JP5863338B2 - プラスミド型ベクター、遺伝子プロモーター活性の検出方法、及びアッセイキット - Google Patents

Description

本発明の実施形態は、プラスミド型ベクター、遺伝子プロモーター活性の検出方法、及びアッセイキットに関する。

ヒトゲノムの塩基配列が決定されて以降、ゲノム情報を基盤とした疾患の新しい診断法の開発が期待されている。例えば、ゲノムの塩基配列情報に基づく遺伝子解析から、癌をはじめとする多くの疾患関連遺伝子が発見されている。これらの疾患関連遺伝子や疾患関連蛋白質は、癌などの疾患の診断用バイオマーカーとして注目されている。しかしながら、バイオマーカー検出による診断は、疾患の早期には必ずしも十分なバイオマーカーの発現が得られないなどの原因により、安定した結果が得られないのが現状である。

疾患の早期診断は、治癒率の向上や患者の負担軽減の点からも、今後の医療において不可欠である。早期診断の一つのアプローチとして、疾患の早期に発現する遺伝子のプロモーター活性の変化を検出する方法が挙げられる。遺伝子プロモーターの活性が変化することにより、遺伝子の発現確率が制御される。遺伝子プロモーターの活性は、疾患関連遺伝子や疾患関連蛋白質の発現よりも早期に観察される。

細胞内における遺伝子プロモーターの活性を検出する方法としては、レポータージーンアッセイが挙げられる。レポータージーンアッセイは、プロモーターの活性を可視化するためのレポーター遺伝子を連結した発現カセットを当該プロモーターの下流に組み込んだレポーターベクターを、被検細胞に導入してレポーター蛋白質の活性をもとに当該プロモーターの活性を定量化する方法である。レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子やβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、蛍光蛋白質遺伝子などが採用されている。

しかしながら、例えば、疾患早期においては、遺伝子プロモーターの活性が変化して前疾患化の状態にある細胞はごく少数であり、診断のために採取した血液や組織に当該細胞が含まれる確率は高いとはいえない。このため、疾患の早期診断などには、高感度な検出技術が求められる。

Ｋｏｊｉｍａ Ｔ．、ＪＣＬ、２００９年、第１１９巻、ｐ３１７２−８１

現在、高感度なレポータージーンアッセイとしては、遺伝子プロモーターと蛍光蛋白質とをウイルスのゲノムに組み込んだウイルス型レポーターベクターによる方法が報告されている。このレポータージーンアッセイでは、ウイルスベクターを感染させた宿主細胞の内部で当該ウイルスベクターを増殖させ、蛍光蛋白質の発現量を増やすことにより、レポータージーンアッセイを高感度化している。しかしながら、ウイルス型レポーターベクターは、ウイルスを使用するので、その取り扱いが簡便ではなく、操作者に感染の危険性があるなど安全性にも課題が残る。

一方、プラスミド型レポーターベクターは、ウイルス型レポーターベクターよりも取り扱いが簡便で、かつ感染性も持たず安全性が高いベクターである。プラスミド型レポーターベクターを使用したレポータージーンアッセイも多数報告されており、疾患の早期診断への適用も期待されている。しかしながら、プラスミド型ベクターは、ウイルス型レポーターベクターと違って宿主細胞の内部で増殖しないので、その検出感度に問題がある。

実施形態の目的は、遺伝子プロモーターの活性を高感度に検出可能なプラスミド型ベクター、遺伝子プロモーターの検出方法、及びアッセイキットを提供することにある。

本実施形態に係るプラスミド型ベクターは、遺伝子プロモーター、第１の遺伝子、第２の遺伝子、内部リボゾーム結合配列、転写終結シグナル配列、及び複製開始配列を有する。第１の遺伝子は、遺伝子プロモーターの下流に配置され、遺伝子プロモーターの活性を可視化するためのレポーター蛋白質をコードする。第２の遺伝子は、遺伝子プロモーターの下流に配置され、複製開始蛋白質をコードする。内部リボゾーム結合配列は、第１の遺伝子と第２の遺伝子との間に配置される。転写終結シグナル配列は、第１の遺伝子と第２の遺伝子との転写を終結するためのシグナルをコードする。複製開始配列は、複製開始蛋白質により認識される。

本実施形態に係るプラスミド型ベクターの構造を模式的に示す図。 図１のプラスミド型ベクターを使用した、遺伝子プロモーター活性の検出方法（レポータージーンアッセイ）の全体像を示す図。 本実施形態に係るプラスミド型ベクターｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴの作製方法の典型的な流れを模式的に示す図。 本実施形態の実施例に係るｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴとｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴ−Ｅ１０７ＫとｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴ−Ｄ４０２Ｅとの構造を模式的に示す図。 本実施形態に係るネガティブコントロール用のベクターｐＣＭＶ−Ｌｕｃの作製方法の典型的な流れを模式的に示す図。 本実施形態の実施例に係るｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴとｐＣＭＶ−ＬｕｃとにおけるＬＴ蛋白質の発現量の検出結果を示す図。 本実施形態の実施例に係るｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴとｐＣＭＶ−Ｌｕｃとのコピー数の比較結果を示す図。 本実施形態の実施例に係るｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴとｐＣＭＶ−Ｌｕｃとのレポーター蛋白質の発光シグナルの検出結果を示す図。 本実施形態の実施例に係るｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴとｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴ−Ｅ１０７ＫとｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴ−Ｄ４０２ＥとのｐＣＭＶ−Ｌｕｃに対するレポーター蛋白質のシグナル強度の比較結果を示す図。 従来例に係る非増幅型のレポーターベクターを使用した、遺伝子プロモーター活性の検出方法の全体像を示す図。

以下、図面を参照しながら本実施形態に係わるプラスミド型ベクター、遺伝子プロモーターの検出方法、及びアッセイキットを説明する。

本実施形態に係るプラスミド型ベクターは、検出対象の遺伝子プロモーターが活性化している宿主細胞で特異的に自己増幅することにより、検出シグナルを増強するプラスミド型のレポーターベクターである。

［プラスミド型ベクターの構造］
図１は、本実施形態に係る自己増幅型レポーターベクターであるプラスミド型ベクター１の構造を模式的に示す図である。図１に示すように、本実施形態に係るプラスミド型ベクター１は、検出対象となる遺伝子プロモーター１０を有している。検出対象となる遺伝子プロモーター１０の下流には、転写及び翻訳のための塩基配列２０が配置されている。塩基配列２０は、レポーター遺伝子２１と内部リボゾーム結合配列（ＩＲＥＳ：internal ribosome entry site）２３と複製開始蛋白質遺伝子２５と転写終結シグナル配列２７とを含んでいる。レポーター遺伝子２１と複製開始蛋白質遺伝子２５との間にＩＲＥＳ２３が配置されている。複製開始蛋白質遺伝子２５の下流に転写終結シグナル配列２７が配置されている。また、プラスミド型ベクター１は、レポーター遺伝子２１や複製開始蛋白質遺伝子２５を通る側の遺伝子プロモーター１０と転写終結シグナル配列２７との間以外の部位に複製開始配列３０を有している。なお、ＩＲＥＳ２３の上流にレポーター遺伝子２１が配置され、下流に複製開始蛋白質遺伝子２５が配置されるとしたが、本実施形態はこれに限定されない。例えば、ＩＲＥＳ２３の上流に複製開始蛋白質遺伝子２５が配置され、下流にレポーター遺伝子２１が配置されてもよい。この場合、レポーター遺伝子２１の下流に転写終結シグナル配列２７が配置されるとよい。

