JP2000500019A - ストレプトアビジン融合タンパク質経由でのペプチドの生産方法 - Google Patents
ストレプトアビジン融合タンパク質経由でのペプチドの生産方法Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、微生物中でのDNAの発現によるペプチドの組換え生産方法であって、前記DNAがストレプトアビジンと1つの前記ペプチドから成る融合タンパク質をコードするペプチドの組換え生産方法に関する。ストレプトアビジンと該ペプチドはエンドプロテイナーゼにより開裂させることができるペプチド配列により連結されている。この方法は、不溶性の不活性タンパク質の単離、変性剤を使った不活性タンパク質の可溶化、エンドプロテイナーゼによる融合タンパク質の開裂が行える程度までの8.5〜11のpH値での変性剤の希釈、融合タンパク質の開裂、ストレプトアビジンと未開裂の融合タンパク質が沈澱するまでのpH値の低下、および上清からの所望のペプチドの精製も含んで成る。前記方法は副甲状腺ホルモンおよびウロジラチン並びにそれらの断片を生産するのに特に適当である。
Description
【発明の詳細な説明】
ストレプトアビジン融合タンパク質経由でのペプチドの生産方法
本発明は、ストレプトアビジン融合タンパク質の発現およびその後の融合タン
パク質の酵素的開裂によるペプチドの組換え生産方法に関する。
ペプチドは普通約100アミノ酸までから成る物質であると理解される。そのよ
うなペプチドは化学的に〔Kent,S.B.H.他(1988)(1)、Hodson,J.H.(1993)(2)
〕または組換えにより〔Kopetzki,E.他(1994)(3)、Winnacker,E.L.(1987)(4)
、Harris,T.J.R.(1983)(5)〕のいずれかで調製することができる。
ペプチド化学合成の欠点は、特に経済的な合成が約30〜40アミノ酸までしか可
能でないことと、合成中に望ましくない修飾(誤った配列、開裂されない保護基
)がしばしば起こることである。更なる問題は、断片のカップリング中のラセミ
化、保護基の開裂の難しさ、および最終的に複雑な精製である。
ペプチドの組換え生産には様々な方法が利用できる。例えば、直接発現を微生
物または細胞系の細胞質中で行うことができる。しかしながら、これには約80〜
100アミノ酸の最低ペプチド鎖長が要求される。それより小さいペプチドは安定
でなく、タンパク質分解により分解される。更にそれらのタンパク質は通常は付
加的なN末端メチオニンを含み、収率が非常に低い。
そのようなペプチドの生産は、選択的開裂配列を有する可溶性融合タンパク質
の発現とその後の化学的または酵素的開裂による所望のペプチドの遊離により改
善することができる〔Itakura,K.他(1977)(20);EP-B 0 001 930(21);Gram,
H.他(1994)(19);Sharma,
A.他(1992)(22)〕。しかしながら、可溶性融合タンパク質の特定の欠点は、そ
れらが細胞中でまたは分泌の最中にタンパク質分解と主に非構造ペプチド領域中
のプロセシングにより既に分解されてしまう可能性があることである。
ストレプトアビジン融合タンパク質の生産はEP-B 0 198 015、Sano,T.(1991
)(9)およびSano,T.(1992)(10)において記載されている。Sanoの場合のそのよ
うなキメラタンパク質は、ストレプトアビジン成分としてストレプトアビジンの
アミノ酸16〜133、ポリリンカーおよび標的タンパク質の配列を含んで成る。San
oにより記載された標的タンパク質はマウスメタロチオネインIタンパク質とT7
遺伝子10タンパク質である。しかしながら、それらのキメラタンパク質は、標的
タンパク質をストレプトアビジン成分から再開裂せしめることができる開裂部位
を1つも含まない。ストレプトマイセス中でのストレプトアビジン融合タンパク
質の生産はEP-B 0 198 015に記載されている。しかしながら、該融合タンパク質
からのペプチド成分の単離は非常に複雑である。例えば、開裂前と開裂後の両方
でリガンドとしてイミノビオチンを使ったアフィニティークロマトグラフィーを
実施しなければならない。
本発明の目的は、できるだけ完全であるストレプトアビジン成分からの分離に
よりストレプトアビジン融合タンパク質経由でペブチドを高収率で且つ高純度で
生産することができる方法を提供することであった。
この目的は、本発明によれば、ペプチドの組換え生産方法であって、ストレプ
トアビジンと前記ペプチドを含んで成り前記ストレプトアビジンと前記ペプチド
がエンドプロテイナーゼにより開裂され得るペプチド配列を介して連結されてい
る融合タンパク質をコードするDNAを、微生物、好ましくは原核生物中で発現
せしめ、次い
で発現された不溶性の不活性融合タンパク質を単離し、変性剤を使って前記不活
性融合タンパク質を可溶化し、エンドプロテイナーゼにより前記融合タンパク質
を開裂させることができるまで前記変性剤を8.5〜11のpH値で希釈し、前記融合
タンパク質を開裂せしめ、開裂されたストレプトアビジンと開裂されない融合タ
