【発明の詳細な説明】
Ｔ細胞及びＢ細胞リンパ腫及び白血病の治療のための ＣＤ48に対する抗体の使用
技術分野
本発明は、Ｔ細胞及びＢ細胞リンパ腫及び白血病の治療方法に関する。該方法
はＣＤ48を標的とする抗体を使用する。
発明の背景
この１０年にわたり、白血病及びリンパ腫の化学療法には大きな進歩が見られ
た。併用化学療法及び骨髄移植（ＢＭＴ）により高い割合での緩解が得られてい
る。しかしこれらの緩解の多くは長く持続するものではなく、血液癌であると診
断された患者の大部分は最終的にはその疾患により死亡する。従って非ホジキン
リンパ腫及び成人性急性慢性白血病の患者の長期生存率はいまだに低い。現在、
急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）及び中度あるいは高度非ホジキンリンパ腫の
患者のわずかに40％のみが長期の生存を達成しているに過ぎない。
これらの化学療法の進歩と同時に、Kohler及びMilsteinがハイブリドーマによ
るモノクローナル抗体(ＭｏＡｂ)の製造を記載した独創的な報告を刊行した。Ｍ
ｏＡｂは悪性腫瘍造血細胞の表面に発現された抗原に結合し得るので、このよう
な物質を血清療法に使用してそのような細胞に特異的に向かわせ、破壊できるで
あろうとする楽観的な見通しがなされていた。さらに、ＭｏＡｂ療法は特定の細
胞毒性メカニズムを提供することにより腫瘍細胞の抵抗性を回避できるであろう
とされていた。しかし、齧歯動物免疫グロブリンの免疫原性、腫瘍細胞による抗
原の変調、貧食細胞による抗原の非特異的取り込み、ある種の抗体の低い結合ア
フィニティ、一定の場合における血漿中に循環する抗原の問題等の数々の大きな
障害によりこの方法の可能性が制限されてきた。これらの問題のいくつかについ
ては対処する方法が提案されているが、さらに大きな困難は、殆どのＭｏＡｂが
、標的表面抗原に結合した後にヒト補体カスケードの活性化あるいは細胞障害性
Ｔリンパ球により媒介される抗体依存性細胞障害の促進により細胞を死滅させる
能力を欠いていることである。in vitroでのこの細胞溶解エフェクター機能の欠
如は、
白血病及びリンパ腫の患者における抗体の静脈注射では全般に不十分な結果しか
得られていないことに反映されている(11)。
47kdのグリコホスファチジルイノシトール結合糖タンパク質であるＣＤ48は、
それが免疫治療の良好な標的となり得ることを示唆するいくつかの特徴を有して
いる。ＣＤ48はリンパ系悪性腫瘍に広く発現されるが、その他の組織には発現さ
れない(2,3,4)。正常及び悪性腫瘍Ｔ細胞及びＢ細胞の両方がＣＤ48を発現する
が、殆どのＣＤ34陽性細胞はＣＤ48を発現しない。ＣＤ48は、Ｔ細胞及びＢ細胞
の表面にも高いレベルで存在する。ヒトにおけるＣＤ48の生物学的機能はまだ明
確になっていない。マウスにおいてはＣＤ48はＣＤ2の高アフィニティリガンド
であるが(5)、ヒトＣＤ2に対しては低アフィニティリガンドである(6,7)。
抗ＣＤ48抗体が開示されており(3)、そのような抗体の一つが抗腫瘍治療にお
ける使用について試験されている(13)。この試験では、ＩｇＭ抗ＣＤ48抗体の最
大50mgを慢性リンパ性白血病の４人の患者に注射している。しかし、一時的な循
環リンパ球の低下が観察されるのみで、いずれの患者においても基となる疾患の
進行に対しては影響を与えなかった。これらの結果は、抗ＣＤ48抗体は強い抗腫
瘍効果を示さないことを示唆している。
本発明者らは今回、動物モデルにおいてＣＤ48抗原に対する適当なアイソタイ
プの抗体が強い抗腫瘍効果を有することを見出した。この抗腫瘍効果は動物モデ
ルにおいて示され、腫瘍細胞を有するマウスの抗ＣＤ48抗体による治療により、
対照抗体で治療されたものよりも長い生存（治癒）がもたらされた。
発明の概要
従って本発明の第一の形態は、Ｔ細胞またはＢ細胞リンパ腫あるいは白血病の
治療方法であって、該方法はＣＤ48に対するクラスＩｇＧの抗体をそれを必要と
する対象（患者）に投与することを含む。
このＩｇＧアイソタイプは、マウスＩｇＧ2a、ヒトＩｇＧ1、ヒトＩｇＧ2及び
ラットＩｇＧ2bから選択されるアイソタイプとすることができる。対象がヒトで
ある場合、好ましいアイソタイプはヒトＩｇＧ1またはＩｇＧ2である。対象がマ
ウスである場合は、好ましいアイソタイプはマウスＩｇＧ2aである。対象がラッ
トである
場合は、好ましいアイソタイプはラットＩｇＧ2bである。
本明細書で使用する用語「抗体」は、必要な特異性を有する結合ドメインを持
った任意の特異的結合物質をいう。すなわちこの用語は、天然あるいは合成の、
免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを包含する、抗体断片、
誘導体、抗体の機能的等価物及び同族体を包含するものである。従って、別のポ
リペプチドに融合した、免疫グロブリンドメインあるいは等価物を含むキメラ分
子を含む。
好ましい態様においては、抗体は、最近クローン化され、配列決定されたHuLy
m-3抗原(9)に対するものである。
本発明者らは、Ｆｃ部分がヒトＦｃ領域により置き換えられたキメラ抗ＣＤ48
抗体がマウス抗ＣＤ48抗体よりも改良された特徴を示すことを見出した。これら
の特徴としては、より高いエフェクター効果、より長い血清中半減期、及びより
低い免疫原性等がある。
従って、別の好ましい態様においては、ＣＤ48に対する抗体はキメラ(すなわ
ちヒト化)抗体である。このキメラ抗体は、Ｆｃ部分の少なくとも一部がヒトＦ
ｃ部分により置き換えられたマウス抗体とすることができる。
抗ＣＤ48抗体の効能は、例えば、放射性同位体、サイトカイン、タンパク質毒
素、抗癌剤等に抱合することによって増強され得ることは理解され得るであろう
。抗癌剤はドクソルビシン、シスプラチン、タキソール、インターフェロン、シ
ュードモナスエキソトキシンＡ、フマギリン、ＡＧＭ-1470、タモキシフェン、
