JP3423085B2 - 免疫測定法 - Google Patents

免疫測定法

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【発明の詳細な説明】 【0001】 【産業上の利用分野】本発明は、抗原抗体反応の妨害物
質であるリウマチ因子の影響を回避することができる免
疫測定法に関する。 【0002】 【従来の技術】免疫測定法は、尿、血清、組織片等のヒ
トから採取した生体成分を検体として分析、同定し、そ
の中の微量成分を検出することにより、疾病等の生体の
異常を診断する臨床検査法であり、抗原抗体反応の反応
特異性、結合強度等を利用する方法として、広く用いら
れている。しかし、免疫測定法の測定対象となる検体中
には、個体特性、採取条件等により、生体成分であるリ
ウマチ因子(以下「RF」という)等が混在しており、
これらが抗原抗体反応を妨害し、誤診を起こすので、こ
れら妨害物質の影響を解消、軽減する種々の手法が検討
されている。 【0003】生体成分を検体とする免疫測定法では、抗
原抗体反応を起こす条件を生体内の状態に近づける目的
で、試薬系のpHを6.0〜8.0の中性付近に調整す
ることが通例であった。しかし、こうした条件下では、
稀に検体中のRFが、試薬系に含まれる抗原又は抗体と
反応し、自己凝集を引き起こすことがあった。RFは、
自己抗体であり、変性ヒト抗体分子のFc部分に対して
反応することが知られているが、RF濃度、純度等が特
定の条件下では異種抗体分子に対して反応するケースも
あり、これが異種抗体を用いた臨床検査で抗原抗体の特
異的反応を妨害する。こうしたRFによる測定の妨害を
回避するため、検定の前に血清中の内因性のRFを不活
性化するか、又は、除去する等の前処理が通常必要で、
この前処理をしなければ測定の結果は著しい誤差を生じ
る場合がある。 【0004】特開昭54−119292号公報には、こ
の妨害反応を回避する目的で、異種抗体分子のFc部分
を酵素反応で取り除いたF(ab′)2 分子を、抗体と
して用いる免疫測定法が開示されている。しかしなが
ら、このような免疫測定法は、酵素反応、精製等の原料
調製のための煩雑な工程が加わるため、コストアップ、
製造ロット間差につながる場合があった。 【0005】上述のように、従来の免疫測定法では、検
査の煩雑さ、遅延化につながり、試薬製造工程を繁雑に
し、製造ロット間差を引き起こす等の問題があった。そ
こで、これら問題を回避するため、抗体分子を酵素処理
しない試薬を用いて、採取した生体成分を測定する方法
の確立が望まれていた。 【0006】 【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記に鑑
み、リウマチ因子と異種抗体分子との相互作用を軽減
し、リウマチ因子の測定への影響を回避することができ
る免疫測定法を提供することを目的とする。 【0007】 【問題を解決するための手段】本発明の要旨は、ヤギ由
来の抗体をラテックス粒子に担持させたラテックス試薬
と検体とを混合し、免疫凝集反応により抗原を測定する
免疫測定法において、検体のpHを一旦1〜4に低下さ
せる前処理をすることなく、反応液のpHを、4.0〜
6.0に維持するところに存する。 【0008】上記ラテックス粒子に担持させる抗体は、
ヤギ由来の抗体である。上記ラテックス粒子としては特
に限定されず、例えば、有機高分子粉末等が挙げられ
る。上記有機高分子粉末の素材としては、例えば、ポリ
