JP2000290294A - Ｔｉｍｐ修飾体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】本発明は、ＴＩＭＰの新規修飾体を提供する。 【解決手段】本発明のＴＩＭＰ修飾体は、ＴＩＭＰのＮ
Ｈ₂末端α−アミノ基を電子吸引基で修飾し、メタロプ
ロテイナーゼとの結合性を実質的に欠いていることを特
徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、メタロプロテイナ
ーゼの組織性阻害剤（ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏ
ｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ）
（以下、「ＴＩＭＰ」と言う）の新規修飾体に関する。

【０００２】

【従来の技術】転移は、悪性の癌の特徴であり、患者の
生命を最も脅かす病態であり、この転移を抑えることが
癌治療の重要な目的の一つである。しかしながら、この
転移を完全に抑える治療法はなく、外科手術、放射線治
療や化学療法を行いつつ、いわゆる対処療法的に治療を
施しているのが現状である。しかしながら、近年、転移
のメカニズムが徐々に明らかになりつつあり、癌の転移
能力の反映として、細胞外マトリックス（ｅｘｔｒａｃ
ｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）（以下、「ＥＣＭ」と
言う）の分解系が注目されている。

【０００３】より詳細には、癌細胞は原発部位で増殖を
開始し、その一部の細胞は周りの細胞との接着を断ち、
腫瘍組織より逸脱できるようになる。しかしながら、腫
瘍組織は密なＥＣＭに囲まれており、物理的な運動によ
る破壊だけでなく、それらを酵素分解しなければそこか
ら離脱することはできない。転移性癌細胞は、この障壁
となっているＥＣＭを分解する酵素を産生しながら組織
の中を移動しはじめる。さらに遠隔移動するため、癌細
胞は強固なＥＣＭで構成される血管壁を破り、血流に入
る。その後、転移先の血管壁内膜に接着し、そして血管
外へ脱出するために、再び血管壁ＥＣＭを酵素分解し、
さらに周辺ＥＣＭを分解しながら組織中に浸潤する（細
胞工学 Ｖｏｌ．１７ Ｎｏ．４ １９９８，ｐ．５２
３−５３３）。

【０００４】このような一連の過程のなかで、ＥＣＭの
分解は、癌細胞の転移を研究、診断等する上で、最も重
要であると考えられている。マトリックスメタロプロテ
イナーゼ（以下、「ＭＭＰ」と言う）（Ｄｏｃｈｅｒｔ
ｙ，Ａ．Ｊ．Ｐ．，Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｊ．，Ｃｒａ
ｂｂｅ，Ｔ．，Ａｎｇａｌ，Ｓ．および Ｍｕｒｐｈ
ｙ，Ｇ．（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌ．１０，２００−２０７）は、ＥＣＭの成分を分解
する、一群の亜鉛依存性エンドペプチダーゼである。Ｍ
ＭＰは、形態形成、血管形成、組織修復および腫瘍浸潤
などの生理学的および病理学的条件下の組織再構築にお
いて本質的な役割を果たしている（Ｄｏｃｈｅｒｔｙ，
Ａ．Ｊ．Ｐ．ら，（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌ．１０，２００−２０７ 同上； Ｍａｔ
ｒｉｓｉａｎ，Ｌ．Ｍ．（１９９２）Ｂｉｏｅｓｓａｙ
ｓ １４，４５５−４６３； Ｓｔｅｔｌｅｒ−Ｓｔｅ
ｖｅｎｓｏｎ，Ｗ．Ｇ．，Ａｚｎａｖｏｏｒｉａｎ，
Ｓ．，および Ｌｉｏｔｔａ，Ｌ．Ａ．（１９９３）Ａ
ｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９，５４１−５
７３）。大部分のＭＭＰはチモーゲンとして分泌され、
そしてセリンプロテアーゼまたは若干の活性ＭＭＰによ
って活性化される。

【０００５】ＭＭＰは現在までに、約２０種類発見され
ており、それぞれ特徴的な基質特異性を保持しており、
各種コラーゲン、糖タンパク質、プロテオグリカンなど
を分解する。ＭＭＰはその基質特異性、存在形態により
大別されている。例えば、ＭＭＰ−２および−９は、ゼ
ラチンを基質とするため、ゼラチナーゼ群として、各々
ゼラチナーゼＡ、ゼラチナーゼＢとも呼ばれている。ま
た、ＭＭＰ−１４ないし−１７は、膜結合型であり、Ｍ
Ｔ−ＭＭＰ（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｙｐｅ−ＭＭＰ）群
と呼ばれる。ＭＭＰ−１４ないし−１７は、各々ＭＴ１
−ＭＭＰ、ＭＴ２−ＭＭＰ、ＭＴ３−ＭＭＰおよびＭＴ
４−ＭＭＰとも呼ばれる。以上の他、コラゲナーゼ群
（ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−１３およびＭＭＰ
−１８）、ストロムライシン群（ＭＭＰ−３およびＭＭ
Ｐ−１０）なども存在する。

【０００６】活性化されたＭＭＰの活性は、メタロプロ
テイナーゼの組織性阻害剤（以下、「ＴＩＭＰ」とい
う）として知られる一群の内因性特異的阻害剤によって
調節される。ＴＩＭＰはこれまでに４種類同定されてお
り、ＭＴ−ＭＭＰ以外のＭＭＰはそれら４種類のＴＩＭ
Ｐにより効率よく阻害される。ＭＴ−ＭＭＰについては
選択性があり、ＴＩＭＰ−２とＴＩＭＰ−３には効率よ
く阻害される一方、ＴＩＭＰ−１によってはほとんど阻
害されない。ＴＩＭＰは基本的にＮ末端領域とＣ末端領
域の構造を有する。ＭＭＰの阻害活性はＴＩＭＰのＮ末
端領域にあり、Ｃ末端領域を有しないような組換えＴＩ
ＭＰでもＭＭＰを阻害できる。ＴＩＭＰのＭＭＰ阻害活性機構についての知見 ＴＩＭＰによるＭＭＰの阻害活性の機構については、こ
れまでの研究により仮説が考えられている。例えば、Ｔ
ＩＭＰ−２およびＴＩＭＰ−１については以下に記載す
るようにいくらか知見が得られている。

【０００７】ＭＭＰ系列の中で、ゼラチナーゼＡ（ＭＭ
Ｐ−２）およびゼラチナーゼＢ（ＭＭＰ−９）は、基底
膜の主成分であるＩＶ型コラーゲンに対するそれらの強
い活性のために、基底膜を越えた腫瘍細胞の浸潤におい
て特に重要である（Ｌｉｏｔｔａ，Ｌ．Ａ．（１９８
６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４６，１−７； Ｃｏｌｌ
ｉｅｒ，Ｉ．Ｅ．，Ｗｉｌｈｅｌｍ，Ｓ．Ｍ．，Ｅｉｓ
ｅｎ，Ａ．Ｚ．，Ｍａｒｍｅｒ，Ｂ．Ｌ．，Ｇｒａｎｔ
Ｇ．Ａ．，Ｓｅｌｔｚｅｒ，Ｊ．Ｌ．，Ｋｒｏｎｂｅ
ｒｇｅｒ，Ａ．，Ｈｅ，Ｃ．，Ｂａｕｅｒ，Ｅ．Ａ．，
および Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｇ．Ｉ．（１９８８）Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，６５７９−６５８７；
Ｗｉｌｈｅｌｍ，Ｓ．Ｍ．，Ｃｏｌｌｉｅｒ，Ｉ．
Ｅ．，Ｍａｒｍｅｒ，Ｂ．Ｌ．，Ｅｉｓｅｎ，Ａ．
Ｚ．，Ｇｒａｎｔ Ｇ．Ａ．，および Ｇｏｌｄｂｅｒ
ｇ，Ｇ．Ｉ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
６４，１７２１３−１７２２１）。ＭＭＰの他のチモー
ゲンとは異なり、プロゼラチナーゼＡは、セリンプロテ
アーゼまたは可溶性ＭＭＰによって活性化されることは
ないが、癌細胞および線維芽細胞の表面上でＭＭＰ様活
性によって活性化されると報告された（Ｏｖｅｒａｌ
ｌ，Ｃ．Ｍ．，および Ｓｏｄｅｋ，Ｊ．（１９９０）
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，２１１４１−２１１
５１； Ｂｒｏｗｎ，Ｐ．Ｄ．，Ｌｅｖｙ，Ａ．Ｔ．，
Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｉ．Ｍ．，Ｌｉｏｔｔａ，Ｌ．
Ａ．，および Ｓｔｅｔｌｅｒ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，
Ｗ．Ｇ．（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０，６
１８４−６１９１； Ｗａｒｄ，Ｒ．Ｖ．，Ａｔｋｉｎ
ｓｏｎ，Ｓ．Ｊ．，Ｓｌｏｃｏｍｂｅ，Ｐ．Ｍ．，Ｄｏ
ｃｈｅｒｔｙ，Ａ．Ｊ．，Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｊ．
Ｊ．，および Ｍｕｒｐｈｙ，Ｇ．（１９９１）Ｂｉｏ
ｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０７９，２４
２−２４６；Ａｚｚａｍ，Ｈ．Ｓ． および Ｔｈｏｍ
ｐｓｏｎ，Ｅ．Ｗ．（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓ．５２，４５４０−４５４４）。

【０００８】Ｓａｔｏ ら（Ｓａｔｏ，Ｈ．，Ｔａｋｉ
ｎｏ，Ｔ．，Ｏｋａｄａ，Ｙ．，Ｃａｏ，Ｊ．，Ｓｈｉ
ｎａｇａｗａ，Ａ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｅ．，および
Ｓｅｉｋｉ，Ｍ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３７
０，６１−６５）は、細胞表面上のプロゼラチナーゼＡ
の活性化因子としてＭＴ−ＭＭＰと称される新規の膜型
ＭＭＰを確認した。プロゼラチナーゼＡの細胞媒介活性
化には、２段階の過程が含まれ、最初に、プロゼラチナ
ーゼＡのＡｓｎ−３７とＬｅｕ−３８との間のペプチド
結合におけるＭＴ−ＭＭＰで触媒された切断が、チモー
ゲンを中間型に変換し、そして次に、Ａｓｎ−８０−Ｔ
ｙｒ−８１結合の自己触媒的切断が、その中間型を成熟
型に変換する（Ｓｔｒｏｎｇｉｎ，Ａ．Ｙ．，Ｍａｒｍ
ｅｒ，Ｂ．Ｌ．，Ｇｒａｎｔ，Ｇ．Ａ．，および Ｇｏ
ｌｄｂｅｒｇ，Ｇ．Ｉ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２６８，１４０３３−１４０３９）。いくつか
の研究は、双方の段階が細胞表面上への（プロ）ゼラチ
ナーゼＡの結合によって大きく促進されるので、細胞表
面上の（プロ）ゼラチナーゼＡの受容体がその活性化に
重要であるということを示唆している。ゼラチナーゼＡ
のカルボキシ末端のヘモペキシン様ドメインは、細胞表
面との相互作用に不可欠であると報告されている（Ｓｔ
ｒｏｎｇｉｎ，Ａ．Ｙ．，Ｍａｒｍｅｒ，Ｂ．Ｌ．，Ｇ
ｒａｎｔ，Ｇ．Ａ．，および Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｇ．
Ｉ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１
４０３３−１４０３９； Ｓｔｒｏｎｇｉｎ，Ａ．
Ｙ．，Ｃｏｌｌｉｅｒ，Ｉ．，Ｂａｎｎｉｋｏｖ，
Ｇ．，Ｍａｒｍｅｒ，Ｂ．Ｌ．，Ｇｒａｎｔ，Ｇ．
Ａ．，および Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｇ．Ｉ．（１９９
５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，５３３１−５３
３８）。

