JP2000513589A - 生物学的サンプルの高特異性ホモシステインアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明の新規な方法は、生物学的サンプル中のホモシステイン濃度を、通常そのようなサンプル中に存在するシステイン及び／またはメチオニンの濃度による妨害なしに測定することを可能とする特定のホモシステイナーゼ酵素の使用を含む。また、生物学的サンプル中のホモシステイン濃度の測定に使用するための診断キットであって、（a）上記の特徴を有するホモシステイナーゼ、及び(b)ホモシステイナーゼ反応において生成した生成物の量を測定するのに使用することができる少なくとも１の試薬を含む前記診断キットも提供する。別の形態においては、1種より多いホモシステイナーゼから得られた、あるいはそれを模倣するアミノ酸部分配列を含み、典型的にはそれをコードするキメラポリヌクレオチドから製造されるキメラ分子としてホモシステイナーゼが提供される。ホモシステインアッセイ法においてさらに付加される改良は、γ-グルタミルシステインシンセターゼ酵素を使用して生物学的サンプル中に存在するシステインからの妨害をさらに限定することである。

Description

【発明の詳細な説明】 生物学的サンプルの高特異性ホモシステインアッセイ 発明の分野 本発明は、例えば尿、全血及び血漿のような生物学的流体中のホモシステイン のアッセイに関する。特に本発明は1種以上のホモシステイナーゼ酵素を含む酵 素調製物の使用及びこれらの酵素を含む診断キットに関する。本発明の好ましい 実施においては、ホモシステイン濃度は、それから生成される硫化水素の測定に よって決定される。 K.S．McCullyら(American Journal of Pathology ，56，pp.111-128，1969)は 、血漿ホモシステインレベルの心臓血管疾患のリスクとの関連を最初に報告した 。McCulleyらは、高い血漿ホモシステイン濃度と動脈硬化性疾患との間の相関を 発見した。より最近の研究によれば、それほど高くはない血漿ホモシステインレ ベルでも虚血性心疾患、脳血管障害及び末梢血管障害の有意に増加したリスクを 示すものであると判断されている。例えばJ．Selhubら、New England Journal o f Medicine ，32，pp．286-291，1995及びS．Kangら、Annual Review of Nutriti on ，12．pp.279-298，1992を参照。 心臓血管疾患のリスクを調べることに関して、高いホモシステインレベルが高 いコレステロールレベルよりも良好な予測指標であり得るという実質的な証拠が 存在する。例えば、ある研究においては、12%だけ正常の上限より高い血漿ホモ システイン濃度が心筋梗塞の3.4倍高いリスクと関連付けられている(M．Stampfe rら、Journal of the American Medical Association，268，pp．877-881，1992 )。心臓血管疾患と診断される前に血液が採取された別のケーススタディにおい て、271名の群(後に心筋梗塞に罹患した)はその後に心筋梗塞に罹患しなかった 対照患者と比較して有意に高いホモシステインのレベルを示した(P．Uelandら、 Cardiovascular Disease，Hemostasis and Endothelial Function，1992，pp.18 3-236，Marcel Dekker，New Yorkを参照)。 O．Nygardら，New England Journal of Medicine，337(4)．pp.230-236(1997) は、総血漿ホモシステインが冠状動脈疾患と確定診断された患者における死亡率 の強力な予測指標であることを報告している。 ホモシステインが心臓血管疾患プロセスに関与する分子メカニズムの詳細な理 解はまだ得られていない。例えば、酸素フリーラジカルの過剰生成、エラスター ゼ活性化及び石灰沈着(すなわちプラーク形成)を生じる作用にホモシステインが 関与していることが示唆されている。現在の理論の概観のためには、K．McCully ，Nature Medicine，2(4)，pp.386-389(1996)及びK.S．McCully，Annals of Cli nical and Laboratory Science ，23(6)、pp.477-493(1993)を参照されたい。ま た循環ホモシステインの高いレベルは血液凝固プロセスに直接影響を及ぼし得る (上記O．Nygardら及びそこに引用された文献を参照)。 従って、患者におけるホモシステインレベルを測定するための正確な方法を開 発し、そのようなアッセイを標準的医療実務として認められたものとすることが 望まれている。また下記するように、例えばホモシスチン尿症のような異常なホ モシステイン代謝を伴う疾患について、乳児を広範囲にスクリーニングすること を可能とすることに対する差し迫った必要が存在する。 報告された技術 A．Arakiら、Journal of Chromatography，422，pp．43-52(1987)は、チオー ル特異的蛍光源との反応を利用し、その後高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)で その他のチオール種を分離する、血漿中の遊離及びタンパク質結合ホモシステイ ンの検出方法を記載している。N.P.B．Dudmanら、Clinical Chemistry，42(12) ，pp．2028-2032(1996)も参照。そのような方法の臨床応用についての欠点とし ては、HPLCによって処理することができるサンプルの数が本来的に限定されるこ と、HPLCの使用により高いスループットのスクリーニングが可能でないこと、臨 床研究室には適当なHPLC装置が存在しない可能性があること等が挙げられる。 Shipchandlerらは最近(Clinical Chemistry，41(7)，pp.991-994，1995を参照 )、ホモシステイン及びホモシスチン(ホモシステインのジスルフィドダイマー) の検出のための蛍光偏光イムノアッセイを記載している。このアッセイは、シス テイ ン及びメチオニンに対する交差反応性が殆どないことが判ったと記載されている 。このアッセイではホモシステインをS-アデノシルホモシステインに変換し、検 出はS-アデノシルホモシステイン及びそのフルオレセイン類似体を認識するモノ クローナル抗体の使用に基づいている。しかし、この検出技術に伴うと思われる 欠点としては、モノクローナル抗体の製造に伴うコスト、抗体の「非特異性」、 すなわち例えばS-アデノシルメチオニンに対する交差反応性である。その上、こ の方法は単一の供給者からしか入手することができない特定の特許された装置に よってしか実施することができないようである。 K-W．Thongら(Experimental Parasitology，63，pp.143-151，1987)は、ホモ システインをα-ケトブチレート、硫化水素、及びアンモニアへ酵素的に変換し 、その後酢酸鉛で硫化水素を測定することを記載している(K-W．Thongら、IRCS Medical Science ，13．pp.493-494及びpp．495-496，1985も参照)。しかし、関 連する酵素(例えば、寄生生物Trichomonas vaginalisからのもの)の臨床診断の ための使用については示唆されていない。その上、臨床においては、開示された 方法はホモシステインとシステインを区別せず、また生物学的サンプル中のジス ルフィド結合しているホモシステイン分子あるいはタンパク質に結合されたもの の部分を検出しない。 細菌Pseudomonas ovalisからの微生物酵素の使用を含むホモシステインの検出 のための別の方法がYamaguchiら、Annual Report of Sapporo City Institute o f Public Health ，No．20，pp．67-74，1993に開示されている。この著者はホモ システインレベルを測定する(例えばホモシスチン尿症患者について)間接的な方 法としてアミノ酸のメチオニンの検出に着目している。これは例えばタンパク質 とジスルフィド結合しやすい等、ホモシステインが不安定であると考えられたか らである。 ホモシステインの間接的な測定として、前記方法は正確さに欠ける可能性があ り、生成物の硫化水素ではなく生成物のアンモニアを測定することは、生物学的 流体中のアンモニアの高バックグラウンドレベルを考慮すると感度が低くなる可 能性がある。一般的に可能性のある問題として、混入デアミナーゼの存在によっ てアンモニアアッセイが悪影響を受けることも指摘される。同様に、生成物α- ケ トブチレートのアッセイは、生物学的サンプル中の高バックグラウンドレベルを 考えると、効果がないと考えられる(アッセイ方法については、Y．Tanら、Prote in Expression and Purification ，9，pp．233-245，1997を参照)。 本発明の実施に関連する別の文献は1997年5月20日に発行されたSundrehagenの 米国特許5,631,127号である。 心臓血管疾患におけるホモシステインの役割について認識が高まっていること 、及び心臓血管疾患のリスクについて患者をスクリーニングするという公衆衛生 上の目標を考慮すると、患者におけるホモシステインレベルを正確に測定するた めに使用することができる新規な分析方法について差し迫った必要性が存在する 。そのような方法は、高いホモシステイン濃度が特定の疾病状態の原因である場 合、及び高いホモシステイン濃度が既存の疾病状態の検出可能な副産物である場 合の両方において有意な医学的利益をもたらすと考えられる。 またそのような分析方法は、他の方法で発病が検出できるようになる前に心臓 血管疾患に対する患者の感受性を予測することによって大きな利益が得られる。 この点については、そのような方法を一般の集団、及び特に全ての乳児の広範な スクリーニングに適用することにより大きな利益が得られる。本発明は、臨床環 境における使用のための診断キットを含めそのような方法を提供する。 そのような改良された分析方法の設計に関して、単一の段階/酵素アッセイに おいてホモシステインを測定するのに有用であるが、生物学的サンプル中に通常 存在するシステイン及びメチオニンの干渉濃度に対して非反応性の酵素が開発で きれば大きな価値がある。下記のように、本発明はそのような特異性を有するホ モシステイナーゼ酵素を提供するものである。 発明の概要 本発明は、生物学的流体中のホモシステインの濃度の新規な測定方法を提供す る。本発明の好ましい態様においては、生物学的流体は患者からの尿、組織液、 血液、血清、あるいは血漿サンプルであり、本発明の方法は心臓血管疾患のリス クを調べるために有効である。特に本発明は、関連する妨害物質、特にシステイ ン及びメチオニンの検出を回避しつつ生物学的流体中のホモシステイン濃度を測 定するための新規な方法を提供する。 従って、例えばホモシステイン及びシステインを含む生物学的サンプル中に存 在するホモシステインの量を測定するための方法が提供され、該方法は、ホモシ ステイン及びシステインから硫化水素を生成することができる酵素調製物に前記 サンプルを接触させ、ホモシステインから生成される硫化水素の量を測定するこ とにより前記サンプル中のホモシステインの量を測定することを含む。最も好ま しい態様においては、酵素調製物は、システインから生成される硫化水素が無視 し得るような、システインと比較してホモシステインに対する反応性が十分であ る単一の酵素のみからなる。 前記酵素調製物はホモシステイナーゼと呼ばれる酵素を含むが、これは下記す るように他の名称により言及されることもある。また用語「酵素調製物」は、特 記しない限り、単独及び複数のアリコートの両者を包含し、すなわち1種以上の 酵素の単一の量または複数の量をアッセイ方法の間に加えることができ、その用 語を限定せずに使用する場合は、反応工程の間に必要な酵素の全てを加えるのに アリコートあるいは段階をどのようにあるいはいくつ使用するかを示すものであ る。 本発明の好ましい形態によれば、例えば体液のような生物学的サンプル中に存 在するホモシステインの総濃度は、遊離形態ではなく他の分子に共有結合したホ モシステイン分子を含むものと認識される。本発明の方法は、ホモシステインか ら誘導された硫化水素の測定の前にこのホモシステインを放出させる段階をさら に提供する。 しかし、本発明の方法は関連物質(例えばシステイン)からの干渉がない遊離の ホモシステインレベルの正確な測定を提供するので、遊離のホモシステインだけ が検出されるとしても、価値ある情報が臨床医に提供されるということが指摘さ れる。そのような情報は、多くの用途のうち、例えば全新生児の試験において、 迅速な最初の診断手段として非常に有用であると考えられる。 本発明の別の態様は、ホモシステインを前記生物学的サンプル中に存在し得る あらゆるシステインから区別するために方法を包含する。そのような方法の代表 的なものは、以下の通りである。 (I) 追加的な初期段階を方法に含めることによりホモシステインから生成される 硫化水素をシステインから生成される硫化水素から区別する方法であって、 (a) ホモシステインを前記酵素調製物から保護する試薬に前記生物学的サンプル を接触させ、 (b) 前記酵素調製物により前記サンプル中に存在するシステインから硫化水素を 生成させ、 (c) 前記硫化水素を除去し、そして、 (d) 前記ホモシステインを脱保護し、別の量の酵素調製物を加えてそれから硫化 水素を生成する、 前記方法、 (II)（a）前記生物学的サンプル中に存在するホモシステインを、それを単離さ れ得る化合物に変換することができる別の酵素調製物に接触させ、 (b) 前記化合物を単離し、 (c) 前記化合物をそれがホモシステインに戻るように変換される条件下で酵素調 製物または別の試薬に接触させ、そして、 (d) そのように生成されたホモシステインを、それから硫化水素を生成すること ができる前記酵素調製物に接触させる、 追加の初期段階を含む方法、 (III) システインを前記酵素調製物に対して非反応性にする薬剤で、前記生物学 的サンプルを前処理する方法、及び (IV) ホモシステインから生成される硫化水素をシステインから生成される硫化 水素から区別する方法であって、 (a) 酵素調製物により前記サンプル中に存在するホモシステイン及びシステイン の両方から硫化水素を生成し、前記酵素がシステインから生成された硫化水素の 量と等しいピルベートもシステインから生成するものとし、 (b) そのようにして生成されたピルベートの量を測定し、 (c) ホモシステインに由来する硫化水素の量からホモシステインの量を計算し、 前記アッセイを行うために前記サンプルを第1の部分と第2の部分に分割し、ある いは任意に分割しないものとする、 段階を含む前記方法。 多数の患者のサンプルからのサンプルの迅速な試験に容易に使用することがで きる、本発明の特に好ましい態様においては、ホモシステイン及びシステインを 含む生物学的サンプル中に存在するホモシステインの量を測定するための方法が 提供され、該方法は、 (a) 前記サンプルを部分1と部分2の2つの部分に分割し、 (b) 部分1をホモシステインをホモシステイナーゼの基質でない物質に変換し得 る第1の酵素調製物に接触させ、前記第1の酵素調製物はシステインを基質として 認識しないものとし、 (c) ホモシステイン及びシステインの両方から硫化水素を生成することができる ホモシステイナーゼを含む第2の酵素調製物に部分1と部分2を独立して接触させ 、 (d) 部分1と部分2において生成された硫化水素の量を測定し、 (e) 部分2の硫化水素測定値から部分1の測定値を減じて、結果を2倍することに よって前記生物学的サンプル中のホモシステインの量を計算する、 段階を含む。 本発明の医療上の実施のためには、生物学的サンプル中におけるホモシステイ ンの量の測定に使用するための診断キットが提供され、該キットに含まれるホモ システイナーゼはいくつかのソースのうちの1つから得られる。好ましい態様に おいては、前記診断キットは、 (a) Trichomonas vaginalisまたはPseudomonas(例えば種ovailsまたはputida)か らのホモシステイナーゼ、及び (b) ホモシステイナーゼ反応において生成される硫化水素の量を測定するために 使用することができる少なくとも1種の試薬、 を含む。 本発明の別の形態においては、1種以上の遺伝子またはその他のポリヌクレオ チド配列に由来する、ホモシステイナーゼをコードする(DNAまたはRNAの)キメラ ヌクレオチド配列であって、その配列の発現によりキメラホモシステイナーゼが 生成される配列が提供される。そのようなホモシステイナーゼは本発明の実施に 関して価値ある特性を有し、その好ましい例としては、Trichomonas vaginalis 及びPseudomonas putidaホモシステイナーゼの両者に由来するアミノ酸配列を含 むキ メラ酵素が挙げられる。 このように本発明はホモシステインの臨床的アッセイの設計において2つの基 本的なアプローチを提供するものであり、（1）ホモシステイナーゼ反応生成物 を検出するための新規なアッセイ法を使用して生物学的サンプル中のホモシステ インの検出を増強し、また(2)他の含硫アミノ酸と比較して、ホモシステインに 対して実質的に高められた反応性を有するホモシステイナーゼ酵素を設計するこ とによってそのようなアッセイの感度をさらに増強するものである。 上記(2)のアプローチに関しては、配列番号10によってコードされるタンパク 質の使用が代表的なものである。そのようなホモシステイナーゼ酵素は、システ イン及びメチオニンに対して十分に非反応性であり、例えば、患者の組織液、尿 、血液、血清、あるいは血漿のサンプル中に存在するホモシステインの濃度を単 一の段階のアッセイにより測定し得るものであり、前記サンプル中でのホモシス テインに対する前記ホモシステイナーゼの反応から生成する1種以上の生成物の 量を測定し、前記測定はその中におけるシステインまたはメチオニンの濃度に実 質的影響されないものである。 好ましい形態においては、そのようなホモシステイナーゼは、Pseudomonas、C lostridium、AeromonasまたはTrichomonasからのホモシステイナーゼを模倣する ものであり、その例においては、そのような酵素の1以上のペプチド配列は例え ば、 (a) Gly-Gly-Asn-Arg-Leu-Ala-Gly-Gln-Glu(配列番号10の残基43〜51を参照)、 (b)Leuを含む(a)のサブセット、 (c) Arg-Val-Cys-Lys-Glu-Ala-His-Ser-Gln(配列番号10の残基168〜176を参照) 、 (d) Gluを含む(c)のサブセット、 (e) Gln-Met-Arg-Met-Tyr-Gly-Ser-Met-Ile(配列番号10の残基304〜312を参照) 、 及び (f) Tyrを含む(e)のサブセット、 からなる群から選択される、配列番号10の1以上の相同ペプチド配列によって対 応するように置換されている。 好ましい形態においては、そのようなホモシステイナーゼは、配列番号10の置 換変異体、付加変異体、欠失変異体、あるいは誘導体であり、前記変異体または 誘導体は下記の特性、 (a) 適当なアッセイにおいてホモシステインに対する配列番号10の活性の少なく とも約10%の活性、及び／または (b) 適当なアッセイにおいてシステイン(またはメチオニン)に対する配列番号10 の活性の約1000%未満の活性、 の一方または両方を有する。 本発明の別の形態は、従って、（1）そのような特異性を有するホモシステイ ナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む精製され単離されたDNA分子であっ て、そのコード配列が宿主細胞においてそこから発現を誘導することができる調 節配列に機能可能なように結合したもの、及び(2)適切にトランスフェクトされ た宿主細胞を含むものである。 本発明の別の好ましい態様は、ホモシステインとシステインを含む生物学的サ ンプル中に存在するホモシステインの量を測定するための方法であって、該方法 は、ホモシステイナーゼにより触媒された反応においてホモシステインから生成 された生成物の濃度を測定することを含み、その生成物は前記サンプル中のシス テインに対する前記ホモシステイナーゼの反応によっても生成されるものであり 、そのようにしなければ前記サンプルがシステインの妨害濃度を含むものであり 、 (a) 前記サンプルを、システインのγ-グルタミルシステインへの変換を可能と する基質の存在下で、γ-グルタミルシステインシンセターゼとインキュベート し、 (b) 段階(a)から得られた混合物をホモシステイナーゼとインキュベートし、 (c) ホモシステイナーゼによって触媒される反応において、ホモシステインとシ ステインの両者から生成され得る生成物の濃度を測定する段階を含み、（1）ホ モシステイナーゼとして配列番号10あるいはその残基Met¹からLeu³⁹⁶に対応する Trichomonas vaginalis酵素を使用し、（2）大腸菌γ-グルタミルシステインシ ンセターゼを使用することが好ましい前記方法である。また、システインtRNAシ ンセターゼの使用に基づく同様の方法におけるように、診断キットも提供される 。 本発明の別の重要な特徴は、被検者の生物学的流体中のホモシステイン濃度の 単一の酵素によるアッセイにおいて使用するための診断キットを含み、該キット は、 (a) ホモシステイナーゼ酵素、及び (b) ホモシステインに対するホモシステイナーゼの反応によって生成される生成 物硫化水素の量を測定するために使用することができる少なくとも1種の試薬を 含み、前記ホモシステイナーゼがシステインに対して十分に非反応性であって、 前記ホモシステイナーゼのシステインに対する反応によって生成される硫化水素 は前記キットを心臓血管疾患のリスクを調べるために使用することを実質的に妨 げないものである。 本発明のこの形態によれば、提供される典型的な診断キットは、そこに含まれ るホモシステイナーゼが、例えば、前記流体中のホモシステインとシステインの 濃度がそれぞれ約20μＭ及び約300μＭであるとき、ホモシステインのアッセイ において生物学的サンプルに接触させたときに前記ホモシステイナーゼの作用に よって生成される硫化水素の少なくとも約90%が前記ホモシステインに由来する ものであるという特性を有するものである。好ましくは、含まれるホモシステイ ナーゼは、前記生物学的流体に接触させた際に前記ホモシステイナーゼの作用に より生成される硫化水素の少なくとも約99%がホモシステインに由来するもので あるという特性を有する。