CN110511278A

CN110511278A - 抗b7-h6抗体、融合蛋白及其使用方法

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Publication number: CN110511278A
Application number: CN201910720847.XA
Authority: CN
Inventors: C·L·森特曼; T·张
Original assignee: Council Of Dartmouth University
Current assignee: Council Of Dartmouth University; Dartmouth College
Priority date: 2012-05-07
Filing date: 2013-05-07
Publication date: 2019-11-29
Also published as: ES2719495T3; EP2847223A1; HK1208476A1; JP6389166B2; EP3505537A1; CN104395344B; EP2847223B1; US20210206858A1; JP2015519337A; US20150152181A1; WO2013169691A1; EP2847223A4; US20180066059A1; US9790278B2; CN104395344A; US11034766B2

Abstract

本发明提供了对B7‑H6具有特异性的抗体、嵌合抗原受体和双特异性T细胞衔接物，以及将它们用于与B7‑H6表达相关的疾病的诊断和治疗的方法。

Description

抗B7-H6抗体、融合蛋白及其使用方法

本申请是申请日为2013年5月7日、发明名称为“抗B7-H6抗体、融合蛋白及其使用方法”的中国发明专利申请No.201380034592.2的分案申请。

引言

本申请要求2012年5月7日提交的美国专利申请系列号61/643,456和2012年9月25日提交的美国专利申请系列号61/705,227的优先权权益，所述专利申请的内容以引用方式整体并入本文。

本发明是在美国国立卫生研究院授予的合同号为CA130911的政府资助下作出的。政府享有本发明中的某些权利。

背景技术

自然杀伤(NK)细胞是先天免疫***的淋巴细胞，其参与消灭肿瘤细胞。在人类中，激活性自然细胞毒性受体(NCR)NKp30、NKp44和NKp46在NK细胞介导的肿瘤细胞裂解中起到主要的作用。NKp30能识别B7-H6，后者是B7家族的一个成员。与所有已知的B7家族成员一样，B7-H6包括两个Ig结构域，在胞外区中具有相邻的相位1内含子。重要的是，B7-H6在正常人组织中不能检测到，但在多种人肿瘤细胞系上选择性表达，包括T和B淋巴瘤、黑素瘤和癌(Brandt等人，(2009)，J.Exp.Med.(《实验医学杂志》)，206:1495-1503)。此外，B7-H6在肿瘤细胞上的表达会引起NKp30特异性NK细胞的细胞毒性和细胞因子分泌。因此，B7-H6起到肿瘤诱导的自体分子的作用，该自体分子通过其与激活性受体NKp30的相互作用来向先天免疫警告有细胞转化的情况(Brandt等人，(2009)，出处同上)。

发明内容

本发明是分离的抗体或该抗体的抗原结合片段，其特异性结合B7同源物6(B7-H6)，其中重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3序列分别在SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ IDNO:7中示出；并且轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3序列分别在SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10中示出。在一个实施例中，该抗体具有SEQ ID NO:3的重链可变结构域。在另一个实施例中，该抗体具有SEQ ID NO:4的轻链可变结构域。在其他实施例中，该抗体是人源化的。在还进一步的实施例中，该抗体与合成分子如标记、细胞毒性剂或治疗性放射性同位素缀合。在另外其他实施例中，该抗体是嵌合抗原受体，而该合成分子包括跨膜区、胞内T细胞受体信号传导结构域(例如从CD3ζ获得)及共刺激蛋白受体的任选的胞内结构域。在其他实施例中，该抗体是双特异性T细胞衔接物(engager)，而该合成分子包括能结合T细胞抗原(例如CD3)的抗原结合结构域。提供了包括本发明的抗体或抗原结合片段和药学上可接受的载体的药物组合物，其为含有例如与标记缀合的该抗体或抗原结合片段的试剂盒。

本发明还是嵌合抗原受体，其包括能特异性结合B7同源物6的抗体的抗原结合片段、跨膜区和胞内T细胞受体信号传导结构域。在一些实施例中，跨膜区和胞内T细胞受体信号传导结构域从CD3ζ获得。在其他实施例中，该嵌合抗原受体还包括共刺激蛋白受体的胞内信号传导结构域。

本发明还提供双特异性T细胞衔接物，其包括能特异性结合B7同源物6的抗体的抗原结合片段和能结合T细胞抗原的抗原结合结构域，其中在一些实施例中该T细胞抗原是CD3。

还提供了使用本文描述的抗体杀灭表达B7同源物6的细胞或抑制其生长的方法以及治疗与B7同源物6异常表达相关的疾病或病症的方法。

附图说明

图1显示抗B7H6嵌合抗原受体(CAR)的结构。

图2显示NKp30嵌合抗原受体(CAR)和抗B7H6CAR修饰的T细胞通过产生IFN-γ而对NKp30配体阳性细胞作出响应。表达野生型B7-H6(WT)、抗B7-H6CAR(aB7H6-28-z)或NKp30-CD28-CD3ζ融合蛋白(30-28-z)的T细胞与培养基、RMA细胞、表达B7-H6的RMA细胞、或K562细胞(10⁵个细胞)接触(图2A)或者与外周血单核细胞(PBMC，10⁵细胞)或不成熟树突细胞(iDC，2×10⁴个细胞)(图2B)接触24小时，用ELISA测量IFN-γ的产生水平。结果以平均值+标准偏差(SD)表示。

图3显示HLA-DR、CD83、CD86、NKp30配体和B7-H6在不成熟树突细胞(iDC)和成熟树突细胞(mDC)上的表达。

图4显示与同种型对照染色相比，B7H6(使用抗B7H6单克隆抗体)和NKp30配体(使用可溶性NKp30-Ig)在各种人细胞系和小鼠RMA细胞和RMA-B7H6细胞上的表达。

图5显示抗B7H6CAR修饰的T细胞在进行体内处理后能提高荷RMA/B7H6淋巴瘤小鼠的存活率。B6小鼠接种RMA/B7H6(10⁵个细胞，静脉内，第0天)。给予模拟物转导的T细胞或抗B7H6CAR修饰的T细胞(5×10⁶个细胞，静脉内，第5、7、9天(图5A))。数据以Kaplan-Meier存活率曲线呈现。所示的数据为两个独立实验的汇集(pool)(图5B)。用10⁴个RMA以皮下方式对原初的小鼠和存活的小鼠(自图5B)再次攻击(无B7H6表达)，隔日测量肿瘤面积(图5C)。这些数据显示在CAR治疗后存活的小鼠对相同的肿瘤具有抗性，这表明诱导了对抗其他肿瘤抗原的免疫应答，因为RMA细胞不表达B7H6。

图6显示抗B7H6BiTE的结构和活性。图6A示出抗B7H6抗体的scFv和抗CD3抗体(OKT3)的scFv之间的融合。VH，可变区重链；VL，可变区轻链；和L，接头。图6B显示含有这个BiTE的经调理的培养基引起了抗表达B7H6的肿瘤细胞(RMA-B7H6,K562)但不抗不表达B7H6的肿瘤细胞(RMA)的人T细胞对B7H6+肿瘤细胞的强劲杀灭。OKT3激活的PBMC与肿瘤细胞系以5:1的E:T比例(效应细胞与靶细胞比)在1比4稀释的含有抗B7H6BiTE的经调理的培养基或对照培养基中进行共培养。共培养五小时后，收获细胞上清液，通过乳酸脱氢酶(LDH)释放测定法测定细胞毒性。