【０００９】また、最近の研究（Ｂｒｏｏｋｓ，Ｐ．
Ｃ．，Ｓｉｌｌｅｔｔｉ，Ｓ．，ｖｏｎ Ｓｃｈａｌｓ
ｃｈａ，Ｔ．Ｌ．，Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ，Ｍ．，お
よびＣｈｅｒｅｓｈ，Ｄ．Ａ．（１９９６）Ｃｅｌｌ
９２，３９１−４００； Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ，Ｔ．，
Ｓａｔｏ，Ｈ．，Ｔａｋｉｎｏ，Ｔ．，Ｉｔｏｈ，
Ｍ．，Ａｋｉｚａｗａ，Ｔ．，および Ｓｅｉｋｉ，
Ｍ．（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６，２５３
５−２５３８； Ｐｅｉ，Ｄ．Ｑ．，および Ｗｅｉｓ
ｓ，Ｓ．Ｊ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
７１，９１３５−９１４０； Ｗｉｌｌ，Ｈ．，Ａｔｋ
ｉｎｓｏｎ，Ｓ．Ｊ．，Ｂｕｔｌｅｒ，Ｇ．Ｓ．，Ｓｍ
ｉｔｈ，Ｂ．，および Ｍｕｒｐｈｙ，Ｇ．（１９９
６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１７１１９−１
７２１３； Ｌｉｃｈｔｅ，Ａ．，Ｋｏｌｋｅｎｂｒｏ
ｃｋ，Ｈ．，および Ｔｓｃｈｅｓｃｈｅ，Ｈ．（１９
９６）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３９７，２７７−２８２）
は、ＭＴ−ＭＭＰの膜貫通領域を欠いた変異体が、プロ
ゼラチナーゼＡをその中間型へと変換するが、成熟型へ
はほとんど変換しないことを示唆している。部位特異的
変異導入技術によって活性部位残基を置換した変異プロ
ゼラチナーゼＡの細胞性プロセッシングは、その変異体
の成熟型を産生しないということも報告されている（Ａ
ｔｋｉｎｓｏｎ，Ｓ．Ｊ．，Ｃｒａｂｂｅ，Ｔ．，Ｃｏ
ｗｅｌｌ，Ｓ．，Ｗａｒｄ，Ｒ．Ｖ．，Ｂｕｔｌｅｒ，
Ｍ．Ｊ．，Ｓａｔｏ，Ｈ．，Ｓｅｉｋｉ，Ｍ．，Ｒｅｙ
ｎｏｌｄｓ，Ｊ．Ｊ．，および Ｍｕｒｐｈｙ，Ｇ．
（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，３０４
７９−３０４８５； Ｓａｔｏ，Ｈ．，Ｔａｋｉｎｏ，
Ｔ．，Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ，Ｔ．，Ｉｍａｉ，Ｋ．，Ｏ
ｋａｄａ，Ｙ．，Ｓｔｅｔｌｅｒ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏ
ｎ，Ｗ．Ｇ．，および Ｓｅｉｋｉ，Ｍ．（１９９６）
ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３８５，２３８−２４０）。

【００１０】これらの研究は、中間型ゼラチナーゼＡの
成熟型への変換のために細胞に結合したゼラチナーゼＡ
の活性が重要であることを示唆している。一方、ＴＩＭ
ＰとＭＭＰとの複合体の結晶構造についても研究がなさ
れている。

【００１１】ＴＩＭＰ−１とストロムライシンとの間に
形成された複合体の結晶構造は、ＴＩＭＰ−１のＮＨ₂
末端のＣｙｓ−１の遊離α−アミノ基およびカルボニル
酸素がストロムライシンの触媒亜鉛原子を配位してお
り、したがって、阻害作用に関与していることを示唆す
る（Ｇｏｍｉｓ−Ｒｕｔｈ，Ｆ．Ｘ．，Ｍａｓｋｏｓ，
Ｋ．，Ｂｅｔｚ，Ｍ．，Ｂｅｒｇｎｅｒ，Ａ．，Ｈｕｂ
ｅｒ，Ｒ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．，Ｙｏｓｈｉｄａ，
Ｎ．，Ｎａｇａｓｅ，Ｈ．，Ｂｒｅｗ，Ｋ．，Ｂｏｕｒ
ｅｎｋｏｖ，Ｇ．Ｐ．，Ｂａｒｔｕｎｉｋ，Ｈ．，およ
び Ｂｏｄｅ，Ｗ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８
９，７７−８１）。ごく最近、ＴＩＭＰ−２とＭＴ１−
ＭＭＰの触媒ドメインとの間に形成された複合体の結晶
構造も確認された（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｃａｔａｌａ
ｎ，Ｃ．，Ｂｏｄｅ，Ｗ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｒ．，Ｔｕｒ
ｋ，Ｄ．，Ｃａｌｖｅｔｅ，Ｊ．Ｊ．，Ｌｉｃｈｔｅ，
Ａ．，Ｔｓｃｈｅｓｃｈｅ，Ｈ．，および Ｍａｓｋｏ
ｓ，Ｋ．（１９９８）ＥＭＢＯＪ．１７，５２３８−５
２４８）。しかしながら、一方、２種類のＭＭＰ−ＴＩ
ＭＰ複合体の結晶構造は、ＴＩＭＰが、対応するＭＭＰ
と広範囲に接触していることも示すというデータもあ
る。

【００１２】また、従来、ジエチルピロカーボネートを
用いるＴＩＭＰ−１の化学修飾は、阻害活性を消滅させ
ると報告されてきた。修飾される残基は、ＴＩＭＰ−１
のＨｉｓ−９５、Ｈｉｓ−１４４およびＨｉｓ−１６４
であり、Ｈｉｓ−９５の修飾は、活性の低下に関与して
いると考えられる（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｒ．Ａ．，
Ｓｍｉｔｈ，Ｂ．Ｊ．，Ａｎｇａｌ，Ｓ．，および Ｆ
ｒｅｅｄｍａｎ，Ｒ．Ｂ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｉ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１２０３，１４７−１
５４）。しかしながら、部位特異的変異導入による研究
は、Ｈｉｓ−９５のグルタミンへの置換が、ＴＩＭＰ−
１の阻害活性に影響を与えないことを示した（Ｗｉｌｌ
ｉａｍｓｏｎ，Ｒ．Ａ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｂ．Ｊ．，Ａｎ
ｇａｌ，Ｓ．，および Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｒ．Ｂ．
（１９９３）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔ
ａ．１２０３，１４７−１５４）。さらに、Ｈ９５Ｑ変
異体は、ジエチルピロカーボネート処理に対してなお感
受性である。これまでのところ、ＴＩＭＰ−１活性に対
するジエチルピロカーボネートの作用については説明さ
れていない。

【００１３】このように、ＴＩＭＰのＭＭＰの阻害活性
機構について、ＴＩＭＰがＭＭＰと複合体を形成するこ
とが知られており、そして、当該複合体の形成にはＴＩ
ＭＰのＮ末端領域が関与していると推定されていた。し
かしながら、その詳細は不明であり、またこのような機
構の解明から癌の転移を有効に抑制する方法も得られて
いなかった。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、新規なＴＩ
ＭＰ修飾体を提供することを目的とする。本発明のＴＩ
ＭＰ修飾体は、ＴＩＭＰのＮＨ₂末端α-アミノ基を電子
吸引基で修飾し、メタロプロテイナーゼとの結合性を実
質的に消失していることを特徴とする。

【００１５】本発明のＴＩＭＰ修飾体は、好ましくは、
ＴＩＭＰ−２修飾体である。本発明において、好ましく
は、前記電子吸引基はカルバミル基である。本発明は、
また、前記ＴＩＭＰ修飾体を加えることにより、ｉｎ
ｖｉｔｒｏでＴＩＭＰを含む複合体の形成を阻害する方
法を提供する。

【００１６】本発明の阻害方法において、好ましくは、
前記ＴＩＭＰ修飾体はＴＩＭＰ２修飾体であり、前記複
合体はＭＴ−ＭＭＰ、ＴＩＭＰ−２およびゼラチナーゼ
Ａを含む複合体である。

【００１７】本発明は、さらに、請求項１ないし３のい
ずれか１項に記載のＴＩＭＰ修飾体を含む、薬学的に受
容可能な担体と共に含む医薬用組成物を提供することを
目的とする。

【００１８】本発明の医薬用組成物は、好ましくは、癌
の転移抑制または血管新生抑制のために用いられる。

【００１９】

【発明を解決するための手段】本発明者らは、ＴＩＭＰ
のＭＭＰの阻害活性機構を解明し、癌の浸潤・転移およ
び血管内皮細胞の浸潤によって引き起こされる血管新生
等の諸現象を有効に抑制するために鋭意研究につとめた
結果、本発明を想到した。以下、より詳細に説明する。

【００２０】本発明者らは、ＴＩＭＰのうち、ＴＩＭＰ
−２につき以下のような仮説に基づき研究を行った。Ｔ
ＩＭＰ−２のＮＨ₂末端の反応性部位は、ＭＴ−ＭＭＰ
の活性部位に結合してプロテアーゼ−阻害剤複合体を形
成し、一方、ＴＩＭＰ−２のＣＯＯＨ末端部分は、ゼラ
チナーゼＡのヘモペキシン様ドメインに対して親和性を
有する。したがって、ＭＴ−ＭＭＰとＴＩＭＰ−２との
間に形成された複合体は、プロゼラチナーゼＡの受容体
として作用するという仮説が立てられる。この仮説は、
ＭＴ−ＭＭＰの過発現が細胞表面上でのゼラチナーゼＡ
の蓄積を引き起こすという知見によって支持されると考
えられる（Ｓａｔｏ，Ｈ．，Ｔａｋｉｎｏ，Ｔ．，Ｏｋ
ａｄａ，Ｙ．，Ｃａｏ，Ｊ．，Ｓｈｉｎａｇａｗａ，
Ａ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｅ．，および Ｓｅｉｋｉ，
Ｍ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３７０，６１−６
５）。