以下、プラスミド型ベクター１に含まれる個々の要素について詳細に説明する。

検出対象の遺伝子プロモーター１０は、ＲＮＡポリメラーゼの結合配列を有する塩基配列である。遺伝子プロモーター１０は、ＲＮＡポリメラーゼの結合配列に機能的に連結された遺伝子の転写を活性化する。遺伝子プロモーター１０は、目的に応じて任意の遺伝子プロモーターに選択されればよい。例えば、疾患の早期診断が目的であれば、遺伝子プロモーター１０として、疾患の早期に活性化している任意の疾患関連遺伝子プロモーターを用いることができる。具体的には、疾患が癌の場合、遺伝子プロモーター１０として、ｃ−ｆｏｓやｃ−ｍｙｃ、ＣＤ１３、ＣＤ９０、Ｓｎａｉｌ、薬物耐性トランスポーター遺伝子（ＡＢＣＧ、ＭＤＲ）等の遺伝子プロモーターなどが利用可能である。環境刺激、例えば、有害化学物質、温度、酸化ストレスの検出が目的であれば、遺伝子プロモーター１０として、対象となる環境刺激に反応して活性化する遺伝子プロモーターを用いることができる。具体的には、環境刺激が有害化学物質の場合、検出対象の遺伝子プロモーター１０として、チトクロムｐ４５０の遺伝子プロモーターなどが利用可能である。なお、遺伝子プロモーター１０は、任意のエンハンサーを含んでよい。エンハンサーは、遺伝子プロモーター１０に連結された塩基配列である。エンハンサーは、遺伝子プロモーター１０による遺伝子の転写の活性化を増強する機能を有する。

レポーター遺伝子２１は、レポーター蛋白質をコードする遺伝子（塩基配列）である。レポーター遺伝子２１は、遺伝子プロモーター１０の活性を可視化する役割を有する。レポーター遺伝子２１としては、当該技術分野において既知のあらゆるレポーター遺伝子が適用可能である。レポーター遺伝子２１としては、その翻訳産物であるレポーター蛋白質の活性を簡単に測定でき、測定バックグラウンドの低いものが好ましい。具体的には、レポーター遺伝子２１として、発光蛋白質遺伝子や、蛍光蛋白質遺伝子、発色蛋白質遺伝子、活性酸素生成酵素遺伝子、重金属結合蛋白質遺伝子等が挙げられる。レポーター遺伝子２１は、レポーター蛋白質の検出装置に応じて適宜選択可能である。

複製開始蛋白質遺伝子２５は、複製開始蛋白質をコードする遺伝子である。複製開始蛋白質は、宿主細胞において、ＤＮＡの複製開始に機能しうる蛋白質である。複製開始蛋白質としては、例えば、宿主細胞に感染して増幅するウイルスに由来する蛋白質でも、宿主細胞と同じ或いは異なる動物種の蛋白質でもよい。

ＩＲＥＳ２３は、レポーター遺伝子２１の翻訳産物であるレポーター蛋白質と複製開始蛋白質遺伝子２５の翻訳産物である複製開始蛋白質とを個別に合成可能にレポーター遺伝子２１と複製開始蛋白質遺伝子２５とを単一のｍＲＮＡ（バイシストロニックなｍＲＮＡ）に転写するための塩基配列である。より詳細には、ＩＲＥＳ２３は、哺乳類細胞において、ｍＲＮＡの５’末端キャップ構造に依存せずに、ｍＲＮＡの内部にリボゾームを結合させて蛋白質の翻訳を開始させる塩基配列である。ＩＲＥＳ２３が２つの遺伝子の間に配置されることにより、バイシストロニックなｍＲＮＡが合成される。すなわち、ＩＲＥＳ２３が２つの遺伝子の間に組み込まれることで、この２つの遺伝子がコードする２種類の蛋白質を1つのｍＲＮＡで翻訳させることができる。例えば、ＩＲＥＳ２３としては、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）のＩＲＥＳなどが挙げられる。本実施形態に係るＩＲＥＳ２３は、レポーター遺伝子２１と複製開始蛋白質遺伝子２５との間に配置され、レポーター遺伝子２１と複製開始蛋白質遺伝子２５とを連結する。従って、１つのバイシストロニックなｍＲＮＡからレポーター蛋白質と複製開始蛋白質とが翻訳される。

転写終結シグナル配列２７は、上流のレポーター遺伝子２１と複製開始蛋白質遺伝子２５との転写を終結するためのシグナルをコードする塩基配列である。転写終結シグナル配列２７は、哺乳動物の遺伝子の転写終結に機能するものであればよい。例えば、転写終結シグナル配列２７としては、シミアン・ウイルス４０（ＳＶ４０）の後期ポリ（Ａ）付加シグナル配列や、牛成長ホルモン遺伝子のポリ（Ａ）付加シグナル配列などが挙げられる。ただし、本実施形態において使用可能な転写終結シグナル配列２７は、これに限定されるものではなく、転写終結シグナルとしての機能を損なわない限りにおいては、遺伝子配列を改変したものを用いてもよい。

複製開始配列３０は、複製開始蛋白質遺伝子２５の発現により合成される複製開始蛋白質により認識可能な塩基配列である。複製開始蛋白質遺伝子２５の発現により合成される複製開始蛋白質が複製開始配列３０を認識し、結合することで、プラスミド型ベクター１の複製が開始される。複製開始配列３０は、複製開始蛋白質の生物種と同じ源または異なる源に由来してよい。

例えば、ヒトやサルなどの霊長類の細胞にプラスミド型ベクター１を導入する場合、複製開始蛋白質遺伝子２５としてＳＶ４０のラージＴ抗原（ＬＴ）遺伝子が、複製開始配列３０としてＳＶ４０のｏｒｉ配列が適用可能である。あるいは、ヒトやサルなどの霊長類の細胞にプラスミド型ベクター１を導入する場合、複製開始蛋白質遺伝子２５としてエプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）のＥＢＮＡ−１蛋白質が、複製開始配列３０としてＥＢウイルス潜在複製起点(ｏｒｉＰ)が適用可能である。また、マウスなどのげっ歯類の細胞にプラスミド型ベクター１を導入する場合、複製開始蛋白質遺伝子２５としてマウス・ポリオーマ・ウイルス（ＰｙＶ）のラージＴ抗原（ＬＴ）遺伝子が、複製開始配列３０としてＰｙＶコア起点配列が適用可能である。

上述のように、本実施形態に係るプラスミド型ベクター１は、レポーター遺伝子２１と複製開始蛋白質２５と複製開始配列３０とを同一のベクター内に含んでいる。これにより、本実施形態に係るプラスミド型ベクター１は、自己増幅型のレポーターベクターとして機能する。

［遺伝子プロモーター活性の検出］
本実施形態に係る遺伝子プロモーター１０の活性の検出方法（レポータージーンアッセイ）は、本実施形態に係るプラスミド型ベクター（自己増幅型レポーターベクター）１を使用して、検出対象となる遺伝子プロモーター１０の活性を検出する。

図２は、本実施形態に係るプラスミド型ベクターを使用したレポータージーンアッセイの全体像を示す図である。

図２に示すように、まず、プラスミド型ベクター１は、宿主細胞に導入される。プラスミド型ベクター１を宿主細胞に導入する方法は、既知の細胞工学手法を用いればよい。例えば、プラスミド型ベクター１の宿主細胞の導入方法としては、生化学的方法や物理化学的方法がある。生化学的方法としては、カチオン脂質を用いるリポフェクション法や、磁性粒子を用いるマグネトフェクション法、塩化カルシウムを用いる方法などが挙げられる。物理化学的方法として、例えば、電気穿孔法などが挙げられる。プラスミド型ベクター１の宿主細胞への導入方法として、上述の生化学的方法や物理化学的方法を単独で用いるだけでなく、互いに組み合わせてもよい。例えば、生化学的な方法であるリポフェクション法とマグネトフェクション法とを組み合わせて用いてもよいし、生化学な方法であるリポフェクション法と物理化学的な方法である電気穿孔法とを組み合わせて用いてもよい。

