KR101363455B1

KR101363455B1 - 매트릭스 메탈로프로테아제 활성 억제 펩타이드 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101363455B1
Application number: KR1020110091923A
Authority: KR
Inventors: 정용지; 김은미
Original assignee: (주)케어젠
Priority date: 2011-09-09
Filing date: 2011-09-09
Publication date: 2014-02-21
Also published as: EP2754665A4; JP5908589B2; EP2754665B1; KR20130028403A; ES2637290T3; US20140328782A1; CN104024271A; US9303064B2; BR112014005398B1; EP2754665A1; WO2013035931A1; CN104024271B; BR112014005398A2; JP2014526459A

Abstract

본 발명은 매트릭스 메탈로프로테아제의 활성을 억제하는 펩타이드 및 이의 용도에 대한 것이다. 본 발명의 매트릭스 메탈로프로테아제의 활성을 억제하는 펩타이드는 직접적인 매트릭스 메탈로프로테아제의 활성을 억제하여 피부상태를 개선하는데 매우 우수한 효능을 발휘한다. 또한, 본 발명의 펩타이드를 포함하는 조성물은 히알루론산 분해 효소의 활성 억제, 지방세포에서의 지방생성 억제 및 혈관형성 억제 등의 우수한 생리활성이 있어 항비만, 항암 및 항염증 등의 다양한 질병의 치료에 이용 가능하며, 펩타이드는 크기가 작기 때문에 피부 투과도가 매우 뛰어나 다양한 분야에서 이용 가능하다. 본 발명의 펩타이드의 우수한 활성 및 안정성은 의약, 의약외품 및 화장품에 매우 유리하게 적용될 수 있다.

Description

매트릭스 메탈로프로테아제 활성 억제 펩타이드 및 이의 용도{Peptides Inhibiting the Activity of Matrix Metalloproteases and Use Thereof}

본 발명은 매트릭스 메탈로프로테아제의 활성을 억제하는 펩타이드 및 이의 용도에 대한 것이다.

매트릭스 메탈로프로테아제(Matrix metalloproteinase; MMP)는 콜라겐, 프로테오글리칸 및 젤라틴과 같은 거대 생분자들을 분해시킬 수 있는 엔도펩티다아제류 효소로, 크게 콜라게나제, 젤라티나제, 스트로멜리신 및 막형 MMP 로 분류 된다. 매트릭스 메탈로프로테아제는 모두 전구 효소의 형태로 발현된 후 일부분이 잘려나감으로써 활성화된다 (Bond,J.S.,et al., Int. J. Biochem., 75,565-574(1985); Chen, J.M., Chen, W.T.,Cell, 48, 193~203(1987); Harris, E.D.et al., Coll Rel Res, 4, 493-512(1984)).

콜라게나제는 삼중나선형 간질성 콜라겐과 젤라틴 등에 작용하며, 섬유아세포 콜라게나제, 호중구 콜라게나제 및 콜라게나제-3의 3종유가 알려져 있고, 제 I,II 및 III 형의 콜라겐 소섬유 (Collagen fibrils) 들을 절단하는 것으로 보고 되어있다(Goldberg, G.I.,et al, J.Biol.Chem., 261, 6600-6605(1986); Fini, M.E.,et al., Biochemistry, 26, 6155-6165(1987)). 또한 이들 세가지 콜라게나제들은 서로 약 50% 이상의 서열 동일성을 가지는 것으로 알려져 있다(Borkakoti, et al., Nature Struct. Biol., 1, 106-110(1994); EMBO, J., 13, 1263-1269(1994)).

MMP는 전펩타이드 부위, 촉매성 부위 및 C-말단 부이의 세부위로 구분된다. MMP는 모두 활성이 없는 잠복형으로 생성 분비된 후, N-말단의 전펩타이드 부위의 80개의 아미노산이 잘려있고, 이 PRCGVPD 서열을 갖는 부위의 시스테인이 제거되면서 활성화 된다(Van Wart, H.E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 5578-5582(1990)). 활성화된 MMP는 천연 억제제인 MMP 조직저해제(Tissue Inhibitor of Matrix Metalloproteinase)와 결합하여 활성이 억제되는 것으로 알려져 있는데, 이 결합은 촉매성 부위에 의해서 조절된다(Murphy, et al., J. Niol. Chem., 267, 9612-9618 (1992)). 여러 가지 형태의 MMP는 기질특이성을 갖고 있으며, 정상적인 세포에도 세포외 매트릭스(extracellular matrix)나 다른 콜라겐 구조를 분해해야 할 필요성이 있을 때 대사과정에서 발현된다. MMP에 의해 매개되는 질환으로는 동맥경화증, 중추신경계의 염증질환, 알츠하이머, 피부 노화, 류마티스성 관절염, 골관절염, 각막궤양, 골질환, 단백뇨증, 복대동맥류질환, 외상성 관절 손상에 따른 퇴행성 연골손실, 신경계의 수초탈락 질환, 간경변, 신사구체 질환,배태막의 미성숙 파열, 염증성 장질환, 치근막 질환, 노화와 관련된 황반 변성, 당뇨성 망막병증, 증식성 유리체 망막병증, 미성숙 망막병증, 원추 각막, 쇼그렌 증후군, 근시, 안과 종양, 각막이식 거부, 혈관신생, 암의 침윤과 전이 등이 있다. 류머티즘성 관절염과 골관절염은 자가면역 이상이 원인이지만, 병이 진행 되면서 관절 연골의 세포외 매트릭스가 파괴된다. 이러한 관절염 및 관절 외상에서 스트로멜리신이 주요한 효소로 인식되었으며, 프로콜라게나제를 활성 콜라게나제로 전환시키는데 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀져 있다. 따라서, MMP 활성을 억제함으로써 관절염 진행을 막을 수 있으며, 상기한 MMP는 침투성 백혈구 또는 섬유아세포 또는 외재적으로 미생물로부터 유래 되는 것으로 보고되어 있다.

또한 염증매개체의 자극에 의하여 분비된 콜라게나제 및 세균으로부터 분비된 콜라게나제는 치주조직의 기질인 콜라겐을 분해하여 잇몸 퇴축을 발생시키고, 점차 진행되어 치주 질환을 야기한다. 염증을 일으킨 잇몸에서 분리된 섬유아세포 콜라게나제 및 스트로멜리신의 활성이 확인 되었고, 효소의 수준은 관찰된 치은염의 정도와 상호 연관됨이 확인되었다(Overall, C.M. et al., J. Periodontal Res. 22, 81-88(1987)).