ＡＣＮＵ、ＢＣＮＵ、ＣＣＮＵ及びＰＣＮＵ等のニトロソウレア、ジアジコン、
デカルバジン、ハイドレア、セムスチン、マツロン、テニポシド、及びテラザン
トから選択し得る。
本発明の第一の形態の方法は、非ホジキンリンパ腫あるいはリンパ系白血病の
治療に使用できる。
本発明の一つの利点は、ＣＤ48はＣＤ34陽性始原細胞の5％未満においてのみ
発現されるという本発明者らによる発見にある。すなわち、抗ＣＤ48抗体はリン
パ球性白血病及びリンパ腫細胞を標的とするが、ＣＤ34+始原細胞の大部分を残
して増殖させ、不足した細胞種の数を補うものである。
発明の詳細な説明
本発明をより明確に理解し得るように、その好ましい形態を以下の実施例を参
照して説明する。実施例における図は以下の通りである。
図１：抗ＣＤ48抗体HuLy-m3のインターナリゼーション。
図2(a)及び2(b)：ＳＣＩＤ/RajiにおけるＣＤ48治療後の生存率(Kaplan Meier
曲線)。ＳＣＩＤマウスに、(a)１ｘ106Raji細胞または(b)５ｘ104Raji細胞を注
射した。一群５匹のマウスに、Raji細胞注射後０、２及び４日に200ugのマウス
抗ＣＤ48抗体、HuLym3またはアイソタイプ対照抗体を注射した。
図2(c)：異なる抗ＣＤ48抗体投与量の効果。ＳＣＩＤマウスに、１ｘ105Raji
細胞を注射し、一群５匹のマウスに、Raji細胞注射後０、２及び４日に200Ｔｇ
のアイソタイプ対照、200Ｔｇまたは20ＴｇのＩｇＧ2a抗ＣＤ48抗体HuLym3を注
射した。
図2(d)：異なる抗ＣＤ48抗体の効果。ＳＣＩＤマウスに、５ｘ105Raji細胞を
注射し、一群５匹のマウスに、Raji細胞注射後０、２及び４日に200ＴｇのＩｇ
Ｇ2aアイソタイプ対照、200ＴｇのＩｇＧ2a抗ＣＤ48抗体HuLym3あるいは200Ｔｇ
のＩｇＭ抗ＣＤ48抗体を注射した。
図３：Raji細胞系を標的細胞として使用し、ヒトＰＢＭＣエフェクター細胞を
使用した、キメラHuLym3、マウスHuLym3及びラットCampath抗体のＡＤＣＣアッ
セイ。示した結果は１ug/mlの抗体濃度と25:1のエフェクターの標的に対する比
についてのものである。
材料及び方法
細胞系
HuLym3ハイブリドーマ細胞系は、Dr．Mauro S Sandrin，The Austin Research
Institute，Melbourne(17)からの寄贈物であり、10％胎児ウシ血清(ＦＢＳ)ま
たは10％ウシＩｇＧ非含有血清(Starrate)、２ｍＭグルタミンを含むＲＰＭＩ16
40中で37℃インキュベーターにおいて37℃で培養した。細胞系ＣＯＳ1、ＣＨＯ-
Ｋ1、Raji、Daudi、MＯＬＴ-4、Ｕ-937及びＣＣＲＦ-ＣＥＭはＡＴＣＣから得た
。ＣＯＳ
及びＣＨＯ細胞は10％ ＦＢＳを含む1:1 ＤＭＥＭ/Ｆ12(ＣＳＬ)中で37℃、5％
ＣＯ2で培養した。Raji、Daudi、ＭＯＬＴ-4、Ｕ-937及びＣＣＲＦ-ＣＥＭはＲ
ＰＭＩ 1640、２ｍＭグルタミン、10％ FCS中で37℃及び5％ＣＯ2で培養した。
抗体の製造及び精製
抗体(ＩｇＧ2a)は、HuLy-M3ハイブリドーマでコンディショニングされた培地
あるいはヌードマウスもしくはＢａｌｂＣ/ＣＢＡ交雑種で生成された腹水から
、タンパク質Ａアフィニティクロマトグラフィー(Pharmacia)を使用して精製し
た。抗体の純度は10％ ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより確認し、活性はヒト白血病細胞系
を使用してフローサイトメトリーにより確認した。動物実験のために、抗体をイ
オン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過によりさらに精製した。ＩｇＧ2aアイ
ソタイプ対照抗体(抗ヒトＴＳＨ)はBioquestから入手し、上記のように再精製し
た。タンパク質濃度は280nmにおける吸光度により測定した(18)。ラットCampath
-1抗体は、Bob Hale，ＭＲＣ，Cambridge，ＵＫからの寄贈物であった。ＩｇＭ
抗ＣＤ48抗体ＷＭ63はKen Bradstock，Department of Haematology，Westmead H
ospitalから得た。
ヒト単核細胞のフローサイトメトリー分析によるＣＤ34/ＣＤ48発現
正常個体あるいはSt．Vincent's Hospital，Sydney，AustraliaのＣＣＬ及び
ＮＨＬ患者からヒト末梢血(患者から10ml、正常個体から50ml)を得、ＥＤＴＡチ
ューブに回収して凝固を防止し、リンパ球及び単球(ＰＢＭＣ)をFicoll勾配上で
調製した。生存細胞をトリパンブルー排除により計数し、ＰＢＳ中に１ｘ106細
胞/mlの終濃度で再懸濁した。フローサイトメトリー分析については、抗ＣＤ34-
ＦＩTC、抗ＣＤ45-ＰｅｒＣＰ及びビオチン化抗ＣＤ48あるいはアイソタイプ対
照抗体を5.0ｘ106細胞と4℃で30分間インキュベートし、2mlの洗浄媒体(ＰＢＳ/
1％ＢＳＡ)で一回洗浄し、その後ストレプトアビジン-ＰＥを加え4℃に30分間置
いた。細胞を２回洗浄し、ＰＢＳ中に1％ショ糖及び0.5％パラホルムアルデヒド
を含む500μｌの固定バッファー中に固定し、直ちに特性化しない場合は１mlの
ＰＢＳ/1％ ＢＳＡを加えて4℃で貯蔵した。サンプル調製の24時間以内にCoulte
r Epi
csフローサイトメーターで蛍光を測定した。
細胞あたりのＣＤ48分子数の測定
上記のようにしてヒト末梢血単核細胞を調製し、20ｘ106/mlの終濃度で再懸濁
した。Simply Cellular Microbeadsを使用し、製造者の説明書に従って、細胞あ
たりの結合部位数を測定した。
抗体インターナリゼーション
ＣＤ48モノクローナル抗体のインターナリゼーションの試験はフローサイトメ