プラスミド型ベクター１を宿主細胞に導入した後、宿主細胞が***して増殖しうる培養条件下において、宿主細胞を任意の期間に亘り培養する。この宿主細胞が***して増殖しうる培養条件がプラスミド型ベクター１を増幅可能な条件となる。この培養期間中において、宿主細胞の状態または宿主細胞がおかれている環境が遺伝子プロモーター１０に固有の活性化条件を満たしている場合、遺伝子プロモーター１０は活性化する。このように、活性化条件を満たしている宿主細胞（ターゲット細胞）において遺伝子プロモーター１０が活性化状態にある場合、ＩＲＥＳ２３で連結されたレポーター遺伝子２１と複製開始蛋白質遺伝子２５とは、バイシストロニックなｍＲＮＡに転写され、翻訳される。この転写と翻訳とにより、レポーター蛋白質（測定対象のシグナル）と複製開始蛋白質とが合成される。複製開始蛋白質は、複製開始配列３０を認識し、結合し、宿主細胞に含まれるＤＮＡ複製に係る複数の蛋白質（ＤＮＡ複製装置）をリクルートする。リクルートされた複数の蛋白質により、宿主細胞内においてプラスミド型ベクター１の複製が行われる。このようにして、プラスミド型ベクター１は、宿主細胞内において次々に複製を繰り返し、個体数を増幅させる。個体数の増幅に伴い、プラスミド型ベクター１により合成されるレポーター蛋白質の数も増加する。

一方、宿主細胞が遺伝子プロモーター１０の活性化条件を満たさない場合、遺伝子プロモーター１０は活性化しない。活性化条件を満たしていない宿主細胞（非ターゲット細胞）においてレポーター遺伝子２１と複製開始蛋白質遺伝子２５とは転写及び翻訳されないので、レポーター蛋白質と複製開始蛋白質とは合成されない。すなわち、非ターゲット細胞において測定シグナルは、不出である。また、複製開始蛋白質が合成されないので、プラスミド型ベクター１は、複製を行うことができない。

このように、本実施形態に係るプラスミド型ベクター１は、遺伝子プロモーター１０の活性化条件を満たす宿主細胞（ターゲット細胞）内に限定して自己増幅する。一方、図１０に示すように、複製開始蛋白質遺伝子と複製開始配列とを有さない従来型のプラスミド型ベクター（非増幅型レポーターベクター）は、ターゲット細胞内であっても自己増幅することができない。従って、本実施形態に係るプラスミド型ベクター１は、従来型のプラスミド型ベクターに比べて、ターゲット細胞におけるレポーター蛋白質、すなわち測定対象のシグナルを増加させることができる。これにより、レポータージーンアッセイの高感度化が可能となる。

以下に、レポーター蛋白質の発現量の検出について詳細に説明する。上述のように、レポーター遺伝子２１として、発光蛋白質遺伝子や、蛍光蛋白質遺伝子、発色蛋白質遺伝子、活性酸素生成酵素遺伝子、重金属結合蛋白質遺伝子等が選択可能である。

発光蛋白質遺伝子は、発光反応を触媒する酵素蛋白質をコードする遺伝子である。発光蛋白質遺伝子としては、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子が挙げられる。ルシフェラーゼ遺伝子の翻訳産物であるルシフェラーゼは、基質の一種であるルシフェリンを用いて発光反応をおこなう。

蛍光蛋白質遺伝子は、蛍光蛋白質をコードする遺伝子である。蛍光蛋白質遺伝子としては、例えば、青色蛍光蛋白質遺伝子、緑色蛍光蛋白質遺伝子、赤色蛍光蛋白質遺伝子が挙げられる。青色蛍光蛋白質遺伝子の翻訳産物である青色蛍光蛋白質は、青色の蛍光を発する。緑色蛍光蛋白質遺伝子の翻訳産物である緑色蛍光蛋白質は、緑色の蛍光を発する。赤色蛍光蛋白質遺伝子の翻訳産物である赤色蛍光蛋白質は、赤色の蛍光を発する。

発色蛋白質遺伝子は、発色反応を触媒する酵素蛋白質をコードする遺伝子である。発色蛋白質遺伝子としては、例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子が挙げられる。β−ガラクトシダーゼ遺伝子の翻訳産物であるβ−ガラクトシダーゼは、５−ブルモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）やｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）などの基質を用いて発色反応をおこなう。

発光蛋白質遺伝子や、蛍光蛋白質遺伝子、発色蛋白質遺伝子の翻訳産物は、光学検出装置により検出可能である。具体的には、レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子の場合、宿主細胞からルシフェラーゼ蛋白質を抽出して基質を加えた後に、ルミノメーターを用いて溶液の発光強度を測定すればよい。レポーター遺伝子が蛍光蛋白質遺伝子の場合、例えば、宿主細胞にレーザーを照射し、宿主細胞内において蛍光蛋白質から発生される蛍光の強度を蛍光測定装置により測定してもよい。或いは、レポーター遺伝子が蛍光蛋白質遺伝子の場合、宿主細胞から抽出した蛍光蛋白質を含む抽出液にレーザーを照射し、抽出液中の蛍光蛋白質から発生される蛍光の強度を蛍光測定装置により測定してもよい。レポーター遺伝子がβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の場合、β−ガラクトシダーゼ蛋白質を抽出して基質を加えた後に、吸光度測定装置を用いて溶液の吸光度を測定すればよい。

活性酸素生成酵素遺伝子は、活性酸素を生成する酵素をコードする遺伝子である。活性酸素生成酵素遺伝子としては、例えば、一酸化窒素合成酵素遺伝子やキサンチンオキシダーゼ遺伝子などが挙げられる。一酸化窒素合成酵素遺伝子の翻訳産物である一酸化窒素合成酵素とキサンチンオキシダーゼ遺伝子の翻訳産物であるキサンチンオキシダーゼとは、活性酸素を生成する。

活性酸素は、電子スピン共鳴装置（ＥＳＲ装置）などで検出することができる。ＥＳＲ装置による方法では、活性酸素の発生量を直接的に測定しても良いし、特異的なスピントラップ剤を利用して測定しても良い。スピントラップ剤を利用する場合、まず、活性酸素生成酵素をスピントラップ剤でトラップしてから、トラップされた活性酸素生成酵素から発生される活性酸素の発生量を測定する。

重金属結合蛋白質遺伝子は、重金属に特異的に結合する蛋白質をコードする遺伝子である。重金属に結合された蛋白質の発生量は、磁気共鳴イメージング装置（ＭＲＩ装置）や陽電子断層撮影装置（ＰＥＴ装置）や放射線断層撮影装置（ＣＴ装置）などの画像診断装置により測定可能である。重金属結合蛋白質の発生量は、例えば、以下のように行われる。まず、測定可能な重金属を予め宿主細胞の培養液に加える。次に、宿主細胞を洗浄したり、宿主細胞から重金属結合蛋白質を抽出したりする。次に、抽出された重金属結合蛋白質を、培養液に加えた重金属に対応した画像診断装置で撮像し、重金属結合蛋白質に関する画像を発生する。そして発生された画像に画像処理を施して重金属結合蛋白質の量を測定する。なお、重金属結合蛋白質は、宿主細胞の内部で発現させてもよいし、宿主細胞の外表面で発現させてもよい。

重金属結合蛋白質遺伝子として、例えば、鉄やガドリニウムあるいはその錯体化合物などの強磁性金属を結合する蛋白質をコードする遺伝子を利用する場合、画像診断装置としては、ＭＲＩ装置等の核磁気共鳴装置が良い。この場合、重金属結合蛋白質遺伝子として、上記の錯体化合物などの強磁性金属と特異的に結合する抗体遺伝子や一本鎖抗体遺伝子などでもよい。具体的には、重金属結合蛋白質遺伝子としては、鉄結合蛋白質であるフェリチンやトランスフェリン、あるいはガドリニウムに対して結合能を有する一本鎖抗体が適当である。

