JP2000503684A

JP2000503684A - 野菜抽出物、その製造方法およびヒト用または動物用医薬における利用

Info

Publication number: JP2000503684A
Application number: JP10543772A
Authority: JP
Inventors: ジレサン，ユベール・ジャン・マリー・フランソワ
Original assignee: フェファ・ナムローゼ・フェンノートシャップ; ジレサン，ユベール・ジャン・マリー・フランソワ
Priority date: 1997-04-16
Filing date: 1998-04-16
Publication date: 2000-03-28
Also published as: PT912191E; ES2191296T3; NO985906L; CN1226831A; NO985906D0; CA2258501C; DK0912191T3; ATE236648T1; EP0912191A1; DE69813137T2; AU6856498A; DE69813137D1; CA2258501A1; NO318787B1; EP0912191B1; WO1998046244A1; KR20000016714A; BR9804850A

Abstract

(57)【要約】本発明は、次の工程、ａ）野菜物質をパルプになるまで圧搾し；ｂ）得たパルプを水また有機溶媒で冷処理または熱処理し；ｃ）一定の濃度を得るまで溶媒を除去し；ｄ）得た抽出物を１以上の下記方法によって選択的にさらに精製する：熱凝固法、硫酸アンモニウムでの精製、沈降、ゲルまたはイオン交換樹脂のクロマトグラフィーを含む方法によって得られる生物活性植物抽出物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】野菜抽出物、その製造方法およびヒト用または動物用医薬における利用本発明は、新規の野菜抽出物、その製造方法およびそのバイオテクノロジーおよび医療における利用、特に細胞生長または生物阻害因子としての活性に基づく利用に関する。植物はしばしば予期しない薬効あるいはその活性成分を有する。癌などの特に処置の難しい疾患の処置のために、植物は医薬の有力な供給源である。本発明において、予想外にも、植物、特に糖質、タンパク質、糖タンパク質およびテルペンを含有する野菜から生物活性がある抽出物が得られることが見出された。この目的のために、ジャガイモ、ラディッシュ、カブ、ビート、ニンジン、キクイモ、サツマイモ、セイヨウアブラナ、キュウリ、カボチャ、ズッキーニ、トマトなどの野菜を用いることができる。本発明の抽出物は次の連続相に従ってつくられる。 −選択した野菜をパルプ（どろどろ状態のもの）になるまで圧搾し； −得たパルプを水また有機溶媒で冷処理または熱処理し； −一定の濃度を得るまで溶媒を蒸発し； −得た抽出物を１以上の下記方法によって選択的にさらに精製する：熱凝固法、硫酸アンモニウムでの精製、沈降、ゲルまたはイオン交換樹脂のクロマトグラフィー。一定の活性を有する３種のフラクションを得ることができる。抽出方法については、ＢＩＯＭＥＤＩＡ社の名前のフランス特許出願ＦＲ−Ａ−２７３２３４７にすでに記載されている。この出願の内容を本明細書に合体する。本明細書によって、抽出物をさらに精製すると、分子量５,０００、７,５００、１０,０００、１２,０００、１５,０００、２０,０００、３０,０００、４０, ０００、６５,０００、８２,０００、１０５,０００、１３０,０００、１８０, ０００、２００,０００、２２０,０００、２５０,０００ダルトンを有する糖質、タンパク質、糖タンパク質、テルペンおよびペプチド型の１６種の分子が得られる。