JP2023503624A - 新規抗ｃｄ３／抗ｅｇｆｒ二重特異性抗体及びその使用 - Google Patents

新規抗ｃｄ３／抗ｅｇｆｒ二重特異性抗体及びその使用 Download PDF

Info

Publication number
JP2023503624A
JP2023503624A JP2022530934A JP2022530934A JP2023503624A JP 2023503624 A JP2023503624 A JP 2023503624A JP 2022530934 A JP2022530934 A JP 2022530934A JP 2022530934 A JP2022530934 A JP 2022530934A JP 2023503624 A JP2023503624 A JP 2023503624A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
antigen
binding portion
acid sequence
egfr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2022530934A
Other languages
English (en)
Inventor
チン メイ
チュオチー ワン
チン リー
チエンチン シュイ
Original Assignee
ウーシー バイオロジクス アイルランド リミテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ウーシー バイオロジクス アイルランド リミテッド filed Critical ウーシー バイオロジクス アイルランド リミテッド
Publication of JP2023503624A publication Critical patent/JP2023503624A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06F—ELECTRIC DIGITAL DATA PROCESSING
    • G06F16/00—Information retrieval; Database structures therefor; File system structures therefor
    • G06F16/20—Information retrieval; Database structures therefor; File system structures therefor of structured data, e.g. relational data
    • G06F16/23—Updating
    • G06F16/2365—Ensuring data consistency and integrity
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06F—ELECTRIC DIGITAL DATA PROCESSING
    • G06F16/00—Information retrieval; Database structures therefor; File system structures therefor
    • G06F16/20—Information retrieval; Database structures therefor; File system structures therefor of structured data, e.g. relational data
    • G06F16/25—Integrating or interfacing systems involving database management systems
    • G06F16/254—Extract, transform and load [ETL] procedures, e.g. ETL data flows in data warehouses
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06F—ELECTRIC DIGITAL DATA PROCESSING
    • G06F16/00—Information retrieval; Database structures therefor; File system structures therefor
    • G06F16/20—Information retrieval; Database structures therefor; File system structures therefor of structured data, e.g. relational data
    • G06F16/27—Replication, distribution or synchronisation of data between databases or within a distributed database system; Distributed database system architectures therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Abstract

本開示において、ＣＤ３及びＥＧＦＲに対する二重特異性抗体、該抗体をコードする核酸分子、該抗体を発現するために使用される発現ベクター及び宿主細胞を提供する。本開示の抗体は、免疫機能の調節によりＣＤ３関連及び／又はＥＧＦＲ関連疾患の治療のための強力な薬剤を提供する。【選択図】図１６