重金属結合蛋白質遺伝子として、例えば、ストロンチウムや銅、テクネチウム、ガリウム、あるいはそれらの錯体化合物などの放射性同位体金属を結合する蛋白質をコードする遺伝子を利用する場合、画像診断装置としては、ＰＥＴ装置やＣＴ装置等の放射線測定装置が良い。この場合、重金属結合蛋白質遺伝子として、上記の錯体化合物などの放射性同位体金属と特異的に結合する抗体遺伝子や一本鎖抗体遺伝子を用いてもよい。

このように本実施形態に係るレポータージーンアッセイによれば、プラスミド型ベクター１からのレポーター蛋白質の発現量を、レポーター蛋白質に応じた検出装置により測定することができる。そして、検出装置を利用した発現量の測定値と閾値との比較により、遺伝子プロモーター１０の活性の有無を検出することができる。例えば、発現量の測定値が閾値よりも大きい場合、遺伝子プロモーター１０の活性が検出されたとし、発現量の測定値が閾値よりも小さい場合、遺伝子プロモーター１０の活性が検出されないとするとよい。閾値は、遺伝子プロモーター１０やレポーター遺伝子２１、宿主細胞等に応じてユーザにより任意に設定可能である。

上述のように、遺伝子プロモーター１０は、検出対象に応じて任意に選択可能である。例えば、癌の診断の場合、遺伝子プロモーター１０として、例えば、ｃ−ｆｏｓやｃ−ｍｙｃ、ＣＤ１３、ＣＤ９０、Ｓｎａｉｌ、薬物耐性トランスポーター遺伝子（ＡＢＣＧ、ＭＤＲ）などの癌関連遺伝子の遺伝子プロモーターが用いられるとよい。これにより、癌細胞においてプラスミド型ベクター１が増幅し、レポーター蛋白質の発現量が増加するので、宿主細胞に含まれる癌細胞を高感度に検出することができる。他の例として、環境刺激の検出の場合、遺伝子プロモーター１０として、環境特異的なプロモーターが用いられるとよい。これにより、宿主細胞に化学物質や温度、酸化ストレスなどの所望の環境刺激を与えることにより、プラスミド型ベクター１が細胞内で増幅し、レポーター蛋白質の発現量が増加するので、環境刺激を高感度に検出することができる。

また、宿主細胞として使用できる細胞は、例えば、ヒトおよびサルを含む霊長類、マウスおよびラットを含むげっ歯類などに由来する細胞が適用可能である。また、これらの細胞として、株化細胞や初代培養細胞も適用可能である。霊長類に由来する株化細胞の例としては、ヒト肝癌に由来するＨｕｈ−７やＨｅｐＧ２、ヒト血球細胞に由来するＪｕｒｋａｔやＨＬ６０、ヒト乳癌に由来するＭＣＦ−７、サル腎臓に由来するＣＶ−１、或いはこれらのサブクローンや遺伝子改変細胞などが挙げられる。げっ歯類に由来する株化細胞の例としては、マウス肝癌に由来するＨｅｐａ−１、マウス神経芽腫に由来するＮｅｕｒｏ２ａ、ラット褐色細胞腫に由来するＰＣ１２、或いはこれらのサブクローンや遺伝子改変細胞などが挙げられる。初代培養細胞の例としては、肝臓や肺や腎臓などの消化器系、白血球などの循環器系、甲状腺などの内分泌系、或いは脳や脊髄などの脳神経系の器官に由来する初代培養細胞や組織幹細胞などが挙げられる。

本実施形態に係るレポータージーンアッセイに使用する宿主細胞は、プラスミド型ベクター１に組み込まれた複製開始蛋白質遺伝子２５と複製開始配列３０との種類に応じて選択されればよい。例えば、複製開始蛋白質遺伝子２５がＳＶ４０のＬＴ蛋白質遺伝子で、複製開始配列３０がＳＶ４０ｏｒｉの場合、或いは複製開始蛋白質遺伝子２５がＥＢＶのＥＢＮＡ−１蛋白質で、複製開始配列３０がＥＢＶのｏｒｉＰの場合、宿主細胞として、ヒトやサルなどの霊長類由来の細胞が選択されるとよい。また、複製開始蛋白質遺伝子２５がＰｙＶのＬＴ蛋白質で、複製開始配列３０がＰｙＶコア起点配列の場合、宿主細胞として、マウスなどのげっ歯類由来の細胞が選択されるとよい。

プラスミド型ベクター１と宿主細胞の動物種との組合せが正しければ、細胞の種類は特に限定されない。宿主細胞は、例えば、株化細胞や初代培養細胞でもよい。また、宿主細胞が由来する組織も特に限定されない。これは、検出対象となる遺伝子プロモーター１０の種類に応じて選択されればよい。

このように、本実施形態に係るプラスミド型ベクター１を用いることにより、高感度な遺伝プロモーター１０の活性の検出方法、すなわち高感度なレポータージーンアッセイを提供することが可能となる。

［アッセイキット］
本実施形態に係るアッセイキットは、本実施形態に係るレポータージーンアッセイにおいて使用される。

本実施形態に係るアッセイキットは、本実施形態に係るプラスミド型ベクター１と検出試薬とを有している。検出試薬は、細胞内のプラスミド型ベクター１に含まれるレポーター蛋白質をコードするレポーター遺伝子２１の発現を検出するための試薬である。また、本実施形態に係るアッセイキットは、さらに、導入試薬や抽出試薬を有していても良い。導入試薬は、プラスミド型ベクター１を細胞に導入するための試薬である。抽出試薬は、細胞からレポーター蛋白質を抽出するための試薬である。また、本実施形態に係るアッセイキットは、反応容器や培養容器を含んでいても良い。反応容器は、検出試薬や導入試薬、抽出試薬による反応を行うための容器である。培養容器は、プラスミド型ベクター１を培養するための容器である。さらに本実施形態に係るアッセイキットは、培養のための培地やバッファーを更に含んでもよい。

このように、本実施形態に係るアッセイキットは、本実施形態に係るレポータージーンアッセイにおいて使用されることにより、高感度に遺伝子プロモーター１０の活性を検出することが可能となる。

［実施例］
１．プラスミド型ベクターの塩基配列
次に、ヒトやサルなどの霊長類の細胞を宿主細胞とする場合を具体例に挙げて、本実施形態に係るプラスミド型ベクターについて説明する。この具体例に係るプラスミド型ベクター１として、ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴを採用する。このｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴの複製開始蛋白質遺伝子２５としてＳＶ４０のＬＴ遺伝子を、複製開始配列３０としてＬＴ遺伝子の翻訳産物であるＬＴ蛋白質が認識可能な塩基配列を採用する。また、ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴの遺伝子プロモーター１０としてサイトメガロウイルスのプロモーターを、レポーター遺伝子２１としてホタルのルシフェラーゼ遺伝子を、ＩＲＥＳ２３として脳心筋炎ウイルスのＩＲＥＳを、転写終結シグナル配列２７として牛成長ホルモン遺伝子の転写終結シグナル配列を採用する。