ンパク質が沈澱するまでpH値を下げ、そして上清から所望のペプチドを精製する
ことを含んで成る方法により達成される。
本発明の方法は、ストレプトアビジン融合タンパク質を原核生物中で非常に良
好に発現させることができ且つ不溶性不活性タンパク質(封入体)の形で単離す
ることができるという利点を利用する。変性剤中で可溶化されたストレプトアビ
ジン融合タンパク質は、8.5より上のpH値で、沈澱させることなくそれらをエン
ドプロテイナーゼで消化することができる程度にまで希釈することができる。
本発明の方法の更に重要な利点は、活性タンパク質を形成させるための融合タ
ンパク質の復元が不要であることである。最終的に遊離されたストレプトアビジ
ンと場合により開裂されなかったストレプトアビジン融合タンパク質は、6以下
のpH値での沈澱により所望のペプチドから分離することができる。本発明の方法
は多数の短鎖ペプチドの生産に適する。該方法は特に、ナトリウム利尿プチドや
副甲状腺ホルモンペプチドの生産に特に適当である。
ナトリウム利尿ペプチド(NPペプチド)は、心室、副腎および脳において前
駆体ポリペプチド(プロホルモン)から生成されるナトリウム利尿活性を有する
ペプチドであり、そして2個のシステイン残基間でのジスルフィド結合により形
成される構造要素として17アミノ酸の環を有する。前駆体ポリペプチドは、例え
ば「心房性」ナトリウム利尿ペプチド(ANP 1〜126)またはカルジオジラチ
ン(CCD 1〜126)並びにB型およびC型の「脳」ナトリウム利
尿ペプチドである。好ましいNPペプチドはヒトα心房性ナトリウム利尿ペプチ
ド(hαANP)から誘導される。この場合、アミノ酸95〜126、99〜126および
102〜126のC末端hαANP断片が特に好ましい。
ウロジラチン(CDD 95〜126)はヒト尿から単離することができるナトリウ
ム利尿ペプチドである〔Forssmann,K.他(1988)(23)〕。このペプチドは32アミ
ノ酸の鎖長であり、2個のシステイン残基間でのジスルフィド結合の形成により
17アミノ酸の環を形成し、そしてカルジオジラチン/「心房性」ナトリウム利尿
ペプチド(CDD/ANP)ファミリーの一員である。αANP(99〜126)と同
様に、それはANPプロペプチド(ANP 1〜126)から形成される。ウロジラ
チン(CCD 95〜126)はおそらくアミノ酸94と95の間でのこのペプチドの開裂
により生体内で形成されるのだろう。約3.5 kDaのウロジラチンペプチドは、N
末端の4アミノ酸延長によりαANP(99〜126)ペプチドと異なっている。ウ
ロジラチンのアミノ酸配列と構造は例えばDrummer,C.他(1993)(24)中に記載
されている。ウロジラチンは膜上のANPレセプターAおよびBに結合し、該レ
セプターに関連した細胞内グアニル酸シクラーゼを活性化する。これは第二のメ
ッセンジャーであるcGMPの形成を引き起こし、cGMPが腎臓の利尿作用お
よびナトリウム排出作用並びに血管平滑筋に対する弛緩作用を媒介する〔Heim,
J.M.(1989)(25)〕。従ってウロジラチンは、例えば心臓または肝臓移植後の患
者において、急性腎不全の予防および治療用の好ましい薬剤である〔Bub,A.他
(1992)(26);Drummer,C.他(1991)(27)および(1992)(28);Emmeluth,C.
他(1992)(29);Goetz,K.L.他(1990)(30)〕。
本発明の方法は副甲状腺ホルモン(PTH)並びにその断片を生
産するのにも有利に用いることができる。PTHのDNA配列とアミノ酸配列は
例えばRokkones,E.他(1994)(16)に記載されている。ヒト副甲状腺ホルモン遺
伝子は115アミノ酸のプレープロ−PTHタンパク質をコードする。シグナル配
列とプロセグメントの開裂後、成熟PTHホルモンは84アミノ酸(PTH1〜84
)を有する。E.コリ中およびS.セレビシェ中で組換え生産されたPTHは不
安定であり、迅速に分解されることが示された。PTH融合タンパク質の生産は
Forsberg,G.他(1991)(17)により記載されている。このために、成熟PTH(1
〜84)と15 kD IgG結合タンパク質とから成る融合タンパク質をコードする核酸
が調製される。両タンパク質成分の間にトロンビンまたはサブチリシンのための
開裂部位が挿入される。この融合タンパク質もまた不安定であり、E.コリ中で
の発現の最中にかなりの程度が既に分解されてしまう。プロテインAシグナル配
列を使ったE.コリの周縁質中への成熟PTH(1〜84)ホルモンの分泌により
PTH(1〜84)の分解を防止することもできなかった。E.コリ中でのPTH
(1〜84)の半減期はわずか数分である。
第Xa因子を使って開裂せしめることができる融合タンパク質を使ったE.コ
リ中でのPTH(1〜84)の生産はGardella,T.J.他(1990)(18)により記載され
ている。しかしながら、第Xa因子による開裂はごく不完全であり(2時間後に
約50%開裂)、または第Xa因子との長期インキュベーション後にはPTH(1
〜84)の分解も引き起こす。
