JP5228168B2 - 試料の光学的検査のための方法および装置 - Google Patents

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Description

例えば生物学的プレパラートの検査のための顕微鏡観察では、今日、多光子吸収または第2高調波発生(SHG)などの非線形コントラストがますます頻繁に使用されている。非線形効果の励起に必要なエネルギーを準備するには、短パルスレーザの使用が有利である。その場合、パルスのピーク出力はできる限り大きくしなければならないだろうが、それと同時にプレパラートの損傷を防止するため、試料スポットのパルス長はできる限り小さくすべきであろう。短パルスレーザは、例えば、パルス長が、数10fs(フェトム秒)で、繰返し率が、数10MHzの光インパルスを供給する。これは、このように、平均出力は小さいままで極端に高いパルスピークエネルギーを放出するという長所を持っている。
短パルスの短所は、顕微鏡を通って試料に到る途中で群速度分散(GVD)により変化が起きることである − 通例では長くなる。
パルス長拡大の補償に然るべき装置が提案された。
DE 19827139 A1 DE 19744302 A1 DE 19930532 A1
上記の装置は、本質的には第2級分散の補償にしか適していない。したがって、高次分散が発生する場合は十分に役立たない。すなわち、これではパルス長拡大は完全には補償し得ない。そして、例えば生物学的プレパラートの場合では、前もって予測し得ない高次分散を想定しておかねばならない。また、顕微鏡内の光学コンポーネントにも高次分散が発生する。そのため、従来技術では非線形コントラストの励起に際し最適条件を作り出すことは不可能である。
そのほか、高いパルスピーク出力またはパルスピーク強度によって、相互作用発現の望まれる領域から外れた部分で試料が損傷を受けたり、顕微鏡装置の光学系が損傷を受けかねないという短所がある。
従来の蛍光顕微鏡検査では、生物学的プレパラートの特殊マーキングに様々な色素が使用されている。これらの色素は、続いての作業過程で様々な光波長によって励起される。そのようなプレパラートでは、多光子励起の利用により殆どの場合異なった色素の同時励起が行われる。これは、一方では、励起に光の1波長しか必要としないので長所になる。他方、個別色素の放出波長帯域がオーバラップする場合にはもはや色素をスペクトル分離することができないので、これは短所でもある。
本発明はこれらの短所を解消するものである。
それは、独立請求項に記載された手段および作業ステップにより行われる。
有利な実施態様は従属請求項の対象である。
本発明によれば、フーリエ平面における光パルスの振幅変調および/または位相変調を、対応の顕微鏡内測定量(例えば、2光子蛍光信号)が最適化されるように、フィードバック過程を通じて変更することが可能であり有利である。さらに、本発明に基づく配置によれば試料スポットで高いパルスピーク出力を得ることが可能な上、顕微鏡装置内においても、または測定量の励起が行われるべき焦点領域から外れた層においても損傷作用が発生することがない。この配置によれば、試料内にフォーカシングする光学系の設置最適化のために、ビーム横断面の可変的適合化も可能である。
短パルス光源LQからコヒーレント光(短パルスレーザ)または時間的インコヒーレント光(広帯域または白色光源)が発せられ、好ましくもそれがコリメートされて、第1分散素子D1、例えばプリズムまたは格子に到達する。この分散素子は、到達ビームを、中心波長の周辺方向にスペクトル別に分解するので、各光パルスのスペクトル成分、ここではl1〜l5と記されたスペクトル成分が空間的に分離される。
第2分散素子D2は、スペクトル分解の点では本質的に同じ特徴を持っているが、しかし第1素子D1に対して空間的に相対する位置に配置されている。
それにより、光は(コリメートされて)再び平行に進むが、しかし空間的にスペクトル分解されたままで、ここではただX/YスキャナSCと対物レンズOだけで示されている、試料Tの光学走査のための装置を通り抜ける(図1)。この場合X/Yスキャナは、対物レンズO後方のひとみ近くに設置されている。このことは、対物レンズ焦点距離fの記入により図面上に暗に示されている。
