RU2744869C2 - Метод и реактивы для детекции активности люциферазы - Google Patents
Метод и реактивы для детекции активности люциферазы Download PDFInfo
- Publication number
- RU2744869C2 RU2744869C2 RU2019125190A RU2019125190A RU2744869C2 RU 2744869 C2 RU2744869 C2 RU 2744869C2 RU 2019125190 A RU2019125190 A RU 2019125190A RU 2019125190 A RU2019125190 A RU 2019125190A RU 2744869 C2 RU2744869 C2 RU 2744869C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- luciferase
- thieno
- hydroxy
- thiochromene
- sulfoxy
- Prior art date
Links
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 title claims abstract description 104
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 title claims abstract description 92
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 49
- 230000000694 effects Effects 0.000 title abstract description 23
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title abstract description 14
- 241001533497 Odontosyllis Species 0.000 claims abstract description 53
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims abstract description 51
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 34
- FWAOHXQIZAWOLN-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxy-5-sulfooxy-7H-thieno[3,2-f]thiochromene-1,7,8-tricarboxylic acid Chemical compound OC1=C2C(=C3C=C(C(SC3=C1OS(=O)(=O)O)C(=O)O)C(=O)O)C(=CS2)C(=O)O FWAOHXQIZAWOLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 26
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 23
- DIEWNOYSZLEIHB-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxy-7-oxalo-5-sulfooxy-9H-thieno[3,2-f]thiochromene-1,8-dicarboxylic acid Chemical compound C(=O)(O)C(=O)C=1SC2=C(C(=C3C(=C2CC=1C(=O)O)C(=CS3)C(=O)O)O)OS(=O)(=O)O DIEWNOYSZLEIHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims abstract description 4
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 74
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 74
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 74
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 claims description 73
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 claims description 25
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 claims description 25
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 21
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- SBYDDAARIAFFBN-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxy-7-oxalo-5-sulfooxy-7H-thieno[3,2-f]thiochromene-1,8-dicarboxylic acid Chemical compound C(=O)(O)C(=O)C1SC2=C(C(=C3C(=C2C=C1C(=O)O)C(=CS3)C(=O)O)O)OS(=O)(=O)O SBYDDAARIAFFBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 11
- JAVNXDQGYAWDJT-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxy-5-sulfooxy-9H-thieno[3,2-f]thiochromene-1,7,8-tricarboxylic acid Chemical compound OC1=C2C(=C3CC(=C(SC3=C1OS(=O)(=O)O)C(=O)O)C(=O)O)C(=CS2)C(=O)O JAVNXDQGYAWDJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 8
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 abstract description 3
- 238000003255 drug test Methods 0.000 abstract description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 24
- LIYGYAHYXQDGEP-UHFFFAOYSA-N firefly oxyluciferin Natural products Oc1csc(n1)-c1nc2ccc(O)cc2s1 LIYGYAHYXQDGEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- JJVOROULKOMTKG-UHFFFAOYSA-N oxidized Photinus luciferin Chemical compound S1C2=CC(O)=CC=C2N=C1C1=NC(=O)CS1 JJVOROULKOMTKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 18
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 15
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 15
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 14
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 13
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 13
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 12
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 12
- 239000000463 material Substances 0.000 description 11
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 9
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 8
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 7
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 6
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 6
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 5
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 5
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- -1 4-hydroxy-5- (sulfoxy) -7H-thieno [3,2-f] thiochromene-1,7,8-tricarboxylic acid compound Chemical class 0.000 description 3
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 108010047357 Luminescent Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000006830 Luminescent Proteins Human genes 0.000 description 3
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 241000243820 Polychaeta Species 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 3
- 238000003390 bioluminescence detection Methods 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 3
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 3
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- HBZBAMXERPYTFS-SECBINFHSA-N (4S)-2-(6,7-dihydro-5H-pyrrolo[3,2-f][1,3]benzothiazol-2-yl)-4,5-dihydro-1,3-thiazole-4-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(=N1)c1nc2cc3CCNc3cc2s1 HBZBAMXERPYTFS-SECBINFHSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UWTATZPHSA-N D-Cysteine Chemical compound SC[C@@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- 229930195710 D‐cysteine Natural products 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 125000002619 bicyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 2
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 150000001793 charged compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000002414 normal-phase solid-phase extraction Methods 0.000 description 2
- 125000003431 oxalo group Chemical group 0.000 description 2
- WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N phenylacetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC=C1 WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010089402 phialidin Proteins 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000002371 ultraviolet--visible spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 108010000239 Aequorin Proteins 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- PKKNOHGNPVHZJC-UHFFFAOYSA-N COC(=O)C=1C2=C(SC=1)C(=C(C=C2)OC)OC Chemical compound COC(=O)C=1C2=C(SC=1)C(=C(C=C2)OC)OC PKKNOHGNPVHZJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 1
- 241000700108 Ctenophora <comb jellyfish phylum> Species 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- JIGUQPWFLRLWPJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acrylate Chemical compound CCOC(=O)C=C JIGUQPWFLRLWPJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Malonic acid Chemical compound OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710128071 Mitrocomin Proteins 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 238000006069 Suzuki reaction reaction Methods 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 238000007239 Wittig reaction Methods 0.000 description 1
- 241000269370 Xenopus <genus> Species 0.000 description 1
- INULNSAIIZKOQE-YOSAUDMPSA-N [(3r,4ar,10ar)-6-methoxy-1-methyl-3,4,4a,5,10,10a-hexahydro-2h-benzo[g]quinolin-3-yl]-[4-(4-nitrophenyl)piperazin-1-yl]methanone Chemical compound O=C([C@@H]1C[C@H]2[C@H](N(C1)C)CC=1C=CC=C(C=1C2)OC)N(CC1)CCN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 INULNSAIIZKOQE-YOSAUDMPSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000031709 bromination Effects 0.000 description 1
- 238000005893 bromination reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001460 carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000012219 cassette mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- XMPZTFVPEKAKFH-UHFFFAOYSA-P ceric ammonium nitrate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[Ce+4].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O XMPZTFVPEKAKFH-UHFFFAOYSA-P 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 238000006880 cross-coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- VUEPDBBXOWKBHS-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-dimethoxyphosphoryl-3-sulfanylbutanedioate Chemical compound COC(=O)C(C(C(=O)OC)S)P(=O)(OC)OC VUEPDBBXOWKBHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019439 ethyl acetate Nutrition 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010093301 halistaurin Proteins 0.000 description 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000000504 luminescence detection Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- OOQLUBMPIQPJFO-UHFFFAOYSA-N methyl 4-formyl-6,7-dimethoxy-1-benzothiophene-3-carboxylate Chemical compound COC(=O)C1=CSC2=C1C(C=O)=CC(=C2OC)OC OOQLUBMPIQPJFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IMAKHNTVDGLIRY-UHFFFAOYSA-N methyl prop-2-ynoate Chemical compound COC(=O)C#C IMAKHNTVDGLIRY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 230000004118 muscle contraction Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010089433 obelin Proteins 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000005895 oxidative decarboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- PNJWIWWMYCMZRO-UHFFFAOYSA-N pent‐4‐en‐2‐one Natural products CC(=O)CC=C PNJWIWWMYCMZRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229960003424 phenylacetic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000003279 phenylacetic acid Substances 0.000 description 1
- 125000005642 phosphothioate group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 229940124272 protein stabilizer Drugs 0.000 description 1
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000002804 saturated mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 125000000542 sulfonic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- FBWNMEQMRUMQSO-UHFFFAOYSA-N tergitol NP-9 Chemical compound CCCCCCCCCC1=CC=C(OCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO)C=C1 FBWNMEQMRUMQSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- IBBLKSWSCDAPIF-UHFFFAOYSA-N thiopyran Chemical compound S1C=CC=C=C1 IBBLKSWSCDAPIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003809 water extraction Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0013—Luminescence
- A61K49/0017—Fluorescence in vivo
- A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
- A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D333/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom
- C07D333/50—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings or ring systems
- C07D333/76—Dibenzothiophenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D335/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom
- C07D335/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings or ring systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D495/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
- C07D495/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains two hetero rings
- C07D495/04—Ortho-condensed systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
- C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
- C12Y113/12—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13) with incorporation of one atom of oxygen (internal monooxygenases or internal mixed function oxidases)(1.13.12)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к биологии, химии и биотехнологии, а именно к биолюминесцентной системе червя Odontosyllis undecimdonta. Предложено соединение 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновая кислота:или его таутомер - 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновая кислота. Также предложены предшественники указанного соединения и его таутомера - 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновая кислота и 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновая кислота, соответственно. Кроме того, предложены биолюминесцентная композиция, способы и набор для выявления люциферазы в биологических образцах с использованием указанных соединений. Указанные компоненты биолюминесцентной системы червя Odontosyllis undecimdonta являются перспективными для применения в качестве реагентов для множества анализов, включая диагностические системы, системы контроля качества, системы тестирования лекарственных препаратов и т.д. 8 н. и 13 з.п. ф-лы, 1 табл., 13 ил.