图7提供的数据显示抗B7H6BiTE蛋白能引起IFN-γ分泌。图7A，OKT3激活的人T细胞与肿瘤细胞以E:T＝1:1比例(10⁵:10⁵)在各种huBiTE1浓度下进行共培养。24小时后收集上清液，通过ELISA测定IFN-γ浓度。图7B，OKT3激活的T细胞与肿瘤细胞以4:1、1:1或0.25:1的E:T比例进行培养。HuBiTE1以250ng/mL的浓度加入到共培养物。24小时后收集培养物上清液。通过ELISA测量IFN-γ浓度。图7C显示含有能激活小鼠T细胞的抗B7H6BiTE的经调理的培养基当与表达B7H6的小鼠肿瘤细胞共培养时，能引起小鼠T细胞强劲产生IFN-γ。ConA激活的小鼠脾细胞与肿瘤细胞系以5:1的E:T比例(对于B16F10和B16F10/B7H6，10⁵:2×10⁴)或1:1的E:T比例(对于K562，10⁵:10⁵)在1比4稀释的经调理的培养基(来自转染小鼠Bite1质粒的293F细胞)或对照上清液中进行共培养。共培养(24小时)后收集上清液，通过ELISA测定IFN-γ浓度。

图8显示小鼠BiTE1(抗B7H6BiTE)特异性激活了小鼠T细胞以杀灭B7H6+肿瘤细胞。ConA激活的小鼠脾细胞与RMA(用0.1μM CSFE预标记)和RMA-B7H6(用1μM CSFE预标记)混合物(50％RMA+50％RMA-B7H6；图8A)或者B16F10和B16F10-B7H6混合物(50％B16F10+50％B16F10-B7H6；图8B)以1:1、5:1和10:1的E:T比例进行共培养。8小时和24小时后，收获细胞并通过流式细胞术确定活细胞身份。基于对照组归一化的RMA:RMA-B7H6比例或者每个实验组的B16F10:B16F10-B7H6比例计算B7H6+细胞的特异性裂解率。

具体实施方式

为在癌症的治疗中靶向B7-H6，产生了两种小鼠来源的能特异性识别B7-H6的单克隆抗体(mAb)。这两个克隆均属小鼠IgG2a亚类。分离了编码mAb克隆47.39的重链和轻链的基因。测定了核苷酸和推导的氨基酸。使用这些序列产生了嵌合抗原受体(CAR)，其包括mAb47.39的重链和轻链的可变部分(VH和VL)。具体地讲，该抗B7-H6CAR包括能识别B7-H6的单链可变片段(scFv)，接着是CD28分子的一部分(包括铰链结构域、跨膜结构域和胞质结构域)和CD3ζ的胞质区(图1)。使用流式细胞术确认了这个CAR能识别B7-H6分子。此外发现，表达抗B7-H6CAR的T细胞响应B7-H6阳性细胞(即K562骨髓性白血病细胞和表达B7-H6的RMA细胞)的刺激而产生了高水平IFN-γ(图2A)，而自体PBMC和iDC不响应抗B7-H6CAR(图2B)。流式细胞术数据显示，树突细胞(DC)不在细胞表面上表达B7-H6(图3)，而癌细胞系如K562、U937、A375、Hela、T47D和Panc-1的确表达B7-H6(图4)，并且所述表达与NKp30表达相关联。在这点上，与基于NKp30的CAR不同的是，抗B7H6CAR不表现出对抗自体树突细胞的反应性。此外，证实抗B7H6CAR能使T细胞重新导向以特异性裂解B7H6阳性肿瘤细胞，但不裂解B7H6阴性肿瘤细胞。表达B7H6特异性CAR的鼠T细胞的过继转移导致了在五天前输注过B7H6⁺淋巴瘤细胞的C57BL/6小鼠的存活率改善(图5A和5B)。此外，在用B7H6⁺淋巴瘤细胞进行的第一次攻击中存活下来的小鼠在用B7H6⁺淋巴瘤细胞进行的再次攻击时表现出免疫性(图5C)。因此，这证明了B7H6特异性CAR用于抗B7H6⁺肿瘤的过继T细胞免疫治疗的用途。

除了抗B7H6CAR之外，还产生了抗B7H6/抗CD3BiTE(双特异性T细胞衔接物(图6A)。产生了抗B7H6BiTE的人源形式和小鼠源形式(即分别为huBiTE1和muBiTE1)，两者均能够特异性裂解B7H6⁺肿瘤(图6B、8A和8B)。此外，抗B7H6BiTE的人源形式和小鼠源形式在T细胞和肿瘤细胞共培养物中均引起了IFN-γ分泌(图7A-7C)。

因此，本发明提供对B7-H6具有特异性的抗体，其中该抗体具有由SEQ ID NO:1的核苷酸序列编码的重链和由SEQ ID NO:2的核苷酸序列编码的轻链。此外，本发明提供对B7-H6具有特异性的抗体，其中该抗体具有SEQ ID NO:3的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:4的轻链氨基酸序列。更具体地讲，本发明提供特异性结合B7-H6的抗体，其中该抗体的重链可变区具有Gly-Tyr-Thr-Phe-Thr-Gly-Tyr-Trp(SEQ ID NO:5)的CDR1序列、Ile-Leu-Pro-Gly-Thr-Gly-Ser-Thr(SEQ ID NO:6)的CDR2序列、Ala-Ile-Pro-Gly-Pro-Met-Asp-Tyr(SEQ ID NO:7)的CDR3序列；并且该抗体的轻链可变区具有Gln-Asp-Ile-Asn-Ser-Tyr(SEQID NO:8)的CDR1序列，Arg-Ala-Asn(SEQ ID NO:9)的CDR2序列和Leu-Gln-Tyr-Asp-Glu-Phe-Pro-Tyr-Thr(SEQ ID NO:10)的CDR3序列。在一些实施例中，该抗体可包括SEQ ID NO:3的重链与任何合适的轻链(如US 2004/0152105、PCT/US2000/030039和PCT/IB2010/003411中描述的那些)的组合。同样，该抗体可包括SEQ ID NO:4的轻链与任何合适的重链(如US 2004/0152105、PCT/US2000/030039和PCT/IB2010/003411中描述的那些)的组合。

该抗体可以是对人B7-H6具有特异性的分离抗体，并且可以是全长抗体或抗体片段。该抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体、重组抗体、嵌合抗体或人源化抗体。另外，该抗体可以为任何同种型，包括但不限于IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。因此，例如，该抗体可为任何IgA，如IgA1或IgA2，或为任何IgG，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或合成的IgG。该抗体也可为任何对B7-H6具有特异性的抗体片段，如F(ab)₂、Fv、scFv、F(ab')₂、F(ab)、VL、VH、dsFv、Fv、scFv-Fc、(scFv)₂、双抗体和二价抗体。该抗体可为任何修饰的或合成的抗体，包括但不限于非耗竭性IgG抗体、T-bodies或者抗体的其他Fc变体或Fab变体。