MMP는 여러 가지 중추신경계(CNS)의 발병과 관련이 있다. MMP는 염증성의 단핵구 세포를 중추신경으로 유입시켜 마이엘린을 파괴시키거나 혈액뇌 관문 (Blood-Brain Barrier)을 파괴시키며 알츠하아이머 질환에서는 아밀로이드 베타단백질의 축적에 관여하는 것으로 추정되고 있다(Yong, VW, et al.,Trends Neurosci 21(2),75-80(1998)). 또한 MMP는 알츠하이머 질환의 뇌에서 정상의 뇌보다 그 농도가 높은 것으로 보고되고 있으며(Leake A, Morris CM, & Whateley J. Neurosci Lett 291(3),201-3(2000), 뇌척수액에서의 젤라티나제 B수준은 다발성 경화증 및 기타 신경성 질환과 관련되어 있으며(Miyazaki, K,et al., Nature 362,839~841(1993)), 아밀로이드 베타단백질을 분해하여 축적시키는 데도 기여하는 것으로 보고되고 있다(Backstrom JR, et al., J neurosci 16(24),7910-9(1996)).

또한, MMP는 피부 노화를 유도하므로, 이를 억제하면 주름 치료 및 예방작용을 기대할 수 있으며, MMP는 또한 기저막 분해작용으로 혈관신생, 암의 침윤과 전이를 촉진시킨다. 따라서, MMP는 기저막의 분해를 통하여 암의 침윤과 전이에 매추 중요한 역할을 할 뿐 아니라, 이에 의해 매개되는 질환이 매우 다양하므로 이를 억제할 수 있는 약제의 개발이 요구되고 있다. 그러나 이러한, 억제제는 장기간 사용시에 안전하게 사용할 수 있어야 이상적인 치료제로 사용할 수 있으므로 MMP활성 억제제로서 독성이 적은 제제의 개발이 요구되고 있다.

또한 MMP에 의해 매개되는 다양한 질환들의 효과적인 치료를 위해 MMP 억제제에 대한 연구가 활발히 진행 되고 있으며, MMP 억제제의 개발은 다양한 질환들의 치료에 효과적으로 사용된다.

본 발명자들은 매트릭스 메탈로프로테아제의 활성을 억제하는 우수한 펩타이드들을 개발하고자 노력한 결과, 다양한 종류의 펩타이드를 제조 및 스크리닝하였다. 그 결과, 많은 펩타이드 후보물질 중에서 콜라겐 분해 억제 효과, 산화 스트레스에 의한 세포 사멸 억제 효과, 매트릭스 메탈로프로테아제 2 활성 억제 효과 및 히알루론산 분해 억제 효과 등의 생리활성이 우수할 뿐만 아니라 안정성 및 피부 투과율이 우수한 펩타이드를 선별함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 다음 일반식 1의 펩타이드를 제공하는 데 있다:

일반식 1

X_aa1-X_aa2-Pro-Cys-X_aa3-X_aa4-X_aa5-Ser-X_aa6

본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부상태(skin conditions) 개선용 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부상태(skin conditions) 개선용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드 및 히알루론산을 포함하는 피부 필러(filler)을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 MMP-활성 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 일반식 1의 펩타이드를 제공한다.

일반식 1

X_aa1-X_aa2-Pro-Cys-X_aa3-X_aa4-X_aa5-Ser-X_aa6

상기 일반식에서, X_aa1은 Ser, Met, Tyr, Gly, Ala, Val, Leu 또는 Ile이고, X_aa2는 Ile, Leu, Val, Ser, Met, Tyr, Gly 또는 Ala이며, X_aa3은 Lys, Tyr 또는 Phe이고, X_aa4는 Leu, Ile, Val, Ser, Met, Tyr, Gly 또는 Ala이며, X_aa5는 Gln, Ser 또는 Thr이고, X_aa6은 Gly, Pro 또는 Lys이다.

본 발명자들은 매트릭스 메탈로프로테아제의 활성을 억제하는 우수한 펩타이드들을 개발하고자 노력한 결과, 다양한 종류의 펩타이드를 제조 및 스크리닝하였다. 그 결과, 많은 펩타이드 후보물질 중에서 콜라겐 분해 억제 효과, 산화 스트레스에 의한 세포 사멸 억제 효과, 매트릭스 메탈로프로테아제 2의 활성 억제 효과 및 히알루론산 분해 억제 효과 등의 생리활성이 우수할 뿐만 아니라 안정성 및 피부 투과율이 우수한 펩타이드를 선별함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

좀 더 자세히 살펴보면, 본 발명자들은 컴퓨터를 이용한 유사 검색(Homology Search)와 도킹 방법 등을 통해 이미 알려져 있는 가상의 매트릭스 메탈로프로테아제와의 결합 가능 부위를 선정하고, 예측된 부위의 아미노산 서열을 최적화하여 후보 펩타이드들을 합성하였다. 선정된 다수의 펩타이드들은 2-클로로-트리틸-레진에 Fmoc-아미노산을 이용한 고체상 합성을 수행한 뒤, 트리플로로아세트산을 이용하여 레진에서 떼어낸 뒤 무수에테르에서 원하는 펩타이드를 수득하였다. 합성한 펩타이드는 정제 및 분석과정을 거쳐 함량과 순도를 점검한 뒤 여러 생물학적 테스트를 거쳐 가장 생리 활성이 우수한 펩타이드를 스크리닝 함으로써, 본 발명의 펩타이드를 선별하였다.

본 발명의 펩타이드에 있어서, 상기 X_aa1은 Ser, Met 또는 Tyr이고, X_aa2는 Ile 또는 Leu이며, X_aa3은 Lys, Tyr 또는 Phe이고, X_aa4는 Leu, Ile 또는 Val이며, X_aa5는 Gln, Ser 또는 Thr이고, X_aa6은 Gly, Pro 또는 Lys인 것을 특징으로 하는 펩타이드인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 서열목록 제1서열 내지 제3서열로 구성된 군으로부터 선택되는 펩타이드인 것을 특징으로 하는 펩타이드이다.

본 명세서에서 용어 “펩타이드”는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques)에 따라 제조될 수 있다(Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)).