例えば、そのような診断キットは、約1〜500μＭの範 囲、あるいは必要に応じてさらに高い生物学的流体中のホモシステイン濃度を正 確に測定するために使用することができ、典型的な例においては、前記流体は0 〜約1000μＭのシステインも含む。 そのようなキットの使用に関しては、本発明の他のアッセイ方法と同様に、ジ スルフィド還元剤、例えばジチオトレイトール(DTT)を使用して、他の分子(例え ば遊離のシステイン、その他のホモシステイン分子またはタンパク質SH基)にジ スルフィド結合される生物学的サンプル中のホモシステイン分子も検出できるよ うにすることが一般に好ましい。 本発明のさらに別の代表的な形態は、以下直ぐに続く発明の詳細な説明に記載 する。本発明の実施は、病理学的プロセスにおけるホモシステインの役割に関す る任意の特定の理論に依るものではなく、またそのようなものにより限定される ものでもないことも認識されるべきである。図面の簡単な説明 図1(A及びB)は、mgl1遺伝子によってコードされるTrichomonas vaginalisホモ システイナーゼのアミノ酸配列の、Trichomonas vaginalis pAC2-1クローンによ ってコードされるものとの比較を示す。 図2は、システイン、メチオニン及びホモシステインについてのpAC2-1クロー ンのホモシステイナーゼに対応する比活性(単位/粗大腸菌抽出物のmg)の比較を 示す。 図3は、システイン、メチオニン及びホモシステインについてのホモシステイ ナーゼ(pAC2-1クローン、DEAE-Fast Flow法により精製したもの)の比活性の比較 を示す。 図4は、システイン、メチオニン及びホモシステインについてのホモシステイ ナーゼ(pAC2-1クローン、ニッケルカチオンアフィニティ試薬を使用して精製し たもの)の比活性の比較を示す。 図5は、システイン、メチオニン及びホモシステインについてのホモシステイ ナーゼ(pAC2-1クローン)の測定K_cat値を示す。発明の詳細な説明 血漿ホモシステインレベルの上昇は、血管疾患の危険因子として認められてい る。ホモシステインのアテローム発生特性は、集合的にホモシスチン尿症と呼ば れる遺伝病の稀な群との関連において最初に注目された。この病状は、典型的に は正常血液におけるものよりも10倍(またはそれ以上)高いホモシステインの循環 レベルを特徴とする。このような状況下では、ホモシステインは尿においても検 出される。早発性血管疾患はこの状態に強く関連する。例えば、ホモシスチン尿 症を未治療のまま放置すると、約50%の患者が血栓塞栓症状を呈し、30歳までの 死亡率は約20%である(例えばS.H．Muddら、American Journal of Human Genetic s ，37，pp.1-31，1985参照)。 これまで75を越える疫学的及び臨床的研究により総ホモシステインレベルと冠 状動脈及び末梢動脈疾患、卒中、及び静脈血栓との間の関係が明らかになってい ることから、例えば血漿中のホモシステインレベルを正確に測定することができ る診断的方法について明確な医学上の必要性が存在する。そのような方法が患者 の大きな集団、あるいは一般の集団もしくは新生乳児の大量のスクリーニングに 使用できるならば非常に有利であると考えられる。そのようなアッセイ方法の開 発は、主に2つの相関する困難によって阻害されてきた。 (1) ホモシステインの化学的及び生化学的性質は、アミノ酸のメチオニン及びシ ステインを含むその他のスルフヒドリル含有生体分子のものと密接に関連し、従 ってホモシステインのための改良されたアッセイ方法はホモシステインのみに対 して反応するものでなければならない。 (2) ホモシステインは非常に反応性が高く、生理的条件下で、遊離のホモシステ イン分子以外に、例えばジスルフィド結合したダイマー、遊離のシステインとジ スルフィド結合したヘテロダイマー、血漿タンパク質のシステイン残基にジスル フィド結合したコンジュゲート、その他のタンパク質アミノ酸のR基(例えば、タ ンパク質リシンのε-アミノ基)に結合したもの(多くの場合N-アシル誘導体とし て)等の多くの形態で存在する。これらのコンジュゲートした形態は、病理学的 プロセスに関与し得るホモシステインの総量の大きな部分を占める。血漿ホモシ ステイン濃度の正常範囲を越えた僅かな増加も統計的に有意な疾患のリスクを与 えることから(上記O．Nygardら参照)、臨床的アッセイにより生物学的流体中の 総ホモシステイン含量を検出する能力が得られることは有用である。これは、遊 離のホモシステイン(またはホモシステインを含むその他の形態の任意のもの)の 再現可能な検出であって、メチオニン及びシステインのようなその他の物質から の干渉がないものが臨床医に価値ある情報を提供することを意味する。 従って本発明は、患者サンプルの大規模なスクリーニングを実施可能な条件下 で上記の複雑さを克服するホモシステインアッセイ方法の開発およびそのための 試薬の選択に関する。本発明の実施に有用なホモシステイナーゼ酵素 本発明の実施においては、生物学的サンプル中のホモシステイン濃度は以下「 ホモシステイナーゼ」として言及する酵素により酵素的に測定する。「ホモシス テイナーゼ」は、硫化水素をホモシステインから生成する反応を触媒することが できる酵素として定義される。代表的な場合においては、アンモニアとα-ケト ブチレートも生成される。本明細書で記載するように、生成物の硫化水素を検出 するのが好ましいが、生成物のアンモニア及び／またはα-ケトブチレートある いはその他の生成物を検出してもよい。本明細書で定義するホモシステイナーゼ は、他のスルフヒドリル化合物が関与する他の反応を触媒し得、文献において種 々の名称が付されているかも知れないが、ホモシステインからの硫化水素の生成 を触媒する特性を有するものであるならば、本発明の実施において一般に有用で ある。 本発明の実施に好ましい第1のホモシステイナーゼは、細菌ソース、Pseudomon as putidaから得られるL-メチオニン-α-デアミノ-γ-メルカプトメタンリアー ゼ(メチオニンリアーゼ)である。該酵素は、S．Itoら、Journal of Biochemistr y ，79，pp.1263-1272(1976)により精製され、約170kDaの分子量を有すると測定 されている。S．Itoの研究によれば、この酵素はメチオニンのα-γ脱離により α-ケトブチレート、メタンチオール及びアンモニアを生成する。ホモシステイ ンを基質とする場合は、α-ケトブチレート、硫化水素及びアンモニアが反応生 成物となる。相同な酵素がPseudomonas ovalisから単離されている(H．Tanakaら 、Biochemistry，16，pp.100-106(1977))。このPseudomonas酵素の組換え生成の 方法も開発されており(Y．Tanら，Protein Expression and Purification，9，p p.233-245，1997を参照)、組換え酵素を本発明の臨床的実施に使用すれば、診断 キットのコストとアッセイの再現性に関して利点が得られると考えられる。Tan らの文献には、酵素コード配列の単一コピーを含むpACl-1と称するクローンの構 築が記載されている。コード配列の2つのコピーをタンデムに含むpACl-11と称さ れる別のクローンも構築されている。pACl-1の構造と同様に、pT7-7プラスミド を使用してpACl-11を構築した。2つのコード配列がBamHI部位で結合されており 、第1の遺伝子はNdeIによりBamHI部位に、第2のものはBamHIにより別のBamHI部 位に結合されている。 P．putida酵素の基質特異性も測定されている。例えば、N．Esakiら、Methods in Enzymology 、143，pp.459-465(1987)は、相対的活性尺度において、メチオ ニンに対する活性を100として、システインに対して10であり、ホモシステイン に対して180であると報告している。該酵素は3種の全てのスルフヒドリル含有ア ミノ酸に対して反応性であることから、硫化水素のソースを適当に測定できる臨 床的 アッセイを確立する必要性が強調される。システインと比較してホモシステイン に対する見かけ上10倍の前記酵素の優先性は、生物学的サンプル中のシステイン の濃度が高いかもしれないことを考慮しておらず、実際これはホモシステインの 濃度より非常に高いことに注意されたい。適当な触媒活性を有するホモシステイ ナーゼ酵素は、当分野において知られる通常のスクリーニング法及びアッセイを 使用して他のPseudomonas種、あるいはその他の細菌から得ることができる。 本発明の実施において有用なホモシステイナーゼのソースである生物の別の群 は、Trichomonas寄生生物及び関連する原生動物の種である。Trichomonadは、泌 尿生殖器の重要な寄生生物であって、耐気性(ただし依然として嫌気性である)鞭 毛原生動物である。Trichomonas vaginalisからのホモシステイナーゼを使用す ることが本発明の実施に好ましい。 Trichomonas種は、宿主組織において酸素毒性に対抗するためにそのチオール 代謝能力を使用すると思われる。K-W Thongら、Experimental Parasitology，63 ，pp.143-151 (1987)及びそこに引用される文献を参照。ホモシステイナーゼ活 性(前記文献中ではホモシステインデスルフラーゼ活性と称されている)の有意な 変動がTrichomonas週間で見られたが、酵素活性の許容レベルについて入手可能 な種をスクリーニングすることは日常的な手段である。一般的には、以下に記載 するアッセイにおける使用のためにはホモシステイナーゼは少なくとも約1単位/ 精製タンパク質mgの比活性を有していることが好ましいが、異なる酵素活性を有 する酵素あるいは酵素調製物のより多い、あるいはより少ない量を使用するアッ セイについて設計上の変更を加えることは関連分野に熟知する者の技術の範囲内 にあるものである。高度に精製された活性なP．putida酵素は約20単位/mgの比活 性を有する(酵素活性の単位は標準条件下で1分あたりに基質の1マイクロモルを 変換し得るものとして表すことができる(上記Tanらを参照))。 上記のK-W．Thongら(1987)によって報告された「ホモシステインデスルフラー ゼ活性」は、Trichomonasにおけるメチオニン代謝活性に係わるものと同じ酵素 から得られるものであるようであり、後にB.C．Lockwood及びG.H．Coombs(Bioch emical Journal ，279，pp.675-682，1991)によりメチオニン-γ-リアーゼと命名 され、これにはこの酵素の精製についても記載されている。上記したように、Tr ich omonas vaginalisからのメチオニン-γ-リアーゼ(ホモシステイナーゼ)の使用は 、本発明の実施において好ましいものである。 T．vaginalis酵素の組換体の使用も好ましい。1つの可能性のあるクローン化 方法は、T．vaginalis遺伝子がほとんどイントロンを有していない可能性がある というA．Marcosら、FEMS Microbiology Letters，135，pp 259-264(1996)の観 察に従うものである。すなわちゲノムライブラリーを構築し(D．E．Rileyら、Mo lecular and Biochemical Parasitology ，51，pp.161-164，1992を参照)、Pseud omonas putida酵素に対応し、いくらかの部分的保存配列を反映すると考えられ るDNAフラグメントでスクリーニングする。 またLockwoodらは、Pseudomonas、Clostridium及びAeromonasの種を含むメ チオニン-γ-リアーゼ活性を有している細菌のその他の報告も記載している。 そのような種は本発明の実施において有用なホモシステイナーゼ活性のソース であると考えられる。有用なホモシステイナーゼ酵素を提供すると考えられる別 の生物は、ある種の海藻(例えば、広範なメチオニン関連代謝を有する種につい て記載するD.A．Gageら、Nature，387，pp.891-897，(1997)を参照)、硫黄菌、 及び極端な環境条件下で生存する土壌微生物あるいはその他の微生物である(例 えばR.A．Kerr，Science，276，pp.703-704，1997及びE．Pennist，Science，27 6，pp.705-706，1997参照)。ホモシステイナーゼ型酵素の有用なソースであり得 る微生物の別の例としては、歯周疾患に関係する細菌、例えばシステインから揮 発性硫黄化合物を生成することができるものが挙げられる。この点については、 S．Perssonら、Oral Microbiology and Immunology，5(4)，pp.195-201，1990を 参照。 最後に、本発明の実施において有用である「ホモシステイナーゼ」の定義に関 して、硫化水素が必ずそのような酵素の産物であることは、ここでは限定事項と されるものではない。広くいえば、本発明は、極めて大きい数のホモシステイン 含有サンプルの経済的な分析を可能とし、一方、干渉物質の検出を回避する、高 スループット診断法を提供するものである。 従って、ホモシステインを代謝するその他の酵素も、ホモシステインに類似す る物質(例えばシステイン)からの妨害を回避できるような条件でその代謝物を検 出する方法が存在すれば、本発明の実施において有用であると考えられる。以下 の実施例は、干渉物質の検出を避けつつ、ホモシステインを正確に測定するため の広範な技術を記載するものである。従って、以下に記載する方法は、ホモシス テインに作用する多くのその他の酵素を使用した検出方法に適合させることがで きることは当業者に理解されるであろう。キメラホモシステイナーゼ 上記したように、本発明の好ましい態様においては、キメラホモシステイナー ゼ酵素をコードする1以上の遺伝子(あるいはcDNAまたはその他のイントロンのな い配列のようなその他のポリヌクレオチド)に由来する(DNAまたはRNAの)キメラ ヌクレオチド配列が提供される。 そのようなホモシステイナーゼは本発明の実施に関して非常に有用な特性を有 し、その好ましい例としては、Trichomonas vaginalis及びPseudomonas putida ホモシステイナーゼの両者に対応するアミノ酸配列を含むキメラ酵素が挙げられ る。 P．putidaホモシステイナーゼは種々の条件下でT．vaginalis酵素より安定で あると考えられる。それによる1つのあり得る結果として(B．Lockwoodら、Bioch emical Journal 、 279、pp.675-682を参照(1991))、精製の間のT．vaginalis酵素 の回収は非常に低いものであった(「メチオニンγリアーゼ」に言及している679 ページ表2を参照)。従って本発明の実施においては、この高い安定性を利用する ためにキメラ酵素にP．putida配列を含めることが好ましい。 上記したように、異なるホモシステイナーゼは、それらの種々の硫黄含有基質 、例えばシステイン、メチオニン及びホモシステインに対する異なるそれぞれの 反応性を有する。特定の反応条件の選択が特定の環境下での見かけ上の反応性に 影響を及ぼし得るが、T．vaginalis酵素が基質としてのホモシステインに対して P．putida酵素より高い反応性を有することが示されており、基質としてのシス テインまたはメチオニンに対してより大きい反応性を示し得る。この点について は、その表4においてLockwoodら、1991により報告された結果は、T．vaginalis 酵素についての相対的活性データが基質としてのホモシステインに対して顕著な 「優先性」を示すことを明らかにしていることにおいて注目すべきものである( その678ページにおいて報告されているK_mデータも参照)。これは、P．putida酵 素に関して 上記N．Esakiらよって報告されたデータと対照的である。 このように、その成分種の両方からキメラタンパク質に与えられる機能上の特 徴を利用するキメラ分子として酵素を提供することにより、本発明の臨床診断用 途における使用のためのホモシステイナーゼの特性が改良され得る。特に、P．p utida酵素の安定性に実質的に貢献するその領域を本発明のキメラホモシステイ ナーゼに含ませ、さらに基質としてのホモシステインに対する反応性を優先的に 高めるT．vaginalis酵素の領域も含ませることが好ましい。 そのような酵素の設計に関しては、T．vaginalisホモシステイナーゼが実際に 2つの遺伝子から誘導される2つのタンパク質種を含むとする最近の報告が注目さ れる(J.C．Mottramを参照、T．vaginalismgl1遺伝子、寄託番号AJ000486、NID g 2330884、及びT．vaginalis mgl2遺伝子、寄託番号AJ000487，NID g2330886とし て1997年7月17日にGene Bankへ配列を直接に寄託)。その全配列は参考により直 接記載したのと同様に全て本明細書の一部とする。1998年2月26日に公開された 国際特許出願WO 98/07872及びA．McKieら、Journal of Biological Chemistry， 278，pp．5549-5556，1998も参照。 従って本発明は、Pseudomonas putidaホモシステイナーゼのアミノ酸配列、及 びTrichomonas vaginalisホモシステイナーゼのアミノ酸配列(mgl1またはmgl2の どちらかあるいは両方に由来する)をコードするキメラヌクレオチド配列であっ て、それからホモシステイナーゼ活性を有する機能的タンパク質が発現され得る 配列を含む精製され単離されたDNA分子を提供する。好ましい形態においては、 ヌクレオチド構築物(または対応するアミノ酸構築物)は主としてP．putidaのも のに対応し、従ってPseudomonas putidaホモシステイナーゼをコードするヌクレ オチド配列を含むDNA分子であって、その酵素の1以上のアミノ酸をコードする1 以上の部分配列がTrichomonas vaginalisホモシステイナーゼの対応するアミノ 酸をコードする1以上のヌクレオチド部分配列によって対応するように置換され た前記DNA分子が提供される。本発明の実施において、以下、mgl1遺伝子によっ てコードされるT．vaginalis酵素をT1タンパク質と称し、mgl2遺伝子によりコー ドされるものをT2タンパク質と称する。 キメラポリペチド及びコードポリヌクレオチドの選択に関して、次の考察が注 目される。すなわち、T1及びT2タンパク質は非常に類似したDNA配列によってコ ードされている。従って、一般的には、P．putidaバックボーンへのmgl1コード 部分配列の置換は同等なmgl2部分配列置換により得られるものと実質的に同じ効 果を有し、実質的に同様な改善をもたらすと考えられる。 しかし、T1及びT2配列が実質的に異なる部分領域の数は限られており、同時に T1配列が刊行物に記載されたP．putida配列と実質的な相同性を示す(T2配列はそ れ程ではない)点に注意すべきである。実際に、刊行物に記載されたP．putida配 列はT1配列に有意な相同性を示す。 従って、本発明の別の好ましい態様においてば、T．vaginalis酵素のコード配 列の領域であって、T2配列と対応するT1配列とが互いに非常に異なるが、T1配列 がP．putidaのそれに実質的に類似している前記領域が特定される。理論に拘束 されるものではないが、これらのT2のコード部分領域が、ホモシステインに対す るキメラ種の高められた反応性を与え、それにより本発明の診断的方法を容易に するアミノ酸配列ドメインをP．putidaコードポリヌクレオチドに挿入する唯一 の機会を与えるものと考えられる。 従って本発明は、Pseudomonas putidaホモシステイナーゼのコード配列を含む DNA分子であって、前記酵素の1以上のアミノ酸をそれぞれコードするその1以上 の部分配列が、Trichomonas vaginalisホモシステイナーゼの1以上の対応するア ミノ酸のそれぞれをコードする１以上のヌクレオチド部分配列によって対応する ように置換されており、得られるアミノ酸置換体が、 (a) Pseudomonas putidaからのVal-Gly-Ser-Gln-Ala-Leu-Val-Asp-Arg-Ile-Arg- Leu(配列番号2)またはその任意のサブセットに対してTrichomonas vaginalis(T2 )からのCys-Ser-Arg-Ala-Asp-Ile-Ile-Ala-Lys-Val-Lys-Ser(配列番号1)または その任意のサブセット、 (b) Pseudomonas putidaからのGlu-Leu-Lys(配列番号4)またはその任意のサブセ ットに対してTrichomonas vaginalis(T2)からのAsp-Val-Asp(配列番号3)または その任意のサブセット、 (c) Pseudomonas putidaからのAla-Leu-Gln-Leu(配列番号6)またはその任意のサ ブセットに対してTrichomonas vaginalis(T2)からのCys-His-Val-Val(配列番号5 ) またはその任意のサブセット、 (d) Pseudomonas putidaからのGly-Leu-Glu-Asp-Ile-Asp-Asp-Leu-Leu-Ala(配列 番号8)またはその任意のサブセットに対してTrichomonas vaginalis(T2)からのC ys-Glu-Asn-Val-Gln-Asp-Ile-Ile-Asp-Asp(配列番号7)またはその任意のサブセ ット、及び (e) 上記の群(a)、(b)、(c)、及び(d)により与えられる置換の1、2、3または4の 任意の組合せ、 からなる群から選択される前記DNA分子を提供する。 上記に挙げたTrichomonas vaginalis mgl2(T2)アミノ酸部分配列に関して、そ れらがほぼ下記のアミノ酸配列位置に対応する点に留意する必要がある。 Cys-Ser-Arg-Ala-Asp-Ile-Ile-Ala-Lys-Val-Lys-Ser(配列番号1)、226〜237付近 、Asp-Val-Asp(配列番号3)、318〜320付近、 Cys-His-Val-Val(配列番号5)、331〜335付近、及び Cys-Glu-Asn-Val-Gln-Asp-Ile-Ile-Asp-Asp(配列番号7)、381〜390付近 本発明のこの態様の実施と関連して、上記に挙げたT．vaginalis部分配列は、 さらに保存的なアミノ酸置換を受容するように修飾することができる。さらに、 T．vaginalis部分配列は上記に挙げたP．pulida配列を対応して置換する必要は なく、例えば、T．vaginalis部分配列が近傍(すなわちそこから約10のアミノ酸 位置まで)に挿入され、標的とされるP．putida配列が全体または一部として所定 の位置に残存していてもよい。また、T．