Description

関連出願
本願は、２０１９年１１月２９日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１９／１２１８６９号の利益を主張し、これは全文を参照することにより本明細書に援用されるものとする。
配列リスト
本願を、電子的形態の配列リストと共に出願する。配列リストの全内容は、参照することにより本明細書に援用される。
技術分野
本願は、概して、抗体に関する。より詳細には、本願は、ＣＤ３及びＥＧＦＲに対する二重特異性抗体、この調製方法、及び二重特異性抗体の使用に関する。
上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）は、広範囲のヒト組織内で発現され、その過剰発現は、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、頭頸部がんなどの上皮細胞起源のいくつかの悪性腫瘍と関連する。そのリガンドＥＧＦとの結合により、ＥＧＦＲは、不活性単量体から活性ホモ二量体又はヘテロ二量体へ移行し、次いで、チロシンリン酸化及び下流シグナル伝達を誘導して腫瘍細胞無制限増殖をもたらす。２つのＥＧＦＲ標的抗体、セツキシマブ（アービタックス）及びパニツムマブ（ベクティビックス）は、結腸がん及び頭頸部がんの治療のため米国食品医薬品局により承認された。
臨床統計によれば、様々な抗腫瘍活性は現存のＥＧＦＲ特異的治療抗体で観察され、難治性又は再発性ＥＧＦＲ発現腫瘍は期待外れの臨床転帰であると判明した。特に、結腸直腸がんの約４０～５０％を含むＥＧＦＲ変異、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ変異を有する患者は、抗ＥＧＦＲ治療抗体に応答しない。
Ｔ細胞は、腫瘍細胞に対するＴ細胞認識及び活性化後、タンパク質分解酵素（グランザイム）及び孔形成タンパク質（パーフォリン）などの広範囲の細胞傷害性効果により腫瘍細胞の排除及び腫瘍増殖の制御において極めて中心的役割を果たす。Ｔ細胞を標的とする、特に、Ｔ細胞のＣＤ３分子を標的とするモノクローナル抗体（ＯＫＴ３など）は、ＣＤ３をベースとするＢＩＴＥモノクローナル抗体及びＣＡＲ－Ｔ並びにＣＤ３媒介二重特異性抗体など、ますます有望な免疫治療手段になった。ＯＫＴ３などのヒトＣＤ３に対して特異的なマウスモノクローナル抗体（Kung et al., Science, 206: 347-9(1979)）は、治療のために開発された第一世代ＣＤ３抗体であった。ＯＫＴ３は強力な免疫抑制効果を有するが、その臨床使用は、その免疫原性及び***促進的可能性と関連がある重篤な副作用により妨害された（Chatenoud, Nature Reviews, 3: 123-132(2003)）。ＯＫＴ３は、それ自体の迅速なクリアランス及び中和を促進する抗グロブリン応答を誘導した（Chatenoud et al.,Eur.J.Immunol.,137:830-8(1982)）。加えて、ＯＫＴ３は、インビトロでＴ細胞増殖及びサイトカイン産生を誘導し、インビボでサイトカインの大規模放出をもたらした（Hirsch et al., J. Immunol, 142: 737-43(1989)）。かかる重篤な副作用は、移植におけるＯＫＴ３のより広範な使用並びに自己免疫などの他の臨床分野へのその使用拡大を限定した。ＣＤ３（Ｔ細胞活性化）及びＥＧＦＲを標的とする二重特異性抗体は、難治性又は再発性ＥＧＦＲ発現腫瘍を有する患者ための代替となる治療レジメンを提供し得る。
したがって、セツキシマブ（アービタックス）及びパニツムマブ（ベクティビックス）治療などのＥＧＦＲモノクローナル抗体に対する耐性又は効果がない腫瘍を有する患者のための代替となる免疫治療ストラテジーとしてＣＤ３及びＥＧＦＲを標的とする二重特異性抗体の開発によるこの満たされていない臨床的に高い必要性に取り組むための緊急のニーズがある。
本開示は、有望な治療効果を提供することができるＥＧＦＲ及びＣＤ３二重結合活性を組み合わせる二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）を確立することを目的とする。ＢｓＡｂはＥＧＦＲと結合し、ＥＧＦＲ及びそのリガンド間の相互作用を遮断することができ、ＥＧＦＲ発現腫瘍細胞（野生型ＥＧＦＲを発現する腫瘍細胞及び変異ＥＧＦＲ多様体を発現する腫瘍細胞の両方）に細胞傷害性Ｔ細胞を向け直し、その後、弱いオフ腫瘍毒性を用いてより特異的及び効果的に腫瘍細胞を破壊する。
広い意味では、本開示は、改良された有効性を有する抗ＣＤ３及び抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体、該二重特異性抗体を含む化合物、組成物及び製造物品、該抗体の製造方法を対象とする。本開示により提供される利益は抗体療法及び診断の分野に幅広く適用でき、様々な標的と反応する抗体と併せて使用してよい。
本開示は、ＣＤ３及びＥＧＦＲに対する二重特異性抗体を提供する。本開示は、抗ＣＤ３／抗ＥＧＦＲ抗体をコードする単離ヌクレオチド配列、二重特異性抗体の発現のために使用される発現ベクター及び宿主細胞も提供する。本開示は、抗ＣＤ３／抗ＥＧＦＲ抗体の調製方法を更に提供し、そのインビボ及びインビトロ機能を検証する。本開示の二重特異性抗体は、増殖性疾患、免疫不全、又は感染症を含む疾病を予防又は治療するための非常に強力な薬剤を提供する。いくつかの実施形態では、疾病は、ＣＤ３関連及び／又はＥＧＦＲ関連疾患である。
いくつかの態様では、本開示は、ＣＤ３と特異的に結合する第一抗原結合部位及びＣＤ３と異なる抗原と特異的に結合する第二抗原結合部位を含む二重特異性抗体又はその抗原結合部を提供する。
いくつかの態様では、ＣＤ３と異なる抗原は、ＥＧＦＲである。
いくつかの態様では、本開示は、第二抗原結合性部分と関連する第一抗原結合性部分を含む二重特異性抗体又はその抗原結合部を提供し、
第一抗原結合性部分は、ＣＤ３抗原結合性部分であり、
抗体重鎖ＣＨ１ドメインと機能的に連結された第一抗体の第一重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）、及び
抗体軽鎖定常（ＣＬ）ドメインと機能的に連結された第一抗体の第一軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）を含み、
第二抗原結合性部分は、ＥＧＦＲ抗原結合性部分であり、
Ｎ末端からＣ末端へ、第一Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域（Ｃ１）と機能的に連結された第二抗体の第二重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）を含む第一ポリペプチド、及び
Ｎ末端からＣ末端へ、第二ＴＣＲ定常領域（Ｃ２）と機能的に連結された第二抗体の第二軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）を含む第二ポリペプチドを含み、
Ｃ１及びＣ２は、二量体を安定化することができる非天然鎖間ジスルフィド結合により二量体を形成することができ、
ＣＤ３抗原結合性部分は、抗ＣＤ３抗体から誘導され、
ａ）配列番号１により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる重鎖ＣＤＲ１、
ｂ）配列番号２により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる重鎖ＣＤＲ２、
ｃ）配列番号３により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる重鎖ＣＤＲ３、
ｄ）配列番号４により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ１、
ｅ）配列番号５により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ２、及び
ｆ）配列番号６により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ３
を含み、並びに
ＥＧＦＲ抗原結合性部分は、抗ＥＧＦＲ抗体から誘導され、
ａ）配列番号７により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる重鎖ＣＤＲ１、
ｂ）配列番号８により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる重鎖ＣＤＲ２、
ｃ）配列番号９により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる重鎖ＣＤＲ３、
ｄ）配列番号１０により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ１、
ｅ）配列番号１１により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ２、及び
ｆ）配列番号１２により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ３
を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＤ３抗原結合性部分及びＥＧＦＲ抗原結合性部分を含む二重特異性抗体又はその抗原結合部を提供し、
前記ＣＤ３抗原結合性部分は、重鎖ＣＨ１定常領域ドメインと機能的に連結された抗ＣＤ３抗体の第一ＶＨ（ＶＨ１）、及び軽鎖定常領域（ＣＬ）と機能的に連結された抗ＣＤ３抗体の第一ＶＬ（ＶＬ１）を含むＦａｂを含み、
前記ＥＧＦＲ抗原結合性部分は、第一Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域（Ｃ１）と機能的に連結された抗ＥＧＦＲ抗体の第二重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）、及び第二ＴＣＲ定常領域（Ｃ２）と機能的に連結された抗ＥＧＦＲ抗体の第二軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）を含むキメラＦａｂを含み、Ｃ１及びＣ２は、前記二量体を安定化することができる非天然鎖間ジスルフィド結合により二量体を形成することができ、
（Ａ）前記ＣＤ３抗原結合性部分は：
配列番号１により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる重鎖ＣＤＲ２、
配列番号３により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる重鎖ＣＤＲ３、
配列番号４により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号６により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ３
を含み、並びに
（Ｂ）前記ＥＧＦＲ抗原結合性部分は：
配列番号７により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号８により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる重鎖ＣＤＲ２、
配列番号９により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる重鎖ＣＤＲ３、
配列番号１０により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１１により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１２により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ３
を含む。
いくつかの実施形態では、第一Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域（Ｃ１ドメイン）は、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＴＣＲβ定常領域を含み、１つの好ましい実施形態では、Ｃ１ドメインは、配列番号２９により表されるＴＣＲβ定常領域を含む又はそれからなる。
いくつかの実施形態では、第二Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域（Ｃ２ドメイン）は、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＴＣＲα定常領域を含み、１つの好ましい実施形態では、Ｃ２ドメインは、配列番号３０により表されるＴＣＲα定常領域を含む又はそれからなる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている二重特異性抗体又はその抗原結合部は、Ｆｃ領域を更に含み、Ｆｃ領域は、ＣＤ３抗原結合性部分のＣＨ１ドメインと機能的に連結されている。
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域などのヒトＦｃ領域、特に、ヒトＩｇＧ４又はＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。好ましくは、Ｆｃ領域は、変異Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＤ３抗原結合性部分及びＥＧＦＲ抗原結合性部分を含む二重特異性抗体又はその抗原結合部を提供し、
（Ａ）前記ＣＤ３抗原結合性部分は：
配列番号１により表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２により表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、
配列番号３により表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、
配列番号４により表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５により表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号６により表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
を含み、並びに
（Ｂ）前記ＥＧＦＲ抗原結合性部分は：
配列番号７により表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号８により表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、
配列番号９により表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、
配列番号１０により表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１１により表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１２により表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
を含む。
特定の実施形態では、二重特異性抗体のＣＤ３抗原結合性部分は、抗ＣＤ３抗体から誘導され、
（ｉ）配列番号１３を含む又はそれからなる重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）配列、及び
（ｉｉ）配列番号１４を含む又はそれからなる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）配列
を含む。
特定の実施形態では、二重特異性抗体のＥＧＦＲ抗原結合性部分は、抗ＥＧＦＲ抗体から誘導され、
（ｉ）配列番号１５を含む又はそれからなる重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）配列、及び
（ｉｉ）配列番号１６を含む又はそれからなる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）配列
を含む。
特定の実施形態では、二重特異性抗体又は抗原結合部は、第二抗原結合性部分と関連する第一抗原結合性部分を含み、
第一抗原結合性部分は、
（ｉ）配列番号１３を含む又はそれからなる重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）配列、及び
（ｉｉ）配列番号１４を含む又はそれからなる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）配列；
を含むＣＤ３抗原結合性部分であり、
第二抗原結合性部分は、
（ｉ）配列番号１５を含む又はそれからなる重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）配列、及び
（ｉｉ）配列番号１６を含む又はそれからなる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）配列
を含むＥＧＦＲ抗原結合性部分である。
いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合性部分は、
（ｉ）配列番号１３と少なくとも８５％配列同一性、例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は更に１００％の配列同一性を有し、同時にＣＤ３との結合特異性を維持する重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）配列；及び
（ｉｉ）配列番号１４と少なくとも８５％配列同一性、例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は更に１００％の配列同一性を有し、同時にＣＤ３との結合特異性を維持する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）配列
を含む。
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合性部分は、
（ｉ）配列番号１５と少なくとも８５％配列同一性、例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は更に１００％の配列同一性を有し、同時にＥＧＦＲとの結合特異性を維持する重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）配列；及び
（ｉｉ）配列番号１６と少なくとも８５％配列同一性、例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は更に１００％の配列同一性を有し、同時にＥＧＦＲとの結合特異性を維持する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）配列
を含む。
特定の実施形態では、二重特異性抗体又は抗原結合部は、第二抗原結合性部分と関連する第一抗原結合性部分を含み、
第一抗原結合性部分は、
（ｉ）配列番号１３からなる重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）配列、及び
（ｉｉ）配列番号１４からなる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）配列；
を含むＣＤ３抗原結合性部分であり、
第二抗原結合性部分は、
（ｉ）配列番号１５からなる重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）配列、及び
（ｉｉ）配列番号１６からなる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）配列
を含むＥＧＦＲ抗原結合性部分である。
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体又はその抗原結合部は、４つのポリペプチド鎖：
ｉ）ＶＨ１－ＣＨ１－ヒンジ１－ＣＨ２－ＣＨ３により表される第一重鎖と；
ｉｉ）ＶＬ１－ＣＬにより表される第一軽鎖と；
ｉｉｉ）ＶＨ２－Ｃ１－ヒンジ２－ＣＨ２－ＣＨ３により表される第二重鎖と；
ｉｖ）ＶＬ２－Ｃ２により表される第二軽鎖と、
を含み；
ｉ）のＶＨ１－ＣＨ１部分及びＶＬ１－ＣＬは抗ＣＤ３アーム（Ｔ３と呼ぶ、図１参照）を形成し、ｉｉｉ）のＶＨ２－Ｃ１及びＶＬ２－Ｃ２は抗ＥＧＦＲアーム（Ｕ１と呼ぶ、図１参照）を形成し；
Ｃ１及びＣ２は、少なくとも１つの非天然鎖間結合を含む二量体を形成することができ、２つのヒンジ領域及び／又は２つのＣＨ３ドメインは、二量体形成を促進することができる１つ以上の鎖間結合を形成することができる。
特定の実施形態では、二重特異性抗体又はその抗原結合部は、４つのポリペプチド鎖：
ｉ）配列番号２３により表される第一重鎖又は配列番号２３と少なくとも８５％、例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは更に１００％の配列同一性を有し、同時にＣＤ３との結合特異性を維持するアミノ酸配列と；
ｉｉ）配列番号２２により表される第一軽鎖又は配列番号２２と少なくとも８５％、例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは更に１００％の配列同一性を有し、同時にＣＤ３との結合特異性を維持するアミノ酸配列と；
ｉｉｉ）配列番号２４により表される第二重鎖又は配列番号２４と少なくとも８５％、例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは更に１００％の配列同一性を有し、同時にＥＧＦＲとの結合特異性を維持するアミノ酸配列と；
ｉｖ）配列番号２１により表される第一軽鎖又は配列番号２１と少なくとも８５％、例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは更に１００％の配列同一性を有し、同時にＥＧＦＲとの結合特異性を維持するアミノ酸配列と、
を含む。
特定の実施形態では、二重特異性抗体又はその抗原結合部は、４つのポリペプチド鎖：
ｉ）配列番号２３により表される第一重鎖と；
ｉｉ）配列番号２２により表される第一軽鎖と；
ｉｉｉ）配列番号２４により表される第二重鎖と；
ｉｖ）配列番号２１により表される第二軽鎖と、
を含む。
特定の実施形態では、二重特異性抗体又はその抗原結合部は、４つのポリペプチド鎖：
ｉ）配列番号２３により表される第一重鎖と；
ｉｉ）配列番号２２により表される第一軽鎖と；
ｉｉｉ）配列番号２４により表される第二重鎖と；
ｉｖ）配列番号２１により表される第二軽鎖と、
からなる。
いくつかの実施形態では、ＣＤ３及びＥＧＦＲ抗原を、とりわけ、カニクイザル、又はＣＤ３及びＥＧＦＲタンパク質から誘導することができる。好ましくは、ＣＤ３及びＥＧＦＲタンパク質は、ヒトＣＤ３及びＥＧＦＲタンパク質である。好ましい実施形態では、上記抗体は、同時にヒトＣＤ３及びＥＧＦＲタンパク質と特異的に結合することができる。
いくつかの実施形態では、第一Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域（Ｃ１ドメイン）は、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＴＣＲβ定常領域を含み、１つの好ましい実施形態では、Ｃ１ドメインは、配列番号２９により表されるＴＣＲβ定常領域を含む又はそれからなる。
いくつかの実施形態では、第二Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域（Ｃ２ドメイン）は、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＴＣＲα定常領域を含み、１つの好ましい実施形態では、Ｃ２ドメインは、配列番号３０により表されるＴＣＲα定常領域を含む又はそれからなる。
いくつかの実施形態では、Ｃ１ドメインは、配列番号２９のアミノ酸配列を含み、Ｃ２ドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｃ１ドメインは、配列番号２９のアミノ酸配列から成り、Ｃ２ドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列からなる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている二重特異性抗体又はその抗原結合部は、Ｆｃ領域を更に含み、Ｆｃ領域は、ＣＤ３抗原結合性部分のＣＨ１ドメインと機能的に連結されている。
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域などのヒトＦｃ領域、特に、ヒトＩｇＧ４又はＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。好ましくは、Ｆｃ領域は、変異Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている二重特異性抗体又はその抗原結合部は、ヒト化抗体である。
いくつかの態様では、本開示は、次の特性：
（ａ）高親和性で同時にヒトＣＤ３及びＥＧＦＲタンパク質と特異的に結合することと；
（ｂ）ヒトＣＤ３及び／又はカニクイザルＣＤ３タンパク質と特異的に結合することと；
（ｃ）ヒトＥＧＦＲ及び／又はカニクイザルＥＧＦＲタンパク質と特異的に結合することと；
（ｄ）抗ＣＤ３抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、これらの組合せ、並びにＣＤ３及びＥＧＦＲを標的とする他の二重特異性抗体と比較して、ＥＧＦＲ発現腫瘍細胞の存在下強力なＴ細胞活性化を誘導することができることと；
（ｅ）良好な熱安定性を提供し、ヒト血清中安定であることと；
（ｆ）抗ＣＤ３抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、これらの組合せ、並びにＣＤ３及びＥＧＦＲを標的とする他の二重特異性抗体と比較して、優れた抗腫瘍効果を提供することと
のうち１つ以上を有する二重特異性抗体又はその抗原結合部を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に定義されている二重特異性抗体又はその抗原結合部をコードする核酸配列を含む単離核酸分子を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＤ３結合性部分の重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）をコードする単離ヌクレオチド配列、ＣＤ３結合性部分の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）をコードする単離ヌクレオチド配列、ＥＧＦＲ結合性部分の重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）をコードする単離ヌクレオチド配列、及びＥＧＦＲ結合性部分の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）をコードする単離ヌクレオチド配列を提供する。
いくつかの実施形態では、ＣＤ３結合性部分の重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）をコードする単離ヌクレオチド配列は、配列番号１７により表され、ＣＤ３結合性部分の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）をコードする単離ヌクレオチド配列は、配列番号１８により表される。
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ結合性部分の重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）をコードする単離ヌクレオチド配列は、配列番号１９により表され、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）をコードする単離ヌクレオチド配列は、配列番号２０により表される。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＤ３結合性部分の重鎖をコードする単離ヌクレオチド配列であって、ＣＤ３結合性部分の重鎖をコードする単離ヌクレオチド配列は：
（Ａ）配列番号２３に記載されている重鎖をコードする核酸配列か；
（Ｂ）配列番号２７に記載されている核酸配列か；又は
（Ｃ）高ストリンジェンシー条件下、（Ａ）若しくは（Ｂ）の核酸配列の相補鎖にハイブリダイズした核酸配列を含む又はそれからなる、単離ヌクレオチド配列
を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＤ３結合性部分の軽鎖をコードする単離ヌクレオチド配列をであって、ＣＤ３結合性部分の軽鎖をコードする単離ヌクレオチド配列は：
（Ａ）配列番号２２に記載されている重鎖をコードする核酸配列か；
（Ｂ）配列番号２６に記載されている核酸配列か；又は
（Ｃ）高ストリンジェンシー条件下、（Ａ）若しくは（Ｂ）の核酸配列の相補鎖にハイブリダイズした核酸配列を含む又はそれからなる、単離ヌクレオチド配列
を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＥＧＦＲ結合性部分の重鎖をコードする単離ヌクレオチド配列であって、ＥＧＦＲ結合性部分の重鎖をコードする単離ヌクレオチド配列は：
（Ａ）配列番号２４に記載されている重鎖をコードする核酸配列か；
（Ｂ）配列番号２８に記載されている核酸配列か；又は
（Ｃ）高ストリンジェンシー条件下、（Ａ）若しくは（Ｂ）の核酸配列の相補鎖にハイブリダイズした核酸配列を含む又はそれからなる、単離ヌクレオチド配列
を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＥＧＦＲ結合性部分の軽鎖をコードする単離ヌクレオチド配列であって、ＥＧＦＲ結合性部分の軽鎖をコードする単離ヌクレオチド配列は：
（Ａ）配列番号２１に記載されている重鎖をコードする核酸配列か；
（Ｂ）配列番号２５に記載されている核酸配列か；又は
（Ｃ）高ストリンジェンシー条件下、（Ａ）若しくは（Ｂ）の核酸配列の相補鎖にハイブリダイズした核酸配列を含む又はそれからなる、単離ヌクレオチド配列
を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書で定義されている核酸分子を含むベクターを提供する。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示されている単離核酸分子又はベクターを含む宿主細胞を提供する。
いくつかの実施形態では、宿主細胞を、これに限定されないが、細菌細胞（例えば、グラム陰性又はグラム陽性菌などの真正細菌、例えば、エシェリキアなどの腸内細菌科、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、及び真菌細胞（例えば、酵母細胞、糸状菌細胞、その他）、植物細胞又は動物細胞など、原核生物又は真核生物微生物からの細胞から選択してよい。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書で定義されている二重特異性抗体又はその抗原結合部及び薬剤的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書で定義されている二重特異性抗体又はその抗原結合部の産生方法であって、前記方法は：
－上記宿主細胞内で二重特異性抗体又はその抗原結合部を発現させるステップと；
－前記宿主細胞から前記抗体又はその抗原結合部を単離するステップと
を含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書で定義されている二重特異性抗体又はその抗原結合部の産生方法であって、前記方法は：
本明細書で定義されている二重特異性抗体又はその抗原結合部をコードする核酸配列を含む単離核酸分子を含む宿主細胞内で抗体又は抗原結合部を発現させるステップと、
－前記宿主細胞から前記抗体又はその抗原結合部を単離するステップと
を含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書で定義されている二重特異性抗体又はその抗原結合部の産生方法であって、前記方法は：
－単離核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞内で抗体又は抗原結合部を発現させるステップであって、前記単離核酸分子は、本明細書で定義されている二重特異性抗体又はその抗原結合部をコードする核酸配列を含む、ステップと、
－前記宿主細胞から前記抗体又はその抗原結合部を単離するステップと
を含む方法を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、対象における免疫応答の調節方法であって、前記方法は、二重特異性抗体又はその抗原結合部又は本明細書で定義されている医薬組成物の有効量を前記対象に投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、対象における腫瘍細胞の増殖の阻害方法であって、前記方法は、二重特異性抗体又はその抗原結合部又は本明細書で定義されている医薬組成物の有効量を前記対象に投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、対象における増殖性疾患、免疫不全、又は感染症を含むＣＤ３関連及び／又はＥＧＦＲ関連疾患の予防又は治療方法であって、前記方法は、二重特異性抗体又はその抗原結合部又は本明細書で定義されている医薬組成物の有効量を前記対象に投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、増殖性疾患は、結腸がん、肺がん、肝がん、子宮頸がん、乳がん、卵巣がん、膵がん、メラノーマ、グリオブラストーマ、前立腺がん、食道がん、又は胃がんなどのがんである。
いくつかの実施形態では、感染症は、慢性感染症である。
いくつかの実施形態では、本明細書で定義されている二重特異性抗体若しくはその抗原結合部を、がん免疫療法において使用するため化学療法薬、放射線及び／又は他の薬剤と併用して投与してよい。
いくつかの態様では、本開示は、
ｉ）Ｔ細胞活性の回復など、免疫応答の調節において使用するため；
ｉｉ）ＥＧＦＲ発現腫瘍細胞の存在下Ｔ細胞活性化の増強において使用するため；及び／又は
ｉｉｉ）がん細胞に対する前記免疫応答のブーストなど、免疫応答の刺激において使用するための
二重特異性抗体又はその抗原結合部を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、増殖性疾患（がんなど）、免疫不全、又は感染症を含むＣＤ３関連及び／又はＥＧＦＲ関連疾患の治療又は予防において使用するための本明細書で定義されている二重特異性抗体又はその抗原結合部を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、増殖性疾患（がんなど）、免疫不全、又は感染症を含むＣＤ３関連及び／又はＥＧＦＲ関連疾患の診断において使用するための本明細書で定義されている二重特異性抗体又はその抗原結合部を提供する。いくつかの態様では、本開示は、対象における腫瘍細胞の免疫応答の調節又は増殖の阻害のための医薬品製造における、二重特異性抗体又はその抗原結合部の使用を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、増殖性疾患（がんなど）、免疫不全、又は感染症を含むＣＤ３関連及び／又はＥＧＦＲ関連疾患の治療又は予防のための医薬品製造における、本明細書で定義されている二重特異性抗体又はその抗原結合部の使用を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書で定義されている二重特異性抗体又はその抗原結合部を含む容器を備えるキットを提供する。
いくつかの実施形態では、増殖性疾患（がんなど）、免疫不全、又は感染症を含むＣＤ３関連及び／又はＥＧＦＲ関連疾患の治療又は診断のために、キットを使用する。
いくつかの実施形態では、ＣＤ３関連及び／又はＥＧＦＲ関連疾患は、ＥＧＦＲ関連固形腫瘍である。好ましい実施形態では、ＥＧＦＲ関連固形腫瘍は、高ＥＧＦＲ発現を特徴とする。
いくつかの実施形態では、キットは、使用説明書、及びキット中の構成要素の各々を区分けするパッケージを更に備える。
実施形態では、キットは、対象におけるＣＤ３関連及び／又はＥＧＦＲ関連疾患の検出、診断、進行、予防又は治療のための二重特異性抗体の使用説明書を更に備える。
前述は概要であり、したがって、必然的に単純化、一般化、及び詳細の省略を含み；その結果、当業者は、この要約はほんの例証であり、決して限定する意図はないと認識するだろう。本明細書に記載されている方法、組成物及び／又は機器及び／又は他の主題の態様、特徴、及び利点は、本明細書に記載されている教示において明白になるだろう。概要は、明細書中以下に更に記載される簡易に概念の選択を誘導するために提供される。この概要は、クレームの主題の主要な特徴又は必須の特徴を特定する意図もなく、クレームの主題の範囲を決定する助けとして使用されることも意図していない。更に、本明細書を通して引用されている全ての参考文献、特許及び公開特許出願の内容は、全文の参照により本明細書に援用される。
図１は、Ｗ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９の略図であり、Ｔ３は抗ＣＤ３アームであり、Ｕ１は抗ＥＧＦＲアームである。 図２は、Ｗ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示す。Ｍ：タンパク質マーカー；レーン１：非還元性；レーン２：還元性。 図３は、Ｗ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９のＳＥＣ－ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。 図４、それぞれ、Ｊｕｒｋａｔ．２Ｂ８及びＡ４３１細胞株を用いてＦＡＣＳにより測定された、ヒトＣＤ３（Ａ）及びＥＧＦＲ（Ｂ）に対するＷ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９の結合活性を示す。 図５は、それぞれ、カニクイザルＰＢＭＣ及びＥＧＦＲ発現安定ＣＨＯＫ１細胞株を用いてＦＡＣＳにより測定された、カニクイザルＣＤ３（Ａ）及びＥＧＦＲ（Ｂ）に対するＷ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９の結合活性を示す。 図６は、フローサイトメトリーにより、それぞれ、Ｊｕｒｋａｔ．２Ｂ８及びＡ４３１細胞で試験された、ヒトＣＤ３（Ａ）及びＥＧＦＲ（Ｂ）に対するＷ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９の結合活性を示す。 図７は、フローサイトメトリーにより前標識化されたＪｕｒｋａｔ．２Ｂ８及びＡ４３１細胞を用いて試験された、ＣＤ３及びＥＧＦＲ発現細胞に対するＷ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９の架橋結合活性を示す。 図８は、腫瘍細胞Ａ４３１（Ａ、高ＥＧＦＲ発現）及びＨＴ－２９（Ｂ、中程度ＥＧＦＲ発現）に対するＷ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９によるヒトＴ細胞活性化の結果を示し、ＨＣＣ１４１９細胞（陰性ＥＧＦＲ発現）をコントロールとして使用した。 図９は、腫瘍細胞Ａ４３１（Ａ）及びＨＴ－２９（Ｂ）に対するＷ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９によるカニクイザルＴ細胞活性化の結果を示し、ＨＣＣ１４１９細胞（陰性ＥＧＦＲ発現）をコントロールとして使用した。 図１０は、腫瘍細胞Ａ４３１（Ａ）、ＨＴ－２９（Ｂ）、ＭＣＦ－７細胞（Ｃ）及びＨＣＣ１４１９細胞（Ｄ）に対するＷ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９の細胞傷害性活性を示す。 図１１は、Ｊｕｒｋａｔ．２Ｂ８（Ａ及びＣ）及びＡ４３１細胞（Ｂ及びＤ）に対するＷ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９のＡＤＣＣ及びＣＤＣ能を示す。 図１２は、示差走査蛍光分析（ＤＳＦ）により測定されたＷ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９の熱安定性を示す。 図１３は、Ｗ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９の血清安定性を示す。 図１４は、ヒトＰＢＭＣ－ＨＴ２９のマウスモデルにおいて試験された投与後の相対的体重変化を示す。 図１５は、ヒトＰＢＭＣ－ＨＴ２９モデルにおいてＷ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９のインビボ抗腫瘍有効性試験の末梢ヒトＣＤ３のパーセンテージ（Ａ）及び末端ヒトＣＤ３のパーセンテージ（Ｂ）を示す。（Ａ）及び（Ｂ）では、棒の各群は、左から右へ、それぞれ、アイソタイプコントロール０．３ｍｇ／ｋｇ；パニツムマブ、０．３ｍｇ／ｋｇ；Ｗ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９、０．３ｍｇ／ｋｇ；及びＷ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９、０．０８ｍｇ／ｋｇからの結果を示す４つの棒からなる。 図１６は、ヒトＰＢＭＣ－ＨＴ２９のマウスモデルにおいて試験された投与後追跡された腫瘍増殖を示す。 図１７は、投与後の相対的動物体重変化を示す。アイソタイプ（０．１ｍｇ／ｋｇ）をネガティブコントロールとして使用し、パニツムマブ（０．１ｍｇ／ｋｇ）をポジティブコントロールとして使用する。 図１８は、投与後モニターされた腫瘍増殖を示す。アイソタイプ（０．１ｍｇ／ｋｇ）をネガティブコントロールとして使用し、パニツムマブ（０．１ｍｇ／ｋｇ）をポジティブコントロールとして使用する。 図１９は、単回投与ＰＫ試験におけるカニクイザル血清中のＷ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９濃度の結果を示す。 図２０は、投与後のＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の検出結果を示す。 図２１は、投与後のサイトカイン（すなわち、ＩＬ－２、ＩＮＦ－γ、ＴＮＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－５及びＩＬ－６）放出に対するＷ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９の効果を示す。
本開示を多くの異なる形態で具体化してよいが、本明細書において本開示の原理を例証するその特定の例証的実施形態を開示する。本開示は例証される特定の実施形態に限定されないことは強調されるべきである。さらに、本明細書で使用されるいずれものセクションの見出しは構成的目的のためだけであり、記載されている主題を限定すると解釈されないものとする。
本明細書において別段に定義されない限り、本開示との関連で使用される科学用語及び技術用語は、当業者により普通に理解される意味を有するべきである。更に、文脈上別の意味を必要とされない限り、単数形は複数形を含むべきであり、複数の用語は単数形を含むべきである。より詳細には、本明細書及び添付のクレームで使用されるとき、文脈上別の意味を明白に指示されない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は複数の参照対象を含む。したがって、例えば、「ａ ｐｒｏｔｅｉｎ（タンパク質）」は、複数のタンパク質を含み、「ａ ｃｅｌｌ（細胞）」と言うのは、細胞の混合物を含むなど。本願では、別段の指定がない限り、「又は（ｏｒ）」の使用は、「及び／又は（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味する。更に、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」並びに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」などの他の形態の使用は、非限定的である。加えて、本明細書及び添付のクレームで提示される範囲は、両終点及び終点間の全ての点を含む。
細胞及び組織培養、分子生化学、免疫学、微生物学、遺伝学及びタンパク質と核酸化学並びに本明細書に記載されているハイブリダイゼーションとの関連及びこれらの技術との関連で使用される命名法は当技術分野において周知なものであり普通に使用される。本開示の方法及び技術を、特に指定されない限り、総じて、当技術分野において周知の従来方法により、及び本明細書を通して引用及び考察されている様々な一般的及びより特定の参考文献に記載されているように行う。例えば、Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology,6th ed., W. B. Saunders Company(2010);Sambrook J.& Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual,3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.(2000); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc.(2002);Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.(1998);及びColigan et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc.(2003)参照。本明細書に記載されている分析化学、合成有機化学、並びに医薬品及び製薬化学との関連で使用される命名法、並びにこれらの実験室手順及び技術は、当技術分野において周知であり普通に使用されるものである。さらに、本明細書で使用されるいずれものセクションの見出しは構成的目的のためだけであり、記載されている主題を限定すると解釈されないものとする。
定義
本開示をより理解するために、関連用語の定義及び説明を以下の通り示す。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は本明細書において互換的に使用され、アミノ酸残基の重合体、又はアミノ酸残基の複数の重合体の集合体を表す。この用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の改変化学ミメティックであるアミノ酸重合体、並びに天然アミノ酸重合体及び非天然アミノ酸重合体に当てはまる。用語「アミノ酸」は、天然及び合成アミノ酸、並びに天然アミノ酸と同様な機能を有するアミノ酸類似物及びアミノ酸ミメティックを表す。天然アミノ酸は、遺伝子コードによりコードされたもの、並びに後で修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタメート、及びＯ－ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を有する化合物、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基と結合されたα－炭素、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを表す。かかる類似体は、修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）又は修飾ペプチド主鎖を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。α－炭素は、カルボニルなどの官能基と結合する第一炭素原子を表す。β－炭素は、α－炭素と結合した第二炭素原子を表し、この系は、ギリシャ文字を用いてアルファベット順に炭素を命名し続ける。アミノ酸ミメティックは、アミノ酸の一般化学構造と異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様に機能する化学化合物を表す。用語「タンパク質」は、通常、大きなポリペプチドを表す。用語「ペプチド」は、通常、短いポリペプチドを表す。ポリペプチド配列は、通常、ポリペプチド配列がアミノ末端（Ｎ末端）の左手端部になり；ポリペプチド配列がカルボン酸末端（Ｃ末端）になるように記載される。本明細書で使用されるとき、「ポリペプチド複合体」は、特定の機能を行うように関連付けられた１つ以上のポリペプチドを含む複合体を表す。特定の実施形態では、ポリペプチドは免疫関連である。