トリー(19)及び共焦顕微鏡観察により行った。ヒト末梢血単核細胞を上記のよう
にして単離した。フローサイトメトリーについては、5-10ｘ106細胞を過剰の抗
ＣＤ48あるいは対照抗体(10-20ug/0.5-1.0ｘ106細胞)と共にリン酸緩衝食塩水(
ＰＢＳ)中で60分間4℃でインキュベートした。洗浄後、細胞を完全培地(ＲＰＭI
/10％ ＦＣＳ)中に再懸濁し、5％ＣＯ2インキュベーター中で一定期間37℃でイ
ンキュベートした。適当なインキュベート時間の後、ＦＩＴＣ抱合抗マウスある
いは抗ヒトＩｇＧ1抗体を加え30分間4℃に置いた。冷ＰＢＳ/1％ ＢＳＡで二回
洗浄した後、細胞をPBS中の0.5％パラホルムアルデヒド及び1％ショ糖で室温で1
5分間固定し、ＰＢＳ/1％ ＢＳＡ中に再懸濁してフローサイトメトリーによる分
析を行った。
共焦顕微鏡観察については、ヒトＰＢＭＣを調製し、試験モノクローナル抗体
と4℃及び／または37℃で上記したようにインキュベートした。洗浄後、細胞懸
濁物を二つにし、ＰＢＳ中の4％パラホルムアルデヒド（細胞表面染色）あるい
はＰＢＳ中の4％パラホルムアルデヒド/0.1％ Triton X-100（細胞内及び表面染
色）で30分間室温で固定した。ＰＢＳ/1％ ＢＳＡで洗浄した後、細胞をＦＩＴ
Ｃ抱合抗マウスまたは抗ヒトＩｇＧ1抗体と30分間4℃でインキュベートした。そ
の後細胞をＰＢＳで洗浄し、ペレットを退色防止剤としてのＰＰＤ(90％(v/v)グ
リセロール、10％(v/v)PBS中の１ｍｇ/ｍｌ r-フェニレンジアミン、ｐＨ8.0)と
混合し、ガラススライド上に置き、円形カバースリップで覆った。Ａｂインター
ナリゼーションを調べるため、Salastro 2000 ＣＬＳＭ(Molecular Dynamics，S
unnyval
e，ＣＡ，ＵＳＡ)を使用し、平面高度色消し60x/1.40 ＮＡオイル浸漬レンズ及
びアルゴンイオンクラスIIレーザーで共焦レーザー走査顕微鏡分析(ＣＬＳＭ)を
行った。50ｍｍ固定ピンホールを使用し、488ｎｍでの励起、510ｎｍビームスプ
リッター、及び510ｎｍバリアフィルターでＦＩＴＣ標識細胞を通して光切片（
通常0.3ｍｍ間隔）を得た。画像処理はSilicon Graphics Personal Iris ４D 35
ワークステーションを使用して行った。細胞の生存はトリパンブルー排除により
調べた。
ＨＬＭ3によるRajiリンパ腫を有するＳＣＩＤマウスの治療
６週〜8週齢の雌性ＳＣＩＤマウス(ＣＢ17)をAnimal Resources Centre，West
ern Australiaから市販品として得た。マウスを特異的病原体を含まない(ＳＰＦ
)設備として維持したＣ1 Ｌａｂ中で飼育した。一群５匹のマウスにＲＰＭＩ 16
40(200 Ｔｌ)中のRaji細胞を０日において静脈内注射した。その後200 Ｔｌ Ｒ
ＰＭＩ 1640中の抗体を0、2及び４日にi.v.注射した。マウスを毎日観察し体重
を測定して、後肢麻痺の発症時に屠殺した。さらに分析するために血液及び組織
サンプルを採取した。一方の大腿骨及び血液から採取した骨髄を直ちに分析し、
採取した組織は液体窒素中で凍結するか、ホルマリン/ＰＢＳ中で固定した。骨
髄及び血液をフローサイトメトリーで分析してヒト細胞のパーセンテージを測定
した。抗マウスＣＤ45-ＰＥ(PharMingen)及び抗ヒトＣＤ45-ＦＩＴＣ(Becton Di
ckinson)を使用して上記したようにフローサイトメトリーによりマウス及びヒト
白血球を検出した。回収した組織を組織学的染色及び免疫組織化学的分析のため
に切片とした。組織学的染色はヘマトキシリン及びエオシン染色を使用して行っ
た。免疫組織化学的分析については、内因性ペルオキシダーゼをブロッキングす
るために切片を正常ウサギ血清とインキュベートし、その後抗ＣＤ20(Dako)ある
いはHuLy-m3と2時間37℃でインキュベートした。洗浄後、切片をウサギ抗マウス
Ig-ＨＲＰ(Silenus)で追跡し、ヘマトキシリン及びスコットブルーにより対比染
色した。再度洗浄した後、脱水してEukitt中に装着した。
ＨＬＭ3の可変領域遺伝子のクローニング
HuLym3ハイブリドーマ(19)から全ＲＮＡを単離し、Ig-Primer Kit(Navagen)か
らの重鎖または軽鎖3'-プライマーを使用する第一鎖ｃＤＮＡの合成に使用した
。可変重鎖及び軽鎖領域のPCR増幅のために、種々の5'-プライマー(Ig-Prime Ki
t，Novagen)を含む別々のチューブ中でｃＤＮＡをＰＣＲの35サイクルにかけた
。ＶＨ及びＶＬ ＰＣＲ産物をＴ-ベクター(20)中にエレクトロポレーションによ
りクローン化し、大腸菌(ＤＨ5a)中に形質転換した。ＶＨ及びＶＬ ＰＣＲ産物
の全てについて、Ｔ7 Sequencingキット(Pharmacia Biotech)を使用して、フォ
ワード及びリバース両方向についてＤＮＡ配列決定した。各ＰＣＲ産物について
少なくとも２つのクローンを配列決定してＰＣＲエラーが最小限になるようにし
た。重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列は、477A Protein Sequencer & 120A Analyser
(Applied Biosystems)で、アルキル化した別の鎖のＮ-末端アミノ酸配列決定に
より決定した。
キメラＨＬＭ3の構築
発現ベクターＨＣＭＶ-Ｃｒｌ及びＨＣＭＶ-Ｃｋ(21)は、Mary Bendig(Medica
l Research Council，Laboratory of Molecular Biology，ＵＫ)からの寄贈物で
あった。Hind III及びＢａｍ ＨＩ消化によりＶＨ及びＶＬ挿入物をベクターか
ら除去した。Greg Winter(Medical Research Council;Laboratory of Molecular
