濃
   度範囲で存在する、請求項８に記載の試薬キット。