本明細書において用語「抗体」又は「Ａｂ」は広義の意味で使用され、ポリクローナル抗体、単一特異性及び多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を含む様々な抗体構造物を包含する。総じて天然インタクト抗体は、ジスルフィド共有結合及び非共有結合相互作用により結合された２つの重鎖（Ｈ）及び２つの軽鎖（Ｌ）ポリペプチド鎖を含むＹ形状の四量体タンパク質である。抗体の軽鎖を、κ及びλ軽鎖に分類してよい。重鎖を、μ、δ、γ、α及びεに分類してよく、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥとして抗体のアイソタイプを規定する。軽鎖及び重鎖では、可変領域は、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により定常領域と結合し、重鎖は、約３以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を更に含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶH）及び重鎖定常領域（ＣH）からなる。重鎖定常領域は、３ドメイン（ＣH１、ＣH２及びＣH３）からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶL）及び軽鎖定常領域（ＣL）からなる。ＶH及びＶL領域を、高頻度可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ））と呼ぶ）に更に分けることができ、比較的保存領域（フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ぶ）により間隔を置く。各ＶH及びＶLは、次に順：Ｎ末端からＣ末端へ、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で３ＣＤＲ及び４ＦＲからなる。各重鎖／軽鎖対の可変領域（ＶH及びＶL）は、それぞれ、抗原結合性部位を形成する。様々な領域又はドメイン中のアミノ酸の分布は、免疫学的関心のあるタンパク質のカバット配列（National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1987 and 1991))又はChothia & Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917;Chothia et al.,(1989) Nature 342:878-883における定義に従う。抗体は、異なる抗体アイソタイプ、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭ抗体であり得る。
本願に関連して互換的に使用される用語抗体の「抗原結合部」又は「抗原結合性フラグメント」は、完全長抗体が同じ抗原と結合するために完全長抗体と特異的に結合、及び／又は競合する抗原と特異的に結合する能力を保持する完全長抗体のフラグメントを含むポリペプチドを表す。総じて、Fundamental Immunology, Ch. 7(Paul, W., ed., the second edition, Raven Press, N. Y.(1989)を参照、これは全ての目的のため参照により本明細書に援用される。抗体の抗原結合性フラグメントを、例えば、マニピュレーション及び抗体可変及び必要に応じて定常ドメインをコードするＤＮＡの発現を含むタンパク質消化又は組換え遺伝子改変技術など、いずれかの適切な標準的技術を用いて完全抗体分子から誘導してよい。かかるＤＮＡは公知であり、及び／又は、例えば、商業的供給源、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であり、又は合成することができる。ＤＮＡを配列決定してよく、化学的に又は分子生物学的技術の使用によりマニピュレートして、例えば、１つ以上の可変及び／又は定常ドメインを適切な構造中に配置、又はコドンを導入、システイン残基を作成、アミノ酸を修飾、付加若しくは欠失するなどしてよい。
抗原結合性フラグメントの非限定的例としては：（ｉ）Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント；（ｉｖ）Ｆｖフラグメント；（ｖ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント；及び（ｖｉｉ）抗体の高頻度可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離相補性決定領域（ＣＤＲ））、又は限定連鎖ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４ペプチドが挙げられる。ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニ抗体（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）、ナノ抗体（ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ）（例えば、一価ナノ抗体、二価ナノ抗体、その他）、小モジュラー免疫医薬品（ＳＭＩＰ）、及びサメ可変ＩｇＮＡＲドメインなどの他の改変分子も、本明細書で使用されるとき、表現「抗原結合性フラグメント」内に包含される。特定の実施形態では、抗体の抗原結合性フラグメントは、少なくとも１つの定常ドメインと共有結合された少なくとも１つの可変ドメインを含んでよい。可変及び定常ドメインを、相互に直接的に結合してもよく、完全若しくは部分的ヒンジ又はリンカー領域により結合してもよい。ヒンジ領域は、一本鎖ポリペプチド分子中の隣接可変及び／又は定常ドメイン間の可動性又は半可動性連鎖をもたらす少なくとも２（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０以上）アミノ酸から成り得る。
本明細書で使用されるとき、抗体に関して用語「可変ドメイン」は、１つ以上のＣＤＲを含む抗体可変領域又はそのフラグメントを表す。可変ドメインはインタクト可変領域（ＨＣＶＲ又はＬＣＶＲなど）を含んでよいが、インタクト可変領域が抗原と結合又は抗原結合性部位を形成する能力をなお更に保持するもの以外含まないことも可能である。
本明細書で使用されるとき、用語「抗原結合性部分」は、１つ以上のＣＤＲを含む抗体の一部から形成される抗体フラグメント、又は抗原と結合するが、インタクト天然抗体構造を含まないその他の抗体フラグメントを表す。抗原結合性部分の例としては、可変ドメイン、可変領域、ディアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖフラグメント、ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）2、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化でディアボディ（ｄｓディアボディ）、多特異性抗体、ラクダ化単一ドメイン抗体、ナノ抗体、ドメイン抗体、及び二価ドメイン抗体が挙げられるが、これらに限定されない。抗原結合性部分は、親抗体が結合する同じ抗原と結合することができる。特定の実施形態では、抗原結合性部分は、１つ以上の異なるヒト抗体からフレームワーク領域にグラフト化された特定のヒト抗体から１つ以上のＣＤＲを含んでよい。さらに詳しくは、抗原結合性部分のフォーマットは、Spiess et al,2015（上記）、及びBrinkman et al.,mAbs,9(2),pp.182‐212(2017)に記載されており、その内容は全文の参照により本明細書に援用される。
抗体に関する「Ｆａｂ」は、ジスルフィド結合により一本鎖重鎖の可変領域及び第一定常領域に関連する一本鎖軽鎖（可変及び定常領域両方）からなる抗体の部分を表す。特定の実施形態では、軽鎖及び重鎖両方の定常領域を、ＴＣＲ定常領域により置換する。
「Ｆ（ａｂ’）2」は、Ｆａｂ’の二量体を表す。
抗体に関して「フラグメントディフィカルト（Ｆｄ）」は、軽鎖と結合してＦａｂを形成することができる重鎖フラグメントのアミノ末端半分を表す。
抗体に関して「Ｆｃ」は、ジスルフィド結合により第二重鎖の第二及び第三定常領域と結合された第一重鎖の第二（ＣＨ２）及び第三（ＣＨ３）定常領域からなる抗体の部分を表す。抗体のＦｃ部分は、ＡＤＣＣ、及びＣＤＣなどの様々なエフェクター機能に関与するが、抗原結合において機能しない。
抗体の用語における「ヒンジ領域」は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインと結合する重鎖分子の部分を含む。このヒンジ領域は、約２５アミノ酸残基を含み、可動性であり、したがって、２つのＮ末端抗原結合性領域が独立して動くことを可能とする。
本明細書で使用されるとき、「ＣＨ２ドメイン」は、例えば、従来の番号付け方式を用いてＩｇＧ抗体の約アミノ酸２４４からアミノ酸３６０まで伸びる重鎖分子の部分を表す（アミノ酸２４４～３６０、カバット番号付けシステム；及びアミノ酸２３１～３４０、ＥＵ番号付けシステム；Kabat, E., et al., U. S. Department of Health and Human Services (1983) 参照）。
「ＣＨ３ドメイン」は、ＩｇＧ分子のＣＨ２ドメインからＣ末端まで伸び、約１０８アミノ酸を含む。特定の免疫グロブリン分類、例えば、ＩｇＭ、はＣＨ４領域を更に含む。
抗体に関して「Ｆｖ」は、完全抗原結合性部位を有する抗体の最小フラグメントを表す。Ｆｖフラグメントは、一本鎖重鎖の可変ドメインと結合された一本鎖軽鎖の可変ドメインからなる。いくつかのＦｖ設計は、ｄｓＦｖを含んで提供され、２ドメイン間の会合は導入されたジスルフィド結合により促進され、ｓｃＦｖを、一本鎖ポリペプチドとして２ドメインを結合するためのペプチドリンカーを用いて形成することができる。対応する免疫グロブリン重鎖又は軽鎖の可変及び定常ドメインに関連した重鎖又は軽鎖免疫グロブリン鎖の可変ドメインを含むＦｖ構築物も産生した。また、Ｆｖを、多量体化してディアボディ及びトリボディを形成した（Maynard et al., Annu Rev Biomed Eng 2 339-376(2000)）。
「一本鎖Ｆｖ抗体」又は「ｓｃＦｖ」は、直接的又はペプチドリンカー配列により相互に連結された軽鎖可変領域及び重鎖可変領域からなる改変抗体を表す（Huston JS et al. Proc Natl Acad Sci USA,85:5879(1988)）。
特定の実施形態では、「ｓｃＦｖ二量体」は、１つの部分のＶHが他の部分のＶLと配位し、同じ抗原（又はエピトープ）又は異なる抗原（又はエピトープ）を標的とすることができる２つの結合部位を形成するように、別のＶH－ＶL部分と二量体化されたＶH－ＶL（ペプチドリンカーにより結合）を含む二価ディアボディ又は二価ＳｃＦｖ（ＢｓＦｖ）である。
他の実施形態では、「ｓｃＦｖ二量体」は、ＶH1－ＶL1が配位し、且つ、ＶH2－ＶL2が配位し、各配位対は異なる抗原特異性を有するように、ＶL1－ＶH2（ペプチドリンカーにより結合）と関連するＶH1－ＶL2（ペプチドリンカーにより結合）を含む二重特異性ディアボディである。
「ＳｃＦａｂ」は、一本鎖Ｆａｂフラグメント（ｓｃＦａｂ）の形成をもたらす、ポリペプチドリンカーにより軽鎖と結合されたＦｄとの融合ポリペプチドを表す。
「ｄｓＦｖ」は、一本鎖軽鎖の可変領域及び一本鎖重鎖の可変領域間の結合がジスルフィド結合であるジスルフィド安定化Ｆｖフラグメントを表す。いくつかの実施形態では、「（ｄｓＦｖ）2」又は「（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）」は、３ペプチド鎖：ペプチドリンカー（例えば、長鎖可動性リンカー）により結合された２つのＶH部分、及びジスルフィド架橋によりそれぞれ２つのＶL部分と結合された２つのＶH部分を含む。いくつかの実施形態では、ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’は、各ジスルフィド対重鎖及び軽鎖が異なる抗原特異性を有する二重特異性である。
「付加ＩｇＧ」は、ＩｇＧと融合されて二重特異性（Ｆａｂ）2－Ｆｃの形式を形成するＦａｂアームを有する融合タンパク質を表す。これは、コネクタを有するか又は有しないＩｇＧ分子のＣ末端又はＮ末端と融合されたＦａｂを有する「ＩｇＧ－Ｆａｂ」又は「Ｆａｂ－ＩｇＧ」を形成することができる。特定の実施形態では、付加ＩｇＧを、ＩｇＧ－Ｆａｂ4の形式に更に改変することができる（Brinkman et al.,2017（上記）参照）。
本明細書で使用されるとき、用語「抗ＣＤ３抗体」又は「ＣＤ３抗体」は、ＣＤ３、例えば、ヒトＣＤ３と結合することができる、本明細書で定義されている抗体を表す。
用語「ＣＤ３」及び「ＣＤ３タンパク質」は、本明細書において互換的に使用される。ＣＤ３タンパク質は、実際全てのＴ細胞内に存在する。ＣＤ３－ＴＣＲ複合体は、自然及び養子免疫応答におけるＴ細胞機能、並びに細胞及び体液性免疫機能を調節する。これらは、広範囲の細胞傷害性効果により病原体の排除及び腫瘍増殖の防除を含む。ＣＤ３ Ｔ細胞共受容体は、４つの別々の鎖：ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、及び２つのε鎖からなる。４つの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）として公知の分子及びＴリンパ球における活性シグナルを生成するζ鎖と関連する。ＴＣＲ、ζ鎖、及びＣＤ３分子は、サブユニットとしてのＴＣＲが抗原と認識・結合し、サブユニットとしてのＣＤ３がシグナル伝達経路への抗原刺激を移動・運搬し、最終的にＴ細胞活性を調節する、ＴＣＲ複合体を構成する。用語「ＣＤ３」は、ヒトＣＤ３、並びにその多様体、アイソフォーム、及び種相同体を含み得る。したがって、本明細書で定義及び開示されている抗体又はその抗原結合部は、ヒト以外の種からのＣＤ３、例えば、カニクイザルＣＤ３と結合してもよい。
本明細書で使用されるとき、用語「ヒトＣＤ３」は、ヒトＣＤ３の完全アミノ酸配列など、ヒト起源のＣＤ３を表す。
本明細書で使用されるとき、用語「カニクイザルＣＤ３」は、アカゲザルＣＤ３の完全アミノ酸配列など、カニクイザル由来のＣＤ３を表す。
本明細書で使用されるとき、用語「抗ＥＧＦＲ抗体」は、ＥＧＦＲと特異的に結合する抗体を表す。「抗ＥＧＦＲ抗体」は、単一特異性を有する一価抗体を含んでよい。好ましい抗ＥＧＦＲ抗体は、本明細書において他のところに記載されている。
用語「上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）」は、上皮細胞表面で発現された１７０キロダルトン（ｋＤａ）膜結合タンパク質である。ＥＧＦＲは、細胞周期制御分子の分類であるタンパク質チロシンキナーゼの増殖因子受容体ファミリーのメンバーである。（W. J. Gullick et al., 1986, Cancer Res.,46:285-292）。ＥＧＦＲは、そのリガンド（ＥＧＦあるいはＴＧＦ－α）が細胞外ドメインと結合する場合に活性化し、受容体細胞内チロシンキナーゼドメインの自己リン酸化をもたらす（S. Cohen et al., 1980, J. Biol. Chem.,255:4834-4842; A. B. Schreiber et al., 1983, J. Biol. Chem.,258:846-853）。
ＥＧＦＲは、ファミリー、すなわち、プロトがん遺伝子のＥＲＢＢファミリーの１メンバーである増殖促進がん遺伝子、ｅｒｂＢ又はＥｒｂＢ１のタンパク質産物であり、多くのヒトがんの発症及び進行において極めて重要な役割を担うと考えられている。特に、ＥＧＦＲの発現増加は、乳がん、膀胱がん、肺がん、頭部がん、頸部がん及び胃がん並びにグリオブラストーマにおいて観察された。
本明細書で使用されるとき、用語「二価」は、２つの抗原結合性部位を有する抗体又は抗原結合性フラグメントを表し；用語「一価」は、１つの単一抗原結合性部位のみを有する抗体又は抗原結合性フラグメントを表し；及び用語「多価」は、複数の抗原結合性部位を有する抗体又は抗原結合性フラグメントを表す。いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合性フラグメントは、二価である。
本明細書で使用されるとき、「二重特異性」抗体は、２つ異なるモノクローナル抗体から誘導されるフラグメントを有する人工抗体を表し、２つの異なるエピトープと結合することができる。２つのエピトープは、同じ抗原に存在してもよく、２つの異なる抗原に存在してもよい。
用語「二重特異性抗原結合性分子」は、少なくとも第一抗原結合性ドメイン（本明細書では第一抗原結合性部位とも呼ぶ）及び第二抗原結合性ドメイン（本明細書では第二抗原結合性部位とも呼ぶ）を含むタンパク質、ポリペプチド又は分子複合体を意味する。いくつかの実施形態では、「二重特異性抗原結合性分子」は、「二重特異性抗体」である。二重特異性抗体内の各抗原結合性ドメインは、単独、又は１つ以上の追加のＣＤＲ及び／若しくはＦＲと組み合わせて少なくとも１つのＣＤＲを含み、特定の抗原と特異的に結合する。本開示との関連で、第一抗原結合性部位は、第一抗原（例えば、ＣＤ３）と特異的に結合し、第二抗原結合性部位は、第二の異なる抗原（例えば、ＥＧＦＲ）と特異的に結合する。
本明細書で互換的に使用されるとき、用語「抗ＣＤ３／抗ＥＧＦＲ抗体」、「抗ＣＤ３／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体」、「ＣＤ３及びＥＧＦＲに対する抗体」、「抗ＣＤ３×ＥＧＦＲ二重特異性抗体」、「ＣＤ３×ＥＧＦＲ抗体」は、ＣＤ３及びＥＧＦＲと特異的に結合する二重特異性抗体を表す。
本明細書で使用されるとき、用語「モノクローナル抗体」又は「ｍＡｂ」は、単一分子組成物の抗体分子の調製を表す。モノクローナル抗体は、単一結合特異性及び特定のエピトープに対する親和性を示す。
「ドメイン抗体」は、重鎖の可変領域又は軽鎖の可変領域のみを含む抗体フラグメントを表す。特定の例では、２つ以上のＶHドメインは、ペプチドリンカーと共有結合し、二価又は多価ドメイン抗体を作る。二価ドメイン抗体の２つのＶHドメインは、同じ又は異なる抗原を標的としてよい。
本明細書で使用されるとき、用語「ヒト抗体」は、フレームワーク及びＣＤＲ領域両方がヒト生殖系免疫グロブリン配列から誘導される可変領域を有する抗体を含むことを意図される。更に、抗体が定常領域を含む場合、定常領域もヒト生殖系免疫グロブリン配列から誘導される。本開示のヒト抗体は、ヒト生殖系免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基を含むことができる（例えば、インビトロでのランダム若しくは部位特異的変異誘発又はインビボでの体細胞変異により誘導される変異）。しかしながら、本明細書で使用されるとき、用語「ヒト抗体」は、マウスなどの別の哺乳類種の生殖系由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上へグラフト化された抗体を含むことを意図しない。
用語「ヒト化抗体」は、マウスなどの別の哺乳類種の生殖系由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上へグラフト化された抗体を表すことを意図される。追加のフレームワーク領域改変を、ヒトフレームワーク配列内で行ってよい。
本明細書で使用されるとき、用語「キメラ抗体」は、可変領域配列が１つの種由来であり、可変領域配列がマウス抗体由来であり定常領域配列がヒト抗体由来である抗体など、定常領域配列が別の種由来である抗体を表す。
本明細書で使用されるとき、用語「組換え抗体」は、別の種の免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニック動物から単離された抗体、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現された抗体、組換えから単離された抗体、コンビナトリアル抗体ライブラリー、又は他のＤＮＡ配列への免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを含むいずれかの他の手段により調製、発現、作成若しくは単離された抗体など、組換え手段により調製、発現、作成若しくは単離された抗体を表す。
本明細書で使用されるとき、用語「スペーサー」は、ペプチド結合により結合され、１つ以上のポリペプチドと結合するために使用される１、２、３、４若しくは５アミノ酸残基、又は５～１５、２０、３０、５０以上のアミノ酸残基の長さを有する人工アミノ酸配列を表す。スペーサーは、第二構造を有してもよく、有しなくてもよい。スペーサー配列は、当技術分野において公知であり、例えば、Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448(1993); Poljak et al. Structure 2:1121-1123(1994) 参照。当技術分野において公知のいずれもの適切なスペーサーを使用することができる。例えば、本開示の有用なスペーサーは、グリシン及びプロリン残基が豊富であってよい。例としては、ＴＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＳ若しくはＳＧＧＧＧ又はそのタンデムリピート（例えば、２、３、４、又はそれ以上の反復）など、スレオニン／セリン及びグリシンからなる単一又は反復配列を有するスペーサーが挙げられる。
用語「機能的結合」又は「機能的に連結された」は、これらが意図的に機能することを可能とする関係性にあるような方法で、対象の２つ以上の生物学的配列のスペーサー又はリンカーを有する又は有しない並列を表す。ポリペプチドに関して使用される場合、結合された産物が目的の生物学的機能を有することを可能とするような方法でポリペプチド配列を結合することを意味することを意図される。例えば、抗体可変領域を、抗原結合性活性を有する安定産物を提供するように、定常領域と機能的に結合してよい。この用語は、ポリヌクレオチドに関して使用してもよい。一例として、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー配列、その他）と機能的に結合されている場合、ポリヌクレオチドからのポリペプチドの調節表現を可能とするような方法で、ポリヌクレオチド配列は結合していることを意味することを意図される。
本明細書で使用されるとき、用語「エピトープ」は、抗体が結合する抗原上の原子又はアミノ酸の特定の基を表す。タンパク質の三次フォールディング（立体配置又は立体構造エピトープとも呼ぶ）により並置された連続アミノ酸（直線的又は連続的エピトープとも呼ぶ）又は非連続アミノ酸の両方から、エピトープを形成することができる。連続アミノ酸から形成されたエピトープは、通常、タンパク質上の一次アミノ酸残基に沿って直線的に配置されており、連続アミノ酸の小セグメントを主要組織適合抗原（ＭＨＣ）分子との抗原結合から消化又は変性溶媒への暴露によっても保持することができるが、三次フォールディングにより形成されるエピトープは、通常、変性溶媒処理により失う。エピトープは、通常、固有空間コンフォメーションにおいて少なくとも３、及び通常それ以上、少なくとも５、約７、又は約８～１０のアミノ酸を含む。２抗体は、抗原に対して競合結合を示す場合、抗原内の同じ又は密接に関係があるエピトープと結合してよい。例えば、抗体又は抗原結合性部分が、少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％抗原との参照抗体の結合を遮断する場合、抗体又は抗原結合性部分は、参照抗体と同じ／密接に関係があるエピトープを結合すると見做してよい。
本明細書で使用されるとき、用語「特異的結合」又は「特異的に結合する」は、例えば、抗体と抗原間なお、２分子間の非ランダム結合反応を表す。
ＫDは、会合速度に対する解離速度の比（ｋoff／ｋon）を表すために使用され、これに限定されないが、表面プラズモン共鳴法、マイクロスケール熱泳動法、ＨＰＬＣ－ＭＳ法及びフローサイトメトリー（ＦＡＣＳなど）法を含む、当技術分野において公知のいずれかの従来方法によって決定してよい。特定の実施形態では、ＫD値を、フローサイトメトリーの使用によっておおよそ決定することができる。
アミノ酸配列（例えば、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質）に関して使用される場合、用語「融合」又は「融合された」は、例えば、化学結合又は組換え手段によって、天然に存在しない一本鎖アミノ酸配列中に２つ以上のアミノ酸配列を組み込むことを表す。融合アミノ酸配列を、２つのコードポリヌクレオチド配列によって産生してよく、宿主細胞中への組換えポリヌクレオチドを含む構築物の導入方法によって発現することができる。
用語「抗原特異性」は、抗原結合性分子により選択的に認識される特定の抗原又はそのエピトープを表す。
本明細書で使用されるとき、用語「同一性」は、配列のアラインメント及び比較により決定されるとき、２つ以上のポリペプチド分子又は２つ以上の核酸分子の配列間の関係性を表す。「同一性パーセント」は、比較分子におけるアミノ酸又はヌクレオチド間の同一残基のパーセントを意味し、比較される分子の最小サイズに基づいて算出される。これらの算出のため、好ましくは、アラインメントにおけるギャップ（もしあれば）を、特定の数学的モデル又はコンピュータプログラム（すなわち「アルゴリズム」）によりアドレスする。整列核酸又はポリペプチドの同一性を算出するために使用することができる方法としては、Computational Molecular Biology,(Lesk, A. M., ed.),1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G.,1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.),1991, New York: M. Stockton Press; and Carillo et al,1988, SIAMJ. Applied Math.48:1073に記載されているものが挙げられる。
本明細書で使用されるとき、用語「免疫原性」は、生物体において特定の抗体又は感作リンパ球の形成を刺激する能力を表す。抗体及び感作リンパ球などの免疫エフェクター物質を最終的に生成するように活性化、増殖及び分化するために特定の免疫細胞を刺激する抗原の特性を表すだけでなく、抗体及び感作Ｔリンパ球を、抗原で生物体を刺激後に生物体の免疫系において形成することができる特定の免疫応答も表す。免疫原性は、抗原の最も重要な特性である。抗原が宿主において免疫応答の生成を上手く誘導することができるかどうかは、３因子：抗原の特性、宿主の反応性、及び免疫化手段に依存する。
本明細書で使用されるとき、アミノ酸残基に関して用語「置換」は、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質において１つ以上のアミノ酸を別のものによる天然又は誘導置換を表す。ポリペプチドにおける置換は、ポリペプチド機能の縮小、増強、又は排除をもたらし得る。
本明細書で使用されるとき、アミノ酸残基に関して用語「変異」又は「変異した」は、アミノ酸残基の置換、挿入、又は付加を表す。
天然「Ｔ細胞受容体」又は天然「ＴＣＲ」は、シグナル伝達を媒介することができる複合体を形成するためにインバリアントＣＤ３鎖と関連するヘテロ二量体Ｔ細胞表面タンパク質である。ＴＣＲは、免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、一本鎖重鎖及び一本鎖軽鎖を有する半抗体と類似しており、天然ＴＣＲは、細胞外部分、膜貫通部分、及び細胞内部分を有する。ＴＣＲの細胞外ドメインは、膜近位定常領域及び膜遠位可変領域を有する。本明細書に開示されているいくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、抗体の可変ドメイン及びＴＣＲの定常ドメインを有する可溶性キメラタンパク質を含み、ＴＣＲ定常ドメインのサブユニット（α及びβドメインなど）は、改変ジスルフィド結合により結合する。
本明細書で使用されるとき、用語「Ｋａ」は、特定の抗体－抗原相互作用の会合速度を表すことを意図されるが、本明細書で使用されるとき、用語「Ｋｄ」は、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度を表すことを意図される。抗体のＫｄ値を、当技術分野において確立された方法を用いて決定することができる。本明細書で使用されるとき、用語「ＫD」は、特定の抗体－抗原相互作用の解離定数を表すことを意図され、Ｋａに対するＫｄの比（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される。抗体のＫｄの好ましい決定方法は、表面プラズモン共鳴の使用、好ましくは、Biacore（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムの使用による。
本明細書で使用されるとき、ＩｇＧ抗体の用語「高親和性」は、標的抗原に対して、１×１０-7Ｍ以下、より好ましくは５×１０-8Ｍ以下、更により好ましくは１×１０-8Ｍ以下、更により好ましくは５×１０-9Ｍ以下、更により好ましくは１×１０-9Ｍ以下のＫDを有する抗体を表す。
本明細書で使用されるとき、「５０％効果濃度」とも呼ばれている用語「ＥＣ50」は、特定の暴露時間後ベースラインと最大値の中間の応答を誘導する薬物、抗体又は毒物の濃度を表す。本願との関連で、ＥＣ50は、「ｎＭ」の単位で表される。
本明細書で使用されるとき、用語「結合するために競合する」は、結合標的との結合における２抗体の相互作用を表す。第二抗体の非存在下における第一抗体の結合と比較して、第一抗体のその同種エピトープとの結合が第二抗体の存在下検出可能に減少する場合、第一抗体は、第二抗体と結合するために競合する。第二抗体のそのエピトープとの結合も、第一抗体の存在下で検出可能に減少する場合、そうとは限らないが、もう１つの可能性も当てはまり得る。すなわち、第二抗体が、第一抗体のそのそれぞれのエピトープとの結合を阻害しないで、第一抗体は、第二抗体のそのエピトープとの結合を阻害することができる。しかしながら、各抗体が、他の抗体のその同種エピトープとの結合を検出可能に阻害する場合、同程度、より大きな程度、又はより少ない程度までであろうとなかろうと、抗体は、そのそれぞれのエピトープは結合するために相互に「交差競合」すると考えられる。
本明細書で使用されるとき、「結合を阻害する」能力は、いずれかの検出可能レベルまで２分子の結合を阻害する抗体又はその抗原結合性フラグメント（例えば、ヒトＣＤ３／ＥＧＦＲ及びヒト抗ＣＤ３／抗ＥＧＦＲ抗体）の能力を表す。特定の実施形態では、２分子の結合を、抗体又はその抗原結合性フラグメントにより少なくとも５０％阻害することができる。特定の実施形態では、かかる阻害効果は、６０％超、７０％超、８０％超、又は９０％超であってよい。
本明細書で使用されるとき、用語「エピトープ」は、免疫グロブリン又は抗体が特異的に結合する抗原の部分を表す。「エピトープ」は、「抗原決定基」としても公知である。エピトープ又は抗原決定基は、総じて、アミノ酸、炭水化物又は糖側鎖などの分子の化学活性表面基から成り、総じて、特定の三次元構造及び特定の電荷特性を有する。例えば、エピトープは、総じて、固有の立体コンフォメーション中に少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５連続又は非連続アミノ酸を含み、「直線的」又は「立体配座的」であってよい。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,Vol.66,G.E.Morris,Ed. (1996)参照。直線的エピトープでは、タンパク質及び相互作用分子（例えば、抗体）間の全ての相互作用部位は、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って直線的に存在する。立体配剤的エピトープでは、相互作用部位は、タンパク質中に相互に分離しているアミノ酸残基に広がる。当業者により公知の従来技術によって同じエピトープとの結合の競合性に応じて、抗体をスクリーニングしてよい。例えば、競合又は公差競合に関する試験を行って、抗原（例えば、ＲＳＶ融合タンパク質）との結合について相互に競合又は公差競合する抗体を得てもよい。その公差競合に基づいた同じエピトープと結合する抗体を得るハイスループット方法は、国際公開第０３／４８７３１号パンフレットに記載されている。
本明細書で使用されるとき、用語「単離」は、人工的手段によって天然状態から得られる状態を表す。特定の「単離」物質又は成分が天然に存在する場合、その天然環境が変化するので可能であるか、又は天然環境から物質を単離するか、又は両方である。例えば、特定の単離されていないポリヌクレオチド又はポリペプチドは、特定の生きている動物の体内に天然に存在し、かかる天然状態から単離された高純度の同じポリヌクレオチド又はポリペプチドは、単離ポリヌクレオチド又はポリペプチドと呼ぶ。用語「単離」は、人工又は合成物質混合物も、単離物質の活性に影響を与えない他の不純物も除外しない。
本明細書で使用されるとき、用語「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を表すことを意図される（例えば、ＣＤ３／ＥＧＦＲタンパク質と特異的に結合する単離抗体は、ＣＤ３／ＥＧＦＲ以外の抗原タンパク質と特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、ヒトＣＤ３／ＥＧＦＲタンパク質と特異的に結合する単離抗体は、他の種由来のＣＤ３／ＥＧＦＲタンパク質などの他の抗原に対する交差反応性を有し得る。さらに、単離抗体は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まないことがある。
本明細書で使用されるとき、用語「ベクター」は、その中に挿入されたポリヌクレオチドを有することができる核酸媒体を表す。ベクターがその中に挿入されたポリヌクレオチドによりコードされたタンパク質の発現を可能とする場合、ベクターを発現ベクターと呼ぶ。ベクターは、宿主細胞内への形質転換、形質導入、又はトランスフェクションにより、宿主細胞内で発現された運搬される遺伝子物質要素を有することができる。ベクターは、当業者に周知であり、プラスミド、ファージ、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）又はＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）；λファージ又はＭ１３ファージ及び動物ウイルスなどのファージが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターとして使用することができる動物ベクターとしては、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルスなど）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポーバウイルス（ＳＶ４０など）が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは、発現制御するための複数の要素を含んでよく、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択要素及びレポーター遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、ベクターは、複製開始点を含んでよい。
本明細書で使用されるとき、用語「宿主細胞」は、対象のタンパク質、タンパク質フラグメント、又はペプチドを生成するように改変することができる細胞系を表す。宿主細胞としては、培養細胞、例えば、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＮＳＯ、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０などのげっ歯類（ラット、マウス、モルモット、又はハムスター）由来の哺乳類培養細胞；又は細菌細胞（例えば、グラム陰性又はグラム陽性菌、例えば、大腸菌類（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの腸内細菌科）、及び真菌細胞（例えば、酵母細胞、糸状性真菌細胞、その他）などの原核又は真核微生物由来細胞；昆虫細胞、及びトランスジェニック動物若しくは培養組織内に含まれる細胞などの植物細胞又は動物細胞が挙げられる。用語は、特定の対象だけでなく、かかる細胞の子孫も包含する。変異又は環境の影響のいずれかにより続く世代において特定の変異が起こることがあるので、かかる子孫は親細胞と同じでない可能性があるが、それでも、用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。
本明細書で使用されるとき、用語「トランスフェクション」は、核酸を、真核細胞、特に、哺乳類細胞に導入する方法を表す。トランスフェクションのプロトコール及び技術としては、脂質トランスフェクション並びにエレクトロポレーションなどの化学的及び物理的方法が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかのトランスフェクション技術は、当技術分野において周知であり、本明細書に開示されている。例えば、Graham et al.,1973,Virology 52:456;Sambrook et al.,2001,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,上記;Davis et al.,1986,Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al,1981,Gene 13:197参照。
本明細書で使用されるとき、用語「ＳＰＲ」又は「表面プラズモン共鳴」は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Pharmacia Biosensor AB、スウェーデン国ウプサラ及び米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いてバイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度変化を検出することによって、リアルタイムバイオセンサー相互作用の分析を可能とする光学的現象を表し、且つ含む。更なる説明のため、実施例５並びに Joensson, U., et al.(1993)Ann.Biol.Clin.51:19-26;Joensson,U., et al.(1991)Biotechniques11:620-627;Johnsson,B.,et al.(1995)J.Mol.Recognit.8:125-131;及び Johnnson, B., et al.(1991)Anal.Biochem.198:268-277参照。
本明細書で使用されるとき、用語「蛍光活性化細胞選別」又は「ＦＡＣＳ」は、フローサイトメトリーの特殊型を表す。これは、各細胞の特異的光散乱及び蛍光特性に基づいて、一度に１つの細胞、生物学的細胞の異種性混合物を２つ以上の容器に選別する方法を提供する（FlowMetric. “Sorting Out Fluorescence Activated Cell Sorting”. Retrieved 2017-11-09）。ＦＡＣＳを行う装置は当業者に公知であり、一般に市販されている。かかる装置の例としては、Becton Dickinson（米国カリフォルニア州フォスターシティ）のFACS Star Plus、ACScan及びFACSort装置、Coulter Epics Division（米国フロリダ州ハイアリア）のEpics C及びCytomation（米国コロラド州コロラドスプリングス）のMoFloが挙げられる。
本明細書で使用されるとき、用語「対象」又は「個体」又は「動物」又は「患者」は、疾病又は病態の診断、予後、予防、及び／又は治療を必要としている哺乳類又は霊長類を含むヒト又は非ヒト動物を表す。哺乳類対象としては、ヒト、飼育動物、家畜、及び動物園、スポーツ、又はイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ブタ、雌ウシ、クマ、その他もろもろなどのペット動物が挙げられる。
本明細書で使用されるとき、用語「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域とＣ１複合体及びＦｃ受容体などのそのエフェクターとの結合に起因する生物学的活性を表す。好ましいエフェクター機能としては：Ｃ１複合体上の抗体及びＣ１ｑの相互作用により誘導される補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；抗体のＦｃ領域とエフェクター細胞上のＦｃ受容体との結合により誘導される抗体依存性細胞介在性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）；及びファゴサイトーシスが挙げられる。
本明細書で使用されるとき、用語「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」又は「ＡＤＣＣ」は、特定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）上に結合された分泌Ｉｇは、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原担持標的細胞と特異的に結合した後、細胞毒で標的細胞を死滅させることを可能とする、細胞傷害性の形態を表す。抗体は、細胞傷害精細胞を「アーム」し、かかる死滅に絶対的に必要である。ＡＤＣＣを媒介するための一次細胞、ＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球は、FcγRI、FcγRII及びFcγRIIIを発現する。Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)の４６４頁の造血細胞上のＦｃＲ発現を表３中に要約している。対象の分子のＡＤＣＣ活性を評価するため、米国特許第５，５００，３６２号又は同第５，８２１，３３７号に記載されているなどのインビトロＡＤＣＣアッセイを行ってよい。かかるアッセイのための有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、又は加えて、対象の分子のＡＤＣＣ活性を、例えば、Clynes et al. PNAS(USA)95:652-656(1998)に開示されているなどの動物モデルにおいてインビボ評価してよい。
用語「補体依存性細胞傷害」又は「ＣＤＣ」は、補体の存在下標的細胞の溶解を表す。古典的補体経路の活性化は、補体系（Ｃ１ｑ）の第１成分がその同種抗原と結合されている抗体（適切なサブクラスの）と結合することによって開始される。補体活性化を評価するため、例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163(1996)に記載されているＣＤＣアッセイを行ってよい。
本明細書で使用されるとき、用語「がん」は、悪性細胞増殖又は腫瘍、異常増殖、浸潤又は転移を特徴とするいずれもの病状を表し、固形腫瘍及び白血球などの非固形腫瘍（血液悪性腫瘍）の両方を含む。本明細書で使用されるとき、「固形腫瘍」は、腫瘍及び／又は悪性細胞の固形塊を表す。がん又は腫瘍の例としては、血液悪性腫瘍、口腔がん（例えば、唇、舌又は咽頭の）、消化器官（例えば、食道、胃、小腸、結腸、大腸、又は直腸）、腹膜、肝臓及び胆汁道、膵臓、咽頭又は肺（小細胞及び非小細胞）などの呼吸器系、骨、結合組織、皮膚（例えば、メラノーマ）、***、生殖器（卵管、子宮、子宮頸部、精巣、卵巣、又は前立腺）、尿路（例えば、膀胱又は腎臓）、脳及び甲状腺などの内分泌腺が挙げられる。特定の実施形態では、がんは、卵巣がん、乳がん、頭頸部がん、腎がん、膀胱がん、肝細胞がん、及び結腸直腸がんから選択される。
本明細書で病状の治療との関連で使用されるとき、用語「治療」、「治療すること」又は「治療された」は、総じて、ヒト又は動物にかかわらず、いくつかの所望の治療効果を達成する治療及び療法、例えば、病態の進行の阻害に関し、進行速度を低下させる、進行速度の停止、病態の退縮、病態の寛解、及び病態の治癒が挙げられる。予防対策としての治療（すなわち、発症予防、予防）も含まれる。がんのため、「治療すること」は、腫瘍若しくは悪性細胞増殖、増殖、若しくは転移、又はこれらのいくつかの組合せを弱める又は遅延させることを表し得る。腫瘍のため、「治療」は、腫瘍の全て若しくは部分の除去、腫瘍増殖及び転移の阻害若しくは遅延、腫瘍発生の予防若しくは遅延、又はこれらのいくつかの組合せを含む。
本明細書で使用されるとき、用語「有効量」は、所望の治療レジメンにより投与される場合、合理的利益／リスク比に相応のいくつかの所望の治療効果を得るために有効である活性化合物、若しくは物質、組成物の量又は活性化合物を含む投与量に関する。例えば、ＣＤ３／ＥＧＦＲ関連疾患又は病態の治療との関連で使用される場合、「有効量」は、前記疾患又は病態を治療するために有効な量又は濃度の抗体又はその抗原結合部を表す。
哺乳類における特定の病状に関連して、本明細書で使用されるとき、用語「予防する」、「予防」又は「予防すること」は、疾病の発症の予防若しくは遅延、又は臨床若しくはその無症候性症状の発現の予防を表す。
本明細書で使用されるとき、用語「薬剤的に許容可能な」は、媒体、希釈剤、賦形剤及び／又はその塩が、製剤中の他の成分と化学的及び／又は物理的に混合可能であり、レシピエントと生理的に適合性がることを意味する。
本明細書で使用されるとき、用語「薬剤的に許容可能な担体及び／又は賦形剤」は、対象に薬理的及び／又は生理的に適合性のある担体及び／又は賦形剤並びに当技術分野において周知である有効成分（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR,19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995参照）を表し、ｐＨ調整剤、界面活性剤、アジュバント及びイオン強度強化剤が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ｐＨ調整剤としては、リン酸バッファが挙げられるが、これらに限定されず；界面活性剤は、カチオン性、アニオン性、又は非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ－８０が挙げられるが、これらに限定されず；イオン強度強化剤としては、塩化ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、用語「アジュバント」は、抗原に対する免疫応答を強化又は生物体に対する抗原と共に送達若しくは前以て生物体に送達される場合に生物体における免疫応答のタイプを変化させることができる非特異的免疫賦活薬を表す。様々なアジュバントがあり、アルミニウムアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、フロイントアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバント及びフロイント不完全アジュバント）、コリネバクテリウムパルバム、リポ多糖、サイトカインなどが挙げられるが、これらに限定されない。フロイントアジュバントは、現在、動物実験において最も普通に使用されるアジュバントである。水酸化アルミニウムアジュバントは、離漿治験においてより普通に使用される。