Biology,ＵＫ)からの寄贈物であるＭ13-ＶｋＰＣＲ1ベクターからＨｉｎｄ III
及びＡｐａ Ｉでの消化によりリーダー配列を得た。ＶＨ及びＶＬをＰＣＲで再
増幅して両方の可変領域に5'Ａｐａ ＬＩ部位を導入し、3'Ｂａｍ ＨＩ部位及び
Ｂｇｌ II部位をＶＨ及びＶＬにそれぞれ導入した。Ｈｉｎｄ III−Ａｐａ ＬＩ
リーダー配列及びＡｐａ ＬＩ-Ｂａｍ ＨＩ ＶＨ配列あるいはＡｐａ ＬＩ−Ｂ
ｇｌ IIＶＬ配列を三成分結合により前記Ｈｉｎｄ III−ＢａｍＨＩ消化ＨＣＭ
Ｖベクターに結合した。Gene Pulser（ＢｉｏＲａｄ）を使用してエレクトロポ
レーション(2.2kv、250ｕＦ静電容量)により結合産物を大腸菌ＤＨ5a中に形質転
換した。
ＣＯＳ1及びＣＨＯ-Ｋ1細胞中での発現
キメラ抗体をＣＯＳ及びＣＨＯ-Ｋ1細胞中で発現させた。Gene Pulser装置(27
0ボルト、250ｍＦ、BioRad)を使用してエレクトロポレーションによりＤＮＡを
ＣＯＳI及びＣＨＯ-Ｋ1細胞に導入した。形質転換体をＧ418(4mg/ml)選択下に培
養し、組み立てられたヒト抗体に特異的なサンドウィッチＥＬＩＳＡを使用して
高収率クローンをスクリーニングした。
100ｍＭグリシン(ｐＨ3.0)で溶出するProtein A Sepharose ＣＬ-4Ｂ(Pharmac
ia)またはＰＯＲＯＳ 50Ａアフィニティクロマトグラフィー(Perfusion Chromat
ography)を使用してキメラＨＬＭ3を細胞培養上清から精製し、バッファー交換
するためＰＢＳ(ｐＨ7.4)に対して透析した。ストック溶液の濃度は１mg/mlより
高い。
組み立てられたキメラ抗体発現のＥＬＩＳＡ
サンドウィッチＥＬＩＳＡを使用して、組み立てられたヒト抗体の濃度を測定
した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratorie
s，Inc.，ＵＳＡ)をNunc Maxisorbプレート上に２ug/mlで4℃において一晩被覆
させた。抗ヒトκ軽鎖-ビオチン(The Binding Site Ltd.，England)を追跡抗
体として使用し(0.5ug/ml)、その後炭酸バッファー中のアルカリホスファターゼ
抱合卵白-アビジン(Jackson)(0.5ug/ml)及び１mg/mlのホスファターゼ基質(p-ニ
トロフェニルホスフェートジナトリウム、Sigma)を、各段階の間に洗浄を行いな
がら逐次プレートに加えた。ＥＬＩＳＡ Reader(Dynateck ＭＲ7000，Baxter)で
ＯＤ405ｎｍの吸光度を読み取った。ヒトＩｇＧ(Jackson ImmunoResearch Labor
atories，Inc.，ＵＳＡ)を標準として使用した(0.25〜1000ng/ml)。全ての抗体
インキュベーションは37℃で少なくとも１時間行った。
ＡＤＣＣアッセイ
Cytotoxicity Detection Kit(ＬＤＨ)(Boehringer Mannheim)を使用してＡＤC
Cを測定した。末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を健常なドナーから単離し、エフェク
ター細胞として使用した。ヒトRaji細胞系を標的細胞のソースとして使用した。
Campath1(ＣＤｗ52)モノクローナル抗体(ラットＩｇＧ2b)を陽性対照として使用
した。マウスＩｇＧ2a(抗-ＴＮＰ、Pharmagen)及びヒトＩｇＧ1(The Binding Si
te)
抗体をそれぞれHuLym3及びキメラHuLym3のアイソタイプ対照として使用した。Ｐ
ＢＭＣをアッセイ培地(1％ＢＳＡを含むＲＰＭＩ1640)中に１ｘ107lｍｌで再懸
濁した。Raji細胞をアッセイ培地中１ｘ105/ｍｌの終濃度に調整し、各抗体の種
々の濃度(0.01〜10ｕｇ/ｍｌ)とともに室温で30分間インキュベートした。エフ
ェクター及びＡｂ標識標的抗体(1ｘ105)を種々の比率で加えて37℃、5％ＣＯ2で
４時間インキュベートした。放出されたラクテートデヒドロゲナーゼ(ＬＤＨ)活
性を、細胞障害性検出キットを使用し、製造者の説明書に従って測定した。三回
行った実験の平均吸光度を計算し、バックグラウンド(アッセイ培地のみ)を補正
して下記式に代入した。
低対照：アッセイ培地中の標的細胞
高対照：標的細胞及び2％Triton Ｘ-100
Ｅ+Ｔ-Ａｂ：エフェクター及びＡｂで標識された標的細胞
Ｅ+Ｔ：エフェクター及び標的細胞のみ
結果
ＣＤ48抗原の特性化
ＣＤ34+/ＣＤ48+細胞の測定
ＣＤ48を発現するＣＤ34+細胞のパーセンテージを、ＣＤ34、ＣＤ45及びＣＤ4
8に対する抗体を使用して三標識フローサイトメトリーにより測定した。ＣＤ34+
細胞を最初に選択し、その後ＣＤ48+/ＣＤ45+細胞を調べた。二人の健康なドナ
ー及び二人のＣＬＬ及びＮＨＬ患者のＰＢＭＣを調べた。健常個体及びＣＬＬ及
びＮＨＬの患者のＣＤ34陽性細胞の5％未満のみがＣＤ48を発現することが判っ
た。調べたサンプルの全てがＣＤ48+であるＣＤ34+細胞の約4％(±1％)のレベル
を有していた。
細胞あたりの抗ＣＤ48結合部位の数
細胞あたりの抗ＣＤ48結合部位の数は、Quantum Simply Cellular Microbeads
及びフローサイトメトリーを使用して測定した。健常個体(2)及びＣＬＬ患者(2)
は同様な結合部位数を有しており、細胞あたり約40000±10000の結合部位が存在
していた。Ｂ-リンパ腫細胞系Rajiは患者あるいは正常個体よりも高いレベルの
ＣＤ48を発現し、約200000結合部位/細胞を有していた。
ＣＤ48モノクローナル抗体のインターナリゼーション
抗体インターナリゼーションは、i）表面標識抗体のロスをフローサイトメト
リーで監視する、及びii）共焦顕微鏡観察を使用して標識抗体の位置(表面ある