본 발명의 펩타이드는 아미노산 서열의 일부 부위를 선정하고 그 활성을 증가시키기 위해 N-말단 또는 C-말단에 변형을 유도할 수 있다. 이러한 변형을 통해 본 발명의 펩타이드는 생체내 투여시의 반감기를 증가시킨 높은 반감기를 가질 수 있다.

또한, 본 발명의 펩타이드의 C-말단은 히드록시기(-OH), 아미노기(-NH₂), 아자이드(-NHNH₂) 등으로 변형되어 있으며, 펩타이드의 N-말단은 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 구성된 군으로부터 선택되는 보호기가 결합되어 있다.

상술한 아미노산의 변형은 본 발명의 펩타이드의 안정성을 크게 개선하는 작용을 한다. 본 명세서에서 용어 “안정성”은 인 비보 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미한다. 상술한 보호기는 생체 내의 단백질 절단효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호하는 작용을 한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 인간 피부섬유모세포(human primary dermal fibroblast) 및 섬유아세포(fibroblast)에서 세포의 성장을 촉진 시키며, 산화스트레스(oxidative stress)에 의한 세포 사멸을 억제 한다. 또한, 직접적으로 세포에 자외선(UV)를 조사하여 세포 사멸을 유도한 후 본 발명의 펩타이드를 처리하였을 때 세포 사멸을 억제하는 기능을 갖는다. 더욱이, 본 발명의 펩타이드는 매트릭스 메탈로프로테아제의 활성을 직접적으로 억제 하는 기능을 갖을뿐 아니라, 매트릭스 메탈로프로테아제에 의한 콜라겐 분해를 본 펩타이드에 의해 콜라겐 분해가 억제되는 기능을 갖는다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 피부 미백에 중요한 멜라노좀 이동(melanosome transfer) 억제 효과가 뛰어나다. 이러한 결과는 본 발명의 펩타이드가 피부상태 개선에 매우 우수한 효능을 가진다는 것을 의미한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부상태(skin conditions) 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 있어서 피부 상태의 개선은 주름개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지, 피부보습 개선, 상처 제거, 피부재생 또는 미백이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부상태(skin conditions) 개선용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 있어서 피부 상태의 개선은 상처 제거 또는 피부재생이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명의 펩타이드 및 히알루론산을 포함하는 피부 필러(filler)를 제공한다.

본 발명의 펩타이드는 히알루론산 분해 효소의 활성을 억제시킴으로써 필러 제품에 적용하였을 때, 필러 제품의 장기간 안정성을 향상시키는데 우수한 효과를 보인다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 펩타이드는 치주세포에 처리하였을때, 염증관련 단백질들의 발현이 억제되는 항염증 효과에 우수한 효능을 나타낸다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 펩타이드는 지방세포에 처리하였을때, 지방합성을 억제하는 기능이 탁월하여 비만의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 펩타이드는 혈관내피세포에서 튜브형성(tube formation)을 억제함으로 인해 혈관 생성을 억제하는 기능을 갖기 때문에, 다양한 암의 치료에 응용 가능하다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 MMP-활성 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로서, 상기 MMP-활성 관련 질환은 관절염, 당뇨병성 망막증, 비대성 반흔, 건선, 점막 및 상피 조직의 궤양, 자가면역에 의한 염증, 기저막의 분해와 관련된 질병인 낭창, 자가 면역성 신경장애, 근세포 파괴, 녹내장 또는 과다한 혈관신생인 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.

본 발명의 펩타이드는 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP)의 활성 억제, 콜라겐 분해 억제, 히알루론산 분해 억제, 멜라노좀 이동(melanosome transfer)을 억제, 지방세포(adipocyte cell)에서의 지방(lipid) 생성 억제 및 혈관생성 억제등의 다양한 생리활성을 가짐으로써 이와 관련된 질병 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 펩타이드는 다른 단백질 보다 분자량이 훨씬 작기 때문에, 피부 침투율이 매우 우수하다. 따라서 본 발명의 조성물을 국소적으로 피부에 도포하는 경우 피부상태를 효과적으로 개선할 수 있다.

따라서 본 발명의 펩타이드는 다양한 분야의 의약품 및 화장품의 용도에 적합한 형태로 이용할 수 있으며, 본 발명의 조성물은 약제학적 조성물과 화장품 조성물로 제조될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 펩타이드의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다.

본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 펩타이드의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구, 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 근육 주입, 정맥내 주입, 피하 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 1일 당 0.0001-1000 ㎍이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 펩타이드의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount); 및 (b) 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 화장품 조성물이다.

본 명세서에서 용어 “화장품학적 유효량”은 상술한 본 발명의 조성물의 피부 개선 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 펩타이드와 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명의 매트릭스 메탈로프로테아제의 활성을 억제하는 펩타이드는 직접적인 매트릭스 메탈로프로테아제의 활성을 억제하여 피부상태를 개선하는데 매우 우수한 효능을 발휘한다.

(b) 본 발명의 펩타이드를 포함하는 조성물은 히알루론산 분해 효소의 활성 억제, 지방세포에서의 지방생성 억제 및 혈관형성 억제 등의 우수한 생리활성이 있어 항비만, 항암 및 항염증 등의 다양한 질병의 치료에 이용 가능하다.

(c) 본 발명의 펩타이드는 크기가 작기 때문에 피부 투과도가 매우 뛰어나다.

(d) 상술한 본 발명의 펩타이드의 우수한 활성 및 안정성은 의약, 의약외품 및 화장품에 매우 유리하게 적용될 수 있다.