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к биологии, химии и биотехнологии, а именно к биолюминесцентной системе червя Odontosyllis undecimdonta.
Уровень техники
Биолюминесценция - процесс излучения света живыми организмами в ходе биохимической реакции, в которой химическая энергия превращается в световую. Способность к биолюминесценции определяется наличием специфического белка люциферазы или фотопротеина. Люциферазы - это ферменты, которые катализируют окисление низкомолекулярных соединений - люциферинов, превращая их в оксилюциферины. Окисление сопровождается выделением света и высвобождением оксилюциферина. Описано несколько типов биолюминесцентных систем.
Например, у ряда морских кишечнополостных описаны системы, включающие белки семейства экворина (Prasher, et al., Biochem. 1987, 26:1326-1332; Tsuji et al., Photochem Photobiol, 1995 62(4):657-661). Семейство экворина (aequorin) включает также обелин (obelin), халистаурин или митрокомин (halistaurin = mitrocomin), фиалидин или клитин (phiallidin = clytin) и т.д. Это фотопротеины, содержащие ковалентно связанный с ними люциферин, который в присутствии ионов Са2+ подвергается химическим превращениям с образованием продукта в возбужденном электронном состоянии.
Морские полихеты Odontosyllis undecimdonta, широко известные как «огненные черви», излучают яркое сине-зеленое свечение. Биолюминесценция Odontosyllis является системой люциферин-люциферазы, белок люцифераза известен из Darrin T. Schultz et al, Biochemical and Biophysical Research Communications, V. 502 (3), 2018, P. 318-323, но структура люциферина не была известна.
Компоненты биолюминесцентных систем (люциферазы, фотопротеины, люциферины и т.д.) - широко используемые реагенты для множества анализов, включая диагностические системы, системы контроля качества и т.д. Например, белки семейства экворина широко используются для исследований высвобождения и связывания Са2+ в биологических системах, например, во время мышечного сокращения. Использование биолюминесцентных систем в подробностях описано, например, в Cormier, М.L. et al., Photochem. & Photobiol. 49/4, 509-512 (1989), Smith, D.F. et al. in ′′Bioluminescence and Chemiluminescence: Current Status (P. Stanley & L. Krick, eds.), John Wiley and Sons, Chichester, U.K. 1991, 529-532.
Несмотря на большое количество биолюминесцентных систем, используемых на сегодняшний день, сохраняется потребность в расширении линейки люциферин-люциферазных пар, обладающих новыми свойствами. Расшифровка новых компонентов биолюминесцентных систем позволяет расширить спектр доступных анализов и приложений для использования.
Раскрытие изобретения
Задачей настоящего изобретения является установление компонентов биолюминесцентной системы червя Odontosyllis undecimdonta, в частности идентификация молекулы люциферина и предлюциферина, а также разработка способа выявления люциферазы в биологическом образце с помощью люциферина или предлюциферина червя Odontosyllis undecimdonta и способа детекции биолюминесценции посредством люциферина или предлюциферина червя Odontosyllis undecimdonta.
Технический результат состоит в расширении арсенала технических средств в области применения биолюминесцентных систем и достигается за счет идентификации молекулы люциферина червя Odontosyllis undecimdonta, окисление которого сопровождается испусканием света. Также технический результат достигается за счет идентификации молекулы предлюциферина червя Odontosyllis undecimdonta. Указанные компоненты бюолюминесцентной системы червя Odontosyllis undecimdonta являются перспективными для применения в качестве реагентов для множества анализов, включая диагностические системы, системы контроля качества, системы тестирования лекарственных препаратов и т.д.
Настоящее изобретение обеспечивает молекулу люциферина червя, а именно 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновую кислоту, характеризующуюся следующей структурной формулой:
и/или её таутомер 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновую кислоту, характеризующуюся следующей структурной формулой:
Настоящее изобретение также обеспечивает применение соединения 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновой кислоты и/или его таутомера 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновой кислоты в качестве субстрата для фермента люциферазы, окисление данной молекулы приводит к появлению света.
Настоящее изобретение также обеспечивает молекулу предлюциферина, а именно соединение 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновая кислота, характеризующееся следующей структурной формулой:
и/или его таутомер 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновая кислота, характеризующийся следующей структурной формулой:
Настоящее изобретение также включает применение соединения 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновой кислоты и/или его таутомера 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновой кислоты в качестве предшественника люциферина (предлюциферина).
Настоящее изобретение также включает набор для детекции люциферазы в биологическом образце, включающий люциферин и/или предлюциферин по изобретению.
В частных вариантах воплощения изобретения набор дополнительно включает буфер, детергент, восстановительный агент и/или глицерин.
В частных вариантах воплощения изобретения указанные компоненты набора содержатся в допустимых количествах.
Настоящее изобретение также включает биолюминесцентную композицию, включающую люциферазу и, по меньшей мере, одно соединение по настоящему изобретению. В частных вариантах воплощения изобретения люцифераза является рекомбинантной. В частных вариантах воплощения изобретения люцифераза представляет собой люциферазу червя Odontosyllis undecimdonta.
Кроме того, настоящее изобретение также обеспечивает способ выявления (детекции) люциферазы в биологическом образце, включающем люциферазу и, по меньшей мере, одно соединение по изобретению. В частных вариантах воплощения изобретения люцифераза представляет собой люциферазу червя Odontosyllis undecimdonta. В частных вариантах воплощения изобретения люцифераза представляет собой рекомбинантную люциферазу. В частных вариантах воплощения изобретения биологический образец представляет собой ткань и/или клетку. В частных вариантах воплощения изобретения биологический образец характеризуется значением рН в диапазоне от 7 до 8.
В частных вариантах воплощения изобретения способ выявления люциферазы включает следующие этапы:
а) добавление соединения по изобретению к биологическому образцу для получения реакционной смеси;
б) инкубирование реакционной смеси в условиях, подходящих для возникновения биолюминесценции;
в) детектирование биолюминесценции в реакционной смеси.
В частных вариантах воплощения изобретения концентрация соединения (люциферина и/или предлюциферина) составляет 0.03 - 300 мкМ.
Кроме того, обеспечивается способ детекции биолюминесценции в биологическом образце, включающем люциферазу и, по меньшей мере, одно соединение по изобретению. В частных вариантах воплощения изобретения люцифераза представляет собой рекомбинантную люциферазу. В частных вариантах воплощения изобретения люцифераза представляет собой люциферазу червя Odontosyllis undecimdonta. В частных вариантах воплощения изобретения биологический образец представляет собой ткань и/или клетку. В частных вариантах воплощения изобретения биологически образец характеризуется значением рН в диапазоне от 7 до 8.
В частных вариантах воплощения изобретения способ детекции биолюминесценции включает следующие этапы:
а) экспрессию гена люциферазы в биологическом образце;
б) добавление соединения по изобретению к биологическому образцу;
в) детектирование биолюминесценции.
В частных вариантах воплощения изобретения концентрация соединения по изобретению (люциферина и/или предлюциферина) составляет 0.03 - 300 мкМ.
Также настоящее изобретение обеспечивает реактивы и наборы реактивов для реализации методов настоящего изобретения.
Настоящее изобретение также включает получение соединений по изобретению.
Для более полного раскрытия вышеперечисленных характеристик настоящего изобретения ниже предлагается детальное описание изобретения, кратко сформулированного выше, в виде ссылок на воплощения, некоторые из которых проиллюстрированы дополнительными фигурами. При этом следует отметить, что прилагаемые фигуры иллюстрируют лишь типичные воплощения настоящего изобретения и, следовательно, не должны быть восприняты в качестве ограничения объема изобретения, которое может допускать другие, в равной степени эффективные, воплощения.
Подробное раскрытие изобретения
Краткое описание чертежей
Фигура 1. Результат измерения биолюминесценции люциферина Odontosyllis undecimdonta во времени.
Фигура 2. UV-vis спектр предлюциферина Odontosyllis undecimdonta.