いは細胞内)を決定するという二つの方法で調べた。容易に細胞内にインターナ
リゼーションされることが知られている抗ＣＤ3抗体であるＯＫＴ3を陽性対照と
して使用した(22)。結果は図１に示す。図１は、ＯＫＴ3で標識され、37℃でイ
ンキュベートされた細胞からの急速なシグナルのロスを示しており、約30分後に
当初の値の半分となった。これに対し、抗ＣＤ48抗体で標識された細胞は、24時
間後でもシグナルのロスを示さなかった。健常個体、ＣＬＬ患者及び白血病細胞
系から単離されたＰＢＭＣについて行った実験では全て同様な結果が得られた。
ＳＣＩＤマウスにおけるＢ細胞リンパ腫モデルの樹立
ＣＤ48に対する抗体がin vivoで抗腫瘍効果を媒介できるかどうかを調べるた
め、ＳＣＩＤマウスにおいてＢ細胞リンパ腫のモデルを樹立した。ヒトRaji Ｂ
細胞リンパ腫細胞系を静脈内注射した全ての非処理ＳＣＩＤマウスは後肢麻痺を
起こした。麻痺の発症は再現可能で、注射した細胞の投与量に依存した。１ｘ106
あるいは５ｘ104個の細胞を注射されたＳＣＩＤマウスはそれぞれ19±2日、あ
るいは34±3日後に麻痺を起こした。マウスを麻痺の発症時に屠殺した。マウス
の剖検において、肝臓、腎臓、卵巣、脾臓、肺、リンパ節等の種々の器官におけ
る散在性の腫瘍が見られた。大きな新生物浸潤がしばしば明確な白色の種々の大
きさの結節を形成していた。免疫組織化学的分析により腫瘍細胞の明確な結節
の存在が確認された。これらの細胞はヒトＣＤ20及びＣＤ48に特異的な抗体によ
り陽性に染色された。屠殺したマウスの大腿骨からの骨髄は20〜60％ヒト細胞を
含んでいたが、末梢血中においてはヒト細胞は全く検出されなかった。
抗ＣＤ48抗体によるＳＣＩＤマウスにおける腫瘍細胞増殖の阻害
0日においてRaji細胞を注射した５匹のＳＣＩＤマウスの群を、200ugマウス抗
ＣＤ48抗体またはアイソタイプ対照抗体で、０、２及び４日に処理した。結果は
図2(a)及び(b)に示す。１ｘ106個のRaji細胞を注射されたマウスを抗ＣＤ48抗体
で処理すると、後肢麻痺に到る時間が40％延長された。５ｘ104個の細胞の細胞
量を注射し、同じ投与量で処理した５匹のマウスの４匹は長期間生存した。アイ
ソタイプ対照抗体で処理したものは約32日後に後肢麻痺を起こした。抗ＣＤ48抗
体の投与量のマウスの生存に対する効果も調べた。図2cは、20Ｔｇの抗体投与量
が60％のマウスにおいて後肢麻痺に到る時間を延長できることを示している。図
2dは、異なるアイソタイプの抗ＣＤ48抗体の抗腫瘍効果を示している。ＩｇＭ抗
体は対照抗体に対しマウスの生存を延長させなかったが、ＩｇＧ2a抗体は顕著な
生存効果を示した。これらの結果は、マウス抗ＣＤ48マウス抗体HuLym3は強力な
抗腫瘍効果をin vivoでもたらすことができることを示している。
ＨＬＭ3可変領域遺伝子のクローニング
強力なin vivo抗腫瘍活性に基づいて、マウス/ヒトキメラ抗体の構築のために
抗ＣＤ48抗体の可変領域をクローン化した。縮退プライマー(Ig-Primer Kit，No
vagen，ＵＳＡ)を使用するＰＣＲにより可変領域を増幅した。これらのプライマ
ーを使用することにより、複数のＰＣＲ産物が生成した。Ｖｈについて二つの異
なる産物と、Ｖｌについての三種の個々の産物であった。予測されるアミノ酸配
列を決定されたＮ-末端アミノ酸配列と比較することにより正確なＶｌ産物を決
定し、データベースを検索することにより確認した。Ｖｈ産物はKabatデータベ
ース検索により同定し、これにより一つの産物が50bpの欠失を含むことが示され
た。重鎖からはアミノ酸配列は得られず、これはおそらくＮ-末端がブロックさ
れていたことによるものと思われる。
キメラＨＬＭ3の構築及びＣＨＯ細胞中での発現
抗ＣＤ48 Ｖｈ及びＶｌ遺伝子セグメントを使用して、キメラ抗体発現ベクタ
ー、ＨＣＭＶ.Ｖｈ及びＨＣＭＶ．Ｖｌを構築した。プラスＫミドＤＮＡを一時
的発現のためにＣＯＳ細胞に、安定な発現のためにＣＨＯＫ1細胞に同時にトラ
ンスフェクトした。418選択の後にサンドウィッチＥＬＩＳＡを使用してキメラ
抗体の最高のレベルを発現するＣＨＯＫ1クローンを採取した。キメラ抗体の構
造をＳＤＳ-ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットにより確認した(23)。キメラ抗体
は、種々の細胞系及び4ＰＢＭＣサンプルについて調べたところ、マウスのもの
とほぼ同一の結合特性を有し(23)、競合ＥＬＩＳＡ(23)により調べたところマウ
スのものと同じ相対的アフィニティを有していることが示された。
ｍＨＬＭ3及びｃＨＬＭ3のＡＤＣＣ
前記キメラ抗体は、ヒトＰＭＢＣをエフェクター細胞として使用するＡＤＣＣ
アッセイにおいて有意な溶解を起こすことができた。6:1、12:1、25:1、50:1及
び100:1のエフェクターの標的細胞に対する比で0.01-10ug/mlの抗体の濃度範囲
を試験した。ラットCampath-1抗体(ＩｇＧ2b)もいくつかのアッセイにおいて使
用した。キメラHuLym3は、マウスHuLym3より2〜6倍、Campath1よりも2〜3倍高い
効率の比溶解を起こした。キメラHuLym3での比溶解のレベルは0.1〜5ug/mlの抗
体濃度及び12:1〜50:1のエフェクターの標的に対する比率について同様であり、
キメラHuLym3は通常60％を超える比溶解を生じる。典型的なＡＤＣＣアッセイの
結果を表１及び図３に示す。観察された最大比細胞溶解はこれまでに記載された
ように(24)エフェクター細胞のソースに依存した。
考察
ＣＤ48は、リンパ球、単球、及びリンパ球性白血病及びリンパ腫細胞の大多数
の表面において発現される(2,3)。リンパ腫及び白血病の治療のためのＣＤ48を
標的とする能力を評価する目的で、ＣＤ48のいくつかの性質をさらに特性化した
。ＣＤ34は造血細胞発生における初期のマーカーを代表するものである(25)。白