融合タンパク質を使ったE.コリ中でのPTH断片(PTH1〜38)の生産も
Gram,H.他(1994)(19)により記載されている。C末端側に融合されたPTH(1
〜38)ペプチドの開裂にAsp-Pro-Proリンカーが使われる。これは2段階法によ
って開裂/除去することが
できる。第一段階の反応において、酸に不安定なAsp-Proペプチド結合が化学的
に加水分解される(60 mM HCl中で50℃にて24時間の融合タンパク質のインキュ
ベーション)。その後、残ったN末端のPro-Proジペプチドが第二段階の反応に
おいてL.ラクチス(L .lactis)からのジペプチジルペプチダーゼIVを使って
酵素的に除去される。しかしながら、この方法は非常に時間がかかり、酸加水分
解により多量の副生成物が形成される。
融合タンパク質は特異的に開裂させるプロテイナーゼ(制限プロテイナーゼ)
を使って酵素的に開裂させることができる。プロテイナーゼは、生産しようとす
るペプチドのアミノ酸配列を考慮に入れて選択される。できるなら、制限プロテ
イナーゼの認識/開裂配列が融合タンパク質の所望のペプチド中と好ましくは担
体成分(ストレプトアビジン成分)中にも存在しないように注意しなければなら
ない。すなわちそれは開裂領域(リンカー領域)中に1度だけ存在すべきである
。適当な特異的に開裂させるエンドプロテイナーゼは例えばエンテロキナーゼ、
第Xa因子、トロンビン、サブチリシンBPN変異体/ユビキチンタンパク質ペ
プチダーゼ、レニン、コラーゲナーゼ、トリプシン、キモトリプシン、エンドプ
ロテイナーゼLys-C、カリクレイン〔Carter,P.(12)〕、TEVプロテイナーゼ
〔Parks,T.D.他、Anal.Biochem.216(1994)413-417〕(36)、IgAプロテイ
ナーゼ,〔Pohlner,J.他、Nature 325(1987)458-462〕(37)、Kex2pプロテイナ
ーゼ(EP-A 0 467 839)(38)またはS.アウレウスV8プロテイナーゼである。
好ましくは、リジンのC末端側でタンパク質およびペプチドを特異的に開裂せ
しめるエンドプロテイナーゼLysCが使われる。そのような酵素は例えば真菌また
は細菌由来のものが知られている(DE 30 34 045 C2)。エンドブロテイナーゼL
ysCはウロジラチンのよ
うなリジン残基を含まないペプチドを生産するのに特に適当である。
エンドプロテイナーゼにより開裂せしめることができるペプチド配列は、本発
明の意味の中では好ましくは5〜15アミノ酸から成り且つ所望のエンドプロテイ
ナーゼのためのC末端開裂部位を含有する、短鎖ペプチド配列として理解される
。このリンカーは、好ましくは所望のエンドプロテイナーゼ認識配列のN末端側
にGly,Thr,Ser,Ala,Pro,Asp,Glu,ArgおよびLysのアミノ酸から選ばれた
数個のアミノ酸の組合せを更に含んで成る。それらの追加のアミノ酸の2〜8が
負に帯電したアミノ酸Aspおよび/またはGluであるリンカーの使用が特に好まし
い。
融合タンパク質をコードするDNAは、Sambrook,J.他(1989)(6)に記載さ
れた既知の方法により製造することができる。
ストレプトアビジン成分として例えばEP-B 0 198 015(7)およびEP-A 0 612 32
5(8)に記載されたストレプトアビジンを用いることができる。更に例えばSano,
T.他(9)により記載されたようなストレプトアビジン誘導体またはストレプトア
ビジン断片も適当である。好ましくはN末端および/またはC末端において先端
が切り取られた(短縮された)ストレプトアビジンが用いられる。これは凝集と
タンパク質分解を防止する(Sano,T.他(9))。好ましくはアミノ酸10〜20で始
まりそしてアミノ酸130〜140で終わるストレプトアビジンが使われる(Argarana
,C.E.他(1986)(33)と同様な番号付け)。アミノ酸16〜133または13〜139から
成るストレプトアビジンの使用が特に好ましい。
融合タンパク質は、微生物中、好ましくは原核生物中での融合タンパク質をコ
ードするDNA(核酸配列)の発現により生産される。使われる発現ベクターは
、タンパク質が変性された不溶性形(封入体)で生産されるように培地中へのタ
ンパク質の分泌を媒介するで
あろういずれの要素も含むべきではない。発現に適当であるDNAは、好ましく
は合成により製造することができる。そのような方法は当業者に周知であり、例
えばBeattie,K.L.およびFowler,R.F.(1991)(34);EP-B 0 424 990(35);Itak
ura,K.他(1997)(20)中に記載されている。本発明のタンパク質の核酸配列を
変更することも有利なことがある。そのような変更は例えば次のものである:
− 連結、クローニングおよび突然変異誘発を促進する様々な制限酵素認識配
列を導入するための核酸配列の変更。
− 宿主細胞にとって好ましいコドンを含めるための核酸配列の変更。
− 宿主細胞中での発現を最適にするための追加の調節および転写要素による
核酸配列の延長。