도 1 은 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제1서열 내지 제3서열 펩타이드의 고성능 액상 크로마토그래피 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2a 는 본 발명의 펩타이드들을 각 농도별로 처리한 후, 인간 피부섬유모세포에서의 세포성장 효과를 나타내는 그래프이다.
도 2b 는 본 발명의 펩타이드들을 각 농도별로 처리한 후, 섬유아세포의 세포성장 효과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 펩타이드들을 처리한 후, 섬유아세포의 세포성장 효과를 나타내는 현미경 사진이다.
도 4a는 본 발명의 펩타이드들의 산화스트레스에 의한 섬유아세포의 사멸 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 4b는 자외선(UV)를 인간 피부섬유모세포에 처리하여 세포사멸을 유도한 후 본 발명의 펩타이드들을 처리하여, 자외선(UV) 에 의한 세포사멸 억제 효과를 나타내는 현미경 사진이다.
도 4c는 본 발명의 펩타이드들에 의한 ERK의 인산화(phosphorylation)를 통하여 도 4b의 효과가 나타난다는 것을 보여주는 데이터이다.
도 5a는 본 발명의 펩타이드들을 각 농도별로 처리하였을 때 매트릭스 메탈로프로테아제 2(MMP2)의 활성 억제를 나타내는 젤라틴 자이모그래피(Zelatin zymography) 데이터이다.
도 5b는 본 발명의 펩타이드들을 각 농도별로 처리하였을 때 섬유아세포에서 매트릭스 메탈로프로테아제 2(MMP2)의 활성 억제를 나타내는 젤라틴 자이모그래피 데이터이다.
도 5c는 본 발명의 펩타이드들을 각 농도별로 처리하였을 때 메탈로프로테아제 2(MMP2)의 활성을 직접적으로 억제하는 것을 나타내는 젤라틴 자이모그래피 데이터이다.
도 6a는 메탈로프로테아제 2(MMP2)에 의한 콜라겐(collagen)분해를 촉진시킨 후, 본 발명의 펩타이드를 농도별로 처리하였을 때 콜라겐 분해가 억제되는 것을 나타내는 데이터이다.
도 6b는 IGF-1에 의해 콜라겐의 발현을 유도한 후에 메탈로프로테아제 2(MMP2)를 처리하여 콜라겐 분해를 촉진시킨 후, 본 발명의 펩타이드를 농도별 처리하였을 때 콜라겐 분해가 억제되는 것을 나타내는 데이터이다.
도 7a는 본 발명의 펩타이드들을 처리하였을 때 히알루론산의 분해를 억제하는 것을 나타내는 젤라틴 자이모그래피 데이터이다.
도 7b는 필러제품에 히알루론산 분해 효소를 넣어 인위적으로 분해를 유도한 후, 각 펩타이드를 농도별로 처리하였을 때 필러제품의 히알루론산 분해가 억제 되는 것을 시간별로 나타내는 데이터이다.
도 7c는 필러제품에 히알루론산 분해효소와 서열목록 제2서열 펩타이드 첨가 후 쥐의 등 피부에 주사하여 1일 내지 7일 간격으로 필러제품이 장기간 피부 속에 머물고 있는지에 대한 효과를 검증한 결과, 서열목록 제2서열 펩타이드를 필러제품에 넣어 주사한 시료가 필러제품만을 주사한 제품에 비해 히알루론산 분해 억제 효과가 탁월한 것을 확인할 수 있었으며, 생체내에서 장기간 유지되는 것을 확인할 수 있었다.
도 8a는 본 발명의 펩타이드들을 처리하였을 때 본 발명의 펩타이드 들이 멜라노좀 이동을 억제함으로써 미백효과가 우수하다는 것을 나타내는 데이터이다.
도 8b는 본 발명의 펩타이드들을 처리하였을 때 멜라노좀 이동을 억제하는 것을 세포 모양으로 나타내는 데이터이다.
도 9는 본 발명의 펩타이들에 의하여 염증관련 단백질들의 발현이 억제 되는 항염증 기능을 나타내는 RT-PCR 데이터이다.
도 10은 본 발명의 펩타이드들을 처리하였을 때 지방합성을 억제하는 것을 나타내는 데이터이다.
도 11은 본 발명의 펩타이드들을 처리하였을 때 혈관생성 세포인 HUVEC에 처리하였을 때 혈관생성을 억제하는 것을 나타내는 데이터이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

합성예 1: SIPCKLQSG (서열목록 제1서열)의 합성

클로로 트리틸 클로라이드 레진(Chloro trityl chloride resin; CTL resin, Nova biochem Cat No. 01-64-0021) 700 ㎎을 반응용기에 넣고 메틸렌 클로라이드(MC) 10 ㎖를 가하여 3분간 교반하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름 아마이드(DMF) 10 ㎖를 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 반응기에 10 ㎖의 디클로로메탄용액(DCM)을 넣고 Fmoc-Gly-OH (Bachem, Swiss) 200 mmole 및 디이소프로필 에틸아민(DIEA) 400 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹이고, 1시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응 후 세척하고 메탄올과 DIEA(2:1)를 DCM에 녹여 10분간 반응시키고 과량의 DCM/DMF(1:1)로 세척하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름 아마이드(DMF)를 10 ㎖ 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 탈보호 용액(20%의 피페리딘(Piperidine)/DMF) 10 ㎖를 반응 용기에 넣고 10분간 상온에서 교반한 후 용액을 제거하였다. 동량의 탈보호 용액을 넣고 다시 10분간 반응을 유지한 후 용액을 제거하고 각각 3분씩 DMF로 2회, MC로 1회, DMF로 1회 세척하여 Gly-CTL 레진(Resin)을 제조하였다. 새로운 반응기에 10 ㎖의 DMF 용액을 넣고 Fmoc-Ser(tBu)-OH(Bachem, Swiss) 200 mmole, HoBt 200 mmole 및 Bop 200 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹였다. 반응기에 400 mmole DIEA를 분획으로 2번에 걸쳐 넣은 후 모든 고체가 녹을 때까지 최소한 5분간 교반하였다. 녹인 아미노산 혼합용액을 탈보호된 레진이 있는 반응용기에 넣고 1시간 동안 상온에서 교반하면서 반응시켰다. 반응액을 제거하고 DMF 용액으로 3회 5분씩 교반한 후 제거하였다. 반응 레진을 소량 취하여 카이저 테스트(Nihydrin Test)를 이용하여 반응 정도를 점검하였다. 탈보호 용액으로 상기와 같이 동일하게 2번 탈보호 반응시켜 Ser(tBu)-Gly-CTL Resin을 제조하였다. DMF와 MC로 충분히 세척하고 다시 한 번 카이저 테스트를 수행한 다음 상기와 동일하게 아래의 아미노산 부착 실험을 수행하였다. 선정된 아미노산 서열에 의거하여 Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Leu, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Cys(Trt), Fmoc-Pro, Fmoc-Ile 및 Fmoc-Ser(tBu), 순으로 연쇄반응을 시켰다. Fmoc-보호기를 탈보호 용액으로 10분씩 2번 반응시킨 후 잘 세척하여 제거하였다. 무수초산과 DIEA, HoBt를 넣어 한시간동안 아세틸화를 수행한 뒤 제조된 펩티딜 레진을 DMF, MC 및 메탄올로 각각 3번을 세척하고, 질소 공기를 천천히 흘려 건조한 후, P₂O₅ 하에서 진공으로 감압하여 완전히 건조한뒤 탈루 용액[트리플로로화 초산(Trifluroacetic acid) 95%, 증류수 2.5%, 티오아니졸(Thioanisole) 2.5%] 30 ㎖을 넣은 후 상온에서 가끔 흔들어주며 2 시간 반응을 유지하였다. 필터링을 하여 레진을 거르고, 레진을 소량의 TFA(Trifluoroacetic acid) 용액으로 세척한 후 모액과 합하였다. 감압을 이용하여 전체 볼륨이 절반 정도 남도록 증류하고 50 ㎖의 차가운 에테르를 가하여 침전을 유도한 후, 원심분리하여 침전을 모으고, 2번 더 차가운 에테르로 세척하였다. 모액을 제거하고 질소 하에서 충분히 건조하여 정제 전 NH₂-Ser-Ile-Pro-Cys-Lys-Leu-Gln-Ser-Gly-COOH 펩타이드 1을 0.7 g 합성하였다(수율: 93%). 분자량 측정기를 이용하여 측정시 분자량 932(이론값 : 932.12)를 얻을 수 있었다. 다른 서열2, 서열3 펩타이드도 위와 같은 방법으로 합성을 진행하였다(도 1).