除了SEQ ID NO:3的重链之外，本发明的抗体可进一步包括使用序贯原初链改组(sequential chain shuffling)选自Fab文库的轻链。同样，除了SEQ ID NO:4的轻链之外，本发明的抗体可进一步包括使用序贯原初链改组选自Fab文库的重链。

在一些实施例中，本发明提供对B7-H6具有约10μM或更低、5μM或更低、2μM或更低、1μM或更低、500nM或更低、400nM或更低、300nM或更低或者200nM或更低的亲合力的抗体。本发明还提供对B7-H6具有约100nM或更低、约75nM或更低、约50nM或更低、约25nM或更低、约10nM或更低或者约5nM或更低的亲合力的抗体。亲合力可使用本领域公知的技术如ELISA或BIACORE进行测量。

本发明的抗体可通过任何合适的技术来产生，例如使用任何合适的真核生物或非真核生物表达***来产生。在某些实施例中，该抗体用哺乳动物表达***来产生。在一些实施例中，重链可由诸如SEQ ID NO:1的DNA序列编码，而轻链可由诸如SEQ ID NO:2的DNA序列编码。

本发明的抗体可用合适的非真核生物表达***如细菌表达***来产生。细菌表达***可用来产生片段，如F(ab)₂、Fv、scFv、F(ab')₂、F(ab)、VL、VH、dsFv、Fv、scFv-Fc、(scFv)₂及双抗体。用于变更DNA编码序列以产生此类片段的技术是本领域公知的。

可使用任何类型的合适的缀合，将本发明的抗体与合成分子缀合。可使用重组工程和掺入的硒半胱氨酸(例如，如WO 2008/122039中所描述)来缀合合成分子。其他的缀合方法可包括共价偶联至天然的或工程改造的赖氨酸侧链胺或半胱氨酸侧链硫醇。参见例如Wu等人，(2005)，Nat.Biotechnol.(《自然生物技术》)，23:1137-1146。合成分子可以是任何分子，如靶向肿瘤的分子。当然，应认识到，合成分子也可以是蛋白质或抗体，其中所得的融合蛋白可通过常规的重组蛋白表达***和方法来产生。

在这点上，具体的实施例包括嵌合抗原受体(CAR)。CAR也称人工T细胞受体、嵌合T细胞受体或嵌合免疫受体，是工程改造的受体，其将任意的特异性移植到免疫效应细胞上。通常，使用这些受体来将单克隆抗体的特异性移植到T细胞上，例如通过逆转录病毒载体表达来移植。这些分子的最普通形式是衍生自单克隆抗体的scFv与CD3-ζ跨膜和内结构域即胞内T细胞受体(TCR)信号传导结构域融合所得的融合物。这种分子导致响应于其靶标的scFv的识别而出现ζ信号的传递。“第一代”CAR通常具有来自CD3ζ链的胞内结构域，该胞内结构域是来自内源TCR的信号的主要传递物。“第二代”CAR将来自各种共刺激蛋白受体(例如CD28、41BB、ICOS)的胞内信号传导结构域添加到CAR的胞质尾区以给T细胞提供额外的信号(参见图1A)。临床前研究已表明，该第二代的CAR设计能改善T细胞的抗肿瘤活性(Maher等人，(2002)，Nat.Biotechnol.(《自然生物技术》)，20:70-75；Kowolik等人，(2006)，Cancer Res.(《癌症研究》)，66:10995-11004)。更近期的“第三代”CAR将多种信号传导结构域如CD3z-CD28-41BB或CD3z-CD28-OX40结合在一起以进一步增加效力(Zhao等人，(2009)，J.Immunol.(《免疫学杂志》)，183:5563-5574；Pule等人，(2005)，Mol.Ther.(《分子治疗》)，12:933-941；Zhong等人，(2010)，Mol.Ther.(《分子治疗》)，18:413-420)。因此，在本发明的一个实施例中，抗B7-H6 scFv片段被包括在CAR中。

可使用CD3-ζ和本领域公知的其他共刺激分子的序列，采用标准的重组蛋白技术，来制备本发明的CAR。例如，人CD3-ζ序列可以以GENBANK登录号NP_932170获取，人CD28序列可以以GENBANK登录号NP_006130获取，人OX40序列可以以GENBANK登录号NP_003318获取，并且人CD19序列可以以GENBANK登录号AAA69966获取。在具体的实施例中，本发明的CAR包括人CD3ζ胞质结构域(氨基酸52-164；SEQ ID NO:11)、人CD28铰链-跨膜-胞质结构域(氨基酸135-220；SEQ ID NO:12)和任选CD19的一部分(氨基酸1-327；SEQ ID NO:13)。

其他合成分子包括治疗剂如细胞毒性剂、细胞抑制剂或抗血管生成剂和放射性同位素。细胞毒性剂可以是植物分子、真菌分子或细菌分子(例如蛋白质毒素)。治疗剂可以是类美坦素(maytansinoid)(例如美坦西醇或DM1类美坦素)、紫杉烷或加利车霉素。治疗剂包括长春新碱和***。治疗剂可以是抗代谢药(例如抗叶酸剂如甲氨喋呤、氟嘧啶如5-氟尿嘧啶、胞嘧啶***糖苷、或者嘌呤或腺苷的类似物)；嵌入剂(例如蒽环霉素如多柔比星、道诺霉素、表柔比星、伊达比星、丝裂霉素C、放线菌素或光辉霉素)；铂衍生物(例如顺铂或卡铂)；烷基化剂(例如氮芥、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、环磷酰胺、异环磷酰胺亚硝基脲或塞替派)；抗有丝***剂(例如长春花生物碱如长春新碱或者紫杉类化合物如紫杉醇或多西他赛)；拓扑异构酶抑制剂(例如依托泊苷和替尼泊苷、安吖啶、托泊替康)；细胞周期抑制剂(例如黄酮吡啶酚(flavopyridol))；或者微管剂(microbtubule agent)(例如埃博霉素、盘皮海绵内酯类似物或软珊瑚醇类似物)。治疗剂可以是蛋白体抑制剂或拓扑异构酶抑制剂如硼替佐米、安吖啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷、替尼泊苷或多柔比星。治疗性放射性同位素包括钇(⁹⁰Y)、镥(¹⁷⁷Lu)、锕(²²⁵Ac)、镨、砹(²¹¹At)、铼(¹⁸⁶Re)、铋(²¹²Bi或²¹³Bi)和铑(¹⁸⁸Rh)。抗血管生成剂包括利诺胺、贝伐单抗(bevacuzimab)、血管生长抑素和雷佐生。合成分子可以是另一种抗体如利妥昔单抗或贝伐单抗。