ＳＶ４０のＬＴ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１（野生型）に示す。ＬＴ遺伝子の塩基配列は、ＬＴ蛋白質のＤＮＡ複製開始の機能を失わない限りにおいては、配列番号１の塩基配列と完全に一致している必要はない。例えば、ＤＮＡ複製開始の機能を高める可能性がある任意の変異をＬＴ遺伝子の塩基配列に導入した変異型ＬＴ遺伝子を作製し、当該遺伝子をプラスミド型ベクター１に組み込んでもよい。このような変異型ＬＴ遺伝子の塩基配列の例を、配列表の配列番号２（変異型１）、配列番号３（変異型２）、及び配列番号４（変異型３）に示す。配列番号２に係る変異型ＬＴ遺伝子は、配列番号１に係るＬＴ遺伝子と比べて、３１９番目の塩基をグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）に置換し、３２１番目の塩基をアデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）に置換したものである。この塩基の置換により、配列番号２に係るＬＴ遺伝子の翻訳産物であるＬＴ蛋白質は、配列番号１に係るＬＴ遺伝子の翻訳産物であるＬＴ蛋白質と比べて、１０７番目のアミノ酸をグルタミン酸からリジンに置換したものとなる。当該変異は、ＬＴ蛋白質のＤＮＡ複製機能を損なうことなく、ＬＴ蛋白質とＲｂ蛋白質（癌化抑制機能を有する蛋白質）との相互作用を阻害するような変異の例である。配列番号３に係る変異型ＬＴ遺伝子は、配列番号１に係るＬＴ遺伝子と比べて、１２０６番目の塩基をチミン（Ｔ）からグアニン（Ｇ）に置換したものである。この塩基の置換により、配列番号３に係るＬＴ遺伝子の翻訳産物であるＬＴ蛋白質は、配列番号１に係るＬＴ遺伝子の翻訳産物であるＬＴ蛋白質と比べて、４０２番目のアミノ酸をアスパラギン酸からグルタミン酸に置換したものとなる。当該変異は、ＬＴ蛋白質のＤＮＡ複製機能を損なうことなく、ＬＴ蛋白質とｐ５３蛋白質（癌化抑制機能を有する蛋白質）との相互作用を阻害するような変異の例である。配列番号４は、配列番号１に係るＬＴ遺伝子に配列番号２の置換と配列番号３の置換との両方を導入することにより作製された変異型ＬＴ遺伝子である。上記の変異型ＬＴ遺伝子は、一例であり、ＤＮＡ複製開始の機能を高める可能性がある変異であれば、置換する塩基やアミノ酸配列の種類や場所は、ここに示した変異型ＬＴ遺伝子と完全に一致している必要はない。

複製開始蛋白質遺伝子２５がＳＶ４０のＬＴ遺伝子の場合、複製開始配列３０として、例えば、ＳＶ４０のｏｒｉ配列が適当である。ＳＶ４０のｏｒｉ配列の一例を配列表の配列番号５に示す。この塩基配列も、複製開始の機能を失わない限りにおいては、配列番号５の塩基配列と必ずしも完全に一致している必要はない。

ＬＴ遺伝子や、変異型ＬＴ遺伝子、ＳＶ４０のｏｒｉ配列等の塩基配列は、既知の遺伝子工学手法により取得可能である。例えば、これら取得対象の塩基配列に特異的なプライマーセットを利用したＰＣＲ（polymerase chain reaction：ポリメラーゼ連鎖反応）により、取得対象の塩基配列を含むＤＮＡを増幅して取得することが可能である。または、取得対象の塩基配列の全てを人工的に合成してもよい。また既にベクターに組込まれたものを利用してもよい。

また、遺伝子プロモーター１０であるサイトメガロウイルスのプロモーターの一例を配列表の配列番号６に、レポーター遺伝子２１であるホタルのルシフェラーゼ遺伝子の一例を配列表の配列番号７に、脳心筋炎ウイルスのＩＲＥＳの一例を配列表の配列番号８に、牛成長ホルモン遺伝子の転写終結シグナル配列の一例を配列表の配列番号９に示す。なお、本実施形態に係るプラスミド型ベクター１は、これらの遺伝子や塩基配列に限定されるわけではない。また、遺伝子やシグナルの塩基配列も、その機能を失わない限りにおいて、上記配列番号に記載の塩基配列と完全に一致しなくともよい。

２．ベクターの作製
次に、プラスミド型ベクターｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴの作製方法について説明する。図３は、プラスミド型ベクターｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴの作製方法の典型的な流れを模式的に示す図である。

図３に示すように、ベクターＰＧＶ−Ｂ２（ＴＯＹＯ Ｂ−Ｎｅｔ）とベクターｐＢＳＩＩ−ＩＲＥＳとベクターｐＣＭＶ−ＬＴ（ｗ／ｏＺｅｏ）とを用意する。ベクターＰＧＶ−Ｂ２は、ホタルのルシフェラーゼ遺伝子４１を含んでいる。ベクターｐＢＳＩＩ−ＩＲＥＳは、脳心筋炎ウイルスのＩＲＥＳ４３を含んでいる。ベクターｐＣＭＶ−ＬＴは、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）の遺伝子プロモーター（ＣＭＶプロモーター）４５、ＬＴ遺伝子４７、牛成長ホルモン遺伝子の転写終結シグナル配列４９、及びＳＶ４０ｏｒｉ配列５１を有している。

まず、制限酵素ＳａｃＩと制限酵素ＸｂａＩとでＰＧＶ−Ｂ２を消化してルシフェラーゼ遺伝子４１を切り出す。同様に、制限酵素ＳａｃＩと制限酵素ＸｂａＩとでｐＢＳＩＩ−ＩＲＥＳを切断する。そして、ＰＧＶ−Ｂ２から切り出されたルシフェラーゼ遺伝子４１を、制限酵素ＳａｃＩと制限酵素ＸｂａＩとで切断されたｐＢＳＩＩ−ＩＲＥＳにＴ４リガーゼで連結することによりｐＢＳＩＩ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳを作製する。

次に、ｐＢＳＩＩ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳを制限酵素ＰｓｔＩで切断する。制限酵素ＰｓｔＩで切断されたｐＢＳＩＩ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳの３’突出末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化する。平滑化の後、ｐＢＳＩＩ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳを制限酵素ＮｈｅＩで切断することにより、ルシフェラーゼ遺伝子４１とＩＲＥＳ４３とからなるＤＮＡ断片をｐＢＳＩＩ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳから切り出す。一方、ｐＣＭＶ−ＬＴにもｐＢＳＩＩ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳに対して施した処理を施す。すなわち、ｐＣＭＶ−ＬＴを制限酵素ＰｓｔＩで切断し、３’突出末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、ｐＣＭＶ−ＬＴを制限酵素ＮｈｅＩで切断する。そして、ｐＢＳＩＩ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳから切り出されたＤＮＡ断片をｐＣＭＶ−ＬＴにＴ４リガーゼで連結することにより、本実施形態に係るプラスミド型ベクターｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴを作製する。上述の処理により、ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴは、ＣＭＶプロモーター４５、ルシフェラーゼ遺伝子４１、ＩＲＥＳ４３、ＬＴ遺伝子４７、転写終結シグナル配列４９、及び複製開始配列５１を含んでいる。ルジフェラーゼ遺伝子４１、ＩＲＥＳ４３、ＬＴ遺伝子４７、及び転写終結シグナル配列４９は、ＣＭＶプロモーター４５の下流に組み込まれている。

また、さらに他のプラスミド型ベクター１として、上述のプラスミド型ベクターｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴのＬＴ遺伝子を変異型ＬＴ遺伝子に組み換えたｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴ−Ｅ１０７ＫとｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴ−Ｄ４０２Ｅとを作製した。図４は、ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴとｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴ−Ｅ１０７ＫとｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴ−Ｄ４０２Ｅとの構造を模式的に示す図である。図４の（ａ）に示すように、ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴのＬＴ遺伝子４７の３１９番目の塩基はグアニン（Ｇ）であり、３２１番目の塩基はアデニン（Ａ）であり、１２０６番目の塩基はチミン（Ｔ）である。ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴ−Ｅ１０７ＫのＬＴ遺伝子４７´の３１９番目の塩基はアデニン（Ａ）であり、３２１番目の塩基はグアニン（Ｇ）であり、１２０６番目の塩基は、チミン（Ｔ）である。ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴ−Ｄ４０２ＥのＬＴ遺伝子４７´´の３１９番目の塩基はグアニン（Ｇ）であり、３２１番目の塩基はアデニン（Ａ）であり、１２０６番目の塩基は、グアニン（Ｇ）である。ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴ−Ｅ１０７Ｋは、プラスミドの部位特異的変異導入法により、ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴのＬＴ遺伝子の３１９番目の塩基をグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）に、３２１番目の塩基をアデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）に置換することにより作製される。ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴ−Ｄ４０２Ｅは、プラスミドの部位特異的変異導入法により、ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴのＬＴ遺伝子の１２０６番目の塩基をチミン（Ｔ）からグアニン（Ｇ）に置換することにより作製される。