【００２１】ＴＩＭＰ−２は、プロゼラチナーゼＡの細
胞媒介活性化における二機能調節因子である。Ｓｔｒｏ
ｎｇｉｎら（Ｓｔｒｏｎｇｉｎ，Ａ．Ｙ．，Ｃｏｌｌｉ
ｅｒ，Ｉ．，Ｂａｎｎｉｋｏｖ，Ｇ．，Ｍａｒｍｅｒ，
Ｂ．Ｌ．，Ｇｒａｎｔ，Ｇ．Ａ．，および Ｇｏｌｄｂ
ｅｒｇ，Ｇ．Ｉ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２７０，５３３１−５３３８）は、少量のＴＩＭＰ
−２が、ＭＴ−ＭＭＰ含有細胞膜によるプロゼラチナー
ゼＡの活性を促進するが、過剰のＴＩＭＰ−２はＭＴ−
ＭＭＰ活性を強く阻害することを示した。これは、ＴＩ
ＭＰ−２のＭＴ−ＭＭＰに対する結合がプロゼラチナー
ゼＡに受容体を与える反面、ＭＴ−ＭＭＰの触媒活性は
阻害するためであると説明されうる。

【００２２】本発明者は、ヒト癌細胞系におけるゼラチ
ナーゼＡ、ＴＩＭＰ−２および３種類のＭＴ−ＭＭＰの
発現レベルを検討し、そしてプロゼラチナーゼＡの活性
化が、培地中に分泌されたＴＩＭＰ−２のレベルとのみ
強い逆の相関関係を有することを発見した。これによ
り、ＴＩＭＰ−２はプロゼラチナーゼＡの活性化の重要
な調節因子であることが示唆された（Ｓｈｏｆｕｄａ，
Ｋ．，Ｍｏｒｉｙａｍａ，Ｋ．，Ｎｉｓｈｉｈａｓｈ
ｉ，Ａ．，Ｈｉｇａｓｈｉ，Ｓ．，Ｍｉｚｕｓｈｉｍ
ａ，Ｈ．，Ｙａｓｕｍｉｔｓｕ，Ｈ．，Ｍｉｋｉ，
Ｋ．，Ｓａｔｏ，Ｈ．，Ｓｅｉｋｉ，Ｍ．，および Ｍ
ｉｙａｚａｋｉ，Ｋ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．（東京）１２４，４６２−４７０）また、前述した
ＴＩＭＰとＭＭＰとの複合体の結晶構造のデータによれ
ば、ＴＩＭＰ−１もＴＩＭＰ−２もＮＨ₂末端のＣｙｓ
−１のα−アミノ基およびカルボニル酸素が、プロテア
ーゼの触媒亜鉛と相互作用していると推定され、よっ
て、ＴＩＭＰのＮＨ₂末端のＣｙｓ−１による触媒亜鉛
原子のキレート化は、ＭＭＰ活性の阻害に共通の機序で
あると考えられる。

【００２３】上述のような仮説に基づき、本発明者はＴ
ＩＭＰ−２において、ＭＭＰとの結合に関与していると
予測されるＮＨ₂末端部位を修飾したＴＩＭＰ−２修飾
体を製造した。そして、プロゼラチナーゼＡの細胞媒介
活性化に対するＴＩＭＰ−２修飾体の作用について検討
した。その結果、シアネートイオンでＴＩＭＰ−２を処
理したところ、マトリライシンまたはゼラチナーゼＡに
対する阻害活性の低下をもたらすことを見出した。ＴＩ
ＭＰ−２修飾体の構造的および機能的分析により、阻害
活性の低下はＴＩＭＰ−２のＮＨ₂末端Ｃｙｓ−１のα
−アミノ基のカルバミル化によることが示された（実施
例）。

【００２４】従って、本発明はＴＩＭＰのＭＭＰとの結
合に関与するＮＨ₂末端を修飾し、ＭＭＰとの結合性を
実質的に消失しているＴＩＭＰ修飾体を提供する。既に
記載したように、ＴＩＭＰは既に４つの型が発見されて
おり、ＴＩＭＰ−１ないしＴＩＭＰ−４と命名されてい
る。それらのアミノ酸配列を各々配列表の配列番号１な
いし４に示す。いずれの型も前駆体として産生され、後
にシグナル配列が切断されて成熟体となる。シグナル配
列の切断は、いずれの型もアラニンとシステインの間で
起こる。即ち、ＴＩＭＰ−１では、アミノ酸残基番号で
第２３番目と第２４番目の間が、ＴＩＭＰ−２では第２
６番目と第２７番目の間が、ＴＩＭＰ−３では第２３番
目と第２４番目の間が、そして、ＴＩＭＰ−４では第２
９番目と第３０番目の間が切断される。よって、成熟体
はいずれもＮ末端がシステイン残基となる。

【００２５】ＴＩＭＰは、Ｔ９８Ｇヒトグリア芽腫細
胞、ＨＴ１０８０ヒト繊維肉腫細胞系の馴化培地等の材
料より、公知の方法（Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｋ．，Ｆｕｎ
ａｈａｓｈｉ，Ｋ．，Ｎｕｍａｔａ，Ｙ．，Ｋｏｓｈｉ
ｋａｗａ，Ｎ．，Ａｋａｏｇｉ，Ｋ．，Ｋｉｋｋａｗ
ａ，Ｙ．，Ｙａｓｕｍｉｔｓｕ，Ｈ．，および Ｕｍｅ
ｄａ，Ｍ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
８，１４３８７−１４３９３；ならびにＣｏｌｌｉｅ
ｒ，Ｉ．Ｅ．，Ｗｉｌｈｅｌｍ，Ｓ．Ｍ．，Ｅｉｓｅ
ｎ，Ａ．Ｚ．，Ｍａｒｍｅｒ，Ｂ．Ｌ．，Ｇｒａｎｔ
Ｇ．Ａ．，Ｓｅｌｔｚｅｒ，Ｊ．Ｌ．，Ｋｒｏｎｂｅｒ
ｇｅｒ，Ａ．，Ｈｅ，Ｃ．，Ｂａｕｅｒ，Ｅ．Ａ．，お
よび Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｇ．Ｉ．（１９８８）Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，６５７９−６５８７）を用
いて精製することができる。または、本明細書の配列表
に記載されているように、アミノ酸配列も公知であり、
遺伝子工学的手法により産生させることもできる。遺伝
子工学的手法によるタンパク質の産生は当業者に熟知さ
れており、当業者は本明細書に基づいて、ＴＩＭＰを得
ることが可能である。

【００２６】本発明のＴＩＭＰ修飾体は、好ましくは、
ＴＩＭＰ−２の修飾体である。しかしながら、本発明の
ＴＩＭＰ修飾体は特定の型のＴＩＭＰに限定されず、Ｔ
ＩＭＰ−１等他の修飾体も含まれる、配列表の配列番号
Ｎｏ．１ないしＮｏ．４に記載されたアミノ酸配列から
も、特にＮＨ₂末端領域の配列は相同性が高いことがわ
かる。さらに、前述したように、ＭＭＰとの結合体は、
ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２のいずれもＮＨ₂末端のＣ
ｙｓ−１のα−アミノ基およびカルボニル酸素が、プロ
テアーゼの触媒亜鉛と相互作用していると推定され、よ
って、ＴＩＭＰのＮＨ₂末端のＣｙｓ−１による触媒亜
鉛原子のキレート化は、ＭＭＰ活性の阻害に共通の機序
であると考えられる。よって、いずれのＴＩＭＰにおい
ても共通してＮＨ₂末端を修飾することにより、ＭＭＰ
との結合性を実質的に消失すると考えられる。

【００２７】本発明においては、上述したように、成熟
ＴＩＭＰの遊離ＮＨ₂末端を修飾する。修飾は、電子吸
引性の基であれば既知のものを用いることができる。例
えば、限定されるわけではないが、カルバミル基、アセ
チル基、アミジノ基、トリニトロフェニル基等である。
カルバミル基が好ましい。

【００２８】電子吸引性の基による末端ＮＨ₂の修飾
は、特に限定されず、公知の方法を用いることによって
行える。例えば、カルバミル基によって修飾する場合、
先ず、水溶液中、ＫＮＣＯを用いて、２０℃から４０
℃、好ましくは２５℃から３７℃で、１０分から５時
間、好ましくは２０分から３０分間反応させる。緩衝液
としては、トリス−ＨＣｌ、ヘペス（Ｈｅｐｅｓ）−ナ
トリウム、リン酸緩衝液等を用いることができる。ｐＨ
は、７．０−８．５の範囲内である。次いで、ヒドロキ
シアミン塩酸塩等のヒドロキシルアミンの塩を添加し反
応を停止させることにより、カルバミル基導入量を調節
することができる。反応は、１０℃から２５℃、好まし
くは２０℃から２５℃で、３０分から２時間、好ましく
は６０分から２時間行う。

【００２９】さらに、電子吸引性の基を導入された修飾
ＴＩＭＰを、アフィニティーカラム等により、非修飾Ｔ
ＩＭＰと分離することができる。アフィニティーカラム
の担体に固定する物質としては、各ＴＩＭＰのＮＨ₂末
端の反応性部位とのみと結合性を有するもの、例えば、
ＴＩＭＰ−２の場合は、マトリライシン、ストロムライ
シン等を固定化物質として使用できる。

【００３０】上述のようにして得られた本発明のＴＩＭ
Ｐ修飾体は、末端ＮＨ₂が修飾されているため、ＭＭＰ
と結合することができず、よって複合体を生成できな
い。例えば、本明細書の実施例において、１個のカルバ
ミル化されたα−アミノ基を有する修飾ＴＩＭＰ−２
は、マトリライシンとの親和性をもたなかった。理論に
しばられるわけではないが、ＴＩＭＰの末端ＮＨ₂を電
子吸引性の基で修飾することにより、アミノ基のＮα窒
素の塩基度の減少がもたらされ、これによりＮα窒素が
ＭＭＰの触媒中心である亜鉛原子に配位できないように
させ、それによってＴＩＭＰ−２の阻害活性を消滅させ
ると考えられる（図７Ａ）。

【００３１】一方、本発明のＴＩＭＰ修飾体はＣ末端側
は修飾されていない。よって、本発明ではＴＩＭＰのＣ
末端領域の関与する反応は阻害されない点をその特徴の
一つとする。例えば、ＴＩＭＰ−１とＴＩＭＰ−２は、
活性型となる前の潜在型（プロ型）ＭＭＰとも複合体を
形成することが知られており、ＴＩＭＰ−１は潜在型Ｍ
ＭＰ−９と、ＴＩＭＰ−２はプロゼラチナーゼＡ（潜在
型ＭＭＰ−２）と、Ｃ末端領域同士の親和性により結合
することが知られている（Ｂｉｒｋｅｄａｌ−Ｈａｎｓ
ｅｎ，Ｈ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｗ，Ｇ．，Ｂｏｄｄｅｎ，
Ｍ．Ｋ．ら：Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｒａｌ Ｂｉｏｌ．
Ｍｅｄ．４，１９７−２５０（１９９３）； Ｎａｇａ
ｅ，Ｈ．：Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７８，１５１−１６
０（１９９７））。即ち、ＴＩＭＰ−２は、Ｎ末端領域
でＭＴ１−ＭＭＰと結合し、一方、Ｃ末端側でプロゼラ
チナーゼＡと結合し、三分子複合体を形成すると推測さ
れている。プロゼラチナーゼＡが活性型のゼラチナーゼ
Ａになるためには、当該三分子複合体を形成することが
必要であるとするモデルが考えられている（図７Ｂ）。