ビームは対物レンズを通過して試料Tの方向へ再び集束される。すなわち、スペクトル分解が対物レンズOの焦点位置で解消されて元に戻され、それにより光源LQの光パルスが再構成される。
このように、素子D1と対象物T間ではスペクトル成分が空間的にオーバラップしないので短パルスは存在しない。D1とO間の領域における光パルスの長さは、光パルスを分解する空間的スペクトル分解能に依存する。
この種の装置では、少なくとも領域3においては光パルスの通過する光学系を極めて短いパルスによる、または極めて高いパルスピーク出力による損傷から護る必要のないことが1つの長所である。高いパルスピーク出力は、相互作用を起こす正にその試料スポットにおいて、すなわち、例えば色素との非線形相互作用(例えば、2光子蛍光励起)もなされる試料内焦点領域において初めて現われる。これにより、試料は少なくとも、相互作用の行われるべき領域から外れた部分では損傷から護られる。他方、使用可能な材料および光学層の範囲が広がるので、試料への結像に用いる光学装置の補正がより適切に実施できる。それによりコストの節減も可能である。
また別な長所として、例えば位相板PPなど、光パルスへの影響に空間的差異をもたらす装置をコリメートされた光路内に、例えばスキャナSCの前に挿入することが可能である。位相板は、屈折率の変更用として、特定領域ではその横断面に沿う方向では厚さが異なっているので、特定のスペクトル成分は他のスペクトル成分に対し時間差を生じて遅延する。これにより、光源LQから試料Tまでの、その途中に加えられたガラス材OMを含めた全光路における光学系の群速度分散GVDを補償することができる。
形態の異なるこの種の位相板を複数枚使用することによって、光パルスの形態に影響を与えることができる。空間的に離れた成分の位相間における相互調整は、例えば、個別制御の可能な素子(マトリックス形態であれば有利)を持つ空間光変調器SLMを、光路内PPの近くに、それに代えて、またはそれに加えて配置することでフレキシブルに実施することもできる。
そのほか、素子D1およびD2をビームの可変的拡大に使用できるという長所もある。その目的には素子D1とD2間の距離を変更する。それにより、素子D1およびD2の形態次第では、少なくとも1空間方向においては両素子間の距離(図3a、4a、6aのS1およびS2参照)に依存したビームの拡大が得られる。
主として平行な光路内に、それも好ましくはD2とスキャナSC間に、例えば、後に説明する別な検出器による試料反射光の平行捕捉のために少なくとも1つの別な光源をビームスプリッタを通じて組入れることができる。
図2はレーザ走査型顕微鏡の場合と同様の配置であり、ピンホール光学系PO、ピンホールPH、検出器DE1、DE2、照明光路から検出光を切り離すための、スキャナSCの後方に設置された第1ダイクロイックビームスプリッタ(メインカラースプリッタ)MDB1(デスキャン検出)、走査光学系SO、中間像ZB、鏡筒レンズおよびノンデスキャン検出DE3のための別な検出光路が描かれている。
この場合、ノンデスキャン検出光の反射分離は、別なダイクロイックビームスプリッタMDB2を通じて行われる。検出光の複数検出チャネルへの追加的分割は、例えば2つのチャネルDE1およびDE2への分割はまた別なダイクロイックビームスプリッタMDB3を使用して行うことができる。検出器の前には、それも好ましくはMDBとDEとの間に、蛍光信号の測定のために然るべきフィルタが旋回挿入される。ここではPは顕微鏡対物レンズOのひとみを表わしている。この平面に共役な、顕微鏡装置の別なひとみ平面に試料走査のためのスキャナSCが設置されている。
光源DISPのスペクトル成分をスペクトル別に空間分割するユニットは、既に上で説明した素子D1とD2から成っている。これはコリメートされた光路内に、それも好ましくは光源とMDB1間に設置され、光パルスのスペクトル成分をスペクトル別に空間分割する他、ひとみPへの照射を最適化するために光源のビームを拡大する作用も有している。ユニットDISPは、一般にはこれに加えてプリチャープユニットのような作用も行う。すなわち、これは顕微鏡光学系のGVDにおける少なくとも1つの成分に対する補償のために使用することもできる。補償における調整の可能性については、図11を手掛かりに説明している。
残りのGVDの補償は、コリメートされた光路内に、例えばスキャナSCの前に、横断面方向の厚さが異なり、例えばプレートの少なくとも1側面または両側面が湾曲している、または楔形である位相板PP(前出箇所参照)を設置することにより行える。