スチレン、スチレン−スルホン酸塩共重合体、メタクリ
ル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリル−ブ
タジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸
エステル共重合体、ポリ酢酸ビニル−アクリレート共重
合体等の重合体等が挙げられる。特にこれらの重合体の
粒子粉末を均一に懸濁させたラテックス等が好適に用い
られる。 【0009】上記ラテックス粒子の平均粒径は、検体中
の抗原の検出方法、検出濃度又は検出機器等によって適
宜選択されるが、通常0.05〜1.0μmであり、な
かでも0.05〜0.5μmが好ましい。 【0010】上記抗体を上記ラテックス粒子に担持させ
るには、通常の化学結合又は物理吸着が適用でき、上記
ラテックス試薬を得ることができる。上記ラテックス試
薬と検体中の抗原との免疫凝集反応を行う反応液のpH
は、4.0〜6.0である。pHが4.0未満である
と、ラテックスの自己凝集、抗原抗体反応の抑制等がお
こり、検量線が高値で再現性が悪く、目的とする反応性
を得ることができず、pHが6.0を超えると、RFが
CRP測定値に影響を与えて本発明の目的を達成できな
いので、上記範囲に限定される。 【0011】上記反応液を構成する緩衝液としては、測
定条件により適宜選択されるが、例えば、リン酸緩衝
液、リン酸−クエン酸緩衝液、酢酸−酢酸ナトリウム緩
衝液等が挙げられる。 【0012】上記ラテックス試薬には、保存安定性を向
上させる目的で、牛血清アルブミン(BSA)、塩化コ
リン等の第4級アンモニウム塩;糖類等の安定化剤等を
添加することができる。 【0013】また、上記ラテックス試薬の凝集反応を促
進する目的で、緩衝液中に、ポリエチレングリコール、
デキストラン等の水溶性高分子を添加することも有効で
ある。 【0014】上記反応を行う場合の反応温度は、4〜5
0℃が好ましく、20〜40℃がより好ましい。本発明
の免疫測定法においては、通常の光学的測定法を適用で
き、例えば、散乱光強度、吸光度又は粒子数のいずれを
測定してもよい。測定波長は、一般に300〜1000
nmを使用することができる。 【0015】 【実施例】以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説
明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるもの
ではない。 【0016】実施例1〜2及び比較例1〜3 ヒトCRP測定用ラテックス試薬の反応液のpHを調製
し、CRP測定値に与えるRFの影響を調べた。ラテックス試薬の調製 約0.15μmの粒子サイズのポリスチレンラテックス
粒子1gに対し、ヤギ由来抗ヒトCRP抗体を0.1g
の割合で吸着させ、B/F分離後、1%牛血清アルブミ
ンを含む36mMリン酸緩衝液(pH6.5)中にラテ
ックス濃度5.0g/lとなるよう懸濁させたヒトCR
P測定用ラテックス試薬を用いた。 【0017】ラテックス希釈液の調製 上記ヒトCRP測定用ラテックス試薬を用いて、血清中
のCRPを測定する場合に、反応性、pH等を調整する
目的でラテックス希釈液を用いることがあり、pHの効
果を調べる目的で、希釈液にpHの異なる緩衝液を用
い、反応液のpHを変えて測定を行った。上記希釈液に
は、1%牛血清アルブミンを含む20mMクエン酸−リ
ン酸緩衝液を使用し、クエン酸−リン酸の混合比を変え
ることで最終測定時のpHが3.5(比較例1),4.