以上で本実施形態に係るプラスミド型ベクター１の作製方法の具体例についての説明を終了する。

なお、プラスミド型ベクター１、あるいは変異型ＬＴ遺伝子に組み換えたプラスミド型ベクター１とともに宿主細胞に導入されるネガティブコントロール用のベクターとしてｐＣＭＶ−Ｌｕｃが作製された。図５は、ベクターｐＣＭＶ−Ｌｕｃの作製方法の典型的な流れを模式的に示す図である。図５に示すように、ｐＣＭＶ−Ｌｕｃは、ｐＣＭＶ−ＬＴ（ｗ／ｏＺｅｏ）とベクターＰＧＶ−Ｂ２とから作製された。ｐＣＭＶ−ＬＴは、ＣＭＶプロモーター６１、ＬＴ遺伝子６３、転写終結シグナル配列６５、及びＳＶ４０ｏｒｉ配列６７を含んでいる。ＰＧＶ−Ｂ２は、ルシフェラーゼ遺伝子６９を含んでいる。ｐＣＭＶ−Ｌｕｃは、ｐＣＭＶ−ＬＴのＬＴ遺伝子６３とＰＧＶ−Ｂ２のルシフェラーゼ遺伝子６９とを組み換えることにより作製可能である。

具体的には、まず、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩと制限酵素ＸｂａＩとでＰＧＶ−Ｂ２を切断してルシフェラーゼ遺伝子６９を切り出す。同様に、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩと制限酵素ＸｂａＩとでｐＣＭＶ−ＬＴを切断し、ｐＣＭＶ−ＬＴからＬＴ遺伝子６３を除去する。そして、切り出されたルシフェラーゼ遺伝子６９を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩと制限酵素ＸｂａＩとで切断されたｐＣＭＶ−ＬＴにＴ４リガーゼで連結することによりネガティブコントロール用のベクターｐＣＭＶ−Ｌｕｃを作製する。すなわち、ｐＣＭＶ−Ｌｕｃは、ＣＭＶプロモーター６１、ルシフェラーゼ遺伝子６９、転写終結シグナル配列６５、及びＳＶ４０ｏｒｉ配列６７を含んでいる。ルシフェラーゼ遺伝子６９と転写終結シグナル配列６５とは、ＣＭＶプロモーター６１の下流に組み込まれている。このように、ｐＣＭＶ−Ｌｕｃは、複製開始蛋白質遺伝子と複製開始配列とを含んでおらず、非自己増幅型のレポーターベクターとして機能する。

３．宿主細胞におけるＬＴ蛋白質の発現
ヒト肝がん細胞（Ｈｕｈ−７）に、ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴとｐＣＭＶ−Ｌｕｃとを導入する。上述のように、ｐＣＭＶ−Ｌｕｃは、ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴに対するネガティブコントロール用のベクターとして導入される。

各プラスミド型ベクターの細胞への導入は、リポフェクション法で行われた。プラスミド型ベクターの導入試薬として、リポフェクタミン２０００（ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用した。リポフェクションの操作は、試薬のマニュアルに従った。簡単には、５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭに縣濁した１．０μｌのカチオン脂質（リポフェクタミン２０００）と、０．６μｇのｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴ或いは０．４μｇのｐＣＭＶ−Ｌｕｃと，０．２μｇのＤＮＡ（ｐＵＣ１９）を含む５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭとを混合してリポフェクタミン/ベクター複合体を形成した。リポフェクタミン/ベクター複合体の形成後、この複合体液５０μｌを培養プレート（２４ウェルプレート）で予め一晩培養しておいた培地（Ｈｕｈ−７（８．０×１０^４細胞／ウェルで播種））に加えることにより、細胞にｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴを導入した。

リポフェクションから４８時間後、培養プレートから培地を取り除き、培地内の細胞をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中に縣濁した。縣濁後、リン酸緩衝液と細胞とを含む縣濁液を角速度１４，０００ｒｐｍで５分間に亘って遠心分離器で遠心分離し、縣濁液から細胞ペレットを回収した。この細胞ペレットにＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）用の細胞溶解液を加え、沸騰水中で５分間に亘ってインキュベートした後、８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動を行った。電気泳動後、サブマリン型ブロッティング装置でゲル中の蛋白質をＰＶＤＦ膜に転写（ブロッティング）し、ＰＶＤＦ膜をブロックエース（Ｄａｉｎｉｐｐｏｎ Ｓｕｍｉｔｏｍｏ Ｐｈａｒｍａ）でブロッキングした。ブロッキング後、一次抗体溶液（５００倍希釈したマウス抗ＬＴモノクローナル抗体（Ｃｌｏｎｅ９Ｅ１０，Ｓｉｇｍａ））にＰＶＤＦ膜を浸し、室温で１時間に亘って反応させた。そして、ＰＶＤＦ膜をトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）で３回洗浄した。

洗浄後、ＰＶＤＦ膜内のＬＴ蛋白質の発現量をＡＢＣキット（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ，ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ）を使用して測定した。ＡＢＣキットの操作は、販売メーカーのマニュアルに従った。ＰＶＤＦ膜（酵素標識二次抗体）は、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（ＫＰＬ社）で発色させた。

図６は、ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴとｐＣＭＶ−ＬｕｃとにおけるＬＴ蛋白質のシグナルの検出結果を示す図である。図６に示したように、ｐＣＭＶ−Ｌｕｃにおいては、ＬＴ蛋白質の発現は検出されていない。一方、ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴにおいては、ＬＴ蛋白質の発現が特異的に検出された。図６の例においては、ＬＴ蛋白質のシグナルの分子量は、約８２ｋＤａであると測定された。

４．プラスミド型ベクターの増幅
上記の３と同様の方法で、Ｈｕｈ−７細胞に、同コピー数のｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴとｐＣＭＶ−Ｌｕｃとを導入した。リポフェクションから７２時間後、Ｄｎｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して細胞からＤＮＡを抽出した。ＤＮＡの抽出操作は、キットのマニュアルに従った。抽出されたＤＮＡ溶液２００μｌのうち、１．０μｌを鋳型としてＰＣＲをおこない、ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴ、或いはｐＣＭＶ−Ｌｕｃの部分塩基配列を増幅した。ＰＣＲに使用したプライマーの塩基配列を以下に示す。

フォワードプライマー:
５’−ＣＧＡＣＴＧＴＧＣＣＴＴＣＴＡＧＴＴＧＣＣＡＧＣＣ−３’
リバースプライマー:
５’−ＣＣＡＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＴＡＴＴＧＴＣＴＴＣＣＣ−３’
ＰＣＲ反応後のＤＮＡ溶液を、０．８％のアガロースゲルで電気泳動した。電気泳動後、ＤＮＡ溶液を含むゲルをエチジウムブロマイドにより染色し、染色されたゲルの写真を撮影した。そして、エチジウムブロマイド染色写真に描出されたバンドの染色強度を画像解析ソフトウェア(ＩｍａｇｅＪ)で数値化した。

図７に、細胞にプラスミド型ベクターを導入してから７２時間後のｐＣＭＶ−Ｌｕｃに対するｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴのコピー数（バンドの染色強度）の比較結果を示す。図７（ａ）は、ｐＣＭＶ−ＬｕｃとｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴとのエチジウムブロマイド染色写真を示す。図７（ｂ）は、ｐＣＭＶ−ＬｕｃとｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴとのコピー数を比較したグラフ（染色強度比のグラフ）を示す。図７（ａ）に示すように、ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴは、ｐＣＭＶ−Ｌｕｃよりも写真の輝度が高い。従って、ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴは、ｐＣＭＶ−Ｌｕｃよりもシグナル強度が高いことがエチジウムブロマイド染色写真から見出すことができる。また、図７（ｂ）に示すように、ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴは、ｐＣＭＶ−Ｌｕｃよりもシグナル強度が高い。このグラフから、ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴのコピー数は、ｐＣＭＶ−Ｌｕｃのコピー数の４．２倍に増幅していることを見出すことができる。