vaginalis挿入物は、酵素安定性の低下 によリホモシステインに対する増加した反応性の利益が減じられることがない限 り、上記の配列のN末端あるいはC末端に追加のアミノ酸を導入するものであって もよい。 適当なキメラをコードするポリヌクレオチドの構築は当業者には自明であり、 部位特異的もしくはループアウト突然変異誘発技術を使用し、あるいはPCR技術 を使用することができる。そのようなコードポリヌクレオチドの発現のための適 当な宿主細胞は、例えば、Y．Tanら，Protein Expression and Purification，9 ，pp.233-245，1997に記載されている。システインに対する反応性を欠く1段階アッセイ用ホモシステイナーゼ また、本発明の実施によれば、システインに対して実質的に非反応性、すなわ ちそのような反応性がいずれも十分に低く、ヒト被験者からの組織液、尿、血液 、血清もしくは血漿サンプルまたはその他の生物学的流体もしくはサンプル中に 存在するホモシステインの量を単一の酵素アッセイにおいて測定し得、サンプル 中に同様に存在するシステイン及び／またはメチオニンの濃度を補正する必要が ない、新規なホモシステイナーゼ酵素も提供される。そのような生物学的サンプ ル中のシステイン及び／またはメチオニンの濃度は一般にホモシステインの濃度 よりもずっと高く、特に一定の疾患症状においてそうであることを考えれば、単 純で迅速なホモシステインアッセイに対する公衆衛生上の広範な必要性に鑑みて 、これらの発見の意義は臨床医に直ちに理解されるであろう。そのような酵素は メチオニンと反応するかもしれないが、異なる検出可能な反応生成物(硫化水素) が得られるので、これは一般に無関係である。 この点、配列番号10によって示される新規なTrichomonas vaginalisホモシス テイナーゼの活性は注目に値する(下記にさらに説明する実施例8及び図2〜4を参 照)。システインと比較したホモシステインに対するこの酵素の相対活性は、生 物学的試験サンプル中に存在するどのようなシステインについても補正すること なくホモシステイン測定を容易に可能とする。 本発明の好ましい例において、そのような新規な酵素はPseudomonas、Clostri dium、AeromonasまたはTrichomonasを含む種々の微生物で見られるホモシステイ ナーゼを模倣するものであり、特に好ましいホモシステイナーゼは、そのmgl1遺 伝子(配列番号11)またはmgl2遺伝子から発現されるものを含むT．vaginalisから 誘導されるものである。 図1(A及びB)は、2種のTrichomonas vaginalisホモシステイナーゼ、すなわち 本発明の新規なクローン(pAC2-1)から得られた第1のもの、及び公知のmgl1遺伝 子から得られた第2の酵素のアミノ酸配列を示す(アミノ酸の比較については配列 番号10及び12、コードDNAの比較については配列番号9及び11も参照)。pAC2-1はm gl1と比較して、 アミノ酸位置47におけるPheからLeu、 アミノ酸位置172におけるAspからGlu、及び アミノ酸位置308におけるSerからTyr の3つの相違(突然変異)の存在を特徴とすることが判るであろう。 1以上のこれらの相違(突然変異)を含むアミノ酸置換を導入することにより形 成された修飾ホモシステイナーゼアミノ酸配列は特に本発明の実施において有用 である。従って、本発明の好ましい例は、 (a) Gly-Gly-Asn-Arg-Leu-Ala-Gly-Gln-G1u(配列番号10の残基43〜51を参照)、 (b) Leuを含む(a)のサブセット、 (c) Arg-Val-Cys-Lys-Glu-Ala-His-Ser-Gln(配列番号10の残基168〜176を参照) 、 (d) Gluを含む(c)のサブセット、 (e) Gln-Met-Arg-Met-Tyr-Gly-Ser-Met-Ile(配列番号10の残基304〜312を参照) 、 及び (f) Tyrを含む(e)のサブセット、 からなる群から選択される配列番号10の1以上のペプチド(部分)配列を含むホモ システイナーゼを提供することを含む。 また、本発明の好ましいホモシステイナーゼである配列番号10は、Trichomona svaginalisゲノムDNAから遺伝子として単離されたDNA配列(pAC2-1、配列番号9を 参照)から発現されたものであることが指摘される。これに対し、mgll及びmg12 の報告された単離はcDNA法を使用するものであるようである。従ってpAC2-1は新 規なホモシステイナーゼTrichomonas遺伝子を表わし得るものである。 代表的な例においては、ホモシステイナーゼがPseudomonas、Clostridium、Ae romonasまたはTrichomonas由来の酵素を模倣するものであり、その当初のポリペ プチド配列の1以上のペプチド(部分)配列が、 (a) Gly-Gly-Asn-Arg-Leu-Ala-Gly-Gln-Glu(配列番号10の残基43〜51を参照)、 (b) Leuを含む(a)のサブセット、 (c) Arg-Val-Cys-Lys-Glu-Ala-His-Ser-Gln(配列番号10の残基168〜176を参照) 、 (d) Gluを含む(c)のサブセット、 (e) Gln-Met-Arg-Met-Tyr-Gly-Ser-Met-Ile(配列番号10の残基304〜312を参照) 、及び (f) Tyrを含む(e)のサブセット、 からなる群から選択される配列番号10の1以上の相同ペプチド配列により対応す るように置換されているものである。 この点、用語「相同」の使用はそのような相同性が完全に相同であることを示 すことを意図するものではなく、一般に認められたモデルを使用したそのような 配列の比較により、現在では有意に異なるとしても、そのような配列が共通の祖 先遺伝子またはそのサブセットから進化したものでありうることを意昧する。同 様に、本明細書で使用する用語「変異」は、天然のもの、実験的なもの等、どの ような手段によって生起された修飾も包含するように広く理解されるべきもので ある。 従って、一般に好ましい例としては、第1のTrichomonasホモシステイナーゼを 模倣するものであって、その第2のTrichomonasホモシステイナーゼ(配列番号10 に記載したpAC2-1からのもの)のLeu⁴⁷、Glu¹⁷²及びTyr³⁰⁸残基に対応するアミノ 酸の1以上が対応して前記Leu⁴⁷、Glu¹⁷²及びTyr³⁰⁸の1以上により置換されてい るキメラホモシステイナーゼが挙げられる。 本発明の別の例は、配列番号10の置換変異体、付加変異体、欠失変異体または その他の誘導体であって、それらの変異体または誘導体が下記の特性、 (a) 適当なアッセイ(例えば実施例８に記載するような)においてホモシステイン に対する配列番号10の活性の少なくとも約10%、好ましくは約25%、より好ましく は少なくとも50%の活性、及び／または (b) 適当なアッセイ(例えば実施例８に記載するような)においてシステインまた はメチオニンに対する配列番号10の活性の約1000%未満、好ましくは500%未満、 より好ましくは200%未満の活性、 のいずれかまたは両方を有するホモシステイナーゼにより定義される。 特性のそのような範囲は一般に、システインまたはメチオニンと比較して、ホ モシステインについて酵素の十分に高められた活性を維持すると考えられ、1段 階法がやはり使用できるが、そのような相対的感受性の正確な要件は各臨床用途 において容易に決定できることは理解されるであろう。例えばシステインは、少 なくとも非疾患患者に関しては、尿サンプルにおいて一般に低い濃度であると考 えられる。例えば適当な組換え法により製造されたその他の生物からの変異体ホ モ システイナーゼの条件については、上記の相対的指標が有用であると考えられる 。配列番号10によって表される酵素は、このホモシステイナーゼのホモシステイ ンに対する見かけ上の活性がシステイン及びメチオニンに対するよりも少なくと も約100倍高いことを考えれば、特に有用な例である。 ホモシステイナーゼが1段階アッセイ法におけるその有用性を改良するために 修飾される代表的な例においては、野生型T．vaginalisアミノ酸配列(mgllから のもの、配列番号11及び12を参照)は、そのPhe⁴⁷、Asp¹⁷²、及びSer³⁰⁸の1以上 が削除されるか、あるいは (1) Phe⁴⁷を、Leu、Ile、VaL Ala、Gly，Met及びTrpで置換すること、 (2) Asp¹⁷²を、Glu、Gln、またはAsnで置換すること、 (3) Ser³⁰⁸を、Tyr、Phe、Met、Trp、Gln、Thr、またはAsnで置換すること、 に従って変更されるものであり（一般にはもちろん適当なコードDNAの修飾によ る）、ここでは当分野で認識されているように、比較的保存的なアミノ酸置換が 提案され、その点におけるそれらの有効性は通常の実験によって測定することが できる。 以下にさらに記載するように(実施例７を参照)、ニッケル-NTAアフィニティ精 製法(Qiagen Company、ドイツより入手可能)を使用して、適当なホモシステイナ ーゼコードDNA配列でトランスフェクトした大腸菌またはその他の宿主細胞から のホモシステイナーゼの精製を容易にすることができる。これらの方法は、NTA 樹脂マトリックスに固定されたニッケルカチオンに対するタンパク質イミダゾー ル基の選択的結合を利用するものである。本発明のこの態様の好ましい例におい ては、適当なコードDNA(配列番号９及び１０を参照)の修飾によって、例えば、6 つの連続ヒスチジン残基を含むアミノ末端標識をホモシステイナーゼに導入し、 それによリ宿主細胞材料からのその精製を容易にする。 ホモシステイナーゼ配列番号10(図IABも参照)は、前記タンパク質の天然Met¹ のN-末端側に位置する1以上のヒスチジン残基を含む修飾されたホモシステイナ ーゼ酵素の代表的なものであり、この修飾された酵素はシステイン及びメチオニ ンに対して十分に非反応性であり、一段階アッセイにおいてそのような酵素を使 用することによって被検者の組織液、尿、血液、血清または血漿のサンプル中に 存在するホモシステインの濃度を測定し得る。そのようなアッセイにおいては、 ホモ システインに対する前記修飾されたホモシステイナーゼの反応から生じる1以上 の生成物の量を測定し、そのような測定はサンプル中のシステインまたはメチオ ニンの濃度に実質的に影響されない。本開示のこの態様によれば、本発明の実施 において有用であるホモシステイナーゼは、天然ホモシステイナーゼMet¹のN-末 端側に位置する1以上、好ましくは2〜15、最も好ましくは5〜8の連続したヒスチ ジン残基を含む。 実施例 実施例1 二重酵素減算（double enzvmatic subtraction）による システインを含むサンプル中のホモシステインの検出 血漿サンプル中の遊離ホモシステインの濃度は、以下のように測定される。血 液サンプル(0.1〜5.1mL)を、抗凝固剤としてEDTAを使用して、標準的なバキュテ ーナーで集め、血漿を遠心分離によって調製する。 生物学的サンプル中の遊離ホモシステインの測定が有用な予測情報を臨床医に 提供すると考えられるが、ホモシステインの大きな部分が他の分子(例えば遊離 システイン、その他のホモシステイン分子及び利用可能なタンパク質スルフヒド リル基)にジスルフィド結合されて存在すると認められている。本発明の実施に よれば、プロトコルにおいてジスルフィド還元剤(例えばジチオトレイトール、D TT)を使用して、ホモシステイン分子のより広範なプールの検出を可能とするこ とが一般に好ましい。 150単位/mlのTrichomonas vaginali酵素のホモシステイナーゼストック溶液も 調製する。酵素のストック溶液は一般に、1〜1000単位/ml好ましくは100〜200単 位/mlの範囲であるが、正確な活性は、サンプル中のホモシステインの濃度等の 種々の因子に応じて実施者により選択される。 上記したように、同様の活性レベルでP．putida酵素を使用することも好まし い。 バッファー中に適当に希釈した血漿サンプルを2つの等容量、部分1と2に分割 する。部分1に適当な量のS-アデノシルホモシステインヒドロラーゼ(SAHH)及び 一定量のアデノシンを加える(SAHHは真核生物及び原核生物ソースのいずれから も入手でき、T．vaginalisにおいてこれをクローニングする方法はBagnaraら、M olecul ar and Biochemical Parasitology ，81，pp.1-11，1996に示されている)。十分 なアデノシンの存在下で、血漿ホモシステインをS-アデノシルホモシステインに 変換する。部分2は、SAHHと反応させない。 そしてTrichomonas vaginalisホモシステイナーゼを部分1及び部分2のサンプ ルに加え、約10〜30分反応させる。0.5〜1単位/mLの範囲のホモシステイナーゼ の終濃度が好ましいが、必要に応じ、正確な量を調整することができる。部分1 のサンプル中に残存するアデノシンがヒドロリアーゼ反応が逆行することを阻害 するので、これに留意して当初濃度を選択しなければならない。必要な量は選択 されるSAHHに依存し得るが、有用な開始点は存在するホモシステインの濃度未満 の濃度である。そして部分1及び部分2の両者中の硫化水素を測定し、もとのサン プル中に存在したホモシステインの量を、部分2の硫化水素測定値から部分1の硫 化水素測定値を減じ、この結果を二倍にすることによって計算する。硫化水素測 定は、0.1〜1.0モルの範囲でサンプルに酢酸鉛を添加し、該硫化物を沈殿させる ことによリ行う。沈殿は、標準的な分光光度計により360nmあるいは不溶性の沈 殿物を測定することができるその他の適当な波長(例えば可視領域)で測定する。 この工程は容易に自動化することができる。 二重酵素減算法の実施において有用な別の酵素は、シスタチオニンβ-シンタ ーゼであり、これはホモシステインとセリンからのシスタチオニン体の生成を触 媒する。血清または血漿サンプルについては、反応は血中のセリンの比較的高い 濃度を利用してシスタチオニンの方向に駆動され得る。この酵素の適当なソース としては、Trichomonas、Pseudomonas、あるいは例えば肝臓等の哺乳動物組織か ら単離される材料が挙げられる。S-アデノシルホモシステインヒドロラーゼにつ いて上記した範囲と同等の単位/mlが得られる量で酵素を使用し得る。SAHHの使 用について上記したように、不正確なデータをもたらすこの酵素反応の逆行を防 ぐように段階を行うことが好ましい。反応は、外部からセリンを反応サンプルに 加えるか、シスタチオニンへの変換が終了したら酵素を不可逆的に阻害すること により、シスタチオニンの方向に駆動し、維持することができる。適当な阻害剤 としては、活性部位に高アフィニティを有するセリン類似体が挙げられる。 二重酵素減算法に基づくさらに別の方法も利用できる。最近発表された研究に おいては、酵素メチオニンtRNAシンセターゼ(メチオニンtRNAシンターゼ)が、ホ モシステインを反応体として受容できることが示されている(H．Jakubowskyら、 FEBS Letters，317，pp.237-246，1993を参照)。従ってこの酵素を使用して上記 の結果を再現することが可能である。 実施例2 交互S-アデノシルホモシステインヒドロラーゼ法 実施例1により生成されたS-アデノシルホモシステインを以下の操作にかける 。その生成の後、単離し、S-アデノシルホモシステインがホモシステインに変換 されて戻る条件でさらなる量のS-アデノシルホモシステインヒドロラーゼと接触 させる。その後前記酵素調製物を用いてそのように生成されたホモシステインを ホモシステイナーゼと接触させて、そこから硫化水素を生成する。 実施例3 直接酵素減算によるシステインを含むサンプル中の ホモシステインの検出 実施例1の最初の方法に従い、ホモシステインとシステインとを含む血漿サン プルを調製する。サンプルは部分に分割せず、その代わり、存在するシステイン がtRNAと結合する条件下で、システインtRMAシンセターゼ酵素のサンプルを加え る。選択される酵素は真核生物あるいは原核生物いずれの起源でもよく、その反 応のための条件は当分野において周知である。 そしてシステインを枯渇させたサンプルを上記したようにホモシステイナーゼ と反応させ、硫化水素測定からホモシステイン濃度を直接に測定する。 直接酵素減算法の別の例を下記実施例10に示すが、これは酵素γ-グルタミル システインシンセターゼに基づくものであり、これは真核生物あるいは原核生物 起源のものであってよい。この酵素を使用するアッセイ系を記載する。 システインを枯渇させるために有用な別の酵素としては、システインオキシダ ーゼ及びシスタチオニンβ-シンセターゼが挙げられる。 実施例4 他の生体分子に結合したホモシステインの検出方法 上記したように、ホモシステインは他の生体分子に結合されて生物学的流体中 に存在し、そのような形態で「保存された」ホモシステインが病理的プロセスに 関与すると考えられる。従って、全ホモシステインを測定することが望ましく、 これには(l)ホモシステインダイマー、(2)ホモシステイン/システインヘテロダ イマー、(3)ホモシステインがジスルフィド結合でタンパク質システインに結合 したホモシステイン及びタンパク質のコンジュゲート、および(4)ホモシステイ ン(そのN-アシル化形態を含む)がタンパク質アミノ酸R基、特にタンパク質リシ ンのε-アミノ基に結合した、ホモシステインとタンパク質のコンジュゲートが 含まれる。 形態(1)〜(3)については、還元溶液を使用して共有結合で結合したホモシステ インを遊離させる。1つの例においては、水素化ホウ素ナトリウムまたはナトリ ウムシアノ水酸化ホウ素ストック溶液を約0.1M以下に調製する。反応は、前記水 酸化ホウ素を血漿サンプル(実施例1の最初の工程に従って調製したもの)に加えp H6〜8で5〜10分間室温で行う。過剰の水酸化ホウ素を分解し、その後サンプルを 実施例1または3の酵素反応工程に供することができる。あるいはサンプルを以下 の方法によりさらに操作することにより、水酸化ホウ素をHClで中和し得る。 しかし、水素化ホウ素ナトリウムは一定の環境下でホモシステイナーゼを変性 させることが判ったので、DTTの使用が好ましい。 実施例５ 酸性条件下における操作 上記の形態(4)については、6Ｎ HClを上記タンパク質サンプルで約50/50に希 釈して用いることができる。沸騰温度で1-2時間窒素下で還流した後、完全に乾 燥するまで真空下でサンプルから水を除去する。もしホモシステインが他のアミ ノ酸に結合しているならば、これによって解放される。また、これによってホモ システインのラクトン化プロセスが完了する。乾燥した時点で、酢酸ナトリウム (1Ｍ)および無水酢酸(10Ｍ)を添加する。これを沸騰温度でさらにｌ時間還流し てアセチル化ホモシステインチオラクトンを生成する。 上記無水物を蒸発させて除去し乾燥させる。エーテルを用いてＮ-アセチル化 ホモシステインチオラクトンを選択的に抽出する。次に、このエーテルを真空下 で35℃で蒸発させる。そこに生理学的に緩衝化された水（リン酸緩衝化生理食塩 水ｐＨ7.5)を添加し、これは次にチオラクトン環を開環する。この時点で、２つ の反 応のどちらかが実施される。次にホモシステイナーゼを添加して10-30分間反応 させ、その後上記のように硫化水素を検出する。または、好ましくはブタ腎臓デ アセチラーゼを添加してホモシステインを脱アシル化し、次にホモシステイナー ゼを添加する。 実施例６ システインを含むサンプル中のホモシステインを 直接酵素的減法(subtraction)によって検出するための付加的方法 概して言えば、この付加的方法は以下の事実を利用するものである。すなわち 、ホモシステイナーゼの作用でシステインから生成されるピルビン酸は、血漿等 の生物学的サンプル中に存在するホモシステインおよびシステインの両者に対す るホモシステイナーゼの作用で生成される硫化水素から独立して検出することが できるという事実である。したがって、ホモシステインの測定は単純な引き算に よって行なうことができる。この方法によれば、ピルビン酸から検出可能な生成 物を生成する任意の数の酵素によってピルビン酸を酵素的に測定することができ る。同様に、ロイシンデヒドロゲナーゼを用いて硫化水素との関連においてα- ケト酪酸（ホモシステインから生成されるがシステインからは生成されない）を 測定することができる。 この方法の２つの主要なプロセス、すなわちピルビン酸の検出および硫化水素 の検出は、１個のサンプル中で同時に実施することができる。または、この２つ の検出は平行するサンプル中で別々に実施することができる。どちらの場合にも 適切な対照を用いて実施する。 好ましい例においては、ピルビン酸の検出に用いられる酵素は哺乳動物の乳酸 デヒドロゲナーゼであり、そしてピルビン酸および全硫化水素の両方の測定は標 準的分光光度計を用いて１個のキュベット中で実施される。実施例１の最初の手 順にしたがってホモシステインおよびシステインの両方を含む血漿サンプルを調 製する。このサンプルは部分に分割しない。かわりに、このサンプルにホモシス テイナーゼ（膣トリコモナス(Trichomonas vaginalis)またはP．putida由来）の サンプルを、ホモシステインから硫化水素、アンモニアおよびα-ケト酪酸が生 成され、さらにシステインから硫化水素、アンモニアおよびピルビン酸が生成さ れ る条件下で添加する。酵素乳酸デヒドロゲナーゼのサンプル（先行する実施例に 用いたのと同等の濃度量(単位/ml)で）もまた、この酵素がシステインから生成 されたピルビン酸と反応する条件下で添加され、次にその反応を340nmで又はそ の付近で(NADHに対して)周知の方法によってモニターする。 サンプル中のホモシステインおよびシステインの両者の合計濃度は、先に記述 したように（実施例１参照）、沈降する発色した鉛塩を検出することができる任 意の波長（可視域など）で、または例えば360nmもしくはこの近傍で、ホモシス テイナーゼから生成された全硫化水素を測定することによって比色的に測定する ことができる。硫化水素は、当分野で公知の他の発色性金属塩の形成に基づいて も検出することができる。(システインおよびホモシステインから生成された)全 硫化水素を(システインのみから生成された)全ピルビン酸と比較することによっ て、もとのサンプル中のホモシステイン濃度が決定される。この方法もまた容易 に自動化され、両方の検出波長を同時にモニターすることが可能である。 血液または血液由来の溶液中のピルビン酸を検出するための乳酸デヒドロゲナ ーゼの使用は当技術分野で認められている幾つかの方法の１つにしたがえばよい が、特定の予防措置をここでも繰り返さなければならない。ピルビン酸は血液中 および血液由来の物質中で非常に不安定であって、重合することさえある。