【００３２】本発明のＴＩＭＰ修飾体は、末端ＮＨ₂を
修飾されており、ＭＭＰ、例えば、ＴＩＭＰ−２の場合
はＭＴ１−ＭＭＰと結合できない一方、Ｃ末端は修飾さ
れていないので、プロゼラチナーゼＡとの結合が可能で
ある（図５）。よって、プロゼラチナーゼＡとの結合に
おいて天然のＴＩＭＰ−２と競合する一方、ＭＴ１−Ｍ
ＭＰとは結合せず、ＴＩＭＰを含む複合体の形成を阻害
する。従って、このようなＴＩＭＰの複合体の形成によ
り促進される反応が、調節、抑制される。一方、ＮＨ₂
末端が結合するＭＭＰ自体の酵素活性機能には無関係で
ある。例えば、本発明のＴＩＭＰ−２修飾体は、ＭＴ１
−ＭＭＰの触媒活性を阻害することなく、プロゼラチナ
ーゼＡの活性化を阻害できる（図７Ａ）。このようにＴ
ＩＭＰ−２修飾体は、ＭＴ１−ＭＭＰのプロテアーゼ活
性自体と、ＴＩＭＰと結合して複合体を形成し、プロゼ
ラチナーゼＡの活性化を促進する機能とを区別する有用
な手段である。

【００３３】本発明は、さらに、本発明のＴＩＭＰ修飾
体を含む、薬学的に受容可能な担体と共に含む医薬用組
成物を提供する。本発明の医薬用組成物は、ＭＭＰが関
与する癌の転移および血管新生の抑制、並びにこれらに
伴う疾患を予防、治療するために有用である。具体的に
は、特に、胃癌、大腸癌、肺癌、頭頸部癌、脳腫瘍、乳
癌、甲状腺癌、前立腺癌、卵巣癌、膵癌等の癌の転移お
よびそれにおける血管新生等の予防、治療に有用であ
る。

【００３４】本発明の組成物は、薬学的に受容可能な担
体との混合物中に、ＴＩＭＰの治療上有効な量を含む。
本発明の組成物は、全身的にまたは局所的に、経口的ま
たは静脈内、皮下内、筋肉内等の非経口的に投与しう
る。

【００３５】経口的に投与される場合、錠剤、散剤、液
状等公知の所望の形態を採用しうる。製剤化には、賦形
剤、希釈剤、潤滑剤、結合剤、流動助剤、崩壊剤、界面
活性剤等、公知の所望の製剤化のための補助剤を使用し
うる。

【００３６】また、非経口的に投与可能なＴＩＭＰタン
パク質溶液の調剤は、ｐＨ、等張性、安全性等を考慮
し、当業者の技術範囲内において行いうる。本発明の組
成物の用量用法は、薬剤の作用、例えば、患者の症状の
性質および／もしくは重度、体重、性別、食餌、投与の
時間、並びに他の臨床的作用を左右する種々の因子を考
慮し、診察する医師により決定されうる。当業者は、こ
れらの要素に基づき、本発明の組成物の用量を決定する
ことができる。以下、実施例によって本発明を説明する
が、実施例は例証のためのものであり、本発明を制限す
るものではない。本発明の範囲は、請求の範囲の記載に
基づいて判断される。さらに、当業者は本明細書の記載
に基づいて、容易に修正、変更を加えることが可能であ
る。