血病あるいはリンパ腫細胞を標的とするがＣＤ34+細胞は標的としないことが治
療剤として有利であると考えられる。我々は、ＣＤ48がＣＤ34+細胞の5％未満で
しか発現されないことから、ＣＤ48に対する抗体が殆どのＣＤ34+細胞を標的と
しないことを示した。従って、抗体処理によりＣＤ48+細胞が全て除去されれば
、残ったＣＤ34+始原細胞が増殖し、その枯渇した細胞種の数を再構成すること
ができるであろう。
二価の抗体による架橋は表面抗原をパッチし、キャップし、最終的にそのイン
ターナリゼーションを起こす。このプロセスが起こる速度は抗原によって異なる
。ＣＤ3及びＣＤ7のようなある種のリンパ球様分化抗原は数分のうちにインタナ
リゼーションを起こすが、ＣＤ45及びＣＡＭＰＡＴＨ-1のような別のものでは前
記プロセスは数時間かかり得る。抗ＣＤ48抗体は、調整なしでは少なくとも24時
間細胞の表面に存在したままになる。抗ＣＤ48抗体の細胞表面上での安定性は、
この抗体により媒介される観察される細胞障害効果において重要な役割を果たし
ているようである。
健常なドナーとＣＬＬ患者ドナーからのＰＢＭＣの表面上でのＣＤ48の発現レ
ベルに有意な差はないようである。両方の細胞の表面は約40000部位/細胞で抗体
を結合した。ＣＤ48はＥＢＶ-感染Ｂ細胞上において高い発現のレベルに誘導さ
れる(26)。これはＥＢＶ+であり約200000部位/細胞発現するヒトRaji細胞系の分
析により確認された。
ＩｇＭ抗ＣＤ48抗体がフェーズＩ予備臨床試験に使用されている(13)。４人の
ＣＬＬ患者が64mgまでの抗体で６日間に渡って治療され、有意ではあるが一時
的な循環白血球数の減少が観察された。ＩｇＭ抗ＣＤ48抗体はin vitroで強力に
補体を活性化できたが、これは循環腫瘍細胞の一時的な減少のみを起こす大きな
補体活性化を起こすことができたＩｇＭ Campath抗体と同様である。Campath-1
抗体の種々のアイソタイプによる別の臨床試験により、ＡＤＣＣの媒介がin viv
oにおける強力な抗腫瘍効果に重要であることが示唆されている(14,15)。マウス
ＩｇＧ2a及びヒトＩｇＧ1抗体がＡＤＣＣ及び抗腫瘍活性を媒介することが示さ
れている(27)。
我々は抗ＣＤ48抗体が強力なin vivo抗腫瘍効果を媒介でき、アイソタイプ対
照抗体で処理すると約34日後に後肢麻痺を起こす、Raji細胞を注射されたＩＣＤ
マウスを長期間生存させ得ることを示した。このモデルにおける疾患の発現は、
例えばDaudi細胞系(29)のようなヒトＢ細胞系(28)を使用したその他のＣＩＤマ
ウスモデルと同様である。しかし、後肢麻痺に到る時間はRaji細胞系によればそ
の他のモデルと比較してより短い。例えば、１ｘ106個のDaudi細胞をＩＶ注射し
たＳＣＩＤマウスは約34日後に後肢麻痺を起こすが、１ｘ106個のRaji細胞の注
射は約20日後に後肢麻痺を起こす。すなわちRaji細胞系は疾患をより早く形成す
る。そこで我々は他のモデルで報告されているのと同様の細胞投与量の１ｘ106
でのRaji細胞の投与と、Daudi ＳＣＩＤモデルに報告されている未処理動物のも
のと同様の生存期間である約１カ月のマウスの生存をに可能とする低い細胞投与
量の結果を報告するものである。より高い投与量では、抗ＣＤ48抗体による処理
は後肢麻痺に到る時間が40％延長された。より低い細胞投与量実験では抗ＣＤ48
抗体による32日の処理によりマウスの大多数が長期間の生存を示し、未処理動物
よりも少なくとも10倍長くマウスが生存した後に後肢麻痺が起った。我々は抗体
がずっと低い投与量でも活性であることも示したものである。
ＳＣＩＤマウスにおける抗ＣＤ48抗体の治療効果は、Raji細胞に結合しないア
イソタイプ対照抗体が治療効果を有しないことから、抗原特異的であるようであ
る。抗ＣＤ48抗体の細胞障害効果は、該抗体が抗原を変調できないこと、マウス
エフェクター機能によるマウスＩｇＧ2aの有効な相互作用等のいくつかの特徴に
依存するようである。SIＣＤマウスは有意なＴ細胞及びＢ細胞応答を欠くので、
起こり得るエフェクター応答は腫瘍細胞に対するモノクローナル抗体の直接の毒
性であるか、例えぱ好中球、マクロファージあるいはナチュラルキラー細胞のよ
うな細胞障害活性を有するその他の細胞を集合させることである。抗ＣＤ48抗体
はRaji細胞に対する直接の細胞障害性を有していないので（未発表の結果）、エ
フェクター細胞を集合させることが観察された抗腫瘍効果の最も可能性の高い説
明である。
我々はまた、Ｆｃ部分がヒトＦｃ領域に置き換えられた抗体を製造することに
より、マウスモノクローナル抗体を治療に使用することに関するいくつかの問題
を解決することを試みた。キメラ抗体は、当初のマウス抗体と比較して、より高
いエフェクター機能、より長い血清半減期、より低い免疫原性(14,15,16)等の臨
床的使用のための改良された特徴を有していると予測される。ヒトＩｇＧ1定常
領域からなるキメラ抗体は、多くの場合において、ヒトエフェクター細胞を使用
したＡＤＣＣアッセイにおいてより高いin vitro細胞殺傷活性を示した(14,15)
。キメラ抗体は通常、ヒトにおいてマウス抗体よりも少なくとも５倍長い半減期
を有しており(16)、75％ヒトであるが、キメラ抗体に対する免疫反応はマウスの
対応物よりもずっと低いことが多い(16)。
マウスＦｃをヒトＦｃ領域に置き換えることにより、in vitro及びin vivoに
おいて新規あるいは増強されたエフェクター機能を獲得することが可能となる。
これはin vitroで明確に示され、ヒトエフェクター細胞を使用して、キメラ抗体
はマウスのものと比較して著しく増強されたＣＤ48+Raji細胞の溶解を媒介する
ことができた。同様の結果がいくつかのキメラ抗体について得られている(30)。
この抗体のマウスＩｇＧ2aアイソタイプがマウスにおいてマウスエフェクター機