二重特異性抗体及びその抗原結合性フラグメント
特定の実施形態では、本明細書において提供される抗体及びその抗原結合性フラグメントは、二重特異性である。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される二重特異性抗体及びその抗原結合性フラグメントは、ＣＤ３に対する第一特異性、及びＣＤ３と異なる第二抗原に対する第二特異性を有し、その遮断は１つの抗原単独より相乗効果を産生する可能性がある。
特定の実施形態では、第二特異性は、腫瘍関連抗原又はそのエピトープに対してである。用語「腫瘍関連抗原」は、腫瘍細胞により発現される標的抗原を表すが、腫瘍への形質転換前に同種細胞（又は正常細胞）により発現されてもよい。いくつかの実施形態では、腫瘍関連抗原を、腫瘍細胞によってのみ提示することができ、正常細胞、すなわち、非腫瘍細胞によって提示されない。いくつかの他の実施形態では、腫瘍関連抗原を、腫瘍細胞上で排他的に発現することができるか、又は非腫瘍細胞と比較して腫瘍特異的変異を示す可能性がある。いくつかの他の実施形態では、腫瘍関連抗原を、腫瘍細胞及び非腫瘍細胞療法において見ることができるが、非腫瘍細胞と比較した場合、腫瘍細胞では過剰発現されるか、又は非腫瘍組織と比較して腫瘍組織の密でない構造のせいで腫瘍細胞において抗体結合を利用できる。いくつかの実施形態では、腫瘍関連抗原は、腫瘍の血管系に存在する。
腫瘍関連抗原の例証となる例は、ＬＡＧ－３、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ－３、ＣＤ１３５）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、Ｈｅｒ２ｎｅｕ、Ｈｅｒ３、ＩＧＦＲ、ＩＬ３Ｒ、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ＣＤＣＰ１、デルリン１、テネイシン、ｆｒｉｚｚｌｅｄ１－１０、血管抗原ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／ＦＬＫ１）、ＶＥＧＦＲ３（ＦＬＴ４、ＣＤ３０９）、ＰＤＧＦＲ－α（ＣＤ１４０ａ）、ＰＤＧＦＲ－β（ＣＤ１４０ｂ）エンドグリン、ＣＬＥＣ１４、Ｔｅｍ１－８、及びＴｉｅ２である。更なる例としては、Ａ３３、ＣＡＭＰＡＴＨ－１（ＣＤｗ５２）、がん胎児抗原（ＣＥＡ）、炭酸脱水素酵素ＩＸ（ＭＮ／ＣＡ ＩＸ）、ｄｅ２－７ ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、Ｅｐ－ＣＡＭ、葉酸結合タンパク質、Ｇ２５０、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ－３、ＣＤ１３５）、ｃ－Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）、ＣＳＦ１Ｒ（ＣＤ１１５）、ＨＬＡ－ＤＲ、ＩＧＦＲ、ＩＬ－２受容体、ＩＬ３Ｒ、ＭＣＳＰ（メラノーマ関連細胞表面コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、Ｍｕｃ－１、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、及びＴＡＧ－７２が挙げられる。
特定の実施形態では、第二特異性は、感染性疾患関連抗原又はそのエピトープに対してである。感染性疾患関連抗原の非限定的例としては、例えば、ウイルス粒子表面で発現される、又はウイルスに感染された細胞で選択的に発現される抗原が挙げられ、ウイルスは、ＨＩＶ、肝炎（Ａ、Ｂ又はＣ）、ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ－１、ＨＳＶ－２、ＣＭＶ、ＨＡＶ－６、ＶＺＶ、エプスタインバーウイルス）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器多核体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶ、デングウイルス、パピローマウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルス、及びアルボウイルス脳炎ウイルスが挙げられる。あるいは、標的抗原は、細菌表面で発現される、又は細菌に感染された細胞で選択的に発現される抗原であり得、細菌は、クラミジア、リケッチア、マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌、淋菌、クレブシエラ、プロテウス、セラチア菌、シュードモナス、レジオネラ、ジフテリア、サルモネラ、桿菌、コレラ、破傷風、ボツリヌス、炭疽菌、ペスト、レプトスピラ、及びライム病原因菌からなる群から選択される。特定の実施形態では、標的抗原は、真菌表面で発現される、又は真菌に感染された細胞で選択的に発現される抗原であり、真菌は、カンジダ属（白色体、クルセイ、グラブラータ、トロピカリス、その他）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、アスペルギルス属（フミガーツス、ニガー、その他）、ムコラーレス目（ムコール属、アブシディア属、リゾプス属、その他）、スポロトリックス・シェンキイ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｋｉｉ）、ブラストミセス・デルマチチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）、及びヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）からなる群から選択される。特定の実施形態では、標的抗原は、寄生虫表面で発現される、又は寄生虫に感染された細胞で選択的に発現される抗原であり、寄生虫は、エントアメーバ・ヒストリチカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、バランチジウム・コリ（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ ｃｏｌｉ）、ネグレリア・フォーレリ（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ｆｏｗｌｅｒｉ）、アカンソアメーバ属（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ ｓｐ．）、ジアルジア・ラムビア（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｉａ）、クリプトスポリジウム属（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．）、ニューモシスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、プラスモディウム・ビバックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、バベシア・ミクロチ（Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ）、トリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）、トリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、リーシュマニア・ドノバニ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ）、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、ニッポストロンギルス・ブラシリエンシス（Ｎｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、タエニア・クラッシケプス（Ｔａｅｎｉａ ｃｒａｓｓｉｃｅｐｓ）、及びブルギア・マラヤ（Ｂｒｕｇｉａ ｍａｌａｙｉ）からなる群から選択される。特定の病原体関連抗原の非限定的例としては、例えば、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＩＶ ＣＤ４、Ｂ型肝炎糖タンパク質Ｌ、Ｂ型肝炎糖タンパク質Ｍ、Ｂ型肝炎糖タンパク質Ｓ、Ｃ型肝炎Ｅ１、Ｃ型肝炎Ｅ２、幹細胞特異的タンパク質、単純ヘルペスウイルスｇＢ、サイトメガロウイルスｇＢ、及びＨＴＬＶエンベロープタンパク質が挙げられる。
特定の好ましい実施形態によれば、本開示は、ＣＤ３と特異的に結合する第一抗原結合性部位及びＥＧＦＲと特異的に結合する第二抗原結合性部位を含む二重特異性抗体又はその抗原結合部を含む。かかる抗体は、本明細書において、例えば、「抗ＣＤ３／抗ＥＧＦＲ」若しくは「抗ＣＤ３／ＥＧＦＲ」、又は「抗ＣＤ３×ＥＧＦＲ」若しくは「ＣＤ３×ＥＧＦＲ」二重特異性抗体、又は他の同様な用語で呼んでよい。
本開示の二重特異性抗体は、高親和性を有するヒトＣＤ３及びヒトＥＧＦＲと結合する。本開示の抗体とＣＤ３又はＥＧＦＲとの結合を、当技術分野において確立された１つ以上の技術、例えば、ＥＬＩＳＡを用いて評価することができる。本開示の抗体の結合特異性を、抗体とＣＤ３タンパク質又はＥＧＦＲタンパク質を発現する細胞との結合を、例えば、フローサイトメトリーでモニターすることによって決定することもできる。例えば、抗体を、その細胞表面でＣＤ３を発現するようにトランスフェクトされたＣＨＯ細胞などのヒトＣＤ３を発現する細胞株と、抗体を反応させるフローサイトメトリーアッセイにより試験することができる。加えて又はあるいは、結合速度論（例えば、ＫD値）を含む抗体の結合を、ＢＩＡｃｏｒｅ結合アッセイで試験することができる。更に他の適切な結合アッセイとしては、例えば、組換えＣＤ３タンパク質を用いたＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳが挙げられる
いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性抗体又はその抗原結合部は、ＣＤ３抗原結合性部分及びＥＧＦＲ抗原結合性部分を含み、
前記ＣＤ３抗原結合性部分は、重鎖ＣＨ１定常領域ドメインと機能的に連結された抗ＣＤ３抗体の第一ＶＨ（ＶＨ１）、及び軽鎖定常領域（ＣＬ）と機能的に連結された抗ＣＤ３抗体の第一ＶＬ（ＶＬ１）を含むＦａｂを含み、
前記ＥＧＦＲ抗原結合性部分は、第一Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域（Ｃ１）と機能的に連結された抗ＥＧＦＲ抗体の第二重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）、及び第二ＴＣＲ定常領域（Ｃ２）と機能的に連結された抗ＥＧＦＲ抗体の第二軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）を含むキメラＦａｂを含み、Ｃ１及びＣ２は、前記二量体を安定化することができる非天然鎖間ジスルフィド結合により二量体を形成することができ、
（Ａ）前記ＣＤ３抗原結合性部分は：
配列番号１により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる重鎖ＣＤＲ１と、
配列番号２により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる重鎖ＣＤＲ２と、
配列番号３により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる重鎖ＣＤＲ３と、
配列番号４により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ１と、
配列番号５により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ２と、
配列番号６により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ３と
を含み、並びに
（Ｂ）前記ＥＧＦＲ抗原結合性部分は：
配列番号７により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる重鎖ＣＤＲ１と、
配列番号８により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる重鎖ＣＤＲ２と、
配列番号９により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる重鎖ＣＤＲ３と、
配列番号１０により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ１と、
配列番号１１により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ２と、
配列番号１２により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ３と
を含む。
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体又はその抗原結合部は、以下の特性：
（ａ）高親和性で同時にヒトＣＤ３及びＥＧＦＲタンパク質と特異的に結合することと；
（ｂ）ヒトＣＤ３及び／又はカニクイザルＣＤ３タンパク質と特異的に結合することと；
（ｃ）ヒトＥＧＦＲ及び／又はカニクイザルＥＧＦＲタンパク質と特異的に結合することと；
（ｄ）抗ＣＤ３抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、これらの組合せ、並びにＣＤ３及びＥＧＦＲを標的とする他の二重特異性抗体と比較して、ＥＧＦＲ発現腫瘍細胞の存在下強力なＴ細胞活性化を誘導することができることと；
（ｅ）良好な熱安定性を提供し、ヒト血清中安定であることと；
（ｆ）抗ＣＤ３抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、これらの組合せ、並びにＣＤ３及びＥＧＦＲを標的とする他の二重特異性抗体と比較して、優れた抗腫瘍効果を提供することと
のうち１つ以上を有する。
例えば、本開示の二重特異性抗体は、１×１０-7Ｍ以下のＫDでヒトＣＤ３タンパク質と結合し、５×１０-8Ｍ以下のＫDでヒトＣＤ３タンパク質と結合し、４×１０-8Ｍ以下のＫDでヒトＣＤ３タンパク質と結合し、３×１０-8Ｍ以下のＫDでヒトＣＤ３タンパク質と結合し、２×１０-8Ｍ以下のＫDでヒトＣＤ３タンパク質と結合し、１×１０-8Ｍ以下のＫDでヒトＣＤ３タンパク質と結合し、５×１０-9Ｍ以下のＫDでヒトＣＤ３タンパク質と結合し、４．７０×１０-9Ｍ以下のＫDでヒトＣＤ３タンパク質と結合する。
例えば、本開示の二重特異性抗体は、１×１０-7Ｍ以下のＫDでヒトＥＧＦＲタンパク質と結合し、５×１０-8Ｍ以下のＫDでヒトＥＧＦＲタンパク質と結合し、１×１０-8Ｍ以下のＫDでヒトＥＧＦＲタンパク質と結合し、６．２０×１０-9Ｍ以下のＫDでヒトＥＧＦＲタンパク質と結合する。
例えば、腫瘍担持マウスモデルで試験するとき、本開示の二重特異性抗体は、パニツムマブ（抗ＥＧＦＲ抗体）と比較して所望の腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）を達成し、予想外に、通常用量（例えば、０．３ｍｇ／体重ｋｇ）におけるＴＧＩより低い用量（例えば、０．０８ｍｇ／体重ｋｇ）においてより高いＴＧＩを達成した。
ＣＤ３と特異的に結合する第一抗原結合性部分
第一抗原結合性部分は、ＣＤ３と特異的に結合し、したがって、本開示では、ＣＤ３抗原結合性部分とも呼ぶ。２つの用語を互換的に使用することができる。
第一抗原結合性部分は、重鎖ＣＨ１定常領域ドメインと機能的に連結された抗ＣＤ３抗体の第一ＶＨ（ＶＨ１）、及び軽鎖定常領域（ＣＬ）と機能的に連結された抗ＣＤ３抗体の第一ＶＬ（ＶＬ１）を含むＦａｂを含む。
いくつかの実施形態では、第一抗原結合性部分は：
ａ）配列番号１、及び２つ以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換により配列番号１と異なるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる重鎖ＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号２、及び２つ以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換により配列番号２と異なるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる重鎖ＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号３、及び２つ以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換により配列番号３と異なるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる重鎖ＣＤＲ３と、
ｄ）配列番号４、及び２つ以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換により配列番号４と異なるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ１と、
ｅ）配列番号５、及び1つ以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換により配列番号５と異なるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ２と、
ｆ）配列番号６、及び1つ以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換により配列番号６と異なるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ３と、を含む。
いくつかの実施形態では、第一抗原結合性部分は：
ａ）配列番号１により表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号２により表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号３により表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３と、
ｄ）配列番号４により表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１と、
ｅ）配列番号５により表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２と、
ｆ）配列番号６により表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３と
を含む。
いくつかの実施形態では、第一抗原結合性部分は：
ａ）配列番号１により表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号２により表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号３により表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３と、
ｄ）配列番号４により表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１と、
ｅ）配列番号５により表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２と、
ｆ）配列番号６により表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３と
を含む。
いくつかの実施形態では、第一抗原結合性部分の重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）は：
（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列と、
（ｉｉ）配列番号１３と少なくとも８５％、例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有し、同時にＣＤ３との結合特異性を維持するアミノ酸配列か；又は
（ｉｉｉ）配列番号１３と比較して１つ以上（例えば、１～１８、１～１５、１～１０、又は１～５）のアミノ酸の付加、欠失及び／若しくは置換を有し、同時にＣＤ３との結合特異性を維持するアミノ酸配列と
を含む。
いくつかの実施形態では、第一抗原結合性部分の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）は：
（ｉ）配列番号１４のアミノ酸配列と、
（ｉｉ）配列番号１４と少なくとも８５％、例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有し、同時にＣＤ３との結合特異性を維持するアミノ酸配列か；又は
（ｉｉｉ）配列番号１４と比較して１つ以上（例えば、１～17、１～１５、１～１０、又は１～５）のアミノ酸の付加、欠失及び／若しくは置換を有するアミノ酸配列と
を含む。
いくつかの実施形態では、第一抗原結合性部分の重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）は、配列番号１３のアミノ酸配列から成り、第一抗原結合性部分の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）は、配列番号１４のアミノ酸配列からなる。
いくつかの実施形態では、第一抗原結合性部分は、２つのポリペプチド鎖：
ｉ）ＶＨ１－ＣＨ１－ヒンジ１－ＣＨ２－ＣＨ３により表される第一重鎖と；
ｉｉ）ＶＬ１－ＣＬにより表される第一軽鎖と、を含み；
ｉ）のＶＨ１－ＣＨ１部分及びＶＬ１－ＣＬは、抗ＣＤ３アームを形成する（Ｔ３と呼ぶ、図１参照）。
いくつかの実施形態では、第一抗原結合性部分は、２つのポリペプチド鎖：
ｉ）配列番号２３により表される第一重鎖又は配列番号２３と少なくとも８５％、例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは更に１００％の配列同一性を有し、同時にＣＤ３との結合特異性を維持するアミノ酸配列と；
ｉｉ）配列番号２２により表される第一軽鎖又は配列番号２２と少なくとも８５％、例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは更に１００％の配列同一性を有し、同時にＣＤ３との結合特異性を維持するアミノ酸配列と
を含む。
いくつかの実施形態では、第一抗原結合性部分は、２つのポリペプチド鎖：
ｉ）配列番号２３により表される第一重鎖と；
ｉｉ）配列番号２２により表される第一軽鎖と
を含む。
いくつかの実施形態では、第一抗原結合性部分は、２つのポリペプチド鎖：
ｉ）配列番号２３により表される第一重鎖；及び
ｉｉ）配列番号２２により表される第一軽鎖
からなる。
いくつかの実施形態では、第一抗原結合性部分は、Ｆｃ領域と機能的に結合している。好ましくは、Ｆｃ領域は、ＣＤ３抗原結合性部分のＣＨ１ドメインと機能的に結合している。
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域などのヒトＦｃ領域、特に、ヒトＩｇＧ４又はＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。好ましくは、Ｆｃ領域は、変異Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。
ＥＧＦＲと特異的に結合する第二抗原結合性部分
本明細書で提供されている第二抗原結合性部分は、ＥＧＦＲと特異的に結合し、したがって、本開示では、ＥＧＦＲ抗原結合性部分とも呼ぶ。２つの用語を互換的に使用することができる。
第二抗原結合性部分は、第一Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域（Ｃ１）と機能的に連結された抗ＥＧＦＲ抗体の第二重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）、及び第二ＴＣＲ定常領域（Ｃ２）と機能的に連結された抗ＥＧＦＲ抗体の第二軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）を含むキメラＦａｂを含み、Ｃ１及びＣ２は、前記二量体を安定化することができる非天然鎖間ジスルフィド結合により二量体を形成することができる。
いくつかの実施形態では、第二抗原結合性部分は：
配列番号７、及び２つ以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換により配列番号７と異なるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる重鎖ＣＤＲ１と、
配列番号８、及び２つ以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換により配列番号８と異なるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる重鎖ＣＤＲ２と、
配列番号９、及び1つ以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換により配列番号９と異なるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる重鎖ＣＤＲ３と、
配列番号１０、及び２つ以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換により配列番号１０と異なるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ１と、
配列番号１１、及び1つ以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換により配列番号１１と異なるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ２と、
配列番号１２、及び1つ以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換により配列番号１２と異なるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ３と
を含む。
いくつかの実施形態では、第二抗原結合性部分は：
ａ）配列番号７により表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号８により表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号９により表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３と、
ｄ）配列番号１０により表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１と、
ｅ）配列番号１１により表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２と、
ｆ）配列番号１２により表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３と
を含む。
いくつかの実施形態では、第二抗原結合性部分は：
ａ）配列番号７により表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１と、
ｂ）配列番号８により表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２と、
ｃ）配列番号９により表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３と、
ｄ）配列番号１０により表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１と、
ｅ）配列番号１１により表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２と、
ｆ）配列番号１２により表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３と
を含む。
いくつかの実施形態では、第二抗原結合性部分の重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）は：
（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列と、
（ｉｉ）配列番号１５と少なくとも８５％、例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有し、同時にＥＧＦＲとの結合特異性を維持するアミノ酸配列か；又は
（ｉｉｉ）配列番号１５と比較して１つ以上（例えば、１～１８、１～１５、１～１０、又は１～５）のアミノ酸の付加、欠失及び／若しくは置換を有し、同時にＥＧＦＲとの結合特異性を維持するアミノ酸配列と
を含む。
いくつかの実施形態では、第二抗原結合性部分の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）は：
（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列と、
（ｉｉ）配列番号１６と少なくとも８５％、例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有し、同時にＥＧＦＲとの結合特異性を維持するアミノ酸配列か；又は
（ｉｉｉ）配列番号１６と比較して１つ以上（例えば、１～16、１～１５、１～１０、又は１～５）のアミノ酸の付加、欠失及び／若しくは置換を有し、同時にＥＧＦＲとの結合特異性を維持するアミノ酸配列と
を含む。
いくつかの実施形態では、第二抗原結合性部分の重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）は、配列番号１５のアミノ酸配列から成り、第二抗原結合性部分の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）は、配列番号１６のアミノ酸配列からなる。
いくつかの実施形態では、第二抗原結合性部分は、２つのポリペプチド鎖：
ｉ）ＶＨ２－Ｃ１－ヒンジ２－ＣＨ２－ＣＨ３により表される第二重鎖と；
ｉｉ）ＶＬ２－Ｃ２により表される第二軽鎖と
を含み；
ｉｉｉ）のＶＨ２－ＣＨ１及びＶＬ２－ＣＬは、抗ＥＧＦＲアーム（Ｕ１と呼ぶ、図１参照）を形成し、
Ｃ１及びＣ２は、少なくとも１つの非天然鎖間結合を含む二量体を形成することができ、２つのヒンジ領域及び／又は２つのＣＨ３ドメインは、二量体形成を促進することができる１つ以上の鎖間結合を形成することができる。
いくつかの実施形態では、第二抗原結合性部分は、２つのポリペプチド鎖：
ｉ）配列番号２４により表される第二重鎖又は配列番号２４と少なくとも８５％、例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは更に１００％の配列同一性を有し、同時にＥＧＦＲとの結合特異性を維持するアミノ酸配列と；
ｉｉ）配列番号２１により表される第一軽鎖又は配列番号２１と少なくとも８５％、例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは更に１００％の配列同一性を有し、同時にＥＧＦＲとの結合特異性を維持するアミノ酸配列と
を含む。
いくつかの実施形態では、第二抗原結合性部分は、２つのポリペプチド鎖：
ｉ）配列番号２４により表される第二重鎖と；
ｉｉ）配列番号２１により表される第二軽鎖と
を含む。
いくつかの実施形態では、第二抗原結合性部分は、２つのポリペプチド鎖：
ｉ）配列番号２４により表される第二重鎖；及び
ｉｉ）配列番号２１により表される第二軽鎖
からなる。
いくつかの実施形態では、第一Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域（Ｃ１ドメイン）は、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＴＣＲβ定常領域を含み、１つの好ましい実施形態では、Ｃ１ドメインは、配列番号２９により表されるＴＣＲβ定常領域を含む又はそれからなる。
いくつかの実施形態では、第二Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域（Ｃ２ドメイン）は、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＴＣＲα定常領域を含み、１つの好ましい実施形態では、Ｃ２ドメインは、配列番号３０により表されるＴＣＲα定常領域を含む又はそれからなる。
いくつかの実施形態では、Ｃ１ドメインは、配列番号２９のアミノ酸配列を含み、Ｃ２ドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。
各ＣＤＲ又は各ＶＨ若しくはＶＬへのアミノ酸の割当ては、特記されない限り、Kabat et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest (5th Ed.),US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no.91-3242; Chothia et al., 1987, PMID: 3681981; Chothia et al., 1989, PMID: 2687698; MacCallum et al., 1996, PMID:8876650; 又はDubel, Ed. (2007) Handbook of Therapeutic Antibodies,3rd Ed., Wily-VCH Verlag GmbH and Co.により提供されている番号付けスキームの１つに従ってよい。
抗体配列における可変領域及びＣＤＲを、当技術分野で開発された一般規則（上記提示されている通り、例えば、カバット番号付けシステムなど）又は公知可変領域のデータベースに対して配列をアラインメントすることによって同定することができる。これらの領域の同定方法は、Kontermann and Dubel, eds., Antibody Engineering, Springer, New York,NY,2001及びDinarello et al., Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons Inc.,Hoboken,NJ,2000に記載されている。抗体配列の好ましいデータベースは、www.bioinf.org.uk/absの「Ａｂｙｓｉｓ」ウェブサイト（ユニバーシティカレッジロンドン生化学＆分子生物学学部（英国ロンドン）のA. C. Martinにより保守されている）及びRetter et al., Nucl. Acids Res.,33（データベース発行物）: D671-D674 (2005)に記載されているwww.vbase2.orgのＶＢＡＳＥ２ウェブサイトによりアクセスすることができる。好ましくは、ＰＤＢからの構造データを含むＫａｂａｔ、ＩＭＧＴ及びタンパク質データバンク（ＰＤＢ）から配列データを集積するＡｂｙｓｉｓデータベースを用いて、配列を解析する。Dr. Andrew C. R. Martin’s book chapter Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In:Antibody Engineering Lab Manual(Ed.:Duebel, S. and Kontermann,R.,Springer-Verlag,Heidelberg,ISBN-13:978-3540413547、ウェブサイトbioinforg.uk/absでも入手可能）参照。Ａｂｙｓｉｓデータベースウェブサイトは、本明細書の教示により使用することができるＣＤＲを同定するために開発された一般規則を更に含む。特に指定されない限り、本明細書に記載されている全ＣＤＲを、ＫａｂａｔによるＡｂｙｓｉｓデータベースウェブサイトに従って誘導する。
２アミノ酸配列間の同一性パーセントを、ＰＡＭ１２０ウエイト残基表、１２のギャップ長さペナルティ及び４のギャップペナルティを用いてＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたE. Meyers及びW. Miller(Comput.Appl.Biosci.,4:11-17(1988))のアルゴリズムを用いて決定することができる。加えて、２アミノ酸配列間の同一性パーセントを、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックス、並びに１６、１４、１２、１０、８、６、又は４のギャップウエイト及び１、２、３、４、５、又は６の長さウエイトのいずれかを用いてＧＣＧソフトウェアパッケージ(http://www.gcg.comで入手可能)においてＧＡＰプログラムに組み込まれたNeedleman及びWunsch(J.Mol.Biol.48:444-453(1970))のアルゴリズムによって決定することができる。
加えて又はあるいは、本開示のタンパク質配列を、「問い合わせ配列」として更に使用して公開データベースに対してサーチを行って、例えば、関連配列を同定することができる。Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて、かかるサーチを行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質サーチを、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行って、本開示の抗体分子と相同性のアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためギャップ付きアラインメントを得るため、Altschul et al, (1997) Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402に記載されているようにギャップ付きＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。www.ncbi.nlm.nih.gov.参照。
他の実施形態では、ＣＤＲのアミノ酸配列は、上記のそれぞれの配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性であり得る。他の実施形態では、可変領域のアミノ酸配列は、上記のそれぞれの配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性であり得る。
好ましくは、単離抗体又はその抗原結合部のＣＤＲは、２アミノ酸以下、又は１アミノ酸以下の保存的置換を含む。本明細書で使用されるとき、用語「保存的置換」は、アミノ酸配列を含むタンパク質／ポリペプチドの必須特性に不都合なほどに影響も受けず変化もしないアミノ酸置換を表す。例えば、保存的置換を、部位特異的変異誘発及びＰＣＲ媒介変異誘発などの当技術分野において公知の標準的技術によって導入してよい。保存的アミノ酸置換としては、アミノ酸残基が、対応するアミノ酸残基と類似の側鎖、例えば、物理的又は機能的に類似（類似の大きさ、形状、電荷、共有結合又は水素結合の形成能を含む化学特性、その他）を有する別のアミノ酸残基により置換される置換が挙げられる。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーとしては、アルカリ性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン及びヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸）、無電荷極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。したがって、対応するアミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基により置換される。アミノ酸保存的置換の同定方法は、当技術分野において周知である（例えば、Brummell et al.,Biochem.32:1180-1187(1993);Kobayashi et al., Protein Eng.12(10):879-884(1999);及びBurks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417(1997) 参照。これらは参照により本明細書に援用される）。
特定の実施形態では、二重特異性抗体の第一抗原結合性部分及び第二抗原結合性部分を、リンカーによって相互に連結してよい。
特定の実施形態では、二重特異性抗体は、第一抗原結合性部分又は第二抗原結合性部分と機能的に連結されたＦｃ領域を更に含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＣＤ３抗原結合性部分のＣＨ１ドメインと機能的に結合している。
本開示の二重特異性抗体のＦｃ領域は、ヒトＦｃ領域であってよい。本開示の二重特異性抗体のＦｃ領域は、いずれかのアイソタイプであってよく、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４が挙げられるが、これらに限定されない。この方法の１つの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４アイソタイプである。
本開示の二重特異性抗体との関連で、Ｆｃ領域は、所望の機能の変化のないＦｃ領域の特定のキメラバージョンと比較して、１つ以上のアミノ酸変化（例えば、挿入、欠失又は置換）を含んでよい。例えば、本開示は、ＦｃとＦｃＲｎ間の改変された結合相互作用（例えば、増強又は低下）を有する改変Ｆｃ領域をもたらすＦｃ領域における１つ以上の改変を含む二重特異性抗原結合性分子を含む。かかるＦｃ改変の非限定的例としては、例えば、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域のアミノ酸配列の２２８位におけるセリン（「Ｓ」）からプロリン（「Ｐ」）への変異が挙げられる。
特定の実施形態では、第一及び／又は第二抗原結合性部分は、二重特異性である。用語「二価」は、抗原結合性分子におけるそれぞれ２つの結合部位の存在を示す。特定の実施形態では、これは、一価カウンターパートより、抗原又はエピトープとの強力な結合を提供する。特定の実施形態では、二価抗原結合性部分において、結合部位の第一結合価及び結合部位の第二結合価は、構造的に同じである（すなわち、同じ配列を有する）。
ＴＣＲ定常領域
ヒトＴＣＲα鎖定常領域は、ＴＲＡＣとして知られており、Ｐ０１８４８のＮＣＢＩ受託番号（https://www.uniprot.org/uniprot/P01848)を有し、ＷＴ ＴＣＲαドメインの配列は：
ＩＱＮＰＤＰＡＶＹＱＬＲＤＳＫＳＳＤＫＳＶＣＬＦＴＤＦＤＳＱＴＮＶＳＱＳＫＤＳＤＶＹＩＴＤＫＴＶＬＤＭＲＳＭＤＦＫＳＮＳＡＶＡＷＳＮＫＳＤＦＡＣＡＮＡＦＮＮＳＩＩＰＥＤＴＦＦＰＳＰＥＳＳ
である。
本発明における改変ＴＣＲα定常ドメインは：
ＰＤＩＱＮＰＤＰＡＶＹＱＬＲＤＳＫＳＳＤＫＳＶＣＬＦＴＤＦＤＳＱＴＱＶＳＱＳＫＤＳＤＶＹＩＴＤＫＣＶＬＤＭＲＳＭＤＦＫＳＮＳＡＶＡＷＳＱＫＳＤＦＡＣＡＮＡＦＱＮＳＩＩＰＥＤＴＦＦＰＳＰＥＳＳ（配列番号３０）
である。
ヒトＴＣＲβ鎖定常領域は、ＴＲＢＣ１及びＴＲＢＣ２（ＩＭＧＴ命名法）として知られている２つの異なる多様体を有する。本発明では、野生型ＴＣＲβドメインの配列は：
ＤＬＫＮＶＦＰＰＫＶＡＶＦＥＰＳＥＡＥＩＳＨＴＱＫＡＴＬＶＣＬＡＴＧＦＹＰＤＨＶＥＬＳＷＷＶＮＧＫＥＶＨＳＧＶＳＴＤＰＱＰＬＫＥＱＰＡＬＮＤＳＲＹＣＬＳＳＲＬＲＶＳＡＴＦＷＱＮＰＲＮＨＦＲＣＱＶＱＦＹＧＬＳＥＮＤＥＷＴＱＤＲＡＫＰＶＴＱＩＶＳＡＥＡＷＧＲであり、Ａ０Ａ５Ｂ９のＮＣＢＩ受託番号(https://www.uniprot.org/uniprot/A0A5B9)
を有し、本発明における改変ＴＣＲβ定常ドメインは：
ＬＥＤＬＫＮＶＦＰＰＥＶＡＶＦＥＰＳＥＡＥＩＳＨＴＱＫＡＴＬＶＣＬＡＴＧＦＹＰＤＨＶＥＬＳＷＷＶＮＧＫＥＶＨＳＧＶＣＴＤＰＱＰＬＫＥＱＰＡＬＱＤＳＲＹＡＬＳＳＲＬＲＶＳＡＴＦＷＱＮＰＲＮＨＦＲＣＱＶＱＦＹＧＬＳＥＮＤＥＷＴＱＤＲＡＫＰＶＴＱＩＶＳＡＥＡＷＧＲ（配列番号２９）
である。
本開示では、本明細書で提供されているポリペプチド複合体の第一及び第二ＴＣＲ定常領域は、ＴＣＲ定常領域間において、二量体を安定化することができる少なくとも１つの非天然鎖間結合を含む二量体を形成することができる。
本明細書で使用されるとき、用語「二量体」は、共有又は非共有相互作用によりポリペプチド又はタンパク質などの２つの分子によって形成された結合構造を表す。ホモ二量体又はホモ二量体化を２つの同じ分子によって形成し、ヘテロ二量体又はヘテロ二量体化を２つの異なる分子によって形成する。第一及び第二ＴＣＲ定常領域により形成された二量体は、ヘテロ二量体である。
鎖間結合を、１つのＴＣＲ定常領域上の１つのアミノ酸残基及び他のＴＣＲ定常領域上のもう１つのアミノ酸残基間で形成する。特定の実施形態では、非天然鎖間結合は、２つのＴＣＲ定常領域を二量体に結合することができるいずれかの結合又は相互作用であり得る。適切な非天然鎖間結合の例としては、ジスルフィド結合、水素結合、静電相互作用、塩架橋、又は疎水性－親水性相互作用、ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）又はこれらの組合せが挙げられる。
「ジスルフィド結合」は、構造Ｒ－Ｓ－Ｓ－Ｒを有する共有結合を表す。アミノ酸システインは、例えば、別のシステイン残基からの第二チオール基とジスルフィド結合を形成することができるチール基を含む。ジスルフィド結合は、２つのポリペプチド鎖上のそれぞれに存在する２つのシステイン残基のチオール基間で形成され、それにより、鎖間架橋又は鎖間結合を形成する。
本明細書で使用されるとき、「非天然」鎖間結合は、天然カウンタパートＴＣＲ定常領域の天然会合において見られない鎖間結合を表す。例えば、非天然鎖間結合を、各々がそれぞれのＴＣＲ定常領域に存在する変異アミノ酸残基及び天然アミノ酸残基；あるいはＴＣＲ定常領域にそれぞれに存在する２つの変異アミノ酸残基間で形成することができる。特定の実施形態では、少なくとも１つの非天然鎖間結合を、ポリペプチド複合体の第一ＴＣＲ定常領域に含まれる第一変異残基及び第二ＴＣＲ定常領域に含まれる第二変異残基間で形成する。
本明細書で使用されるとき、用語「接触界面」は、ポリペプチドが相互に相互作用／結合するポリペプチド上の特定の領域を表す。接触界面は、相互作用が起こる場合に接触又は結合する対応するアミノ酸残基と相互作用することができる１つ以上のアミノ酸残基を含む。接触界面におけるアミノ酸残基は、連続配列であってもよく、そうでなくてもよい。例えば、界面が三次元である場合、界面内のアミノ酸残基を、直鎖配列上の異なる位置において分離してよい。
二重特異性抗体の生成
本明細書で提供されている二重特異性抗体及び抗原結合性フラグメントを、当技術分野において公知のいずれかの適切な方法を用いて作成することができる。従来手法では、２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対を、組換え方法で二重特異性抗体を産生するために宿主細胞内で同時発現させることができ（例えば、Milstein and Cuello, Nature, 305:537 (1983)参照）、次いで、親和性クロマトグラフィーによって精製する。
