DE19930532A1 - Anordnung zur Optimierung der Pulsform in einem Laser-Scanning-Mikroskop - Google Patents
Anordnung zur Optimierung der Pulsform in einem Laser-Scanning-MikroskopInfo
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Abstract
Vorrichtung zur Einkopplung eines Kurzpulslasers in einen mikroskopischen Strahlengang, wobei die spektralen Komponenten der Laserstrahlung mit Hilfe eines dispersiven Elementes räumlich separiert, die einzelnen spektralen Komponenten manipuliert und anschließend wieder mit Hilfe eines weiteren dispersiven Elementes räumlich überlagert werden.
Description
In der Mikroskopie zur Untersuchung von z. B. biologischen Präparaten werden
heutzutage immer häufiger nichtlineare Kontraste, wie die Zwei-Photonen Absorption
oder die Erzeugung der zweiten Harmonischen (SHG) eingesetzt. Um die zur Anregung
von nichtlinearen Effekten nötige Energie bereitzustellen, ist es vorteilhaft
Kurzpulslaser einzusetzen. Dabei sollte die Pulsspitzenleistung möglichst groß und
damit die Pulslänge am Ort der Probe möglichst klein sein, um eine gleichzeitige
Schädigung der Präparate zu verhindern. Kurzpulslaser liefern beispielsweise
Lichtimpulse mit einer Pulslänge von einigen 10 fs bei einer Repetitionsrate von
mehreren 10 MHz. Sie haben dadurch den Vorteil äußerst hohe Pulsspitzenenergien
bei gleichzeitig geringer mittlerer Leistung zu emittieren.
Nachteilig ist, daß sich die kurzen Pulse auf dem Weg durch das Mikroskop zur Probe
durch die Gruppengeschwindigkeitsdispersion (GVD) verändern - im Normalfall werden
sie länger.
Zur Kompensation der Pulsverlängerung wurden entsprechende Anordnungen
(Prechirp-Einrichtungen) vorgeschlagen (DE 196 22 353).
In DE 197 33 193 sind weiterhin apaptive Optiken vorgesehen.
Die beschriebenen Vorrichtungen sind zur Kompensation der Dispersion 2. Ordnung
geeignet.
In den z. B. biologischen Präparaten ist jedoch mit nicht vorher bestimmbaren
Dispersionen höherer Ordnungen zu rechnen. Weiterhin treten in den optischen
Komponenten in einem Mikroskop Dispersionen höherer Ordnung auf. Somit ist es mit
den herkömmlichen Techniken nicht möglich, optimale Bedingungen zur Anregung der
nichtlinearen Kontraste schaffen.
In konventionellen Fluoreszenzmikroskopie werden verschiedene Farbstoffe zur
spezifischen Markierung von biologischen Präparaten eingesetzt. Diese Farbstoffe
werden anschließend mit unterschiedlichen Lichtwellenlängen angeregt. Durch den
Einsatz der Multiphotonen-Anregung erfolgt bei solchen Präparaten meist eine
simultane Anregung der verschiedenen Farbstoffe. Dies ist einerseits ein Vorteil, da
man nur noch eine Lichtwellenlänge zur Anregung benötigt. Andererseits ist es von
Nachteil, wenn sich die Emissionswellenlängenbänder der einzelnen Farbstoffe
überlagern, da die Farbstoffe dann nicht mehr spektral getrennt werden können.
Aufgabe der Erfindung ist die Beseitigung der beschriebenen Nachteile.
Ein Blockschaltbild des bevorzugten Aufbaus ist in Fig. 1 dargestellt.
Ausgehend vom Kurzpulslaser KL gelangen die Lichtimpulse in den Pulsformer PF.
Dieser ist schematisch in Fig. 2a gezeigt. Im Pulsformer PF wird der einfallende Strahl
beam in in einem ersten dispersiven Element (1) bestehend z. B. aus einem Gitter oder
Prismen die spektralen Komponenten der Lichtpulse räumlich aufgespalten.
Anschließend wird mit Hilfe einer achromatisch korrigierten Linse oder Linsengruppe L1
(Fig. 2) eine Fourierebene erzeugt.
Diese Ebene (Brennebene) zeichnet sich dadurch aus, daß hier die einzelnen
Spektralanteile der Lichtpulse räumlich separiert sind. Die Transformation in diese
Ebene entspricht mathematisch gesehen einer Fouriertransformation. In diese Ebene
wird ein räumlicher Licht-Modulator (2) (spatial light modulator - SLM) in Transmission
eingesetzt. Dieser besteht im allgemeinen aus einer Matrix von helixartig oder parallel
angeordneten, nematischen Flüssigkeitskristallen (z. B. SLM-S160/h, Firma: Jenoptik
LOS). Durch eine entsprechende elektronische Beschaltung der einzelnen Punkte der
Matrix kann die Transmission bzw. Phasenverschiebung der entsprechenden
spektralen Komponente eingestellt werden. Anschließend wird die räumliche Trennung
der spektralen Komponenten der Lichtpulse durch eine zweite identische Linse L2 und
ein zweites dem ersten identisches dispersives Element (3) aufgehoben - beam out.