湾曲度は、光学系の残余GVDが光源LQから試料Tまでの光路内で補償されるように、つまり光パルスの個別スペクトル成分を時間的にずらすことで、帯域幅の制限されたパルス長、換言すれば、できる限り短いパルス長が試料スポットに現われるように調整されている。
異なった湾曲度を持つ複数のこの種位相板の使用により、パルスの形態にさらに影響を与えることができる。顕微鏡では下記ファクタの作用があるため影響を与える必要がある。その作用により、試料スポットにおける影響ではパルス長に対して効果がなく、殆どの場合もはや帯域幅の制限はなされない。すなわち、パルスの延長が起きる :
・ 顕微鏡内の光学素子を構成するガラス材の作用。この場合補償は恒常的に行うことができる。
・ プレパラート自体の作用。この場合パルスの延長はプレパラートへの浸透度に依存する。そのほか、パルスの拡大は高次分散によっても惹き起こされる。したがって、ここでの補償は個々のスペクトル成分ごとにリアルタイムで行わねばならない。
・ 波長変化による作用。
・ ガラス繊維内に自己位相変調など、追加的な非線形プロセスが現われた場合における平均出力の変化による作用。
以上より、SLMの使用が非常に有利であり、既に上述したように、空間的に離れた成分の位相間における相互調整は、個別制御の可能な素子(マトリックス形態であれば有利)によりフレキシブルに行うことができる。素子の制御は、上記ファクタ量の依存下で、好ましくはリアルタイムでの調整により行われる。その場合、例えば、試料T内で励起される2光子蛍光信号が測定量として機能する。殆どの場合では然るべき調整により、試料の相互作用スポットにおけるパルス長の最適化が達成される。
そのほか使用色素に関しては、相互作用における特性が光パルスの時間的挙動に依存している。したがって、個別色素ごとに蛍光信号を最適化することが可能である。その場合、他の色素の蛍光はそれと同時に抑制される。このように、測定量(この場合では2光子蛍光信号)をフィードバックして当該測定量が最適化されるように、光パルスの時間的挙動を位相変調または振幅変調を通して調整することが可能である。
図3aおよび4aには、光源DISPのスペクトル成分、すなわちD1およびD2用のスペクトル成分をスペクトル別に空間分割するためのユニットにおける典型的な配置が示されている。
図3には2つのアキシコンD1D2が描かれているが、そのうちD1の方が例えば頂点の方から照明される。両アキシコンは、第1アキシコンが角分散を取り込んで、第2アキシコンがそれを元どおりに補償して、その結果第2アキシコンの後方ではビームが再び平行になるというように、配置および構成されている。
すなわち、D2はD1と一緒にフラットプレートの役割をするように構成されることがとりわけ多い。具体的に言えば、D2がプリズム状またはアキシコン状の刳り抜き部を持つフラットプレートをなしていて、そこへD1が(理論的には)ピッタリはまり込みD2と共にフラットプレートを形成する。
アキシコンは、プリズム状に研磨されたガラスプレート(屈折素子)から構成するか、または角分散の増長のため、例えばリング状の格子構造を持つ回折素子から構成することもできる。アキシコンの定義については、特にhttp://www.sciner.com/Opticsland/axicon.htmが参考になる。
図4は2つのプリズムD1D2を持つ装置を示したものであるが、D1は、例えば頂点の方から照明される。ここでも、第1プリズムが角分散を取り込んで、第2プリズムがそれを補償して、その結果、第2プリズムの後方ではビームが再び平行になるというように構成されている。
構成については図3に対する注釈を参照のこと。
図3c、4cにはそれぞれ第1素子前方のビーム分布が、図3b、4bには第2素子後方のビーム分布が描かれている。
プリズム使用の場合ではスペクトル成分l1、l2….は分割されて列状に相並ぶが、アキシコン使用の場合では複数の平面にリング状に現われる。その場合各スペクトル成分は一定のリングを形成する。
矢印S1、S2より、図示されていない制御ユニットを通じて制御される、場合によっては相互に連結もされる両分散素子の接近、離反方向の動きが見て取れる。この移動が、既に説明したビーム拡大への適合化のほか、加えて試料Tスポットにおけるパルス長変更の作用もする(例えば、DE 19744302A1、DE 19930532A1参照、空間分割は保持)。