合成分子也可以是标记。标记可用于诊断应用，并且可包括例如造影剂。造影剂可以是放射性同位素标记如碘(¹³¹I或¹²⁵I)、铟(¹¹¹In)、锝(⁹⁹Tc)、磷(³²P)、碳(¹⁴C)、氚(³H)、其他放射性同位素(例如放射性离子)或以上所列的治疗性放射性同位素。例如，造影剂可包括不透射线的材料、磁共振成像(MRI)剂、超声显像剂和任何其他适合于通过能对动物身体进行显像的装置进行检测的造影剂。合成分子也可以是荧光标记、生物活性酶标记、发光标记或发色团标记。

此外，合成分子也可以是磁性纳米粒子、控释聚合物纳米粒子或脂质组合物。磁性纳米粒子包括但不限于铁(例如Fe₃O₄或Fe₂O₄)、钴、锌、镉、镍、钆、铬、铜、锰、铽、铕、金、银、铂或它们的合金。控释聚合物纳米粒子可用常规方法从生物可降解聚合物或非生物可降解聚合物来生产，所述生物可降解聚合物或非生物可降解聚合物例如为聚乳酸、聚乳酸的衍生物、PEG化的聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物、乳酸-乙醇酸共聚物的衍生物、PEG化的乳酸-乙醇酸共聚物、聚酸酐、聚原酸酯、聚原酸酯的衍生物、PEG化的聚原酸酯、聚己内酯、聚己内酯的衍生物、PEG化的聚己内酯、聚丙烯酸、聚丙烯酸的衍生物、聚氨基甲酸酯、聚氨基甲酸酯的衍生物或者它们的组合)。类似地，可用常规方法生产脂质组合物(例如脂质体、固体质子纳米粒子等)并将其与本发明的抗体缀合。

在一些实施例中，该抗体还可对除B7-H6之外的一种或多种抗原具有特异性。例如，可将本发明的抗体进行工程改造(例如改造成二价的双抗体或缀合的Fab二聚体或三聚体)以具有对B7-H6和另一肿瘤抗原(例如与本文公开的淋巴瘤、白细胞、黑素瘤或肉瘤相关的抗原)的特异性。或者，可将该抗体进行工程改造以具有对B7-H6和能促进其他细胞(如细胞毒性效应细胞或T细胞)的激活或靶向的抗原的特异性。因此，本发明还包括BiTES(双特异性T细胞衔接物)和DARTS(双亲和力再靶向试剂(dual affinity retargetingreagents))。

如本领域所知，BiTE指具有两个抗原结合结构域的单多肽链分子，其中一个抗原结合结构域结合T细胞抗原(例如CD3)，另一个结合靶细胞的表面上存在的抗原(WO 05/061547；Baeuerle等人，(2008)，Drugs of the Future(《未来的药物》)，33:137-147；Bargou等人，(2008)，Science(《科学》)，321:974-977)。已构建出了抗各种靶抗原的BiTE抗体，所述靶抗原包括CD19、EpCAM、Her2/neu、EGFR、CD66e(或CEA、CEACAM5)、CD33、EphA2和MCSP(或HMW-MAA)(Baeuerle等人，(2009)，Curr.Opin.Mol.Ther.(《分子治疗新见》)，11:22-30)。BiTE抗体的主要特点(所述特点的组合能将所述抗体与其他双特异性抗体构建体区别开来)包括高效力的重新导向的裂解，EC₅₀值在0.1至50pmol/L(2-1,000pg/mL)的范围内(Baeuerle等人，(2009)，出处同上)；T细胞的严格靶细胞依赖性激活(Brischwein等人，(2007)，J.Immunother.(《免疫治疗杂志》)，30:798-807)；以及激活的T细胞对系列裂解的支持，即在低E:T比例下的活性。BiTE抗体通常作为高等真核生物细胞系分泌的重组糖基化蛋白质而产生。因此，在本发明的另一个实施例中，抗B7-H6抗体片段(例如scFv)是BiTE的一个组分。在具体的实施例中，本发明的BiTE由通过接头(例如(G₄S)₃接头)融合在一起的抗B7-H6抗体片段和抗CD3抗体片段组成。在特定的实施例中，抗CD3抗体片段包括具有Ser-Gly-Tyr-Thr-Phe-Thr-Arg-Tyr-Thr-Met-His(SEQ ID NO:15)的CDR1序列、Tyr-Ile-Asn-Pro-Ser-Arg-Gly-Tyr-Thr-Asn-Tyr-Asn-Gln-Lys-Phe-Lys-Asp(SEQ ID NO:16)的CDR2序列和Tyr-Tyr-Asp-Asp-His-Tyr-Cys-Leu(SEQ ID NO:17)的CDR3序列的重链可变区；以及具有Ser-Ala-Ser-Ser-Ser-Val-Ser-Tyr-Met-Asn(SEQ ID NO:18)的CDR1序列、Asp-Thr-Ser-Lys-Leu-Ala-Ser(SEQ ID NO:19)的CDR2序列和Gln-Gln-Trp-Ser-Ser-Asn-Pro-Phe(SEQ ID NO:20)的CDR3序列的轻链可变区。参见US 5,929,212。

DART指包括至少两条缔合(尤其是通过共价相互作用缔合)形成至少两个表位结合位点的多肽链的免疫球蛋白分子，所述表位结合位点可识别相同或不同的表位。DART的每条多肽链包括免疫球蛋白轻链可变区和免疫球蛋白重链可变区，但这些区域不发生相互作用形成表位结合位点。相反，其中一条(例如第一条)DART多肽链的免疫球蛋白重链可变区与另一条(例如第二条)DART多肽链的免疫球蛋白轻链可变区发生相互作用形成表位结合位点。类似地，其中一条(例如第一条)DART多肽链的免疫球蛋白轻链可变区与另一条(例如第二条)DART多肽链的免疫球蛋白重链可变区发生相互作用形成表位结合位点。DART可为单特异性的、双特异性的、三特异性的，等等，因此能够同时结合一个、两个、三个或者更多个不同的表位(其可属相同的抗原或者属不同的抗原)。DART另外可为单价的、二价的、三价的、四价的、五价的、六价的，等等，因此能够同时结合一个、两个、三个、四个、五个、六个或者更多个分子。DART的这两个属性(即特异性程度和价可进行组合，例如以产生四价(即能够结合四组表位)的双特异性(即能够结合两个表位)抗体，等等。DART分子的构建在WO2006/1l3665、WO 2008/157379和WO 2010/080538中公开。因此，在本发明的另一个实施例中，抗B7-H6抗体片段被包括在DART中。

本发明还提供已经过重组工程改造以产生本发明的抗体的真核生物细胞或非真核生物细胞。真核生物细胞或非真核生物细胞可用作表达***以产生本发明的抗体。在另一个实施例中，本发明提供经工程改造以重组表达本发明的B7-H6特异性抗体的B7-H6靶向免疫细胞。例如，本发明提供经工程改造以表达本发明的抗体(例如scFv、scFv-Fc、(scFv)₂)的T细胞，该抗体连接到具有以下结构域的合成分子：间隔区或铰链区(例如CD28或IgG铰链)、跨膜区(例如跨膜经典结构域)和胞内T细胞受体(TCR)信号传导结构域，从而形成CAR。可被包括在CAR中的胞内TCR信号传导结构域包括但不限于CD3ζ、FcR-γ和Syk-PTK信号传导结构域以及CD28、4-1BB和CD134共信号传导结构域。构建表达CAR的T细胞的方法是本领域公知的。参见例如Marcu-Malina等人，(2009)，Exp.Opin.Biol.Ther.(《生物治疗专家意见》)，9:579-91。