서열 번호	아미노산 서열	분석값(질량분석기)
서열 번호	아미노산 서열	분석치	이론치
1	SIPCKLQSG	932	932.12
2	MIPCYISSP	1011	1010.24
3	YLPCFVTSK	1056.3	1057.29

시험예 1: 합성 펩타이드를 활용한 인간 피부섬유모세포( human primary dermal fibroblast )의 성장 효과능 분석

합성예 1에서 합성된 서열 펩타이드들에 대한 성장인자의 유사 효능 및 억제 효능을 분석하기 위해 리지노 등의 방법(Rizzino, et al ., Cancer Res . 48:4266(1988))을 참조하여 인간 피부섬유모세포를 이용한 SRB(Sulforhodamine B, Sigma) 비색법으로 측정하였다.

인간 피부섬유모세포를 각각 250 ㎖ 용량의 조직 배양용 플라스크를 이용하여 5% 우태아혈청(FBS; fetal bovine serum, Sigma)과 1% MSCGS (Mesenchymal Stem Cell Growth Supplement, Science, 미국) 를 포함하는 MSCM(Mesenchymal stem cell medium, Gibco, 미국)에서 배양하였다. 배양된 세포주들을 1% 트립신 용액으로 배양용기 바닥에서 떼어낸 후 원심분리하여 세포 침전물만을 모았다. 배양된 세포주들을 1% 트립신 용액으로 배양용기 바닥에서 떼어낸 후 원심 분리하여 세포 침전물만을 모았다. 이를 FBS가 함유되지 않은 MSCM 배양액에 다시 현탁한 후, 96-웰 조직 배양용 평판에 각 웰 당 3 X 10³ 세포가 되도록 넣고 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. 24시간 뒤 혈청을 완전히 제외한 동일한 배양액으로 배지를 교환한 뒤 표준을 잡기위한 공 시료 및 합성 펩타이드를 증류수에 멸균상태로 녹인 뒤 10 ng/㎖, 100 ng/㎖, 1 ㎍/㎖ 및 10 ㎍/㎖의 농도로 72시간을 위와 동일 조건으로 배양하였다. 배양이 완료된 후 배양 상층액을 제거하고 에탄올을 이용하여 세포를 고정화 한 다음 세포고정이 끝난 후, PBS(phosphate buffer saline)로 3회 세척하였다. 세척용액을 제거한 뒤 비색 SRB 용액으로 처리하고 1% 아세트산으로 충분히 세척을 한 뒤 현미경으로 세포를 관찰하여 생존 세포의 상태를 관찰하였으며, 자외선 590 nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존 상태를 측정하였다.

도 2a 및 2b에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 서열목록 제1서열에서 제3서열 펩타이드들은 인간 피부섬유모세포와 섬유아세포(fibroblast)의 성장을 농도-의존적으로 크게 촉진하였다. 또한, 도 3에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 서열목록 제1서열 내지 제3서열 펩타이드들의 처리가 섬유아세포의 성장을 농도-의존적으로 유도함으로써 세포의 모양 및 형태가 크게 변화하였음을 현미경을 통해 확인할 수 있다.

시험예 2: 합성 펩타이드의 산화스트레스(oxidative stress)에 의한 세포 사멸 억제 효과

합성예 1에서 합성된 서열이 산화스트레스에 의한 세포 사멸 억제 효과를 보이는지 관찰하기 위해, 섬유아세포인 NIH3T3 세포와, 인간 피부섬유모세포를 이용하여 실험을 진행 하였다. 상기 두 세포를 상술한 바와 같은 방법으로 배양 하였으며, 96-웰 조직 배양용 평판에 각 웰 당 3 X 10³ 세포가 되도록 넣고 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. 배양 후 혈청을 완전히 제외한 동일한 배양액으로 배지를 교환하고 세포에 산화스트레스를 주기 위해 메나디온(menadione, Sigma)을 15 μＭ의 농도로 세포에 처리하였다. 그 후, 각 펩타이드를 농도별로 처리하여 48시간 동안 배양하여 세포의 사멸을 관찰 하였다. 세포의 사멸은 상기 세포 증식 실험과 마찬가지로, SRB 시약을 통해 살아 있는 세포를 염색 한 후 590 nm에서 흡광도를 측정하여 확인하였다.

도 4a는 섬유아세포에 15 μＭ 의 메나디온을 처리하여 산화스트레스를 준 후, 본 발명의 펩타이드 들을 농도별(1ng/㎖, 10ng/㎖, 100ng/㎖, 1000ng/㎖)로 처리하여 세포 사멸 억제 효과를 관찰한 데이터이며, 본 발명의 펩타이드들을 농도별로 처리하였을 때 산화스트레스에 의한 세포 사멸을 억제 하는 것을 볼 수 있다.

