JP5863338B2 - プラスミド型ベクター、遺伝子プロモーター活性の検出方法、及びアッセイキット - Google Patents
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Description
図1は、本実施形態に係る自己増幅型レポーターベクターであるプラスミド型ベクター1の構造を模式的に示す図である。図1に示すように、本実施形態に係るプラスミド型ベクター1は、検出対象となる遺伝子プロモーター10を有している。検出対象となる遺伝子プロモーター10の下流には、転写及び翻訳のための塩基配列20が配置されている。塩基配列20は、レポーター遺伝子21と内部リボゾーム結合配列(IRES:internal ribosome entry site)23と複製開始蛋白質遺伝子25と転写終結シグナル配列27とを含んでいる。レポーター遺伝子21と複製開始蛋白質遺伝子25との間にIRES23が配置されている。複製開始蛋白質遺伝子25の下流に転写終結シグナル配列27が配置されている。また、プラスミド型ベクター1は、レポーター遺伝子21や複製開始蛋白質遺伝子25を通る側の遺伝子プロモーター10と転写終結シグナル配列27との間以外の部位に複製開始配列30を有している。なお、IRES23の上流にレポーター遺伝子21が配置され、下流に複製開始蛋白質遺伝子25が配置されるとしたが、本実施形態はこれに限定されない。例えば、IRES23の上流に複製開始蛋白質遺伝子25が配置され、下流にレポーター遺伝子21が配置されてもよい。この場合、レポーター遺伝子21の下流に転写終結シグナル配列27が配置されるとよい。
本実施形態に係る遺伝子プロモーター10の活性の検出方法(レポータージーンアッセイ)は、本実施形態に係るプラスミド型ベクター(自己増幅型レポーターベクター)1を使用して、検出対象となる遺伝子プロモーター10の活性を検出する。
本実施形態に係るアッセイキットは、本実施形態に係るレポータージーンアッセイにおいて使用される。
1.プラスミド型ベクターの塩基配列
次に、ヒトやサルなどの霊長類の細胞を宿主細胞とする場合を具体例に挙げて、本実施形態に係るプラスミド型ベクターについて説明する。この具体例に係るプラスミド型ベクター1として、pCMV−Luc−IRES−LTを採用する。このpCMV−Luc−IRES−LTの複製開始蛋白質遺伝子25としてSV40のLT遺伝子を、複製開始配列30としてLT遺伝子の翻訳産物であるLT蛋白質が認識可能な塩基配列を採用する。また、pCMV−Luc−IRES−LTの遺伝子プロモーター10としてサイトメガロウイルスのプロモーターを、レポーター遺伝子21としてホタルのルシフェラーゼ遺伝子を、IRES23として脳心筋炎ウイルスのIRESを、転写終結シグナル配列27として牛成長ホルモン遺伝子の転写終結シグナル配列を採用する。
次に、プラスミド型ベクターpCMV−Luc−IRES−LTの作製方法について説明する。図3は、プラスミド型ベクターpCMV−Luc−IRES−LTの作製方法の典型的な流れを模式的に示す図である。
ヒト肝がん細胞(Huh−7)に、pCMV−Luc−IRES−LTとpCMV−Lucとを導入する。上述のように、pCMV−Lucは、pCMV−Luc−IRES−LTに対するネガティブコントロール用のベクターとして導入される。
上記の3と同様の方法で、Huh−7細胞に、同コピー数のpCMV−Luc−IRES−LTとpCMV−Lucとを導入した。リポフェクションから72時間後、Dneasyキット(Qiagen)を使用して細胞からDNAを抽出した。DNAの抽出操作は、キットのマニュアルに従った。抽出されたDNA溶液200μlのうち、1.0μlを鋳型としてPCRをおこない、pCMV−Luc−IRES−LT、或いはpCMV−Lucの部分塩基配列を増幅した。PCRに使用したプライマーの塩基配列を以下に示す。