該方法の中の適当な発現ベクターの作製および発現のための全ての追加の段階
は、技術の現状であり、当業者に周知である。そのような方法は例えばSambrook
,J.他(1989)(6)に記載されている。
融合タンパク質は原核生物中だけでなく他の細胞、例えば真核宿主細胞、例え
ば酵母(例えばサッカロミセス、ピヒア、ハンゼヌラおよびクルイベロミセス)
並びに真菌、例えばアスペルギルスおよびトリコデルマ中に不溶性タンパク質凝
集物の形、いわゆる封入体(IB)の形で蓄積することができる。封入体は、細
胞中でのタンパク質の合成速度が、生来の活性タンパク質に折り畳まれる速度よ
りも大きい時に形成される。この場合、タンパク質は細胞内で好ましくは細胞質
中で凝集する。よって、タンパク質は変性され圧縮された不溶性の形態で細胞中
に貯蔵される。これは細胞機能の妨害を最小にする。
例えばエシェリキア、ストレブトマイセスまたはバシラスが原核宿主生物とし
て適当である。本発明の融合タンパク質の生産には、
微生物、好ましくは原核生物が融合タンパク質をコードするDNAを含有するベ
クターを使って常法により形質転換され、次いで常法により醗酵される。細胞の
溶解後、不溶性不活性タンパク質(IB)が常法により例えば遠心分離(ペレッ
ト分画)により単離される。必要なら、例えば界面活性剤を含む緩衝液でペレッ
トを洗浄することにより、所望の不溶性タンパク質凝集物を更に富化せしめるこ
とができる。
IBは当業者に周知の方法により変性剤、例えば塩酸グアニジン、尿素または
尿素誘導体(米国特許第5,453,363 号を参照のこと)を使って可溶化され、そし
て希釈または透析により適当な非変性緩衝液(pH>8.5)に移される。この方法
では、希釈は残存する変性剤が融合タンパク質の酵素的加水分解に対して有意な
影響を与えないような方式で行われる。
希釈は好ましくは、例えばIB可溶化物を変性剤を含まない緩衝液(pH>8.5
)に滴下添加することによりパルス様方式で行われる。
そのようなパルス様希釈は、変性剤の効果の除去と可溶化すべき分子の分離を
ほぼ同時に可能にする。これは可溶化すべき分子の望ましくない分子間相互作用
(凝集)を大部分回避する。
驚くべきことに、本発明の方法により生産された融合タンパク質は宿主細胞中
で分解されず且つペプチド成分自体(例えばPTHまたはウロジラチン)の有意
な開裂を伴わずに完全に酵素的に開裂され得ることがわかった。
本発明の方法はウロジラチン、副甲状腺ホルモンまたはその断片の生産に特に
適当である。アミノ酸95〜126、99〜126または102〜126のウロジラチン断片並び
にアミノ酸1〜37の副甲状腺ホルモン断片が特に好ましく生産される。
下記の実施例、刊行物、配列表および図面は本発明を更に説明す
るが、本発明の保護範囲は特許請求の範囲から発する。記載の方法は、変更後で
あっても本発明の内容を説明する例として理解すべきである。
図1は、実施例1に従って得られるDNAセグメントAおよびBを示す。
図2は、実施例2に従って得られるDNAセグメントCおよびDを示す。
図3は、実施例4に従って得られるDNAセグメントEおよび実施例4に従っ
て得られるDNAセグメントFを示す。実施例1 エンドプロテイナーゼリンカーを含有するコアSA−URO(95−126)の作製 (ブラスミド:pSA-EK-URO)
コアSA:アミノ酸Met-(13-139)の短縮形ストレプトアビジン
URO(95-126):アミノ酸95〜126のウロジラチンまたはカル
ジオジラチン断片〔Drummer,C.他(1993)
(24)により記載された配列〕。
エンドプロテイナーゼLysC開裂部位を含有するコアSA−URO(95-126)融
合タンパク質用の発現ベクターは、コアストレプトアビジン用の発現ベクターpS
AM-COREを基にしている。プラスミドpSAM-COREの作製と説明はWO 93/09144(11)
中に記載されている。コアSA融合タンパク質を調製するために、コアSA遺伝
子の終止コドンの前の3′末端に置いたユニークNheI制限開裂部位を使用する。
リンカー[VDDDDK](配列番号1)およびウロジラチン(95〜126)ポリペブ
チド[TAPRSLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY](配列番号2)をコードする長さ約
140 bpのDNA断片は、2本の長さ約70 bpの化学合成DNA断片から成った。
E.コリにおいて好ましく使われ
るコドン(E.コリのコドン使用頻度)を遺伝子デザインの際に考慮に入れ、そ
して各DNAセグメントの末端に適当なユニーク制限エンドヌクレアーゼ開裂部
位を提供した。
2つの反応混合物中、相補的オリゴヌクレオチド1(配列番号3)と2(配列
番号4)
をDNAセグメントA(図1)にアニールさせ、そしてオリゴヌクレオチド3(
配列番号5)と4(配列番号6)
をDNAセグメントB(図1)にアニールさせ(反応緩衝液:12.5ミリモル/l
Tris-HCl,pH 7.0および12.5ミリモル/l MgCl2;オリゴヌクレオチド濃度:各
場合1ピコモル/60μl)、次いでハイブリダイゼーション生成物AおよびBを