５．レポータージーンアッセイ−１−（ルシフェラーゼアッセイ）
上記の３と同様の方法で、Ｈｕｈ−７細胞とサル腎がん細胞（ＣＶ−１）とのそれぞれに、同コピー数のｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴとｐＣＭＶ−Ｌｕｃとをリポフェクション法により導入し、培養プレートで培養した。リポフェクションから７２時間後に、培養プレートから培地を取り除き、各細胞をＰＢＳで２回洗浄してから、細胞からルシフェラーゼ（レポーター蛋白質）を抽出するための抽出試薬である細胞溶解液（ＰｉｃａＧｅｎｅ Ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ ＬＣβ，ＴＯＹＯ Ｂ−Ｎｅｔ社)を添加した。室温で１５分間に亘って細胞と細胞溶解液との縣濁液をインキュベートした後、角速度１５，０００ｒｐｍで５分間に亘って縣濁液を遠心分離器で遠心分離することによって、縣濁液から細胞残渣を取り除いた。そして、細胞残渣が取り除かれた縣濁液の上清にルシフェラーゼ基質溶液(ＰｉｃａＧｅｎｅ ＬＴ２．０，ＴＯＹＯ Ｂ−Ｎｅｔ社)を加えた後、検出試薬であるルシフェラーゼ基質溶液（ルシフェリン溶液）が加えられた上清の発光強度をルミノメーター(Ｍｉｔｈｒａｓ ＬＢ９４０，Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社)で測定した。

図８は、ｐＣＭＶ−ＬｕｃとｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴとのレポーター蛋白質のシグナル強度の比較結果を示す図である。図８に示すように、宿主細胞がＨｕｈ−７の場合、ｐＣＭＶ−Ｌｕｃに対するｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴのレポーター蛋白質のシグナル強度は、約５．７倍であった。宿主細胞がＣＶ−１の場合、ｐＣＭＶ−Ｌｕｃに対するｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴのレポーター蛋白質のシグナル強度は、約１９．８倍であった。このように、本実施形態に係るプラスミド型ベクターは、非増幅型のプラスミド型ベクターに比べて最大で約１９．８倍のレポーター蛋白質を発現することが可能である。従って本実施形態に係るレポータージーンアッセイは、従来型のレポータージーンアッセイに比べて高感度に遺伝子プロモーターの活性を検出することができる。

６．レポータージーンアッセイ−２−（ルシフェラーゼアッセイ）
上記の３と同様の方法で、サル腎がん細胞（ＣＶ−１）に、同コピー数のｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴとｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴ−Ｅ１０７ＫとｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴ−Ｄ４０２ＥとｐＣＭＶ−Ｌｕｃとをリポフェクション法により導入し、培養プレートで培養した。リポフェクションから７２時間後に、培養プレートから培地を取り除き、各細胞をＰＢＳで２回洗浄してから、細胞からルシフェラーゼ（レポーター蛋白質）を抽出するための抽出試薬である細胞溶解液（ＰｉｃａＧｅｎｅ Ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ ＬＣβ，ＴＯＹＯ Ｂ−Ｎｅｔ社)を添加した。室温で１５分間に亘って細胞と細胞溶解液との縣濁液をインキュベートした後、角速度１５，０００ｒｐｍで５分間に亘って縣濁液を遠心分離器で遠心分離することによって、縣濁液から細胞残渣を取り除いた。そして、細胞残渣が取り除かれた縣濁液の上清にルシフェラーゼ基質溶液(ＰｉｃａＧｅｎｅ ＬＴ２．０，ＴＯＹＯ Ｂ−Ｎｅｔ社)を加えた後、検出試薬であるルシフェラーゼ基質溶液（ルシフェリン溶液）が加えられた上清の発光強度をルミノメーター(Ｍｉｔｈｒａｓ ＬＢ９４０，Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社)で測定した。

図９は、ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴとｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴ−Ｅ１０７ＫとｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴ−Ｄ４０２ＥとのｐＣＭＶ−Ｌｕｃに対するレポーター蛋白質のシグナル強度の比較結果を示す図である。図１０に示すように、ｐＣＭＶ−Ｌｕｃに対するｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴとｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴ−Ｅ１０７ＫとｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＬＴ−Ｄ４０２Ｅとのレポーター蛋白質のシグナル強度は、それぞれ約２０倍と約１０８倍と約１７７倍とであった。このように、本実施形態に係るプラスミド型ベクターは、変異型ＬＴ遺伝子を用いることにより、非増幅型のプラスミド型ベクターに比べて最大で約１７７倍のレポーター蛋白質を発現することが可能である。従って本実施形態に係るレポータージーンアッセイは、従来型のレポータージーンアッセイに比べて高感度に遺伝子プロモーターの活性を検出することができる。

［効果］
上述のように、本実施形態に係るプラスミド型ベクター１は、検出対象となる遺伝子プロモーター１０、レポーター遺伝子２１、ＩＲＥＳ２３、複製開始蛋白質遺伝子２５、転写終結シグナル配列２７、及び複製開始配列３０を有している。レポーター遺伝子２１、ＩＲＥＳ２３、複製開始蛋白質遺伝子２５、及び転写終結シグナル配列２７は、遺伝子プロモーター１０の下流に配置される。ＩＲＥＳ２３は、レポーター遺伝子２１と複製開始蛋白質遺伝子２５とを連結している。従って、プラスミド型ベクター１が遺伝子プロモーター１０の活性化条件を満たす宿主細胞に導入された場合、遺伝子プロモーター１０の活性化に伴ってプラスミド型ベクター１が複製を繰り返しながら、個々のプラスミド型ベクター１においてレポーター蛋白質が合成される。従って、従来の非増幅型レポーターベクターに比して、本実施形態に係るプラスミド型ベクター１は、遺伝子プロモーター１０の活性に起因して合成されるレポーター蛋白質の発現量、すなわち、測定シグナルの発現量を増大させることができる。また、本実施形態に係るプラスミド型ベクター１は、プラスミドを利用しているので、ウイルスを利用したベクターに比して、感染等の危険性がなく、取り扱いが簡便である。

本実施形態に係るレポータージーンアッセイは、プラスミド型ベクター１に含まれる遺伝子プロモーター１０の活性に伴ってプラスミド型ベクター１が増幅可能な条件下で宿主細胞を培養し、培養された宿主細胞内でのプラスミド型ベクター１に含まれるレポーター遺伝子２１の発現量を測定する。従って、本実施形態に係るレポータージーンアッセイは、従来の非増幅型レポーターベクターを利用したレポータージーンアッセイに比して、遺伝子プロモーターの活性を高感度に検出することができる。

また、本実施形態に係るアッセイキットは、プラスミド型ベクター１と、宿主細胞における、プラスミド型ベクター１に含まれるレポーター遺伝子２１の発現を検出するための試薬とを含んでいる。従って、本実施形態に係るアッセイキットは、従来の非増幅型レポーターベクターを利用したアッセイキットに比して、遺伝子プロモーターの活性を高感度に検出することができる。

例えば、疾患早期における前疾患化状態にある細胞において特異的に活性化する遺伝子プロモーター１０をプラスミド型ベクター１に組み込んだ場合、この前疾患化状態にある細胞の単位個数あたりのレポーター蛋白質の発現量を従来に比して大幅に増大することできる。発現量の増大により、レポーター蛋白質の発現を容易に検出することができ、結果的に遺伝子プロモーター１０の活性を容易に検出することができる。このように、本実施形態によれば、極微量の病変細胞の変化を高感度に検出することができる。