도 4b 는 본 발명의 펩타이드에 의한 산화스트레스에 의한 세포 사멸 억제 효과를 인간 피부섬유모세포를 이용하여 관찰한 데이터이다. 각 펩타이드를 농도별 처리한 후 자외선(UV)를 각각 20 mJ/cm² , 30 mJ/cm² 세기로 조사한 후 세포의 상태를 확인 하였다. 세포는 SRB 시약을 이용하여 염색하였으며, 광학 현미경을 이용하여 세포의 상태의 확인 하였다. 결과에서 볼 수 있듯이, 20 mJ/cm² 와 30 mJ/cm² 의 세기로 세포에 자외선(UV)를 조사하였을 때 세포의 사멸이 유도되는 것을 관찰하였으며, 각 펩타이드들을 농도별로 처리하였을 때 자외선(UV)에 의한 세포의 사멸을 억제하는 것을 관찰 할 수 있었다.

도 4c 는 본 발명의 펩타이드들에 의한 산화스트레스에 의한 세포 사멸 억제 효과 시그널을 관찰하기 위해서 웨스턴블롯팅(western blot)을 수행한 결과이다. 그 결과, 본 발명의 펩타이드들을 각 시간별(15분, 30분, 60분) 처리하였을 때 ERK(extracellular signal-regulated kinases)의 인산화가 촉진되는 것을 확인할 수 있었다.

결과적으로, 본 발명의 서열목록 제1서열에서 제3서열 펩타이드들은 인간 피부섬유모세포 및 섬유아세포에서 산화스트레스에 의해 유도되는 사멸을 억제 하는 것을 확인 할 수 있었으며(도 4a 및 4b), 이 효과는 각 펩타이드들에 의한 ERK의 인산화 촉진에 의해 오는 효과임을 웨스턴블롯팅을 통해 확인 하였다(도 4c).

시험예 3: 합성 펩타이드에 의한 매트릭스 메탈로프로테아제 2(Matrix metalloprotease 2)의 활성 억제 효과

상기 합성된 서열 펩타이드에 대한 젤라틴 자이모그래피(gelatin zymography)를 이용하여 매트릭스 메탈로프로테아제 2의 활성 억제 효과를 관찰 하였다. 매트릭스 메탈로프로테아제 2의 활성억제 효과를 검증을 위하여, 매트릭스 메탈로프로테아제 2가 존재할 때 각 펩타이드들에 의한 매트릭스 메탈로프로테아제 2의 활성 억제 효과와 섬유아세포를 이용한 매트릭스 메탈로프로테아제 2의 활성 억제 효과를 각각 관찰하였다.

직접적인 펩타이드의 매트릭스 메탈로프로테아제 2 활성 억제 효과 관찰을 위해서, 매트릭스 메탈로프로테아제 2와 본 발명의 펩타이드들을 농도별 (0.1 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖) 로 혼합하여 상온에서 1시간 동안 반응한 후 젤라틴 자이모그래피를 시행하여 매트릭스 메탈로프로테아제 2의 활성을 측정하였다. 젤라틴(2 ㎎/㎖)을 기질로 한 단백질 전기영동 (SDS-PAGE)을 시행한 후, 2.5% 트라이톤 X-100(Triton X-100)에 30분 처리하여 다시 완충제(50 mM Tris-HCl, 0.2 M NaCl, 5 mM CaCl₂, 1% Triton X-100)에서 24시간 동안 37℃에서 처리하였다. 처리 후 젤은 쿠마시브릴리언트블루(Coomassie brilliant blue)R250(Sigma)으로 염색하였고, 탈색버퍼(5% 메탄올, 7.5% 아세트산, 증류수)로 처리하였다. 그 후 젤라틴 가수분해에 의하여 나타나는 밴드를 관찰함으로써, 매트릭스 메탈로프로테아제 2의 활성을 관찰하였다.

섬유아세포를 이용한 펩타이드의 매트릭스 메탈로프로테아제 2 활성 억제 효과 관찰을 위해서, 섬유아세포를 24-웰 조직 배양용 평판에 각 웰 당 3x10⁴세포를 24시간 동안 배양하였다. 세포를 무혈청 배지로 24시간 동안 배양한 후, 본 발명의 펩타이드들을 각각의 농도별로(10 ng/㎖, 100 ng/㎖, 1000 ng/㎖) 24시간 동안 처리하였다. 배양이 완료된 세포를 바닥에서 떼어내어 원심분리하여 상등액만을 회수한 후 젤라틴 자이모그래피를 이용하여 세포 내의 매트릭스 메탈로프로테아제 2의 활성을 확인하였다.

결과적으로, 본 발명의 펩타이드들을 농도별로 처리하였을 때 매트릭스 메탈로프로테아제 2의 활성이 억제 되는 것을 젤라틴 자이모그래피를 통해 확인할 수 있다(도 5a 및 5c). 또한 NIH3T3 섬유아세포를 이용한 펩타이드의 매트릭스 메탈로프로테아제 2 활성 억제 관찰에서도 각 펩타이드를 농도별로 처리하였을 때 상기와 같은 결과를 확인 할 수 있었다(도 5b).

시험예 4: 펩타이드에 의한 매트릭스 메탈로프로테아제 2의 콜라겐( collagen ) 분해 억제 효과

인간 피부섬유모세포를 24-웰 조직 배양용 평판에 각 웰 당 3x10⁴세포로 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 5% 혈청이 함유된 배지를 넣어 42시간 동안 배양하고 매트릭스 메탈로프로테아제 2 20 ng/㎖과 펩타이드로 6시간 동안 처리하였다. 세포를 원심분리하여 상등액만을 회수한 후 콜라겐 키트(collagen kit)를 이용하여 콜라겐의 합성양을 확인하였다. 또한 위와 같은 배양 조건으로 IGF-1(insulin-like growth factor type 1)을 넣어 콜라겐 합성을 인위적으로 유도한 후 매트릭스 메탈로프로테아제 2와 펩타이드를 넣어 4시간 동안 배양한 후, 콜라겐 분해를 억제하는지에 대한 관찰을 콜라겐 키트를 이용하여 진행하였다.