各々E.コリpUCBM21ベクター(Boehringer Mannheim GmbH,Mannheim,Germany
)のポリリンカー領域中にサブクローニングした(DNAセグメントA,開裂部
位:EcoRIおよびNotI;DNAセグメントB,開裂部位:NotIおよびHindIII)。
2つのサブクローン化DNAセグメントのDNA
配列をDNA塩基配列決定によって確認した。その後、コアSA−URO(95-1
26)融合遺伝子用の発現プラスミドpSA-EK-UROを、NheI/NotI DNAセグメン
トA、NotI/HindIII DNAセグメントBおよび約2.9 kbpのNheI/HindIII−pS
AM-COREベクター断片から3断片連結において組み立てた。この方法では、DN
AセグメントAおよびBは、対応するpUCBM21プラスミド誘導体から適当なエン
ドヌクレアーゼでの二重消化により単離した。制限マッピングにより所望のプラ
スミドpSA-EK-UROを同定し、そしてリンカー−ウロジラチン領域のDNA配列を
DNA塩基配列決定により再確認した。実施例2 エンテロキナーゼリンカーを含有するコアSA−PTH(1-37)融合遺伝子の作 製(プラスミド:pSA-EK-PTH)
PTH(1-37):Handy,G.N.他(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 78: 7365-7369(39)により記載されたアミノ
酸配列のアミノ酸1〜37の副甲状腺ホルモン断片。
エンテロキナーゼ開裂部位を含有するコアSA−PTH(1-37)融合遺伝子の
発現用のベクターpSA-EK-PTHは、エンテロキナーゼ開裂部位を含有するコアSA
−URO(95-126)融合遺伝子について実施例1に記載した方策に従って調製し
た。
2つの反応混合物において、相補的オリゴヌクレオチド5(配列番号7)と6
(配列番号8)
をDNAセグメントC(図2)にアニールさせ、そしてオリゴヌクレオチド7(
配列番号9)と8(配列番号10)
をDNAセグメントD(図2)にアニールさせ(反応緩衝液:12.5ミリモル/l
Tris-HCl,pH 7.0および12.5ミリモル/l MgCl2;オリゴヌクレオチド濃度:
各場合1ナノモル/60μl)、次いでハイブリダイゼーション生成物CおよびD
を各々E.コリpUCBM21ベクターのポリリンカー領域中にサブクローニングした
(DNAセグメントC,開裂部位:EcoRIおよびNcoI;DNAセグメントD,開
裂部位:NcoIおよびHindIII)。2つのサブクローン化DNAセグメントのDN
A配列をDNA塩基配列決定により確認した。その後、コアSA−EK−PTH
(1-37)融合遺伝子用の発現プラスミドpSA-EK-PTHを、NheI/NcoI DNAセグ
メントC、NcoI/HindIII DNAセグメントDおよび約2.9 kbpのNheI/HindIII
−pSAM-COREベクター断片から3断片連結において組み立てた。この方法では、
DNAセグメントCおよびDは、対応するpUCBM21プラスミド誘導体から適当な
エンドヌクレアーゼでの二重消化により単離した。制限マッピングにより所望の
プラスミドpSA-EK-PTHを同定し、そしてエンテロキナーゼリンカー−PTH領域
のDNA配列をDNA塩基配列決定により再確認した。実施例3 トロンビンリンカーを含有するコアSA−PTH(1-37)融合遺伝子の作製(プ ラスミド:pSA-THRO-PTH)
プラスミドpSA-THRO-PTHは、エンテロキナーゼリンカーコード領域をトロンビ
ンリンカーに置き換えることにより、コアSA−EK−PTH用発現プラスミド
pSA-EK-PTH(実施例2参照)から誘導される。
使用するトロンビンリンカーのアミノ酸配列[GDFLAEGLVPR](配列番号15)
は、フィブリノーゲン中の天然のトロンビン開裂部位(アミノ酸位置:6〜16)
およびトロンビンに対する最小認識配列(Carter,P.,Ladisch,M.R.;Willson
,R.C.;Painton,C.C.;Builder,S.E.編(1990)(12))に基づいている。
このために、プラスミドpSA-EK-PTHをNheIとPvuIIで消化し、長さ約2.9 kbpの
NheI/PvuII-pSA-EK-PTHベクター断片を単離し、そして2つの相補的オリゴヌク
レオチド9(配列番号11)と10(配列番号12)のハイブリダイゼーションにより
調製したDNAセグメントE(図3)に連結せしめた。
所望のプラスミド構成物pSA-THRO-PTHを制限マッピングにより同定し、そして
置換されたリンカー領域をDNA塩基配列決定により確認した。実施例4 TEVリンカーを含有するコアSA−PTH(1-37)融合遺伝子の作製(プラス ミド: pSA-TEV-PTH)
プラスミドpSA-TEV-PTHは、エンテロキナーゼリンカーのコード領域をTEV
リンカーに置き換えることにより、コアSA−EK−PTH発現プラスミドpSA-
EK-PTH(実施例2参照)から誘導される。
植物ウイルスTEV NIaプロテイナーゼ(「タバコ腐食ウイルス」)はアミノ酸