本发明提供通过使表达B7-H6的细胞(B7-H6细胞)与本发明的抗体、抗体片段或融合蛋白(例如BiTE)接触来抑制所述细胞的方法。该抗体可以是裸(未缀合)抗体，或者是与合成分子(例如细胞毒性剂、细胞抑制剂或抗血管生成剂或放射性同位素)缀合的抗体。该方法可用来在体外或者在受试者中(即在体内)抑制B7-H6细胞。被接触的B7-H6细胞可例如在与B7-H6异常表达或水平相关的疾病的细胞培养物或动物模型中。该方法可例如用于对该抗体对特定B7-H6细胞类型的抑制活性进行测量和/或分级(相对于另一抗体)。抑制B7-H6细胞可包括阻断或降低B7-H6阳性细胞(即表达B7-H6的细胞)的活性或生长。抑制也可包括杀灭B7-H6阳性细胞。本发明的抗体、抗体片段或融合蛋白(例如BiTE)的细胞毒性可用任何常规的测定法进行评估，所述测定法包括例如乳酸脱氢酶细胞毒性测定法，如可从普洛麦格公司(PROMEGA)商购获得的CYTOTOX 96非放射性细胞毒性测定法。

本发明还提供治疗患有与B7-H6异常水平相关的疾病、被怀疑患有该疾病或者处于该疾病的风险的受试者的方法。本发明上下文中所用的术语“异常”意在包括与正常或健康细胞中的B7-H6表达相比B7-H6表达提高或降低。在这点上，其中正常细胞不表达B7-H6且患病细胞表达B7-H6，该患病细胞表现出B7-H6的异常表达。通常，治疗方法包括将治疗有效量的本发明的分离抗体、抗体片段或融合蛋白给予受试者。该抗体可为本文描述的任何抗B7-H6抗体。因此，该抗体可为嵌合抗体、人源化抗体、合成抗体、F(ab)₂、Fv、scFv、F(ab')₂、F(ab)、VL、VH、dsFv、Fv或(scFv)₂。在一些实施例中，该方法包括给予IgG、scFv、dsFv、F(ab')₂、双抗体、二价抗体、CAR、BITE或DART。在其他实施例中，所给予的抗体可与上文所述的合成分子缀合，例如细胞毒性剂、细胞抑制剂或抗血管生成剂或治疗性放射性同位素。一种示例性的细胞毒性剂是假单胞菌(Pseudomonas)外毒素A(PE38)。可治疗的疾病包括例如淋巴瘤、白细胞、黑素瘤和肉瘤。可治疗的与B7-H6升高相关的具体疾病包括髓性白血病(例如急性髓性白血病)、急性非淋巴细胞白血病、T细胞急性淋巴母细胞白血病、T细胞或B细胞淋巴瘤、***、胃肉瘤、乳腺癌、胰腺癌、黑素瘤或***癌。

本发明还提供通过过继转移将本发明抗体作为能选择性结合B7-H6的CAR或BiTE来表达的重组宿主细胞(例如本文所述的T细胞)，来治疗患有与B7-H6水平升高相关的疾病、被怀疑患有该疾病或者处于该疾病的风险的受试者的方法。可使用重组技术将编码CAR或者BiTE的遗传物质引入到来自待治疗受试者的任何合适的T细胞，例如效应型记忆T细胞。可扩增携带该遗传物质的T细胞(例如在细胞因子存在下扩增)。通常通过输注将重组T细胞转移到患者。所转移的本发明T细胞然后可对受试者体内的表达B7-H6的细胞发动免疫应答。过继转移方法可例如用于治疗患有或者被怀疑患有髓性白血病、急性非淋巴细胞白血病、T细胞急性淋巴母细胞白血病、T细胞或B细胞淋巴瘤、***、胃肉瘤(例如结肠癌)、乳腺癌、胰腺癌、黑素瘤或***癌的受试者。

在一些实施例中，前述的治疗方法还可包括针对与B7-H6升高相关的疾病共给予第二治疗剂。例如，当待治疗的疾病涉及表达B7-H6的癌症时，该方法还可包括共给予适合治疗该癌症的细胞毒性剂、细胞抑制剂或抗血管生成剂。如果该癌症是B细胞淋巴瘤，则该方法还可包括例如共给予利妥昔单抗、阿仑单抗或CHOP化学治疗方案。

本文所用的术语“治疗”、“进行治疗”、“处理”和“治疗有效”并不必定意味着100％治疗或完全治疗。相反，存在着本领域普通技术人员认为具有潜在有益效果或治疗效果的不同程度的治疗。在这点上，本发明方法可提供任何数量的任何水平的治疗。此外，本发明方法提供的治疗可包括治疗待治疗的疾病的一种或多种病症或症状。

为在治疗中使用，本发明还提供含有本文所描述的抗体和药学上可接受的载体的药物组合物。药物组合物可由本文描述的任何抗体制备。一种示例性的组合物包括具有SEQID NO:3(重链)和/或SEQ ID NO:4(轻链)的嵌合抗体。另一种示例性的组合物包括具有一个、两个、三个、四个、五个或六个选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的CDR的人源化抗体。又另一个示例性的药物组合物包括通过柔性接头与抗CD3e scFv融合的抗B7-h6 scFv(即BiTE)。再另一个示例性的药物组合物包括与CD28的铰链结构域、跨膜结构域和胞内结构域和CD3ζ的胞内结构域融合的抗B7-h6 scFv(即CAR)。

本发明的组合物可包括该抗体的载体，该载体理想地是药学上可接受的载体。药学上可接受的载体可以是任何合适的药学上可接受的载体。本文所用的术语“药学上可接受的载体”意指一种或多种适合给予到患病的人或牲畜体内的相容性固体或液体填料、稀释剂、其他赋形剂或包囊物质(例如，生理上可接受的载体或药学上可接受的载体)。术语“载体”表示一种天然或合成的有机或无机成分，活性成分与之结合以促进应用。可将药学上可接受的载体与一种或多种活性组分(例如杂合分子)共混，并且当组合物中存在超过一种药学上可接受的载体时可将它们互相共混，共混的方式要做到基本上不损害所需的药物功效。“药学上可接受的”材料通常能够给予患者，而又不产生明显的不良生理效应，如恶心、头晕、皮疹或胃部不适。例如，可取的是包含药学上可接受的载体的组合物当为了治疗目的给予人患者时没有免疫原性。

药物组合物可含有合适的缓冲剂，包括例如在盐中的乙酸、在盐中的柠檬酸、在盐中的硼酸和在盐中的磷酸。药物组合物还可任选含有合适的防腐剂，如苯扎氯铵、氯丁醇、对羟基苯甲酸酯和硫柳汞。