5’−CGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCC−3’
リバースプライマー:
5’−CCAGCATGCCTGCTATTGTCTTCCC−3’
PCR反応後のDNA溶液を、0.8%のアガロースゲルで電気泳動した。電気泳動後、DNA溶液を含むゲルをエチジウムブロマイドにより染色し、染色されたゲルの写真を撮影した。そして、エチジウムブロマイド染色写真に描出されたバンドの染色強度を画像解析ソフトウェア(ImageJ)で数値化した。
上記の3と同様の方法で、Huh−7細胞とサル腎がん細胞(CV−1)とのそれぞれに、同コピー数のpCMV−Luc−IRES−LTとpCMV−Lucとをリポフェクション法により導入し、培養プレートで培養した。リポフェクションから72時間後に、培養プレートから培地を取り除き、各細胞をPBSで2回洗浄してから、細胞からルシフェラーゼ(レポーター蛋白質)を抽出するための抽出試薬である細胞溶解液(PicaGene Cell lysis buffer LCβ,TOYO B−Net社)を添加した。室温で15分間に亘って細胞と細胞溶解液との縣濁液をインキュベートした後、角速度15,000rpmで5分間に亘って縣濁液を遠心分離器で遠心分離することによって、縣濁液から細胞残渣を取り除いた。そして、細胞残渣が取り除かれた縣濁液の上清にルシフェラーゼ基質溶液(PicaGene LT2.0,TOYO B−Net社)を加えた後、検出試薬であるルシフェラーゼ基質溶液(ルシフェリン溶液)が加えられた上清の発光強度をルミノメーター(Mithras LB940,Berthold社)で測定した。
上記の3と同様の方法で、サル腎がん細胞(CV−1)に、同コピー数のpCMV−Luc−IRES−LTとpCMV−Luc−IRES−LT−E107KとpCMV−Luc−IRES−LT−D402EとpCMV−Lucとをリポフェクション法により導入し、培養プレートで培養した。リポフェクションから72時間後に、培養プレートから培地を取り除き、各細胞をPBSで2回洗浄してから、細胞からルシフェラーゼ(レポーター蛋白質)を抽出するための抽出試薬である細胞溶解液(PicaGene Cell lysis buffer LCβ,TOYO B−Net社)を添加した。室温で15分間に亘って細胞と細胞溶解液との縣濁液をインキュベートした後、角速度15,000rpmで5分間に亘って縣濁液を遠心分離器で遠心分離することによって、縣濁液から細胞残渣を取り除いた。そして、細胞残渣が取り除かれた縣濁液の上清にルシフェラーゼ基質溶液(PicaGene LT2.0,TOYO B−Net社)を加えた後、検出試薬であるルシフェラーゼ基質溶液(ルシフェリン溶液)が加えられた上清の発光強度をルミノメーター(Mithras LB940,Berthold社)で測定した。
上述のように、本実施形態に係るプラスミド型ベクター1は、検出対象となる遺伝子プロモーター10、レポーター遺伝子21、IRES23、複製開始蛋白質遺伝子25、転写終結シグナル配列27、及び複製開始配列30を有している。レポーター遺伝子21、IRES23、複製開始蛋白質遺伝子25、及び転写終結シグナル配列27は、遺伝子プロモーター10の下流に配置される。IRES23は、レポーター遺伝子21と複製開始蛋白質遺伝子25とを連結している。従って、プラスミド型ベクター1が遺伝子プロモーター10の活性化条件を満たす宿主細胞に導入された場合、遺伝子プロモーター10の活性化に伴ってプラスミド型ベクター1が複製を繰り返しながら、個々のプラスミド型ベクター1においてレポーター蛋白質が合成される。従って、従来の非増幅型レポーターベクターに比して、本実施形態に係るプラスミド型ベクター1は、遺伝子プロモーター10の活性に起因して合成されるレポーター蛋白質の発現量、すなわち、測定シグナルの発現量を増大させることができる。また、本実施形態に係るプラスミド型ベクター1は、プラスミドを利用しているので、ウイルスを利用したベクターに比して、感染等の危険性がなく、取り扱いが簡便である。
