JP2000281645A - クロルフェナピルのハプテン化合物、抗体及び測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、クロルフェナピルのハプテン化合
物、抗体及び測定方法を提供することを目的とする。 【解決手段】 本発明のハプテン化合物は、クロルフェ
ナピル又はその部分にスペーサーアーム及び結合のため
の官能基を共有結合させた構造を有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、４−ブロモ−２−
（４−クロロフェニル）−１−エトキシメチル−５−ト
リフルオロメチルピロール−３−カルボニトリル（以
下、本明細書中「クロルフェナピル」と言う）のハプテ
ン化合物、抗原、抗体及びそのフラグメントに関する。

【０００２】本発明はさらに、前記抗原、抗体及びその
フラグメントを用いた免疫学的測定方法に関する。

【０００３】

【従来の技術】クロルフェナピルは、以下の式（２）：

【０００４】

【化３】

【０００５】で表される構造を有する、フェニルピロー
ル系の殺虫剤である。より詳細には、クロルフェナピル
は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｕｍａｎｕｓの産生
するジオキサピロロマイシンを基に合成された、ピロー
ル環を有する新規骨格の化合物である。ｓｏｕｔｈｅｒ
ｎ ａｒｍｙｗｏｒｍ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｒｉ
ｄａｎｉａ）、ｔｏｂａｃｃｏ ｂｕｄｗｏｒｍ（Ｈｅ
ｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）などの鱗翅目害
虫、ｗｅｓｔｅｒｎ ｐｏｔａｔｏ ｌｅａｆｈｏｐｐ
ｅｒ（Ｅｍｐｏａｓｃａ ａｂｒｕｐｔａ）などの半翅
目害虫、ミナミキイロアザミウマなどのアザミウマ目害
虫、ナミハダニなどのＴｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ属のハダ
ニ、サビダニ類、ホコリダニ類といった幅広いスペクト
ラムの害虫やハダニ類に活性を有する。ワタ、野菜、果
樹におけるこれら害虫に対しては１２５−５００ｇ
ａ．ｉ．／ｈａで有効である。一方、ハダニの天敵であ
る捕食性ダニの１種（Ｍｅｔａｓｅｉｕｌｕｓ ｏｃｃ
ｉｄｅｎｔａｌｉｓ）に対する殺虫活性はハダニに対す
る殺虫活性と比較してかなり低く、実用上の悪影響は少
ないと考えられている。

【０００６】クロルフェナピルは経皮活性と経***性を
有するが、少なくとも鱗翅目害虫に対しては経***性の
方が強い。また、速効性は有機リン剤やピレスロイド剤
に比べ劣るが、適度の残効性を持つ。ピレスロイド剤に
抵抗性であるｓｏｙｂｅａｎｌｏｏｐｅｒ（Ｐｓｅｕｄ
ｏｐｌｕｓｉａ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）やｔｏｂａｃｃ
ｏ ｂｕｄｗｏｒｍに対して感受性系統と変わらぬ活性
を示すなど、既存剤との交差抵抗性はみられない。日本
においてもコナガ、ハスモンヨトウ、シロイチモジヨト
ウ、ミナミキイロアザミウマ、ナミハダニ、カンザワハ
ダニなどの難防除害虫に高い防除効果を示すことが知ら
れている。作用機作はミトコンドリアにおける酸化的リ
ン酸化の脱共役である（新農薬の開発展望 第７１頁お
よび第７６頁−第７８頁、 １９９７年１１月２８日
（株）シーエムシー 発行）。

【０００７】近年、土壌、水、大気等の環境中での残留
農薬や、最近特に増加してきた輸入農産物のポストハー
ベスト農薬等の残留に大きな社会的関心が寄せられてい
る。クロルフェナピルについては、環境庁による農薬登
録保留基準値が、例えば、みかんで０．５ｐｐｍ、第二
大粒果実類で１ｐｐｍ、小粒果実類で０．２ｐｐｍ、第
二果菜類で１ｐｐｍ、第一葉菜類で１ｐｐｍ、第二葉菜
類で３ｐｐｍ、根・茎類で０．１ｐｐｍ、てんさい０．
５ｐｐｍ、茶５０ｐｐｍ等定められている（改訂３版
農薬登録保留基準ハンドブック 第２５８頁−第２６０
頁、１９９８年９月２５日、化学工業日報社 発行）。
よって、環境や食品に関する安全確保のためには、これ
らに含有される、クロルフェナピルの量を迅速かつ正確
に測定することが必要である。

【０００８】従来、例えば農作物中のクロルフェナピル
は、果実、野菜、茶等から抽出し、精製した後、ガスク
ロマトグラフィー（ＧＣ）により分析されてきた。即
ち、例えば、試料をアセトンで抽出し、ヘキサンに転溶
した後、ヘキサン−ジエチルエーテルを溶媒として用い
たケイ酸マグネシウムカラムクロマトグラフィーで精製
後、ＧＣで測定する方法等が採用されている。これらの
方法は、試料の調製が煩雑で多大の手順と時間を必要と
し、分析に熟練を要すること、並びに、測定装置や設備
等に高額の費用を必要とする等の問題点がある。クロル
フェナピルの測定は短時間で膨大な数の試料の分析結果
を出す必要があり、精度面だけでなく、簡便性、迅速性
及び経済性をも具備した新規測定方法が要求されてきて
いる。