能を媒介することにおいて最も有効であろうと予測されるので(27)、我々はマウ
スのものである抗体をＳＣＩＤマウスにおいて試験した。
すなわち我々は、ＣＤ48に対する抗体がＳＣＩＤマウスにおいて強力な抗腫瘍
効果を媒介することができ、この抗体のキメラであるものがヒトＰＢＭＣエフェ
クター細胞により強力なＡＤＣＣ活性を媒介することができることを示した。こ
れらの性質は、抗ＣＤ48抗体がリンパ性白血病、リンパ腫等を含む多くの疾患の
治療に有用であり得ることを示唆している。
当業者であれば、広範に記載された本発明の概念及び範囲を逸脱することなく
、具体的な態様に記載された本発明について多数の変形及び／または修飾が可能
であることを理解するであろう。従ってここに示した態様はあらゆる意味におい
て例示的なものであり、限定的なものではない。
参考文献
１．Longo ＤＬ:非ホジキンリンパ腫（Non-Hodgkin's lymphoma.）Current Opin
ion in Hematolagy 1:295，1994
２．Henniker ＡＪ，Bradstock ＫＦ，Grimsley Ｐ，Atkinson ＭＫ:ヒトリンパ
球上の新規な非線状抗原：二種のＣＤ-48モノクローナル抗体による特性化（A n
ovel non-lineage antigen on humaan leucocytes:characterization with two
ＣＤ-48 monoclonal antibodies.）Disease Markers 8:179，1990
３．Vaughan ＨＡ，Thompson ＣＨ，Sparrow ＲＬ，McKenzie IFC:HuLy-ｍ3-ヒ
ト白血球抗原（HuLy-ｍ3-a human leukocyte antigen.）Transplantation 36:44
6，1983
４，Hadam ＭＲ:Ｎ10 Cluster report:ＣＤ48、ＮＫ-及び非線状抗原（ＣＤ48，
ＮＫ-and non-lineage antigens.）Fourth international workshop and confer
ence on human leukocyte differentiation antigens P661，1989
５．Kato Ｋ，Koyanagi Ｍ，Okada Ｈ，Takanashi Ｔ，Wong YW，Williams ＡＦ
,Okumura Ｋ，Yagita Ｈ:ＣＤ48はマウスＣＤ2の対抗受容体でありＴ細胞活性化
に関与する（ＣＤ48 is a counter-receptor for mouse ＣＤ2 and is involved
in Ｔ cell activation.）Ｊ Exp Med 176:1241，1992
６:Arulanandam ＡＲＮ，Moingeon Ｐ，Concino ＭＦ，Recny MA，Kato Ｋ，Yag
ita Ｈ，Koyasu Ｓ，Reinherz ＥＬ:可溶性マルチマー組換えＣＤ2タンパク質は
、ヒトＣＤ2に対する低アフィニティリガンドとしてＣＤ48を同定する：ヒト及
びマウスの進化の間のＣＤ2リガンドの分岐（A soluble multimeric recombinan
t ＣＤ2 protein identifies ＣＤ48 as a low affinity ligand for human Ｃ
Ｄ2:d
ivergence of ＣＤ2 ligands during the evolution of humans and mlce.）Ｊ
Ｅｘｐ Med 177:1439，1993
７．Sandrin ＭＳ，Mouhtouris Ｅ，Vaughan ＨＡ，Warren HS，Parish ＣＲ:Ｃ
Ｄ48はヒトＣＤ2に対する低アフィニティリガンドである（ＣＤ48 is a low aff
inity ligand for human ＣＤ2.）Ｊ Immunol 151;4606，1993
８．Korinek Ｖ，Stefanova Ｉ，Angelisova Ｐ，Hilgert Ｉ，Horejsi Ｖ:ヒト
白血球抗原ＣＤ48(ＭＥＭ-102)は活性化マーカーBlast-1と密接に関連している
（The human leucocyte antigen ＣＤ48（ＭＥＭ-102）is closely related to
the activation marker Blast-1.）Immunogenetics 33:108，1991
９．Vaughau ＨＡ，Henning ＭＭ，Purcell ＤＦＪ，McKenzie IFC，Sandrin Ｍ
Ｓ:ＣＤ48のｃＤＮＡクローンの単離（The isolation of ｃＤＮＡclones for
ＣＤ48．Immunogenetics 33:113，1991
10．Stauton ＤＥ and Lawson ＤＡＥＭＢＯ（1987）ＥＭＢＯ Ｊ．6．3695-370
1
11．Grossbard ＭＬ，Press ＯＷ，Appelbaum ＦＲ，Bernstein ＩＤ，Nadler
ＬＭ:モノクローナル抗体による白血病及びリンパ腫の治療（Monoclonal antibo
dy-based therapies of leukemia and lymphoma.）Blood 80:863，1992
12．Maloney ＤＧら、再発性Ｂ細胞リンパ腫患者におけるキメラ抗Ｃｄ20モノク
ローナル抗体(ＩＤＥＣ-Ｃ2Ｂ8)の上昇する単一投与量注射を使用したフェーズ
Ｉ臨床試験（Phase I clinical trail using escalating single dose infusion
of chimeric anti-Ｃｄ20 monoclonal antibody（ＩＤＥＣ-Ｃ2Ｂ8)in patient
s with recurrent Ｂ-cell lymphoma.）Blood，84，2457-2466.