配列ENLYFQ ↓G/Sを認識し、GlnとGlyまたはSerとの間を開裂する(Dougherty,
W.G.他(1988)(13))。組換え生産された酵素はGIBCO BRL(Life Technologies
,Inc.Gaithersburg,MD,USA)から入手した。
このために、プラスミドpSA-EK-PTHをNheIとPvuIIで消化し、長さ約2.9 kbpの
NheI/PvuII−pSA-EK-PTHベクター断片を単離し、そして2つの相補的オリゴヌ
クレオチド11(配列番号13)と12(配列番号14)のハイブリダイゼーションによ
り調製したDNAセグメントF(図3)に連結せしめた。
所望のプラスミド構成物pSA-TEV-PTHを制限マッピングにより同定し、そして
置換されたリンカー領域をDNA塩基配列決定により確認した。実施例5 E.コリ中でのコアSA融合タンパク質の発現
コアSA融合タンパク質の発現のために、実施例1〜4に記載の発現プラスミ
ドpSA-EK-URO,pSA-EK-PTH,pSA-THRO-PTHおよびpSA-TEV-PTH(アンピシリン耐
性)のうちの1つとlacIqリプレッサープラスミドpUBS500(カナマイシン耐性;
調製および説明はEPA 0368342を参照のこと)を用いて、E.コリK12株RM82(ED
8654のメチオニン復帰変異体、Murray,N.E.他(1977)(14))を形質転換せし
めた。
RM82/pUBS500/pSA-EK-URO,RM82/pUBS500/pSA-EK-PTH,RM82/pUBS500/pSA-THR
O-PTHおよびRM82/pUBS500/pSA-TEV-PTH細胞を、50mg/mlアンピシリンと50mg/m
lカナマイシンを含むDYT培地〔1%(w/v)酵母エキス、1%(w/v)バクト−ト
リプトン(Difco,Detroit,USA)および0.5 %NaCl〕中で0.6〜0.9の550 nmで
の光学濃度(OD550nm)まで培養し、続いてIPTG(イソプロピル−β−D−チ
オガラクトシド)(最終濃度1〜5ミリモル/l)と共にインキュベートした。
4〜8時間の誘導期の後、遠心分離により細胞を回収し、細胞ペレットを25ミリ
モル/lのリン酸カリウム緩衝液pH 7.5で洗浄した。発現分析
各場合に1mlの遠心済培地からの細胞ペレット(RM82/pUBS500/pSA-EK-URO,R
M82/pUBS500/pSA-EK-PTH,RM82/pUBS500/pSA-THRO-PTHおよびRM82/pUBS500/pSA-
TEV-PTH細胞)を0.25mlの10ミリモル/lリン酸塩緩衝剤,pH 6.8および1ミリ
モル/l EDTA中に再懸濁し、そして超音波処理によって細胞を溶解させた。遠
心分離後、1/5容の5×SDS試料緩衝液(1×SDS試料緩衝液:50ミリモル/l Tr
is-HCl,pH 6.8,1% SDS,1%メルカプトエタノール,10%
グリセロール,0.001 %ブロモフェノールブルー)を上清に加えた。不溶性細胞
破片画分を6〜8 M尿素を含有する1×SDS試料緩衝液0.3 ml中に再懸濁し、該試
料を95℃で5分間インキュベートしそして遠心分離した。その後、SDS−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動(PAGE)〔Laemmli,U.K.(1970)(15)〕によりタンパ
ク質を分離し、クーマシーブリリアントブルーR色素で染色した。
E.コリ中で合成されたコアSA融合タンパク質は均質であり、不溶性細胞破
片画分(IB)中にもっぱら観察された。このコア−SA融合タンパク質の発現
収率はE.コリの全タンパク質に関して30〜50%であった。実施例6 細胞溶解および封入体(IB)の調製
200 g(湿重量)のE.コリRM82/pUBS500/pSA-EK-URO,RM82/pUBS500/pSA-EK-
PTH,RM82/pUBS500/pSA-THRO-PTHおよびRM82/pUBS500/pSA-TEV-PTH細胞を1lの
0.1モル/l Tris-HCl,pH 7.0中に0℃で懸濁し、300 mgのリゾチームを添加し
、そして0℃で20分間インキュベートした。その後、高圧分散によって機械的に
細胞を完全溶解させ、2mlの1モル/l MgCl2と10mgのDNアーゼ(Boehringer
Mannheim # 154709)を添加することによって25℃で30分以内でDNAを消化し
た。続いて500 mlの60ミリモル/l
細胞溶解液に添加し、0℃で更に30分間インキュベートした。その後、不溶性成
分(細胞破片とIB)を遠心分離により沈澱させた。
ペレットを1lの0.1モル/l Tris-HCl,20ミリモル/l EDTA pH 6.5中に懸
濁し、25℃で30分間インキュベートし、そして遠心分離によりIB調製物を単離
した。IBの可溶化
25 gのIBペレット(湿重量)を200 mlの10ミリモル/l Tris-HCl緩衝剤、
8モル/l尿素、10ミリモル/l EDTA pH 7.0中で25℃にて2時間攪拌すること