药物组合物可以单位剂量形式呈现，并且可通过任何合适的方法制备，许多这类方法是药物领域熟知的。这类方法包括将本发明的抗体与构成一种或多种辅助成分的载体相结合的步骤。通常，通过如下方式制备组合物：将活性剂与液体载体、微细固体载体或两者均匀地和紧密地相结合，然后如有必要的话将产品成形。

适合胃肠外给予的组合物适宜地包括本发明组合物的无菌含水制剂，其优选与接受者的血液等渗。这种含水制剂可用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂根据已知的方法配制。无菌可注射制剂还可以是在无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液剂或混悬剂，例如作为1,3-丁二醇中的溶液剂。可以采用的可接受的溶媒和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的不挥发性油类通常用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以采用任何柔和的不挥发性油类，如合成的单甘油酯或双甘油酯。此外，脂肪酸如油酸可用于注射剂的制备。适合于口服给予、皮下给予、静脉内给予、肌肉内给予等给予方式的载体制剂可在宾夕法尼亚州伊斯顿市Mack出版公司的《雷明顿药物科学》(Remington'sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,PA)中找到。

在本发明的情形中可使用的递送***包括定时释放、延迟释放和持续释放递送***，使得本发明组合物的递送在待治疗的部位敏化之前出现，并且在有足够的时间造成待治疗的部位敏化的情况下出现。本发明的组合物可与其他治疗剂或疗法联合使用。这种***可避免反复给予本发明组合物，从而给受试者和医生带来更多便利，并且对于本发明的某些组合物而言可能是特别合适的。

有许多种类型的释放递送***可供本领域普通技术人员使用并且为他们所知。合适的释放递送***包括聚合物基质***，如聚(丙交酯-乙交酯)、共聚草酸酯(copolyoxalate)、聚己内酯、聚酰胺酯、聚原酸酯、聚羟基丁酸和聚酸酐。含有药物的前述聚合物的微胶囊例如在US 5,075,109中描述。递送***还包括属于脂质的非聚合物***，所述脂质包括固醇类如胆固醇、胆固醇酯和脂肪酸或中性脂肪如单、双和三甘油酯；水凝胶释放***；硅橡胶(sylastic)***；基于肽的***；蜡涂层；使用常规粘合剂和赋形剂的压制片剂；部分融合的植入物；等等。具体例子包括但不限于：侵蚀性***，其中活性组合物以一定形式包含在基质内，如US 4,452,775、US 4,667,014、US 4,748,034和US 5,239,660中描述的那些***；和扩散性***，其中活性组分以受控速率从聚合物中渗透出来，如US 3,832,253和US 3,854,480中所描述。此外，可使用基于泵的硬件递送***，其中一些适于植入。

术语“受试者”在本文中例如与治疗和诊断方法结合时用来指人或动物受试者。动物受试者包括但不限于与B7-H6表达升高相关的病症或疾病的动物模型如哺乳动物模型，所述病症或疾病例如髓性白血病、急性非淋巴细胞白血病、T细胞急性淋巴母细胞白血病、T细胞或B细胞淋巴瘤、***、胃肉瘤(例如结肠癌)、乳腺癌、胰腺癌、黑素瘤或***癌。

在另一个实施例中，本发明提供本发明的抗体用于在试验样品中检测B7-H6(例如细胞表面B7-H6)例如相对于对照的变化量的用途。试验样品可来自细胞培养物或来自试验受试者，例如来自患有与B7-H6在受试者中异常表达相关的疾病或病症的受试者、被怀疑患有所述疾病或病症的受试者或处于所述疾病或病症的风险的受试者的血浆或组织样品。对照量适宜地对应于使用相同的抗体在来自一个或多个对照培养物或受试者的相应样品中检测到的B7-H6量。使用本发明的抗体测定B7-H6量的方法可包括任何免疫测定法如免疫印迹法(蛋白质印迹法)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)和流式细胞术，例如荧光激活细胞分选(FACS)分析。

另外，B7-H6检测可用于监测与B7-H6表达相关的疾病的进展。相对于对照显著升高或降低的B7-H6量分别指示受试者的疾病恶化或改善。

前述的筛选可用来鉴定疾病的存在或监测疾病的进展，所述疾病包括例如髓性白血病、急性非淋巴细胞白血病、T细胞急性淋巴母细胞白血病、T细胞或B细胞淋巴瘤、***、胃肉瘤(例如结肠癌)、乳腺癌、胰腺癌、黑素瘤或***癌。

本发明还提供适合于执行本发明的方法的试剂盒。通常，试剂盒包括两个或多个为执行本发明的治疗方法或检测方法而需要的组分。试剂盒组分包括但不限于本发明的一种或多种抗体、适当的试剂和/或设备。

试剂盒可包括本发明的抗体和适合于检测B7-H6(例如通过ELISA或FACS)的免疫测定缓冲液。试剂盒还可含有一个或多个微量滴定板、标准品、测定稀释剂、洗涤缓冲剂、粘性板盖和/或关于使用该试剂盒执行本发明的方法的说明书。试剂盒可包括与基底(例如多孔板或芯片)结合的本发明抗体，所述基底被合适地包装并可用于检测B7-H6。在一些实施例中，试剂盒包括与标记缀合的本发明抗体，所述标记例如为荧光标记、生物活性酶标记、发光标记或发色团标记。试剂盒还可包括用于使该缀合抗体显色的试剂，例如该酶的底物。在一些实施例中，试剂盒包括与造影剂缀合的本发明抗体，并任选包括可用于对受试者中的抗体进行显像的一种或多种试剂或一件或多件设备。

通常，试剂盒中的本发明的抗体被合适地包装，例如包装在小瓶、小袋、安瓿和/或任何适于治疗方法或检测方法的容器中。试剂盒组分可作为可在使用前进一步稀释的浓缩物(包括冻干的组合物)提供，或者它们可以以使用浓度提供。当本发明的抗体供体内使用时，可在具有所需数量和浓度的药剂的灭菌容器中提供单个剂量。

通过以下非限制性实例更详细地描述本发明。

实例1：材料和方法

抗B7H6嵌合抗原受体的构建。通过将抗B7H6杂交瘤克隆47.39的单链可变片段(scFv)与人CD28铰链-跨膜-胞质结构域(残基135-220)和CD3ζ胞质结构域(残基52-164)融合，构建抗B7H6CAR。通过将重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)与15个氨基酸的甘氨酸(G)-丝氨酸(S)接头((G₄S)₃接头；3个重复的GGGGS(SEQ ID NO:14))融合，进行抗B7H6 scFv的构建。然后将抗B7H6构建体克隆到逆转录病毒载体pFB-neo(加州帕洛阿尔托的Stratagene公司(Stratagene,Palo Alto,CA))中。通过将抗B7H6 CAR与T2A序列融合，然后与截短的人CD19(残基1-327)融合，制备抗B7H6 CAR-T2A-tCD19构建体。所有PCR均使用高保真DNA聚合物Phusion(马萨诸塞州伊普斯威奇的纽英伦生物技术公司(New England BioLabs,Ipswich,MA))来进行。