【００３７】

【実施例】本願明細書に記載する実施例は、下記の「実
験手順」によって行った。実験手順 材料 用いられた材料の由来は次の通りであった。Ｐｅｐｔｉ
ｄｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．（大阪，日本）か
らの３１６７−ｖ（７−メトキシクマリン−４−イル）
アセチル−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−
Ａｌａ−ノルバリル−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｎε−（２，４
−ジニトロフェニル）−リシンアミド）；和光純薬株式
会社（大阪）からのシアン酸カリウム；東京化成（東
京，日本）からのｐ−アミノフェニル酢酸第二水銀（Ａ
ＰＭＡ）；Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓ（ウプサラ，スウェーデン）からのＣＮＢｒ活
性セファロース４Ｂ；Ｂｅｃｋｍａｎ（フラートン，Ｃ
Ａ）からの Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ ＯＤＳ ５Ｕ
（２．０×１５０ｍｍ）。Ｎ−トシル−Ｌ−フェニルア
ラニンクロロメチルケトンで処理されたウシ膵臓トリプ
シンは、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ（フリーホールド，Ｎ
Ｊ）から購入され；植物レクチンコンカナバリンＡ（Ｉ
Ｖ型，実質的に炭水化物不含）は Ｓｉｇｍａ（セント
・ルイス，ＭＯ）から；ゼラチンは Ｄｉｆｃｏ（デト
ロイト，ＭＩ）からであった。組換えヒトマトリライシ
ンは、オリエンタル酵母工業株式会社製（滋賀，日本）
のものを使用した。他の化学薬品は全て、分析用または
商業的に入手可能なものを使用した。タンパク質 ＴＩＭＰ−２不含およびＴＩＭＰ−２結合型のプロゼラ
チナーゼＡは、前に記載されたように（Ｍｉｙａｚａｋ
ｉ，Ｋ．，Ｆｕｎａｈａｓｈｉ，Ｋ．，Ｎｕｍａｔａ，
Ｙ．，Ｋｏｓｈｉｋａｗａ，Ｎ．，Ａｋａｏｇｉ，
Ｋ．，Ｋｉｋｋａｗａ，Ｙ．，Ｙａｓｕｍｉｔｓｕ，
Ｈ．，および Ｕｍｅｄａ，Ｍ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１４３８７−１４３９３）、
Ｔ９８Ｇヒトグリア芽細胞腫細胞系の馴化培地（以下、
「ＣＭ」と言う）から別個に精製した。ＴＩＭＰ−２
は、Ｃｏｌｌｉｅｒ ら（Ｃｏｌｌｉｅｒ，Ｉ．Ｅ．，
Ｗｉｌｈｅｌｍ，Ｓ．Ｍ．，Ｅｉｓｅｎ，Ａ．Ｚ．，Ｍ
ａｒｍｅｒ，Ｂ．Ｌ．，ＧｒａｎｔＧ．Ａ．，Ｓｅｌｔ
ｚｅｒ，Ｊ．Ｌ．，Ｋｒｏｎｂｅｒｇｅｒ，Ａ．，Ｈ
ｅ，Ｃ．，Ｂａｕｅｒ，Ｅ．Ａ．，および Ｇｏｌｄｂ
ｅｒｇ，Ｇ．Ｉ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６３，６５７９−６５８７）の方法にしたがって
ＳｙｎＣｈｒｏｐａｋ ＲＰ−４ 逆相カラム（Ｓｙｎ
Ｃｈｒｏｍ；ラフィエット，ＩＮ）を用いて、ＴＩＭＰ
−２結合プロゼラチナーゼＡから精製した。プロゼラチ
ナーゼＡに対するウサギ抗血清は、公知の方法を用いて
製造したものを使用した。ＫＮＣＯを用いるＴＩＭＰ−２の化学修飾 ５０μｌの１．０Ｍ ＫＮＣＯを、０．１Ｍ ＮａＣｌ
および０．０１％ＮａＮ₃を含有する５０ｍＭトリス−
ＨＣｌ（ｐＨ７．５）（トリス緩衝食塩水；ＴＢＳ）中
に５００ピコモルのＴＩＭＰ−２を含有した２００μｌ
のタンパク質溶液に対して加えた。その混合物を３７℃
で０分間、３０分間、６０分間、１２０分間および２４
０分間インキュベートした。インキュベーション後、反
応混合物から得られた５０μｌの各試料を２０μｌの
１．０Ｍヒドロキシルアミン塩酸塩（ｐＨ８．０）と混
合し、そして２５℃で１時間インキュベートして修飾反
応を終結させた。得られた反応混合物をＴＢＳに対して
４℃で透析した。化学修飾後のＴＩＭＰ−２の阻害活性の検定 種々の条件下でのＴＩＭＰ−２の修飾後、種々の濃度の
ＴＩＭＰ−２修飾体を、１０ｍＭ ＣａＣｌ₂および
０．０１％のＢｒｉｊ３５を含有する９０μｌのＴＢＳ
中のマトリライシン（３３ｎＭ）と一緒に３７℃で１５
分間インキュベートした。それら混合物を、１０μｌの
１ｍＭの３１６７ｖと一緒に加え、そして更に４０分間
インキュベートした。その反応物を、１００μｌの０．
１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）を加えることによって終
結させた。マトリライシンによって加水分解された３１
６７ｖの量を、３６０ｎｍでの励起および４６０ｎｍで
の発光を用いて蛍光定量法によって測定した。酵素非存
在下で加水分解された３１６７ｖの量を、加水分解され
た基質の全量から差引いた。ＴＩＭＰ−２（１５０μ
ｇ）を、５００μｌのＴＢＳ中０．２Ｍ ＫＮＣＯと一
緒に３７℃で２５分間インキュベートした。この処理
は、ＴＩＭＰ−２の阻害活性の５０％減少を引き起こし
た。部分カルバミル化後の活性および不活性ＴＩＭＰ−２の
分離 ＫＮＣＯで処理したＴＩＭＰ−２試料を、０．２Ｍヒド
ロキシルアミン塩酸塩と一緒に２５℃で１時間更にイン
キュベートした後、１０ｍＭ ＣａＣｌ₂含有ＴＢＳに
対して４℃で充分に透析した。活性ＴＩＭＰ−２と不活
性ＴＩＭＰ−２を分離するために、マトリライシン１０
０μｇを５００μｌのＣＮＢｒ活性セファロース４Ｂに
対して結合させたマトリライシン−セファロース４Ｂカ
ラムに対してその反応混合物を加え、そして不活性ＴＩ
ＭＰ−２を含有する流出（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）
画分を集めた。１０ｍＭ ＣａＣｌ₂含有ＴＢＳでカラ
ムを洗浄後、吸着した試料（活性ＴＩＭＰ−２）を、４
Ｍグアニジン塩酸塩および２０ｍＭ ＥＤＴＡを含有す
るＴＢＳで溶離した。溶離後、そのカラムを、１０ｍＭ
ＣａＣｌ₂および５０μＭ ＺｎＣｌ₂を含有するＴＢ
Ｓで、次いで１０ｍＭ ＣａＣｌ₂含有ＴＢＳで逐次的
に洗浄して、固定されたマトリライシンを再生した。流
出画分および溶離画分中のＴＩＭＰ−２試料を、リン酸
緩衝溶液に対して別々に透析した。ＴＩＭＰ−２修飾体によるゼラチナーゼＡ活性の阻害検
定 ＴＩＭＰ−２不含型のプロゼラチナーゼＡを、前に記載
されたように（Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｋ．，Ｆｕｎａｈａ
ｓｈｉ，Ｋ．，Ｎｕｍａｔａ，Ｙ．，Ｋｏｓｈｉｋａｗ
ａ，Ｎ．，Ａｋａｏｇｉ，Ｋ．，Ｋｉｋｋａｗａ，
Ｙ．，Ｙａｓｕｍｉｔｓｕ，Ｈ．，および Ｕｍｅｄ
ａ，Ｍ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
８，１４３８７−１４３９３）、１ｍＭ ＡＰＭＡと一
緒に３７℃で１時間インキュベートすることによって活
性化させた。活性型ゼラチナーゼＡ（８９ｎＭ）を、１
０ｍＭ ＣａＣｌ₂および０．０１％Ｂｒｉｊ３５を含
有する９０μｌのＴＢＳ中の種々の濃度のＴＩＭＰ−２
のＫＮＣＯ処理誘導体と一緒に３７℃で１５分間インキ
ュベートした。それら混合物を、１０μｌの１ｍＭ３１
６７ｖと一緒に加え、そして更に４０分間インキュベー
トした。１００μｌの０．１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．
５）を加えることによって反応を終結させた。加水分解
された３１６７ｖの量を上記のように測定した。マトリライシン結合画分およびマトリライシン非結合画
分中のＫＮＣＯで処理された型のＴＩＭＰ−２の還元お
よびＳ−カルボキサミドメチル化 マトリライシン結合画分およびマトリライシン非結合画
分中のＫＮＣＯで処理された型のＴＩＭＰ−２それぞれ
（１０μＭ）を、４Ｍグアニジン塩酸塩および２０ｍＭ
ＥＤＴＡを含有するＴＢＳ中１００ｍＭジチオトレイ
トールと一緒に５０℃で３０分間インキュベートした。
インキュベーション後、それら試料を氷水の容器に移
し、そして２４０ｍＭヨードアセトアミドと一緒に更に
インキュベートした。２時間後、試料をＴＢＳに対して
透析した。細胞培養物並びにＣＭおよび細胞溶解産物の調製 ＨＴ１０８０線維肉腫細胞系を、１０％ウシ胎児血清
（ＦＣＳ）を補足したダルベッコ修飾イーグル培地およ
びハムのＦ１２培地（Ｇｉｂｃｏ；グランド・アイラン
ド，ＮＹ）の１：１混合物、ＤＭＥ／Ｆ１２中で半密集
まで増殖させた。それら細胞を血清不含ＤＭＥ／Ｆ１２
で３回洗浄し、そして血清不含ＤＭＥ／Ｆ１２中の種々
の濃度のＴＩＭＰ−２またはＴＩＭＰ−２修飾体および
一定濃度のコンカナバリンＡ（１００μｇ／ｍｌ）の存
在下で培養を更に続けた。２４時間後、得られたＣＭを
集め、遠心分離によって清澄にし、そして蒸留水に対し
て４℃で透析した。次に、試料を凍結乾燥させ、そして
５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％ドデシル
硫酸ナトリウムおよび１０％グリセロールから成る少量
のドデシル硫酸ナトリウム試料採取用緩衝液中に溶解さ
せた。これら手順により、初期ＣＭを２０倍に濃縮し
た。細胞溶解産物を調製するために、細胞をリン酸緩衝
溶液で３回洗浄後、少量のドデシル硫酸ナトリウム試料
採取用緩衝液中に溶解させた。リガンドブロッティング分析 ＴＩＭＰ−２またはＴＩＭＰ−２修飾体を、非還元条件
下においてドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動に供した。電気泳動後、ゲル上のタンパ
ク質を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｍｉｎｉ Ｔｒａｎｓ−Ｂｌ
ｏｔ 装置（リッチモンド，ＣＡ）を用いてニトロセル
ロース膜上に移した。その膜を、５％脱脂乳含有ＴＢＳ
を用いて室温で１２時間遮断し、０．０５％トゥイーン
（Ｔｗｅｅｎ）２０、１０ｍＭ ＣａＣｌ₂および０．
１％ウシ血清アルブミンを含有するＴＢＳ（ＴＢＳ−ト
ゥイーン）で洗浄後、ＴＢＳ−トゥイーン中においてプ
ロゼラチナーゼＡ（５μｇ／ｍｌ）と一緒に室温でイン
キュベートした。３時間後、膜をＴＢＳ−トゥイーンで
洗浄し、そしてＴＢＳ−トゥイーンで１０００倍に希釈
された抗プロゼラチナーゼＡ抗血清と一緒に３時間イン
キュベートした。ＴＢＳ−トゥイーンで洗浄後、膜を１
０００倍希釈ビオチニル化抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｖｅｃ
ｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；バーリンゲーム，
ＣＡ）とインキュベートし、ＴＢＳ−トゥイーンで洗浄
後、アビジン−アルカリ性ホスフェート（Ｖｅｃｔｏ
ｒ）と一緒に室温で１時間インキュベートした。その膜
を充分に洗浄後、５−ブロモ−４−クロロ−３−インド
リルリン酸およびニトロブルーテトラゾリウムを含有す
る反応混合物中でインキュベートして、膜上に着色生成
物を生じさせた。ゼラチンザイモグラフィー ザイモグラフィーは、Ｍｉｙａｚａｋｉら（Ｍｉｙａｚ
ａｋｉ，Ｋ．，Ｈａｔｔｏｒｉ，Ｙ．，Ｕｍｅｎｉｓｈ
ｉ，Ｆ．，Ｙａｓｕｍｉｔｓｕ，Ｈ．，およびＵｍｅｄ
ａ，Ｍ．（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０，７
７５８−７７６４）に記載されたように、ゼラチン１ｍ
ｇ／ｍｌを含有する１０％ポリアクリルアミドゲル上で
行った。アミノ末端配列分析 試料を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７
７Ａ 気相シークエンサーで分析した。フェニルチオヒ
ダントイン誘導体を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ １２０Ａ ＰＴＨ 分析器を用いてオンライン
システムで検出した。質量分析 ＴＩＭＰ−２のトリプシンペプチド（１０ピコモル／μ
ｌ）を、等容量のα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸
溶液（α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸１０ｍｇ
を、０．１％トリフルオロ酢酸含有５０％アセトニトリ
ル１ｍｌ中に溶解させた）と一緒に混合した。試料／マ
トリックス溶液を、飛翔質量分析（ｆｌｉｇｈｔ ｍａ
ｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）のマトリックス介助
レーザー脱離イオン化時間のために試料プレート上に滴
下した後、周囲条件下で乾燥させた。質量スペクトル
は、Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ（商標）ＳＴＲ システム
（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎ
ｃ．；フレーミンハム，ＭＡ）で得られた。実施例 阻害活性に対するＴＩＭＰ−２のＫＮＣＯ処理の効果 ＴＩＭＰ−１とストロムライシンとの間に形成される複
合体の最近確認された結晶構造は、ＴＩＭＰ−１のＮＨ
₂末端のＣｙｓ−１のα−アミノ基が、ストロムライシ
ンの活性部位の触媒亜鉛原子に対して結合し、したがっ
て、ＴＩＭＰ−１の阻害作用において本質的な役割を果
たすことを示唆している（Ｇｏｍｉｓ−Ｒｕｔｈ，Ｆ．
Ｘ．，Ｍａｓｋｏｓ，Ｋ．，Ｂｅｔｚ，Ｍ．，Ｂｅｒｇ
ｎｅｒ，Ａ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｒ．，Ｓｕｚｕｋｉ，
Ｋ．，Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｎ．，Ｎａｇａｓｅ，Ｈ．，Ｂ
ｒｅｗ，Ｋ．，Ｂｏｕｒｅｎｋｏｖ，Ｇ．Ｐ．，Ｂａｒ
ｔｕｎｉｋ，Ｈ．，および Ｂｏｄｅ，Ｗ．（１９９
７）Ｎａｔｕｒｅ ３８９，７７−８１）。ＴＩＭＰ−
２のＮＨ₂末端部分の構造はＴＩＭＰ−１のそれと相同
であるので、ＴＩＭＰ−２のＣｙｓ−１のα−アミノ基
は、ＴＩＭＰ−１のそれに対応して、ＴＩＭＰ−２の阻
害作用に重要でありうる。この可能性を検討するため
に、本発明者は、種々の条件下においてＴＩＭＰ−２を
ＫＮＣＯで処理することによってＣｙｓ−１のα−アミ
ノ基をカルバミル化することを試みた。そしてＴＩＭＰ
−２修飾体を、３１６７ｖのマトリライシンに触媒され
た加水分解を阻害するそれらの能力について調べた。図
１Ａで示されるように、ＴＩＭＰ−２とＫＮＣＯとのイ
ンキュベーションは、阻害のＩＣ₅₀値の増加をもたらし
た。このＩＣ₅₀は、マトリライシンの活性の５０％阻害
を与えるＴＩＭＰ−２修飾体の濃度を示している。ＫＮ
ＣＯとのインキュベーション時間に対するＩＣ₅₀の逆の
値をプロットした場合、１／ＩＣ₅₀値は、ＫＮＣＯとの
インキュベーション時間の増加に伴って減少し、そして
１／ＩＣ₅₀値の５０％減少は、インキュベーション時間
が２５分である場合に観察された（図１Ｂ）。ＴＩＭＰ
−２の阻害活性は、ＫＮＣＯとの４時間のインキュベー
ション後に消滅した。ＴＩＭＰ−２の部分修飾後の活性および不活性画分の分
離 「実験手順」で記載されたように、ＴＩＭＰ−２を０．
２Ｍ ＫＮＣＯを用いて３７℃で２５分間処理した。こ
の修飾は、ＴＩＭＰ−２の５０％阻害活性の減少をもた
らした（図１）。次に、部分修飾されたＴＩＭＰ−２
を、マトリライシン−セファロース４Ｂカラムで分離し
た。分離後、マトリライシン結合画分およびマトリライ
シン非結合画分はほぼ同量のタンパク質を含有し（デー
タは示されていない）、分離前の修飾ＴＩＭＰ−２の約
５０％は、マトリライシンに対してほとんど親和性がな
かったことが示唆された。マトリライシン結合画分およ
び天然ＴＩＭＰ−２は、３１６７ｖのマトリライシンに
触媒された加水分解を阻害する同様の能力を示した（図
２Ａ）。対照的に、マトリライシン非結合画分は、阻害
活性がなかった。マトリライシン非結合画分は、ＡＰＭ
Ａ活性ゼラチナーゼＡに対しても不活性であった（図２
Ｂ）。これらデータは、ＴＩＭＰ−２のＫＮＣＯでの処
理が、ＴＩＭＰ−２の末端ＮＨ₂の修飾をもたらし、し
たがって、プロテアーゼ阻害複合体の形成を妨げるとい
う知見と一致する。ＴＩＭＰ−２の阻害活性の減少に関与する修飾部位の決
定 阻害活性の減少に関与する修飾部位を決定するために、
マトリライシン結合画分およびマトリライシン非結合画
分中の試料を還元し且つＳ−カルボキサミドメチル化し
た後、トリプシン消化を施し、その後、消化物を逆相Ｈ
ＰＬＣによって分離した。２種類の溶離プロフィール間
で認められる違いは、マトリライシン結合画分およびマ
トリライシン非結合画分それぞれからのＢ−２０および
Ｕ−２１のピークだけであった（図３ＡおよびＢ）。そ
れらペプチドの質量分析（図４ＡおよびＢ）は、Ｂ−２
０およびＵ−２１の分子質量がそれぞれ、２３４５．２
２および２３８８．２６であることを示した。測定され
た分子質量に基づき、Ｂ−２０は、ヒトＴＩＭＰ−２の
残基１ないし２０に該当するペプチドとされる。もう一
方で、Ｂ−２０とＵ−２１との間の分子質量の差はカル
バミル付加物の質量に相当し、Ｕ−２１は、１個のカル
バミル化アミノ基を有するＴＩＭＰ−２の残基１ないし
２０に該当するペプチドであることが示唆される。