Claims (21)
- プラスミド型ベクターを被検細胞に導入し、
前記プラスミド型ベクターに含まれる遺伝子プロモーターの活性に伴って前記プラスミド型ベクターが増幅可能なように、前記被検細胞が***して増殖する条件下で前記被検細胞を培養し、
培養された前記被検細胞内での前記プラスミド型ベクターに含まれるレポーター遺伝子の発現量を測定し、その結果に基づいて、前記被検細胞の状態または環境を判定すること
を具備し、
前記プラスミド型ベクターが、
検出されるべき特定の状態または特定の環境にある当該被検細胞において活性化される、前記被検細胞に由来する遺伝子プロモーターと、
前記遺伝子プロモーターの下流に配置された、前記遺伝子プロモーターの活性を可視化するためのレポーター蛋白質をコードする第1の遺伝子と、
前記遺伝子プロモーターの下流に配置された、複製開始蛋白質をコードする第2の遺伝子と、
前記第1の遺伝子と前記第2の遺伝子との間に配置された内部リボゾーム結合配列と、
前記第1の遺伝子と前記第2の遺伝子との転写を終結するためのシグナルをコードする転写終結シグナル配列と、
前記複製開始蛋白質により認識される複製開始配列と
を備える被検細胞の状態または環境を判定する方法。 - さらに、請求項1に記載の方法によって、前記被検細胞が由来する哺乳類対象についての情報を得ることを特徴とする被検細胞が由来する哺乳類対象についての情報を得る方法。
- 前記第2の遺伝子は、シミアン・ウイルス40のラージT抗原遺伝子であり、
前記複製開始配列は、シミアン・ウイルス40の複製開始配列である
請求項1または2に記載の方法。 - 前記第2の遺伝子は、配列番号1、配列番号2、配列番号3または配列番号4に記載の塩基配列からなる遺伝子である請求項1〜3の何れか1項に記載の方法。
- 前記第2の遺伝子は、エプスタイン・バー・ウイルスのEBNA−1遺伝子であり、
前記複製開始配列は、エプスタイン・バー・ウイルスの複製開始配列である
請求項1または2に記載の方法。 - 前記第2の遺伝子は、マウス・ポリオーマ・ウイルスのラージT抗原遺伝子であり、
前記複製開始配列は、マウス・ポリオーマ・ウイルスの複製開始配列である
請求項1または2に記載の方法。 - 前記被検細胞は、ヒト、サル、マウスまたはラット由来の細胞である請求項1〜6の何れか1項に記載の方法。
- 前記レポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、青色蛍光蛋白質遺伝子、緑色蛍光蛋白質遺伝子または赤色蛍光蛋白質遺伝子であり、
前記測定することは、前記発現量として、前記レポーター遺伝子の翻訳産物の発光量または蛍光量を、光学検出装置を利用して測定することである
請求項1〜7の何れか1項に記載の方法。 - 前記第レポーター遺伝子は、一酸化窒素合成酵素遺伝子、またはキサンチンオキシダーゼ遺伝子であり、
前記測定することは、前記発現量として、前記レポーター遺伝子の翻訳産物により生成される活性酸素量を電子スピン共鳴装置を利用して測定することである
請求項1〜7の何れか1項に記載の方法。 - 前記レポーター遺伝子は、重金属結合蛋白質遺伝子であり、
前記測定することは、前記発現量として、前記レポーター遺伝子の翻訳産物に結合した重金属量を、磁気共鳴イメージング装置、核医学診断装置、またはX線コンピュータ断層撮影装置を利用して測定することである