により懸濁した。遠心分離により不溶性成分を分離し、透明な上清を更に処理し
た。実施例7 可溶化物の希釈
ポンプ(押出量:15〜40ml/時)を使って3.8 lの50ミリモル/l Tris-HCl
pH 9.0に200 mlのコアSA融合タンパク質可溶化物を連続添加することにより、
BioFlo II醗酵槽(New Brunswick Scientific Co.,Inc.Edison,NJ,USA)中
で希釈を行った。実施例8 コアSA融合タンパク質の酵素的開裂 エンテロキナーゼ開裂
(開裂配列ValAsp4Lys)
エンテロキナーゼ開裂部位を有するコアSA融合タンパク質を、0.3〜3 mg/m
lの濃度および1:20〜1:250の基質/プロテイナーゼ比(エンテロキナーゼ;
子ウシ腸からの制限プロテイナーゼ、Boehringer Mannheim,Mannheim,Germany
)において30℃にて50ミリモル/l Tris-HCl,pH 8.0中で消化し、そして酵素
的開裂の時間推移(速度論)を分析用逆相HPLCにより分析した(実施例9.1参照
)。このために、反応混合物から6〜24時間に渡り1〜3時間間隔で試料(10〜
100 μl)を取った。LysC エンドプロテイナーゼ開裂
(開裂部位 Lys)
コアSA−EK−URO融合タンパク質を0.3〜3 mg/mlの濃度および1:100
0〜1:25,000の基質/プロテイナーゼ比〔リゾバクター・エンザイモゲネス(L ysobactor enzymogenes
)からのLysC−エンドプロテイナーゼ、配列分析用;Boe
hringer Mannheim,Mannheim,Germany〕において30〜35℃にて50ミリモル/l
Tris-
HCl,pH 8.0中で消化し、そして酵素的開裂の時間推移(速度論)を分析用逆相H
PLCにより分析した(実施例9.1参照)。このために、反応混合物から6〜24時間
に渡り1〜3時間間隔で試料(10〜100μl)を取った。トロンビン開裂
(開裂配列 GDFLAEGLVPR)
コアSA−THRO−PTH融合タンパク質を0.3〜3 mg/mlの濃度および1
:50〜1:500の基質/プロテイナーゼ比(ヒト血漿からのトロンビン;Boehrin
ger Mannheim,Mannheim,Germany)において25〜30℃にて50ミリモル/l Tris
-HCl,pH 8.8中で消化し、そして酵素的開裂の時間推移(速度論)を分析用逆相
HPLCにより分析した(実施例9.1参照)。このために、反応混合物から6〜24時
間に渡り1〜3時間間隔で試料(10〜100 μl)を取った。TEV NIa プロテイナーゼ開裂
(開裂配列GluAsnLeuTyrPheGln↓Gly/Ser)
コアSA−TEV−PTH融合タンパク質を0.3〜3 mg/mlの濃度および1:5
0〜1:500の基質/プロテイナーゼ比(組換えTEV NIa 制限プロテイナーゼ,GI
BCO BRL Life Technologies,Inc.,Gaithersburg,MD,USA)において30℃にて
50ミリモル/l Tris-HCl,pH 8.0,0.5ミリモル/l EDTAおよび1ミリモル/
l DTT中で消化し、そして酵素的開裂の時間推移(速度論)を分析用逆相HPLCに
より分析した(実施例9.1参照)。このために、反応混合物から6〜24時間に渡
り1〜3時間間隔で試料(10〜100 μl)を取った。実施例9 沈澱によるコアSAと未開裂のコアSA融合タンパク質との分離
遊離されたコアSA担体タンパク質と未開裂のコアSA融合タンパク質を、pH
を下げることにより(pH<6)開裂調製物から沈澱さ
せた。開裂混合物を25ミリモル/lの最終濃度になるように1モル/lのクエン
酸と混合し、pH 3.0に調整し、そして沈澱を遠心分離または濾過により分離した
。実施例10 ペプチドURO(95-126)およびPTH(1-37)の精製
酵素的に開裂されたペプチドを当業者に周知のクロマトグラフィー法により更
に精製することができる。10.1 Fractogel EMD-SO3 650(M)上でのカチオン交換クロマトグラフィーによる ペプチドの精製
25ミリモル/lクエン酸,pH 3.0(1 CV/h)で平衡化したMerck Company(Darm
stadt,Germany)製のFractogel EMD-SO3-650(M)カラム(3×40cm,V=283ml)上
に開裂混合物を負荷した。そして溶出液の280 nm吸光度が緩衝液のブランク値に
達するまで平衡緩衝液で洗浄した。結合した物質を平衡緩衝液中の0〜1ミリモ
ル/l NaClの勾配(10〜20 CV,1 CV/h)により溶出させた。10.2 逆相HPLCによるペプチドの精製
カチオン交換クロマトグラフィーによるペプチドの予備精製(実施例10.1参照
)の後、1〜2mlのアリコート(約100〜300 μg)を半調製用RP-HPLCにより分
画精製した。
クロマトグラフィー条件:
カラム :Eurospher 100-C8,5 μm(4×250 mm、V= 3.17
ml)(Knauer,Berlin,Germany)