しが って、ピルビン酸測定は、回収したサンプルのタンパク質を含まない濾液を用い て、および当技術分野で公知のメタリン酸で処理した場合のみ回収したサンプル を用いて、実施することが望ましい。 実施例７ 大腸菌BL21（DE3）pAC2-1クローンの作製 膣トリコモナスのpAC2-1ホモシステイナーゼ遺伝子のクローニングを下記のよ うに実施した。概して言えば、他の微生物に適用可能と認められる組換え方法が トリコモナスDNAの操作についても有用である。上述したように多数のトリコモ ナス遺伝子はイントロンを欠くゆえに特にそう言えるのである。有用な参照文献 としてY．Tanら，Protein Expression and Purification，9,pp．233-245(1997) および1996年12月19日に公表されたY．Tanらの国際特許公開第96/40284号を挙げ ることができる。 標準的手順(Wizard Minipreps，Promega，Madison，WI)によって膣トリコモナ スのゲノムDNAを単離し、PCR反応の鋳型として用いた。PCR反応はPCR試薬キット (Roche，Branchburg，NJ)に添付された方法にしたがって実施した。mgl１遺伝子 のヌクレオチド配列(J.C．Mottramら，Gene Bank受託番号AJOO0486，NID g23308 84，1997年7月17日提出)に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。 使用した具体的プライマーは以下の通りである： （センス）5'-GGATTACATATGCATCATCATCATCATCACATGAGTGGCCACGCTATCGAC-3’（配 列番号１３）（CATATG NdeI部位を含む）；および（アンチセンス） 5'-GGATTAGGATCCTTAGAGGACTAAGTCGAGAGCC-3’（配列番号１４）（GGATCC Ba mHI部位を含む）。使用した付加的試薬は、制限エンドヌクレアーゼ、T4 DNAリ ガーゼ、およびBL21(DE3)コンピテント細胞を含んでいた。これらは全てStratag ene(San Diego，CA)より購入した。GeneAmp PCR試薬キットはRoche(Branchburg ，NJ)より購入し、またDNA精製キットはPromega(Madison，WI)より購入した。PC R増幅用のオリゴヌクレオチドプローブは、IDT Inc．（Coralville，IA）によっ て合成された。他の全ての試薬はSigma(St．Louis，MO)から購入した。野生型膣 トリコモナスはAmerican Type Culture Collection(Rockville，MD)より購入し た。 PCR反応の条件は以下の通りであった。すなわち、94℃で１分間変性、50℃で ２分間アニーリングおよび72℃で２分間伸長を35サイクル実施した。これに続い て72℃で10分間、最終伸長工程を実施した。標準的プロトコールを用いて、PCR 増幅産物（Kb-ラダーマーカーによって同定される1.2K bpの単一バンドとして出 現した）を回収し、NdeIおよびBamHI制限酵素によって消化し、次にpT7-7ベクタ ーのNdeIおよびBamHIクローニング部位に連結した(pT7-7ベクターはHarvard Med ical School，Boston，MAのStan Tabor博士によって提供された；Current Proto cols in Molecular Biology，F.A．Ausubelら（編），1990,pp．16.2.1-16.2.11 ，Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York収録のTabor,S．「T7 R NAボリメラーゼ／プロモーター系を用いた発現(Expression using the T7 RNA p olymerase/promoter system)」参照）。次に、得られたプラスミド を電気的形質転換法によって大腸菌BL21(DE3)細胞中に形質転換した。 37℃で１晩インキュベートした後、アンピシリン含有プレートからアンピシリ ン耐性コロニーを選択した。選択したコロニーの細胞を５mlのLB培地(Fisher)中 で37℃で１晩増殖させた。α-ケト酪酸アッセイ（メチル-2-ベンゾチアゾリンオ ンヒドラゾンの反応に基づくK．Sodaら，Methods in Enzymology，143，459-465 ,1981の方法の改変法を使用）および／またはH₂Sを生成させ定量する脱チオメチ ル化アッセイ(A.E．Braunsteinら，Biochimica et Biophysica Acta，242，pp． 247-260，1971参照）（これらのアッセイは両方とも以下に直接記述する）にお ける粗製培養抽出物の酵素活性に基づいて適切なクローンを選択した。 また、含有するプラスミド(これもpT7-7に基づく発現ベクターpAC2-11)がホモ システイナーゼをコードする配列を２コピー（これらはタンデムに存在する）含 むという点でのみ異なっている大腸菌BL21（DE3）pAC2-1クローンの変異型をも 構築した。大腸菌BL21（DE3）pAC2-11と称するこの特定のクローンは、本発明の 診断方法に用いるための組換えホモシステイナーゼの高レベル発現をもたらす。 すなわち、２コピーのコード配列はpT7-7のNdeIとBsp106I部位の間に配置されて いた。第１のコピーはNdeIからBamHIの間に、第２のコピーはBamHIからBsp106I の間に連結されていた。組換えホモシステイナーゼはpAC2-1またはpAC2-11クロ ーンから同じ方法によって精製することができる。α-ケト酪酸／ピルビン酸アッセイ このアッセイの第１工程において、10μＭリン酸ピリドキサールおよび異なる 濃度(25μＭ-25ｍＭ)のDL-ホモシステインまたはＬ-メチオニンまたはＬ-システ インをそれぞれ含む容量1mlの100 mMリン酸緩衝液(ｐＨ8.0)を、約1-100単位の ホモシステイナーゼ(“HCYase”)酵素を供給するのに十分な量（典型的には50μ ｌ）の粗細胞抽出物（細胞を超音波処理し、遠心後上清を回収したもの）サンプ ルと共に37℃で10分間インキュベートした。0.1mlの50％TCAを添加することによ って反応を停止させた。次に、Eppendorf遠心機を用いて懸濁物を13k rpmで２分 間遠心した。上清の0.5mlサンプルを、0.8mlの1Ｍ酢酸ナトリウム(ｐＨ5.2)に溶 解した0.5mlの0.05％3-メチル-2-ベンゾチアゾリンオンヒドラゾン(“MBTH”)に 添加し、50℃で30分間インキュベートした。各サンプルについて分光測 光法によりOD₃₂₀で反応生成物の量を測定した。タンパク質の量はウシ血清アル ブミンを標準としてBio-Rad500-0006キット(Bio-Rad，Richmond，CA)を用いて測 定した。酵素の比活性をタンパク質1mgあたりの単位として計算した。ここで酵 素の１単位とは、１分間にホモシステインから１μmolのα-ケト酪酸の形成を触 媒する量と定義される。当然ながら、このアッセイ方法は1アッセイ試験あたり 例えば1-100単位の酵素を供給する精製ホモシステイナーゼサンプルに対しても 用いることができる。脱チオメチル化スクリーニングアッセイ 上記のように、用いたアッセイはA.E．Braunsteinらの方法(前掲)の改変法で ある。標準的反応混合物はリン酸カリウム緩衝液(ｐＨ7.5，100ｍＭ)、酢酸鉛(0 .33ｍＭ)、および1-100単位のホモシステイナーゼを供給するのに十分な粗細胞 抽出物から成っていた。この混合物に、反応混合物の全容量が1.5mlとなるよう に異なる濃度(５μＭ-100μＭ)の基質DL-ホモシステインまたはＬ-システインま たはＬ-メチオニンを添加した。37℃で10分間インキュベートした後、分光光度 計を用いてOD₃₆₀で硫化鉛の測定を行なった。このアッセイ方法は例えば1アッセ イ試験あたり1-100単位の酵素を供給する精製ホモシステイナーゼサンプルに対 しても用いることができる。 生成物ホモシステイナーゼの精製 上記の初期アッセイスクリーニングを行なった後、DEAE Sepharose Fast Flow クロマトグラフィー（pAC2-1クローンから得られた酵素活性プロフィールについ ては図３参照）またはニッケル-NTAアフィニティークロマトグラフィー（pAC2-1 クローンから得られた酵素活性プロフィールについては図４参照）を含むプロト コールを用いて、有望なクローン由来のホモシステイナーゼ(“HCYases”)を精 製した。細胞増殖条件 特定のクローンに対応する冷凍大腸菌ストック10μｌを、10μg/mlのアンピシ リンを含む5mlのLB培地(Fisher)に播き、穏やかに振とうしながら(300rpm)３0℃ で１晩培養した。次に、500mlのフラスコに入れた２つの新鮮な100ml容量のLB培 地中に培養物を分割し、300rpmで振とうしながら30℃で6時間さらに 培養した。次に全培養物を800mlのLB培地を含む各6リットルの18個のフラスコ中 に分割した。300rpmで37℃にて１晩増殖を継続させ、約10というOD₆₀₀を達成し た。次に細菌を4000gで遠心分離して増殖培地を新鮮なLB培地に交換し、そして 再度37℃および300 rpmでさらに６時間インキュベーションを続けた。OD₆₀₀が20 に達した時、４℃で4000gで10分間遠心することにより細菌を集菌した。上記方 法の広範な変法もまた有効であることが認められるであろう。クロマトグラフィーに先立つ前処理 細菌ペレットを、抽出液(20ｍＭリン酸カリウム、10μＭリン酸ピリドキサー ル及び0.01％β-メルカプトエタノール、ｐＨ9.0)に懸濁し、次にキャビテータ ー(cavitator)型ホモジナイザー（モデルHC 8000，Microfluidics Corporation ，Newton，MA)を用いて破壊した。冷却遠心機(Sorvall製、Superspeed RC2-B)を 用いて8000gで4℃で30分間この懸濁物を遠心した。次に上清を回収し、50℃で1 分間加熱し、限外濾過にかけた。限外濾過には、10ｍＭリン酸カリウム緩衝液( ｐＨ8.3)を含む2.5 ft²圧力カートリッジを用いた分取はかり装置(preparatory scale device）(モデルTFF PLHK 100k，Millipore，Bedford MA)を用いた。限外 濾過の間、ｐＨは7.2に調節した。クロマトグラフィー条件‐第１カラム 上記に由来する濃縮物(ｐＨ7.2)を、40 ｍＭ KCl-PPM緩衝液(40 ｍＭ塩化カリ ウム、10ｍＭリン酸カリウム、10μＭリン酸ピリドキサール、0.01％β-メル F(Pharmacia，Uppsala，Sweden)を含有する第ｌカラム（直径100mm x30ｃm)に加 えた。上記タンパク質サンプルのローディングの後、約10容量の40ｍＭKCI-PPM 緩衝液を用いて、OD₂₈₀が0.1以下に低下するまでカラムを前洗浄した。次に、PP M緩衝液中で40-300 ｍＭ KClの線勾配を用いてタンパク質を溶出し、溶出液を50 0mlの画分として回収した。ホモシステイナーゼを含む画分をそれらの黄色い色 および活性アッセイによって同定した。クロマトグラフィー条件‐第２カラム 80ｍＭ KClおよび10ｍＭリン酸カリウムを含む溶液(ｐＨ8.3)を外液として24 時間透析した後、回収した溶出液（約2-5mg/mlは、合計5-10gのタンパク質の 回収に相当する）を第２カラムに加えた。ローディング後、80 ｍＭ KClおよび1 0ｍＭリン酸カリウムを含む溶液(ｐＨ8.3)４容量を用いて（流速約6-8ml/分で） 、 harmacia XK 50130、容量500mL直径50mm x25cm)を前洗浄した。次に、10ｍＭリ ン酸カリウム緩衝液(ｐＨ8.3)中で80-300ｍＭ塩化カリウムの線勾配を用いてホ モシステイナーゼを溶出した。溶出液を300mlの画分として回収し、そして黄色 い色およびホモシステイナーゼ酵素活性によって活性画分を同定することができ た。この方法で精製したホモシステイナーゼの酵素活性（ホモシステイン、シス テインおよびメチオニンに対する）の結果は後述する実施例８で論じる（図３も 参照されたい）。 または、付加的な２段階戦略を用いることができる。第１段階では、分配(par ti ン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ7.2を用いて実施した。タンパク質の溶出は20ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ7.2（溶液Ａ）から20ｍＭリン酸ナトリウム緩衝 液、ｐＨ7.2、500ｍＭ NaCl（溶液Ｂ）への線勾配(8ml/分）を用いて実施した。 洗浄は20ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ7.2)に溶解した0.6Ｍ NH₄SO₄を用い て実施した。タンパク質の溶出は、0.6Ｍ NH₄SO₄，20ｍＭリン酸ナトリウム緩衝 液、ｐＨ7.2（溶液Ａ）から20ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ7.2（溶液Ｂ） への線勾配(5ml/分）を用いて実施した。以下の精製結果はこの付加的方法によ って得られた。上記の細胞溶解物は、8400単位のホモシステイナーゼを比活性（ 単位/mg）5.2で含んでいた。プレカラム(pre-column)操作の完了後、比活性6 ム）の完了後、5,040単位を比活性172で回収した（収率60％)。フェニルSepharo s (収率50％)。得られたホモシステイナーゼの分析 HPLC分析のため、L-6200A Intelligentポンプ（Hitachi,Ltd.、東京、日本） をSupelco Progel^TMTSKカラム(G3000 SW_XL，30cm x7.8mm,Supelco,Bel lefonte，PA)と共に使用した。典型的には、20μｌサイズのサンプル（約0.1-0. 5ｍｇ/mlのタンパク質を含む）をカラムに加え、0.12 Ｍ NaCl，10 ｍＭリン酸 ナトリウム緩衝液(ｐＨ7.2)を含む溶液を用いて流速約1ml/分で溶出した。分光 光度計(Hitachi U2000)を用いて波長280nmでタンパク質含有画分を同定した。ウ シ血清アルブミン(MW 66,000)およびサツマイモ由来β-アミラーゼ(MW200,000)( Sigma，St．Louis，MO)を分子量標準として用いた。得られた保持時間は、BSA 8 .88分、β-アミラーゼ7.82分、および生成物ホモシステイナーゼ8.28分であった 。 非還元性7.5％または10％ポリアクリルアミドを用いてあらかじめ形成したプ レートを0.2 Ｍ Tris-グリシン緩衝液(ｐＨ8.3)中に入れ、0.1％のSDSの存在下 または不在下で、得られたタンパク質の電気泳動を実施した。使用した分子量標 準はKaleidoscope Prestained Standards (Bio-Rad，Richmond，CA)であった。 生成物ホモシステイナーゼは0.1％SDSの存在下では約43 kDの単一バンドとなり 、0.1％SDSの不在下では約172 kDの単一バンドとなった。 次に、ACGT Inc．(Northbrook，IL)によって、T7 DNAポリメラーゼおよびジデ オキシヌクレオチド終結反応法を用いて、適切なクローンのDNA配列決定が実施 された。プライマーウォーキング法(primer walking method)が用いられ、そし て配列はDNA分析器を用いて分析された。Ni-NTA 法を用いた、6xヒスチジンのタグを付けた(tagged)タンパク質としてのホ モシステイナーゼの精製 大腸菌由来の組換えホモシステイナーゼを精製する別の方法は、ニッケル-NTA アフィニティークロマトグラフィーの使用を含む。この技術は、NTA樹脂マトリ ックス中に固定されたニッケルカチオンに対するタンパク質ヒスチジンイミダゾ ールの親和性を利用するものである。この技術(Qiagen Company，Germany)を十 分利用するためには、６個の付加的ヒスチジン残基からなる配列がホモシステイ ナーゼの天然のMet¹のＮ末端側に（好ましくは発現されるべきＤＮＡコード配列 を改変することによって）付加される（上記実施例７および配列番号９および１ ０参照）。 この精製法にしたがつて（さらなる情報については、Qiagenから入手可能なTh e QIAexpressionist,A handbook for high level expression and purificati on of 6xHis-tagged proteins，1997年3月、第３版をも参照されたい）、大腸菌 BL21(DE3)、クローンpAC2-1の稠密に増殖した培養物100mlを遠心により集菌し、 得られたペレットを4mlの溶菌緩衝液(300ｍＭ NaCl，10ｍＭイミダゾール，50ｍ Ｍ NaH₂PO₄，ｐＨ8.0)に再懸濁した。次に、この細菌懸濁物を氷上で1分間超音 波処理した。 ベンチトップ遠心機セットを最大スピードで20分間用いて細胞破砕物を除去し た。次に、清澄な上清を1mlのNi-NTAスラリー(Qiagen)と混合し、氷上で60秒間 穏やかに振とうして吸着させた。次に混合物を使い捨てポリプロピレンカラムに 移し、通過画分を廃棄した。次に8mlの洗浄緩衝液(300ｍＭ NaCl，20ｍＭイミダ ゾール，50ｍＭ NaH₄PO₄，ｐＨ8.0)を用いてNi-NTA樹脂ビーズを洗浄した。その 後、2mlの溶出緩衝液(300ｍＭ NaCl，250ｍＭイミダゾール，50ｍＭ NaH₂PO₄， ｐＨ8.0)を用いて溶出することによって組換えタンパク質を最終的に回収した。 次に精製タンパク質を上記のように特徴づけた。この様式で精製したホモシステ イナーゼの酵素活性（ホモシステイン、システインおよびメチオニンに対する） の結果を以下の実施例８に記述する（図４も参照されたい）。 実施例８ 本発明のホモシステイナーゼの代表的触媒特性 図２から４は、単一工程アッセイのための本発明のホモシステイナーゼの大幅 に増大した有用性を明示している。図２に示す結果は、pAC2-1クローンを含む宿 主大腸菌細胞の粗溶解物の使用を反映し、３つの基質（ホモシステイン、システ インおよびメチオニン）のそれぞれが別個のアッセイにおいて25ｍＭで存在した 場合の、それぞれに対する比活性(単位/mg)を示している。図３および４に示す 結果は（同様にpAC2-1クローンを含む大腸菌について）、精製酵素調製物のホモ システイン、システインおよびメチオニンに対する相対活性を反映する。図３に 示すアッセイのためには、酵素を実施例７に記述したDEAE Sepharose Fast Flow 法を用いて精製した。図４のためには、ニッケル-NTAアガロースアフィニティー 試薬を含む実施例７の精製方法が用いられた（方法については、上記の「α-ケ ト酪酸／ピルビン酸アッセイ」と題した項目を参照されたい）。 宿主大腸菌細胞由来の組換えホモシステイナーゼを精製するには多数の方法を 使用できることが十分認識される。具体的に示すように、本発明の新規なホモシ ステイナーゼは、システインまたはメチオニンに対して示された活性よりも典型 的には100倍、そして時には約1000倍も高い活性をホモシステインに対して示す （本発明のアッセイを用いた場合、例えば実施例１参照）。 実施例９ 単一工程／単一酵素臨床アッセイ 生物学的液体中のホモシステインについての多工程／多酵素アッセイにおける 処置は、ホモシステイナーゼ新規種の基質特異性を利用するために、簡略化され た単一工程／単一酵素アッセイ用に容易に適合させられることが直ちに認識され るであろう（本明細書では、「単一工程アッセイ」および「単一酵素アッセイ」 という用語は、システインおよび／またはメチオニンの存在下でホモシステイン を正確に測定するために生物学的サンプルをただ１つの酵素に接触させればよい ことを示すために相互交換可能に使用される）。このような方法に適切なホモシ ステイナーゼの濃度は、実施例１または本明細書のどこかに記述された濃度と概 して等しいか、または容易に決定される。 本明細書の単一酵素診断法によれば、システインおよび／またはメチオニンの 混入濃度に由来する干渉なしに、貴重な診断的情報を医師に提供するのに十分な 正確さで、全血、血漿、血清、尿または組織液、等の生物学的サンプル中のホモ システイン濃度を測定することができる。このような診断アッセイは迅速かつ正 確で、最小限の試薬しか必要としない。それゆえ臨床ラボにおいて、また公衆衛 生測定法として大規模スクリーニング操作に適用できる。 代表的例においては、正常な血漿中のシステイン濃度は約30-120μＭ（マイク ロモル）であるが、ホモシステイン濃度は約5-15μＭにすぎない。当技術分野に おいて認識されているように、血漿中のホモシステイン濃度が15μＭレベルよリ 上昇すると、患者の心臓血管疾患への危険が重大に増大しうる。数百マイクロマ ルまでのホモシステインレベルを有する高リスク心臓血管疾患患者が同定されて いる。同様に、システイン代謝障害によって影響された患者は500または1000μ Ｍまでもシステインレベルが上昇しうる。本発明の診断キットは、０マイクロモ ル（典型的には10マイクロモル）から約1000マイクロモルまたはそれ以上のシス テインをも含む生物学的液体中のホモシステイン濃度を例えば1-500マイクロモ ルの範囲で測定するのに有用である。 本発明の好ましい実施によれば、ホモシステイナーゼが提供される。この酵素 のホモシステインおよびシステインに対する相対活性は以下の通りである。すな わち、生成物硫化水素を検出することにより患者サンプル中で測定されたホモシ ステインの見かけ濃度（これはシステインからの寄与も反映している）は、実際 のホモシステイン濃度の約150％、好ましくは約110％、そして最も好ましくは約 102％よりも少ない。本発明のさらに好ましい例においては、例えばpAC2-1から 発現された新規なトリコモナスホモシステイナーゼを用いて単一酵素アッセイで 測定したホモシステインの見かけ濃度は、システインからのわずか約1％の偽の 寄与を反映するのみである。 本発明の実施によれば、このような単一酵素アッセイ法（ホモシステイナーゼ として例えば配列番号10を用いる）は、ホモシステインおよびシステインの両方 （および場合によりメチオニン）の広範な天然濃度（および濃度の比）に対して 適用可能である。したがって、このアッセイ法は健常な被験者および疾患、特に 心臓血管疾患の危険がある被験者の両方の体液化学を正確に反映することができ る。 したがって、本発明はその最も好ましい態様において、被験者の生物学的液体 中のホモシステイン濃度を測定する単一酵素アッセイに用いるための診断キット を提供する。