本発明によれば、説明したパルス形態の調整は、上記に加え顕微鏡の他の制御機能と、例えば、特定試料領域の撮像過程における照明のスペクトル組成および/または強度を変更するための制御機能(DE 19829981A1)と組合せて行うこともできる。その制御は顕微鏡の中央制御ユニットを通じて行われる。
光源の中心波長を変更する場合、予備保存データからD1、D2相互間の新規設定を行うことができる。
図5にはアミチプリズムとも云われる直視プリズムGPを有する別構成のユニットDISPが描かれている。この場合、直視プリズムは光源のスペクトル成分に対し調整し得ない固定的分割をなし、それと共にビームの固定的拡大をももたらす。光パルスのスペクトル成分は、それに続き、再び空間的に平行な方向に向けられる。
この配置によるDISPの場合、高い透過率および機械的に安定な構造が極めて容易に実現できるところが長所である。
図6は2つの透過性格子を持つまた別な配置を示している。ビームの進行経過は本質的には図4における配置の場合と同様である。しかし、格子の使用により角分散を増大させることができる。格子使用の場合、それに加えて光軸上では格子の回折次数が零位になる。これは、図では0と表示されている。
第1透過性格子後方の第1回折次数が第2格子の負の回折次数に移行する。それによって角分散は止まるが、しかしビームは空間分離されたままである。
素子D1およびD2の典型的な構成には、図3〜6に示された配置のほか、原則的には、反射性格子などの反射性素子または角分散のほか、偏向をも誘導する素子(例えば、分散プリズム − 部分図Aまたは反射性格子 − 部分図B)も使用することができる(DE 19744302A1参照)。
図11は、そのような配置を模式的に示したものである。この配置では中心波長を変更する場合には、分散素子D1、D2自体を相対的に相互移動させねばならないだけでなく、光源LQからD1までを含めた光路またはD2から試料Tまでを含めた光路も移動させねばならない。移動Bは矢印が示す方向に行われる。この場合では、光源を出発点として形成される光軸に垂直な方向である。
図7は、焦点、すなわち試料Tスポットにおける、1つに基準化された横方向の強度分布を示している。現状技術に基づく照明の場合を参照分布(1)として描いてある。その場合、光源のスペクトル成分はすべて、試料にフォーカシングする光学系のひとみを均等に照らしている。
比較のため、本発明に基づく図3形式の配置によりひとみを照明した場合の強度分布(2)も描き込まれている。曲線(2)は参照曲線(1)とは末梢部分で異なるだけであり、特に多光子顕微鏡検査では比較可能な光学的分解能が達成できるのが認められる。
図8は、素子D1およびD2を図3に従って構成した典型例での強度分布、つまり焦点および光軸における、1つに基準化された強度分布(パルス分布)を時間の関数で示したものである。P1はレーザ出力部におけるパルス分布を表わしている。P2は分散素子D1と試料T間でのパルス長である。曲線P3には試料Tスポットにおけるパルス分布が描かれている。それより、素子D1と試料T間においては(示された時間枠の中では)レーザ強度が殆ど一定していること、そのためピーク強度は小さいということが分かる。その結果、この領域ではパルスのピーク出力は小さい。しかし、試料スポットでは、すなわちスペクトル成分の空間重畳の後には、レーザ出力部のパルス分布とほぼ一致するパルス分布が得られる。
図9は、レーザ走査型顕微鏡における別な配置を模式的に示している。この配置は本質的には図2に基づく配置と同じである。しかし、光源LQと第1分散素子間にはガラス繊維結合用の2つの光学系を持つ単一モードガラス繊維および追加の分散素子Dが配備されている。この分散素子は、最も簡単な例では高分散性のガラス材、または二酸化テルルTeOなどの結晶から成るブロックとすることができる。しかしこの場合では、例えばPPポイントにおいて光源LQと試料T間の光学装置全体の総分散GVDに対する然るべき補償が想定されていなければならない。分散ユニットDは、DE 19744302A1、DE 19930532A1に基づき調整可能なように構成することもできる。