請求項1〜7の何れか1項に記載の方法。 - 被検細胞の状態若しくは環境を判定するためプラスミド型ベクターであって、
検出されるべき特定の状態または特定の環境にある当該被検細胞において活性化される、前記被検細胞に由来する遺伝子プロモーターと、
前記遺伝子プロモーターの下流にある、前記遺伝子プロモーターの活性を可視化するためのレポーター蛋白質をコードする第1の遺伝子と、
前記遺伝子プロモーターの下流にある、複製開始蛋白質をコードする第2の遺伝子と、
前記第1の遺伝子と前記第2の遺伝子との間にある内部リボゾーム結合配列と、
前記第1の遺伝子と前記第2の遺伝子との転写を終結するためのシグナルをコードする転写終結シグナル配列と、
前記複製開始蛋白質により認識される複製開始配列と、
を具備するプラスミド型ベクター。 - 被検細胞が由来する哺乳類対象についての情報を得るためのベクターであって、
検出されるべき特定の状態または特定の環境にある当該被検細胞において活性化される、前記被検細胞に由来する遺伝子プロモーターと、
前記遺伝子プロモーターの下流にある、前記遺伝子プロモーターの活性を可視化するためのレポーター蛋白質をコードする第1の遺伝子と、
前記遺伝子プロモーターの下流にある、複製開始蛋白質をコードする第2の遺伝子と、
前記第1の遺伝子と前記第2の遺伝子との間にある内部リボゾーム結合配列と、
前記第1の遺伝子と前記第2の遺伝子との転写を終結するためのシグナルをコードする転写終結シグナル配列と、
前記複製開始蛋白質により認識される複製開始配列と、
を具備するプラスミド型ベクター。 - 前記第2の遺伝子は、シミアン・ウイルス40のラージT抗原遺伝子であり、
前記複製開始配列は、シミアン・ウイルス40の複製開始配列である
請求項11または12に記載のベクター。 - 前記第2の遺伝子は、配列番号1、配列番号2、配列番号3または配列番号4に記載の塩基配列からなる遺伝子である請求項11〜13の何れか1項に記載のベクター。
- 前記第2の遺伝子は、エプスタイン・バー・ウイルスのEBNA−1遺伝子であり、
前記複製開始配列は、エプスタイン・バー・ウイルスの複製開始配列である
請求項11または12に記載のベクター。 - 前記第2の遺伝子は、マウス・ポリオーマ・ウイルスのラージT抗原遺伝子であり、
前記複製開始配列は、マウス・ポリオーマ・ウイルスの複製開始配列である
請求項11または12に記載のベクター。 - 前記第1の遺伝子は、ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、一酸化窒素合成酵素遺伝子、キサンチンオキシダーゼ遺伝子、青色蛍光蛋白質遺伝子、緑色蛍光蛋白質遺伝子、赤色蛍光蛋白質遺伝子または重金属結合蛋白質遺伝子である請求項11〜16の何れか1項に記載のベクター。
- 被検細胞の状態若しくは環境を判定するためのアッセイキットであって、
請求項11〜17の何れか1項に記載のプラスミド型ベクターと、
前記被検細胞における、前記プラスミド型ベクターに含まれる前記レポーター蛋白質をコードする遺伝子の発現を検出するための試薬と
を具備するアッセイキット。 - 前記被検細胞が由来する哺乳類対象についての情報を得るためのアッセイキットであって、
請求項11〜17の何れか1項に記載のプラスミド型ベクターと、
前記被検細胞における、前記プラスミド型ベクターに含まれる前記レポーター蛋白質をコードする遺伝子の発現を検出するための試薬と
を具備するアッセイキット。 - 前記プラスミド型ベクターを前記被検細胞に導入するための試薬をさらに具備する請求項18または19に記載のアッセイキット。
- 前記被検細胞からレポーター蛋白質を抽出するための試薬をさらに具備する請求項18または19に記載のアッセイキット。
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