Dieser Vorgang entspricht der Rücktransformation in den Zeitbereich. Mit Hilfe der
Phasen- bzw. Amplitudenmodulation kann somit das zeitliche Verhalten der
Lichtimpulse gesteuert werden. Die Anordnung aus 2 Gittern und 2 Linsen ist in der
Literatur unter der Bezeichnung 4f - Anordnung bekannt.
Eine vereinfachte Anordnung für den Pulsformer ist in Fig. 2b aufgeführt. Hier ist gleich
nach dem Modulator (2) ein Spiegel S angeordnet, so daß die Strahlung in sich zurück
mit einem kleinen Höhenversatz oder unter einem kleinem Winkel in sich zurück läuft.
Diese Anordnung kommt zum einen mit weniger optischen Komponenten aus, zum
anderen durchlaufen die Lichtpulse hier zweimal den Modulator (2), so daß sich die
Größe der Phasen-/Amplitudenmodulation verdoppelt.
In Fig. 3 ist die dispersive Aufspaltung und Zusammenführung eines roten Anteils r und
eines blauen Anteils b unter Passieren des Manipulators 2 sowie der
Wellenlängenverlauf entlang einer Richtung X auf dem Manipulator 2 schematisch
dargestellt.
Nachdem im Pulsformer das zeitliche Verhalten verändert werden kann gelangen die
Lichtpulse über entsprechende optische Komponenten über das Mikroskop M und das
Objektiv O in die Probe P. In der Probe P wird aufgrund der starken Fokussierung durch
das Objektiv und der hohen Pulsspitzenleistung der Lichtpulse ein nichtlinearer Effekt
angeregt. Dieser wird vom Detektor (4) registriert. Somit steht ein entsprechendes
Meßsignal zur Verfügung, daß durch die elektronische Ansteuerung des Pulsformers
mittels der Regelung R optimiert werden kann.
Die Wirkungsweise der Regelung soll nun beispielhaft anhand der Erzeugung eines
Zwei-Photonen-Fluoreszenzsignales beschrieben werden.
Das Zwei-Photonen-Fluoreszenzsignal (S) kann wie folgt beschrieben werden:
wobei Pavg die mittlere Leistung und τ die Pulslänge der Lichtpulse am
Ort
der Probe sind. A steht für den Strahlquerschnitt am Ort der Probenwechselwirkung.
Aus der obigen Gleichung ist ersichtlich, daß das Zweiphotonen-Fluoreszenzsignal mit
kleiner werdender Pulslänge und Strahlquerschnitt und größer werdender mittlerer
Leistung wächst. In einem Mikroskop wird die Pulslänge durch folgende Faktoren
beeinflußt, d. h. meist verlängert:
- - Durch die Glasmaterialien aus denen die optischen Elemente im Mikroskop gefertigt sind. Eine Kompensation kann hier stationär erfolgen.
- - Durch das Präparat an sich. Die Pulsverlängerung ist hier abhängig von der Eindringtiefe in das Präparat. Weiterhin wird die Pulsverbreiterung durch Dispersionen höherer Ordnung erzeugt. Deshalb muß hier die Kompensation für jede spektrale Komponente einzeln und in Echtzeit erfolgen.
- - Durch die Änderung der Wellenlänge
- - Durch die Änderung der mittleren Leistung.
Der Pulsformer PF und damit das zeitliche Verhalten der Lichtpulse wird deshalb in
Abhängigkeit von den o. g. Größen durch die Regelung in Echtzeit eingestellt, wobei als
Meßgröße das Zweiphotonen-Fluoreszenzsignal fungiert. Durch den Pulsformer wird im
wesentlichen die Pulslänge und die mittlere Leistung am Ort der Probenwechselwirkung
optimiert.
Weiterhin sind die Wechselwirkungsquerschnitte der verwendeten Farbstoffe abhängig
von dem zeitlichen Verhalten der Lichtpulse. Somit ist es möglich das
Fluoreszenzsignal für einzelne Farbstoffe zu optimieren, wobei die Fluoreszenz anderer
Farbstoffe gleichzeitig unterdrückt wird. Dies ist in der Literatur unter dem Begriff der
kohärenten Kontrolle bekannt. Man hat also die Möglichkeit durch die Rückkopplung
der Meßgröße (hier das Zweiphotonen-Fluoreszenzsignal) das zeitliche Verhalten der
Lichtpulse durch Phasen- oder Amplitudenmodulation so einzustellen, daß die
entsprechende Meßgröße optimiert wird.