これらの分子はすべて水によく溶ける。これらの分子は、ＱハイパーＤＴＭ２０−ゲルのクロマトグラフィーによって抽出物をさらに精製することによって得られ、それによって０.０９Ｍ、０.１５Ｍ、０.２１Ｍ、０.２５Ｍ、０.３２Ｍ、０.４５Ｍ、０.５２Ｍ、０.７０Ｍ、０ .７８Ｍ、０.８５Ｍ、１.０２ＭＮａＣｌで溶出する１１種の分子が得られる。カラム溶出液において、ＱＭＡゲルの第２カラム・クロマトグラフィーによってさらに精製される低分子成分が含まれる。５種のフラクションが０.０５Ｍ、０.０８Ｍ、０.１２Ｍ、０.２０Ｍおよび０.２７ＭＮａＣｌで溶出する。この方法において得られた１６種の成分について、実施例に記載のように活性が測定された。実施例記載の毒性試験および薬理試験から、本発明の化合物は毒性がなく、顕著な性質を有することが分かる。マイトジェン活性を有する本発明の１４種の分子は各々、種々な濃度で様々な目的に用いられる。例えば、研究または診断用の培地の製造に、ヒト用または動物用医薬としての化合物あるいはワクチンの製造に、あるいは化粧品として用いられる。微生物の増殖を促進する５種の分子は、ヒトまたは動物医学、化粧品あるいは農業についての微生物または化合物を製造するために、醗酵培養の分野で有利に用いることができる。代謝に対する作用を有する３種の分子は、体重低下または増加、あるいは微生物学的診断におけるヒトまたは動物医学で、有利に投与することができる。細胞阻害活性を有する２種の分子は、その細胞静止能力によって抗腫瘍剤または抗癌剤として投与することができる。本発明を下記の非制限的実施例によってさらに説明する。実施例実施例１活性物質の単離新鮮な傷んでいないカボチャ１０００ｇを細かいピューレが得られるように砕く。得たピューレを２時間冷水５００ｇで処理する。得たペースト（Ｅ１）を遠心分離か濾過の処理をして、パルプ（Ｅ２）を採取する。得た抽出物をアルコール、カプリン酸、酢酸および硫酸アンモニウムの存在下に熱凝固法によって精製する。遠心分離によって上澄み液を再取し、特定の塩を除外するために限外濾過を行い、そして正しい濃度の濾過液を得る。得た濃縮物についてＱハイパーＤＴＭ２０−ゲルのクロマトグラフィー精製を行い、０.０９Ｍ、０.１５Ｍ、０.２１Ｍ、０.２５Ｍ、０.３２Ｍ、０.４５Ｍ、０.５２Ｍ、０.７０Ｍ、０.７８Ｍ、０.８５Ｍ、１.０２ＭＮａＣｌで溶出する１１種の分子を得る。その溶出濃度に基づく種々のフラクションについて言及する。カラムが充填されているとき、低分子量のものが存在する。これらはＱＭＡ− ゲルの第２カラムで精製され、０.０５Ｍ、０.０８Ｍ、０.１２Ｍ、０.２０Ｍおよび０.２７ＭＮａＣｌで溶出される。実施例２活性実施例１で単離された分子は、ＱハイパーＤＴＭ２０−ゲルの０.３２Ｍで、およびＱＭＡ−ゲルの０.１２Ｍで単離された分子を除きすべてのヒトおよび動物の細胞について高いマイトジェン能を発揮した。これらの２種の分子は顕著な細胞生長阻害活性を有する。実施例３毒性試験インビトロおよびインビボの試験で、本発明の活性成分は低い毒性と優れた耐容性を示した。インビトロでの細胞毒性は中性レッドおよびＭＴＴを用いて測定された。６００μg／ml量で、培養基に毒性は検出されなかった。次のインビボ試験を実施した。マイトジェン活性を示すすべての分子をマウスで試験した。この試験で毒性は存在しなかった。これらの各分子の１００g／l溶液０.５m1を２４匹の雄マウスと２４匹の雌マウスの２群に腹腔内投与したところ、７日後で何ら死亡は認められなかった。細胞生長を阻害する分子について同量で同じ試験を行った。実験の開始時において平均体重損失は３−４％見られた。これは雌および雄の両方であった。