Фигура 3. UV-vis спектр люциферина Odontosyllis undecimdonta.
Фигура 4. Хроматографический профиль водного экстракта лиофилизированных червей Odontosyllis undecimdonta на основании результатов анионообменной хроматографии на колонке DEAE Sepharose HiTrap Fast Flow. Сплошная линия - сигнал поглощения при длине волны 280 нм. Профили активности люциферазы и люциферина Odontosyllis в отн. ед. люминесценции.
Фигура 5. Компоненты биолюминесцентной системы многощетинковых червей Odontosyllis undecimdonta:
А) ампула для ЯМР-спектроскопии с очищенным оксилюциферином, видимый свет;
В) Флуоресценция оксилюциферина под УФ излучением.
Фигура 6. Обращенно-фазовый хроматографический профиль люциферинсодержащей фракции, полученный при проведении ионообменной хроматографии на капиллярной колонке TSK ODS 120T 5 мкм (контроль при двух разных длинах волн: 300 нм и 410 нм). Пики люциферина и оксилюциферина Odontosyllis, соответственно.
Фигура 7. Нумерация тяжелых атомов:
А) люциферин;
Б) оксилюциферин;
В) предлюциферин.
Фигура 8. Масс-спектр высокого разрешения люциферина, демонстрирующий сходство со схемами фрагментации люциферина Odontosyllis (пик шума отмечен звездочкой).
Фигура 9. Обращенно-фазовый хроматографический профиль люциферинсодержащей фракции на основании данных ионообменной хроматографии водного экстракта лиофилизированных червей Odontosyllis undecimdonta на колонке YMC-Triart C18 (3 мкм, 12 нм, 75 × 4,6 мм) (контроль при λabs = 254 нм). Пики люциферина Odontosyllis и предлюциферина отмечены соответственно.
Фигура 10. Масс-спектр высокого разрешения предлюциферина, демонстрирующий сходство со схемами фрагментации люциферина Odontosyllis (пик шума отмечен звездочкой).
Фигура 11. Типичный результат выявления люциферазы в биологических образцах.
Фигура 12. Типичный результат детекции биолюминесценции в биологических образцах.
Фигура 13. Типичный результат измерения биолюминесценции предлюциферина Odontosyllis undecimdonta во времени.
Определения и термины
Различные термины, относящиеся к объектам настоящего изобретения, используются выше и также в описании и в формуле изобретения. Если иное не оговаривается, все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют то же самое значение, которое понятно для специалистов в данной области. Ссылки на методики, используемые при описании данного изобретения, относятся к хорошо известным методам, включая изменения этих методов и замену их эквивалентными методами, известными специалистам.
В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».
Термин «биолюминесценция» или «люминесценция» в настоящем документе означает процесс излучения света, получаемый в результате реакции между ферментом и субстратом, который генерирует свет.
Термин «предшественник люциферина (предлюциферин)» в настоящем документе означает соединение, способное превращаться в люциферин самопроизвольно или под действием ферментов.
Термин «люциферин» в настоящем документе означает соединение, являющееся субстратом для ферментов люцифераз.
Как здесь используется, термин «люцифераза» означает белок, который обладает способностью к окислению люциферина, где реакция окисления сопровождается выделением света (люминесценцией) и происходит освобождение окисленного люциферина.
«Реакционная смесь люциферазы» содержит фермент люциферазу и материалы, которые позволят ферменту люциферазе генерировать световой сигнал. Необходимые материалы и конкретные концентрации и/или количества материалов, необходимых для генерации люминесцентного сигнала, варьируются в зависимости от используемого фермента люциферазы, а также от типа выполняемого анализа на основе люциферазы. Как правило, для люциферазы червя Odontosyllis undecimdonta, эти материалы могут включать: буфер для поддержания реакции при правильном pH, фермент люцифераза червя Odontosyllis undecimdonta и люциферин. Часто к раствору будут добавляться другие материалы, в том числе: бычий сывороточный альбумин (BSA), чтобы поддерживать активность люциферазы, восстановители, детергенты, соли, глицерин, аминокислоты, например D-цистеин и др. Типичная реакционная смесь люциферазы может содержать люциферазу червя Odontosyllis undecimdonta, 50 мМ натрий-фосфатный буфер рН 7.4, 5% глицерин.
«Смесь для обнаружения люциферазы» содержит материалы, которые позволят обнаружить фермент люциферазу. Необходимые материалы и конкретные концентрации и/или количества материалов, необходимых для генерации люминесцентного сигнала, будут варьируются в зависимости от используемого фермента люциферазы, а также от типа выполняемого анализа на основе люциферазы. В общем, для люциферазы червя Odontosyllis undecimdonta эти материалы могут включать в себя: восстановители, детергенты, соли, глицерин, аминокислоты, субстрат люциферазы - люциферин. Часто к раствору могут добавляться другие материалы, в том числе: буфер для поддержания реакции при правильном pH, бычий сывороточный альбумин (BSA), чтобы поддерживать активность люциферазы, восстановители, детергенты, соли, глицерин, аминокислоты, например D-цистеин и т. д. Типичная смесь для обнаружения люциферазы может содержать субстрат люциферазы - люциферин червя Odontosyllis undecimdonta, 50 мМ натрий-фосфатный буфер рН 7.4.
Как здесь используется, термин "выделенный" означает молекулу или клетку, которые находятся в среде, отличной от среды, в которой молекула или клетка находятся в естественных условиях. Например, указанные компоненты могут находиться по существу в очищенной форме. По существу, очищенная форма означает, что белки являются, по меньшей мере, приблизительно на 20% чистыми, часто, по меньшей мере, на 30% чистыми, обычно на 50% чистыми, или, по меньшей мере, на 90% чистыми.
Для выделения белков могут быть использованы любые обычные методики очистки белка, описанные, например, в Guide to Protein Purification, (Deuthser ed.) (Academic Press, 1990). Например, из исходного источника может быть приготовлен лизат или холодный экстракт и очищен с использованием ВЭЖХ, эксклюзионной хроматографии, гель-электрофореза, аффинной хроматографии и т.п. Белковые препараты могут быть протестированы на наличие активной люциферазы или комплекса люциферазы и люциферина с помощью методов настоящего изобретения.
Как здесь используется, термин "мутант" или "производное" относятся к белку (в частности, к люциферазе), раскрытому в настоящем изобретении, в котором одна или более аминокислот добавлены и/или замещены и/или удалены (делетированы) и/или вставлены (инсертированы) в N-конец и/или С-конец, и/или в пределах нативных аминокислотных последовательностей белков настоящего изобретения. Как здесь используется, термин "мутант" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует мутантный белок. Кроме того, термин "мутант" здесь относится к любому варианту, который короче или длиннее белка или нуклеиновой кислоты.
Модификации, а также добавки или делеции могут быть встроены любым методом, известным в данной области (см., например, Gustin et al., Biotechniques (1992) 14: 22; Barany, Gene (1985) 37: 11-123; и Colicelli et al., Mol. Gen. Genet. (1985) 199:537-539), Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1989), CSH Press, pp. 15.3-15.108), включая ошибочно-направленную ПЦР, перестановку, сайт-направленный мутагенез с использованием олигонуклеотидов, мутагенез с использованием ПЦР на основе спаренных молекул, мутагенез in vivo, кассетный мутагенез, рекурсивный согласованный мутагенез, экспоненциальный согласованный мутагенез, сайт-направленный мутагенез, случайный мутагенез, генную повторную сборку, генный сайт-насыщенный мутагенез (GSSM), повторную сборку при проведении синтеза лигированием (SLR), или их сочетание. Указанные модификации, добавления или делеции могут быть также встроены способом, включающим рекомбинацию, рекурсивную рекомбинацию последовательности, мутагенез ДНК путем фосфотиоатной модификации, мутагенез на основе включения матрицы, содержащей урацил, мутагенез на основе дуплекса, содержащего бреши, репарационный мутагенез с точечными ошибочными спариваниями, мутагенез с использованием штамма-хозяина, дефицитного по репарации, химический мутагенез, радиогенный мутагенез, делеционный мутагенез, мутагенез с использованием ограничения по селекции, мутагенез с использованием ограничения по очистке, искусственный синтез гена, согласованный мутагенез, создание химерного мультимера нуклеиновой кислоты или их сочетание.
Как здесь используется, термин "функциональный" означает, что нуклеотидная или аминокислотная последовательность может функционировать для указанного испытания или задачи. Термин "функциональный", используемый для описания люцифераз, означает, что белок обладает способностью производить сопровождающуюся люминесценцией реакцию окисления люциферина.