組換え手法も使用してよく、２特異性のため抗体重鎖可変ドメインをコードする配列を、免疫グロブリン定常ドメイン配列しそれぞれ融合し、次いで、二重特異性抗体の組換え発現のため、軽鎖配列のための発現ベクターを適切な宿主細胞にコトランスフェクトされた発現ベクターに挿入する（例えば、国際公開第９４／０４６９０号パンフレット;Suresh et al., Methods in Enzymology,121:210(1986)参照）。同様に、ｓｃＦｖ二量体を、組換えで構築して宿主細胞から発現することもできる（例えば、Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)参照）。
別の方法では、Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に結合することができる。結合された抗体をヒンジ領域において４つの半抗体（すなわち、単量体）に還元し、次いで、再酸化してヘテロ二量体を形成する（Kostelny et al.,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992)）。
２つの抗原結合性ドメインを結合又は架橋して、二重特異性抗体又は抗原結合性フラグメントを形成してもよい。例えば、１つの抗体をビオチンとカップリングし、一方、他の抗体をアビジンとカップリングし、ビオチンとアビジンとの強力な会合は、２つの抗体を複合体形成して二重特異性抗体を形成することができる（例えば、米国特許第４，６７６，９８０（Ｂ２）号明細書；国際公開第９１／００３６０号パンフレット；国際公開第９２／００３７３号パンフレット、及び欧州特許第０３０８９号明細書参照）。別の例のため、２つの抗体又は抗原結合性フラグメントを、例えば、米国特許第４，６７６，９８０（Ｂ２）号明細書に開示されているように、当技術分野において公知の従来方法によって架橋することができる。
二重特異性抗原結合性フラグメントを、例えば、タンパク質切断、又は化学結合によって二重特異性抗体から生成してよい。例えば、抗体の抗原結合性フラグメント（例えば、Ｆａｂ5）を調製し、Ｆａｂ’－チオール誘導体に転換し、次いで、異なる抗原特異性を有する別の転換されたＦａｂ5誘導体と混合・反応して、二重特異性抗原結合性フラグメントを形成してよい（例えば、Brennan et al.,Science,229:81 (1985)参照）。
開示の抗体をコードする核酸分子
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示されている二重特異性抗体又は抗原結合部をコードする核酸配列を含む単離核酸分子を対象とする。例えば、核酸配列は、二重特異性抗体の重鎖及び／又は軽鎖をコードしてよい。
ＣＤ３結合性部分の重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）をコードする単離核酸分子は：
（Ａ）配列番号１３に記載されている重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）をコードする核酸配列か；
（Ｂ）配列番号１７に記載されている核酸配列か；又は
（Ｃ）高ストリンジェンシー条件下、（Ａ）若しくは（Ｂ）の核酸配列の相補鎖にハイブリダイズした核酸配列
からなる群から選択される核酸配列を含んでよい。
ＣＤ３結合性部分の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）をコードする単離核酸分子は：
（Ａ）配列番号１４に記載されている軽鎖可変ドメイン（VL1）をコードする核酸配列か；
（Ｂ）配列番号１８に記載されている核酸配列か；又は
（Ｃ）高ストリンジェンシー条件下、（Ａ）若しくは（Ｂ）の核酸配列の相補鎖にハイブリダイズした核酸配列
からなる群から選択される核酸配列を含んでよい。
ＥＧＦＲ結合性部分の重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）をコードする単離核酸分子は：
（Ａ）配列番号１５に記載されている重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）をコードする核酸配列か；
（Ｂ）配列番号１９に記載されている核酸配列か；又は
（Ｃ）高ストリンジェンシー条件下、（Ａ）若しくは（Ｂ）の核酸配列の相補鎖にハイブリダイズした核酸配列
からなる群から選択される核酸配列を含んでよい。
ＥＧＦＲ結合性部分の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）をコードする単離核酸分子は：
（Ａ）配列番号１６に記載されている軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）をコードする核酸配列か；
（Ｂ）配列番号２０に記載されている核酸配列か；又は
（Ｃ）高ストリンジェンシー条件下、（Ａ）若しくは（Ｂ）の核酸配列の相補鎖にハイブリダイズした核酸配列
からなる群から選択される核酸配列を含んでよい。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＤ３結合性部分の重鎖をコードする単離ヌクレオチド配列であって、ＣＤ３結合性部分の重鎖をコードする単離ヌクレオチド配列は：
（Ａ）配列番号２３に記載されている重鎖をコードする核酸配列か；
（Ｂ）配列番号２７に記載されている核酸配列か；又は
（Ｃ）高ストリンジェンシー条件下、（Ａ）若しくは（Ｂ）の核酸配列の相補鎖にハイブリダイズした核酸配列
からなる群から選択される核酸配列を含む又はそれからなる。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＤ３結合性部分の軽鎖をコードする単離ヌクレオチド配列をであって、ＣＤ３結合性部分の軽鎖をコードする単離ヌクレオチド配列は：
（Ａ）配列番号２２に記載されている重鎖をコードする核酸配列か；
（Ｂ）配列番号２６に記載されている核酸配列か；又は
（Ｃ）高ストリンジェンシー条件下、（Ａ）若しくは（Ｂ）の核酸配列の相補鎖にハイブリダイズした核酸配列
からなる群から選択される核酸配列を含む又はそれからなる。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＥＧＦＲ結合性部分の重鎖をコードする単離ヌクレオチド配列であって、ＥＧＦＲ結合性部分の重鎖をコードする単離ヌクレオチド配列は：
（Ａ）配列番号２４に記載されている重鎖をコードする核酸配列か；
（Ｂ）配列番号２８に記載されている核酸配列か；又は
（Ｃ）高ストリンジェンシー条件下、（Ａ）若しくは（Ｂ）の核酸配列の相補鎖にハイブリダイズした核酸配列
からなる群から選択される核酸配列を含む又はそれからなる。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＥＧＦＲ結合性部分の軽鎖をコードする単離ヌクレオチド配列であって、ＥＧＦＲ結合性部分の軽鎖をコードする単離ヌクレオチド配列は：
（Ａ）配列番号２１に記載されている重鎖をコードする核酸配列か；
（Ｂ）配列番号２５に記載されている核酸配列か；又は
（Ｃ）高ストリンジェンシー条件下、（Ａ）若しくは（Ｂ）の核酸配列の相補鎖にハイブリダイズした核酸配列
からなる群から選択される核酸配列を含む又はそれからなる。
いくつかの態様では、開示は、本明細書に開示されている核酸配列を含むベクターを対象とする。更なる実施形態では、発現ベクターは、二重特異性抗体、例えば、ヒト化二重特異性抗体の定常領域をコードするヌクレオチド配列を更に含む。
本開示との関連のベクターはいずれかに適切なベクターであってよく、染色体ベクター、非染色体ベクター、及び合成核酸ベクター（適切なセットの発現調節エレメントを含む核酸配列）を含む。かかるベクターの例としては、ＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミド及びファージＤＮＡの組合せから誘導されるベクター、並びにウイルス性核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ）ベクターが挙げられる。１つの実施形態では、ＣＤ３又はＥＧＦＲ抗体をコードする核酸は、ネイキッドＤＮＡ又はＲＮＡベクターに含まれ、例えば、直鎖発現エレメント（例えば、Ｓｙｋｅｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ １７，３５５－５９（１９９７）に記載されている）、凝縮核酸ベクター（例えば、米国特許第６，０７７，８３５号明細書及び／又は国際公開第００／７００８７号パンフレットに記載されている）、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９／１８、又はｐＵＣ１１８／１１９、「ミジ」最小核酸ベクターなどのプラスミドベクター（例えば、Schakowski et al., Mol Ther 3,793-800 (2001) に記載されている）、又はＣａＰ０４沈殿構築物などの沈殿核酸ベクター構築物（例えば、国際公開第２０００／４６１４７号パンフレット、Benvenisty and Reshef、米国科学アカデミー紀要83, 9551-55 (1986), Wigler et al., Cell 14,725 (1978)、及びCoraro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7 603(1981)に記載されている）が挙げられる。かかる核酸ベクター及びその使用は、当技術分野において周知である（例えば、米国特許５，５８９，４６６号明細書及び米国特許第５，９７３，９７２号明細書参照）。
１つの実施形態では、ベクターは、細菌細胞における抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＥＧＦＲ抗体の発現に適している。かかるベクターの例としては、BlueScript(Stratagene), pINベクター（Van Heeke & Schuster, J Biol Chem 264,5503-5509(1989)、ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国ワイオミング州マディソン）及び同様のもの）が挙げられる。ベクターは、同じく又は代替的に、酵母系における発現に適したベクターであってよい。酵母系における発現に適したいずれのベクターも使用してよい。適切なベクターとしては、例えば、α因子、アルコール酸化酵素及びＰＧＨなどの構成的又は誘導性プロモーターを含むベクターが挙げられる（F.Ausubel et al.,ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York(1987)、及びGrant et al., Methods in Enzymol 153,516-544(1987)に概説されている）。
ベクターは、同じく又は代替的に、哺乳類細胞における発現に適したベクターであってよく、例えば、Bebbington (1992)Biotechnology (NY)10:169-175に記載されているベクターなど、選択可能なマーカーとしてグルタミン合成酵素を含むベクターが挙げられる。
核酸及び／又はベクターは、分泌／局在化配列をコードする核酸配列も含んでよく、これは、新生ポリペプチド鎖などのポリペプチドの標的を細胞膜周辺腔又は細胞培養培地中とすることができる。かかる配列は当技術分野において公知であり、分泌リーダー又はシグナル伝達ペプチドが挙げられる。
ベクターは、適切なプロモーター、エンハンサー、及び他の発現促進要素を含んでよい又は関連してよい。かかる要素の例としては、強力な発現プロモーター（例えば、ヒトＣＭＶ ＩＥプロモーター／エンハンサー並びにＲＳＶ、ＳＶ４０、ＳＬ３－３、ＭＭＴＶ、及びＨＩＶ ＬＴＲプロモーター）、有効ポリ（Ａ）終止配列、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のプラスミド産物のための複製開始点、選択可能なマーカーとしての抗生物質耐性、及び／又は簡便なクローニング部位（例えば、ポリリンカー）が挙げられる。核酸は、ＣＭＶ ＩＥなどの構成的プロモーターとは対照的に誘導性プロモーターを含んでもよい。
なお更なる態様では、本開示は、上記本明細書で規定されたベクターを含む宿主細胞に関する。
したがって、本開示は、トランスフェクトーマなど、本開示の二重特異性抗体を産生する組換え真核又は原核宿主細胞にも関する。
ＣＤ３特異性抗体を、トランスフェクトーマなどの組換え真核又は原核宿主細胞において発現してよく、本明細書で定義されている本開示の抗体又は本明細書で定義されている本開示の二重特異性抗体を産生する。同様に、ＥＧＦＲ特異性抗体を、トランスフェクトーマなどの組換え真核又は原核宿主細胞において発現してよく、本明細書で定義されている本開示の抗体又は本明細書で定義されている本開示の二重特異性抗体を産生する。
宿主細胞の例としては、酵母、細菌、植物及びＣＨＯ、ＣＨＯ－Ｓ、ＨＥＫ、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ－２９３Ｆ、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ、ＰＥＲ．Ｃ６若しくはＮＳＯ細胞又はリンパ球細胞などの哺乳類細胞が挙げられる。例えば、１つの実施形態では、宿主湯細胞は、細胞ゲノムに安定に組み込まれた第一及び第二核酸構築物を含んでよい。別の実施形態では、本開示は、プラスミド、コスミド、ファージミド、又は直鎖発現要素などの非統合核酸を含む細胞であって、上記規定されている第一及び第二核酸構築物を含む、細胞を提供する。
なお更なる態様では、本開示は、ヒト重鎖及びヒト軽鎖の１つ又は２つのセットをコードする核酸を含むトランスジェニック非ヒト動物又は植物に関し、前記動物又は植物は、本開示の二重特異性抗体を産生する。
更なる態様では、本開示は、本明細書で定義されている本開示の二重特異性抗体において使用するための抗体を産生するハイブリドーマに関する。なお更なる態様では、本開示は、ヒト重鎖及びヒト軽鎖の１つ又は２つのセットをコードする核酸を含むトランスジェニック非ヒト動物又は植物に関し、前記動物又は植物は、本開示の二重特異性抗体において使用するための抗体又は二重特異性抗体を産生する。
１つの態様では、本開示は：
（ｉ）本明細書に開示されている実施形態のいずれか１つによる第一抗原結合性部分の重鎖可変領域及び／又は第二抗原結合性部分の重鎖可変領域をコードし、必要に応じてＣＨ１ドメイン又はＣＬドメインを更にコードする核酸配列か；
（ｉｉ）本明細書に開示されている実施形態のいずれか１つによる第一抗原結合性部分の軽鎖可変領域及び／又は第二抗原結合性部分の軽鎖可変領域をコードする核酸配列か；
（ｉｉｉ）ＴＣＲβ定常ドメイン又はＴＣＲα定常ドメインをコードする核酸配列か；
（ｉｖ）Ｆｃ領域をコードする核酸配列か；
（ｖ）リンカーをコードする核酸配列か；又は
（ｖｉ）上記の少なくとも２つの組合せ
を含む発現ベクターに関する。
１つの態様では、本開示は、配列リストに記載されている１つ以上のアミノ酸配列をコードする核酸構築物に関する。
１つの態様では、本開示は、本明細書に開示されている実施形態のいずれか１つによる二重特異性抗体の産生方法であって、前記方法は、本明細書に開示されている発現ベクター又は複数の発現ベクターを含む本明細書に開示されている宿主細胞を培養するステップ、本明細書に開示されている二重特異性抗体を発現するステップ及び培養培地から前記抗体を精製するステップを含む、方法に関する。１つの態様では、本開示は、上記定義されている発現ベクターを含む宿主細胞に関する。１つの実施形態では、宿主細胞は、組換え真核宿主細胞、又は組換え原核宿主細胞である。
医薬組成物
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示されている少なくとも１つの抗体又はその抗原結合部及び薬剤的に許容可能な担体を含む医薬組成物を対象とする。
組成物の成分
医薬組成物は、必要に応じて、別の抗体又は薬物など、１つ以上の追加の薬剤的に有効な成分を含んでよい。本開示の医薬組成物を、例えば、別の免疫刺激薬、抗がん薬、抗ウイルス薬、又は抗ＣＤ３／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体がワクチンに対して免疫応答を増強するようなワクチンとの併用療法で投与することもできる。薬剤的に許容可能な担体としては、例えば、薬剤的に許容可能な液体、ゲル又は固体担体、水性媒体、非水性媒体、抗菌薬、等張剤、バッファ、酸化防止剤、麻酔薬、懸濁剤／分散剤、キレート剤、希釈剤、アジュバント、賦形剤又は無毒性補助物質、当技術分野で公知の他のもの、少なくとも成分の様々な組合せを挙げることができる。
適切な成分としては、例えば、酸化防止剤、充填剤、結合剤、崩壊剤、バッファ、保存剤、潤滑剤、香料、増粘剤、着色料、糖類及びシクロデキストリンなどの乳剤又は安定剤を挙げることができる。適切な酸化防止剤としては、例えば、メチオニン、アスコルビン酸、ＥＤＴＡ、チオ硫酸ナトリウム、白金、カタラーゼ、クエン酸、システイン、メルカプトグリセロール、チオグリコール酸、メルカプトソルビトール、ブチルメチルアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン及び／又は没食子酸プロピル（ｐｒｏｐｙｌｇａｌａｃｔｅ）を挙げることができる。本開示に開示されているように、本開示の抗体又は抗原結合性フラグメントを含む溶媒では、本開示の組成物は、メチオニンなどの１つ以上の抗酸化剤を含み、還元抗体又はその抗原結合性フラグメントを酸化してよい。酸化還元は、結合親和性の低下を防止又は低減し得、それにより、抗体安定性を向上し、有効寿命を延ばす。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上の抗体又はその抗原結合性フラグメント及びメチオニンなどの１つ以上の酸化防止剤を含む組成物を提供する。本開示は、抗体又はその抗原結合性フラグメントをメチオニンなどの１つ以上の酸化防止剤と混合し、その結果、抗体又はその抗原結合性フラグメントを酸化から防止してその有効寿命を延ばし及び／又は活性を増強する、様々な方法を更に提供する。
更に例証するため、薬剤的に許容可能な担体としては、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、等張性デキストロース注射液、滅菌水注射液、若しくはデキストロース、及び乳酸加リンガー注射液、植物由来の固定油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、若しくはピーナッツ油などの非水性媒体、静菌性又は静真菌性濃度の抗菌薬、塩化ナトリウム若しくはデキストロースなどの等張剤、リン酸若しくはクエン酸バッファ、重硫酸ナトリウムなどの酸化防止剤、プロカイン塩酸塩などの局所麻酔薬、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、若しくはポリビニルピロリドンなどの懸濁剤及び分散剤、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ－８０）などの乳剤、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）若しくはＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸）などの封鎖剤若しくはキレート剤、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸、又は乳酸を挙げることができる。担体として利用される抗菌薬を、フェノール類又はクレゾール、水銀剤、ベンジルアルコール、クロロブタノール、ｐ－ヒドロキシ安息香酸メチル及びプロピルエステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウム及び塩化ベンゼトニウムを含む複数回投与用容器中の医薬組成物に添加してよい。適切な賦形剤としては、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、又はエタノールを挙げることができる。適切な無毒性補助物質としては、例えば、湿潤剤若しくは乳剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、可溶化剤、又は酢酸ナトリウム、ソルビタンラウリン酸モノエステル、トリエタノールアミンオレイン酸塩、又はシクロデキストリンなどの薬剤を挙げることができる。
投与、製剤及び投与量
これに限定されないが、経口投与、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、非経口投与、鼻腔内投与、筋肉内投与、頭蓋内投与、心臓内投与、脳室内投与、気管内投与、口腔内投与、直腸内投与、腹腔内投与、皮内投与、局所投与、経皮投与、及びくも膜下腔内、又は移植若しくは吸入による他の経路を含む様々な経路によって、本開示の医薬組成物を、それを必要とする対象にインビボ投与してよい。主題の組成物を、固体、半固体、液体、又は気体の製剤に調製してよく；錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏剤、液剤、坐剤、浣腸剤、注射剤、吸入剤、及びエアロゾル剤が挙げられるが、これに限定されない。投与の適切な製剤及び経路を、目的の用途及び治療レジメンに応じて選択してよい。
腸内投与用の適切な製剤としては、硬質若しくは軟質ゼラチンカプセル剤、丸剤、コーティング錠を含む錠剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤又は吸入薬及びその徐放剤形が挙げられる。
非経口投与（例えば、注射により）に適した製剤としては、有効成分が溶解、懸濁、又は他の方法で提供されている（例えば、リポソーム又は他のマイクロ粒子中）水性液剤若しくは非水性液剤、等張剤、パイロジェンフリー液剤、滅菌液（例えば、液剤、懸濁剤）が挙げられる。かかる液剤は、酸化防止剤、バッファ、保存剤、安定剤、静菌剤、懸濁剤、増粘剤、及び製剤を目的のレシピエントの血液（又は他の関連体液）と等圧にする溶質などの他の薬剤的に許容可能な成分を付加的に含有してよい。賦形剤の例としては、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセロ－ル、植物油、及び同様のものが挙げられる。かかる製剤において使用するための適切な等張性担体の例としては、塩化ナトリウム注射液、リンゲル液、又は乳酸加リンガー液が挙げられる。同様に、用量、タイミング及び反復を含む特定の投与レジメンは、特定の個体及びその個体の病歴、並びに薬物動態（例えば、有効寿命、クリアランス速度、その他）などの経験的考察に依存するだろう。
投与頻度を決定し、治療過程にわたって調節してよく、増殖又は腫瘍原性細胞数の低減、かかる新生細胞の減少の維持、新生細胞の増殖の低減、又は転移巣形成の遅延に基づく。いくつかの実施形態では、投与される投与量を調整又は減らして副作用及び／又は毒性の可能性を管理してよい。あるいは、対象の治療用組成物の持効性連続的放出製剤が、適切である場合がある。
適切な投与量は患者によって異なり得ることは、当業者により理解されているだろう。最適な投与量の決定は、総じて、あいすれかのリスク又は有害副作用に対する治療効果レベルのバランスに関わるだろう。選択された投与量レベルは、これに限定されないが、特定の化合物の活性、投与経路、投与回数、化合物の***速度、治療期間、併用して使用される他の薬物、化合物及び／又は物質、病態の重症度、並びに患者の種、性別、年齢、体重、病態、総合的健康状態、及び既往歴を含む様々な因子に依存するだろう。総じて、投与量は実質的有害又は有害副作用を引き起こさないで所望の効果を達成する作用部位における局所濃度を達成するように選択されるだろうが、化合物量及び投与経路は、最終的に、医師、獣医師、又は臨床医の裁量によるだろう。
総じて、本開示の抗体又はその抗原結合部を、様々な範囲で投与してよい。これらとしては、投与当たり約５μｇ／体重ｋｇ～約１００ｍｇ／体重ｋｇ；投与当たり約５０μｇ／体重ｋｇ～約５ｍｇ／体重ｋｇ；投与当たり約１００μｇ／体重ｋｇ～約１０ｍｇ／体重ｋｇが挙げられる。他の範囲は、投与当たり約１００μｇ／体重ｋｇ～約２０ｍｇ／体重ｋｇ及び投与当たり約０．５ｍｇ／体重ｋｇ～約２０ｍｇ／体重ｋｇを含む。特定の実施形態では、投与量は、少なくとも約１００μｇ／体重ｋｇ、少なくとも約２５０μｇ／体重ｋｇ、少なくとも約７５０μｇ／体重ｋｇ、少なくとも約３ｍｇ／体重ｋｇ、少なくとも約５ｍｇ／体重ｋｇ、少なくとも約１０ｍｇ／体重ｋｇである。
いずれにしても、本開示の抗体又はその抗原結合部を、好ましくは、それを必要とする対象に必要に応じて投与する。治療される病態の考察、治療される対象の年齢、治療される病態の重症度、治療される対象の健康の全身状態及び同様のことに基づいて主治医などの当業者によって投与頻度の決定を行ってよい。
特定の好ましい実施形態では、本開示の抗体又はその抗原結合部を含む治療過程は、数週又は数ヶ月の期間にわたって選択された製剤の反復投与を含むだろう。より詳細には、本開示の抗体又はその抗原結合部を、１日１回、隔日１回、４日毎に１回、毎週１回、１０日毎に１回、２週間に１回、３週間に１回、毎月１回、６週間に１回、２ヶ月に１回、１０週間に１回又は３ヶ月に１回投与してよい。これに関して、患者の応答及び診療に基づいて投与量を変更してもよく、間隔を調整してもよいことは理解されるだろう。
投与量及びレジメンを、１回以上の投与を与えられた個体における本開示の治療用組成物について経験的に決定してもよい。例えば、本明細書に記載されているように産生された治療用組成物の増加的投与量を個体に与えてよい。選択された実施形態では、経験的に決定又は観察された副作用又は毒性にそれぞれ基づいて、投与量を徐々に増加又は減少若しくは減弱してよい。選択された組成物の有効性を評価するため、特定の疾病、障害又は病態のマーカーを、上記のように追跡することができる。がんのため、これらとしては、触診若しくは目視観察による腫瘍量の直接的測定、Ｘ線若しくは他のイメージング技術による腫瘍量の間接的測定；直接的腫瘍生検及び腫瘍サンプルの顕微鏡検査により評価されるときの改善；間接的腫瘍マーカー（例えば、前立腺がんのためのＰＳＡ）若しくは本明細書に記載されている方法により特定された腫瘍原性抗原、疼痛若しくは麻痺の低減の測定；腫瘍に関連する発声、視覚、呼吸若しくは他の能力障害の改善；食欲低下；又は公認試験により測定される生活の質若しくは生存率の延長の増加が挙げられる。腫瘍性病態が個体の他の場所に転移し始めた、並びに過去及び現在の治療を使用しているかどうかにかかわらず、投与量は、個体、腫瘍性病態の種類、腫瘍性病態の段階に依存して異なることを当業者には明白であろう。
非経口投与（例えば、静脈内注射）に適合した製剤は、約１０μｇ／ｍｌ～約１００ｍｇ／ｍｌの濃度で本明細書に開示されている抗体又はその抗原結合部を含むだろう。特定の選択された実施形態では、抗体又はその抗原結合部の濃度は、２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、６０μｇ／ｍｌ、８０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、３００、μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌ又は１ｍｇ／ｍｌを含むだろう。他の好ましい実施形態では、ＡＤＣ濃度は、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１２ｍｇ／ｍｌ、１４ｍｇ／ｍｌ、１６ｍｇ／ｍｌ、１８ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、３５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、４５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌ又は１００ｍｇ／ｍｌを含むだろう。
本開示の応用
いくつかの態様では、本開示は、対象における障害の治療方法であって、前記方法は、本明細書に開示されている抗体又はその抗原結合部の治療有効量を治療を必要としている対象（例えば、ヒト）に投与することを含む、方法を提供する。例えば、障害は、がんである。
悪性か良性にかかわらず、かつ原発性か続発性かにかかわらず、ＣＤ３及び／又はＥＧＦＲが関連する様々ながんを本開示により提供されている方法を用いて治療又は予防してよい。がんは、固形がん又は血液悪性腫瘍であり得る。かかるがんの例としては、気管支原性肺がんなどの肺がん（例えば、扁平上皮がん、小細胞がん、大細胞がん、及び腺がん）、肺胞細胞がん、気管支腺腫、軟骨性過誤腫（非がん性）、及び肉腫（がん性）；粘液腫、線維腫、及び横紋筋腫などの心臓がん；骨軟骨腫、軟骨腫（ｃｏｎｄｒｏｍａｓ）、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫、類骨腫、軟骨肉腫、多発性骨髄腫、骨肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、ユーイング腫瘍（ユーイング肉腫）、及び細網肉腫などの骨がん；グリオーマ（例えば、多形神経膠芽腫）、未分化星状細胞腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、髄芽腫、脊索腫、シュワン腫、上衣腫、髄膜腫、下垂体腺腫、松果体腫、骨腫、血管芽腫、頭蓋咽頭腫、脊索腫、胚細胞腫、奇形腫、類皮嚢胞、及び血管腫などの脳がん；結腸がん、平滑筋腫、類表皮がん、腺がん、平滑筋肉腫、胃腺がん、腸管脂肪腫、小腸神経線維腫、腸線維腫、大腸ポリープ、及び結腸直腸がんなどの消化器系のがん；肝細胞腺腫、血管腫、肝細胞がん、線維性層板状がん、胆管細胞がん、肝芽腫、及び血管肉腫などの肝がん；腎臓腺がん、腎細胞がん、グラヴィッツ腫瘍、及び腎盂の移行上皮がんなどの腎がん；膀胱がん；基底細胞がん、扁平上皮がん、メラノーマ、カポジ肉腫、及びパジェット病などの皮膚がん；頭頸部がん；網膜芽細胞腫及びクロランブチ黒色腫などの眼関連がん；良性前立腺肥大症、前立腺がん、及び精巣がんなどの***系がん（セミノーマ、テラトーマ、胚性がん腫、及び絨毛がん）；乳がん；子宮がん（子宮内膜がん）、子宮頸がん（子宮頸癌）、卵巣のがん（卵巣がん）、外陰部がん、膣がん、卵管がん、及び胞状奇胎などの女性生殖器系がん；甲状腺がん（乳頭がん、濾胞がん、未分化がん又は髄様がんを含む）；褐色細胞腫（副腎）；副甲状腺の非がん性増殖；膵がんが挙げられる。特定の実施形態では、がんは、結腸がんである。
化学療法との併用使用
抗原又はその抗原結合部を、抗がん薬、細胞傷害性薬又は化学療法薬と併用して使用してよい。
用語「抗がん薬」又は「抗増殖薬」は、がんなどの細胞増殖性疾患を治療するために使用することができるいずれもの薬剤を意味し、細胞傷害性薬、細胞***阻害薬、抗血管新生薬、腫瘍減量薬、化学療法薬、放射線療法及び放射線治療薬、標的抗がん薬、ＢＲＭ、治療用抗体、がんワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、放射線療法及び抗転移薬並びに免疫療法薬が挙げられるが、これらに限定されない。上記の選択された実施形態では、かかる抗がん薬は、複合体を含んでよく、投与前に本開示の部位特異性抗体と関連してよい。より詳細には、特定の実施形態では、選択された抗がん薬は、改変抗体の不対システインと結合して、本明細書に記載されている改変複合体を得るだろう。したがって、かかる改変複合体は、本開示の範囲内にあると明示的に意図される。他の実施形態では、本開示の抗がん薬は、上記異なる治療薬を含む部位特異性複合体と併用して与えられるだろう。
本明細書で使用されるとき、用語「細胞傷害性薬」は、細胞に毒性であり、細胞の機能を低減若しくは阻害する、及び／又は細胞の破壊を引き起こす物質を意味する。特定の実施形態では、物質は、生物由来の天然分子である。細胞傷害性薬の例としては、細菌の小分子毒素又は酵素活性毒素（例えば、ジフテリア毒素、緑膿菌毒素及び外毒素、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ）、真菌（例えば、α－サルシン、レストリクトシン）、植物（例えば、アブリン、リシン、モデシン、ビスキュミン、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリン、ゲロニン、モモルジン、トリコサンチン、オオムギ毒素、シナアブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ－Ｓ）、ニガウリインヒビター、クルシン、クロチン、ロラムブ・オフィシナリス（ｈｌｏｒａｍｂｕ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）インヒビター、ゲロニン、ミテゲリン（ｍｉｔｅｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン、ネオマイシン、及びトリコテセン類）又は動物（例えば、細胞外膵臓ＲＮＡ分解酵素などの細胞傷害性ＲＮＡ分解酵素；ＤＮＡ分解酵素並びにそのフラグメント及び／又は多様体）が挙げられるが、これらに限定されない。
本開示の目的のため、「化学療法薬」は、がん細胞の成長、増殖、及び／又は生存を非特異的に低減又は阻害する化学化合物（例えば、細胞傷害性又は細胞***阻害薬）を含む。かかる価額約は、しばしば、細胞増殖又は***に必要な細胞内過程に弓道され、したがって、総じて急速に増殖・***するがん性細胞に対して特に効果的である。例えば、ビンクリスチンは、微小管を脱重合し、したがって、細胞が有糸***に入るのを阻害する。総じて、化学療法薬は、がん性細胞又はがんになる若しくは腫瘍原性子孫を生成する可能性がある細胞（例えば、ＴＩＣ）を阻害する、又は阻害するように設計されたいずれもの化学薬剤を含むことができる。かかる薬剤は、例えば、ＣＨＯＰ又はＦＯＬＦＩＲＩなどのレジメンで、併用して投与されることが多く、最も効果的であることが多い。
本開示の部位特異性構築物（部位特異性複合体の成分として又は非複合体状態のいずれか）と併用して使用してよい抗がん薬の例としては、アルキル化剤、スルホン酸アルキル、アジリジン類、エチレンイミン及びメチルメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）、アセトゲニン、カンプトテシン、ブリオスタチン、カリスタチン、ＣＣ－１０６５、クリプトフィシン、ドラスタチン、デュオカルマイシン、エリュテロビン、カリスタチン、サルコジクチン、スポンギスタチン、ナイトロジェンマスタード、抗生物質、エンジイン抗生物質、ダイネミシン、ビスホスホネート製剤、エスペラミシン、色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルチノフィリン、クロモマイシニス（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ADRIAMYCIN（登録商標）ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、ミトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗薬、エルロチニブ、ベムラフェニブ、クリゾチニブ、ソラフェニブ、イブルチニブ、エンザルタミド、葉酸誘導体、プリン誘導体、アンドロゲン、抗アドレナリン薬、フォリン酸などの葉酸補給薬、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン、ベストラブシル、ビサントレン、エダトラキサート、デフォファミン、デメコルシン、ジアジクオン、エフロルニチン、エリプチニウム酢酸塩、エポチロン、エトグルシド、ガリウム硝酸塩、ヒドロキシウレア、レンチナン、ロニダイニン、マイタンシノイド、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダンモール、ニトラエリン、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ロソキサントロン、ポドフィリン酸、２－エチルヒドラジド、プロカルバジン、PSK（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、米国オレゴン州ユージーン）、ラゾキサン、リゾキシン、シゾフィラン、スピロゲルマニウム、テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’－トリクロロトリエチルアミン；トリコテシン類（特に、Ｔ－２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、クロランブシル；GEMZAR（登録商標）ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金誘導体、ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；NAVELBINE（登録商標）ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロン酸；イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ、ＣＰＴ－１１）、トポイソメラーゼ阻害薬ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｌｈｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；レチノイド類；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン；オキサリプラチン；細胞増殖を低下させるＰＫＣ－α、Ｒａｆ、Ｈ－Ｒａｓ、ＥＧＦＲ及びＶＥＧＦ－Ａの阻害薬及び上記のいずれかの薬剤的に許容可能な塩、酸又は誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。抗エストロゲン、選択的エストロゲン受容体修飾因子、酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害薬などの腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働く抗ホルモン薬もこの定義に含まれ、副腎におけるエストロゲン産生、及び抗アンドロゲン薬；並びにトロキサシタビン（１，３－ジオキソランヌクレオシドシトシン誘導体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＶＥＧＦ発現阻害薬及びＨＥＲ２発現阻害薬などのリボザイム；ワクチン、PROLEUKIN（登録商標）ｒＩＬ－２；LURTOTECAN（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害薬；ABARELIX（登録商標）ｒｍＲＨ；ビノレルビン及びエスペラミシン並びに上記のいずれかの薬剤的に許容可能な塩、酸又は誘導体を調節する。
放射線療法との併用
本開示は、抗体又はその抗原結合部と、放射線療法（すなわち、γ線照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、電子放出及び同様のものなどの腫瘍細胞内で局所的にＤＮＡ傷害を誘発するためのいずれかのメカニズム）との併用も提供する。腫瘍細胞に放射線同位体の直接的送達を用いた併用療法も考えられ、本開示の複合体を標的抗がん薬又は他の標的化手段と組み合わせて使用してよい。通常、放射線療法を、約１週間～約２週間の期間にわたってパルス状で投与する。放射線療法を、約６～７週間頭頸部がんを有する対象に投与してよい。必要に応じて、放射線療法を、単回投与又は反復投与、逐次投与として投与してよい。
医薬包装及びキット
抗体又はその抗原結合部の１回以上の用量を含む１つ以上の容器を備える医薬包装及びキットも提供する。特定の実施形態では、単位剤形を提供し、単位剤形は、例えば、１つ以上の追加の薬剤と共に若しくは追加の薬剤なしで抗体又はその抗原結合部を含む組成物の所定量を含む。他の実施形態のため、かかる単位剤形を、注射用に使い捨てのプレフィル注射器に供給する。更に他の実施形態では、単位剤形に含まれる組成物は、生理食塩水、若しくは同様のもの；リン酸塩などのバッファ、若しくは同様のものを含んでよく；及び／又は安定かつ効果的ｐＨ範囲内で製剤してよい。あるいは、特定の実施形態では、複合体組成物を、適切な液体、例えば、滅菌水又は生理食塩水の添加により再溶解してよい凍結乾燥散剤として提供してよい。特定の好ましい実施形態では、組成物は、これに限定されないが、ショ糖及びアルギニンを含むタンパク質凝集を抑制する１つ以上の物質を含む。容器上、又は容器に付随するラベルは、同封された複合体組成物を選択された腫瘍性疾患病態の治療のために使用することを示す。
本開示は、部位特異性複合体の単回用量又は反復用量投与単位及び必要に応じて１つ以上の抗がん薬を産生するためのキットも提供する。キットは、容器及び容器上又は容器と付随したラベル又はパッケージインサートを備える。適切な容器としては、例えば、瓶、バイアル、注射器、その他が挙げられる。容器を、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から成形してよく、複合体又は非複合体で本開示の複合体の医薬効果量を含んでよい。他の好ましい実施形態では、容器は、滅菌されたアクセスポートを備える（例えば、容器は、静脈注射用液バッグ又は皮下注射針により突き刺すことができるストッパーを有するバイアルであってよい。かかるキットは、総じて、適切な容器中に、改変複合体の薬剤的に許容可能な製剤及び必要に応じて同じ又は異なる容器中に１つ以上の抗がん薬を収容するだろう。キットは、診断又は併用療法のいずれかのため、他の薬剤的に許容可能な製剤を収容してもよい。例えば、本開示の抗体又はその抗原結合部に加えて、かかるキットは、化学療法薬若しくは放射線療法薬などの抗がん薬；抗血管新生薬；抗転移薬；標的抗がん薬；細胞傷害性薬；及び／又は他の抗がん薬の範囲のいずれか１つ以上を収容してよい。
より詳細には、キットは、追加の成分と共に又は追加の成分なしで本開示の抗体又はその抗原結合部を有用する単一の容器を備えてもよく、各所望の薬剤のための別個の容器を備えてもよい。併用治療薬が複合体を提供する場合、単一液剤を、モル当量の組合せで、あるいは過剰の他成分中の１つの成分のいずれかで前混合してよい。あるいは、キットの複合体及びいずれかの必要に応じて使用される抗がん薬を、患者への投与前に別個の容器内に別々に維持してよい。キットは、滅菌した薬剤的に許容可能なバッファ又は注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、リンゲル液及びデキストロース液などの他の希釈剤を収容するための第二／第三容器手段を備えてもよい。
キットの成分を１つ以上の溶液で提供する場合、溶液は好ましくは水性溶液であり、滅菌水性溶液又は生理食塩水は特に好ましい。しかしながら、キットの成分を、乾燥散剤として提供してよい。乾燥散剤として試薬又は成分を提供する場合、散剤を、適切な溶媒の添加により再溶解することができる。溶媒を別の容器中に提供してもよいと想定される。
上記簡潔に示されているように、キットは、抗体又はその抗原結合部及びいずれかの必要に応じて使用される成分を患者に投与する手段、例えば、製剤を動物に注射若しくは導入又は身体の疾患領域に適用することができる１つ以上の針、静脈注射用液バッグ若しくは注射器、あるいは点眼器、ピペット、又は他のそのような装置を収容してもよい。本開示のキットは、通常、バイアル、又はそのようなもの、及び、例えば、所望のバイアル及び他の装置を配置及び保持する注射容器又は吹込成形プラスチック容器などの商用販売のための厳重に封じた他の成分を収容する手段も備えるだろう。
配列リスト要約
いくつかのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を含む配列リストを本願に添付している。以下の表Ａは、含まれる配列の要約を示す。
抗ＣＤ３／抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体である本明細書に開示されている１つの例証となる抗体を、「Ｗ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９」と命名し、以後リードＢｓＡｂと呼ぶ。
Figure 2023503624000002
Figure 2023503624000003
Figure 2023503624000004
Figure 2023503624000005
Figure 2023503624000006
Figure 2023503624000007
このように総じて記載れている本開示は、以下の実施例の参照によりより容易に理解され、これらの実施例は例証として提供され、本開示を限定することを目的とするものではない。実施例は、以下の実験が実施された全て又はほんの実験であることを示すことを目的とするものではない。
実施例１
材料、ベンチマーク（ＢＭＫ）抗体及び細胞株の調製
実施例で使用された市販材料の情報を表Ｆに示す。特に指定されない限り、実験で使用された試薬及び他の材料は市販品である。
Figure 2023503624000008
Figure 2023503624000009
Figure 2023503624000010
１．１ ＢＭＫ抗体の産生
本開示では、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（パニツムマブ及びセツキシマブ）及び抗ＣＤ３モノクローナル抗体（Ｗ３３１１－２．３０６．４－ｚ１－ｕＩｇＧ１Ｋ、調製の詳細については国際公開第２０１９／０５７０９９号パンフレット参照）並びに抗ＣＤ３及び抗ＥＧＦＲ二重特異性抗体並びにいくつかのＢＭＫコントロール抗体を、標準的分子方法により調製した。
抗ＣＤ３抗体の可変領域、パニツムマブ及びセツキシマブ、をコードするＤＮＡ配列を合成し、それぞれ、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ１の定常領域と共に発現ベクターにクローン化した。
総じて、組換えプラスミドを、製造者説明書に従ってＥＸｐｉ２９３細胞（Ｅｘｐｉ２９３Ｆトランスフェクションキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクトした。細胞を、３７℃、８％ＣＯ2においてインキュベーター内で培養し、次いで、上澄みを培養５日後に回収した。タンパク質を、タンパク質Ａカラム及びＳＥＣカラムを用いて精製した。
１．２ 標的発現細胞株の生成
カニクイザルＥＧＦＲの完全チュコード遺伝子を、カニクイザルＦＧＦＲ発現細胞株成長のため、発現ベクターにクローン化した。簡潔に言えば、７０～９０％コンフルエントなＣＨＯ－Ｋ１細胞を、リポフェクタミン２０００試薬の使用によってカニクイザルＦＧＦＲの完全長コード遺伝子を含む組み換えプラスミドを用いてトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を、３７℃、５％ＣＯ2においてインキュベーター内で培養した。トランスフェクション２４時間後、２～１０μｇ／ｍＬの最終濃度におけるブラストサイジンを使用して安定プールを選択した。それから、陽性プール細胞を、限界希釈法によってサブクローン化した。単一クローンを選び、抗ＥＧＦＲ抗体を用いてＦＡＣＳにより試験した。得られたカニクイザルＦＧＦＲ発現細胞株を、ＣＨＯＫ１－ｃｙｎｏＰｒｏ１（ＥＧＦＲ＋／ＣＤ３－）細胞株と命名した。
加えて、完全培地（１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０）中で培養された次の細胞株を使用した：Ｊｕｒｋａｔ．２Ｂ８（ＣＤ３＋／ＥＧＦＲ－）細胞；ＭＣＦ－７（ＣＤ３－／ＥＧＦＲ低）細胞及びＨＣＣ１４１９（ＣＤ３－／ＥＧＦＲ－）細胞。
対応する培地中で培養された他の細胞株を使用した：１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ中のＡ４３１（ＣＤ３－／ＥＧＦＲ高）；１０％ＦＢＳを添加したＭＣＣｏｙの５Ａ中のＨＴ２９（ＣＤ３－／ＥＧＦＲ中）細胞。