注射４から５日後に、マウスは正常体重を回復し、これは本発明の分子に毒性のないことを示している。実施例４薬理試験薬理試験の結果は本発明の活性成分の顕著な性質を示す。1. マイトジェン活性ＣＲＦＫ−およびＶＥＲＯ−細胞について試験は行われ、６ウエルおよびＨＡＭＦ１２培地を有するＮＵＮＣプレートを用いた。培地に２００,０００細胞／mlを分散せしめた。各分子は細胞培養基において、ＨＡＭＦ１２およびＨＡＭＦ１２＋１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）のみからなるコントロールと比較して０.０２５ｇ／ｌ−４ｇ／ｌの間の用量で試験した。各分子について、活性に関する最適濃度範囲を測定した。平均活性は０.０５ｇ／ｌ−０.０５ｇ／ｌであった。細胞増殖の割合は試験分子によって３−５の範囲で認められた。すなわち出発量２００,０００細胞／mlについて、６００,０００−１,０００,０００細胞／ml が形成される。増殖割合はＳＶＦ細胞で得られた値：９００,０００−１,０００ ,０００細胞／mlに匹敵する。本発明分子のマイトジェン能は、ＡＴＣＣまたはプリモ−カルチャー、動物、成熟核、ヒトまたは二倍体細胞についての１２０以上の細胞系で順次試験された。細胞系についての活性に加えて、０.０９Ｍ、０.１５Ｍ、０.７０Ｍ、０.８５Ｍおよび１.０２Ｍで溶出された分子がかなりの増殖能を同様に示す。 Lactobacillusについて行われた試験によると、コントロールに比して２４時間で３０％のバイオマスが増加する。2. 阻害活性同じ条件で実施された試験において、ＱハイパーＤＴＭ２０−カラムの０.３２Ｍで、およびＱＭＡ−カラムの０.１２Ｍで溶出された分子は、０.５ｇ／ｌ− １ｇ／ｌの用量で細胞増殖の全阻害をもたらした。これらの２種の分子は、ＮＣＪが必要とする腫瘍細胞（６２株）の完全なパネルの生長を同様に阻害した。3. インビボにおける代謝に対する作用この試験は、ＱハイパーＤＴＭ２０−カラムの０.２１Ｍおよび０.４５Ｍで、およびＱＡＭカラムの０.２０Ｍで溶出された分子について行った。２４匹の雄マウス群と２４匹の雌マウス群に、試験をする分子の１００ｇ／ｌ溶液０.５m1 を与えた。本発明の分子は雄および雌の両群においてコントロール群に比して８.２５％の平均体重増加を起こした。なお、コントロール群は１００ｇ／ｌ塩化ナトリウム０.５m1のみが注射された。

【手続補正書】【提出日】１９９９年４月９日（１９９９．４．９）【補正内容】Ｉ．明細書（１）１頁４行、「生物阻害因子」とあるを「生長阻害因子」と訂正する。（２）４頁末行、「ＮＣＪ」とあるを「ＮＣＩ」と訂正する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．次の工程、ａ）選択した野菜をパルプ（どろどろ状態のもの）になるまで圧搾し；ｂ）得たパルプを水また有機溶媒で冷処理または熱処理し；ｃ）一定の濃度を得るまで溶媒を蒸発し；ｄ）得た抽出物を１以上の下記方法によって選択的にさらに精製する：熱凝固法、硫酸アンモニウムでの精製、沈降、ゲルまたはイオン交換樹脂のクロマトグラフィーを含む方法によって得られる生物活性植物抽出物。２．ジャガイモ、ラディッシュ、カブ、ビート、ニンジン、キクイモ、サツマイモ、セイヨウアブラナ、キュウリ、カボチャ、ズッキーニ、トマトから選択される野菜より得られる、請求項１の抽出物。３．請求項１または２の抽出物をさらにＱハイパーＤＴＭ２０クロマトグラフィーカラムで精製し、カラムを溶出し、次いで溶出液の一定の濃度で溶出するフラクションを採取することにより得られる生物活性化合物。４．０.０９ＭＮａＣｌで溶出する、請求項３の生物活性化合物。