Биологические образцы
Реализация методов настоящего изобретения обеспечивает возникновение люминесценции реакционной смеси, содержащей биологический образец, если указанный образец содержит люциферазу, использующую в качестве субстрата (то есть люциферина) 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновую кислоту и/или ее таутомер 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновую кислоту. Такую люциферазу содержат, например, способные к биолюминесценции морские полихеты Odontosyllis undecimdonta.
Биологические образцы могут быть получены с помощью различных технологий, известных в биологии, и включают образцы тканей, клеток, экстракты, гомогенаты, белковые смеси различной степени очистки и т.д. Например, биологические образцы могут быть получены из морских полихет Odontosyllis undecimdonta.
Биологические образцы могут также содержать выделенные компоненты (люциферазу или люциферазу и люциферин или предлюциферин) биолюмнесцентных систем полихет Odontosyllis undecimdonta.
Биологические образцы могут также экспрессировать рекомбинантную люциферазу или её функциональные мутанты. Последовательности нуклеиновых кислот для экспрессии указанных белков могут быть получены из природных источников (например, из полихет Odontosyllis undecimdonta) или синтезированы. В настоящее время известно множество методов для клонирования генов, кодирующих белки, обладающие известной активностью. Частично такие методы описаны в Maniatis, T., et al. (Molecular Cloning--A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 1982) и Newman и Campagnoni (Neuromethods, v. 16, 1990, pp 13-48). Например, может быть приготовлена экспрессионная библиотека в подходящих клетках-хозяевах и протестирована на активность люциферазы. Или может быть осуществлено выделение белка из холодного экстракта, определена его частичная аминокислотная последовательность и осуществлено клонирование соответствующей кДНК из образца кДНК из полихет Odontosyllis undecimdonta. Последовательности нуклеиновых кислот должны быть встроены в кассету экспрессии. Кассета экспрессии может существовать как внехромосомный элемент или может быть включена в геном клетки в результате введения указанной кассеты экспрессии в клетку. В кассете экспрессии нуклеиновая кислота, кодирующая белок, является функционально связанной с регуляторной последовательностью, которая может включить промоторы, энхансеры, терминаторы, операторы, репрессоры и индукторы. После введения кассеты экспрессии в клетку в ней может образовываться функциональный белок. Системы экспрессии включают, например, бактериальные системы, дрожжевые клетки, насекомых, рыб, земноводных или клетки млекопитающих. Методы изготовления кассет экспрессии или систем для экспрессии желаемого продукта известны специалистам, квалифицированным в данной области. Клеточные линии, которые устойчиво экспрессируют люциферазу могут быть выбраны способами, известными в данной области (например, ко-трансфекция с селектируемым маркером, таким как dhfr, gpt, неомицин, гигромицин, что делает возможным выявление и выделение трансфицированных клеток, которые содержат ген, включенный в геном). Вышеописанные системы экспрессии могут использоваться в прокариотических или эукариотических хозяевах. Для получения белка могут использоваться клетки-хозяева, такие как Е. coli, В. subtilis, S. cerevisiae, клетки насекомого в комбинации с бакуловирусными векторами, или клетки высшего организма, такого как позвоночные, например, COS 7 клетки, НЕК 293, СНО, ооциты Xenopus и т.д.
Могут быть также экспрессированы функциональные мутанты природных белков. Как используется в настоящем описании, термин «функциональный» по отношению к люциферазе означает, что указанный белок способен использовать 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновую кислоту и/или ее таутомер 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновую кислоту в качестве люциферина.
Ссылка на нуклеотидную последовательность, "кодирующую" полипептид означает, что с нуклеотидной последовательности в ходе трансляции и транскрипции мРНК продуцируется этот полипептид. При этом может быть указана как кодирующая цепь, идентичная мРНК и обычно используемая в списке последовательностей, так и комплементарная цепь, которая используется как матрица при транскрипции. Как очевидно для любого специалиста в данной области техники, термин также включает любые вырожденные нуклеотидные последовательности, кодирующие одинаковую аминокислотную последовательность. Нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептид, включают последовательности, содержащие интроны.
Реактивы для выявления активности люциферазы
Методы настоящего изобретения основаны на использовании 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновой кислоты и/или ее таутомера 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновую кислоту для детекции активности люциферазы в биологических образцах.
Как используется в настоящем описании, 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновая кислота представляет собой соединение, имеющее следующую структурную формулу:
Как используется в настоящем описании, таутомер вышеуказанного соединения представляет собой соединение 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновую кислоту, имеющее следующую структурную формулу:
Этот новый выделенный авторами настоящего изобретения люциферин имеет уникальное строение, отличающее его от всех ранее описанных природных люциферинов. Так, основу молекулы люциферина червя Odontosyllis составляет конденсированный гетероцикл - тиено[3,2-f]тиохромен, состоящий из двух шестичленных и одного пятичленного циклов. Такие сложные конденсированные трициклические структуры ранее не встречались в качестве субстратов биолюминесцентных реакций. Надо также отметить, что тиопиран впервые фигурирует в составе природных биолюминесцентных субстратов. Люциферин червя Odontosyllis является сильно полярной молекулой и представляет собой сильную кислоту, поскольку эта молекула содержит три карбоксильных заместителя, а также несет сульфокислотный остаток. Лиофильно высушенный субстрат хранится при -20°С без снижения активности не менее 30 дней, чаще не менее 60 дней, обычно не менее года.
Авторами настоящего изобретения разработан путь синтеза люциферина червя Odontosyllis (схема 1). Рекомендованная схема синтеза указанного соединения включает 9 стадий и использует 2,3-диметоксифенилтиол в качестве исходного вещества. Обработка стартового диметоксифенилтиола метил пропиолатом в присутствии азоизобутиронитрила приводит к формированию бициклической конденсированной системы метил 6,7-диметоксибензо[b]тиофен-3-карбоксилата (1). Последующее бромирование бицикла и кросс-сочетание галогенида 2 с этил акрилатом по реакции Сузуки приводит к продукту 3 с высоким выходом. Окисление соединения 3 под действием K2OsO4 и NaIO4 дает метил 4-формил-6,7-диметоксибензо[b]тиофен-3-карбоксилат (4). Снятие защитных метильных групп и дальнейшее окисление продукта 5 церий аммоний нитратом приводит к продукту 6 - метил 4-формил-6,7-диоксо-6,7-дигидробензо[b]тиофен-3-карбоксилату. Реакция Виттига между соединением 6 и диметил 2-(диметоксифосфорил)-3-меркаптосукцинатом в щелочных условиях приводит к формированию трициклической конденсированной структуры 7, последующая эстерификация которого пиридин сульфокислотой и снятие защитных метильных групп приводит к целевому продукту 9 - люциферину червя Odontosyllis.
Схема 1. Синтез люциферина червя Odontosyllis - 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновая кислота
Как используется в настоящем описании, 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновая кислота представляет собой соединение, характеризующееся следующей структурной формулой:
и/или его таутомер 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновая кислота, характеризующийся следующей структурной формулой:
Этот новый выделенный авторами настоящего изобретения предлюциферин имеет уникальное строение, отличающее его от всех ранее описанных природных предлюциферинов.
Состав условий для развития биолюминесцентного сигнала
Формирование биолюминесценции зависит от количества и сохранности люциферазы в биологических образцах. Так же следует отметить воздействие светового излучения, особенно УФ части спектра, на люциферин, приводящее к его деградации и утрате функциональности, что было подтверждено экспериментально.
На формирование сигнала влияет рН реакционной смеси. Формирование биолюминесцентного сигнала происходит в диапазоне рН от 6.0 до 9.8, обычно в диапазоне рН от 6.5 до 9.0, преимущественно, в диапазоне от 7.0 до 8.0. Для обеспечения рН могут быть использованы любые стандартные буферные растворы для данного диапазона рН, включая фосфатный буфер, HEPES, Трис-HCl. В преимущественных воплощениях молярность буферного раствора не превышает 2, например, не превышает 1, чаще находится в диапазоне от 0.05 до 0.4, обычно от 0.1 до 0.2.
Реакционные смеси для нужд настоящего изобретения могут также содержать компоненты, стабилизирующие и защищающие ферменты биолюминесцентной системы от ингибирующего воздействия следовых количеств ионов тяжелых металлов и от деградации протеазами.
Например, реакционная смесь может содержать ДТТ в концентрации не более 20 мМ, чаще в концентрации от 0.1 до 8 мМ, преимущественно в концентрации 0.1- 4 мМ.