かくして本実施形態によれば、遺伝子プロモーターの活性を高感度に検出可能なプラスミド型ベクター、遺伝子プロモーターの検出方法、及びアッセイキットを提供することができる。

本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれるものである。

１…プラスミド型ベクター、１０…遺伝子プロモーター、２１…レポーター遺伝子、２３…内部リボゾーム結合配列（ＩＲＥＳ）、２５…複製開始蛋白質遺伝子、２７…転写終結シグナル配列、３０…複製開始配列

Claims (21)

1. プラスミド型ベクターを被検細胞に導入し、
   前記プラスミド型ベクターに含まれる遺伝子プロモーターの活性に伴って前記プラスミド型ベクターが増幅可能なように、前記被検細胞が***して増殖する条件下で前記被検細胞を培養し、
   培養された前記被検細胞内での前記プラスミド型ベクターに含まれるレポーター遺伝子の発現量を測定し、その結果に基づいて、前記被検細胞の状態または環境を判定すること
   を具備し、
   前記プラスミド型ベクターが、
   検出されるべき特定の状態または特定の環境にある当該被検細胞において活性化される、前記被検細胞に由来する遺伝子プロモーターと、
   前記遺伝子プロモーターの下流に配置された、前記遺伝子プロモーターの活性を可視化するためのレポーター蛋白質をコードする第１の遺伝子と、
   前記遺伝子プロモーターの下流に配置された、複製開始蛋白質をコードする第２の遺伝子と、
   前記第１の遺伝子と前記第２の遺伝子との間に配置された内部リボゾーム結合配列と、
   前記第１の遺伝子と前記第２の遺伝子との転写を終結するためのシグナルをコードする転写終結シグナル配列と、
   前記複製開始蛋白質により認識される複製開始配列と
   を備える被検細胞の状態または環境を判定する方法。
2. さらに、請求項１に記載の方法によって、前記被検細胞が由来する哺乳類対象についての情報を得ることを特徴とする被検細胞が由来する哺乳類対象についての情報を得る方法。
3. 前記第２の遺伝子は、シミアン・ウイルス４０のラージＴ抗原遺伝子であり、
   前記複製開始配列は、シミアン・ウイルス４０の複製開始配列である
   請求項１または２に記載の方法。
4. 前記第２の遺伝子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４に記載の塩基配列からなる遺伝子である請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
5. 前記第２の遺伝子は、エプスタイン・バー・ウイルスのＥＢＮＡ−１遺伝子であり、
   前記複製開始配列は、エプスタイン・バー・ウイルスの複製開始配列である
   請求項１または２に記載の方法。
6. 前記第２の遺伝子は、マウス・ポリオーマ・ウイルスのラージＴ抗原遺伝子であり、
   前記複製開始配列は、マウス・ポリオーマ・ウイルスの複製開始配列である
   請求項１または２に記載の方法。
7. 前記被検細胞は、ヒト、サル、マウスまたはラット由来の細胞である請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
8. 前記レポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、青色蛍光蛋白質遺伝子、緑色蛍光蛋白質遺伝子または赤色蛍光蛋白質遺伝子であり、
   前記測定することは、前記発現量として、前記レポーター遺伝子の翻訳産物の発光量または蛍光量を、光学検出装置を利用して測定することである
   請求項１〜７の何れか１項に記載の方法。
9. 前記第レポーター遺伝子は、一酸化窒素合成酵素遺伝子、またはキサンチンオキシダーゼ遺伝子であり、
   前記測定することは、前記発現量として、前記レポーター遺伝子の翻訳産物により生成される活性酸素量を電子スピン共鳴装置を利用して測定することである
   請求項１〜７の何れか１項に記載の方法。
10. 前記レポーター遺伝子は、重金属結合蛋白質遺伝子であり、
    前記測定することは、前記発現量として、前記レポーター遺伝子の翻訳産物に結合した重金属量を、磁気共鳴イメージング装置、核医学診断装置、またはＸ線コンピュータ断層撮影装置を利用して測定することである
    請求項１〜７の何れか１項に記載の方法。
11. 被検細胞の状態若しくは環境を判定するためプラスミド型ベクターであって、
    検出されるべき特定の状態または特定の環境にある当該被検細胞において活性化される、前記被検細胞に由来する遺伝子プロモーターと、
    前記遺伝子プロモーターの下流にある、前記遺伝子プロモーターの活性を可視化するためのレポーター蛋白質をコードする第１の遺伝子と、
    前記遺伝子プロモーターの下流にある、複製開始蛋白質をコードする第２の遺伝子と、
    前記第１の遺伝子と前記第２の遺伝子との間にある内部リボゾーム結合配列と、
    前記第１の遺伝子と前記第２の遺伝子との転写を終結するためのシグナルをコードする転写終結シグナル配列と、
    前記複製開始蛋白質により認識される複製開始配列と、
    を具備するプラスミド型ベクター。
12. 被検細胞が由来する哺乳類対象についての情報を得るためのベクターであって、
    検出されるべき特定の状態または特定の環境にある当該被検細胞において活性化される、前記被検細胞に由来する遺伝子プロモーターと、
    前記遺伝子プロモーターの下流にある、前記遺伝子プロモーターの活性を可視化するためのレポーター蛋白質をコードする第１の遺伝子と、
    前記遺伝子プロモーターの下流にある、複製開始蛋白質をコードする第２の遺伝子と、
    前記第１の遺伝子と前記第２の遺伝子との間にある内部リボゾーム結合配列と、
    前記第１の遺伝子と前記第２の遺伝子との転写を終結するためのシグナルをコードする転写終結シグナル配列と、
    前記複製開始蛋白質により認識される複製開始配列と、
    を具備するプラスミド型ベクター。
13. 前記第２の遺伝子は、シミアン・ウイルス４０のラージＴ抗原遺伝子であり、
    前記複製開始配列は、シミアン・ウイルス４０の複製開始配列である
    請求項１１または１２に記載のベクター。
14. 前記第２の遺伝子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４に記載の塩基配列からなる遺伝子である請求項１１〜１３の何れか１項に記載のベクター。
15. 前記第２の遺伝子は、エプスタイン・バー・ウイルスのＥＢＮＡ−１遺伝子であり、
    前記複製開始配列は、エプスタイン・バー・ウイルスの複製開始配列である
    請求項１１または１２に記載のベクター。
16. 前記第２の遺伝子は、マウス・ポリオーマ・ウイルスのラージＴ抗原遺伝子であり、
    前記複製開始配列は、マウス・ポリオーマ・ウイルスの複製開始配列である
    請求項１１または１２に記載のベクター。
17. 前記第１の遺伝子は、ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、一酸化窒素合成酵素遺伝子、キサンチンオキシダーゼ遺伝子、青色蛍光蛋白質遺伝子、緑色蛍光蛋白質遺伝子、赤色蛍光蛋白質遺伝子または重金属結合蛋白質遺伝子である請求項１１〜１６の何れか１項に記載のベクター。
18. 被検細胞の状態若しくは環境を判定するためのアッセイキットであって、
    請求項１１〜１７の何れか１項に記載のプラスミド型ベクターと、
    前記被検細胞における、前記プラスミド型ベクターに含まれる前記レポーター蛋白質をコードする遺伝子の発現を検出するための試薬と
    を具備するアッセイキット。
19. 前記被検細胞が由来する哺乳類対象についての情報を得るためのアッセイキットであって、
    請求項１１〜１７の何れか１項に記載のプラスミド型ベクターと、
    前記被検細胞における、前記プラスミド型ベクターに含まれる前記レポーター蛋白質をコードする遺伝子の発現を検出するための試薬と
    を具備するアッセイキット。
20. 前記プラスミド型ベクターを前記被検細胞に導入するための試薬をさらに具備する請求項１８または１９に記載のアッセイキット。
21. 前記被検細胞からレポーター蛋白質を抽出するための試薬をさらに具備する請求項１８または１９に記載のアッセイキット。

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