JP2001066253A - レーザ走査顕微鏡におけるパルス形態の最適化のためのシステム - Google Patents

レーザ走査顕微鏡におけるパルス形態の最適化のためのシステム

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Thomas Feurer
フォイラー （原語表記）Ｔｈｏｍａｓ Ｆｅｕｒｅｒ トーマス
Roland Sauerbrey
ザウエルブレイ （原語表記）Ｒｏｌａｎｄ Ｓａｕｅｒｂｒｅｙ ローラント
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】顕微鏡光路において短パルスレーザを結合させ
るための装置 【解決手段】レーザ光線のスペクトル成分を分散素子に
よって空間的に分離させて個々のスペクトル成分を操作
し、続いてもう一方の分散素子によって今度はそのスペ
クトル成分を空間的に重ね合わせることによって、最適
化されたパルス長および平均出力を得ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、レーザ走査顕微鏡
におけるパルス形態の最適化のためのシステムに関する
ものである。
【０００２】
【従来の技術】例えば生物学標本の検査に用いられる顕
微鏡の場合、今日では２光子吸収や第２高調波発生（Ｓ
ＨＧ）等の非線形コントラストの使用が益々増えてい
る。非線形効果の励起に必要なエネルギーを得るために
は短パルスレーザの使用が有利である。
【０００３】その場合標本の同時損傷を防止するにはパ
ルスピークの出力ができるだけ大きくて試料位置におけ
るパルス長ができるだけ小さくなければならない。短パ
ルスレーザは、例えば数１０ＭＨｚの反復率で数１０ｆ
ｓのパルス長を持つ光パルスを提供する。そのように、
低い平均出力で極めて高いパルスピークエネルギーを放
出するという長所を持っている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】欠点は、短パルスが顕
微鏡を通って試料に到る途中で群速度分散（ＧＶＤ）に
より変化する ― 通常は長くなる ― ことである。伸張
したパルスの長さ補整には対応システム（プレチャーピ
ング用装置）が提案されている（ＤＥ １９６２２３５
３）。ＤＥ １９７３３１９３ではさらに調整用光学系
が装備されている。これらの装置は第２類の分散の補整
に適している。
【０００５】しかし、例えば生物学標本の場合、予備決
定し得ない高度な分散を想定しておかねばならない。さ
らに、顕微鏡の光学コンポーネントにおいても高度な分
散が現れている。従って、旧来の技術では非線形コント
ラスト励起のための最適条件を創出するのは不可能であ
る。
【０００６】
【課題を解決するための手段】旧来の蛍光顕微鏡では、
生物学標本の特殊標識用として各種色素が使用されてい
る。これらの色素は続いて各種波長の光によって励起さ
れる。そのような標本では殆どの場合多光子励起の使用
により各種色素の同時励起が行われる。これは励起に一
波長しか必要でないところが長所であるが、他方個々の
色素の放出波長帯が重なり合うのが欠点である。色素は
その時点ではもはやスペクトル分離できないからであ
る。本発明の課題は上記欠点を取り除くことである。
【０００７】
【発明の実施の形態】システム構成 ：代表的な構造を
図式化したのが図１である。光パルスは短パルスレーザ
ＫＬから出発してパルス整形器ＰＦに到達する。これは
図２ａに図式化して示してある。パルス整形器ＰＦでは
入射光線が光パルスのスペクトル成分を空間的に分割す
る、例えば格子またはプリズムから構成されている第一
分散素子（１）に入り込む − ビームイン。続いて色消
し修正レンズまたはレンズ群Ｌ１（図２）によりフーリ
エ平面が生成される。
【０００８】この平面（焦平面）の特徴は、そこでは光
パルスの各スペクトル成分が空間的に分離されている点
である。この平面への変換は数学的にはフーリエ変換に
相当する。この平面には透過式空間光変調器（２）−
ＳＬＭ − が使用される。これは一般的には螺旋状また
は平行に配置されたネマチック液晶のマトリクス（例え
ばJenoptik LOS社のSLM‐S１６０/h）から成っている。
マトリクスの個々の点に然るべき電気スイッチを装着す
ることによって対応スペクトル成分の透過および位相シ
フトの調整が可能である。その後、同型の第２レンズＬ
２および第１と同型の第２分散素子（３）を経て光パル
ス・スペクトル成分の空間分離過程を終える − ビーム
アウト。