Реакционная смесь может также содержать бета-меркаптоэтанол и/или ЭДТА в конечной концентрации от 0 до 5 мМ.
Например, реакционная смесь может содержать 0.1 - 2 мМ ДТТ и 0.1 - 1 мМ ЭДТА.
Также реакционная смесь может содержать ингибиторы протеаз, например, фенилуксусную кислоту или щавелевую кислоту в стандартно используемых концентрациях.
Для нужд настоящего изобретения 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновую кислоту и/или ее таутомер 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновую кислоту добавляют к биологическому образцу до конечной концентрации 0.03 - 300 мкМ, чаще 1 - 5 мкМ.
Для нужд настоящего изобретения 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновая кислота и/или ее таутомер 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновая кислота добавляют к биологическому образцу до конечной концентрации 0.03 - 300 мкМ, , чаще 1 - 5 мкМ.
В некоторых вариантах воплощения изобретения к образцу добавляют смесь реагентов, включающих буферный раствор, компоненты, стабилизирующие и защищающие ферменты биолюминесцентной системы от ингибирующего воздействия следовых количеств ионов тяжелых металлов и от деградации протеазами. В других воплощениях к биологическому образцу сперва добавляют буферный раствор, компоненты, стабилизирующие и защищающие ферменты биолюминесцентной системы от ингибирующего воздействия следовых количеств ионов тяжелых металлов и от деградации протеазами, а затем раствор 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновой кислоты и/или ее таутомера 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновая кислота или раствор 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновой кислоты и/или её таутомера 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновой кислоты.
В зависимости от растворителя, использованного для приготовления раствора люциферина или раствора предлюциферина, реакционная смесь может содержать небольшие количества использованных растворителей.
Также реакционная смесь может содержать детергенты, такие как Triton X100 или нонилфеноксиполиэтоксиэтанол. В некоторых вариантах воплощения изобретения концентрация детергентов в реакционной смеси не превышает 0,2%, чаще не превышает 0,1%, оптимально не превышает 0,06%.
Также реакционная смесь может содержать бычий сывороточный альбумин (БСА) или другие белки в концентрации, не превышающей 2%, чаще не превышающей 1%, оптимально не превышающей 0,5%. БСА используется, когда концентрация биологического образца крайне мала, тогда БСА играет роль стабилизатора белков.
Развитие биолюминесцентного сигнала происходит в широком диапазоне температур - от 4 до 40°С, оптимально при 20-25°С.
Формирование люминесцентного сигнала начинается сразу после инициации реакции при добавлении ключевых реактивов для выявления активности люциферазы, указанных выше.
Максимальная интенсивность люминесценции наблюдается в момент инициации реакции. Далее идет спад, скорость которого определяется активностью ферментов и начальными концентрациями субстратов. При определенных условиях (субстратов много, активность ферментов мала, температура реакции снижена) реакция может наблюдаться в течение 4 часов и более часов (фигура 1).
Детекция биолюминесценции
Методы настоящего изобретения включают детекцию биолюминесценции, возникающей в биологическом образце, содержащем люциферазу, при появлении в нем люциферина.
Биолюминесценция может быть обнаружена с помощью методов, известных специалистам в данной области, в частности, с помощью визуального скрининга или с использованием люминометра, фотометра, флуориметра, цифровой фотокамеры, с помощью светочувствительной фотопленки. В качестве количественной характеристики может быть использована максимальная интенсивность люминесценции, которая достигается через 5-30 мин после инициации биолюминесцентной реакции или скорость нарастания люминесценции в интервале до 30 мин после инициации биолюминесцентной реакции, например, в течение 5, 10, 20, 30, 60 сек после инициации реакции или дольше.
В преимущественных воплощениях измеряемая люминесценция представляет собой длительное свечение, скорее, чем световые вспышки. В преимущественных воплощениях интенсивность люминесценции зависит от активности ферментов биолюминесцентной системы, присутствующих в образце, начальных концентраций субстратов и температуры реакционной смеси и обычно колеблется в пределах от 10 кв/сек до 10 млн кв/сек, чаще 100 - 100000 кв/сек.
Реакция длится не менее 30 мин после инициации, чаще 30-60 мин, иногда (в зависимости от условий) часы и даже сутки.
Испускаемый при окислении 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновой кислоты и/или ее таутомера 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновой кислоты свет находится в диапазоне от 450 до 600 нм, чаще в диапазоне от 475 до 550 нм, с максимумом эмиссии при 505-510 нм.
Способы применения
Методы и реактивы настоящего изобретения могут быть использованы в широком спектре биолюминесцентных анализов in vivo и in vitro.
В частности, методы и реактивы настоящего изобретения могут быть использованы для выявления активных компонентов биолюминесцентных системы полихет Odontosyllis undecimdonta в процессе их очистки.
Также методы и реактивы настоящего изобретения могут быть использованы для выявления функциональных аналогов ферментов биолюминесцентной системы полихет Odontosyllis undecimdonta в биологических образцах.
Также методы и реактивы настоящего изобретения могут быть использованы для выявления активности рекомбинантной люциферазы в клетках-хозяевах.
В некоторых вариантах воплощения изобретения для осуществления применения должна быть получена нуклеиновая кислота, кодирующая люциферазу. Полученная нуклеиновая кислота должна быть встроена в кассету экспрессии, обеспечивающую временную или постоянную экспрессию этой нуклеиновой кислоты в клетках-хозяевах, например под интересующими исследователя промоторами. Кассета экспрессии может содержать элементы, обеспечивающие адресную доставку конструкции в интересующие клетки или клеточные компартменты, или находится в составе частиц, обеспечивающих адресную доставку. После трансфекции клеток кассетой экспрессии (например, в составе экспрессионного вектора) и по истечении времени, необходимого для наработки в клетках продукта экспрессии, может быть осуществлено выявление активности люциферазы внутри клеток или в клеточном лизате.
Наборы
Также обеспечиваются в соответствии с настоящим изобретением наборы для использования при осуществлении вышеописанных применений.
В некоторых воплощениях наборы обычно включают 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновую кислоту и/или ее таутомер 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновую кислоту, предпочтительно с буферным раствором для растворения указанного субстрата и/или его добавления к биологическим образцам. 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновая кислота и/или ее таутомер могут присутствовать в растворенном виде в соответствующей среде для хранения, такой как водный или буферный раствор с детергентом, обычно в соответствующей емкости. Альтернативно, 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновая кислота и/или ее таутомер могут присутствовать в наборе в лиофилизованном виде.
В некоторых воплощениях наборы обычно включают 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновую кислоту и/или её таутомер 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновую кислоту, предпочтительно с буферным раствором для растворения указанного соединения и/или его добавления к биологическим образцам. 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновая кислота и/или её таутомер 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновая кислота может присутствовать в растворенном виде в соответствующей среде для хранения, такой как водный или буферный раствор с детергентом, обычно в соответствующей емкости. Альтернативно, 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновая кислота и/или её таутомер 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновая кислота может присутствовать в наборе в лиофилизованном виде.
В дополнение к описанным выше компонентам, заявленные наборы могут дополнительно включать инструкции для осуществления заявленных способов. Эти инструкции могут присутствовать в заявленных наборах в различных формах (например, в печатном варианте или на электронном носителе в виде текстового и/или графического файла) в количестве одна или более.
Биолюминесцентные композиции
Также обеспечиваются в соответствии с настоящим изобретением биолюминесцентные композиции для использования при осуществлении вышеописанных применений.
В некоторых воплощениях композиции обычно включают 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновую кислоту и/или ее таутомер 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновую кислоту, предпочтительно с буферным раствором для растворения указанного субстрата и/или его добавления к биологическим образцам. 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновая кислота и/или ее таутомер могут присутствовать в растворенном виде в соответствующей среде для хранения, такой как водный или буферный раствор с детергентом. Альтернативно, 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновая кислота и/или ее таутомер могут присутствовать в композиции в лиофилизованном виде.
В некоторых воплощениях композиции обычно включают 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновую кислоту и/или её таутомер 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновую кислоту, предпочтительно с буферным раствором для растворения указанного соединения и/или его добавления к биологическим образцам. 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновая кислота и/или её таутомер 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновая кислота может присутствовать в растворенном виде в соответствующей среде для хранения, такой как водный или буферный раствор с детергентом. Альтернативно, 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновая кислота и/или её таутомер 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновая кислота может присутствовать в композиции в лиофилизованном виде.