このキットは以下のものを含み、 （ａ）ホモシステイナーゼ酵素：および （ｂ）ホモシステイナーゼのホモシステインに対する反応によって形成される 生成物硫化水素の量を測定するのに用いうる少なくとも１つの試薬； ここで該ホモシステイナーゼは、該酵素のシステインに対する反応によって生成 される硫化水素が心臓血管疾患へのリスクを評価するための該キットの使用を実 質的に妨げないほど、システインに対して十分非反応性である。 本発明の診断キットはホモシステインおよびシステインの広範な濃度および相 対濃度に対して有用であるため、本発明の上首尾な実践の種々の例があることが 期待される。代表的な例ば以下の通りである： （１）最も一般的には、ホモシステインではなくシステインに帰される測定さ れた硫化水素の画分は、資格のある医師による結果の有効な解釈が必要ないほど 十分小さくなければならない。一般に、有用な診断情報は、ホモシステインに起 因する生成された硫化水素の量が全体の約半分である時に得られる。患者サンプ ルにおけるホモシステインと比較して概して高いシステインの濃度を考えると、 このような酵素の特異性はなお明白である。しかし好ましくは、あるアッセイで 検出される全硫化水素の画分のうち、ホモシステインに起因するものは少なくと も90％、好ましくは95％、より好ましくは98％、そして最も好ましくは99％以上 である。例えば配列番号10によって表されるホモシステイナーゼを用いる本発明 の実施にしたがえば、99％というレベルは容易に獲得される。 （２）含有されるホモシステインの濃度が約20マイクロモル以上である、心臓 血管疾患の危険を明示している患者サンプルのアッセイにおいて、300マイクロ モルまたはそれ以上のシステイン濃度は検出される硫化水素の全量に1％未満し か寄与しない。明らかに、そのような酵素はより大きいシステイン濃度を有する 生物学的サンプルについても非常に有用である。 （３）システイン：ホモシステインの濃度比が例えば約15:1である、心臓血管 疾患の危険を明示している患者サンプルのアッセイにおいて、システインは検出 される硫化水素の全量に約1％未満しか寄与しない。 下記のことは公知ホモシステイナーゼと本発明の新規酵素の特性の違いをさら に証拠づける。 膣トリコモナスから単離されたホモシステイナーゼ（これは２つ以上の遺伝子 からの発現を表す場合がある）は、ホモシステインに対して約0.5ｍＭというＫ_m 値をもつことが報告された（前出のLockwoodら，1991参照）。これに対して、pA C2-1クローンから発現された新規酵素について測定されたＫ_m値は（すべて37℃ 、ｐＨ8.0で）、ホモシステイン、システインおよびメチオニンに対してそれぞ れ4.8ｍＭ，3.45ｍＭおよび3.1ｍＭである。 Ｋ_mの計算値は、10μＭリン酸ピリドキサールおよび異なる濃度(10μＭから1. 6ｍＭ)のDL-ホモシステイン、Ｌ-メチオニンまたはＬ-システインをそれぞれ含 む容量1mlの100ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ8.0)中で、50μｌの酵素(300単位/ml)を 用い て37℃、ｐＨ8.0で10分間実施したアッセイから決定した。0.1mlの50％ TCAを添 加して反応を停止させた。次に、Eppendorf遠心機を用いて、得られた懸濁物を1 3k rpmで2分間遠心した。次に上清の0.5mlサンプルを、0.8mlの1Ｍ酢酸ナトリウ ム(ｐＨ5.2)に溶解した0.5ml容量の0.05％ 3-メチル-2-ベンゾチアゾリンオンヒ ドラゾンに添加し、50℃で30分間インキュベートした。次に分光測光法によりOD₃₂₀ で反応生成物の量を測定した。図５に示すＫ_cat（ターンオーバー数）値は、 標準的速度論式およびプロットを用いてV_max値の計算から決定した。 pAC2-1クローンから発現された酵素の速度論は野生型酵素のそれとは全く異な ることが明らかである。本発明の付加的態様は以下の認識を含む。すなわち、向 上した速度論的特性を提供するために膣トリコモナス酵素のアミノ酸配列におけ るある変化が記述されたが、当業者はこれを達成する他の可能性のある作用機構 を認めるであろう。その１例は、活性部位または非活性部位における該酵素の共 有結合修飾である。ホモシステイナーゼを改変するそのような他の方法は、もし それが本明細書に初めて開示されたような速度論的特性を有する酵素の生成をも たらすならば、本発明の実施の範囲内にある。 実施例10 γ-グルタミルシステインシンテターゼに基づくアッセイ技術 酵素γ-グルタミルシステインシンテターゼ（EC 6.3.2.2、グルタミン酸-シス テインリガーゼとも呼ばれる）は、生物学的サンプル中のホモシステインについ てのアッセイの正確さを高めるために用いることができるもう１つの酵素である 。この酵素は、生きている細胞中で多くの重要な機能を有するトリペプチドであ るグルタチオン（γ-Ｌ-グルタミル-Ｌ-システイニルグリシン）の合成における 第１段階であってかつ律速段階である段階を触媒する。代謝経路においてグルタ チオンが果たす重要な役割を認めるならば、γ-グルタミルシステインシンテタ ーゼが基質システインの代替物としてホモシステインを受け入れることはまずな いだろうと思われる。したがってこの酵素の使用は、干渉するシステインを除去 することにより生物学的サンプル中のホモシステインの高度に特異的な測定（ホ モシステイナーゼによる）に寄与する。好ましい例においては、アッセイは直接 酵素的減法（実施例３参照）を用いて実施される。パートＡ ‐大腸菌γ-グルタミルシステインシンテターゼをコードするDNAの発現 本明細書の主な達成は、生物学的サンプル中のホモシステイン濃度の正確な測 定をもたらす、感受性の高い、酵素に基づくアッセイ法である。先に述べたよう に、多種類の生物学的サンプルにおいて、システインの天然の濃度はホモシステ インの測定に干渉する。以下の記述するように、特に好ましい酵素に基づくホモ システインのアッセイは２つの酵素の使用を含む。すなわち、(1)ホモシステイ ンに対して高い特異性を有し、かつシステインに対して非常に低い特異性を有す るホモシステイナーゼ（pAC2-1から発現される膣トリコモナス酵素、配列番号10 等）、および(2)その使用がシステインからの干渉をさらに減少させる、クロー ンGSH-I His（下記参照）等に由来するγ-グルタミルシステインシンテターゼで ある。 この多酵素アプローチの価値がいったん認識されたならば、使用されたγ-グ ルタミルシステインシンテターゼ酵素は多様な供給源（例えば、ブタ肝臓、小麦 胚芽、ウシ水晶体、ラット肝臓、またばProteus mirabilisもしくば大腸菌Ｂを 含む細菌）から提供されうることが直ちに理解されるであろう。γ-グルタミル システインシンテターゼ酵素はこのような供給源から公知の方法によって精製す ることができる。または、例えば大腸菌等の原核宿主細胞から、または組換え発 現について有用であると一般に認められている真核細胞から組換えによって発現 させることができる。適切な大腸菌株は大腸菌BL21(DE3)、HB 101およびJM 109 を含む。 このアプローチの広範な有用性を認めるならば、本明細書の教示に基づいて臨 床家には広範囲な特定のアッセイ条件、酵素濃度、検出色素団、等が使用可能で あるということも直ちに明らかとなろう。例えば、大腸菌γ-グルタミルシステ インシンテターゼ（gsh Ｉ）遺伝子のヌクレオチド配列がK．Watanabeら(Nuclei c Acids Research，14(11)，pp．4393-4400，1986およびそこに引用されている 文献を参照されたい）によって報告されている。518アミノ酸から成るオープン リーディングフレームが推定され、普通でない(unusual)コドンであるTTGが翻訳 開始 点(Met¹)であると決定された。該酵素およびその機能もまた分子レベルで特徴づ けられ、その発現および精製方法が記述されている(Y．Inoueら，App1ied Micro biology and Biotechnology，38，pp．473-477，1993)。 本発明の実施においては、大腸菌γ-グルタミルシステインシンテターゼ遺伝 子をクローン化するため、大腸菌HB 101のゲノムDNAを単離し、PCRの鋳型として 用いた。プライマーは、コード配列を２つの重複する断片として増幅できるよう に選択された。選択されたプライマーは小さいほうの遺伝子断片に対応するGSH- 1およびGSH-2、ならびに大きいほうの遺伝子断片に対して同様に選択されたGSH- 3およびGSH-4であった。また、普通でない開始コドンTTG（下記のGSH-L配列番号 15参照）をATGに置換した。 プライマーGSH-1からGSH-4までのヌクレオチド配列は以下の通りであった（ヌ クレオチド番号は、オープンリーディングフレームを含むとK．Watanabeらによ って報告されている単離された2098 bp HincII-PstI制限断片に基づいて、K．Wa tanabeらの第4396頁に使用されているものと対応するように割り振った）： これはヌクレオチド第1877-1894に対応しており（1894は終止コドン）、12個の 付加的ヌクレオチドが結合されている（配列番号18）。 得られたタンパク質のＮ末端にオリゴ（６量体）ヒスチジンタグを付けるため （上記実施例７も比較されたい）、プライマーGSH-1Hをコードする配列の5'末端 に一連の連続ヒスチジンコドン(CAT/CAC)を下記のように含ませた（次に、GSH-1 の代わりにGSH-1HをGSH-2と共に使用し、また上記のように普通でない開始コド ンを置換した）： 適切な発現プラスミドを構築するため、上記の小さい方の断片をNdeIおよびEc oRIで消化し、大きい方の断片をEcoRIおよびBamHIで消化した。次に、両方の断 片を、あらかじめNdeI/BamHIで消化したpT7-7プラスミド(NdeIおよびBamHI部位 を含む）との３者間連結(3-way ligation)に用いて、プラスミドpGSH-IおよびpG SH-I-HIS（これらはＮ末端のヒスチジンタグのコード配列において異なっている のみである）を作製した。RE分析によって正しいクローニングであることを確認 した。次に該プラスミドを大腸菌BL21(DE3)細胞中に形質転換し、タンパク質少 量調製物(miniprep)を調製して組換えタンパク質の発現を確認した。 実施例７にpAC2-1膣トリコモナスホモシステイナーゼの精製について記述した 方法を用いて、ニッケル-NTAアフィニティークロマトグラフィーによって、大腸 菌BL21(DE3)より十分なγ-グルタミルシステインシンテターゼを精製した。パートＢ ‐γ‐グルタミルシステインシンテターゼおよびZn(OH)₂トラツピング を用いたアッセイ法 本発明の実施よれば、γ-グルタミルシステインシンテターゼを用いて生物学 的サンプルからシステインを枯渇させた後、いくつかの方法のうち任意の方法に よって（好ましくはホモシステイナーゼの使用を含む方法によって）、得られた １以上の反応生成物を検出して、該サンプル中のホモシステイン濃度の測定を実 施することができる。 有効なアッセイ法のさらなる例を以下に提示する。この方法は、ホモシステイ ナーゼ反応において生成される硫化水素を効率的に消費する反応においてin sit uで生成されるメチレンブルーの比色検出を含む。この方法は、色素分子メチレ ンブルー（メチルチオニンクロリド）の可視域（740nm等）における効率的な検 出を利用するものである。特に、メチレンブルーは硫化水素の存在下で塩化第二 鉄を用いたN,N-ジメチル-p-フェニレンジアミン(“NDPD”)の酸化によって生成 される。この反応機構の変法においては、N,N-ジメチル-p-フェニレンジアミン の代わりにN,N-ジエチル-p-フェニレンジアミンが用いられ、その結果比色検出 が約５倍まで増大する。当技術分野において認められるように、第二鉄の他の供 給源も適切である。 本開示に照らして、当業者はサンプル中のホモシステインを検出するために多 数の方法が使用できることを認めるであろうが、この「メチレンブルー法」は大 量サンプルの迅速で、正確で、かつ経済的なスクリーニングが要求される臨床環 境で特に有用であることが見いだされた。 この方法を説明する手順を以下の通り実施した。すなわち、ヒト血清サンプル をリン酸緩衝化生理食塩水で1:1に希釈し、次にAmicon 30k Centriprepを用いて 4,000rpmで60分間4℃で遠心して限外濾過によりタンパク質を除去した。このタ ンパク質を除去され希釈された血清を回収し、アッセイに使用するため1mlアリ コートに分割しEppendorf試験管に入れた。以下に記述する方法で遊離のホモシ ステインを測定した。プロコールの適切な時点に還元工程（例えば、5ｍＭβ-メ ルカプトエタノールの添加）を含むことにより、ジスルフィド２量体（ホモシス テインまたはシステイン／ホモシステインヘテロ２量体）として存在する、また はタンパク質にジスルフィド結合したものとして見いだされる全血清ホモシステ インの画分も測定することが可能である。しかし、タンパク質（γ-グルタミ ルシステインシンテターゼおよびホモシステイナーゼを含む）を不活性化するそ のような試薬の能力を考慮するならば、還元剤（下記参照）としては例えばγ- グルタミルシステインシンテターゼまたはホモシステイナーゼを不活性化するこ となくホモシステインのジスルフィド結合を還元することができる特殊化された 化合物を選択することが好ましい。 これらのプロトコールにおいては、アッセイの再現性を確かめる確認を最初に 実施した。したがって、第１試験においては、血清（1:1に希釈し、タンパク質 を除去したもの）を入れた別個の試験管に最終濃度が1μＭ、５μＭ、10μＭ、1 5μＭおよび20μＭとなるように異なる量のホモシステインを添加した。ホモシ ステイナーゼ（pAC2-1、配列番号10から発現された膣トリコモナス酵素または野 生型Pseudomonas putida酵素）の50μｌアリコートを各試験管に添加し、（H₂S を保持するため）各試験管の蓋をきっちり閉めて37℃で20分間インキユベートし た。100μｌの1Ｍ NaOHを混合しながら添加して反応を停止し、その後直ちに0.3 mlのトラッピング溶液（溶液Ａ）をさらに添加し、迅速に混合し、13,000rpmで １分間遠心した（溶液Ａは4gのNaOH、2.94gのクエン酸三ナトリウムおよび10gの 酢酸亜鉛を１Ｌの水に溶解して調製した）。次に各試験管の上清を捨て、ペレッ トを0.15mlの溶液Ｂ（6Ｎ HCl中に2.7％ w/v FeCl₃）に溶解し、0.75mlの溶液Ｃ (1Ｎ HCl中に0.2％ w/v NDPD)を添加した。内容物を完全に混合し、つぎに試験 管の蓋を閉じて室温で30分間インキュベートした。ホモシステイナーゼ反応で生 成されたH₂Sを反映する生成物メチレンブルーの濃度を分光光度計の740nmで読ん だ。結果の線形性は組換えPseudomonas putidaおよび膣トリコモナス酵素の両方 について良好であった。 類似した１組のアッセイを実施した。ここでは、システイン濃度が1から20マ イクロモルの間になるように血清を調節した。組換え産生した膣トリコモナス酵 素（配列番号10、クローンpAC2-1由来）および組換え産生した野性型Pseudomona s putida酵素に対する結果を比較すると、この実験は以下のことを示した。すな わち、両酵素がホモシステインに対して示す高い活性にもかかわらず、pAC2-1変 異型はシステインに対してはるかに低い活性を有し、そのため好ましいというこ とである。 以下の方法は、クローンpAC2-1由来の膣トリコモナス酵素および大腸菌Ｂ由来 のγ-グルタミルシステインシンテターゼの好ましい組み合わせの使用を示す。 アッセイの１例においては、密封可能なEppendorf試験管中に、10ｍＭ Ｌ-グ ルタミン酸、2ｍＭ ATP、25ｍＭ MgCl₂を含有するように1mlのインキュベーシヨ ン混合物を調製し、100ｍＭ Tris-HCl，ｐＨ8.0を用いて緩衝化し、そしてクロ ーンGSH-I His由来の組換えγ-グルタミルシステインシンテターゼ5μｇおよび 例えば約50マイクロモルのホモシステインを送達するのに十分な量の生物学的サ ンプルを該混合物に含ませた。試薬は下記のストック液から下記の順序で試験管 に加えるのが好ましいことに注意されたい： (1) 700μｌの水 (2) 100μｌの1Ｍ Tris，ｐＨ8.0 (3) ホモシステイン／システイン含有サンプル(約50μｌ)、または他の適切な 量 (4) 100μｌの100ｍＭ Ｌ-グルタミン酸 (5) 20μｌの100ｍＭ ATP (6) 10μｌの2.5Ｍ MgCl₂および (7) 10μｌの0.5mg1ml クローンGSH-I His由来組換えγ-グルタミルシステイン シンテターゼ 内容物を25℃で30分間インキュベートし、その後10μｌのホモシステイナーゼ 酵素(4.5mg/mlの膣トリコモナス酵素、配列番号10、クローンpAC2-1由来)を添加 し、バイアルを密封し、37℃で20分間さらにインキュベートした。100μｌの1Ｍ NaOHを混合しながら添加してH₂Ｓの生成を停止させ、次に300μｌの溶液Ａを混 合しながら添加し、その後試験管を13,000rpmで45秒間上記のように遠心した。 上清を全て注意深く除去した後、ペレットを150μｌの溶液Ｂに再懸濁し、750μ ｌの溶液Ｃを添加し、室温で20分間さらにインキュベートした。メチレンンブル ーの生成を可視域内で、最も好ましくは約650から750nmでモニターした。 文献はγ-グルタミルシステインシンテターゼが約45℃で至適に機能しうると 報告しているが、本発明の実施においてこの酵素は25℃で極めて良好に機能する こ とが見いだされたことをここに書き留める。 先に述べたように（実施例４参照）、生物学的サンプル中に存在するホモシス テインのかなりの画分が他の生物学的分子に結合している可能性がある。そして 、ホモシステインのこのような「保存」形態は、病理学的プロセスに寄与すると 考えられる。したがって、ホモシステイン濃度を測定する場合、濃度はこれら他 の形態をも含むことが望ましい。全ホモシステイン濃度への主要な寄与物は、(1 )ホモシステイン２量体、（2）ホモシステイン／システインヘテロ２量体、およ び(3)ホモシステインとタンパク質のコンジュゲート（ここでホモシステインは ジスルフィド結合によりタンパク質システインに結合している）を含む。本発明 の実施によれば、ジスルフィド結合還元剤の適切な使用によって、このような付 加的ホモシステイン濃度の合計が正確に測定される。全てのジスルフィド結合還 元剤がこの機能に特に適しているわけではない。なぜなら、それらはホモシステ イナーゼまたはγ-グルタミルシステインシンテターゼ中のジスルフィド結合を 還元する能力を示し、チオール交換反応に関与し、または酵素チオール基と直接 反応し、それによって酵素の活性を変更してしまうからである。このようなあま り好ましくない作用物質の１つはβ-メルカプトエタノールである。 本発明の実施に潜在的に有用なジスルフィド還元剤は、Molecular Probes Inc .，Eugene，ORより入手可能なトリス-(2-カルボキシエチル)ホスフィン(“TCEP ”)である。この還元剤は100ｍＭストック液として新鮮に調製することができる （使用に際しては試験管サンプル1ｍｌあたり10μｌの割合）。そして、好まし くはホモシステインを含有する生物学的サンプル自体に添加する直前にバイアル に分注する。当業者によってこれ以外にも適切な還元剤が認められるであろう。 事実、DTTは最も好ましい還元剤であり、アッセイ酵素に対して最小限の作用し か引き起こさないことが見いだされている。 本発明のこの態様は、ホモシステインおよびシステインを含む生物学的サンプ ル中に存在するホモシステインの量を測定する方法であって、ホモシステイナー ゼによって触媒される反応においてホモシステインより生成される生成物の濃度 を測定することを含み、該生成物は該サンプル中のシステインに対する該ホモシ ステイナーゼの反応によっても生成されうるものであり、該サンプルは他の方法 においては干渉濃度であるシステインを含む方法であって、以下の工程： （ａ）システインからγ-グルタミルシステインへの変換を可能とする基質の存 在下で該サンプルをγ-グルタミルシステインシンテターゼと共にインキ ュベートし； （ｂ）工程（ａ）で得られた混合物をホモシステイナーゼと共にインキュベート し；そして （ｃ）ホモシステイナーゼによって触媒される反応においてホモシステインおよ びシステインの両方から生成されうる生成物の濃度を測定する、 を含んでなり、ジスルフィド結合したホモシステイン分子をホモシステイナーゼ との反応に使用可能にする工程が、工程（ａ）に先立ってサンプルをトリス-(2- カルボキシエチル)ホスフィンで処理することによって実施される該方法によっ て代表される。生成物アンモニアの検出を含む代替法 先に述べたように、ホモシステイナーゼ反応のアンモニア生成物もまた生物学 的サンプル中のホモシステインを定量するのに用いることができる。しかし、シ ステイン濃度によって引き起こされる干渉（これは上記の方法により適切に処理 される）に加えて、アンモニアを検出するのであればメチオニンによる干渉が起 こりうる。この場合、ホモシステイナーゼ反応の間にメタンチオールの放出によ ってメチオニンもまた検出されうることを認識することにより、補正をおおむね 達成することができる。したがって、その濃度を測定し、次にこれを引き算すれ ばよい。生じたメタンチオールは、反応物としてN,N-ジメチル〔またはジエチル ］-p-フェニレンジアミンを用いて、メチレンブルー（その変異型を含む）の生 成によつてODを約510nmで測定することにより決定することができる。Tanakaら ，Journal of Applied Bioshemistry，2，pp.439-444，1980を参照されたい。当 技術分野で認められているように、アンモニアはグルタミン酸デヒドロゲナーゼ の使用を含むアッセイにおいても測定することが可能で、そのような方法は本発 明の実施に適合させることができる。 実施例11 硫化水素の向上した検出法 硫化水素を検出する向上した方法が開発された。この方法は上記実施例10に提 示した方法と関連している。本発明のこの態様による診断キットは下記のように 作製される。 以下の試薬／ストック液を調製する： (a) 緩衝液‐309mgのH₃BO₃（f.w.61.83）を90mlの二重蒸留水に添加し、NaOHを 用いてｐＨを7.5に調整し、次に二重蒸留水を用いて容量を合計100mlとして調製 される50ｍＭホウ酸緩衝液(ｐＨ7.5)のストック液。 (b) 還元剤‐15.4mgのDL-ジチオトレイトール(“DTT”)(Sigma，St．Louis，MO) を1mlのホウ酸緩衝液(a)に溶解し、100ｍＭ溶液を得る。 (c) 発色試薬Ｉ‐33.25mgのフェリシアン酸カリウムK₃Fe(CN)₆(Sigma)を1Ｎ HCl ，1％（w/v）Triton X-100(Sigma)を含む10mlの溶液に溶解し、第二鉄の10ｍＭ ストック液を作製する。