Claims (23)
1. Vorrichtung zur Einkopplung eines Kurzpulslasers in einen mikroskopischen
Strahlengang, wobei die spektralen Komponenten der Laserstrahlung mit Hilfe eines
dispersiven Elementes (1) räumlich separiert, die einzelnen spektralen Komponenten
manipuliert und anschließend wieder mit Hilfe eines weiteren dispersiven Elementes
(3) räumlich überlagert werden.
2. Vorrichtung zur Einkopplung eines Kurzpulslasers in einen mikroskopischen
Strahlengang nach Anspruch 1, wobei die spektralen Komponenten der Laserstrahlung
mit Hilfe eines dispersiven Elementes (1) räumlich separiert, in der Fourierebene/Brenn
ebene eines Abbildungsungselements Komponenten manipuliert (Manipulator 2)
und anschließend wieder mit Hilfe eines weiteren dispersiven Elementes (3) räumlich
überlagert werden.
3. Vorrichtung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die
spektralen Komponenten nach der Manipulation (2) an einem Spiegel reflektiert werden
und mit Hilfe des dispersiven Elementes (1) wieder überlagert werden.
4. Vorrichtung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das
Mikroskop ein Laser-Scanning Mikroskop ist.
5. Vorrichtung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das
Mikroskop zur Untersuchung von nichtlinearen Kontrastverfahren eingesetzt wird.
6. Vorrichtung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei als
dispersives Element Prismen oder Gittern eingesetzt werden.
7. Vorrichtung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der
Manipulator (2) eine Amplitudenmodulation der spektralen Komponenten erzeugt.
8. Vorrichtung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der
Manipulator (2) eine Phasenmodulation der spektralen Komponenten erzeugt.
9. Vorrichtung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der
Vorrichtung zur Einkopplung eines Kurzpulslasers eine Monomode-Faser F
nachgeschaltet ist.
10. Vorrichtung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die
Monomode-Faser auch polarisationserhaltend wirkt.
11. Vorrichtung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei als
Manipulator (2) ein räumlicher Lichtmodulator (spatial light modulator - SLM) in der
Fourierebene verwendet wird.
12. Vorrichtung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei durch
Rückkopplung des Meßsignals (4) der Manipulator (2) gezielt optimiert und damit das
gewünschte Meßsignal eingestellt wird.
13. Vorrichtung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei durch die
Rückkopplung die Phasenmodulation im Modulator (2) zur Kompensation der
Dispersion höherer Ordnung eingesetzt wird.
14. Vorrichtung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei durch die
Rückkopplung die Phasenmodulation im Modulator (2) in Abhängigkeit von der
Mittenwellenlänge des Kurzpulslasers (6) optimiert wird.
15. Vorrichtung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei durch die
Rückkopplung die Phasenmodulation im Modulator (2) in Abhängigkeit von dem
verwendeten Objektiv optimiert wird.
16. Vorrichtung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei durch die
Rückkopplung die Phasenmodulation im Modulator (2) in Abhängigkeit von der
verwendeten mittleren Leistung optimiert wird.
17. Vorrichtung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei durch die
Rückkopplung die Phasenmodulation im Modulator (2) in Abhängigkeit von der
Eindringtiefe (5) in ein zu untersuchendes Präparat eingestellt und damit ein nichtlinear
angeregtes Fluoreszenzsignal optimiert wird.
18. Vorrichtung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei mit Hilfe
eines adaptiven Elementes AO zusätzlich die Pulsfront und die spherischen
Aberrationen optimiert werden.
19. Vorrichtung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei durch die
Rückkopplung die Phasenmodulation im Modulator (2) in Abhängigkeit von dem
verwendeten Objektiv optimiert wird.
20. Vorrichtung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei mittels
Phasen- und Amplitudenmodulation im Modulator (2) ein gezieltes Anregen von
Fluoreszenzfarbstoffen erfolgt.
21. Vorrichtung nach 19, wobei dies selektiv erfolgt.
22. Vorrichtung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei mittels
Phasen- und Amplitudenmodulation im Modulator (2) ein gezieltes Auslösen von
Reaktionen (FRET, Uncaging) in Fluoreszenzfarbstoffen erfolgt.
23. Vorrichtung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei mittels
Phasen- und Amplitudenmodulation im Modulator (2) ein gezieltes Bleichen von
Farbstoffen erfolgt.
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