В дополнение к описанным выше компонентам, заявленные композиции могут дополнительно включать вспомогательные вещества, в частности, адъюванты, растворители и/или наполнители, такие, которые совместимы с соединениями, составляющими суть данного изобретения, и которые не разрушают биологической активности этих соединений.
Следующие примеры предлагаются в качестве иллюстративных, но не ограничивающих.
Примеры
Порядок экстракции предлюциферина
Промыть лиофилизированных червей Odontosyllis undecimdonta метанолом, а затем провести экстракцию предлюциферина 70% ацетоном. Для ТСХ нанести экстракт на силикагель с MeOH:CH2Cl2 (2:1) или EtOAc: ацетон: MeOH: H2O (5:2:2:1). Собрать образцы розового или фиолетового цвета, лиофилизировать и хранить при температуре -20°С.
Анализ результатов обращенно-фазовой ВЭЖХ лиофилизированного субстрата фракций биомассы
O. undecimdonta
Каждую пробирку с законсервированным образцом дважды промыли 1 мл воды, чтобы растворить порошок, затем растворы лиофилизировали. Для анализа ВЭЖХ образцы растворили в 300 мкл 0,1%-ного водного раствора трифторуксусной кислоты. Колонку (5 мкм, 9,2 х 150 мм) ZORBAX SB-C18 (производитель Agilent Technologies, США) в системе Nexera X2 (Shimadzu, Япония) элюировали растворителем A (0,1%-ный водным раствором трифторуксусной кислоты) и растворителем B (ацетонитрилом) в линейном градиенте от 10 до 35% (15 мин) растворителя B при расходе 3 мл/мин. Контроль поглощения осуществлялся при длине волны 220, 250, 330 и 410 нм (Спектр поглощения предлюциферина, фигура 2). Фракции с биолюминесцентной активностью собрали отдельно и лиофилизировали.
Экстракция, разделение и очистка люциферина и оксилюциферина
Водная экстракция нативной люциферазы, люциферина и оксилюциферина из лиофилизированных червей
Odontosyllis undecimdonta
5 мл фосфатного буфера (5 мМ натрий-фосфатный буфер, рН 7,4) добавить к 200 мг лиофилизированных червей. Смесь пипеткой добавить в жидкий азот для создания небольших капель замороженного материала, которые затем измельчить в ступке. Замороженный порошок добавить к 15 мл фосфатного буфера (5 мМ натрий-фосфатный буфер, рН 7,4) и выдерживать в течение 40 минут на ледяной бане и регулярном перемешивании. Центрифугировать смесь при ускорении 40000 g (4°С) в течение 40 мин. Собрать супернатант, содержащий люциферазу, люциферин и оксилюциферин, заморозить бесклеточный экстракт и хранить при -70°С.
Ионообменная хроматография водного экстракта
Нанести водный экстракт Odontosyllis undecimdonta на колонку HiTrap Fast Flow (1,6 х 2,5 см) с диэтилэтаноламин-сефарозой (DEAE-сефароза производства GE Healthcare, Упсала, Швеция) в хроматографической системе Akta Prime (GE, США), уравновесить и промыть 5 мМ натрий-фосфатным буфером (рН 7,4) при расходе 5 мл/мин. Элюировать колонку в линейном градиенте с концентрацией NaCl от 0 до 0,4 М (80 мл) и собирать фракции размером 5 мл. С целью предотвращения биолюминесцентной реакции растворитель, фракции и колонку выдерживают при температуре 4°С. Провести анализ на хроматографической системе Akta Prime (GE, США). На данном этапе была выделена и выявлена специфическая активность люциферазы и люциферина путем попарного смешивания всех фракций. Для контроля биолюминесценции использовался люминометр «Оберон-К», изготовленный на заказ (г. Красноярск, Россия). На этой стадии не были разделены люциферин и оксилюциферин (обладающий видимым зеленым свечением). Все фракции заморозили.
Концентрация на патроне Strata C18 для твердофазной экстракции.
Фракции, которые содержали как люциферин, так и оксилюциферин, были подкислены путем добавления трифторуксусной кислоты (0,05%). Затем их наносили на 3 мл патрон Strata C18 для твердофазной экстракции (Phenomenex, Torrance, США), который был предварительно уравновешен с помощью 0,05%-ного водного раствора трифторуксусной кислоты. После промывки 0,05%-ной трифторуксусной кислотой патрон элюировали ацетонитрилом, содержащим 0,05% трифторуксусной кислоты. При этом осуществлялся контроль биолюминесцентной активности (см. ниже протокол анализа биолюминесцентной активности), а фракции были лиофилизированы.
Обращенно-фазовая хроматография
Дальнейшее разделение люциферина и оксилюциферина проведено с использованием колонки TSK ODS 120T 5 мкм (4,6 мм х 250 мм, производитель «LKB-Producter AB», Бромма, Швеция) в хроматографической системе «Шимадзу» (корпорация Shimadzu, Киото, Япония). Растворитель A представляет собой 0,1%-ный водный раствор трифторуксусной кислоты, а растворитель B - 0,08%-ный раствор трифторуксусной кислоты в ацетонитриле, обработанный в градиенте B 10-50% в течение 20 минут при расходе 1 мл/мин. Контроль поглощения осуществлялся при длине волны 220, 250, 330 и 410 нм (Спектр поглощения люциферина фигура 3). Фракции, содержащие люциферин и оксилюциферин, были собраны отдельно и лиофилизированы.
Люминесцентный анализ
Для контроля реакций использовался люминометр «Оберон-К», изготовленный на заказ (г. Красноярск, Россия). Для каждого измерения использовали 100 мкл реакционной смеси (10 мМ натрий-фосфатный буфер, 150 мМ NaCl, 2 мкл фракции люциферазы, рН 7,4). До добавления люциферина корректировка измерений осуществлялась в соответствии с фоновой люминесценцией люциферазы на основе контроля реакций в течение 20 с.
Применение ионообменной хроматографии охлажденного водного экстракта червей O. undecimdonta позволило на первом этапе разделить субстратные и ферментосодержащие фракции (фигура 4). Ни одна из фракций сама по себе не обладала биолюминесцентной активностью. В результате попарного комбинирования всех фракций были определены фракции, содержащие люциферин и люциферазу. Фракции, содержащие люциферин, имели видимую желто-зеленую окраску (фигура 5А) и флуоресцировали в ультрафиолетовом свете (фигура 5В). По мнению авторов настоящего изобретения наблюдаемый желто-зеленый цвет субстрат-содержащей фракции, по всей видимости, обусловлен присутствием оксилюциферина. Это, в свою очередь, указывало на необходимость дальнейшей очистки (фигура 6). Фракции, содержащие люциферин или оксилюциферин (фигура 6), были определены с помощью биолюминесцентного анализа или спектра поглощения при длине волны 410 нм. Затем они были разделены, лиофилизированы и использованы для дальнейшего анализа.
Превращение люциферина в оксилюциферин, эксперимент с реакцией люминесценции
in vitro
Для реакции биолюминесценции in vitro использовали трис-солевой буферный раствор (150 мМ Трис-HCl, 1 М NaCl, pH 7,5). Каждая пробирка содержала 60 мкл фракции чистого люциферина, 40 мкл трис-солевого буферного раствора и 20 мкл высокоочищенной люциферазы (см. раздел ниже) или трис-солевого буферного раствора в случае негативного контроля. В ходе реакции наблюдалось излучение, при этом свечение в контрольной пробирке отсутствовало. Контроль реакции осуществлялся путем использования 5 мкл аликвот реакционной и контрольной смесей с последующей остановкой реакции через 0, 5, 15, 30, 60, 120, 180 и 300 мин за счет добавления 20 мкл метанола и центрифугирования, после чего для анализа супернатантов применяли метод обращенно-фазовой ВЭЖХ. Использовалась колонка Shim-Pack XR-ODS (3,0 × 75 мм, 2,2 мкм) в сочетании с системой Nexera X2 (Shimadzu, Япония). Растворитель А представляет собой 0,1%-ный раствор муравьиной кислоты, рН 4,9, растворитель В - ацетонитрил. Элюирование осуществлялось в линейном градиенте с концентрацией растворителя B от 1 до 20% (15 мин) при расходе 0,7 мл/мин.
Получение образцов нативной люциферазы и рекомбинантной люциферазы
Очистка проб образцов нативной люциферазы и рекомбинантной люциферазы
Образцы люциферазы для измерения люминесцентной активности и экспериментов по конверсии in vitro были получены согласно следующей процедуре.