この溶液は使用前によく混合しなければならない。 (d) 発色試薬II‐52.5mgのN,N-ジプロピル-フェニレンジアミン(“DPPDA”)（和 光純薬、日本国）を最終濃度が100ｍＭとなるまで二重蒸留水に溶解する。 (e) 組換えホモシステイナーゼ‐配列番号10によって表される酵素（大腸菌クロ ーンpAC2-1，ATCC 98549に由来する）は製品HYase^TMとしてAntiCancer Inc.,San Diego，CAより購入することができる。この酵素の分子量は172,000で、比活性 は40単位/mgである。この酵素は使用前にホウ酸緩衝液を用いて４単位/mlに希釈 し、アッセイ中は0-4℃に保持し、そして各使用ごとに新鮮なものを調製しなけ ればならない。 (f) DL- ホモシステイン‐2.7mgのDL-ホモシステイン(Sigma)を2mlのホウ酸緩衝 液に添加する(最終濃度4ｍＭ)。校正標準として毎日新鮮なものを調製し、使用 中には0-4℃に保持する。（注：一般にホモシステイナーゼはホモシステインの 天然のＬ形光学異性体のみを使用するが、D/L混合物は上記Ｌ形異性体の経済的 供給源である。有効なＬ形異性体の濃度を提供するには、当然ながら50％という 補正係数の使用を必要とする。） 代表的なアッセイプロトコールは以下の通りである。すなわち、0.1mlの血漿 を0.9mlのホウ酸緩衝液に加える。次に、10μｌの100ｍＭ DTT溶液を加え、 よく混合し、37℃で30分間インキュベートする。30μｌのHYase^TM組換えホモシ ステイナーゼ（ホウ酸緩衝液を用いて前もって４単位/mlに希釈してある）を混 合しながら添加し、37℃で１分間さらにインキュベートする。次に、200μｌの 発色試薬Ｉおよび10μｌの発色試薬IIを同時に混合しながら添加し、サンプルを 37℃で20分間インキュベートする。次に、分光光度計を用いて677nmでODを測定 することによって生成物であるメチレンブルー型の色素団を検出する。次に、構 築した校正曲線（標準としてホモシステインおよび／またはそのジスルフィド結 合した２量体、ホモシスチンを用いることができる）からＬ-ホモシステインの 血漿濃度を決定する。この代表的例を提供するにあたっては、アッセイ試薬また は試薬濃度の選択においてかなりの変動が可能であることが当然ながら明らかで ある。そのような改変は当分野の技術の範囲内であることが直ちに認められるで あろう。 実施例12 付加的方法 以下に本発明の実施に有用であると医師が考えるかもしれない方法の更なる例 およびそれらの変法を提供する。組換え細菌の増殖 各発酵作業(fermentation run)は、Master Cell Bank(MCB)由来の、組換えホ モシステイナーゼ（pAC2-1，配列番号９および10参照）を含む１バイアルの組換 え大腸菌からスタートした。10μｌのＭＣＢ由来細菌を５mlのLB培地に播き、37 ℃で400rpmで振とうしながら１晩増殖させた。培養物を6Ｌのフラスコに入れた8 00mlのLB培地に移し、37℃で400rpmで振とうしながら１晩増殖させた。この時点 でOD₆₀₀は約10であった。4000rpｍで20分間遠心して細菌を回収した。次に、細 菌を6Ｌのフラスコに入れた800mlのLB培地培養物中に移し、37℃で400rpmで振と うしながら16時間増殖させた。4000 rpmで4℃で20分間遠心することにより集菌 した。前カラム処理 組換え大腸菌の90x 800mlの培養物から得た細菌ペレットを混ぜ合せ、キャビ テーション型ホモジナイザー(Microfluidics Corp.，Newton，MA;モデルHC8000) を用いて破壊した。ホモジネートを２容量の20ｍＭリン酸カリウム(ｐＨ7. 2)(10μＭリン酸ピリドキサール、0.01％ β-メルカプトエタノールおよび20％ エタノールを含む)に懸濁した。50℃で1分間、該ホモジネートの熱処理を実施し た。1％(w/v)ポリエチレンイミン(PEI)を懸濁液に加え、20分間混合した。自動 冷却遠心機(Sorvall，Superspeed RC 2-B)を用いて4℃で12,000rpmで40分間懸濁 物を遠心して、核酸を除去した。次に上清を回収し、ポリエチレングリコール80 00(PEG 8000)と最終濃度が10-12％(w/v)となるように混合し、４℃で60分間攪拌 した。12,000rpmで40分間遠心して沈殿物（混入タンパク質を含む）を除去した 。次に、3.0Ｍ塩化ナトリウムを最終濃度が0.12Ｍとなるように上清に添加した 。この濃度は組換えホモシステイナーゼを沈殿させた。12,000rpmで40分間遠心 遠心することによりペレットを回収し、20ｍＭリン酸カリウム緩衝液(ｐＨ7.6)( 10μＭリン酸ピリドキサールおよび0.01％ β-メルカプトエタノールを含む）に 懸濁した。DEAE-Sepharose FF クロマトグラフィー 前カラム処理した酵素サンプルを、20ｍＭリン酸カリウム(ｐＨ7.2)を用いて あらかじめ平衡化したDEAE-Sepharose FFカラム(30ｘ5cm)(Pharmacia)に加えた 。カラムのローディング後、50ｍＭ塩化ナトリウム、20ｍＭリン酸カリウム(ｐ Ｈ 7.2)を含む溶液約３容量を用いて、OD₂₈₀が0.1以下に低下するまでカラムを 前洗浄した。次に、同一緩衝液中の塩化ナトリウム濃度の線勾配0.05-0.5Ｍを用 いて、90分にわたって組換えホモシステイナーゼを溶出した。フェニル-Sepharose 6 FFクロマトグラフィー 固体硫酸アンモニウム(79.3mg/ml)を最終濃度が0.6ＭとなるようにDEAE-Sepha rose FFクロマトグラフィーの活性画分に添加した。この上清をフェニル-Sephar ose 6 FFカラム(20ｘ2.6cm)に加える前に、緩衝液Ａ（20ｍＭリン酸カリウム、 ｐＨ7.6中の0.6Ｍ硫酸アンモニウムからなる）を用いてカラムを平衡化した。緩 衝液Ｂ（20ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ7.6、10μＭリン酸ピリドキサール、0.02 ％ β-メルカプトエタノールおよび5.0％エチレングリコールを含む）を用いて 線形的に硫酸アンモニウム勾配を減少させることによって結合タンパク質を溶出 した。DEAE-Sepharose FFカラム(20ｘ1.6cm)によって活性画分を濃縮した。この カラムは硫酸アンモニウムおよびポリエチレングリコールを 除去した。精製酵素を-80℃で保存した。組換えホモシステイナーゼの活性アッセイ α,γまたはα,β-脱離のケト生成物（ホモシステインに対するα-ケト酪酸） についての活性アッセイを、1.5mlのEppendorf式験管中で、１mlの50ｍＭリン酸 緩衝液(ｐＨ8.0)（これも10μＭリン酸ピリドキサールおよび20ｍＭホモシステ インを含む）を用いて37℃で10分間、酵素の量を様々に変えて実施した。0.5ml の4.5％ TCAを添加することによって反応を停止させた。得られた溶液0.05mlを 0.45mlの0.05％ 3-メチル-2-ベンゾチアゾリンオンヒドラゾン(MBTH)と混合し、 1.0Ｍ酢酸ナトリウム(ｐＨ5.2)の1.0 mlサンプルに加え、50℃で30分間インキュ ベートした。 分光光度計を用いてOD₃₃₅で反応生成物の量を測定した。ヒドラゾン生成物は 吸光係数が7.6ｘ10³l/molｘcmである。タンパク質の量はウシ血清アルブミンを 標準とするLowry Reagent Kit(Sigma)を用いて測定した。タンパク質１mgあたり の単位として比活性を計算した。ここで酵素の１単位とは、１分間に1μmolのα -ケト酪酸の形成を触媒する量と定義される。 ホモシステインおよびシステインのそれぞれγおよびβ離脱反応についての活 性アッセイを37℃で30秒間実施した。その結果生じたH₂Sを、メチレンブルー形 成を用いてOD₆₇₁で測定した。SDS-PAGE およびPAGE NOVEX Kit(NOVEX Experimental Technology，San Diego)に記載の方法にした がって電気泳動を実施した。SDS-PAGE用には12％ Tris-Gelを用いた。クーマシ ーブリリアントブルーで染色した後、分子量標準(NOVEX mark 12 Wide Range Pr otein Standard)を用いてタンパク質バンドの強度を推定した。分子量標準は以 下のものを含んでいた:ミオシン、200kD;β-ガラクトシダーゼ、116.3kD;ホスホ リラーゼb，97.4kD;ウシ血清アルブミン、66.3kD;カルボニックアンヒドラーゼ 、31.0kD;トリプシンインヒビター、21.5kD;リゾチーム、14.4kD;アプロチニン 、6.0kD。組換えホモシステイナーゼ活性を検出するため、未変性ゲルを3.3ｍＭ DL-ホモシステイン、0.33ｍＭ酢酸鉛、28.4ｍＭ β-メルカプトエタノールおよ び100ｍＭ Tris-HCl緩衝液(ｐＨ7.5)を含 む反応混合物中に浸漬することによって染色した。ホモシステイナーゼ活性を有 するバンドはホモシステインをα-ケト酪酸、アンモニアおよびH₂Sに変換する。 硫化水素は酢酸鉛と反応して暗褐色の沈殿物(Pb₂S)を形成する。次にクーマシー ブルーを用いてタンパク質についてゲルを染色した。 本開示をさらにサポートするものとして、確認された生存力を有する生物学的 物質を1997年9月26日にブダペスト条約に基づいてAmerican Type Culture Colle ction，Rockville，MD，USAに寄託した。この物質は大腸菌BL21(DE3)、クローン pAC2-1として同定され、ATCC番号98549を与えられた。本特許が許可されたなら ば、公衆の本物質の利用可能性に関する全ての制限は不可逆的に除かれるであろ う。本発明についてのさらなる説明(“Additional Statements of the Invention ”) これまで述べてきた本発明の詳細な説明を理解したならば、当業者は下記の説 明が本発明のさらなる例であることを認めるであろう。 １．ホモシステインおよびシステインを含む生物学的サンプル中に存在するホモ システインの量を測定する方法であって、ホモシステインおよびシステインか ら硫化水素を生成することができる酵素調製物に該サンプルを接触させ、そし てホモシステインから生成された硫化水素の量を測定することによって該サン プル中に存在するホモシステインの量を決定することを含んでなる該方法。 ２．該生物学的サンプルが他の分子と共有結合したホモシステイン分子を含み、 かつ該方法が硫化水素の測定に先立って該ホモシステイン分子をそこから解離 させる工程をさらに含む、上記１に記載の方法。 ３．該生物学的サンプルがタンパク質のアミノ酸Ｒ基と結合したホモシステイン 分子を含む、上記２に記載の方法。 ４．該生物学的サンプルがタンパク質システイン残基、遊離のシステイン分子ま たは他のホモシステイン分子とジスルフィド結合したホモシステイン分子を含 む、上記２に記載の方法。 ５．硫化水素がシステインおよびホモシステインの両方から生成され、そして該 方法が以下の初期工程： （ａ）該生物学的サンプルを、ホモシステインを該酵素調製物から保護する試 薬と接触させ； （ｂ）該酵素調製物に該サンプル中のシステインから硫化水素を生成させ； （ｃ）該硫化水素を除去し；そして （ｄ）該ホモシステインを脱保護し、そしてさらなる量の酵素調製物を添加し てそこから硫化水素を生成させる、 ことをさらに含むことによってホモシステインより生成された硫化水素がシス テインより生成された硫化水素から区別される、上記１に記載の方法。 ６．ホモシステインが酸処理によるラクトン形への変換によって保護され、次に 臭化物または穏やかな塩基を用いて脱保護される、上記５に記載の方法。 ７．以下の初期工程をさらに含んでなる、上記１に記載の方法： （ａ）該生物学的サンプル中に存在するホモシステインを、該ホモシステイン を単離可能な化合物に変換することができるさらなる酵素調製物と接触 させ； （ｂ）該化合物を単離し； （ｃ）該化合物を該化合物が変換されてホモシステインに戻る条件下で酵素調 整物または他の試薬と接触させ；そして （ｄ）そのようにして生じたホモシステインを、そこから硫化水素を生成する ことができる該酵素調製物と接触させる。 ８．以下の工程を含む、上記７に記載の方法： （ａ）該生物学的サンプル中に存在するホモシステインを、ホモシステインが Ｓ-アデノシルホモシステインに変換される条件下で、それ自体がＳ-ア デノシルホモシステインヒドロラーゼを含むさらなる酵素調製物と接触 させ； （ｂ）該Ｓ-アデノシルホモシステインを単離し； （ｃ）該Ｓ-アデノシルホモシステインを、Ｓ-アデノシルホモシステインが変 換されてホモシステインに戻る条件下で、さらなる量のＳ-アデノシル ホモシステインヒドロラーゼと接触させ；そして （ｄ）そのようにして生じたホモシステインをそこから硫化水素を生成するこ とができる該酵素調製物と接触させる。 ９．システインを該酵素調製物に対して非反応性にする作用物質を用いて該生物 学的サンプルが前処理される、上記１に記載の方法。 10．該作用物質がシステインtRNAシンテターゼである、上記９に記載の方法。 11．該酵素調製物が原核細胞起源のホモシステイナーゼを含む、上記１に記載の 方法。 12．該ホモシステイナーゼがPseudomonas putidaに由来する、上記11に記載の方 法。 13．該酵素調製物が真核細胞起源のホモシステイナーゼを含む、上記１に記載の 方法。 14．該ホモシステイナーゼが膣トリコモナス(Trichomonas vaginalis)に由来す る、上記13に記載の方法。 15．該生物学的液体が尿、組織液、血液、血清および血漿からなる群より選択さ れる、上記１に記載の方法。 16．ホモシステインおよびシステインを含む生物学的サンプル中に存在するホモ システインの量を測定する方法であって、以下の工程： （Ａ）該サンプルを部分１および部分２の２つに分割し； （Ｂ）部分１を、ホモシステインをホモシステイナーゼの基質ではない物質に 変換できる第１酵素調製物と接触させ、ここで該第１酵素調製物はシス テインを基質として認識せず； （Ｃ）部分１および部分２を、ホモシステインおよびシステインの両方から硫 化水素を生成することができるホモシステイナーゼを含む第２酵素調製 物とそれぞれ独立して接触させ； （Ｄ）部分１および部分２において生成された硫化水素の量を測定し；そして （Ｅ）部分２の硫化水素測定値から部分１の硫化水素測定値を引き算し、結果 を２倍することにより該生物学的サンプル中のホモシステインの量を計 算する、 ことを含んでなる該方法。 17．該第１酵素調製物がＳ-アデノシルホモシステインヒドロラーゼを含み、そ してホモシステインがＳ-アデノシルホモシステインに変換される、上記16に 記載の方法。 18．生物学的サンプル中に存在するホモシステインの量を測定する方法であって 、該サンプルをホモシステインからの検出可能量の硫化水素の生成を触媒する ことができる酵素調製物と接触させる工程を含み、かつ該サンプルが該測定に 干渉する検出可能量の硫化水素を生成しうる量のシステインをさらに含む該方 法において、ホモシステインに由来する硫化水素の独立した検出を可能とする １以上の付加的工程を含むことからなる改良。 19．以下のものを含んでなる、生物学的サンプル中のホモシステインの量を測定 するための診断キット： （ａ）膣トリコモナス、Pseudomonas ovalisまたはPseudomonas putidaホモシ ステイナーゼ；および （ｂ）ホモシステイナーゼ反応において形成される硫化水素の量を測定するの に用いうる少なくとも１つの試薬。 20．ホモシステインがそこに共有結合しているかもしれない他の分子からホモシ ステインを解離するのに有用なさらなる試薬を含む、上記19に記載のキット。 21．ホモシステインを該ホモシステイナーゼと非反応性の形に変換するのに有用 なさらなる試薬を含む、上記19に記載のキット。 22．ホモシステインをホモシステイナーゼと反応させるのに先立ってホモシステ インを該生物学的サンプルから単離するのに有用なさらなる試薬を含む、上記 19に記載のキツト。 23．システインを該ホモシステイナーゼと非反応性の形に変換するのに有用なさ らなる試薬を含む、上記19に記載のキット。 24．ホモシステインおよびシステインを含む生物学的サンプル中に存在するホモ システインの量を測定する方法であって、以下の工程： （ａ）該サンプルを、ホモシステインから硫化水素およびα-ケト酪酸を生成 することができ、さらにシステインから硫化水素およびピルベート(pyr uvate)を生成することができる酵素調製物と接触させ；そして （ｂ）該サンプルまたはその複製物もしくは一部分を、該サンプルまたはその 複製物もしくは一部分中のピルベートの量を測定できる作用を有する酵 素調製物と接触させ；そして次に （ｃ）そのようにして測定されたピルベートの量を該サンプル中で生成された 硫化水素の量と比較することによって該サンプル中のホモシステインの 量を計算する、 ことを含んでなる該方法。 25．該サンプル中のピルベートを測定することができる該酵素調製物が乳酸デヒ ドロゲナーゼを含む、上記24に記載の方法。 26．該生物学的サンプルがタンパク質のアミノ酸Ｒ基に結合したホモシステイン 分子を含み、そして該方法がまず第１に該結合したホモシステイン分子を該方 法での検出に使用可能にする工程をさらに含む、上記25に記載の方法。 27．該生物学的サンプルがタンパク質システイン残基、遊離のシステイン分子ま たは他のホモシステイン分子にジスルフィド結合したホモシステイン分子を含 み、そして該方法がまず第１に該結合したホモシステイン分子を該方法におけ る検出に使用可能にする工程をさらに含む、上記25に記載の方法。 28．ホモシステインおよびシステインを含む生物学的サンプル中に存在するホモ システインの量を測定する方法であって、以下の工程： （ａ）該サンプルを部分１および部分２の２つに分割し； （ｂ）部分１を、ホモシステインをホモシステイナーゼの基質ではない物質に 変換できる第１酵素調製物と接触させ、ここで該第１酵素調製物はシス テインを基質として認識せず、また該調製物はＳ-アデノシルホモシス テインヒドロリアーゼまたはシスタチオニンβ-シンターゼからなる群 より選択される酵素をさらに含み； （ｃ）部分１および部分２を、ホモシステインおよびシステインの両方から硫 化水素を生成することができるホモシステイナーゼを含む第２酵素調製 物とそれぞれ独立して接触させ； （ｄ）部分１および部分２において生成された硫化水素の量を測定し；そして （ｅ）部分２の硫化水素測定値から部分１の硫化水素測定値を引き算し、結果 を２倍することにより該生物学的サンプル中のホモシステインの量を計 算する、 ことを含んでなる該方法。 29．該ホモシステイナーゼが （ａ）Pseudomonas putida、もしくは （ｂ）膣トリコモナスに由来する、または （ｃ）Pseudomonas putidaおよび膣トリコモナスの両方に由来するヌクレオチ ド配列を含むポリヌクレオチドをコードするキメラ遺伝子の発現によっ て産生されるキメラ酵素である、 上記24に記載の方法。 30．該ホモシステイナーゼが （ａ）Pseudomonas putida、もしくは （ｂ）膣トリコモナスに由来する、または （ｃ）Pseudomonas putidaおよび膣トリコモナスの両方に由来するヌクレオチ ド配列を含むポリヌクレオチドをコードするキメラ遺伝子の発現によっ て産生されるキメラ酵素である、 上記28に記載の方法。 31．該生物学的液体が尿、組織液、血液、血清および血漿からなる群より選択さ れる、上記24に記載の方法。 32．該生物学的液体が尿、組織液、血液、血清および血漿からなる群より選択さ れる、上記28に記載の方法。 33．以下のものを含んでなる、生物学的サンプル中のホモシステインの量を測定 するための診断キツト： （ａ）膣トリコモナスもしくはPseudomonas putidaホモシステイナーゼ、また はPseudomonas putidaおよび膣トリコモナスの両方に由来するヌクレオ チド配列を含むポリヌクレオチドをコードするキメラ遺伝子の発現によ って産生されるキメラ酵素； （ｂ）ホモシステイナーゼ反応において形成される硫化水素の量を測定するの に用いうる少なくとも１つの試薬；および （ｃ）ホモシステイナーゼ反応において該サンプル中に存在するシステインか ら形成されるピルベートの量を測定するのに用いうる少なくとも１つの 試薬。 34．以下のものを含んでなる、生物学的サンプル中のホモシステインの量を測定 するための診断キツト： （ａ）膣トリコモナスもしくはPseudomonas putidaホモシステイナーゼ、また はPseudomonas putidaおよび膣トリコモナスの両方に由来するヌクレオ チド配列を含むポリヌクレオチドをコードするキメラ遺伝子の発現によ って産生されるキメラ酵素； （ｂ）ホモシステイナーゼ反応において形成される硫化水素の量を測定するの に用いうる少なくとも１つの試薬；および （ｃ）シスタチオニンβ-シンターゼ。 35．Pseudomonas putidaホモシステイナーゼのアミノ酸配列および膣トリコモナ スホモシステイナーゼのアミノ酸配列をコードするキメラヌクレオチド配列を 含む精製され、単離されたDNA分子であって、ホモシステイナーゼ活性を有す る機能性タンパク質がそこから発現されうる該DNA分子。 36．Pseudomonas putidaホモシステイナーゼをコードするヌクレオチド配列を含 む上記35に記載のDNA分子であって、該酵素の１以上のアミノ酸をコードする 該配列の１以上のサブ配列が膣トリコモナスホモシステイナーゼの対応するア ミノ酸をコードする１以上のヌクレオチドサブ配列によって対応的に置換され ている該DNA分子。 37．該膣トリコモナスホモシステイナーゼがmgI1遺伝子またはmgI2遺伝子によ ってコードされる膣トリコモナスホモシステイナーゼである、上記36に記載の DNA分子。 38．該膣トリコモナスホモシステイナーゼがmgI2遺伝子によってコードされる 膣トリコモナスホモシステイナーゼである、上記37に記載のDNA分子。 39．