도 6a에서는 각 펩타이드가 매트릭스 메탈로프로테아제 2(MMP2)에 의한 유도 콜라겐 분해를 억제하는 기능을 갖는지에 대한 실험을 진행한 결과를 나타낸다. 매트릭스 메탈로프로테아제 2를 처리하였을 때 세포내에서 콜라겐의 분해가 유도되는 것을 확인할 수 있었고, 각 펩타이드를 동시에 처리하였을 때 콜라겐 분해가 억제되는 것을 확인 할 수 있었다. 또한 IGF-1을 세포내에 처리하여 콜라겐 합성을 유도한 후에 매트릭스 메탈로프로테아제 2와 각 펩타이드들을 처리하였을 때, 콜라겐 분해 억제효과를 관찰하였을 때, 각 서열 펩타이드 3종 모두에서 콜라겐 분해 억제 효과를 확인할 수 있었다(도 6b).

시험예 5: 합성 펩타이드의 필러제품 속 히알루론산 분해 억제 효과 관찰

시판되는 필러제품 속에 인위적으로 히알루론산 분해효소를 100 ㎍의 농도로 넣어 필러제품 속 히알루론산의 분해를 유도한 후, 200 ㎍의 펩타이드들을 처리하여 7일 동안 관찰함으로써 필러제품 속 히알루론산 분해 효과를 확인 하였다. GPC 컬럼을 이용한 분석방법과 래트(rat)을 이용한 인 비보(in vivo)실험을 진행하였다. 대조군으로 필러제품 속에 히알루론산 분해 효소를 이용하였으며, 처리군으로는 필러제품 속에 히알루론산 분해 효소 및 각 펩타이드들을 처리한 것을 이용하였다. 래트 피부에 주사하여 생체내에 필러를 주사하였을 때 펩타이드에 의한 필러속 히알루론산의 분해 억제 효과를 관찰 하였다.

시험예 6: 합성 펩타이드에 의한 멜라노좀 이동( melanosome transfer ) 억제 효과 관찰.

멜라노좀 이동을 관찰하기 위해서 HaCaT 각질 세포를 이용하여 파고사이토시스 시험(Phagocytosis assay)을 진행 하였다. 파고사이토시스를 위한 물질로는 형광(fluoroscence)물질이 붙은 생입자(bioparticle)를 이용하였다. 96-웰 조직 배양용 평판에 각 웰 당 3 X 10³ 세포가 되도록 하여 24시간 동안 배양 후 무혈청 배지로 6시간 동안 배양한다. 이후 파고사이토시스를 유도하기 위해 1 ㎍/㎖ 의 트립신을 처리하고 1 ㎍/㎖의 펩타이드들을 48시간 동안 처리하였다. 그 결과, 현광 현미경을 통해 생입자가 각질 세포내로 파고사이토시스되는 것을 확인하였다.

도 8a 및 도 8b 에서 볼 수 있듯이 본 발명의 펩타이드들에 의해 멜라노좀 이동이 억제되는 것을 확인 할 수 있었다.

시험예 7: 합성 펩타이드에 의한 치주세포에서의 항염증 효과.

상기 합성예에서 합성된 펩타이드들에 치주염 세포에서의 항염증 효과를 관찰하기 위해 Human periodontal ligament fibroblast cell(ATCC, USA)를 이용하여 실험을 진행 하였다. 인간 치주인대 섬유모세포(Human periodontal ligament fibroblast cell)를 6-웰 조직 배양용 평판에 각 웰 당 5x10¹ 세포를 24시간동안 배양하였다. 치주 세포에 염증을 유도하기 위해 10 ㎍/㎖의 농도로 LPS(Lipopolysaccharide / 시그마, USA) 를 처리한 후 본 발명의 펩타이드 들을 1 ㎍/㎖의 농도로 같이 처리하여 4시간동안 배양한 후 대조군과 유발 물질 그리고 유발물질과 펩타이드를 처리한 배양세포로부터 mRNA를 추출하여 IL-6, IL-1 beta, COX-2의 프라이머를 이용하여 역전사 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 사용한 각 프라이머의 뉴클레오타이드 서열은 다음과 같다: IL-6(정방향 5‘-agaggagacttcacagagga-3', 역방향 5’-atctctctgaaggactctgg-3'), IL-1 beta(정방향 5‘-ccgtggaccttccaggatca-3', 역방향 5’-gatccacactctccagctgc-3'), COX-2(정방향 5‘-cccccacagtcaaagacact-3', 역방향 5’-ccccaaagatagcatctgga-3'), Actin(정방향 5‘-gatctcaaagacaaccaactagtg-3', 역방향 5’-ctccagctgaagactcctcccag-3').

도9에서 볼 수 있듯이, 인간 치주인대 섬유모세포에 LPS로 염증을 유도하였을 때 염증성 사이토카인인, IL-6, IL-1beta, COX-2 의 발현이 증가하는 것을 관찰 할 수 있었으며, 본 발명의 펩타이드를 동시에 처리하였을 때에는 위 3가지의 염증성 사이토카인의 발현이 현저하게 억제 하는 것을 확인 할 수 있었다(도9).

시험예 8: 합성 펩타이드에 의한 지방세포( adipocyte cell )에서의 지방( lipid ) 생성 억제 효과.

상기 합성예에서 합성된 펩타이드들에 대한 지질생성(adipogenesis) 억제 효과를 관찰하기 위해 지방전구세포(Pre-adipocyte)인 3T3-L1 세포(ATCC, USA)를 이용하여 실험을 진행하였다. 패시지 8(passage 8)인 지방전구세포 3T3-L1를 24-웰 조직 배양용 평판에 각 웰 당 3x10⁴세포를 24시간동안 배양하였다. 대조군에는 지방전구세포를 지방세포로 분화시키기 위해서 DMI 배지(0.5 mM IBMX, 0.25 μＭ 덱사메타손(Dexametasone) 및 1 ㎍/㎖ 인슐린(insulin))를 이용한 배양을 진행하였고, 처리군에는 DMI 배지에 각 펩타이드들을 1 ㎍/㎖의 농도로 처리하였다. 이후 10일 동안 배양하여 분화를 유도하였다.

도 10에서 볼 수 있듯이, DMI 배지에서 10일 동안 배양한 후 현미경을 통해 관찰하였을 때 대조군은 지방전구세포가 지방세포로 분화되는 것을 확인할 수 있었으며, 세포 위로 지방이 생성되는 것을 확인할 수 있었다. 반면에 각 펩타이드를 처리한 군에서는 지방 생성이 대조군에 비해 현저하게 줄어드는 것을 확인할 수 있었다.

시험예 9: 합성 펩타이드에 의한 혈관생성 억제 효과.