Очищенные образцы люциферазы были получены в результате последовательной очистки водного экстракта лиофилизированных червей: ионообменной хроматографии на колонке HiTrap Fast Flow с DЭАЭ-сефарозой (производитель GE Healthcare, Упсала, Швеция), ультрафильтрации в центробежном фильтре Amicon® Ultra (производитель Merck Millipore, Германия) и гель-фильтрационной хроматографии на колонке Superdex 200 (производитель Phenomenex, США).
Рекомбинантная люцифераза была получена из комплементарной ДНК люциферазы, синтезированной в виде линейного фрагмента двухцепочечной ДНК (производитель Twist Biosciences, США). Клонирование осуществлялось при помощи метода Golden Gate. Плазмиды экспрессии эукариотических клеток были собраны в плазмиду набора MoClo pICH47742 в качестве основной цепи, а следующие части были клонированы в векторах уровня 0: промоторе цитомегаловируса, ген-кандидате люциферазы, кодоне терминации, содержащем часть ДНК и терминаторе SV40 полиаденилирования Клетки HEK293NT трансфицировали полученной плазмидой с реагентом FuGene 6 (производитель Promega, г. Фитчбург, шт. Висконсин, США) в соответствии с протоколом производителя. Трансфицированные клетки выращивали в стандартных условиях.
ЯМР-спектроскопия и масс-спектрометрия
ЯМР-спектроскопия
Структуры люциферина, оксилюциферина и предлюциферина подтверждены совокупностью данных ЯМР-спектроскопии (см. табл. 1).
1H ЯМР спектры люциферина и предлюциферина демонстрировали схожие паттерны протонов, однако в 13С ЯМР спектре предлюциферина наблюдался сигнал четвертичного углерода 177.28 м.д., соответствующий карбонильной группе (см. табл. 1).
Таблица 1. Данные ЯМР-спектроскопии люциферина, оксилюциферина и предлюциферина
Атомa | Люциферин 10°C d4- MeOD | Оксилюциферин 15°C H2O+D2O pH 3.3 | Предлюциферин 7Н 15°C D2O pH 5.2 |
Предлюциферин 9Н 15°C D2O pH 5.2 |
||||
δ1H | δ 13C | δ 1H | δ 13C | δ 1H | δ 13C | δ 1H | δ 13C | |
1 | -b | 128.57 | - | 132.48 | - | 127.92 | - | 130.25 |
1-COOH | - | 166.10 | - | n.o. | - | n.o. | - | 175.26 |
2 | 8.389 (1H) | 136.77 | 8.202 (1H) | 134.76 | 7.671 (1H) | 127.80 | 7.631 (1H) | 126.90 |
3a | - | 129.65 | - | 133.92 | - | 136.08 | - | 136.76 |
4 | - | n.o.с | - | n.o. | - | n.o. | - | n.o. |
5 | - | n.o. | - | n.o. | - | n.o. | - | n.o. |
5a | - | 130.42 | - | 138.73 | - | 125.82 | - | 120.68 |
7 | 4.713 (1H) | 37.24 | - | 187.17 | 4.497 (1H) | 40.83 | - | 155.36 |
7-COOH | - | n.o. | - | - | - | n.o. | - | n.o. |
7-CO | - | - | - | - | - | 177.28 | - | n.o. |
8 | - | n.o. | - | n.o. | - | 127.75 | - | 116.52 |
8-COOH | - | 168.01 | - | 168.14 | - | 172.76 | - | 171.16 |
9 | 8.638 (1H) | 136.87 | 9.622 (1H) | 147.92 | 8.014 (1H) | 131.15 | 4.072 (2H) | 23.00 |
9a | - | n.o. | - | n.o. | - | n.o. | - | 119.93 |
9b | - | 134.10 | - | 135.56 | - | 133.77 | - | 133.94 |
Примечание: a) Нумерация тяжелых атомов указана на фигуре 7; b) «-» - неприменимо; c) «n.o.» - не наблюдается. |
Масс-спектрометрия
HRMS спектр люциферина выявил наличие молекулярного иона с отношением масса/заряд (m/z) 448.9267, соответствующий брутто-формуле C14H9O11S3 + (вычисленное значение m/z 448.9301). Это позволило однозначно идентифицировать выделенный люциферин как 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновую кислоту, структура которого показана на фигуре 8. HRMS профиль основного пика люциферинсодержащей фракции (фигура 9), выявил наличие молекулярного иона с отношением масса/заряд (m/z) 476.9216, паттерн фрагментации которого был подобен таковому для люциферина (фигура 10). Авторы настоящего изобретения определили, что наблюдаемый ион соответствует молекулярной формуле C15H9O12S3 + (вычисленное значение m/z 476.9251), что позволило однозначно установить наличие карбонильной группы в составе предлюциферина и идентифицировать выделенный предлюциферин как 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновую кислоту и/или ее таутомер 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновую кислоту. На основе совокупности данных ЯМР спектроскопии и масс-спектрометрии была установлена природа получения люциферина из предлюциферина как окислительное декарбоксилирование, а природа катализирующего реакцию фермента биолюминесцентной системы червя Odontosyllis undecimdonta как декарбоксилаза.
Использование 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновой кислоты для выявления люциферазы в биологических образцах
Люциферин (4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновая кислота) был получен, как описано выше в разделе «Экстракция, разделение и очистка люциферина и оксилюциферина». В качестве биологических образцов использовали лизаты клеток млекопитающих, содержащие рекомбинантную люциферазу Odontosyllis undecimdonta. Лизаты клеток были получены как описано выше в разделе «Получение образцов нативной люциферазы и рекомбинантной люциферазы».
1 мкг 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновой кислоты растворяют в 100 мкл трис-солевого буферного раствора (150 мМ Трис-HCl, 1 М NaCl, pH 7,5).
В ходе эксперимента в каждом случае сначала измеряли фоновую люминесценцию холодного экстракта, а затем добавляли аликвоты раствора 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновой кислоты.
Во всех случаях была выявлена люминесценция биологических образцов (Фигура 11).
Использование 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновой кислоты для детекции биолюминесценции в биологических образцах
Люциферин (4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновая кислота) был получен, как описано выше в разделе «Экстракция, разделение и очистка люциферина и оксилюциферина». В качестве биологических образцов использовали экстракты червей Odontosyllis undecimdonta. Холодные экстракты были получены как описано выше в разделе «Водная экстракция нативной люциферазы, люциферина и оксилюциферина из лиофилизированных червей Odontosyllis undecimdonta».
1 мкг 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновой кислоты растворяют в 100 мкл трис-солевого буферного раствора (150 мМ Трис-HCl, 1 М NaCl, pH 7,5).
В ходе эксперимента в каждом случае сначала измеряли фоновую люминесценцию холодного экстракта, а затем добавляли аликвоты раствора 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновой кислоты.
Во всех случаях была выявлена люминесценция биологических образцов (Фигура 12).
Использование предлюциферина 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновой кислоты и/или таутомера 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновой кислоты для детекции биолюминесценции в биологических образцах
Предлюциферин 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновая кислота и/или таутомера 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновая кислота был получен, как описано выше в разделе «Порядок экстракции предлюциферина». В качестве биологических образцов использовали экстракты червей Odontosyllis undecimdonta. Холодные экстракты были получены как описано выше в разделе «Водная экстракция нативной люциферазы, люциферина и оксилюциферина из лиофилизированных червей Odontosyllis undecimdonta».
1 мкг 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновой кислоты и/или таутомера 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновой кислоты растворяют в 100 мкл трис-солевого буферного раствора (150 мМ Трис-HCl, 1 М NaCl, pH 7,5).
В ходе эксперимента в каждом случае сначала измеряли фоновую люминесценцию холодного экстракта, а затем добавляли аликвоты раствора 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновой кислоты и/или таутомера 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновой кислоты.
Во всех случаях была выявлена люминесценция биологических образцов, типичный результат детекции люминесценции представлен на фигуре 13.
Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.
Claims (33)
1. Соединение 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновая кислота, характеризующееся следующей структурной формулой:
или его таутомер - 4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9Н-тиено[3,2-f]тиохромен-1,7,8-трикарбоновая кислота, характеризующийся следующей структурной формулой:
2. Применение соединения по п. 1 в качестве люциферина.
3. Соединение 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-9H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновая кислота, характеризующееся следующей структурной формулой:
или его таутомер - 7-(карбоксикарбонил)-4-гидрокси-5-(сульфоокси)-7H-тиено[3,2-f]тиохромен-1,8-дикарбоновая кислота, характеризующийся следующей структурной формулой:
4. Применение соединения по п. 3 в качестве предшественника соединения по п. 1.