ヒト及びカニクイザル末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、健常ドナーから集められたヘパリン静脈血からＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ－１７－１４４０－０３）密度遠心分離によって新たに単離した。初代ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞及びヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞を、それぞれ、ＥａｓｙＳｅｐキット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ－１９０５３）及びＥａｓｙＳｅｐキット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ－１９０５２）によって新たなヒトＰＢＭＣから単離したが、ヒトＣＤ３＋ Ｔ細胞をＥａｓｙＳｅｐキット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ－１７９５１）によって単離した。カニクイザルＴ細胞を、Ｐａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ＿ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ－１３０－０９１－９９３）によって単離した。
実施例２
二重特異性抗体の生成
２．１ 抗体対を選択するための二重特異性抗体の生成
二重特異性抗体の生成のため、抗ＣＤ３抗体（Ｗ３３１１－２．３０６．４－ｚ１－ｕＩｇＧＫ、実施例１で作成）の配列及び抗ＥＧＦＲ抗体（パニツムマブ）の配列を、異なるＢｓＡｂフォーマットを構築するために使用した。
結果：
二重特異性抗体を生成するための抗体対を同定する。結果を、表１に示した。
Figure 2023503624000011
２．２ 二重特異性抗体の異なるフォーマットを生成する
本明細書で提供されているポリペプチド複合体では、第一抗原結合性部分及び第二結合性部分を、Ｉｇ様構造に会合する。Ｉｇ様構造は、Ｙ形状構造物を有する天然抗体に似ており、抗原結合のための２つのアーム並びに会合及び安定性のための１つの基部を有する。天然抗体との類似性は、優れたインビボ薬物動態、所望の免疫応答及び安定性、その他などの様々な利点を提供することができる。本明細書で提供されている第二抗原結合性部分を伴う本明細書で提供されている第一抗原結合性部分を含むＩｇ様構造物は、Ｉｇ（例えば、ＩｇＧ）に匹敵する熱安定性を有することが分かった。特定の実施形態では、本明細書で提供されているＩｇ様構造物は、天然ＩｇＧのものの少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％である。
本明細書で提供されている二重特異性ポリペプチド複合体は、４ポリペプチド鎖：ｉ）ＶＨ１－ＣＨ１－ヒンジ１－ＣＨ２－ＣＨ３により表される第一重鎖；ｉｉ）ＶＬ１－ＣＬにより表される第一軽鎖；ｉｉｉ）ＶＨ２－Ｃ１－ヒンジ２－ＣＨ２－ＣＨ３により表される第二重鎖；及びｉｖ）ＶＬ２－Ｃ２により表される第二軽鎖を含み、Ｃ１及びＣ２は、少なくとも１つの非天然鎖間結合を含む二量体を形成することができ、２つのヒンジ領域及び／又は２つのＣＨ３ドメインは、二量体形成を促進することができる１つ以上の鎖間結合を形成することができ；ｉ）のＶＨ１－ＣＨ１部分及びＶＬ１－ＣＬは抗ＣＤ３アーム（Ｔ３と呼ぶ、図１参照）を形成し、ｉｉｉ）のＶＨ２－Ｃ１及びＶＬ２－Ｃ２は抗ＥＧＦＲアーム（Ｕ１と呼ぶ、図１参照）を形成する。
２．３ インビボ試験のための二重特異性抗体の調製
抗ＣＤ３抗体のＶＬ及びＶＨをコードする核酸配列を、抗ＣＤ３モノクローナル抗体（Ｗ３３１１－２．３０６．４－ｚ１－ｕＩｇＧ１Ｋ）からＯＣＲにより増幅した。抗ＥＧＦＲ抗体のＶＬ及びＶＨはＡＢＸ（パニツムマブ）からであり、そのコード核酸配列を、それぞれ、Ｇｅｎｅｗｉｚ Ｉｎｃにより合成した。Ｃα及びＣβ遺伝子を、Ｇｅｎｅｗｉｚ Ｉｎｃにより合成した。抗ＣＤ３天然又は抗ＥＧＦＲキメラ軽鎖遺伝子を、ＣＭＶプロモーター及びκシグナルペプチドを含む直鎖化ベクターに挿入した。抗ＣＤ３ ＶＨ－ＣＨ１のＤＮＡフラグメントを、ノブ変異を有するヒトＩｇＧ４Ｖ９（変異Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ）定常領域ＣＨ２－ＣＨ３を含む直鎖化ベクターに挿入した。抗ＥＧＦＲＶＨ－ＣβのＤＮＡフラグメントを、ホール変異を有するヒトＩｇＧ４Ｖ９（変異Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ）定常領域ＣＨ２－ＣＨ３を含む直鎖化ベクターに挿入した。ベクターはＣＭＶプロモーター及びヒト抗体重鎖シグナルペプチドを含む。
重鎖及び軽鎖をコードする得られた組換え発現プラスミドを、製造者説明書に従って、ＥｘＰｉ２９３発現システムキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ－Ａ１４６３５）を用いてＥｘＰｉ２９３細胞にコトランスフェクトした。トランスフェクション５日後、上澄みを集め、タンパク質をタンパク質Ａカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ－１７５４３ ８０２）を用いて精製し、サイズ排除カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ－１７１０４３０１）を用いて更に精製した。抗体濃度をＮａｎｏ Ｄｒｏｐにより測定した。タンパク質の純度を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣ－ＳＥＣにより評価した。
結果：
抗ＣＤ３×ＥＧＦＲ抗体、Ｗ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９を設計、構築及び産生した。二重特異性抗体のフォーマットを図１に示し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＳＥＣ－ＨＰＬＣクロマトグラムを、それぞれ、図２及び図３に示した。抗体Ｗ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９の発現力価は、一過性発現により１７０ｍｇ／Ｌより高く、純度は９３．８２％に達する。
実施例３
二重特異性抗体のインビトロ特性
３．１ ＦＡＣＳにより測定されたヒトＣＤ３及びＥＧＦＲ結合活性
ＥＧＦＲ×ＣＤ３二重特異性抗体とヒトＣＤ３及びＥＧＦＲ発現細胞との結合を、フローサイトメトリーにより決定した。
簡潔に言えば、１×１０5Ｊｕｒｋａｔ．２Ｂ８（ＣＤ３＋／ＥＧＦＲ－）又はＡ４３１（ＥＧＦＲ＋／ＣＤ３－）細胞を、ＥＧＦＲ×ＣＤ３二重特異性抗体又はｈＩｇＧ４アイソタイプコントロール抗体の段階希釈で、４℃において６０分間インキュベートした。１％ウシ血清アルブミンを添加した冷ＰＢＳ（洗浄緩衝液）で２回洗浄後、細胞表面結合抗体を、４℃において３０分間蛍光標識された抗ヒトＩｇＧ抗体と共に細胞をインキュベートすることによって検出した。細胞を、同じバッファで２回洗浄し、染色細胞の平均蛍光（ＭＦＩ）をＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩサイトメーター(BD Biosciences)を用いて測定した。抗体も二次抗体も含まないウェルのみを使用してバックグラウンド蛍光を確立した。４パラメータ非線形回帰分析を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて細胞結合のＥＣ50値を得た。
結果：
ヒトＣＤ３及びＥＧＦＲに対するリードＢｓＡｂ（すなわち、Ｗ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９）の結合活性を、Ｊｕｒｋａｔ．２Ｂ８及びＡ４３１細胞株を用いてＦＡＣＳによって行った。結果を、図４及び表２に示した。リードＢｓＡｂは中程度の親和性でヒトＣＤ３と結合することができる（すなわち、図４Ａに示されているように、Ｊｕｒｋａｔ．２Ｂ８（ＣＤ３＋／ＥＧＦＲ－）細胞に対するリードＢｓＡｂの結合活性は、ヒト化抗ＣＤ３抗体、Ｗ３３１１－２．３０６．４－ｚ１－ｕＩｇＧ１Ｋより低かった）が、ヒトＥＧＦＲ発現細胞に対する強力な結合活性を示す（すなわち、図４Ｂに示されているように、リードＢｓＡｂとＡ４３１（ＥＧＦＲ＋／ＣＤ３－）細胞は抗ＥＧＦＲ抗体、パニツムマブより高かった）ことをデータは示した。
Figure 2023503624000012
３．２ ＦＡＣＳにより測定されたカニクイザルＣＤ３及びＥＧＦＲ交差結合活性
ＥＧＦＲ×ＣＤ３二重特異性抗体とカニクイザルＣＤ３及びＥＧＦＲ発現細胞との結合を、フローサイトメトリーにより決定した。
簡潔に言えば、１×１０5カニクイザルＰＢＭＣ（ＣＤ３＋／ＥＧＦＲ－）細胞又はＣＨＯＫ１－ｃｙｎｏＰｒｏ１（ＥＧＦＲ＋／ＣＤ３－）細胞を、ＥＧＦＲ×ＣＤ３二重特異性抗体又はｈＩｇＧ４アイソタイプコントロール抗体の段階希釈で、４℃において６０分間インキュベートした。１％ウシ血清アルブミンを添加した冷ＰＢＳ（洗浄緩衝液）で２回洗浄後、細胞表面結合抗体を、４℃において３０分間蛍光標識された抗ヒトＩｇＧ抗体と共に細胞をインキュベートすることによって検出した。細胞を、同じバッファで２回洗浄し、染色細胞の平均蛍光（ＭＦＩ）をＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩサイトメーター(BD Biosciences)を用いて測定した。抗体も二次抗体も含まないウェルのみを使用してバックグラウンド蛍光を確立した。４パラメータ非線形回帰分析を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて細胞結合のＥＣ50値を得た
結果：
カニクイザルＣＤ３及びＥＧＦＲに対するリードＢｓＡｂ（すなわち、Ｗ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９）の結合活性を、カニクイザルＰＢＭＣ細胞及びＥＧＦＲ発現安定ＣＨＯＫ１細胞を用いてＦＡＣＳにより行った。結果を、図５及び表３に示した。リードＢｓＡｂは中程度の親和性でｃｙｎｏＣＤ３と結合することができる（すなわち、図５Ａに示されているように、カニクイザルＴ細胞に対するリードＢｓＡｂの結合活性は、ヒト化抗ＣＤ３抗体、Ｗ３３１１－２．３０６．４－ｚ１－ｕＩｇＧ１Ｋより低かった）が、カニクイザルＥＧＦＲ発現細胞に対する強力な結合活性を示す（すなわち、図５Ｂに示されているように、リードＢｓＡｂとＣＨＯＫ１－ｃｙｎｏＰｒｏ１（ＥＧＦＲ＋／ＣＤ３－）細胞は抗ＥＧＦＲ抗体、パニツムマブより高かった）ことをデータは示した。
Figure 2023503624000013
３．３ ＦＡＣＳにより測定されたヒトＣＤ３及びＥＧＦＲ結合親和性
ヒトＣＤ３及びＥＧＦＲに対するＥＧＦＲ×ＣＤ３二重特異性抗体の結合親和性を、ＦＡＣＳ分析により測定した。Ａ４３１（ＥＧＦＲ＋／ＣＤ３－）細胞及びＪｕｒｋａｔ．２Ｂ８（ＣＤ３＋／ＥＧＦＲ－）細胞を、それぞれ、５×１０4細胞／ｍｌの濃度において９６ウェルＵ底プレートに移した。試験抗体を、洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡ）で段階希釈し、４℃で１時間細胞と共にインキュベートした。二次抗体ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＦＩＴＣ（Jackson、１０９－０９５－０９８、モルＩｇＧ当たり３．６モルＦＩＴＣ）を添加し、４℃において０．５時間暗所でインキュベートした。それから、細胞を１回洗浄し、１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡに再懸濁し、フローサイトメトリーにより分析した。蛍光強度を定量ビーズ（QuantumTM MESF Kits、Bangs Laboratories,Inc.）に対して結合分子／細胞を換算する。
結果：
ヒトＣＤ３及びＥＧＦＲに対するＷ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９の結合親和性をフローサイトメトリーにより、それぞれ、Ｊｕｒｋａｔ．２Ｂ８及びＡ４３１細胞で試験した。図６及び表４に示されているように、ＣＤ３（図６Ａに示す）及びＲＧＦＲ（図６Ｂに示す）との結合のフィットされたＫＤ値は、それぞれ、４．７ｎＭ及び６．２ｎＭであった。
Figure 2023503624000014
３．４ ＦＡＣＳにより測定された標的細胞に対する二重結合
ヒトＣＤ３及びＥＧＦＲ発現細胞に対するリードＢｓＡｂの同時結合を試験するため、１×１０6／ｍｌ Ａ４３１（ＥＧＦＲ＋／ＣＤ３－）細胞及び１×１０6／ｍｌ Ｊｕｒｋａｔ．２Ｂ８（ＣＤ３＋／ＥＧＦＲ－）細胞を、それぞれ、５０ｎＭカルセイン－ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－Ｃ３０９９）及び２０ｎＭ ＦａｒＲｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－Ｃ３４５７２）で標識化した。冷１％ＢＳＡ／１ＸＰＢＳで洗浄後、標識化Ａ４３１及びＪｕｒｋａｔ．２Ｂ８細胞を再懸濁し、２：３の比（細胞数比）で１×１０6／ｍｌの最終濃度まで混合した。混合細胞の１×１０5／ウェルを蒔き、次いで、ＢｓＡｂの段階希釈を添加した。４℃で６０分間インキュベーション後、カルセイン－ＡＭ及びＦａｒＲｅｄ二重陽性細胞のパーセンテージを、ＦＡＣＳにより分析した。
結果：
ＣＤ３及びＥＧＦＲ発現細胞に対するＷ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９の架橋結合活性を、フローサイトメトリーにより前標識化されたＪｕｒｋａｔ．２Ｂ８及びＡ４３１細胞を用いて試験した。図７に示されているように、陰性コントロールと比較して、架橋Ｊｕｒｋａｔ．２Ｂ８及びＡ４３１細胞集団のおよそ１８％を、二重特異性抗体Ｗ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９により架橋した。
３．５ ヒトＴ細胞活性化の評価
新たに単離したヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用し、ＣＤ６９及びＣＤ２５表面発現の誘導によって測定されたＥＧＦＲ×ＣＤ３二重特異性抗体により活性化した。ＰＢＭＣを、ヘパリン静脈血からFicoll-Paque PLUS(GE Healthcare、#17-1440-03)密度遠心分離により新たに単離し、次いで、完全培地（１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０）中で一夜培養した。アッセイの日に、ＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＢＳ中のＡ４３１、ＨＴ－２９及びＨＣＣ１４１９と共に又はなしのＰＢＭＣ（標的細胞：１×１０4細胞／ウェル；Ｅ：Ｔ比、１０：１）及び抗体を、３７℃で２４時間共インキュベートした。１％ＢＳＡで１回洗浄後、細胞ペレットを、抗ヒトＡｂパネル（ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ４（BD Pharmingen-550628)；ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５標識抗ヒトＣＤ８(BD Pharmingen-560662)；ＰＥ標識抗ヒトＣＤ６９(BD Pharmingen-555531)及びＡＰＣ標識抗ヒトＣＤ２５(BD Pharmingen-555434)を含む染色バッファと共に再懸濁した。４℃において３０分間のインキュベーション後に１％ＢＳＡで細胞を２回洗浄した。ＦＩＴＣ中のＰＥ若しくはＡＰＣ陽性細胞又はＰｅｒＣｐ－Ｃｙ５．５陽性細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリー(BD Biosciences)により決定した。
ＢｓＡｂによるＴ細胞活性化を、フローサイトメトリーにより、ＣＤ６９又はＣＤ２５発現エフェクター細胞のパーセンテージを測定して決定した。新たに単離した精製ヒトＣＤ４+Ｔ細胞及びＣＤ８+Ｔ細胞を、それぞれ、エフェクター細胞として検査した。簡潔に言えば、５×１０4のＣＤ４+Ｔ細胞又はＣＤ８+Ｔ細胞を、３７℃において２４時間１×１０4のＡ４３１、ＨＴ－２９若しくはＨＣＣ１４１９細胞／ウェルの存在下又は非存在下、ＢｓＡｂ又はｈＩｇＧ４アイソタイプコントロール抗体の段階希釈を含む１１０μｌ／ウェル完全培地に蒔いた。インキュベーション後、細胞を１％ＢＳＡ／１ＸＤＰＢＳで２回洗浄し、次いで、４℃において３０分間抗ヒトＡｂパネル（ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ４(BD Pharmingen-550628)；ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５標識抗ヒトＣＤ８(BD Pharmingen-560662)；ＰＥ標識抗ヒトＣＤ６９(BD Pharmingen-555531)及びＡＰＣ標識抗ヒトＣＤ２５(BD Pharmingen-555434)で染色した。ＣＤ６９又はＣＤ２５発現により評価されたＴ細胞活性化を、ＦＡＣＳによって分析した。Ｔ細胞活性化のＥ５０を、Ｐｒｉｓｍ４パラメータ非線形回帰分析の使用によって決定した。
結果：
Ｗ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９ヒトＴ細胞活性化を試験するため、腫瘍細胞Ａ４３１（高ＥＧＦＲ発現）、ＨＴ－２９（中程度ＥＧＦＲ発現）及びＨＣＣ１４１９（陰性ＥＧＦＲ発現）を、標的細胞として使用した。図８及び表５に示されているように、ヒトＰＢＭＣ Ｔ細胞活性化アッセイでは、Ｗ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９は、ＥＧＦＲ発現細胞（Ａ４３１及びＨＴ－２９）の存在下ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化を強力に誘発したが、ＥＧＦＲ陰性発現細胞（ＨＣＣ１４１９）の存在下、ずっとより低いＴ細胞活性化があった。
Figure 2023503624000015
３．６ 腫瘍細胞のカニクイザルＴ細胞活性化
Ｗ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９のカニクイザルＴ細胞活性化を試験するため、腫瘍細胞Ａ４３１（高ＥＧＦＲ発現）、ＨＴ－２９（中程度ＥＧＦＲ発現）及びＨＣＣ１４１９（陰性ＥＧＦＲ発現）を、標的細胞として使用した。手順は、セクション３．５と同様である。
結果：
図９及び表６に示されているように、サルＰＢＭＣ Ｔ細胞活性化アッセイでは、Ｗ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９は、ＥＧＦＲ発現細胞（Ａ４３１及びＨＴ－２９）の存在下ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化を強力に誘発したが、ＥＧＦＲ陰性発現細胞（ＨＣＣ１４１９）の存在下、ずっとより低いＴ細胞活性化があった。
Figure 2023503624000016
３．７ 腫瘍細胞に対する細胞傷害性アッセイ
前活性化ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用して、ＥＧＦＲ×ＣＤ３二重特異性抗体がルシフェラーゼ定量アッセイにおいて特定の腫瘍細胞溶解を媒介する能力を決定した。簡潔に言えば、単離ヒトＰＢＭＣを、５０ＩＵ／ｍｌ組換えヒトＩＬ－２（Ｄｅｌｕｓｈｅｎｇ、＃２０１７１１６６ｂ）及び１０ｎｇ／ｍｌ ＯＫＴ－３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、＃１６－００３７－８５）を含む完全培地（１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリンｍ１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０）中で３日間培養した。アッセイの日に、標的細胞を、完全培地中、エフェクター細胞（ＰＢＭＣ／標的細胞比１０：１）及び二重特異性抗体又はモノクローナル抗体の段階希釈を含む９６ウェルマイクロプレート中、二通りに播種した。エフェクター細胞及び腫瘍細胞を、３７℃において３日間相互作用させた。試験日に、プレートを、１８０μＬ／ウェルのＤＰＢＳで２回洗浄し、次いで、５０μＬ／ウェルのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｇ７５７３）を添加した。生物発光シグナルを、１０分間のインキュベーション後暗所でＥｎｖｉｓｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によって測定した。
細胞傷害性パーセントを、式：
細胞傷害性％＝（Ｌｕｃ Ｓ－Ｌｕｃエフェクター細胞のみ）／（Ｌｕｃ腫瘍細胞のみ－Ｌｕｃエフェクター細胞のみ）×１００％
を用いて算出した。
式中、「Ｌｕｃ Ｓ」は試験ウェルの生物発光シグナルであり、「Ｌｕｃエフェクター細胞のみ」は残ったエフェクター細胞の生物発光シグナルであり、「Ｌｕｃ腫瘍細胞のみ」は腫瘍細胞のみコントロールウェルの生物発光シグナルである。
結果を、二通りのウェルから特定溶解％（平均値±ＳＤ）として表す。
結果：
Ｗ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９の細胞傷害性活性を、初代Ｔ細胞の存在下、４つの様々なＥＧＦＲ発現腫瘍細胞を用いて評価した。図１０及び表７に示されているように、リードＢｓＡｂは、ＥＧＲＦ発現腫瘍細胞に対して選択的及びより強力な細胞傷害性を示したが、ＥＧＦＲ陰性細胞に対してほんの無視できる死滅しか示さなかった。腫瘍細胞上のＥＦＧＲ発現による、０．６～１９．８８のＥＣ５０値を有する細胞傷害性。
Figure 2023503624000017
３．８ ＡＤＣＣ及びＣＤＣアッセイ
抗体依存性細胞介在性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を、ＬＤＨ放出アッセイにより決定した。ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、ヘパリン静脈血からＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、＃１７－１４４０－０３）密度遠心分離により新たに単離し、次いで、完全培地（１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０）中で一夜培養した。ＮＫ細胞を、ヒトＣＤ５６陽性選択キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ－１３０－０５０－４０１）により単離した。簡潔に言えば、ＡＤＣＣアッセイの日に、ＥＧＦＲ発現標的細胞Ａ４３１又はＣＤ３発現標的細胞Ｊｕｒｋａｔ．２Ｂ８（２×１０4／ウェル）を、３７℃において４時間完全培地中、エフェクター細胞（ＮＫ／標的細胞比２．５：１）及び抗体又はｈＩｇＧアイソタイプコントロールの段階希釈と共に１１０μＬ中に蒔いた。インキュベーション後、プレートを遠心分離し、７０μＬの上澄みを、透明底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃３５９９）に移し、５０μＬの反応混合物（Ｒｏｃｈｅ、＃１１６４４７９３０、細胞傷害性反応キット）を各ウェルに添加して１５分間インキュベートした。停止液を添加後、プレートをＭ５ｅにより読んで、４９２ｎｍ及び６００ｎｍにおいてサンプルの吸光度を測定した。
細胞傷害性パーセントを、式：
細胞傷害性％＝（サンプル－エフェクター細胞コントロール－標的細胞コントロール）／（標的細胞溶解－標的細胞コントロール）×１００％
を用いて算出した。
ＣＤＣアッセイのため、ＥＧＦＲ発現標的細胞Ａ４３１又はＣＤ３発現標的細胞Ｊｕｒｋａｔ．２Ｂ８（２×１０4／ウェル）を、３７℃において２時間完全培地中、ヒト正常血清（最終１：５０希釈）（Ｑｕｉｄｅｌ、＃Ａ１１３）及び抗体又はｈＩｇＧアイソタイプコントロールの段階希釈と共に１１０μＬ中に蒔いた。インキュベーション後、プレートを遠心分離し、７０μＬの上澄みを、透明底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃３５９９）に移し、５０μＬの反応混合物（Ｒｏｃｈｅ、＃１１６４４７９３０、細胞傷害性反応キット）を各ウェルに添加して１５分間インキュベートした。停止液を添加後、プレートをＭ５ｅにより読んで、４９２ｎｍ及び６００ｎｍにおいてサンプルの吸光度を測定した。
細胞傷害性パーセントを、式：
細胞傷害性％＝（サンプル－標的細胞コントロール）／（標的細胞溶解－標的細胞コントロール）×１００％
を用いて算出した。
死滅のためのＩＣ50値をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて決定し、値を、４パラメータ非線形回帰分析を用いて算出した。
結果：
シード抗体、Ｗ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９を、Ｊｕｒｋａｔ．２Ｂ８及びＡ４３１細胞のそのＡＤＣＣ及びＣＤＣ能力について評価した。図１１に示されているように、リードＢｓＡｂは、Ｊｕｒｋａｔ．２Ｂ８及びＡ４３１細胞腫瘍細胞両方においてＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性を誘導しなかった。
３．９ 熱安定性（ＤＳＦ）
抗体のＴmを、QuantStudio（商標）７ ＦｌｅｘリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて調査した。
簡潔に言えば、抗体溶液１９μＬを、６２．５Ｘ ＳＹＰＲＯオレンジ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１μＬと混合し、９６ウェルプレート（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に移した。プレートを、０．９℃／分の速度で２６℃から９５℃まで加熱し、得られた蛍光データを収集した。異なる温度に対する蛍光変化の負の微分係数を算出し、最大値を融点Ｔmと定義した。タンパク質が複数のアンフォールディング転移を有する場合、第一の２つのＴmを報告し、それぞれ、Ｔm１及びＴm２とした。データ収集及びＴm算出を、オペレーションソフトウェア（QuantStudio（商標）リアルタイムＰＣＲソフトウェア ｖ１．３）によって自動的に行った。
結果：
示差走査フルオロメトリー（ＤＳＦ）を使用して、Ｗ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９熱安定性を評価した。表８及び図１２に示されているように、Ｗ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９のＴm１及びＴm２は、それぞれ、５５．４℃及び７１．８℃であった。
Figure 2023503624000018
３．１０ 血清安定性
二重結合ＦＡＣＳ分析のため、異なる時点からのサンプルを、４℃において同時に凍結融解（free-thawed）した。融解された抗体を段階希釈し、１×１０5 Ａ４３１細胞／ウェルに添加し、４℃において１時間インキュベートした。細胞を、１％ウシ血清アルブミンを添加したＰＢＳで２回洗浄した。Ｗ３３１－ｈＰｒｏ１．ＥＣＤ．Ｈｉｓ（Ｓｉｎｏ）（３．１６ｎＭ）を細胞に添加し、４℃において１時間インキュベートした。１時間のインキュベーション後、細胞を、１％ウシ血清アルブミンを添加したＰＢＳで２回洗浄し、次いで、１％ウシ血清アルブミン中１：４００希釈されたＨｉｓタグ抗体［ビオチン］、ｍＡｂ、マウス（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ－Ａ００６１３）を細胞に添加し、４℃において３０分間インキュベートした。細胞を１％ウシ血清アルブミンで２回洗浄した後、１％ウシ血清アルブミンで１：４０００希釈されたＡｌｅｘａ６４７結合ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ－０１６－６００－０８４）を細胞に添加し、４℃において３０分間インキュベートした。細胞を、同じバッファで２回洗浄し、染色細胞の平均蛍光（ＭＦＩ）をＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩサイトメーター(BD Biosciences)を用いて測定し、ＦｌｏｗＪｏにより分析した。抗体も二次抗体も含まないウェルのみを使用してバックグラウンド蛍光を確立した。４パラメータ非線形回帰分析を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて細胞結合のＥＣ５０値を得た。
結果：
Ｗ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９の血清安定性を、ヒト血清において行った。リードＢｓＡｂ、Ｗ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９を、３７℃において０、１、４、７及び１４日間ヒト血清と共に共培養し、結合活性をＦＡＣＳによって試験した。図１３に示されているように、セータは、血清培養が、ＣＤ３及びＥＧＦＲとのＷ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９結合活性に対して悪影響を与えないことを示した。
実施例４
ヒトＰＢＭＣ－ＨＴ２９モデルにおけるインビボ抗腫瘍効果試験
Ｗ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９の抗腫瘍効果を、ＮＣＧ雌マウスのヒトＰＢＭＣ－ＨＴ２９モデル(Nanjing Galaxy Biopharmaceutical Co.)において試験した。１３～１４週齢の雌ＮＣＧマウス（ＮＣＧから購入）を試験に使用した。ＨＴ２９細胞を、空気中５％ＣＯ2の雰囲気下、３７℃において１０％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地中単層培養としてインビトロで維持した。腫瘍細胞を、週２回０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ処理をしてルーチンに継代培養した。指数増殖期に増殖する細胞を収穫し、腫瘍接種のためカウントした。
治療モデルを確立するため、０日目、各マウスを、ＨＴ２９腫瘍細胞（１００μｌ ＰＢＳ中２．０×１０6細胞）を有する右前側腹部において皮下接種し、１００μｌ ＰＢＳ中２．０×１０6ＰＢＭＣ細胞（Ｈｅｍａｃａｒｅ、ロット番号：１９０５４０７８）を腹腔内注射した。ＰＢＭＣ移植後１１日目、末梢ヒト／マウスＣＤ４５、ヒトＣＤ３を、ＦＡＣＳによって検出した。絶対ヒトＣＤ３＞３％を有する動物を次の試験のために選択した；ＰＢＭＣ移植後１２日目、平均腫瘍体積が約１３０ｍｍ3に達した場合、動物をランダムに４群にグループ分けし、各群は５匹のマウスを含む。４群のマウスは、それぞれ、合計４注射のため、次の腹腔内注射を受けた：アイソタイプコントロール０．３ｍｇ／体重ｋｇ；パニツムマブ０．３ｍｇ／体重ｋｇ；Ｗ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９ ０．３ｍｇ／体重ｋｇ；Ｗ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９ ０．３ｍｇ／体重ｋｇ。第一回目の注射の日を０日目とした。全腫瘍試験のため、マウスの体重を量り、ノギスを用いて週２回腫瘍増殖を測定した。末梢ヒトＣＤ４５、ヒトＣＤ３を定期的に検出した。試験における動物の取扱い、管理及び治療に関する全手順を、国際実験動物ケア評価認証協会（ＡＡＡＬＡＣ）のガイダンスに従った上海SIPPR-BK Laboratory Animal Co., Ltdの施設内動物管理及び使用委員会（ＩＡＣＵＣ）により承認されたガイドラインに従って行った。腫瘍体積を、式（１／２（長さ×幅2））を用いて算出した。ＴＧＩ（腫瘍増殖阻害）を、式を用いて各群について算出した。
ＴＧＩ（％）＝［１－（Ｔｉ－Ｔ０）／（Ｖｉ－Ｖ０）］×１００
Ｔｉは、所与の日の治療群の平均腫瘍体積である。Ｔ０は、治療の１日目の治療群の平均腫瘍体積である。Ｖｉは、Ｔｉと同日の媒体コントロール群の平均腫瘍体積であり、Ｖ０は、治療の１日目の媒体コントロール群の平均腫瘍体積である。
結果を、平均値及び標準誤差（平均±ＳＥＭ）により表した。Ｇｒａｐｈ Ｐｒｉｓｍ６．０を用いて二元配置ＡＮＯＶＡテューキーの多重比較検定を用いてデータを解析し、ｐ＜０．０５を統計的に有意とした。
結果：
全マウスは、試験期間にわたって生存した。２動物（アイソタイプコントロールの１匹及びＷ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９の０．３ｍｇ／体重ｋｇの１匹）は、明らかな体重損失（＞１５％）を示し、ＧＶＨＤ（グラフト対宿主疾病）として特定され、最終データ解析において排除された。図１４に示されているように、全群の全体的平均体重損失は５％以内であり、各群の中で、統計的差異は観察されなかった（ｐ＞０．０５、二元配置ＡＮＯＶＡ）。
図１５Ａに示されているように、末梢ヒトＣＤ３のパーセンテージを、試験期間にわたってモニターした。０．０８ｍｇ／ｋｇ及び０．３ｍｇ／ｋｇにおいてＷ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９群中に明らかなＴ細胞減少は観察されなかった。図１５Ｂに示されているように、治療後２７日目、アイソタイプコントロールと比較して、末梢ヒトＣＤ３の有意な増加は、Ｗ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９群の低用量において観察され（０．０８ｍｇ／体重ｋｇ、ｐ＜０．０１、一元配置ＡＮＯＶＡ）；腫瘍組織では、全群の中でヒトＣＤ３の差異は観察されなかった。
図１６に示されているように、第一投与後２７日目、アイソタイプコントロール群の平均腫瘍体積は２１７４ｍｍ3であり、これは、ＨＴ２９モデルが定着したことを示した。アイソタイプ群と比較して、パニツムマブ０．３ｍｇ／体重ｋｇは腫瘍増殖を阻害しなかった（ｐ＞０．０５）；Ｗ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９は、０．０８ｍｐｋ及び０．３ｍｐｋにおいて腫瘍増殖を有意に阻害した（それぞれ、ｐ＜０．０００１及びｐ＜０．００１）。パニツムマブ０．３ｍｇ／体重ｋｇと比較して、Ｗ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９０．３ｍｇ／体重ｋｇは腫瘍増殖を有意に阻害し（ｐ＜０．０１）、Ｗ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９０．０８ｍｇ／体重ｋｇは腫瘍増殖を有意に阻害した（ｐ＜０．０００１）。各群の２７日目のＴＧＩは、パニツムマブ０．３ｍｇ／体重ｋｇに対して１６．２１％、Ｗ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９ ０．３ｍｇ／体重ｋｇに対して３３．３５％、及びＷ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９ ０．０８ｍｇ／体重ｋｇに対して５８．６１％であり、表９に示した。
図１６及び表９のデータは、Ｗ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９は、ＴＧＩ ０．３ｍｇ／ｋｇより低い用量０．０８ｍｇ／ｋｇにおいてより高いＴＧＩを予想外に達成することを示した。
Figure 2023503624000019
実施例５
ヒトＰＢＭＣ－ＨＣＴ１１６ ＮＣＧマウスモデルにおけるインビボ抗腫瘍有効性試験
Ｗ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９の抗腫瘍有効性を、ヒトＰＢＭＣ－ＨＣＴ１１６－ＮＣＧマウスモデル(Nanjing Galaxy Biopharmaceutical Co.)において調査した。１０～１１週齢雌ＮＣＧマウスを試験で使用した。ＨＣＴ１１６細胞を、空気中５％ＣＯ2の雰囲気下、３７℃において１０％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培地中単層培養としてインビトロで維持した。腫瘍細胞を、週２回０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ処理をしてルーチンに継代培養した。指数増殖期に増殖する細胞を収穫し、腫瘍接種のためカウントした。
治療モデルを確立するため、０日目、各マウスを、ＨＣＴ１１６腫瘍細胞（１００μｌ ＰＢＳ中１．５×１０6細胞）を有する右前側腹部において皮下接種し、１００μｌ ＰＢＳ中３．０×１０6ＰＢＭＣ細胞（Ｈｅｍａｃａｒｅ、ロット番号：１９０５４０７８）を腹腔内注射した。ＰＢＭＣ移植後１１日目、末梢ヒト／マウスＣＤ４５、ヒトＣＤ３を、ＦＡＣＳによって検出した。絶対ヒトＣＤ３＞３％を有する動物を次の試験のために選択した；ＰＢＭＣ移植後１１日目、平均腫瘍体積が約１２０ｍｍ3に達した場合、動物をランダムに５群にグループ分けし、各群は７匹のマウスを含む。マウスの５群は、それぞれ、全４注射のために次の毎週の腹腔内注射を受けた：アイソタイプコントロール０．１ｍｇ／ｋｇ；パニツムマブ（ＷＢＰ３３６－ｈＢＭＫ２．ＩｇＧ２）０．１ｍｇ／ｋｇ；Ｗ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９ ０．３ｍｇ／ｋｇ；Ｗ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９ ０．１ｍｇ／ｋｇ；Ｗ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９ ０．０３ｍｇ／ｋｇ。第一回目の注射の日を０日目として示した。全腫瘍試験のため、マウスの体重を量り、ノギスを用いて週２回腫瘍増殖を測定した。末梢ヒトＣＤ４５、ヒトＣＤ３を定期的に検出した。試験における動物の取扱い、管理及び治療に関する全手順を、国際実験動物ケア評価認証協会（ＡＡＡＬＡＣ）のガイダンスに従った上海ＳＩＰＰＲ－ＢＫ Laboratory Animal Co.,Ltdの施設内動物管理及び使用委員会（ＩＡＣＵＣ）により承認されたガイドラインに従って行った。腫瘍体積を、式（１／２（長さ×幅2））を用いて算出した。ＴＧＩ（腫瘍増殖阻害）を、式：ＴＧＩ（％）＝［１－（Ｔｉ－Ｔ０）／（Ｖｉ－Ｖ０）］×１００を用いて各群について算出し、式中、Ｔｉは所与の日の治療群の平均腫瘍体積であり、Ｔ０は治療第一日目の治療群の平均腫瘍体積であり、ＶｉはＴｉと同じ日の媒体コントロール群の平均腫瘍体積であり、Ｖ０は治療第一日目の媒体群の平均腫瘍体積である。結果を、平均値及び標準誤差（平均±ＳＥＭ）により表した。Ｇｒａｐｈ Ｐｒｉｓｍ６．０を用いて二元配置ＡＮＯＶＡテューキーの多重比較検定を用いてデータを解析し、ｐ＜０．０５を統計的に有意とした。
結果：
全マウスは、試験期間にわたって生存した。末梢血リンパ球再構成の割合をフローサイトメトリーにより測定した。３動物においてＣＤ４５＋細胞はほとんど確認されず、最終データ解析において排除された（Ｗ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９ ０．３ｍｇ／ｋｇにおける１つ；Ｗ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９ ０．１ｍｇ／ｋｇにおける１つ及びＷ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９ ０．０３ｍｇ／ｋｇにおける１つ）。図１７に示されているように、全群の全体的平均体重損失は５％以下であり、各群の中で、統計的差異は観察されなかった（ｐ＞０．０５、二元配置ＡＮＯＶＡ）。
図１８に示されているように、第一投与後２３日目、アイソタイプコントロール群の平均腫瘍体積は１７２０ｍｍ3であり、これは、ＨＣＴ１１６モデルが定着したことを示した。アイソタイプ群と比較して、パニツムマブ０．１ｍｇ／ｋｇは腫瘍増殖を阻害しなかった（ｐ＞０．０５）；Ｗ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９は、０．３ｍｇ／ｋｇにおいて腫瘍増殖を有意に阻害し（ｐ＜０．００１）、ＴＧＩを表１０に示した。
Figure 2023503624000020
実施例６
カニクイザルにおけるＷ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９の単回投与ＰＫ及び予備毒性試験
４カニクイザル（２動物／群）を２群に分けた。群１及び２の動物にＷ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９の１ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇを、それぞれ、単回静脈内大量投与した。動物情報を表１１に示した。全体的な健康及び外見、特に、皮膚刺激のケージサイド観察を行った。血液学のための全血サンプル分析（ＣＢＣ）及び化学検出のための血清分析を、それぞれ、血液学分析計（ＡＤＶＩＡ２１２０）及び化学分析計（ＨＩＴＡＣＨＩ７１８０）によって決定した。サンプル収集情報を表１２に示した。
Figure 2023503624000021
Figure 2023503624000022
結果：
この試験の目的は、ナイーブ雌カニクイザルにおける単回静脈内大量投与後のＷ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９の薬物動態及び予備毒性効果を決定することであった。血清薬物濃度を図１９に示し、Ｔ１／２は、１ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇについて、それぞれ、７．７５時間及び１９．４時間であった。ＰＫパラメータを表１３に示した。
カニクイザルにおける予備毒性試験
図２０に示されているように、投与後２４時間において、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは末梢血液において減少した。１ｍｇ／ｋｇ群について、末梢ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞集団のレベルは投与後３日目で完全に回復し；１０ｍｇ／ｋｇ群について、Ｔ細胞は投与後１４日目で完全に回復した。投与依存性効果は、２投与スキームにおいて観察された。
図２１に示されているように、ＩＬ－４及びＩＬ５濃度の有意な変化は、Ｗ３４４８－Ｔ３Ｕ１．Ｅ１７Ｒ－１．ｕＩｇＧ４Ｖ９の投与後観察されなかった。ＩＦＮ－γは、１ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの投与後８時間で僅かに増加した。ＴＮＦ－α濃度の一時的増加は、１ｍｇ／ｋｇの投与後１時間において観察された（Ｃ１５０２）。
１０ｍｇ／ｋｇにおいて、注射後８時間において１匹のサル（Ｃ２５０１、雌）は瀕死状態であることが観察され、４時間においてＩＬ－２濃度の増加が観察され、注射後８時間及び１２時間において非常に高いＩＬ－６濃度が検出され、このサルは投与後１２時間において安楽死された。
Figure 2023503624000023
本開示を、趣旨又はその中心的属性から逸脱することなく他の特定の形態で具体化してよいことを、当業者は更に認識するだろう。本開示の前述の明細書はその好ましい実施形態を開示するだけであるから、他の変化形は本開示の範囲内であると意図されることを理解されるべきである。したがって、本開示は、本明細書に詳細に記載されている特定の実施形態に限定されない。むしろ、本開示の範囲及び内容を示す添付のクレームを参照するべきである。
参考文献
１．特許：欧州特許第００１８７９５（Ｂ１）号明細書；１９８６年６月２６日（ＯＫＴ３）。Monoclonal-antibody-producing hybrid cell line, antibody and method of preparing it, therapeutic composition containing it and its diagnostic and therapeutic uses.
２．特許Ｎｏ：米国特許第６，２１７，８６６（Ｂ１）号明細書，２００１年４月１７日；１９９５年６月７日（アービタックス）。Monoclonal antibodies specific to human epidermal growth factor receptor and therapeutic methods employing same.
３．特許Ｎｏ：米国特許第６，２３５，８８３（Ｂ１）号明細書；２００１年５月２２日；１９９７年５月５日（パニツムマブ）。Human monoclonal antibodies to Epidermal Growth Factor Receptor.
４．国際公開第２０１９／０５７０９９号パンフレット。
５．The EGFR family and its ligands in human cancer: signaling mechanisms and therapeutic opportunities. Y. Yarden. European Journal of Cancer 37 (2001) S3‐S8.
６．Anti-CD3 X Anti-EGFR Bispecific antibody redirect T-cell cytolytic activity to EGFR-positive cancer In vitro and in an animal model. Ursula Reusch, et al. Clin Cancer Res 2006;12(1).
７．Cytotoxicity of cytokine-induced killer cells targeted by a bispecific antibody to gastric cancer cells. Lin Zhang, et al. Oncology letters 5,2013.
８．Human IgG2 Antibodies against Epidermal Growth Factor Receptor Effectively Trigger Antibody-Dependent Cellular cytotoxicity but, in Contrast to IgG1, Only by Cells of myeloid Lineage. Tanja Schneider-Merck, et al. J Immunol 2010;184:512-520.
９．Targeting the EGFR signaling pathway in cancer therapy. Parthasarathy Seshacharyulu, et al. Expert Opin Ther Targets.2012 January;16(1):15‐31.
１０．Anti-EGFR Therapy: Mechanism and Advances in Clinical Efficacy in Breast Cancer. John F. Flynn, et al. Journal of Oncology Volume 2009.
１１．EGFR Antagonists in Cancer Treatment. Fortunato Ciardiello, et.al. N Engl J Med 2008;358:1160-74.
１２．Emergence of KRAS mutations and acquired resistance to anti-EGFR therapy in colorectal cancer. Sandra Misael, et al. Nature volume 486, Pages 532‐536(2012).