【００３８】更に、Ｂ−２０についてのＮＨ₂末端配列
分析においてＴＩＭＰ−２の残基１ないし１９に該当す
る配列が決定されたが、第１番目、第３番目および第１
３番目の残基は、Ｓ−カルボキサミドメチルシステイン
のフェニルチオヒダントイン誘導体として検出された。
一方、Ｕ−２１のＮＨ₂末端配列分析において、アミノ
酸のフェニルチオヒダントイン誘導体は検出されなかっ
た。これらの結果は、Ｂ−２０およびＵ−２１が、残基
１ないし２０に該当するＴＩＭＰ−２のＮＨ₂末端部分
から誘導されたペプチドであること、およびＵ−２１の
Ｃｙｓ−１のα−アミノ基はカルバミル化されているこ
とを示している。これらの結果は、ＴＩＭＰ−２のＮＨ
₂末端のＣｙｓ−１のα−アミノ基のカルバミル化が、
ＴＩＭＰ−２の失活をもたらすということも示唆してい
る。プロゼラチナーゼＡ結合能力に対するＴＩＭＰ−２のＫ
ＮＣＯ処理の効果 ＭＭＰ阻害活性に加えて、ＴＩＭＰ−２は、プロゼラチ
ナーゼＡのヘモペキシン様ドメインと相互作用する能力
も有する。ＴＩＭＰ−２のカルバミル化がプロゼラチナ
ーゼＡ結合能力に影響を与えるかどうか調べるために、
ＫＮＣＯで処理されたＴＩＭＰ−２のマトリライシン結
合画分およびマトリライシン非結合画分並びに天然ＴＩ
ＭＰ−２のプロゼラチナーゼＡ結合能力について、「実
験手順」で記載のリガンドブロッティング分析を用いて
試験した。図５で示されるように、天然ＴＩＭＰ−２並
びにマトリライシン非結合画分中のＫＮＣＯ処理された
ＴＩＭＰ−２およびマトリライシン結合画分中のそれ
は、プロゼラチナーゼＡと結合する同様の能力を有し、
ＴＩＭＰ−２のカルバミル化が、プロゼラチナーゼＡと
の相互作用にほとんど影響しないことが示唆された。プロゼラチナーゼＡの細胞媒介活性化に対するＴＩＭＰ
−２修飾体および天然ＴＩＭＰ−２の効果 ＭＴ−ＭＭＰとＴＩＭＰ−２との間に形成された複合体
は、プロゼラチナーゼＡの受容体として作用し、そして
その三分子複合体の形成は、プロゼラチナーゼＡの細胞
媒介活性化に不可欠であるという仮説が立てられた（Ｓ
ｔｒｏｎｇｉｎ，Ａ．Ｙ．，Ｍａｒｍｅｒ，Ｂ．Ｌ．，
Ｇｒａｎｔ，Ｇ．Ａ．，および Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，
Ｇ．Ｉ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
８，１４０３３−１４０３９； Ｓｔｒｏｎｇｉｎ，
Ａ．Ｙ．，Ｃｏｌｌｉｅｒ，Ｉ．，Ｂａｎｎｉｋｏｖ，
Ｇ．，Ｍａｒｍｅｒ，Ｂ．Ｌ．，Ｇｒａｎｔ，Ｇ．
Ａ．，およびＧｏｌｄｂｅｒｇ，Ｇ．Ｉ．（１９９５）
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，５３３１−５３３
８； Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ，Ｔ．，Ｓａｔｏ，Ｈ．，Ｏ
ｋａｄａ，Ａ．，Ｏｈｕｃｈｉ，Ｅ．，Ｉｍａｉ，
Ｋ．，Ｏｋａｄａ，Ｙ．，およびＳｅｉｋｉ，Ｍ．（１
９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，１６０９８
−１６１０３）。カルバミル化されたＴＩＭＰ−２のマ
トリライシン非結合画分は、ＭＭＰの活性部位と相互作
用する反応性部位を失っているが、プロゼラチナーゼＡ
結合部位を保持しているので、ＴＩＭＰ−２修飾体は、
プロゼラチナーゼＡの限られた数のＴＩＭＰ−２結合部
位に関して競合することによってその三分子複合体の形
成を妨げることができると考えられる。この可能性を検
討するために、種々の濃度の修飾型および非修飾型のＴ
ＩＭＰ−２並びに天然ＴＩＭＰ−２を、コンカナバリン
Ａで刺激されたＨＴ１０８０細胞のＣＭに対して加え、
そして細胞溶解産物中の様々な種類の内因性ゼラチナー
ゼＡおよびＣＭ中のそれらを、ゼラチンザイモグラフィ
ーによって分析した。図６Ａで示されるように、細胞に
結合した成熟型のゼラチナーゼＡは、マトリライシン非
結合画分中の不活性のＴＩＭＰ−２修飾体の濃度の増加
に伴って徐々に減少した。細胞溶解産物中のプロゼラチ
ナーゼＡおよびプロゼラチナーゼＢは、ＴＩＭＰ−２修
飾体によって影響されなかった。これら検出されたチモ
ーゲンは、細胞から分泌される前のタンパク質でありう
る。ＣＭ中では、ゼラチナーゼＡの中間型はＴＩＭＰ−
２修飾体の存在下、顕著に減少しなかったものの、成熟
型はＴＩＭＰ−２修飾体の濃度が３６ｎＭまたはそれ以
上まで増加するに伴いほとんど消滅した。一方、プロゼ
ラチナーゼＡの量はＴＩＭＰ−２の濃度の増加に伴って
増加した（図６Ｂ）。これは、内因性プロゼラチナーゼ
Ａの中間型への変換は部分的に阻害されたが、中間型の
成熟型への変換は、高濃度のＴＩＭＰ−２修飾体の存在
下において強く阻害されたことを示唆した。ＣＭ中の成
熟型ゼラチナーゼＡの消失は、細胞結合成熟型の減少と
平行していた。したがって、中間型の成熟型への変換
は、細胞に結合した活性ゼラチナーゼＡに依存しうる。
もう一方において、マトリライシン結合画分中の活性Ｔ
ＩＭＰ−２を濃度を変化させながらＨＴ１０８０細胞の
培養物中に加えた場合、細胞結合成熟型のゼラチナーゼ
Ａは、４．５ｎＭの活性ＴＩＭＰ−２で僅かに増加した
後、更に高濃度では急激に減少した（図６Ａ）。ＣＭ中
のゼラチナーゼＡの成熟型および中間型両方が消失した
が、プロゼラチナーゼＡは、活性ＴＩＭＰ−２の濃度の
増加に伴って増加した。よって、プロゼラチナーゼＡの
ＭＴ−ＭＭＰによるプロセシングは、活性ＴＩＭＰ−２
の存在下で阻害されたことが示唆された。ＣＭ中のゼラ
チナーゼＡの成熟型および中間型の消失は、細胞結合成
熟型の減少とも平行していた。活性ＴＩＭＰ−２による
プロゼラチナーゼＡのプロセッシングの阻害は、細胞結
合プロゼラチナーゼＡの量の増加を伴わなかったので、
細胞結合チモーゲンは、高濃度のＴＩＭＰ−２存在下、
細胞表面から遊離すると考えられる。

【００３９】細胞結合ゼラチナーゼＡに対する作用およ
びプロゼラチナーゼＡの細胞媒介活性化に対するマトリ
ライシン結合画分中の活性ＴＩＭＰ−２の作用は、天然
ＴＩＭＰ−２の作用とほぼ同様であった（データは示さ
れていない）。以上の実施例において、ＴＩＭＰ−２修
飾体を、コンカナバリンＡで刺激されたＨＴ１０８０細
胞の培地に対して加えた場合、内因性プロゼラチナーゼ
Ａの中間型への変換は部分的に阻害され、その中間型の
成熟型への変換は強く阻害された。本発明のＴＩＭＰ−
２修飾体は、細胞表面上での活性型ゼラチナーゼＡの蓄
積をも妨げた。理論に縛られるわけではないが、本発明
者は、ＴＩＭＰ−２修飾体によるゼラチナーゼＡのヘモ
ペキシン様ドメインの占有が、ゼラチナーゼＡを細胞表
面上に保持できないようにさせ、それによってゼラチナ
ーゼＡの中間型からその成熟型への自己触媒的変換を妨
げると推測している。

【００４０】本発明者は、ゼラチナーゼＡの中間型の成
熟型への変換がゼラチナーゼＡの細胞に結合した活性に
依存しているので、ＴＩＭＰ−２修飾体による細胞に結
合した活性型ゼラチナーゼＡの喪失は、成熟型の生産の
阻害を引き起こすということも考えている。実際、高濃
度のＴＩＭＰ−２修飾体の存在下において、ＣＭ中の成
熟型ゼラチナーゼＡの消失は、細胞に結合した活性ゼラ
チナーゼＡの減少と平行していた（図６）。

【００４１】ＭＴ−ＭＭＰ、ＴＩＭＰ−２および（プ
ロ）ゼラチナーゼＡから成る三分子複合体の形成の重要
性を考えると、ＴＩＭＰ−２によるプロゼラチナーゼＡ
の細胞媒介活性化の阻害は、二つの別の方法で説明でき
ると考えられる。一つの解釈は、過剰のＴＩＭＰ−２
が、ＭＴ−ＭＭＰの活性部位および（プロ）ゼラチナー
ゼＡのヘモペキシン様ドメイン中のＴＩＭＰ−２結合部
位両方を占有し、それによって三分子複合体の形成を妨
げるということである（図７Ｂ）。もう一つの解釈は、
ＴＩＭＰ−２がＭＴ−ＭＭＰの触媒活性を阻害し、それ
によってプロゼラチナーゼＡのタンパク質分解過程を阻
害するということである。