5. Набор для детекции люциферазы в биологическом образце, включающий соединение по п. 1 и/или 3, также буфер, детергент, восстановительный агент и/или глицерин.
6. Набор по п. 5, в котором указанные компоненты содержатся в допустимых количествах.
7. Биолюминесцентная композиция, включающая соединение по п. 1 и/или 3 и люциферазу.
8. Композиция по п. 7, в которой люцифераза является рекомбинантной.
9. Композиция по п. 7, в которой люцифераза представляет собой люциферазу червя Odontosyllis undecimdonta.
10. Способ детекции люциферазы в биологическом образце, включающем люциферазу, включающий следующие этапы:
а) добавление соединения по п. 1 и/или 3 к биологическому образцу для получения реакционной смеси;
б) инкубирование реакционной смеси в условиях, подходящих для возникновения биолюминесценции;
в) детектирование биолюминесценции в реакционной смеси, тем самым выявляя люциферазу.
11. Способ по п. 10, в котором люцифераза представляет собой люциферазу червя Odontosyllis undecimdonta.
12. Способ по п. 10, в котором люцифераза представляет собой рекомбинантную люциферазу.
13. Способ по п. 10, в котором биологический образец представляет собой ткань и/или клетку.
14. Способ по п. 10, в котором биологический образец характеризуется значением рН в диапазоне от 7 до 8.
15. Способ по п. 10, в котором концентрация соединения составляет 0,03 – 300 мкМ.
16. Способ детекции биолюминесценции в биологическом образце, который экспрессирует люциферазу, включающий следующие этапы:
а) экспрессию гена люциферазы в биологическом образце;
б) добавление соединения по п. 1 и/или 3 к биологическому образцу;
в) детектирование биолюминесценции.
17. Способ по п. 16, в котором люцифераза представляет собой рекомбинантную люциферазу.
18. Способ по п. 16, в котором люцифераза представляет собой люциферазу червя Odontosyllis undecimdonta.
19. Способ по п. 16, в котором биологический образец представляет собой ткань и/или клетку.
20. Способ по п. 16, в котором биологический образец характеризуется значением рН в диапазоне от 7 до 8.
21. Способ по п. 20, в котором концентрация соединения составляет 0,03 – 300 мкМ.
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2019125190A RU2744869C2 (ru) | 2019-08-08 | 2019-08-08 | Метод и реактивы для детекции активности люциферазы |
US17/633,843 US20220298540A1 (en) | 2019-08-08 | 2020-04-14 | Method and reagents for detecting luciferase activity |
PCT/RU2020/050074 WO2021025593A1 (ru) | 2019-08-08 | 2020-04-14 | Метод и реактивы для детекции активности люциферазы |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2019125190A RU2744869C2 (ru) | 2019-08-08 | 2019-08-08 | Метод и реактивы для детекции активности люциферазы |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2019125190A3 RU2019125190A3 (ru) | 2021-02-08 |
RU2019125190A RU2019125190A (ru) | 2021-02-08 |
RU2744869C2 true RU2744869C2 (ru) | 2021-03-16 |
Family
ID=74503577
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2019125190A RU2744869C2 (ru) | 2019-08-08 | 2019-08-08 | Метод и реактивы для детекции активности люциферазы |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20220298540A1 (ru) |
RU (1) | RU2744869C2 (ru) |
WO (1) | WO2021025593A1 (ru) |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2199125C2 (ru) * | 1994-09-01 | 2003-02-20 | Дзе Секретэри Оф Стейт Фор Дефенс | Меченное люциферазой антитело и способ его получения, способ осуществления анализа на специфическое связывание и набор для применения в анализе на специфическое связывание |
WO2004027378A2 (en) * | 2002-09-20 | 2004-04-01 | Promega Corporation | Luminescence-based methods and probes for measuring cytochrome p450 activity |
US7910087B2 (en) * | 2007-03-02 | 2011-03-22 | University Of Massachusetts | Luciferins |
RU2596398C1 (ru) * | 2015-02-25 | 2016-09-10 | Закрытое акционерное общество "ЕВРОГЕН" | Метод и реактивы для детекции активности люциферазы |
RU2674894C2 (ru) * | 2017-01-30 | 2018-12-13 | Общество с ограниченной ответственностью "ПЛАНТА" | Новые люциферазы и способы их использования |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5283179A (en) * | 1990-09-10 | 1994-02-01 | Promega Corporation | Luciferase assay method |
EP2222870B1 (en) * | 2007-10-29 | 2012-06-27 | PerkinElmer Health Sciences B.V. | Methods, reagents and kits for luciferase assay |
-
2019
- 2019-08-08 RU RU2019125190A patent/RU2744869C2/ru active
-
2020
- 2020-04-14 WO PCT/RU2020/050074 patent/WO2021025593A1/ru active Application Filing
- 2020-04-14 US US17/633,843 patent/US20220298540A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2199125C2 (ru) * | 1994-09-01 | 2003-02-20 | Дзе Секретэри Оф Стейт Фор Дефенс | Меченное люциферазой антитело и способ его получения, способ осуществления анализа на специфическое связывание и набор для применения в анализе на специфическое связывание |
WO2004027378A2 (en) * | 2002-09-20 | 2004-04-01 | Promega Corporation | Luminescence-based methods and probes for measuring cytochrome p450 activity |
US7910087B2 (en) * | 2007-03-02 | 2011-03-22 | University Of Massachusetts | Luciferins |
RU2596398C1 (ru) * | 2015-02-25 | 2016-09-10 | Закрытое акционерное общество "ЕВРОГЕН" | Метод и реактивы для детекции активности люциферазы |
RU2674894C2 (ru) * | 2017-01-30 | 2018-12-13 | Общество с ограниченной ответственностью "ПЛАНТА" | Новые люциферазы и способы их использования |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2019125190A3 (ru) | 2021-02-08 |
RU2019125190A (ru) | 2021-02-08 |
WO2021025593A1 (ru) | 2021-02-11 |
US20220298540A1 (en) | 2022-09-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4958388B2 (ja) | 発光性化合物に関する組成物、方法並びにキット | |
EP1295121B1 (en) | A bioluminescence resonance energy transfer (bret) system with broad spectral resolution between donor and acceptor emission wavelengths and its use | |
GB2479847A (en) | Coelenterazine analogs and manufacturing method thereof | |
US20240018566A1 (en) | Method and agents for detecting luciferase activity | |
Masuda et al. | A novel yellowish-green fluorescent protein from the marine copepod, Chiridius poppei, and its use as a reporter protein in HeLa cells | |
US7795397B2 (en) | Red and near infrared flourescent phyotochrome | |
JP2008054689A (ja) | 単離されたルシフェラーゼおよびその使用 | |
WO2004018671A1 (ja) | 色素蛋白質及び蛍光蛋白質 | |
US6884620B2 (en) | Humanized polynucleotide sequence encoding Renilla mulleri green fluorescent protein | |
AU2008213387A1 (en) | Secreted luciferase MLuc7 and use thereof | |
RU2744869C2 (ru) | Метод и реактивы для детекции активности люциферазы | |
US20070275377A1 (en) | Isolated Photoprotein mtClytin, and Use Thereof | |
WO2003104461A1 (ja) | 色素蛋白質 | |
WO2003104460A1 (ja) | 色素蛋白質 | |
WO2022010386A1 (ru) | Применение кофактора f o и его аналогов в качестве компонента биолюминесцентной реакции | |
WO2021262043A1 (ru) | Метод и реактивы для детекции активности люциферазы | |
US20020064842A1 (en) | Renilla reniformis green fluorescent protein and mutants thereof | |
WO2001064843A1 (en) | Renilla reniformis green fluorescent protein and mutants thereof | |
Patterson | Fluorescent proteins for cell biology | |
Ruchkin et al. | The two key substitutions in the chromophore environment of mKate2 to produce an enhanced FusionRed-like red fluorescent protein | |
Choi et al. | Generation of a fast maturating red fluorescent protein by a combined approach of elongation mutagenesis and functional salvage screening | |
WO2024089297A1 (en) | Novel fluorescent and bioluminescent proteins and reporter systems for ratiometric measurement of luminescence | |
US20090203888A1 (en) | Isolated Photoprotein Aqdecay, and Its Use | |
US20070042375A1 (en) | Isolated berovin photoprotein and use thereof | |
Rusanov et al. | Role of pH in the appearance of the fluorescent state of chromo protein asCP595 and its mutant KFP |