Claims (37)

  1. ＣＤ３抗原結合性部分及びＥＧＦＲ抗原結合性部分を含む、二重特異性抗体又はその抗原結合部であって、
    前記ＣＤ３抗原結合性部分は、重鎖ＣＨ１定常領域ドメインと機能的に連結された抗ＣＤ３抗体の第一ＶＨ（ＶＨ１）、及び軽鎖定常領域（ＣＬ）と機能的に連結された抗ＣＤ３抗体の第一ＶＬ（ＶＬ１）を含むＦａｂを含み、
    前記ＥＧＦＲ抗原結合性部分は、第一Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）定常領域（Ｃ１）と機能的に連結された抗ＥＧＦＲ抗体の第二重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）、及び第二ＴＣＲ定常領域（Ｃ２）と機能的に連結された抗ＥＧＦＲ抗体の第二軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）を含むキメラＦａｂを含み、前記Ｃ１及びＣ２は、二量体を安定化することができる非天然鎖間ジスルフィド結合により前記二量体を形成することができ、
    （Ａ）前記ＣＤ３抗原結合性部分は：
    配列番号１により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる重鎖ＣＤＲ１と、
    配列番号２により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる重鎖ＣＤＲ２と、
    配列番号３により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる重鎖ＣＤＲ３と、
    配列番号４により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ１と、
    配列番号５により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ２と、
    配列番号６により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ３と
    を含み、
    （Ｂ）前記ＥＧＦＲ抗原結合性部分は：
    配列番号７により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる重鎖ＣＤＲ１と、
    配列番号８により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる重鎖ＣＤＲ２と、
    配列番号９により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる重鎖ＣＤＲ３と、
    配列番号１０により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ１と、
    配列番号１１により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ２と、
    配列番号１２により表されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる軽鎖ＣＤＲ３と
    を含む、二重特異性抗体又はその抗原結合部。
  2. （Ａ）前記ＣＤ３抗原結合性部分は：
    配列番号１により表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１と、
    配列番号２により表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２と、
    配列番号３により表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３と、
    配列番号４により表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１と、
    配列番号５により表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２と、
    配列番号６により表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
    を含み、
    （Ｂ）前記ＥＧＦＲ抗原結合性部分は：
    配列番号７により表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１と、
    配列番号８により表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２と、
    配列番号９により表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３と、
    配列番号１０により表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１と、
    配列番号１１により表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２と、
    配列番号１２により表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３と
    を含む、請求項１に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合部。
  3. （Ａ）前記ＣＤ３抗原結合性部分は：
    （ｉ）配列番号１３を含む又はそれからなる重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）配列、及び
    （ｉｉ）配列番号１４を含む又はそれからなる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）配列
    を含み；
    （Ｂ）前記抗ＥＧＦＲ抗体は：
    （ｉ）配列番号１５を含む又はそれからなる重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）配列、及び
    （ｉｉ）配列番号１６を含む又はそれからなる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）配列
    を含む、請求項１に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合部。
  4. （Ａ）前記ＣＤ３抗原結合性部分は：
    （ｉ）配列番号１３からなる重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）配列、及び
    （ｉｉ）配列番号１４からなる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）配列
    を含み；
    （Ｂ）前記抗ＥＧＦＲ抗体は：
    （ｉ）配列番号１５からなる重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）配列、及び
    （ｉｉ）配列番号１６からなる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）配列
    を含む、請求項３に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合部。
  5. 前記二重特異性抗体又はその抗原結合部は、４つのポリペプチド鎖：
    ｉ）ＶＨ１－ＣＨ１－ヒンジ１－ＣＨ２－ＣＨ３からなる第一重鎖であって、前記第一重鎖は、配列番号２３により表される、第一重鎖と；
    ｉｉ）ＶＬ１－ＣＬからなる第一軽鎖であって、前記第一軽鎖は、配列番号２２により表される、第一軽鎖と；
    ｉｉｉ）ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ２－ＣＨ２－ＣＨ３からなる第二重鎖であって、前記第二重鎖は、配列番号２４により表される、第二重鎖と；
    ｉｖ）ＶＬ２－Ｃ２からなる第二軽鎖であって、前記第二軽鎖は、配列番号２１により表される、第二軽鎖と、
    を含み、
    ｉ）のＶＨ１－ＣＨ１部及びＶＬ１－ＣＬは抗ＣＤ３アームを形成し、ｉｉｉ）のＶＨ２－Ｃ１及びＶＬ２－Ｃ２は抗ＥＧＦＲアームを形成する、
    請求項１に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合部。
  6. 前記二重特異性抗体又はその抗原結合部は、４つのポリペプチド鎖：
    ｉ）配列番号２３により表される第一重鎖と；
    ｉｉ）配列番号２２により表される第一軽鎖と；
    ｉｉｉ）配列番号２４により表される第二重鎖と；
    ｉｖ）配列番号２１により表される第二軽鎖と
    からなる、請求項５に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合部。
  7. 前記Ｃ１ドメインは、改変ＴＣＲβ定常領域を含み、及び配列番号２９のアミノ酸配列を含み；並びに前記Ｃ２ドメインは、改変ＴＣＲα定常領域を含み、及び配列番号３０のアミノ酸配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合部。
  8. 前記ＣＤ３抗原結合性部分及び前記ＥＧＦＲ抗原結合性部分をリンカーにより融合する、請求項１～７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合部。
  9. Ｆｃ領域を更に含み、前記Ｆｃ領域は、前記ＣＤ３抗原結合性部分の前記ＣＨ１ドメインと機能的に連結されている、請求項１～８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合部。
  10. 前記Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域などのヒトＦｃ領域である、請求項９に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合部。
  11. 前記ヒトＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４又はＩｇＧ１ Ｆｃ領域である、請求項１０に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合部。
  12. 前記二重特異性抗体又はその抗原結合部は、ヒト化抗体である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合部。
  13. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合部をコードする核酸配列を含む、単離核酸分子。
  14. 前記単離核酸分子は、前記ＣＤ３結合性部分の前記重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）をコードし、配列番号１３に記載の前記重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）をコードする核酸配列を含む、請求項１３に記載の単離核酸分子。
  15. 前記ＣＤ３結合性部分の前記重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）をコードする前記単離核酸分子は、配列番号１７に記載の核酸配列を含む、請求項１４に記載の単離核酸分子。
  16. 前記単離核酸分子は、前記ＣＤ３結合性部分の前記軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）をコードし、配列番号１４に記載の前記軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）をコードする核酸配列を含む、請求項１３に記載の単離核酸分子。
  17. 前記ＣＤ３結合性部分の前記軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）をコードする前記単離核酸分子は、配列番号１８に記載の核酸配列を含む、請求項１６に記載の単離核酸分子。
  18. 前記単離核酸分子は、前記ＥＧＦＲ結合性部分の前記重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）をコードし、配列番号１５に記載の前記重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）をコードする核酸配列を含む、請求項１３に記載の単離核酸分子。
  19. 前記ＥＧＦＲ結合性部分の前記重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）をコードする前記単離核酸分子は、配列番号１９に記載の核酸配列を含む、請求項１８に記載の単離核酸分子。
  20. 前記単離核酸分子は、前記ＥＧＦＲ結合性部分の前記軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）をコードし、配列番号１６に記載の前記軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）をコードする核酸配列を含む、請求項１３に記載の単離核酸分子。
  21. 前記ＥＧＦＲ結合性部分の前記軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）をコードする前記単離核酸分子は、配列番号２０に記載の核酸配列を含む、請求項１３に記載の単離核酸分子。
  22. 請求項１３～２１のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
  23. 請求項１３～２１のいずれか一項に記載の核酸分子又は請求項２２に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  24. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合部及び薬剤的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
  25. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合部の産生方法であって、前記方法は、
    請求項２３に記載の宿主細胞内で請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部を発現させるステップと；
    前記宿主細胞から前記抗体又はその抗原結合部を単離するステップと、
    を含む、方法。
  26. 対象における免疫応答の調節方法であって、前記方法は、請求項１～１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体若しくはその抗原結合部又は請求項２４に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
  27. 対象における腫瘍細胞の増殖の阻害方法であって、前記方法は、請求項１～１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体若しくはその抗原結合部又は請求項２４に記載の医薬組成物の有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
  28. 対象におけるＣＤ３関連及び／又はＥＧＦＲ関連疾患の予防又は治療方法であって、前記方法は、請求項１～１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体若しくはその抗原結合部又は請求項２４に記載の医薬組成物の有効量を前記対象に投与することを含み、前記ＣＤ３関連及び／又はＥＧＦＲ関連疾患は、増殖性疾患、免疫不全、又は感染症である、方法。
  29. 前記増殖性疾患は、結腸がん、肺がん、肝がん、子宮頸がん、乳がん、卵巣がん、膵がん、メラノーマ、グリオブラストーマ、前立腺がん、食道がん、又は胃がんなどのがんである、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記感染症は、慢性感染症である、請求項２８に記載の方法。
  31. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合部を、がん免疫療法において使用するために、化学療法薬、放射線及び／又は他の薬剤と併用して投与する、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の方法。
  32. ｉ）Ｔ細胞活性の回復など、免疫応答の調節において使用するため；
    ｉｉ）ＥＧＦＲ発現腫瘍細胞の存在下Ｔ細胞活性化の増強において使用するため；及び／又は
    ｉｉｉ）がん細胞に対する前記免疫応答のブーストなど、免疫応答の刺激において使用するための
    請求項１～１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合部。
  33. ＣＤ３関連疾患及び／又はＥＧＦＲ関連疾患は、増殖性疾患、免疫不全、又は感染症を含み、対象における前記ＣＤ３関連疾患及び／又は前記ＥＧＦＲ関連疾患の治療又は予防において使用するための、請求項１～１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合部。
  34. 増殖性疾患、免疫不全、又は感染症の診断において使用するための、請求項１～１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合部。
  35. 対象における腫瘍細胞の免疫応答の調節又は増殖の阻害のための医薬品製造における、請求項１～１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合部の使用。
  36. ＣＤ３関連疾患及び／又はＥＧＦＲ関連疾患は、増殖性疾患、免疫不全、又は感染症を含み、対象における前記ＣＤ３関連疾患及び／又は前記ＥＧＦＲ関連疾患の治療又は予防のための医薬品製造における、請求項１～１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合部の使用。
  37. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合部を含む容器を備える、キット。
JP2022530934A 2019-11-29 2020-11-27 新規抗ｃｄ３／抗ｅｇｆｒ二重特異性抗体及びその使用 Pending JP2023503624A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2019121869 2019-11-29
CNPCT/CN2019/121869 2019-11-29
PCT/CN2020/132157 WO2021104430A1 (en) 2019-11-29 2020-11-27 A novel anti-cd3/anti-egfr bispecific antibody and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2023503624A true JP2023503624A (ja) 2023-01-31