상기 합성된 펩타이드에 의한 혈관생성억제 효과를 관찰하기 위해 혈관내피 세포인 HUVEC(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, ATCC, USA)를 이용한 튜브 형성(tube formation)을 관찰하였다. 메트리젤 응고(Matrigel solidification)를 위해서 96-웰 조직 배양용 평판에 각 웰당 50 ul씩 첨가하여 37℃에서 30분 동안 방치한 후, 굳혀진 메트리젤에 0.2% 혈청을 포함한 배지(Non-growth supplement medium)를 가하여 HUVEC 세포를 배양한다. 이때 각 펩타이드들을 1 ㎍/㎖ 의 농도로 함께 처리하여 37℃에서 배양한다. 5시간 이후에 광학 현미경을 이용하여 튜브 형성을 관찰 한다.

도 11에서 볼 수 있듯이, 컨트롤과 비교하였을 때 각 펩타이드들을 처리함으로써 튜브 형성이 억제되는 것을 확인할 수 있다. 이는 합성된 각 펩타이드가 혈관 형성 억제 효과가 있다는 것을 보여준다.

실시예 1: 나노화 펩타이드의 제조

상기 합성예에서 얻은 펩타이드를 50 ㎎을 정확히 칭량한 뒤 증류수 500 ㎖에 충분히 교반하여 용해하였다. 배합체 용액을 레시틴 5 g, 소듐 올리에이트(sodium oleate) 0.3 ㎖, 에탄올 50 ㎖ 및 약간의 유상과 함께 혼합한 후, 증류수로 총량을 1 ℓ로 맞춰 준 다음, 마이크로플루다이저로 고압을 이용하여 유화시켜 사이즈 100 nm 정도의 나노좀을 제조하였다. 제조된 나노좀은 최종 농도가 약 50 ppm으로 단독 혹은 복합적으로 화장품 제조용으로 사용되었다.

제형예 1: 유연화장수

상기 실시예 1에서 제조된 펩타이드 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 유연화장수를 일반적인 화장수 제조 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량%)
펩타이드 나노좀	0.001
1,3-부틸렌글리콜	6.0
글리세린	4.0
PEG 1500	1.0
소듐히알루로네이트	1.0
폴리솔베이트 20	0.5
에탄올	8.0
방부제, 색소	적량
벤조페논-9	0.05
향	미량
정제수	잔량
합계	100

제형예 2: 영양크림

상기 실시예 1에서 제조된 펩타이드 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 영양크림을 일반적인 영양크림 제조 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량%)
펩타이드 나노좀	0.001
메도우폼오일	3.0
세테아릴알콜	1.5
스테아린산	1.5
글리세릴스테아레이트	1.5
유동 파라핀	10.0
밀납	2.0
폴리솔베이트60	0.6
솔비탄 세스퀴올레이트	2.5
스쿠알란	3.0
1,3-부틸렌글리콜	3.0
글리세린	5.0
트리에탄올아민	0.5
토코페릴아세테이트	0.5
방부제, 색소	적량
향	적량
정제수	잔량
합계	100

제형예 3: 영양화장수

상기 실시예 1에서 제조된 펩타이드 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 영양화장수를 일반적인 화장수 제조 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량%)
펩타이드 나노좀	0.002
1,3-부틸렌글리콜	4.0
글리세린	4.0
세테아릴알콜	0.8
글리세릴스테아레이트	1.0
트리에탄올아민	0.13
토코페릴아세테이트	0.3
유동파라핀	5.0
스쿠알란	3.0
마카다미아너트오일	2.0
폴리솔베이트60	1.5
솔비탄세스퀴올레이트	0.5
카르복시비닐폴리머	1.0
방부제,색소	적량
향	적량
정제수	잔량
합계	100

제형예 4: 에센스

상기 실시예 1에서 제조된 펩타이드 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 에센스를 일반적인 에센스 제조 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량%)
펩타이드 나노좀	0.005
글리세린	10.0
1,3-부틸렌글리콜	5.0
PEG 1500	2.0
알란토인	0.1
DL-판테놀	0.3
EDTA-2Na	0.02
히드록시에틸 셀룰로오스	0.1
소듐히알루로네이트	8.0
카르복시비닐폴리머	0.2
트리에탄올아민	0.18
옥틸도데세스-16	0.4
에탄올	6.0
향, 방부제, 색소	적량
정제수	잔량
합계	100

서열목록 전자파일 첨부

Claims

다음 일반식 1의 펩타이드:
일반식 1
X_aa1-X_aa2-Pro-Cys-X_aa3-X_aa4-X_aa5-Ser-X_aa6
상기 일반식에서, X_aa1은 Met 또는 Tyr이고, X_aa2는 Ile 또는 Leu이며, X_aa3은 Tyr 또는 Phe이고, X_aa4는 Ile 또는 Val이며, X_aa5는 Ser 또는 Thr이고, X_aa6은 Pro 또는 Lys이다.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열목록 제2서열 내지 제3서열로 구성된 군으로부터 선택되는 펩타이드인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 세포 성장 촉진능을 갖는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 산화스트레스(oxidative stress)에 의한 세포 사멸을 억제 하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP) 2의 활성을 억제 하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 콜라겐 분해를 억제하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 히알루론산 분해를 억제하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 멜라노좀 이동(melanosome transfer)을 억제하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 지방세포(adipocyte cell)에서의 지방(lipid) 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 혈관생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
서열목록 제1서열 내지 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부상태(skin conditions) 개선용 화장료 조성물로, 상기 피부 상태의 개선은 주름개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지, 피부보습 개선, 상처 제거, 피부재생 또는 미백인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
삭제
서열목록 제1서열 내지 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부상태(skin conditions) 개선용 약제학적 조성물로, 상기 피부 상태의 개선은 상처 제거 또는 피부재생인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
삭제
(a) 서열목록 제1서열 내지 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드; 및 (b) 히알루론산을 포함하는 피부 필러(filler).
서열목록 제1서열 내지 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
서열목록 제1서열 내지 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
서열목록 제1서열 내지 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
서열목록 제1서열 내지 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 MMP-활성 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로서, 상기 MMP-활성 관련 질환은 관절염, 당뇨병성 망막증, 비대성 반흔, 건선, 점막 및 상피 조직의 궤양, 자가면역에 의한 염증, 기저막의 분해와 관련된 질병인 낭창, 자가 면역성 신경장애, 근세포 파괴, 녹내장 또는 과다한 혈관신생인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.