試料容量 :1〜2ml(100 〜300 μgタンパク質)
検出器 :UV,220 nm
流速 :0.5 ml/分
移動相溶媒:A:0.13% TFA/H2O
B:0.1 % TFA,80%アセトニトリル,20%H2O
(v/v)実施例11 分析用逆相HPLC
分析用逆相HPLCはEuropherカラム(Europher 100-C8,5μm,4×250 mm,V
= 3.17 ml,Knauer,Berlin,Germany)を使って行った。試料容量は1〜100 μ
gタンパク質に相当する10〜100 μlであった。検出は220 nmでUV検出器を使
って行った。0.5 ml/分の流速でクロマトグラフィーを行った。
移動相溶媒:
A:0.13%トリフルオロ酢酸/水(50分間で100→0%勾配)
B:0.1 %トリフルオロ酢酸、80%アセトニトリル、20%水(v/v)(50分間で
0→100 %勾配)。実施例12 精製したペプチドの特徴づけ
精製したペプチドの素性および純度を化学合成した標準物に比較して質量分析
法(PD-MSおよびレーザー脱着分光法)、分析用逆相HPLC、等電点電気泳動〔Bar
k,J.E.他,J.Forensic Sci.Soc.16(1976)115-120(42)〕、SDS-PAGE〔Laem
mli,U.K.,Nature 227(1970)680-685(43)〕および毛管電気泳動により調べた
。
【手続補正書】特許法第184条の8第1項
【提出日】1998年2月17日(1998.2.17)
【補正内容】
請求の範囲
1.ペプチドの組換え生産方法であって、ストレプトアビジンと前記ペプチド
を含んで成り前記ストレプトアビジンと前記ペプチドが第X因子またはトロンビ
ンにより開裂させることができるペプチド配列を介して連結されている融合タン
パク質をコードするDNAを微生物中で発現させ、不溶性の不活性融合タンパク
質を単離し、前記不活性融合タンパク質を変性剤を使って可溶化し、第X因子ま
たはトロンビンにより前記融合タンパク質を開裂せしめることができるまで8.5
〜11のpH値にて前記変性剤を希釈し、前記融合タンパク質を開裂させ、開裂され
たストレプトアビジンと開裂されない融合タンパク質が沈澱するまでpH値を下げ
、そして上清から所望のペプチドを精製することを含んで成る方法。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L
U,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF
,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,
SN,TD,TG),AP(KE,LS,MW,SD,S
Z,UG),UA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD
,RU,TJ,TM),AL,AM,AT,AU,AZ
,BA,BB,BG,BR,BY,CA,CH,CN,
CU,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,GB,G
E,HU,IL,IS,JP,KE,KG,KP,KR
,KZ,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,
MD,MG,MK,MN,MW,MX,NO,NZ,P
L,PT,RO,RU,SD,SE,SG,SI,SK
,TJ,TM,TR,TT,UA,UG,US,UZ,
VN
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.ペプチドの組換え生産方法であって、ストレプトアビジンと前記ペプチド を含んで成り前記ストレプトアビジンと前記ペプチドがエンドプロテイナーゼに より開裂せしめることができるペプチド配列を介して連結されている融合タンパ ク質をコードするDNAを微生物中で発現させ、不溶性の不活性融合タンパク質 を単離し、前記不活性融合タンパク質を変性剤を使って可溶化し、エンドプロテ イナーゼにより前記融合タンパク質を開裂せしめることができるまで8.5〜11のp H値にて変性剤を希釈し、前記融合タンパク質を開裂せしめ、開裂されたストレ プトアビジンと開裂されない融合タンパク質が沈澱するまでpH値を下げ、そして 上清から所望のペプチドを精製することを含んで成る方法。 2.可溶化された不活性タンパク質が水性緩衝液中で希釈される、請求項1に 記載の方法。 3.前記ペプチドとしてウロジラチン、副甲状腺ホルモンまたはそれから誘導 された断片が使われる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。 4.前記ペプチドとしてアミノ酸99〜126もしくは102〜126のウロジラチン(9 5〜126)の断片またはアミノ酸1〜37の副甲状腺ホルモンの断片が使われる、請 求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
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