【００４２】本発明者は、天然ＴＩＭＰ−２もＴＩＭＰ
−２修飾体も、細胞結合プロゼラチナーゼＡを増加させ
ることなく、細胞表面上での活性ゼラチナーゼＡの蓄積
を防止しうることを発見した。これらデータは、三分子
複合体の形成の防止が、ＴＩＭＰ−２によるプロゼラチ
ナーゼＡの細胞媒介活性化の阻害の原因となることを示
唆している。

【００４３】過剰天然ＴＩＭＰ−２は、ゼラチナーゼＡ
の中間型の生産を阻害したが、ＴＩＭＰ−２修飾体は阻
害しなかった。したがって、ＴＩＭＰ−２によるＭＴ−
ＭＭＰの触媒活性の阻害は、プロゼラチナーゼＡのプロ
セッシングの阻害の原因となるということも考えられ
る。ＣＭ中の成熟型および中間型ゼラチナーゼＡの消失
並びに細胞に結合した活性ゼラチナーゼＡの減少は、同
様の濃度の非修飾ＴＩＭＰ−２で認められたので（図
６）、三分子複合体の形成の防止およびＭＴ−ＭＭＰ活
性の阻害は、臨界的濃度のＴＩＭＰ−２存在下、同時に
起こりうる（図７Ｂ）。それら機序の両方が、ＴＩＭＰ
−２がプロゼラチナーゼＡの細胞媒介活性化の調節因子
になり得る要因であると考えられる。

【００４４】図面の詳細な説明 図１は、ＴＩＭＰ−２の阻害活性に対するＫＮＣＯの効
果を示す。ＴＩＭＰ−２（２μＭ）を、ＴＢＳ中０．２
Ｍ ＫＮＣＯと一緒に３７℃で０分間（●）、３０分間
（○）、６０分間（▲）、１２０分間（△）および２４
０分間（ｘ）インキュベートした。インキュベーション
後、それぞれの試料をヒドロキシルアミン塩酸塩で処理
し、そして「実験手順」で記載されたようにＴＢＳに対
して透析した。パネルＡでは、マトリライシン（３０ｎ
Ｍ）を、種々の濃度のＴＩＭＰ−２のＫＮＣＯで処理さ
れた誘導体の存在下において０．１ｍＭの３１６７ｖと
一緒に３７℃で４０分間インキュベートした。反応混合
物は全て、ＴＢＳ、１０ｍＭ ＣａＣｌ₂および０．０
１％Ｂｒｉｊ３５を含有した。マトリライシンによって
加水分解された３１６７ｖの量を１００％として、各濃
度のＴＩＭＰ−２のＫＮＣＯ処理誘導体の存在下でマト
リライシンによって加水分解された３１６７ｖの相対量
を縦座標で示す。パネルＢでは、ＫＮＣＯとのインキュ
ベーション時間に対するパネルＡで得られたＩＣ₅₀の逆
の値をプロットしている。ＩＣ₅₀は、マトリライシンの
活性の５０％阻害を与えるＴＩＭＰ−２のＫＮＣＯ処理
誘導体の濃度を示す。

【００４５】図２は、マトリライシン結合画分およびマ
トリライシン非結合画分中のＫＮＣＯで処理された型の
ＴＩＭＰ−２の阻害活性を示す。ＫＮＣＯでの処理後、
部分修飾されたＴＩＭＰ−２を、「実験手順」で記載さ
れたようにマトリライシン−セファロース４Ｂカラムを
用いて分離した。マトリライシン（３０ｎＭ，パネル
Ａ）およびＡＰＭＡ活性化ゼラチナーゼＡ（８０ｎＭ，
パネルＢ）をそれぞれ、マトリライシン結合（●）およ
びマトリライシン非結合（○）画分中の種々の濃度のＫ
ＮＣＯで処理された型のＴＩＭＰ−２の存在下におい
て、０．１ｍＭの３１６７ｖと一緒に３７℃で４０分間
インキュベートした。反応混合物は全て、ＴＢＳ、１０
ｍＭ ＣａＣｌ₂および０．０１％Ｂｒｉｊ３５を含有
した。酵素によって加水分解された３１６７ｖの量を１
００％として、各濃度のＫＮＣＯ処理型ＴＩＭＰ−２の
存在下で酵素によって加水分解された３１６７ｖの相対
量を縦座標で示す。

【００４６】図３は、マトリライシン結合画分およびマ
トリライシン非結合画分中のＫＮＣＯで処理された型の
ＴＩＭＰ−２のトリプシンペプチドのＨＰＬＣ分離を示
す。マトリライシン結合（パネルＡ）およびマトリライ
シン非結合（パネルＢ）画分中のＫＮＣＯで処理された
型のＴＩＭＰ−２をそれぞれ、「実験手順」で記載され
たように還元し且つＳ−カルボキサミドメチル化した
後、１：１００（ｗ／ｗ）の酵素対基質比のトリプシン
を用いて３７℃で２４時間消化した。消化物をＵｌｔｒ
ａｓｐｈｅｒｅ ＯＤＳ ５Ｕカラム（２．０×１５０
ｍｍ）に加え、そして０．０５％トリフルオロ酢酸を含
有するアセトニトリルの直線勾配を用いて０．５ｍｌ／
分の流速で溶離した。カラム溶出液を２０６ｎｍで監視
したが（実線）、破線はカラム基材中のアセトニトリル
の百分率を示す。

【００４７】図４は、Ｂ２０およびＵ−２１の質量スペ
クトルを示す。ＯＤＳカラムから得られたピークＢ−２
０（パネルＡ）およびＵ−２１（パネルＢ）を、マトリ
ックス溶液として１０ｍｇ／ｍｌのα−シアノ−４−ヒ
ドロキシケイ皮酸／５０％アセトニトリル／０．１％ト
リフルオロ酢酸を用いて、マトリックス介助レーザー脱
離イオン化時間の飛翔質量分析に供した。

【００４８】図５は、マトリライシン結合画分およびマ
トリライシン非結合画分中のＫＮＣＯで処理された型の
ＴＩＭＰ−２のプロゼラチナーゼＡ結合能力を示す。マ
トリライシン非結合画分（Ｎ末端修飾されたＴＩＭＰ−
２）およびマトリライシン結合画分（非修飾ＴＩＭＰ−
２）中のＫＮＣＯで処理された型のＴＩＭＰ−２並びに
天然ＴＩＭＰ−２の指定量を、「実験手順」で記載され
たようにリガンドブロッティング分析に供した。縦座標
は、ｋＤａの分子寸法を示す。

【００４９】図６は、コンカナバリンＡで刺激されたＨ
Ｔ１０８０細胞の溶解産物およびＣＭ中でのプロゼラチ
ナーゼＡのプロセッシングに対するＮ末端修飾および非
修飾ＴＩＭＰ−２の効果を示す。ＨＴ１０８０細胞を、
血清不含培地中において、マトリライシン非結合画分
（Ｎ末端修飾ＴＩＭＰ−２）およびマトリライシン結合
画分（非修飾ＴＩＭＰ−２）中の指定された濃度のＫＮ
ＣＯで処理された型のＴＩＭＰ−２並びに一定濃度（１
００μｇ／ｍｌ）のコンカナバリンＡと一緒にインキュ
ベートした。細胞溶解物（パネルＡ）およびＣＭ（パネ
ルＢ）を、インキュベートされた細胞から調製し、そし
て「実験手順」で記載されたようにゼラチンザイモグラ
フィーに供した。くさび形は、６６ｋＤａのプロゼラチ
ナーゼＡ（上段）、５９ｋＤａの中間型（中段）および
５７ｋＤａの成熟型（下段）のゼラチン分解バンドを示
す。９０ｋＤａの矢印は、プロゼラチナーゼＢのゼラチ
ン分解バンドを示す。縦座標、ｋＤａでの分子寸法。

【００５０】図７は、ＭＴ−ＭＭＰ、ＴＩＭＰ−２およ
び（プロ）ゼラチナーゼＡから成る三分子複合体の形成
に対するＴＩＭＰ−２修飾体および天然ＴＩＭＰ−２の
阻害作用についての仮説モデルを示す。

【００５１】パネルＡにおいて、ＴＩＭＰ−２修飾体
は、（プロ）ゼラチナーゼＡのヘモペキシン様ドメイン
に関して競合することにより、ＭＴ−ＭＭＰ、ＴＩＭＰ
−２および（プロ）ゼラチナーゼＡから成る三分子複合
体の形成を阻害する。ＴＩＭＰ−２修飾体は、ＭＴ−Ｍ
ＭＰの活性部位と相互作用できない。パネルＢにおい
て、過剰量の天然ＴＩＭＰ−２は、ＭＴ−ＭＭＰの活性
部位および（プロ）ゼラチナーゼＡのヘモペキシン様ド
メイン両方を占有することによって三分子複合体の形成
を阻害する。図中、Ｈ₂Ｎは、ＴＩＭＰ−２のＮＨ₂末端
のＣｙｓ−１のα−アミノ基を、Ｈ₂ＮＣＯＮＨは、Ｔ
ＩＭＰ−２のＮＨ₂末端のＣｙｓ−１がカルバミル化さ
れたα−アミノ基を、そして、Ｚｎ²⁺は、メタロプロテ
イナーゼの触媒亜鉛原子を示す。

【００５２】

【効果】本発明者は、ＴＩＭＰによるＭＭＰの活性化機
構を解明し、ＴＩＭＰ修飾体によりＴＩＭＰの複合体の
形成により促進される反応を調節、抑制することが可能
となった。一方、ＮＨ₂末端が結合するＭＭＰ自体の酵
素活性機能は影響を受けない。例えば、本発明のＴＩＭ
Ｐ−２修飾体は、ＭＴ１−ＭＭＰの触媒活性を阻害する
ことなく、プロゼラチナーゼＡの活性化を阻害できる
（図７Ａ）。

【００５３】癌の転移の研究において、ＭＭＰ活性を直
接阻害する金属酵素阻害剤が数多く研究・試験されてい
る。例えば、ＢＥ−１６６２７Ｂ、Ｓ１−２７等であ
る。しかしながら、これらのＭＭＰ阻害剤は、ＭＭＰ活
性を広範囲に阻害してしまうため、種々の副作用が指摘
されている。

【００５４】また、ＴＩＭＰを含む複合体の生成を阻害
するためには、例えば、天然ＴＩＭＰを過剰に投与する
方法も考えられる（図７Ｂ）。しかしながら、この方法
は、臨界量まではむしろ複合体の生成を促進する可能性
がある。また、過剰量のＴＩＭＰによりＭＭＰ活性自体
が阻害される可能性がある。