Pseudomonas putidaホモシステイナーゼをコードする配列を含む上記38に記 載のDNA分子であって、それぞれ該酵素の１以上のアミノ酸をコードしている 該配列の１以上のサブ配列が、それぞれ該膣トリコモナスホモシステイナーゼ の対応する１以上のアミノ酸をコードしている１以上のヌクレオチドサブ配列 によって対応的に置換されており、そして該アミノ酸置換が以下のものからな る群より選択される該DNA分子： （ａ）膣トリコモナス由来のCys-Ser-Arg-Ala-Asp-Ile-Ile-Ala-Lys-Val-Lys -Ser（配列番号１）またはその任意のサブセットによる、Pseudomonas putida由来のVal-Gly-Ser-Gln-Ala-Leu-Val-Asp-Arg-Ile-Arg-Leu（ 配列番号２）またはその任意のサブセットの置換； （ｂ）膣トリコモナス由来のAsp-Val-Asp（配列番号３）またはその任意のサ ブセットによる、Pseudomonas putida由来のGlu-Leu-Lvs（配列番号 ４）またはその任意のサブセットの置換； （ｃ）膣トリコモナス由来のCys-His-Val-Val（配列番号５）またはその任意 のサブセツトによる、Pseudomonas putida由来のAla-Leu-Gln-Leu（配 列番号６）またはその任意のサブセットの置換； （ｄ）膣トリコモナス由来のCys-Glu-Asn-Val-Gln-Asp.Ile-Ile-Asp-Asp（配 列番号７）またはその任意のサブセットによる、Pseudomonas putida由 来のGly-Leu-Glu-Asp-Ile-Asp-Asp-Leu-Leu-Ala（配列番号８）または その任意のサブセットの置換； （ｅ）上記のグループ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）によってもたらさ れる置換のうち１つ、２つ、３つまたは４つを含む任意の組み合わせ； および （ｆ）ヌクレオチド配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）に相補 的なヌクレオチド配列。 40．以下のものを含んでなる、生物学的サンプル中のホモシステインの量を測定 するための診断キット： （ａ）上記35に記載のホモシステイナーゼ；および （ｂ）ホモシステイナーゼ反応において形成される硫化水素の量を測定するの に用いうる少なくとも１つの試薬。 41．以下のものを含んでなる、生物学的サンプル中のホモシステインの量を測定 するための診断キット： （ａ）上記39に記載のホモシステイナーゼ；および （ｂ）ホモシステイナーゼ反応において形成される硫化水素の量を測定するの に用いうる少なくとも１つの試薬。 42．該キメラホモシステイナーゼをコードするDNA配列が発現制御配列に機能し うる形で連結されている、上記39に記載の組換えDNA分子。 43．上記42に記載の組換えDNA分子を含むように改変された宿主細胞。 44．患者の生物学的液体中のホモシステイン濃度を測定する方法であって、該サ ンプル中における該ホモシステイン濃度の測定を可能とする該サンプル中の硫 化水素およびピルベートの測定の両者が単一のキュベット中で実施される条件 下での、上記33に記載の診断キットの使用を含む該方法。 45．被験者の組織液、尿、血液、血清または血漿サンプル中に存在するホモシス テインの濃度が単一の酵素アッセイで測定できるほどシステインまたはメチオ ニンに対して十分に非反応性であるホモシステイナーゼ酵素であって、該酵素 アッセイにおいては該サンプル中のホモシステインに対する該ホモシステイナ ーゼの反応から生じた１以上の生成物が測定され、そして該測定が該サンプル 中のシステインまたはメチオニンの濃度によって実質的に影響を受けない、該 ホモシステイナーゼ酵素。 46．膣トリコモナスのホモシステイナーゼのアミノ酸配列を実質的に模倣した(p atterned on)、上記45に記載のホモシステイナーゼ酵素。 47．mgI1遺伝子（配列番号11）によってコードされる膣トリコモナス酵素を模倣 した、上記46に記載のホモシステイナーゼ。 48．mgI2遺伝子によってコードされる膣トリコモナス酵素を模倣した、上記46に 記載のホモシステイナーゼ。 49．配列番号10またはその残基Met¹からLeu³⁹⁶に対応するアミノ酸配列を有する 、上記46に記載のホモシステイナーゼ。 50．以下のものからなる群より選択される、配列番号10の１以上のペプチド配列 を含むホモシステイナーゼ： （ａ）Gly-Gly-Asn-Arg-Leu-Ala-Gly-Gln-Glu; （ｂ）Leuを含む（ａ）のサブセット； （ｃ）Arg-Val-Cys-Lys-Glu-Ala-His-Ser-Gln(配列番号10、残基168-176)； （ｄ）Gluを含む（ｃ）のサブセット； （ｅ）Gln-Met-Arg-Met-Tyr-Gly-Ser-Met-Ile(配列番号10、残基304-312)； および （ｆ）Tyrを含む（ｅ）のサブセット。 51．Pseudomonas、Clostridium、AeromonasまたはTrichomonas由来のホモシステ イナーゼを模倣した、上記45に記載のホモシステイナーゼ。 52．Pseudomonas、Clostridium、AeromonasまたはTrichomonasに由来する上記45 に記載のホモシステイナーゼであって、その１以上のペプチド配列が以下 のものからなる群より選択される配列番号10の１以上のペプチド配列によって 対応的に置換されている該ホモシステイナーゼ： （ａ）Gly-Gly-Asn-Arg-Leu-Ala-Gly-Gln-Glu(配列番号10、残基43-51); （ｂ）Leuを含む（ａ）のサブセット； （ｃ）Arg-Val-Cys-Lys-Glu-Ala-His-Ser-Gln(配列番号10、残基168-176); （ｄ）Gluを含む（ｃ）のサブセット； （ｅ）Gln-Met-Arg-Met-Tyr-Gly-Ser-Met-Ile(配列番号10、残基304-312); および （ｆ）Tyrを含む（ｅ）のサブセット。 53．Trichomonasホモシステイナーゼを模倣したキメラホモシステイナーゼであ って、配列番号10のLeu⁴⁷、Glu¹⁷²およびTyr³⁰⁸に対応するその１以上のアミ ノ酸がそれらによって対応的に置換されている該キメラホモシステイナーゼ。 54．置換変異体、付加変異体、欠失変異体、または配列番号10もしくはその残基 Met¹からLeu³⁹⁶の誘導体であるホモシステイナーゼであって、該変異体または 誘導体が以下の特性の片方または両方を有する該ホモシステイナーゼ： （ａ）実施例８のアッセイにおいて、ホモシステインに対する配列番号10の活 性の少なくとも約25％；および／または （ｂ）実施例８のアッセイにおいて、システインに対する配列番号10の活性の 約500％以下。 55．(a) 被験者の組織液、尿、血液、血清または血漿サンプル中に存在するホモ システインの濃度が単一の酵素アッセイで測定できるほどシステインまたはメ チオニンに対して十分に非反応性であって、該酵素アッセイにおいては該サン プル中のホモシステインに対する該ホモシステイナーゼの反応から生じた１以 上の生成物が測定され、該測定は該サンプル中のシステインまたはメチオニン の濃度によって実質的に影響を受けず；そして （ｂ）配列番号12を模倣しているが、そのPhe⁴⁷、Asp¹⁷²およびSer³⁰⁸のうち １以上が欠失している、または以下の方式： (1) Phe⁴⁷をLeu、Ile、Val、Ala、Gly、MetおよびTrpで置換； (2) Asp¹⁷²をGlu、GlnまたはAsnで置換； (3) Ser³⁰⁸をTry、Phe、Met、Trp、Gln、ThrまたはAsnで置換； により置換されている、 上記45に記載のホモシステイナーゼ酵素。 56．ホモシステインに対する比活性がシステインおよびメチオニンに対する比活 性よりも少なくとも約100倍大きい、上記45に記載のホモシステイナーゼ。 57．上記45に記載のホモシステイナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む精 製され、単離されたDNA分子であって、該コード配列が宿主細胞において発現 を引き出すことができる制御配列に機能しうる形で連結されている、該DNA分 子。 58．上記57に記載のDNA分子を含む宿主細胞。 59．配列番号10またはその残基Met¹からLeu³⁹⁶によって表されるホモシステイナ ーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、上記57に記載の精製され、単離さ れたDNA分子。 60．配列番号９もしくは配列番号９のヌクレオチド39から1226までの断片、また はそれらの相補体であるヌクレオチド配列を含む、上記59に記載のDNA分子。 61．配列番号９またはホモシステイナーゼをコードするその断片に対応するRNA 分子。 62．ホモシステインおよびシステインを含む生物学的サンプル中に存在するホモ システインの量を測定する方法であって、ホモシステイナーゼによって触媒さ れる反応においてホモシステインより生成される生成物の濃度を測定すること を含み、該生成物は該サンプル中のシステインに対する該酵素の反応によって も生成されうるものであり、該サンプルは他の方法においては干渉濃度である システインを含み、そして該方法は該サンプル中のホモシステイン濃度が単一 の酵素アッセイで測定しうるほどシステインに対して十分に非反応性な形で該 酵素を提供する工程を含む、該方法。 63．該生物学的サンプルがヒト被験者の組織液、尿、血液、血清または血漿であ る、上記62に記載の方法。 64．該生物学的サンプルがタンパク質のアミノ酸Ｒ基と結合したホモシステイン 分子を含み、そして該方法がまず第１に該結合したホモシステイン分子を該方 法における検出に使用可能にする工程をさらに含む、上記63に記載の方法。 65．該生物学的サンプルがタンパク質のシステイン残基、遊離のシステイン分子 または他のホモシステイン分子とジスルフィド結合したホモシステイン分子を 含み、そして該方法がまず第１に該結合したホモシステイン分子を該方法にお ける検出に使用可能にする工程をさらに含む、上記63に記載の方法。 66．ホモシステインおよびメチオニンを含む生物学的サンプル中に存在するホモ システインの量を測定する方法であって、ホモシステイナーゼによって触媒さ れる反応においてホモシステインより生成される生成物の濃度を測定すること を含み、該生成物は該サンプル中のメチオニンに対する該酵素の反応によって も生成されうるものであり、該サンプルは他の方法においては干渉濃度である メチオニンを含み、そして該方法は該サンプル中のホモシステイン濃度が単一 の酵素アッセイで測定しうるほどメチオニンに対して十分に非反応性な形で該 酵素を提供する工程を含む、該方法。 67．該生物学的サンプルがヒト被験者の組織液、尿、血液、血清または血漿であ る、上記65に記載の方法。 68．以下のものを含んでなる、生物学的サンプル中のホモシステインの量を測定 するための診断キット： （ａ）上記45に記載のホモシステイナーゼ；および （ｂ）ホモシステイナーゼ反応において形成される生成物の量を測定するのに 用いうる少なくとも１つの試薬。 69.（ｂ）の試薬がホモシステイナーゼ反応において形成される硫化水素の量を 測定するのに使用される、上記68に記載の診断キット。 70．ホモシステイナーゼタンパク質の正常なMet¹のＮ末端側に位置する１以上の ヒスチジン残基を含む改変されたホモシステイナーゼ酵素であって、該酸素は 被験者の組織液、尿、血液、血清または血清サンプル中のホモステイン濃度が 、該サンプル中のホモシステイン中のホモステインに対する該変ホモシステイ ナーゼの反応から生じる１以上の生成物を測定する単一の酵素アッセイで測定 しうるほどシステインまたはメチオニンに対して十分非反応 性であり、該測定は該サンプル中のシステインまたはメチオニンの濃度によっ て実質的に影響されない、該酵素。 71．ホモシステイナーゼタンパク質の正常なMet¹のＮ末端側に位置する約６個の ヒスチジン残基を含む、上記70に記載の改変されたホモシステイナーゼ酵素 。 72．上記70に記載のホモシステイナーゼ酵素をコードするDNA分子。 73．ホモシステインおよびシステインを含む生物学的サンプル中に存在するホモ システインの量を測定する方法であって、ホモシステイナーゼによって触媒さ れる反応においてホモシステインより生成される生成物の濃度を測定すること を含み、該生成物は該サンプル中のシステインに対する該ホモシステイナーゼ の反応によっても生成されうるものであり、該サンプルは他の方法においては 干渉濃度であるシステインを含み、そして該方法は以下の工程： （ａ）システインからγ-グルタミルシステインへの変換を可能とする基質の 存在下で該サンプルをγ-グルタミルシステインシンテターゼと共にイ ンキュベートし； （ｂ）工程（ａ）で得られた混合物をホモシステイナーゼと共にインキュベー トし；そして （ｃ）該ホモシステイナーゼによって触媒される反応においてホモシステイン およびシステインの両方から生成されうる生成物の濃度を測定する、 を含む、該方法。 74．測定される生成物が硫化水素またはアンモニアである、上記73に記載の方法 。 75．該ホモシステイナーゼが膣トリコモナスに由来する、上記73に記載の方法。 76．該ホモシステイナーゼがmgI1遺伝子（配列番号11）によってコードされる膣 トリコモナス酵素である、上記75に記載の方法。 77．該ホモシステイナーゼがmgI2遺伝子によってコードされる膣トリコモナス酵 素である、上記75に記載の方法。 78．該ホモシステイナーゼが配列番号10またはその残基Met¹からLeu³⁹⁶に対応す るアミノ酸配列を有する、上記75に記載の方法。 79．該ホモシステイナーゼがPseudomonas putidaに由来する、上記73に記載の方 法。 80．該生物学的サンプルが組織液、尿、血液、血清または血漿からなる群より選 択される、上記73に記載の方法。 81．該ホモシステイナーゼがPseudomonas、Clostridium、AeromonasまたはTric homonasに由来する、上記73に記載の方法。 82．該生物学的サンプルがタンパク質システイン残基、遊離のシステイン分子ま たは他のホモシステイン分子とジスルフィド結合したホモシステイン分子を含 み、そして該方法がまず第１に該結合したホモシステイン分子をホモシステイ ナーゼとの反応に使用可能にする工程をさらに含む、上記73に記載の方法。 83．ジスルフィド結合したホモシステイン分子をホモシステイナーゼとの反応に 使用可能にする該工程が工程（ａ）に先立つ時点で該サンプルをトリス-(2-カ ルボキシエチル）ホスフィンで処理することによって実施される、上記82に記 載の方法。 84．該γ-グルタミルシステインシンテターゼが大腸菌(E．coli)に由来する、 上記73に記載の方法。 85．硫化水素の検出が、第二鉄および該硫化水素によるＮ,Ｎ-ジアルキル-p-フ ェニレンジアミンの酸化により生成されるメチレンブルー型発色団の比色分析 的検出によって実施される、上記74に記載の方法。 86．該Ｎ,Ｎ-ジアルキル-p-フェニレンジアミンがＮ,Ｎ-ジメチル、Ｎ,Ｎ-ジエ チル、Ｎ,Ｎ-ジ-n-プロピルまたはＮ,Ｎ-ジ-n-ブチルである、上記85に記載の 方法。 87．以下のものを含んでなる、生物学的サンプル中のホモシステインの量を測定 するための診断キット： （ａ）γ-グルタミルシステインシンテターゼ； （ｂ）ホモシステイナーゼ；および （ｃ）ホモシステイナーゼの該サンプルとの反応によって形成される硫化水素 またはアンモニアの量を測定するのに用いうる少なくとも１つの試薬。 88．（ｃ）の試薬が硫化水素またはアンモニアを測定するのに使用される、上記 87に記載のキット。 89．ホモシステインおよびシステインを含む生物学的サンプル中に存在するホモ システインの量を測定する方法であって、ホモシステイナーゼによって触媒さ れる反応においてホモシステインより生成される生成化合物の濃度を測定する ことを含み、該生成化合物は該サンプル中のシステインに対する該ホモシステ イナーゼの反応によっても生成されうるものであり、該サンプルは他の方法に おいては干渉濃度であるシステインを含み、そして該方法は以下の工程： （ａ）適切な環境においてシステインをホモシステイナーゼの基質ではない化 合物に変換することができる酵素と共に該サンプルをインキュベートし； （ｂ）１以上の生成化合物を生じさせるために工程（ａ）で得られた混合物を ホモシステイナーゼと共にインキュベートし；そして （ｃ）該生成化合物の濃度を測定することによって該サンプル中のホモシステ インの量を測定する、 ことを含む、該方法。 90．該生成化合物が硫化水素またはアンモニアである、上記89に記載の方法。 91．工程（ａ）で用いられる酵素がγ-グルタミルシステインシンテターゼ、シ ステインオキシダーゼ、シスタチオニンβ-シンテターゼまたはシステインtRN Aシンテターゼである、上記89に記載の方法。 92．該生物学的サンプルがメチオニンを含む、上記73に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/14 Ｃ１２Ｒ 1:19） (31)優先権主張番号 ０８／９４１，９２１ (32)優先日 平成９年10月１日(1997．10．1) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／９７４，６０９ (32)優先日 平成９年11月19日(1997．11．19) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０９／０６１，３３７ (32)優先日 平成10年４月17日(1998．4．17) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ペリー，アンドリュー，ダブリュ. アメリカ合衆国 92003 カリフォルニア 州，ボンサール，ヴィア デ ラ レイナ 6423番地 (72)発明者 ホフマン，ロバート，エム. アメリカ合衆国 92037 カリフォルニア 州，ラホヤ，ソルダッド マウンテン ロ ード 5543番地

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1. ホモシステイン及びシステインを含む生物学的サンプル中に存在するホモ システインの量を測定するための方法であって、ホモシステイナーゼにより 触媒される反応においてホモシステインから生成される生成物化合物の濃度 を測定することを含み、該生成物化合物は前記サンプル中のシステインに対 する前記ホモシステイナーゼの反応によっても生成され得るものであり、 前記サンプルはそうしなければシステインの阻害濃度を含むものであり、 (a) 前記サンプルを、システインをホモシステイナーゼの基質ではない化合 物に変換することができる第1の酵素とともにそれに適した環境中でインキ ュベートし、 (b) 段階(a)からの混合物をホモシステイナーゼとインキュベートして生成 物化合物を生成し、 (c) 前記生成物化合物の濃度を測定することによって前記サンプル中のホモ システインの量を決定する、 段階を含む前記方法。 2. その下位段階(a)において使用される酵素が、γ-グルタミルシステインシ ンセターゼ、システインオキシダーゼ、シスタチオニンβ-シンセターゼ、 及びシステインtRNAシンセターゼからなる群から選択される請求項1に記載 の方法。 3. 生物学的サンプルがメチオニンを含む請求項1に記載の方法。 4. 生物学的サンプルが尿、組織液、血液、血清、及び血漿からなる群から選 択される請求項1に記載の方法。 5. ホモシステイナーゼ酵素が原核または真核微生物から得られる請求項1に 記載の方法。 6. ホモシステイナーゼが、Clostridium sp、Aeromonas sp.、Pseudomonas putidaまたはTrichomonas vaginalisからのものである請求項5に記載の方法 。 7. 段階(b)において使用されるホモシステイナーゼが、 (a) mgl1遺伝子(配列番号11)によりコードされるTrichomonas vaginalis酵 素、 (b) mgl2遺伝子によりコードされるTrichomonas vaginalis酵素、 (c) 配列番号10、またはそのMet¹からLeu³⁹⁶までの残基、 (d) 配列番号12を模倣するポリペプチドであって、そのPhe⁴⁷、Asp¹⁷²、及 びSer³⁰⁸の1以上が欠失されるか、あるいは (1) Phe⁴⁷を、Leu、Ile、Val、Ala、Gly、Met及びTrpで置換すること、 (2) Asp¹⁷²を、Glu、Gln、またはAsnで置換すること、 (3) Ser³⁰⁸を、Tyr、Phe、Met、Trp、Gln、Thr、またはAsnで置換するこ と、 に従って置換されているもの、 (e) Pseudomonas、Clostridium、AeromonasまたはTrichomonasからの酵素を 模倣するホモシステイナーゼであって、その当初のポリペプチド配列の1以 上のペプチド部分配列が、 (1) Gly-Gly-Asn-Arg-Leu-Ala-Gly-Gln-Glu(配列番号10の残基43〜51を参 照)、 (2) Leuを含む(1)のサブセット、 (3) Arg-Val-Cys-Lys-Glu-Ala-His-Ser-Gln(配列番号10の残基168〜176を 参照)、 (4) Gluを含む(3)のサブセット、 (5) Gln-Met-Arg-Met-Tyr-Gly-Ser-Met-Ile(配列番号10の残基304〜312を 参照)、及び (6) Tyrを含む(5)のサブセット、 からなる群から選択される配列番号10の1以上の相同ペプチド配列により対 応するように置換されているもの、 (f) Pseudomonas putidaホモシステイナーゼであって、その1以上のペプチ ド配列が、Trichomonas vaginalisホモシステイナーゼの1以上ペプチド配列 によって対応するように置換されており、得られるアミノ酸置換が、 (1) Pseudomonas putidaからのVal-Gly-Ser-Gln-Ala-Leu-Val-Asp-Arg-IIe-Ar g-Leu(配列番号2)またはその任意のサブセットに置換するTrichomonas vaginali s(T2)からのCys-Ser-Arg-Ala-Asp-Ile-Ile-Ala-Lys-Val-Lys-Ser(配列番号1)ま たはその任意のサブセット、 (2) Pseudomonas putidaからのGlu-Leu-Lys(配列番号4)またはその任意のサブ セットを置換するTrichomonas vaginalis(T2)からのAsp-Val-Asp(配列番号3)ま たはその任意のサブセット、 (3) Pseudomonas putidaからのAla-Leu-Gln-Leu(配列番号6)またはその任意の サブセットを置換するTrichomonas vaginalis(T2)からのCys-His-Val-Val(配列 番号5)またはその任意のサブセット、 (4) Pseudomonas putidaからのGly-Leu-Glu-Asp-Ile-Asp-Asp-Leu-Leu-Ala(配 列番号8)またはその任意のサブセットを置換するTrichomonas vaginalis(T2)か らのCys-Glu-Asn-Val-Gln-Asp-Ile-Ile-Asp-Asp(配列番号7)またはその任意のサ ブセット、及び (5) 上記の群(1)、(2)、(3)、及び(4)により与えられる置換の1、2、3または4 の任意の組合せ、 からなる群から選択されるもの、 (g) 配列番号10の置換変異体、付加変異体、欠失変異体もしくは誘導体、または その残基Met¹からLeu³⁹⁶であって、それらの変異体または誘導体が下記の特性、 (1) 適当なアッセイにおいてホモシステインに対する配列番号10の活性の少な くとも約25％の活性、及び／または (2) 適当なアッセイにおいてシステインに対する配列番号10の活性の約500%未 満の活性、 のいずれかまたは両方を有するもの、及び (h) 上記(e)及び(f)に記載されるもの以外のPseudomonas putida及びTricho monas vaginalisの両方から得られるホモシステイナーゼコードヌクレオチ ド配列を含むキメラポリヌクレオチドの発現によって生成されたキメラホモ システイナーゼ酵素、 からなる群から選択される請求項1に記載の方法。 