【０００９】この過程は時間領域への逆変換に相当す
る。従って位相、振幅の変調により光パルスの時間的性
状を制御することができる。２格子および２レンズから
成るシステムは文献に４ｆシステムの名で出ており、知
られている。
【００１０】簡略化したパルス整形器のシステムを表し
たのが図２ｂである。そこでは変調器（２）の直後にミ
ラー（Ｓ）が配置されているので、反射逆進時における
光線自体の上下移動あるいは角度のぶれが小さい。この
システムの特徴は、一つには光学コンポーネントが少な
くて済むという点であり、また一つには光パルスが変調
器（２）を２回通過することから位相／振幅変調の大き
さも倍増するという点である。
【００１１】図３にはマニピュレーター（２）通過によ
るレッド成分ｒとブルー成分ｂの***、分散および集束
化が、さらにはマニピュレーター（２）における方向Ｘ
に沿った波長の経過が図示されている。パルス整形器中
で時間特性に変化が起きた場合、光パルスは然るべき光
学コンポーネントから顕微鏡Ｍおよび対物レンズＯを通
って試料Ｐに到達する。試料Ｐでは対物レンズの強い集
束作用および光パルスの高いパルスピーク出力のために
非線形効果が励起される。それは検出器（４）によって
記録される。このようにしてそれぞれの測定シグナルが
提示され、制御系Ｒに基づくパルス整形器の電子制御に
よって最適化することができる。
【００１２】制御系の作用態様は２光子蛍光シグナルの
生成例を基に説明することにする。２光子蛍光シグナル
（Ｓ）は次のように書き表すことができる ： Ｓ ∝ Ｐ２ ａｖｇ／τ２・Ａ２ 但し、Ｐａｖｇは平均出力、τは試料位置における光パ
ルスのパルス長を表している。Ａは試料の作用位置にお
ける光線横断面である。上記の式より明らかなように、
２光子蛍光シグナルはパルス長および光線横断面が小さ
く、平均出力が大きくなるに従って増大する。
【００１３】顕微鏡ではパルス長は次のファクターに影
響され、それも殆どは伸張する ： ・ 顕微鏡に取り付けられている光学素子の材料である
ガラス素材。補整は恒久的に行える。 ・ 標本自体。パルスの伸張は標本内への侵入深度に依
存している。そのほか、パルスの伝播は高度な分散によ
って惹起される。それ故、各スペクトル成分に対する補
整はそれぞれに実時間で行わねばならない。 ・ 波長の変化。 ・ 平均出力の変化。
【００１４】以上より、パルス整形器ＰＦおよびまた光
パルスの時間特性は上記ファクターに基づき制御系によ
って実時間で調整する。その場合に２光子蛍光シグナル
が測定量として機能する。試料の作用位置におけるパル
ス長および平均出力はパルス整形器によって最適化され
る。
【００１５】尚、使用色素の作用横断面は光パルスの時
間特性に依存している。従って、個々の色素に対する蛍
光シグナルを最適化することが可能である。その場合他
の色素の蛍光は抑制される。このことは文献よりコヒー
レント制御の概念で知られている。以上より、測定量
（ここでは２光子蛍光シグナル）の再結合から、光パル
スの時間特性を位相変調又は振幅変調の手段により当該
測定量が最適になるように調整することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図式化した構造
【図２】パルス整形器の４ｆシステム
【図３】ａ）マニピュレーター（２）通過によるレッド
成分ｒとブルー成分ｂの***、分散および集束化，ｂ）
マニピュレーター（２）における方向Ｘに沿った波長の
経過
【符号の説明】 １,３ 格子 ２ マニピュレータ（透過式空間光変調器） ４ 測定シグナル検出器 Ｏ 対物レンズ Ｐ 資料 ＰＦ パルス整形器 ＫＬ 短パルスレーザ Ｌ レンズ Ｍ 顕微鏡 Ｒ 制御系 Ｓ ミラー
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 トーマス フォイラー （原語表記）Ｔｈ ｏｍａｓ Ｆｅｕｒｅｒ ドイツ国 Ｄ−07743 イエナ ガルテン ストラッセ ２ (72)発明者 ローラント ザウエルブレイ （原語表 記）Ｒｏｌａｎｄ Ｓａｕｅｒｂｒｅｙ ドイツ国 Ｄ−07743 イエナ ツェンケ ルストラッセ ５ａ

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 レーザ光線のスペクトル成分が分散素子
    によって空間的に分離され、個々のスペクトル成分が操
    作され、そして再度、分散素子によってそのスペクトル
    成分が空間的に重ね合わされる、顕微鏡光路において短
    パルスレーザを結合させるための装置。