【００５５】これらに対し、本発明のＴＩＭＰ修飾体
は、このようにＭＭＰ自体の酵素活性を阻害せず、ＴＩ
ＭＰの型により特異的に潜在型ＭＭＰの活性化を阻害で
きる。よって、上述のような副作用等の問題も生ぜず、
また試験用の試薬としても有用である。

【００５６】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Oriental Yeast Co., Ltd. Nobuo Agatsuma <120> ＴＩＭＰのＮＨ₂末端αアミノ基修飾体 <130> 990461 <160> 4 <210> 1 <211> 207 <212> PRT <400> 1 Met Ala Pro Phe Glu Pro Leu Ala Ser Gly Ile Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Trp Leu Ile Ala Pro Ser Arg Ala Cys Thr Cys Val Pro Pro His 20 25 30 Pro Gln Thr Ala Phe Cys Asn Ser Asp Leu Val Ile Arg Ala Lys 35 40 45 Phe Val Gly Thr Pro Glu Val Asn Gln Thr Thr Leu Tyr Gln Arg 50 55 60 Tyr Glu Ile Lys Met Thr Lys Met Tyr Lys Gly Phe Gln Ala Leu 65 70 75 Gly Asp Ala Ala Asp Ile Arg Phe Val Tyr Thr Pro Ala Met Glu 80 85 90 Ser Val Cys Gly Tyr Phe His Arg Ser His Asn Arg Ser Glu Glu 95 100 105 Phe Leu Ile Ala Gly Lys Leu Gln Asp Gly Leu Leu His Ile Thr 110 115 120 Thr Cys Ser Phe Val Ala Pro Trp Asn Ser Leu Ser Leu Ala Gln 125 130 135 Arg Arg Gly Phe Thr Lys Thr Tyr Thr Val Gly Cys Glu Glu Cys 140 145 150 Thr Val Phe Pro Cys Leu Ser Ile Pro Cys Lys Leu Gln Ser Gly 155 160 165 Thr His Cys Leu Trp Thr Asp Gln Leu Leu Gln Gly Ser Glu Lys 170 175 180 Gly Phe Gln Ser Arg His Leu Ala Cys Leu Pro Arg Glu Pro Gly 185 190 195 Leu Cys Thr Trp Gln Ser Leu Arg Ser Gln Ile Ala 200 205 207 <210> 2 <211> 220 <212> PRT (400> 2 Met Gly Ala Ala Ala Arg Thr Leu Arg Leu Ala Leu Gly Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Ala Thr Leu Leu Arg Pro Ala Asp Ala Cys Ser Cys Ser 20 25 30 Pro Val His Pro Gln Gln Ala Phe Cys Asn Ala Asp Val Val Ile 35 40 45 Arg Ala Lys Ala Val Ser Glu Lys Glu Val Asp Ser Gly Asn Asp 50 55 60 Ile Tyr Gly Asn Pro Ile Lys Arg Ile Gln Tyr Glu Ile Lys Gln 65 70 75 Ile Lys Met Phe Lys Gly Pro Glu Lys Asp Ile Glu Phe Ile Tyr 80 85 90 Thr Ala Pro Ser Ser Ala Val Cys Gly Val Ser Leu Asp Val Gly 95 100 105 Gly Lys Lys Glu Tyr Leu Ile Ala Gly Lys Ala Glu Gly Asp Gly 110 115 120 Lys Met His Ile Thr Leu Cys Asp Phe Ile Val Pro Trp Asp Thr 125 130 135 Leu Ser Thr Thr Gln Lys Lys Ser Leu Asn His Arg Tyr Gln Met 140 145 150 Gly Cys Glu Cys Lys Ile Thr Arg Cys Pro Met Ile Pro Cys Tyr 155 160 165 Ile Ser Ser Pro Asp Glu Cys Leu Trp Met Asp Trp Val Thr Glu 170 175 180 Lys Asn Ile Asn Gly His Gln Ala Lys Phe Phe Ala Cys Ile Lys 185 190 195 Arg Ser Asp Gly Ser Cys Ala Trp Tyr Arg Gly Ala Ala Pro Pro 200 205 210 Lys Gln Glu Phe Leu Asp Ile Glu Asp Pro 215 220 <210> 3 <211> 211 <212> PRT (400> 3 Met Thr Pro Trp Leu Gly Leu Ile Val Leu Leu Gly Ser Trp Ser 1 5 10 15 Leu Gly Asp Trp Gly Ala Glu Ala Cys Thr Cys Ser Pro Ser His 20 25 30 Pro Gln Asp Ala Phe Cys Asn Ser Asp Ile Val Ile Arg Ala Lys 35 40 45 Val Val Gly Lys Lys Leu Val Lys Glu Gly Pro Phe Gly Thr Leu 50 55 60 Val Tyr Thr Ile Lys Gln Met Lys Met Tyr Arg Gly Phe Thr Lys 65 70 75 Met Pro His Val Gln Tyr Ile His Thr Glu Ala Ser Glu Ser Leu 80 85 90 Cys Gly Leu Lys Leu Glu Val Asn Lys Tyr Gln Tyr Leu Leu Thr 95 100 105 Gly Arg Val Tyr Asp Gly Lys Met Tyr Thr Gly Leu Cys Asn Phe 110 115 120 Val Glu Arg Trp Asp Gln Leu Thr Leu Ser Gln Arg Lys Gly Leu 125 130 135 Asn Tyr Arg Tyr His Leu Gly Cys Asn Cys Lys Ile Lys Ser Cys 140 145 150 Tyr Tyr Leu Pro Cys Phe Val Thr Ser Lys Asn Glu Cys Leu Trp 155 160 165 Thr Asp Met Leu Ser Asn Phe Gly Tyr Pro Gly Tyr Gln Ser Lys 170 175 180 His Tyr Ala Cys Ile Arg Gln Lys Gly Gly Tyr Cys Ser Trp Tyr 185 190 195 Arg Gly Trp Ala Pro Pro Asp Lys Ser Ile Ile Asn Ala Thr Asp 200 205 210 Pro 211 <210> 4 <211> 224 <212> PRT (400> 4 Met Pro Gly Ser Pro Arg Pro Ala Pro Ser Trp Val Leu Leu Leu 1 5 10 15 Arg Leu Leu Ala Leu Leu Arg Pro Pro Gly Leu Gly Glu Ala Cys 20 25 30 Ser Cys Ala Pro Ala His Pro Gln Gln His Ile Cys His Ser Ala 35 40 45 Leu Val Ile Arg Ala Lys Ile Ser Ser Glu Lys Val Val Pro Ala 50 55 60 Ser Ala Asp Pro Ala Asp Thr Glu Lys Met Leu Arg Tyr Glu Ile 65 70 75 Lys Gln Ile Lys Met Phe Lys Gly Phe Glu Lys Val Lys Asp Val 80 85 90 Gln Tyr Ile Tyr Thr Pro Phe Asp Ser Ser Leu Cys Gly Val Lys 95 100 105 Leu Glu Ala Asn Ser Gln Lys Gln Tyr Leu Leu Thr Gly Gln Val 110 115 120 Leu Ser Asp Gly Lys Val Phe Ile His Leu Cys Asn Tyr Ile Glu 125 130 135 Pro Trp Glu Asp Leu Ser Leu Val Gln Arg Glu Ser Leu Asn His 140 145 150 His Tyr His Leu Asn Cys Gly Cys Gln Ile Thr Thr Cys Tyr Thr 155 160 165 Val Pro Cys Thr Ile Ser Ala Pro Asn Glu Cys Leu Trp Thr Asp 170 175 180 Trp Leu Leu Glu Arg Lys Leu Tyr Gly Tyr Gln Ala Gln His Tyr 185 190 195 Val Cys Met Lys His Val Asp Gly Thr Cys Ser Trp Tyr Arg Gly 200 205 210 His Leu Pro Leu Arg Lys Glu Phe Val Asp Ile Val Gln Pro 215 220

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ＴＩＭＰ−２の阻害活性に対するＫＮ
ＣＯの効果を示す。

【図２】図２は、マトリライシン結合画分およびマトリ
ライシン非結合画分中のＫＮＣＯで処理された型のＴＩ
ＭＰ−２の阻害活性を示す。

【図３】図３は、マトリライシン結合画分およびマトリ
ライシン非結合画分中のＫＮＣＯで処理された型のＴＩ
ＭＰ−２のトリプシンペプチドのＨＰＬＣ分離を示す。

【図４】図４は、Ｂ２０およびＵ−２１の質量スペクト
ルを示す。

【図５】図５は、マトリライシン結合画分およびマトリ
ライシン非結合画分中のＫＮＣＯで処理された型のＴＩ
ＭＰ−２のプロゼラチナーゼＡ結合能力を示す。

【図６】図６は、コンカナバリンＡで刺激されたＨＴ１
０８０細胞の溶解産物およびＣＭ中でのプロゼラチナー
ゼＡのプロセッシングに対するＮ末端修飾および非修飾
ＴＩＭＰ−２の効果を示す。

【図７】図７は、ＭＴ−ＭＭＰ、ＴＩＭＰ−２および
（プロ）ゼラチナーゼＡから成る三分子複合体の形成に
対するＴＩＭＰ−２修飾体および天然ＴＩＭＰ０−２の
阻害作用についての仮説モデルを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/99 Ａ６１Ｋ 37/64 Ｆターム(参考） 4C084 AA01 AA02 AA07 BA44 DC32 MA17 MA35 MA43 MA52 MA66 ZA362 ZB262 4H045 AA10 AA30 BA10 CA41 DA56 DA89 EA23 EA28 FA51 GA25

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ＴＩＭＰのＮＨ₂末端α−アミノ基を電子
   吸引基で修飾し、メタロプロテイナーゼとの結合性を実
   質的に消失しているＴＩＭＰ修飾体。
2. 【請求項２】ＴＩＭＰ修飾体がＴＩＭＰ−２修飾体であ
   る、請求項１に記載のＴＩＭＰ修飾体。
3. 【請求項３】前記電子吸引基がカルバミル基である、請
   求項１または２に記載のＴＩＭＰ修飾体。
4. 【請求項４】請求項１ないし３のいずれか１項に記載の
   ＴＩＭＰ修飾体を加えることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
   でＴＩＭＰを含む複合体の形成を阻害する方法。
5. 【請求項５】前記ＴＩＭＰ修飾体がＴＩＭＰ−２修飾体
   であり、前記複合体がＭＴ−ＭＭＰ、ＴＩＭＰ−２およ
   びゼラチナーゼＡを含む複合体である、請求項４に記載
   の阻害方法。
6. 【請求項６】請求項１ないし３のいずれか１項に記載の
   ＴＩＭＰ修飾体を含む、薬学的に受容可能な担体と共に
   含む医薬用組成物。
7. 【請求項７】癌の転移抑制または血管新生抑制のために
   用いる請求項６に記載の医薬用組成物。