その場合ではユニットDがGVDの全補償を行うことができるので、PPポイントにおける位相板または屈撓性ユニットは省略することができる。図9に基づく配置によれば、ガラス繊維内の強度が高い場合に現われ得る自己位相変調SPMの補償のために、素子D1およびD2によって持ち込まれたGVDを然るべき形で利用できるという利点がある。ここに描かれた配置の場合、素子D1およびD2によってもたらされる分散を一段と高く選定し得るという点が特に有利である。それにより、ガラス繊維を通じての伝送可能平均出力、延いては試料Tスポットにおける達成可能なピーク強度が上昇する。D、ファイバおよびD1/D2による作用合成効果についてはDE 19827239A1が参考になる。
図10は、また別な構造を持つガラス繊維装備のレーザ走査型顕微鏡を示したものである。この場合は、図9とは異なり、ガラス繊維束FBが素子D1とD2の間にある。光は2つのレンズL1およびL2によりガラス繊維に対して連結または遮断される。レンズL1およびL2の一方の焦点にはそれぞれガラス繊維が存在し、もう一方の焦点には分散素子D1およびD2が存在する。レンズの焦点距離は同じである必要はない。しかし、異なった焦点距離を選択した場合は、格子D2をそれ相応に適合させる必要がある。繊維束の幾何学構造の如何は分散素子D1およびD2の選択次第である。例えば、図3に描かれたような素子を使用する場合、繊維束は図10aに描かれたような円形横断面を持つものでなければならない。図4〜6に描かれた素子を使用する場合は、個々の繊維が列になって繊維束として配置されていなければならない。図10a/bに、繊維束の概要が示されているが、その場合、個別繊維の見本は黒塗りで描かれている。個別繊維の前には、繊維への連結効率を高めるためマイクロレンズを配置することも可能である。
D1の作用により、それぞれの繊維には特定のスペクトル領域しか連結されないので、繊維ではパルスは発現しないか、または非常に長いパルスが発現するだけであり、したがって、通常なら、それも特に繊維内では損傷作用を惹き起こしかねないパルスピーク出力またはパルスピーク強度もこの場合では極小さなものに過ぎない。このように繊維を経由させることにより、一段と高い平均出力をパルス形態に変化のないまま誘導することができる。
ガラス繊維束から外れたスペクトル成分はL2によりコリメートされる。その場合、個々のスペクトル成分は平行な繊維束として相互に切り離される。角分散の継続がD2により改めて打ち切られるが、スペクトル成分はなお空間分離したままである。後続の光学系は、既に図2を手掛かりに説明したコンポーネントに相当するものである。光軸に沿う方向での移動S2によっても、試料内へフォーカシングする光学系の照明を調整することができる。
個別スペクトル成分と光パルスの群速度分散GVDとの走行時間差の補償は、PPにより、好ましくは線形またはマトリックス形に配置された屈撓性ユニット(SLM)により行われる。
ガラス繊維束を上記のように配置することにより、光源、スペクトル分割器D1および繊維への結合器から成るモジュールおよび繊維束後方の第2分散素子D2付き顕微鏡モジュールを持つ新たな有利な配置が得られるが、これらはこのように互に独立していて、個別に取換可能なように形成することができる。
本発明の基本原理の模式図 レーザ走査型顕微鏡と同様の配置 スペクトル別に空間分割するためのユニットにおける典型的な配置 スペクトル別に空間分割するためのユニットにおける典型的な配置 直視プリズムを有する別構成のユニット 2つの透過性格子を持つ別な配置 焦点(試料スポット)における基準化された横方向の強度分布 図3に従って構成した典型例での強度分布 レーザ走査型顕微鏡における別な配置を模式 別な構造を持つガラス繊維装備のレーザ走査型顕微鏡 図10の配置の模式図
符号の説明
LQ 短パルス光源
D1、D2 分散素子
SC X/Yスキャナ
O 対物レンズ
T 試料
f 焦点距離
OM ガラス材
PO ピンホール光学系
PH ピンホール
DE 検出器
MDB ダイクロイックビームスプリッタ
SO 走査光学系
ZB 中間像
DISP 光源

Claims (19)

  1. 試料の光学的検査のための方法であって、
    短パルス照明光の生成
    照明光の空間分離されたスペクトル成分を生成するための照明光スペクトル分割
    伝送光学系によるスペクトル成分の試料方向への誘導