Family

ID=76129139

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022530934A Pending JP2023503624A (ja) 2019-11-29 2020-11-27 新規抗ｃｄ３／抗ｅｇｆｒ二重特異性抗体及びその使用

Country Status (5)

Country Link
US (2) US20230067182A1 (ja)
EP (1) EP4065604A4 (ja)
JP (1) JP2023503624A (ja)
CN (1) CN114761429B (ja)
WO (1) WO2021104430A1 (ja)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023036137A1 (en) * 2021-09-10 2023-03-16 Wuxi Biologics (Shanghai) Co. Ltd. Process for preparing highly homogenous antibody-drug conjugates for engineered antibodies
WO2023183766A1 (en) * 2022-03-20 2023-09-28 Abcellera Biologics Inc. Anti-cd3 antibodies and t-cell engagers and methods of use
CN114685675B (zh) * 2022-04-27 2023-02-03 深圳市汉科生物工程有限公司 双特异性抗体及其在治疗癌症中的用途
CN114621351B (zh) * 2022-04-27 2023-01-03 华羊生物技术股份有限公司 多特异性抗体及其治疗癌症的用途

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8630984B1 (en) * 2003-01-17 2014-01-14 Renew Data Corp. System and method for data extraction from email files
US7908339B2 (en) * 2004-06-03 2011-03-15 Maxsp Corporation Transaction based virtual file system optimized for high-latency network connections
US7818728B1 (en) * 2005-04-04 2010-10-19 Qd Technology Llc Maximizing system resources used to decompress read-only compressed analytic data in a relational database table
US7917957B2 (en) * 2007-05-29 2011-03-29 Alcatel Lucent Method and system for counting new destination addresses
CA2682626A1 (en) * 2007-04-03 2008-10-09 Micromet Ag Cross-species-specific bispecific binders
US9779121B2 (en) * 2014-06-27 2017-10-03 Sap Se Transparent access to multi-temperature data
CN104774268B (zh) * 2015-01-21 2018-09-28 武汉友芝友生物制药有限公司 一种双特异性抗体egfr×cd3的构建及应用
CN106632681B (zh) * 2016-10-11 2017-11-14 北京东方百泰生物科技有限公司 抗egfr和抗cd3双特异抗体及其应用
CA3060190A1 (en) * 2017-04-24 2018-11-01 Glenmark Pharmaceuticals S.A. T cell redirecting bispecific antibodies for the treatment of egfr positive cancers
CN113004391A (zh) * 2017-08-16 2021-06-22 蜻蜓疗法股份有限公司 结合nkg2d、cd16和egfr、ccr4或pd-l1的蛋白质
MX2020003087A (es) * 2017-09-21 2020-08-17 Wuxi Biologics Ireland Ltd Anticuerpos anti-cd3epsilon novedosos.
MX2020003144A (es) * 2017-09-22 2020-07-28 Wuxi Biologics Ireland Ltd Nuevos complejos de polipeptidos biespecificos cd3/cd19.
BR112020005676A2 (pt) * 2017-09-22 2020-10-20 WuXi Biologics Ireland Limited novos complexos polipeptídicos biespecíficos
KR102062531B1 (ko) * 2018-06-25 2020-01-06 주식회사 티맥스 소프트 결정 테이블을 결정 트리로 변환하는 데이터베이스 서버 및 컴퓨터 판독 가능 매체에 저장된 컴퓨터 프로그램
US11423020B2 (en) * 2018-10-19 2022-08-23 Oracle International Corporation Efficient extraction of large data sets from a database
JP2020177425A (ja) * 2019-04-17 2020-10-29 富士ゼロックス株式会社 情報処理装置及びプログラム

Also Published As

Publication number Publication date
EP4065604A1 (en) 2022-10-05
CN114761429A (zh) 2022-07-15
US20230067182A1 (en) 2023-03-02
US20230008090A1 (en) 2023-01-12
WO2021104430A1 (en) 2021-06-03
EP4065604A4 (en) 2023-12-27
CN114761429B (zh) 2023-11-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110204614B (zh) 抗人lag-3单克隆抗体及其制备方法和用途
JP2023503624A (ja) 新規抗ｃｄ３／抗ｅｇｆｒ二重特異性抗体及びその使用
CN113214400B (zh) 一种双特异性抗pd-l1/vegf抗体及其用途
JP2022504802A (ja) ５ｔ４シングルドメイン抗体およびその治療組成物
WO2019228406A1 (en) A novel anti-cd3/anti-cd20 bispecific antibody
JP2024029261A (ja) 新規の抗ｐｄ－１抗体
TWI813951B (zh) 一種雙功能融合蛋白及其用途
JP7445752B2 (ja) 新規の抗ｐｄ－ｌ１抗体
JP2021501583A (ja) 抗体および使用方法
US20230242645A1 (en) A bispecific anti-pd-l1/vegf antibody and uses thereof
WO2021057930A1 (en) A novel anti-pd-l1/anti-lag-3 bispecific antibody and uses thereof
KR20210104094A (ko) 항-tim-3 항체 및 이의 용도
WO2023222017A1 (en) Anti-b7h3 antibody and uses thereof
WO2023179443A1 (en) Anti-her2/anti-cd47 molecules and uses thereof
WO2022206843A9 (en) A bispecific anti-pd-l1/vegf antibody and uses thereof
WO2024051796A1 (en) Albumin binding proteins, fusion proteins and uses thereof
JP7482031B2 (ja) 新規の抗ｐｄ－１抗体

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220725

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20220725

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20230627

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20230628

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230927

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20231107

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20240206

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240507