５．０.１５ＭＮａＣｌで溶出する、請求項３の生物活性化合物。６．０.２１ＭＮａＣｌで溶出する、請求項３の生物活性化合物。７．０.２５ＭＮａＣｌで溶出する、請求項３の生物活性化合物。８．０.３２ＭＮａＣｌで溶出する、請求項３の生物活性化合物。９．０.４５ＭＮａＣｌで溶出する、請求項３の生物活性化合物。１０．０.５２ＭＮａＣｌで溶出する、請求項３の生物活性化合物。１１．０.７０ＭＮａＣ１で溶出する、請求項３の生物活性化合物。１２．０.７８ＭＮａＣｌで溶出する、請求項３の生物活性化合物。１３．０.８５ＭＮａＣｌで溶出する、請求項３の生物活性化合物。１４．１.０２ＭＮａＣｌで溶出する、請求項３の生物活性化合物。１５．請求項１または２の抽出物をＱハイパーＤＴＭ２０−ゲルクロマトグラフィーカラムにかけ、次いでその溶出液をさらにＱＭＡ−ゲルクロマトグラフィーカラムで精製し、溶出液の一定の濃度で溶出するフラクションを採取することにより得られる生物活性化合物。１６．０.０５ＭＮａＣｌで溶出する、請求項１５の生物活性化合物。１７．０.０８ＭＮａＣｌで溶出する、請求項１５の生物活性化合物。１８．０.１２ＭＮａＣｌで溶出する、請求項１５の生物活性化合物。１９．０.２０ＭＮａＣｌで溶出する、請求項１５の生物活性化合物。２０．０.２７ＭＮａＣｌで溶出する、請求項１５の生物活性化合物。２１．成熟核細胞についてのマイトジェンとしての使用のための請求項４−７、９−１４、１６、１７、１９および２０の生物活性化合物。２２．生物生長阻害剤としての使用のための請求項８および１８の生物活性化合物。２３．代謝促進剤としての使用のための請求項６、９および１９の生物活性化合物。２４．微生物についてのマイトジェンとしての使用のための請求項４、５、１１、１３および１４の生物活性化合物。２５．成熟核細胞についてのマイトジェンとしての使用のための請求項４−７、９−１４、１６、１７、１９および２０の１以上の生物活性化合物の組み合せ。２６．細胞生長阻害剤としての使用のための請求項８および１８の１以上の生物活性化合物の組み合せ。２７．微生物についてのマイトジェンとしての使用のための請求項４、５、１１、１３および１４の１以上の生物活性化合物の組み合せ。２８．方法がａ）選択した野菜をパルプ（どろどろ状態のもの）になるまで圧搾し；ｂ）得たパルプを水また有機溶媒で冷処理または熱処理し；ｃ）一定の濃度を得るまで溶媒を蒸発し；ｄ）得た抽出物を１以上の下記方法によって選択的にさらに精製する：熱凝固法、硫酸アンモニウムでの精製、沈降、ゲルまたはイオン交換樹脂のクロマトグラフィーを含み、細胞生長に影響を与える生物活性を有する野菜抽出物の製造方法。２９．ａ）得たパルプの処理を冷水で実施し、ｂ）得た物質を遠心分離または濾過によって濃縮し、ｃ）熱凝固法をアルコール、カプリン酸、酢酸および硫酸アンモニウムの存在下で行い、ｄ）得た抽出物を遠心分離し、ｅ）上澄液を限外濾過にかけて抽出物を得ることを特徴とする、請求項２８の方法。３０．抽出物をさらにＱハイパーＤＴＭ−２０ゲルのクロマトグラフィー分離にかけ、カラムを勾配ＮａＣｌで溶出する、請求項２８または２９の方法。３１．抽出物をさらにＱハイパーＤＴＭ−２０ゲルのクロマトグラフィー分離にかけ、次いでその溶出液をＱＭＡ−ゲルのカラムでクロマトグラフィー分離を行い、カラムを勾配ＮａＣ１で溶出する、請求項２８または２９の方法。３２．少なくとも１つの次の成分：請求項１または２の抽出物、３−２４の生物活性化合物、または請求項２５−２７の組み合せを含むヒトまたは動物への医療的使用。３３．少なくとも１つの次の成分：請求項１または２の抽出物、請求項３−２４の生物活性化合物、または請求項２５−２７の組み合せを有する培養基。