逆转录病毒转导。使用从载体转导的GP+E86细胞收集的亲嗜性病毒进行鼠原代T细胞的转导，而使用从载体转导的PT67细胞产生的双嗜性逆转录病毒感染人原代T细胞。在用伴刀豆球蛋白A(ConA,1μg/ml)刺激后18～24小时，使来自B6小鼠脾脏的原代T细胞被感染。感染后两天，将转导的原代T细胞(0.5～1×10⁶/ml)在含有G418(1mg/ml)加25U/mlrHuIL-2的RPMI-10培养基中再选择3天。使用HISTOPAQUE-1083(密苏里州圣路易斯的西格玛公司(Sigma,St.Louise,MO))分离活细胞，将细胞充分洗涤，在进行功能分析或静脉注射之前，在没有G418的情况下扩增2天。在进行转导之前，将来自细胞克隆的原代人T细胞用抗CD3 mAb OKT3(40ng/mL；eBioscience公司)加IL-2(50U/mL)激活3天。G418选择和T细胞扩增按照与培养小鼠T细胞相似的程序进行。

抗B7H6BiTE的构建。通过柔性接头将抗B7H6 scFv与抗OKT3 scFv(即，抗CD3scFv；Arakawa等人，(1996)，J.Biochem.(《生物化学杂志》)，120:657-62；US 5,929,212，全文以引用方式并入本文(图6A))融合在一起。所得的人BiTE蛋白(huBiTE)在逆转录病毒载体稳定转染的PT67包装细胞中表达。然后将所得的细胞在无血清培养基中培养。收集上清液，并使用常规的乳酸脱氢酶测定法评估抗B7H6 BiTE对肿瘤细胞的细胞毒性(图6B)。这个分析显示抗B7H6 BiTE能特异性裂解B7H6⁺肿瘤细胞。

为确定抗B7H6 BiTE是否能结合T细胞和肿瘤细胞两者并导致T细胞激活，将OKT3激活的T细胞与肿瘤细胞(RMA、RMA-B7H6和K562)在有或没有抗B7H6 BiTE的情况下共培养24小时。用ELISA分析上清液中的IFN-γ的量。这个分析表明抗B7H6 BiTE诱导了IFN-γ分泌到与表达B7H6的肿瘤细胞(即RMA-B7H6和K562)共培养的T细胞的培养基中(图7A和7B)。类似地，将小鼠抗B7H6 BiTE(MuBiTE1)加入到ConA激活的脾细胞和肿瘤细胞的共培养物，证实引起了该T细胞和肿瘤细胞共培养***中IFN-γ的强劲分泌(图7C)。此外，与huBiTE一样，muBiTE特异性激活了T细胞以杀灭B7H6+肿瘤细胞(图8A和8B)。

序列表

<110> 达特茅斯学院董事会

Sentman, Charles L.

Zhang, Tong

<120> 抗B7-H6抗体、融合蛋白及其使用方法

<130> DC0509WO

<150> US 61/643,456

<151> 2012-05-07

<150> US 61/705,227

<151> 2012-09-25

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1418

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的重链序列

<400> 1

atggaatgga cctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactcccag 60

gttcagctgc agcagtctgg agctgagctg atgaagcctg gggcctcagt gaagctttcc 120

tgcaaggcta ctggctacac attcactggc tactggatag agtggataaa gcagaggcct 180

ggacatggcc ttgagtggat tggagagatt ttacctggaa ctggtagtac taactacaat 240

gagaagttca agggcaaggc cacattcact gcagatacat cctccaacac agcctacatg 300

caactcagca gcctgacaac tgaggactct gccatctatt actgtgcaat cccggggcct 360

atggactact ggggtcaagg aacctcagtc accgtctcct cagccaaaac aacagcccca 420

tcggtctatc cactggcccc tgtgtgtgga ggtacaactg gctcctcggt gactctagga 480

tgcctggtca agggttattt ccctgagcca gtgaccttga cctggaactc tggatccctg 540

tccagtggtg tgcacacctt cccagctctc ctgcagtctg gcctctacac cctcagcagc 600

tcagtgactg taacctcgaa cacctggccc agccagacca tcacctgcaa tgtggcccac 660

ccggcaagca gcaccaaagt ggacaagaaa attgagccca gagtgcccat aacacagaac 720

ccctgtcctc cactcaaaga gtgtccccca tgcgcagctc cagacctctt gggtggacca 780

tccgtcttca tcttccctcc aaagatcaag gatgtactca tgatctccct gagccccatg 840

gtcacatgtg tggtggtgga tgtgagcgag gatgacccag acgtccagat cagctggttt 900

gtgaacaacg tggaagtaca cacagctcag acacaaaccc atagagagga ttacaacagt 960

actctccggg tggtcagtgc cctccccatc cagcaccagg actggatgag tggcaaggag 1020

ttcaaatgca aggtcaacaa cagagccctc ccatccccca tcgagaaaac catctcaaaa 1080

cccagagggc cagtaagagc tccacaggta tatgtcttgc ctccaccagc agaagagatg 1140

actaagaaag agttcagtct gacctgcatg atcacaggct tcttacctgc cgaaattgct 1200

gtggactgga ccagcaatgg gcgtacagag caaaactaca agaacaccgc aacagtcctg 1260

gactctgatg gttcttactt catgtacagc aagctcagag tacaaaagag cacttgggaa 1320

agaggaagtc ttttcgcctg ctcagtggtc cacgagggtc tgcacaatca ccttacgact 1380

aagaccatct cccggactcc gggtaaatga gcggccgc 1418

<210> 2

<211> 719

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的轻链序列

<400> 2

atggacatga ggacccctgc tcagtttctt ggaatcttgt tgctctggtt tccaggtatc 60

aaatgtgaca tcaagatgac ccagtctcca tcttccatgt atgcatctct aggagagaga 120

gtcactatca cttgcaaggc gagtcaggac attaatagct atttaagctg gttccagcag 180

aaaccaggga aatctcctaa gaccctgatc tatcgtgcaa acagattggt agatggggtc 240

ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg caagattatt ctctcaccat cagcagcctg 300

gagtatgaag atatgggaat ttattattgt ctacagtatg atgagtttcc gtacacgttc 360

ggagggggga ccaagctgga aataaaacgg gctgatgctg caccaactgt atccatcttc 420

ccaccatcca gtgagcagtt aacatctgga ggtgcctcag tcgtgtgctt cttgaacaac 480

ttctacccca aagacatcaa tgtcaagtgg aagattgatg gcagtgaacg acaaaatggc 540

gtcctgaaca gttggactga tcaggacagc aaagacagca cctacagcat gagcagcacc 600

ctcacgttga ccaaggacga gtatgaacga cataacagct atacctgtga ggccactcac 660

aagacatcaa cttcacccat tgtcaagagc ttcaacagga atgagtgtta ggcggccgc 719

<210> 3

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的重链序列

<400> 3

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Trp Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Cys

35 40 45

Asp Arg Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Thr Gly Ser Thr Asn Tyr Asn

50 55 60

Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn

65 70 75 80

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Thr Glu Asp Ser Ala Ile

85 90 95

Tyr Cys Asp Arg Tyr Cys Ala Ile Pro Gly Pro Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 4