13．Greenaway Ｓ，Henniker ＡＪ，Walsh Ｍ，Bradstock ＫＦ:慢性リンパ性白
血病患者におけるヒト補体を固定する二種のマウスモノクローナル抗体の予備臨
床試験（A pilot clinical trlal of two murine monoclonal antibodies fixin
g human complement in patients with chronic lymphatic leukemia.）Leukemi
a and Lymphoma 13:323，1994
14，Martin ＪＳ，Dyer Ｇら、(1989)リンパ系悪性腫瘍患者におけるin vivoで
のCampath-1抗体の効果；抗体アイソタイプの影響（Effect of Campath-1 antib
odies in-vivo in patients with lymphoid malignancies;Influences of antib
ody isotope）Blood，73，1431-1439.
15．Bruggemann Ｍ，Williams ＧＴら、(1987)キメラ抗体のマッチしたセットを
使用したヒト免疫グロブリンのエフェクター機能の比較（Comparison of the ef
fector functions of human immunogloblins using a matched set of chimeric
antibodies）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ.，166，1351-1361.
16．Shin ＳＵ（1991）キメラ抗体：ドラッグデリバリー及び免疫療法における
可能性のある用途（Chimeric antibody:Potential applications for drug deli
very and immunotherapy）Biotherapy．3，43-53.
17．Vaughan ＨＡ，Thompson ＣＨ，Sparrow ＲＬ，McKenzie ＩＦＣ:HuLy-ｍ3-
ヒト白血球抗原（HuLy-ｍ3-a human leukocyte antigen.）Transplantation 36:
446，1983
18．Harlow Ｅ and Lane Ｄ抗体：実験室マニュアル（Antibodies:Ａ laborator
y manual.）Cold Spring Harbour Laboratory，USA．1988.
19．Chomczynski Ｐ and Sacchi Ｎ，酸グアニジニウムチオシアネート-フェノ
ール-クロロホルム抽出によるＲＮＡ単離の一段階法（Single step method of
ＲＮＡ isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chlorofolm extra
cti
on）Anal．Biochem．1987;162：156-159
20．Marchuk Ｄら、Ｔベクターの構築、未修飾ＰＣＲ産物の直接のクローニング
のための迅速で一般的な系（Construction of Ｔ vectors，a rapid and genera
l system for direct cloning of unmodified ＰＣＲ products）Nucleic Acid
Research．(1991)19，1154.
21．Maeda Ｈ，Matsushita Ｓ，Eda Ｙ，Kimachi Ｋ，Tokiyoshi Ｓ，Bendig Ｍ
Ｍ:ＨＩＶ中和活性を有する新形態ヒト抗体の構築（Construction of reshaped
human antibodies with ＨＩＶ-neutralizing activity.）Ｈｕｍ Antibod Hybr
idomas 2:124，1991
22．Telerman Ａ，Amson ＲＢ．Romasco Ｆ，Wybran Ｊ，Galand Ｐ，Mosselman
s Ｒ:ヒトＴリンパ球受容体のインターナリゼーション（Internalization of hu
man Ｔ lymphocyte receptors.）Eur Ｊ Immunol 17:991，1987
23．Sun ＨＰ，Smith ＧＭ，準備中の原稿
24．Greenwood Ｊ and Clark Ｍ．ヒトにおける予防及び治療用途のための抗体
分子の抗体製造における組換えヒトＩｇＧサブクラス抗体のマッチしたヤットの
エフェクター機能（Effector functions of matched sets of recombinant huma
n ＩｇＧ subclass antibodies in Antibody Engineering of antibody molecul
es for prophylactic and therapeutic applications in man）(1993)Ｅd by Cl
ark Ｍ．Academic Press.
25．Huang Ｓ andTerstappen ＬＷＭＭ．単一のヒト骨幹細胞からの造血微細環
境と造血幹細胞の形成（Formation of harmatopoietic microenvironment and h
aematopietic stem cells from single human bone stem cells.）Nature（1992
）360，745-749.
26 Thorley-Lawson，ＤＡ，Schooley ＲＴ，Bhan ＡＫ and Nadler ＬＭ（1982
）Cell，30，415-425.
27．Herlyn，Ｄ and Koprowski Ｈ（1982）ＩｇＧ2aモノクローナル抗体はエフ
ェクター細胞との相互作用を介してヒト腫瘍増殖を阻害する（ＩｇＧ2a monoclo
nal antibodies inhibit human tumour growth through interaction with effe
ct or cells.）Ｊ Biol Chem 79，4761-4765.
28．Kawata Ａ，Yoshida Ｍら、(1994)ヒトＢ白血病/リンパ腫の新規なＳＣＩＤ
マウス及びヌードマウスモデルの樹立及び免疫毒素及びモノクローナル抗体によ
る腫瘍の効果的な治療：モノクローナル抗体の抗腫瘍効能のＳＣＩＤマウス及び
ヌードマウスモデルの間における著しい相違（Establishment of New ＳＣＩＤ
and nude mouse models od human Ｂ leukemia/lymphoma and effective therap
y of the tumours with immunotoxin and monoclonal antibody:Marked differe
nce between the ＳＣＩＤ and nude mouse models in the antitumour efficac
y of monoclonal antibody.）Cancer Research．54，2688-2694.
29．Gretie ＧＡら、ＳＣＩＤマウスにおけるヒトＢ細胞腫瘍(Daudi)の散在性あ
るいは局在性増殖（Disseminated or localized growth of a human Ｂ cell tu
mour（Daudi）in ＳＣＩＤ mice.）Int．Ｊ．Cancer（1990）45，481-485.
30．Mount ＰＦ，Sutton ＶＲら、(1994)キメラ抗結腸癌抗体c30.6はscid/scid
マウスにおいてヒト結直腸癌異種移植物の増殖を阻害する（Chimeric anti-colo
n cancer antibody c30.6 inhibits the growth of human colorectal cancer x
enografts in scid/scid mice.）Cancer Rasearch，54，6160-6166.
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ０７Ｋ 16/30 Ｃ１２Ｐ 21/08
16/46 Ａ６１Ｋ 43/00
Ｃ１２Ｎ 15/09 37/02
Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，Ｕ
Ｓ
(72)発明者 スン，ハイピン
オーストラリア国 2010 ニューサウスウ
ェールズ州，ダーリングハースト，ビクト
リア ストリート 384