  2. 【請求項２】 レーザ光線のスペクトル成分が分散素子
    によって空間的に分離され、フーリエ平面／焦平面でス
    ペクトル成分が操作され、そして再度、分散素子によっ
    て空間的に重ね合わされる、請求項１に記載の顕微鏡光
    路において短パルスレーザを結合させるための装置。
  3. 【請求項３】 スペクトル成分が、操作された後に、ミ
    ラーで反射され、再度、分散素子で重ね合わされる、上
    記請求項の少なくとも一つに基づく装置。
  4. 【請求項４】 顕微鏡が、レーザ操作顕微鏡である、上
    記請求項の少なくとも一つに基づく装置。
  5. 【請求項５】 顕微鏡が、非線形コントラスト法の検査
    に使用される、上記請求項の少なくとも一つに基づく装
    置。
  6. 【請求項６】 分散素子がプリズムまたは格子である、
    上記請求項の少なくとも一つに基づく装置。
  7. 【請求項７】 スペクトル成分を操作するマニピュレー
    ターが、スペクトル成分の振幅の変調を行う、上記請求
    項の少なくとも一つに基づく装置。
  8. 【請求項８】 マニピュレーターが、スペクトル成分の
    位相の変調を行う、上記請求項の少なくとも一つに基づ
    く装置。
  9. 【請求項９】 単モード・ファイバーＦが、短パルスレ
    ーザ結合用装置の後ろに接続されている、上記請求項の
    少なくとも一つに基づく装置。
  10. 【請求項１０】 単モード・ファイバーが、偏光維持作
    用も有している、上記請求項の少なくとも一つに基づく
    装置。
  11. 【請求項１１】 マニピュレーターとしてフーリエ平面
    に空間光変調器 − ＳＬＭ − が使用される、上記請求
    項の少なくとも一つに基づく装置。
  12. 【請求項１２】 測定シグナルのフィードバックによっ
    てマニピュレーターが特別に最適化され、それによって
    所定の測定シグナルに調整される、上記請求項の少なく
    とも一つに基づく装置。
  13. 【請求項１３】 フィードバックシステムによって、変
    調器における位相変調が高次元分散の補整のために使用
    され、請求項１２に基づく装置。
  14. 【請求項１４】 フィードバックシステムによって、変
    調器における位相変調が、短パルスレーザの平均波長に
    依存して最適化される、請求項１２または１３に基づく
    装置。
  15. 【請求項１５】 フィードバックシステムによって、変
    調器における位相変調が、使用される対物レンズに依存
    して最適化される、請求項１２，１３または１４に基づ
    く装置。
  16. 【請求項１６】 フィードバックシステムによって、変
    調器における位相変調が、使用される平均出力に依存し
    て最適化される、請求項１２から１５のいずれか一つに
    基づく装置。
  17. 【請求項１７】 フィードバックシステムによって、変
    調器における位相変調が、検査対象の標本への侵入深度
    に依存して調整され、それによって非線形励起蛍光シグ
    ナルが最適化される、請求項１２から１６のいずれか一
    つに基づく装置。
  18. 【請求項１８】 適応素子の補助によりパルスフロント
    および球面収差が追加的に最適化される、上記請求項の
    少なくとも一つに基づく装置。
  19. 【請求項１９】 変調器における位相変調および振幅変
    調の手段が、蛍光色素の特別な励起のために用意されて
    いる、上記請求項の少なくとも一つに基づく装置。
  20. 【請求項２０】 前項記載の手段が選択的に用意されい
    ている、請求項１９に基づく装置。
  21. 【請求項２１】 変調器における位相変調および振幅変
    調の手段が、蛍光色素における特定の反応（ＦＲＥＴ、
    アンケージング）を起させるために用意されている、上
    記請求項の少なくとも一つに基づく装置。
  22. 【請求項２２】 変調器における位相変調および振幅変
    調の手段が、蛍光色素の特定の漂白を行わせるために用
    意されている、上記請求項の少なくとも一つに基づく装
    置。
  23. 【請求項２３】 前記した、そして添付図面に描かれ
    た、顕微鏡光路において短パルスレーザを結合させるた
    めの装置。
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