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的轻链序列

<400> 4

Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Cys

35 40 45

Asp Arg Ile Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg

50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser

65 70 75 80

Leu Glu Tyr Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu

85 90 95

Phe Cys Asp Arg Cys Asp Arg Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys

100 105 110

Leu Glu Ile Lys

115

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的重链可变区CDR1

<400> 5

Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Trp

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的重链可变区CDR2

<400> 6

Ile Leu Pro Gly Thr Gly Ser Thr

1 5

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的重链可变区CDR3

<400> 7

Ala Ile Pro Gly Pro Met Asp Tyr

1 5

<210> 8

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的轻链可变区CDR1

<400> 8

Gln Asp Ile Asn Ser Tyr

1 5

<210> 9

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的轻链可变区CDR2

<400> 9

Arg Ala Asn

1

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的轻链可变区CDR3

<400> 10

Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 11

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的CD3ζ胞质结构域

<400> 11

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

50 55 60

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

65 70 75 80

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

85 90 95

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

100 105 110

Arg

<210> 12

<211> 86

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的CD28铰链-跨膜-胞质结构域

<400> 12

Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser

1 5 10 15

Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr

20 25 30

Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys

35 40 45

Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg

50 55 60

Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp

65 70 75 80

Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

85

<210> 13

<211> 327

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的CD19

<400> 13

Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met

1 5 10 15

Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp

20 25 30

Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln

35 40 45

Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu

50 55 60

Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ser

65 70 75 80

Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu

85 90 95

Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr

100 105 110

Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp

115 120 125

Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro

130 135 140

Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala

145 150 155 160

Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Val Pro Pro

165 170 175

Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro

180 185 190

Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser

195 200 205

Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser

210 215 220

Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp

225 230 235 240

Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala

245 250 255

Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu

260 265 270

Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly

275 280 285

Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu

290 295 300

Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg

305 310 315 320

Arg Lys Arg Lys Arg Met Thr

325

<210> 14

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的接头肽

<400> 14

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 15

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的CD3 HCVR CDR1

<400> 15

Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His

1 5 10

<210> 16

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的CD3 HCVR CDR2

<400> 16

Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 17

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的CD3 HCVR CDR3

<400> 17

Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu

1 5

<210> 18

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的CD3 LCVR CDR1

<400> 18

Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn

1 5 10

<210> 19

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的CD3 LCVR CDR2

<400> 19

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser

1 5

<210> 20

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的CD3 LCVR CDR3

<400> 20

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe

1 5

Claims

1.一种特异性结合B7同源物6(B7-H6)的分离抗体或所述抗体的抗原结合片段，包含：

(a)重链可变区，其包含

(i)SEQ ID NO:5的CDR1，

(ii)SEQ ID NO:6的CDR2，和

(iii)SEQ ID NO:7的CDR3；和

(b)轻链可变区，其包含

(i)SEQ ID NO:8的CDR1，

(ii)SEQ ID NO:9的CDR2，和

(iii)SEQ ID NO:10的CDR3。

2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO:3的重链可变结构域。

3.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO:4的轻链可变结构域。

4.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体是人源化的。

5.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体与合成分子缀合。

6.根据权利要求5所述的抗体，其中所述抗体是嵌合抗原受体，并且所述合成分子包含跨膜区和胞内T细胞受体信号传导结构域。

7.根据权利要求6所述的抗体，其中所述跨膜区和所述胞内T细胞受体信号传导结构域来自CD3ζ。

8.根据权利要求6所述的抗体，还包含共刺激蛋白受体的胞内结构域。

9.一种重组T细胞，包含根据权利要求6所述的抗体。

10.根据权利要求5所述的抗体，其中所述抗体是双特异性T细胞衔接物，并且所述合成分子包含结合T细胞抗原的抗原结合结构域。

11.根据权利要求10所述的抗体，其中所述抗原结合结构域包含特异性结合CD3的抗体片段。

12.根据权利要求11所述的抗体，其中所述特异性结合CD3的抗体片段包含：

(a)重链可变区，其包含

(i)SEQ ID NO:15的CDR1，

(ii)SEQ ID NO:16的CDR2，和

(iii)SEQ ID NO:17的CDR3；和

(b)轻链可变区，其包含

(i)SEQ ID NO:18的CDR1，

(ii)SEQ ID NO:19的CDR2，和

(iii)SEQ ID NO:20的CDR3。

13.根据权利要求5所述的抗体，其中所述合成分子是标记。

14.根据权利要求5所述的抗体，其中所述合成分子是细胞毒性剂或治疗性放射性同位素。

15.一种药物组合物，包含根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段和药学上可接受的载体。

16.一种试剂盒，包含根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段。

17.根据权利要求16所述的试剂盒，其中所述抗体或所述抗原结合片段与标记缀合。

18.一种嵌合抗原受体，包含：

(a)特异性结合B7同源物6的抗体的抗原结合片段，

(b)跨膜区，和

(c)胞内T细胞受体信号传导结构域。

19.根据权利要求18所述的嵌合抗原受体，其中所述跨膜区和所述胞内T细胞受体信号传导结构域来自CD3ζ。

20.根据权利要求18所述的嵌合抗原受体，还包含跨膜结构域或共刺激蛋白受体的胞内信号传导结构域。

21.根据权利要求18所述的嵌合抗原受体，还包含铰链区或间隔区以产生柔性或提高的细胞间间隔。

22.一种重组T细胞，包含根据权利要求18所述的嵌合抗原受体。

23.一种双特异性T细胞衔接物，包含：

(a)特异性结合B7同源物6的抗体的抗原结合片段，和

(b)结合T细胞抗原的抗原结合结构域。

24.根据权利要求21所述的双特异性T细胞衔接物，其中所述抗原结合结构域包含特异性结合CD3的抗体片段。

25.根据权利要求22所述的双特异性T细胞衔接物，其中所述特异性结合CD3的抗体片段包含：

(a)重链可变区，其包含

(i)SEQ ID NO:15的CDR1，

(ii)SEQ ID NO:16的CDR2，和

(iii)SEQ ID NO:17的CDR3；和

(b)轻链可变区，其包含

(i)SEQ ID NO:18的CDR1，

(ii)SEQ ID NO:19的CDR2，和

(iii)SEQ ID NO:20的CDR3。

26.一种杀灭受试者中的表达B7同源物6的细胞或抑制所述细胞的生长的方法，包括将有效量的根据权利要求1、6或10所述的抗体给予有需要的受试者，从而杀灭所述受试者中的表达B7同源物6的细胞或抑制所述细胞的生长。

27.一种治疗受试者中的与B7同源物6的表达相关的疾病或病症的方法，包括将有效量的根据权利要求1、6或10所述的抗体给予有需要的受试者，从而治疗所述受试者中的与B7同源物6的表达升高相关的疾病或病症。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述疾病或病症是髓性白血病、急性非淋巴细胞白血病、T细胞急性淋巴母细胞白血病、T细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、***、胃肉瘤、乳腺癌、胰腺癌、黑素瘤或***癌。

29.根据权利要求27所述的方法，还包括共给予包含第二治疗剂的药物组合物。