8. ホモシステイン及びシステインを含む生物学的サンプル中に存在するホモ システインの量を測定するための方法であって、ホモシステイナーゼにより 触媒される反応においてホモシステインから生成される生成物化合物の濃度 を測定することを含み、該生成物化合物は前記サンプル中のシステインに対 する前記ホモシステイナーゼの反応によっても生成され得るものであり、 前記サンプルはそうしなければシステインの阻害濃度を含むものであり、 (a) 前記サンプルを、システインをホモシステイナーゼの基質ではない化合 物に変換することができる第1の酵素とそれに適した環境中でインキュベー トし、 (b) 段階(a)からの混合物をホモシステイナーゼとインキュベートして生成 物化合物を生成し、 (c) 前記生成物化合物の濃度を測定することによって前記サンプル中のホモ システインの量を決定する、 段階を含み、前記生物学的サンプルがさらに、タンパク質システイン残基、 遊離システイン分子または他のホモシステイン分子にジスルフィド結合され たホモシステイン分子を含み、前記方法がさらに、前記結合されたホモシス テイン分子を段階(b)におけるホモシステイナーゼによる反応に利用できる ようにする段階を含む前記方法。 9. ジスルフィド結合されたホモシステイン分子をホモシステイナーゼによる 反応に利用できるようにする段階を、段階(a)の前の時点で、トリス-(2-カ ルボキシエチル)ホスフィン、DL-ジチオトレイトール、β-メルカプトエタ ノールまたはその他のジスルフィド還元剤で前記サンプルを処理することに よって行う請求項8に記載の方法。 10． ホモシステイナーゼ活性を有するタンパク質をコードする配列を含む精製 され単離されたDNA分子であって、前記コード配列が、 (a) 配列番号10、またはそのMet¹からLeu³⁹⁶までの残基をコードするヌクレ オチド配列、 (b) 配列番号12を模倣するポリペプチドであって、前記ポリペプチドのPhe^{4 7}、Asp¹⁷²、及びSer³⁰⁸の1以上が削除されるか、あるいは (1) Phe⁴⁷を、Leu、Ile、Val、Ala、Gly、Met及びTrpで置換すること、 (2) Asp¹⁷²を、Glu、Gln、またはAsnで置換すること、 (3) Ser³⁰⁸を、Tyr、Phe、Met、Trp、Gln、Thr、またはAsnで置換するこ と、 に従って置換されているものをコードするヌクレオチド配列、 (c) Pseudomonas,Clostridium、AeromonasまたはTrichomonasからの酵素を 模倣するホモシステイナーゼであって、その当初のアミノ酸配列の1以上の ペプチド部分配列が、 (1) Gly-Gly-Asn-Arg-Leu-Ala-Gly-Gln-Glu(配列番号10の残基43〜51を参 照)、 (2) Leuを含む(1)のサブセット、 (3) Arg-Val-Cys-Lys-Glu-Ala-His-Ser-Gln(配列番号10の残基168〜176を 参照)、 (4) Gluを含む(3)のサブセット、 (5) Gln-Met-Arg-Met-Tyr-Gly-Ser-Met-Ile(配列番号10の残基304〜312を 参照)、及び (6) Tyrを含む(5)のサブセット、 からなる群から選択される配列番号10の1以上の相同ペプチド配列により対 応するように置換されているものをコードするヌクレオチド配列、 (d) Pseudomonas putidaホモシステイナーゼであって、前記ホモシステイナ ーゼの1以上のペプチド配列が、Trichomonas vaginalisホモシステイナー ゼの1以上のペプチド配列によって対応するように置換されており、得られるア ミノ酸置換が、 (1) Pseudomonas putidaからのVal-Gly-Ser-Gln-Ala-Leu-Val-Asp-Arg-Ile-Ar g-Leu(配列番号2)またはその任意のサブセットに置換するTrichomonas vaginali s(T2)からのCys-Ser-Arg-Ala-Asp-Ile-Ile-Ala-Lys-Val-Lys-Ser(配列番号1)ま たはその任意のサブセット、 (2) Pseudomonas putidaからのGlu-Leu-Lys(配列番号4)またはその任意のサブ セットを置換するTrichomonas vaginalis(T2)からのAsp-Val-Asp(配列番号3)ま たはその任意のサブセット、 (3) Pseudomonas putidaからのAla-Leu-Gln-Leu(配列番号6)またはその任意の サブセットを置換するTrichomonas vaginalis(T2)からのCys-His-Val-Val(配列 番号5)またはその任意のサブセット、 (4) Pseudomonas putidaからのGly-Leu-Glu-Asp-Ile-Asp-Asp-Leu-Leu-Ala(配 列番号8)またはその任意のサブセットを置換するTrichomonas vaginalis(T2)か らのCys-Glu-Asn-Val-Gln-Asp-Ile-Ile-Asp-Asp(配列番号7)またはその任意のサ ブセット、及び (5) 上記の群(1)、(2)、(3)、及び(4)により与えられる置換の1、2、3または4 の任意の組合せ、 からなる群から選択されるものをコードするヌクレオチド配列、 (e) 配列番号10の置換変異体、付加変異体、欠失変異体もしくは誘導体、または その残基Met¹からLeu³⁹⁶であって、それらの変異体または誘導体が下記の特性、 (1) 適当なアッセイにおいてホモシステインに対する配列番号10の活性の少な くとも約25%の活性、及び／または (2) 適当なアッセイにおいてシステインに対する配列番号10の活性の約500%未 満の活性、 のいずれかまたは両方を有するものをコードするヌクレオチド配列、 (f) 上記(c)及び(d)に記載されるもの以外のPseudomonas putida及びTrichomona s vaginalisSの両方から得られるホモシステイナーゼコードヌクレオチ ド配列を含むキメラポリヌクレオチドの発現によって生成されたキメラホモシス テイナーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列、 からなる群から選択される前記DNA配列。 11． コード配列が、宿主細胞においてそれからの発現を誘導することができる 調節配列に機能可能なように結合されている請求項10に記載の精製され単離 されたDNA分子。 12． 請求項11に記載のDNA分子を含む宿主細胞。 13．(a) 配列番号10、またはそのMet¹からLeu³⁹⁶までの残基 (b) 配列番号12を模倣するものであって、そのPhe⁴⁷、Asp¹⁷²、及びSer³⁰⁸ の1以上が欠失されるか、あるいは (1) Phe⁴⁷を、Leu、Ile、Val、Ala、Gly、Met及びTrpで置換すること、 (2) Asp¹⁷²を、Glu、Gln、またはAsnで置換すること、 (3) Ser³⁰⁸を、Tyr、Phe、Met、Trp、Gln、Thr、またはAsnで置換するこ と、 に従って置換されているもの、 (c) Pseudomonas、Clostridium、AeromonasまたはTrichomonasからの酵素を 模倣するホモシステイナーゼであって、その当初のポリペプチド配列の1以 上のペプチド部分配列が、 (1) Gly-Gly-Asn-Arg-Leu-Ala-Gly-Gln-Glu(配列番号10の残基43〜51を参 照)、 (2) Leuを含む(1)のサブセット、 (3) Arg-Val-Cys-Lys-Glu-Ala-His-Ser-Gln(配列番号10の残基168〜176を 参照)、 (4) Gluを含む(3)のサブセット、 (5) Gln-Met-Arg-Met-Tyr-Gly-Ser-Met-Ile(配列番号10の残基304〜312を 参照)、及び (6) Tyrを含む(5)のサブセット、 からなる群から選択される配列番号10の1以上の相同ペプチド配列により対応す るように置換されているもの、 (d) Pseudomonas putidaホモシステイナーゼであって、その1以上のペプチ ド配列が、Trichomonas vaginalisホモシステイナーゼの1以上ペプチド配列 によって対応するように置換されており、得られるアミノ酸置換が、 (1) Pseudomonas putidaからのVal-Gly-Ser-Gln-Ala-Leu-Val-Asp-Arg-Ile-Ar g-Leu(配列番号2)またはその任意のサブセットに置換するTrichomonas vaginali s(T2)からのCys-Ser-Arg-Ala-Asp-Ile-Ile-Ala-Lys-Val-Lys-Ser(配列番号1)ま たはその任意のサブセット、 (2) Pseudomonas putidaからのGlu-Leu-Lys(配列番号4)またはその任意のサブ セットを置換するTrichomonas vaginalis(T2)からのAsp-Val-Asp(配列番号3)ま たはその任意のサブセット、 (3) Pseudomonas putidaからのAla-Leu-Gln-Leu(配列番号6)またはその任意の サブセットを置換するTrichomonas vaginalis(T2)からのCys-His-Val-Val(配列 番号5)またはその任意のサブセット、 (4) Pseudomonas putidaからのGly-Leu-Glu-Asp-Ile-Asp-Asp-Leu-Leu-Ala(配 列番号8)またはその任意のサブセットを置換するTrichomonas vaginalis(T2)か らのCys-Glu-Asn-Val-Gln-Asp-Ile-Ile-Asp-Asp(配列番号7)またはその任意のサ ブセット、及び (5) 上記の群(1)、(2)、(3)、及び(4)により与えられる置換の1、2、3または4 の任意の組合せ、 からなる群から選択されるもの、 (e) 配列番号10の置換変異体、付加変異体、欠失変異体もしくは誘導体、または そのMet¹からLeu³⁹⁸までの残基であって、それらの変異体または誘導体が下記の 特性、 (1) 適当なアッセイにおいてホモシステインに対する配列番号10の活性の少な くとも約25%の活性、及び／または (2) 適当なアッセイにおいてシステインに対する配列番号10の活性の約50 0%未満の活性、 のいずれかまたは両方を有するもの、及び (f) 上記(c)及び(d)に記載されるもの以外のPseudomonas putida及びTricho monas vaginalisの両方から得られるホモシステイナーゼコードヌクレオチ ド配列を含むキメラポリヌクレオチドの発現によって生成されたキメラホモ システイナーゼ酵素、 であるホモシステイナーゼ酵素。 14． システインまたはメチオニンに対して十分に非反応性のホモシステイナー ゼ酵素であって、被検者の組織液、尿、血液、血清、あるいは血漿のサンプ ル中に存在するホモシステインの濃度を、前記サンプル中でのホモシステイ ンに対する前記ホモシステイナーゼの反応から生成する1種以上の生成物の 量を測定する単一酵素アッセイにより測定し得るものであり、前記測定はそ の中におけるシステインまたはメチオニンの濃度に実質的影響されない前記 ホモシステイナーゼ酵素。 15． (a) γ-グルタミルシステインシンセターゼ、システインオキシダーゼ、 シスタチオニンβ-シンセターゼ及びシステインtRNAシンセターゼからなる 群から選択される酵素、 (b) ホモシステイナーゼ酵素、及び (c) 前記サンプルに対するホモシステイナーゼの反応によって生成される硫 化水素またはアンモニアの量を測定するために使用することができる少なく とも1の試薬、 を含む生物学的サンプル中のホモシステインの量を測定するための診断キッ ト。 16． 酵素(a)が大腸菌からのγ-グルタミルシステインシンセターゼである請求 項15に記載のキット。 17． ホモシステイン及びシステインを含む生物学的サンプル中に存在するホモ システインの量を測定するための方法であって、 (a) ホモシステインから硫化水素とα-ケトブチレートとを生成することが でき、さらにシステインから硫化水素とピルベートとを生成することができ る酵素調製物に前記サンプルを接触させ、 (b₁) 前記サンプル、またはその複製物もしくは一部を、そのサンプル、ま たはその複製物もしくは一部中のピルベートの量がその作用により測定する ことができる酵素調製物に接触させ、または (b₂) 前記サンプル、またはその複製物もしくは一部を、そのサンプル、ま たはその複製物もしくは一部中のα-ケトブチレートの量がその作用により 測定することができる酵素調製物に接触させ、そして (c) 上記のようにして測定されたピルベートまたはα-ケトブチレートの量 をそこで生成された硫化水素の量と比較することにより、前記サンプル中の ホモシステインの量を計算すること を含む前記方法。 18． 前記酵素調製物がラクテートデヒドロゲナーゼを含み、それにより前記サ ンプル中のピルベートを測定することができ、あるいはロイシンデヒドロゲ ナーゼを含み、それにより前記サンプル中のα-ケトブチレートを測定する ことができる請求項17に記載の方法。 19． ホモシステイン及びシステインを含む生物学的サンプル中に存在するホモ システインの量を測定するための方法であって、ホモシステイン及びシステ インから硫化水素を生成することができる酵素調製物に前記サンプルを接触 させ、ホモシステインから生成される硫化水素の量を測定することにより前 記サンプル中のホモシステインの量を決定することを含み、任意に前記生物 学的サンプルが他の分子に共有結合で結合されたホモシステイン分子を含み 、硫化水素の測定に先立ちそれから前記ホモシステイン分子を分離する段階 をさらに含む前記方法。 20． 硫化水素がシステイン及びホモシステインの両者から生成され、 (a) ホモシステインを前記酵素調製物から保護する試薬に前記生物学的サン プルを接触させ、 (b) 前記酵素調製物により前記サンプル中に存在するシステインから硫化水 素を生成させ、 (c) 前記硫化水素を除去し、そして、 (d) 前記ホモシステインを脱保護し、別の量の酵素調製物を加えてそこから 硫化水素を生成する、 追加的な初期段階を方法に含めることによりホモシステインから生成される 硫化水素をシステインから生成される硫化水素から区別する請求項19に記載 の方法。 21． ホモシステイン及びシステインを含む生物学的サンプル中に存在するホモ システインの量を測定するための方法であって、 (a) 前記サンプルを部分1と部分2の2つの部分に分割し、 (b) 部分1を、ホモシステインをホモシステイナーゼの基質でない物質に変 換し得る第1の酵素調製物に接触させ、前記第1の酵素調製物はシステインを 基質として認識しないものとし、 (c) ホモシステイン及びシステインの両方から硫化水素を生成することがで きるホモシステイナーゼを含む第2の酵素調製物に部分1と部分2を独立して 接触させ、 (d) 部分1と部分2において生成された硫化水素の量を測定し、 (e) 部分2の硫化水素測定値から部分1の測定値を減じて、結果を2倍するこ とによって前記生物学的サンプル中のホモシステインの量を計算する、 段階を含む請求項19に記載の方法。 22． その段階(b)において使用される酵素調製物が、S-アデノシルホモシステ インヒドロリアーゼ及びシスタチオニンβ-シンターゼからなる群から選択 される酵素を含む請求項21に記載の方法。 23． (a) Trichomonas vaginalisホモシステイナーゼ若しくはPseudomonas pu tidaホモシステイナーゼ、またはTrichomonas vaginalis及びPseudomonas p utidaの両者から得たヌクレオチド配列を含むキメラコードポリヌクレオチ ドの発現により生成されたキメラ酵素、 (b) ホモシステイナーゼ反応において生成される硫化水素の量を測定するた めに使用することができる少なくとも1種の試薬、及び (c) 前記サンプル中に存在するシステインからホモシステイナーゼ反応にお いて生成されるピルベートの量を測定するために使用することができる少な くとも1種の試薬、 を含む生物学的サンプル中のホモシステインの量を測定において使用するた めの診断キット。 24． 被検者の生物学的流体中のホモシステイン濃度の単一酵素アッセイに用い るための診断キットであって、 (a) ホモシステイナーゼ酵素、及び (b) ホモシステインに対するホモシステイナーゼの反応によって生成される 生成物硫化水素の量を測定するために使用することができる少なくとも1の 試薬を含み、前記ホモシステイナーゼがシステインに対して十分に非反応性 であって、システインに対する前記ホモシステイナーゼの反応によって生成 される硫化水素が心臓血管疾患のリスクを調べるための前記キットの使用を 実質的に妨げることがない、前記キット。 25． そこに含まれるホモシステイナーゼが、前記流体中のホモシステインとシ ステインの濃度がそれぞれ約20μＭ及び約300μＭであるとき、ホモシステ インのアッセイにおいて生物学的流体に接触させたときに前記ホモシステイ ナーゼの作用によって生成される硫化水素の少なくとも約90%が前記ホモシ ステインに由来するものであるという特性を有する請求項24に記載の診断キ ッ ト。 26． そこに含まれるホモシステイナーゼが、ホモシステインのアッセイにおい て生物学的流体に接触させたときに前記ホモシステイナーゼの作用によって 生成される硫化水素の少なくとも約99%が前記ホモシステインに由来するも のであるという特性を有する請求項25に記載の診断キット。 27． 約10〜約1000μＭのシステインも含む生物学的流体中の1〜500μＭの範囲 のホモシステイン濃度を測定するために使用することができる請求項24に記 載の診断キット。 28． 組織液、血液、血漿、血清または尿中のホモシステイン濃度を測定するた めに使用することができる請求項24に記載の診断キット。 29． (a) ジスルフィド結合を還元することができる薬剤、 (b) 第2鉄イオンのソース、 (c) N,N-ジアルキル-p-フェニレンジアミン、及び (d) カリブレーション標準としてのホモシステイン、 からなる群から選択される1以上の試薬をさらに含む請求項24に記載の診断 キット。 30． (a) ホモシステイナーゼとして、配列番号10、またはそのMet¹からLeu³⁹⁶ までの残基、 (b) 試薬として50mMホウ酸バッファー(pH7.5)、100mM DL-ジチオトレイトー ジエチル、ジプロピルまたはジブチルからなる群から選択されるN,N-ジアル キルフェニレンジアミンの100mM溶液、及び (c) カリブレーション標準としてホモシステイン及び/またはホモシスチン 、を含む請求項24の診断キット。 31． 配列番号10、またはその残基Met¹からLeu³⁹⁶までの残基のコード配列の1 以上のコピーを含む宿主細菌細胞。 32． 大腸菌pAC2-1またはpAC2-11である請求項31に記載の宿主細胞。 33． ATCC 98549である請求項31に記載の宿主細胞。 34． 被検者の生物学的流体中に存在するホモシステインの量を測定する方法に おいて、該方法が、ホモシステインからの検出可能な量の硫化水素の生成を 触媒することができる酵素と前記サンプルとを接触させる段階を含み、かつ 、前記サンプルが測定を妨害するシステインの量をさらに含み、それから検 出可能な量の硫化水素を生成することができる前記方法であって、改良が、 該方法において使用するために前記流体中のホモシステインとシステインの 濃度がそれぞれ約20μＭ及び約300μＭであるとき、ホモシステインのアッ セイにおいて生物学的サンプルに接触させたときにホモシステイナーゼの作 用によって生成される硫化水素の少なくとも約90%が前記ホモシステインに 由来するものであるという特性を有するホモシステイナーゼを選択すること を特徴とする前記方法。 35． 請求項24に記載の診断キットを使用することを含む被検者の生物学的流体 中のホモシステインの濃度を測定するための単一酵素法。 36． 被検者の心臓血管疾患についてのリスクを調べる診断方法であって、前記 被検者の生物学的流体中のホモシステインの濃度を測定し、前記流体中のシ ステイン及びメチオニンの濃度からの妨害がなく、 (a) ジスルフィド結合を還元することができる薬剤に前記生物学的流体サン プルを接触させてそこにジスルフィド結合形態で存在する全ホモシステイン の部分を遊離ホモシステインとして放出させ、 (b) ホモシステインと比較してシステインに実質的に非反応性のホモシステ イナーゼに前記サンプルを接触させて、その接触により生成される硫化水素 の少なくとも約90%が、その硫化水素が逃避しない条件下でホモシステイン から生成されるものとし、 (c) 第2鉄イオンとN,N-ジアルキルフェニレンジアミンを前記硫化水素含有 サンプルに加えてメチレンブルー型発色団をその場で生成させ、 (d) 生成される発色団の濃度に基づいて前記サンプル中に存在したホモシス テインの濃度を測定し、そして (e) その結果を、心臓血管疾患の増加したリスクと関連することが判ってい る被検者中の生物学的流体中のホモシステインのレベルと比較する、 段階を含む前記方法。 37． ホモシステイナーゼが配列番号10またはその残基Met¹からLeu³⁹⁶までの残 基である請求項36に記載の方法。 38． 生物学的サンプルまたは流体がメチオニンも含む請求項1、8、17及び19の いずれかに記載の方法。 39． 生物学的流体サンプルが組織液、尿、血液、血清及び血漿からなる群から 選択される請求項36に記載の方法。 40． (a) ホモシステインと比較してシステインに実質的に非反応性のホモシス テイナーゼ、 (b) バッファー、還元剤、硫化水素を検出するために有用な薬剤、及び任意 に、 (c) カリブレーション標準としてのホモシステイン及び／またはホモシスチ ン、 を含む請求項24に記載の診断キット。