    分離されたスペクトル成分が、対物レンズにて再び集束されて、照明光の光パルスが再構成され、試料上または試料内へフォーカシングされることであってスペクトル成分が重畳されている、フォーカシングされること
    のステップを備えることを特徴とする方法。
  2. 空間分離されたスペクトル成分が、平行な光線束に変換される、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
  3. 試料上または試料内にフォーカシングされたスペクトル成分のパルス長を、空間分離したスペクトル成分のパルス長より小さくする、ことを特徴とする請求項1または2に記載の方法。
  4. 試料の光学的検査のための装置であって、
    短パルス照明光の生成器
    前記生成器の後方に配置された、照明光の空間分離されたスペクトル成分の生成のための照明光スペクトル分割器
    分離された照明光の平行化調整器
    料上または試料内への照明光フォーカシング器であって、分離されたスペクトル成分が、前記フォーカシング器にて再び集束されて、照明光の光パルスが再構成され、試料上または試料内へフォーカシングされ、ここで、スペクトル成分が重畳されている、前記フォーカシング器と、
    試料光検出器を含む、
    ことを特徴とする装置。
  5. 試料の光学的検査のための装置であって、
    短パルス照明光の生成器
    前記生成器の後方に配置された、照明光の空間分離されたスペクトル成分を生成するための照明光スペクトル分割器
    試料方向へのスペクトル成分伝送のための伝送光学系
    料上または試料内への照明光フォーカシング器であって、分離されたスペクトル成分が、前記フォーカシング器にて再び集束されて、照明光の光パルスが再構成され、試料上または試料内へフォーカシングされ、ここで、スペクトル成分が重畳されている、前記フォーカシング器と、
    試料光検出器を含む、
    ことを特徴とする装置。
  6. 空間分離されたスペクトル成分を平行な光線束へ変換するための手段が配備されている、ことを特徴とする請求項4または5に記載の装置。
  7. 試料上または試料内にフォーカシングされたスペクトル成分のパルス長を、空間分離したスペクトル成分のパルス長より小さくする、ことを特徴とする請求項4から6のうちの1つに記載の装置。
  8. 光源とスペクトル分割器の間に、調整可能な光線分散手段が配備されている、ことを特徴とする請求項4から7のうちの1つに記載の装置。
  9. 伝送光学系としてガラス繊維束が装備され、これに対し平行光線束の連結および遮断が行われる、ことを特徴とする請求項5から8のうちの1つに記載の装置。
  10. スペクトル分割が、少なくとも1つのプリズムおよび/またはアキシコンおよび/または透過性格子および/または反射性格子によって行われる、ことを特徴とする請求項4から9のうちの1つに記載の装置。
  11. 平行光線束への変換が、別のプリズムまたは別のアキシコンまたは別の格子によって行われる、ことを特徴とする請求項4から10のうちの1つに記載の装置。
  12. 第1プリズムと第2プリズムまたはアキシコンとが、それらが共同でフラットプレート作用をするように構成されている、ことを特徴とする請求項11に記載の装置。
  13. 分割および集束のために直視プリズムが配備されている、ことを特徴とする請求項4から12のうちの1つに記載の装置。
  14. 主として平行光路において、コンポーネントに影響を与えるための補償素子が配備されている、ことを特徴とする請求項4から13のうちの1つに記載の装置
  15. コンポーネントに対する調整可能な影響が、異なった横断面構造を持つ取換可能な光学素子および/または空間光変調器(SLM)によって与えられる、ことを特徴とする請求項14に記載の装置。
  16. 蛍光顕微鏡に使用される請求項4から15のうちの1つに記載された装置。
  17. 多光子顕微鏡に使用される請求項4から15のうちの1つに記載された装置。
  18. レーザ走査型顕微鏡に使用される請求項4から15のうちの1つに記載された装置。
  19. 非線形レーザ走査型顕微鏡検査に使用される請求項4から15のうちの1つに記載された装置。
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