5(実施例1),5.5(実施例2),6.5(比較例
2),7.5(比較例3)となるようにpHを調整し
た。 【0018】測定方法 測定には、日立7150形自動分析装置(日立製作所社
製)を用いて測定波長700nmで行った。以下にその
手順を示した。先ず、水ブランクの吸光度を測定し、次
いで検体(S)と第一試薬(R1)250μlとを添加
し、R1添加後、測定終了までの10分間の反応液の吸
光度を20秒間隔で測定し、水ブランク値を差し引いた
値を吸光度として用いた。第2試薬(R2)250μl
の添加は、R1の添加5分後に行った。即ち、R1の添
加から5分間以内の吸光度測定は、SとR1の反応液に
ついて、一方、R1の添加から5分後以降の吸光度測定
は、SとR2の反応液について行った。 【0019】ここでは、0濃度標準品(positio
n 1)に生理食塩水、CRP標準品(positio
n 2)に5.0mg/dlCRP標準血清(極東製薬
社製)を用いて出力の更正を行った。即ち、5.0mg
/dl標準血清による吸光度の上昇分を演算処理により
求め、これを5.0〔mg/dl〕と読み替え、更正後
に出力するデータは、検体と標準血清の吸光度上昇分の
比から、濃度換算した値となる。例えば、検体による吸
光度上昇分が、標準血清の1/2であれば、出力データ
は、5.0×1/2=2.5〔mg/dl〕となる。 【0020】RFの影響確認試験 RFの影響の有無の確認試験は、RFの添加試験により
行った。即ち、既知濃度のCRP陽性血清(約0.5m
g/dl)にRFを添加し、CRP測定値の変化の有無
を確認した。日常の臨床検査でRF陽性検体が測定値に
影響を与えるケースは非常に稀であるが、高度に精製さ
れたRF溶液を用いると、同じような現象を再現するこ
とができるため、今回の試験では、精製RFとして干渉
チェックRF(国際試薬社製)を使用した。精製水によ
り復元した干渉チェックRFを、CRP陽性血清4容に
対し、RF溶液(5濃度)1容の割合で添加し、最終的
にRFが0、100、200、300、400IU/m
l含まれる被験検体を調製し、標準品による更正後測定
した。結果を表1に示した。 【0021】比較例2及び比較例3(pH6.5〜7.
5)の測定条件では、RF添加濃度の上昇に伴い、測定
値の上昇が認められた。即ち、RFがCRP測定値に影
響を与えていることがわかった。一方、比較例1、実施
例1及び実施例2(pH3.5〜5.5)では、測定値
はほとんど変わらなかった。 【0022】 【表1】 【0023】実施例3〜4及び比較例4〜6 反応液のpHを変えたときの試薬性能を希釈直線性試験
により確認した。実施例1と同様にしてヒトCRP測定
用ラテックス試薬、ラテックス希釈液を調製し、pH
3.5のラテックス希釈液を比較例4、pH4.5のラ
テックス希釈液を実施例3、pH5.5のラテックス希
釈液を実施例4、pH6.5のラテックス希釈液を比較
例5、pH7.5のラテックス希釈液を比較例6として
測定を行い、試薬性能を比較した。 【0024】約20mg/dlのCRP陽性血清(AT
AB社製)を、生理食塩水により希釈し、1/10〜1
0/10CRP濃度の10段階CRP希釈列を調製し
た。標準品による更正後、0濃度(生理食塩水)及び1
0段階濃度CRP希釈列をn=3にて測定し、その平均
値を算出し、グラフにプロットした。結果を図1に示し
た。 【0025】比較例4(pH3.5)の反応液ではCR
P高値における測定値の低下が認められ、通常の反応性
を得ることができなかった。こうした劣化は、ラテック
スの自己凝集、抗原抗体反応の抑制等によるものと考え
られる。一方、実施例3〜4及び比較例5〜6(pH
4.5〜7.5)の測定条件では、ほぼ同等の希釈直線
性能を示した。 【0026】 【発明の効果】本発明の免疫測定法は、上述の構成より
なるので、検体の前処理、試薬原料の加工を行うことな
く、目的とする抗原を特異的に精度よく測定することが
できる。
【図面の簡単な説明】 【図1】実施例3〜4及び比較例4〜6の検量線。縦軸
は、測定値(mg/dl)を、横軸は、濃度(mg/d
l)を、それぞれ表す。

Claims (1)

  1. (57)【特許請求の範囲】 【請求項1】 ヤギ由来の抗体をラテックス粒子に担持
    させたラテックス試薬と検体とを混合し、免疫凝集反応
    により抗原を測定する免疫測定法において、検体のpH
    を一旦1〜4に低下させる前処理をすることなく、反応
    液のpHを、4.0〜6.0に維持することを特徴とす
    る免疫測定法。
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