【０００９】免疫学的測定方法は、抗体が抗原を特異的
に認識する抗原抗体反応に基づいて抗原や抗体の検出を
行う方法であり、その優れた精度、簡便性、迅速性、経
済性から近年注目を集めてきている。免疫学的測定方法
においては検出方法として非常に多種の標識、例えば、
酵素、放射性トレーサー、化学発光あるいは蛍光物質、
金属原子、ゾル、ラテックス及びバクテリオファージが
適用されてきた。

【００１０】免疫学的測定方法の中でも、酵素を使用す
る酵素免疫測定法（ＥＩＡ）は経済性・利便性から特に
優れたものとして広く使用されるに至っている。酵素免
疫測定法についての優れた論評が、Ｔｉｊｓｓｅｎ
Ｐ，“Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ
ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ” ｉｎＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｍｓｔｅｒ
ｄａｍ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｏｘｆｏｒｄ ＩＳＢＮ
０−７２０４−４２００−１（１９９０）に記載され
ている。

【００１１】一般に、分子量が大きな分子については、
それ以上修飾することなく動物に接種することにより、
適当な免疫反応を惹起し、抗原を認識する抗体を産生さ
せることができる。しかし、クロルフェナピルのような
低分子化合物は通常動物に接種したとき免疫応答を引き
出すことができない。これらの分子は免疫原性を有する
高分子化合物に結合させることによって初めて一団のエ
ピトープとして行動し、Ｔ細胞受容体の存在下で免疫応
答を起こし、その結果、一群のＢリンパ球により抗体が
産生される。このように高分子化合物と結合させて初め
て免疫原性を生じる分子を総称して「ハプテン」と言
う。

【００１２】しかし、低分子化合物を高分子化合物と結
合させたものを抗原としても、得られた抗体は望む分子
を認識しないか、あるいはごく低い親和性しかもたない
場合がしばしばある。そのため、一般に低分子化合物そ
のものではなく、結合に利用できる官能基と共にスペー
サーアーム（結合手）を導入したものをハプテンとして
使用する必要がある。しかしその場合に、結合手／官能
基の配置、結合手の大きさ等の全ての問題を考慮して導
入が適切に行われたものを使用しないと、好ましい抗体
は得られない。適切な導入は個々の分子に応じて工夫し
なければならない。

【００１３】クロルフェナピルについては、その必要性
が非常に高かったにもかかわらず、適切な抗体はもとよ
り、そのような抗体を作製するためのハプテンも本発明
前には得られていなかった。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、クロルフェ
ナピルに反応する新規な抗体若しくはそのフラグメン
ト、及びその作製方法を提供することを目的とする。
尚、本明細書において抗体の「フラグメント」とは、抗
原と結合可能な抗体の一部分、例えばＦ_ab断片等を意味
する。

【００１５】本発明はその一態様において、クロルフェ
ナピルに反応性を有するモノクローナル抗体を提供す
る。本発明は、また、クロルフェナピルに反応性を有す
る新規な抗体を作製するための抗原を構成するハプテン
化合物を提供することを目的とする。

【００１６】本発明は、さらに、クロルフェナピルハプ
テンと高分子化合物との結合体を提供することを目的と
する。本発明は、さらにまた、前記抗体又はそのフラグ
メントを産生するハイブリドーマを提供することを目的
とする。

【００１７】本発明は、さらに、前記抗体若しくはその
フラグメント及び／又は前記クロルフェナピルハプテン
と高分子化合物との結合体を使用することを含む、クロ
ルフェナピルの免疫学的測定方法を提供することを目的
とする。

【００１８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を重ねた結果、クロルフェナピル又はその部分にスペー
サーアーム及び高分子化合物との結合に利用できる官能
基を導入した、クロルフェナピルの誘導体をハプテンと
して使用することにより、前記化合物に反応性を有する
抗体を得ることに成功し、本発明の完成に至った。

【００１９】本発明の対象となるクロルフェナピルは、
以下の式（２）：

【００２０】

【化４】

【００２１】で表される構造を有する化合物である。本
発明の抗体は、例えば、クロルフェナピルの部分にスペ
ーサーアーム及び結合に利用できる官能基を導入した誘
導体をハプテンとして適当な高分子化合物と結合させた
ものを抗原として用いることによって得ることができ
る。例えば、以下の式（１）：

【００２２】

【化５】

【００２３】［式（１）中、Ａ¹ないしＡ³は、同一であ
っても異なっていてもよく、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩか
らなるハロゲン原子、ＣＮ、ＣＦ₃、ならびに炭素数１
ないし３のアルキル基からなるグループから選択され；
Ａ⁴は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩから選択されるハロゲン
原子であり；そしてｍは、１ないし１０の整数である］
で表される構造を有する化合物を、抗体作製のためのハ
プテンとして使用する。

【００２４】式（１）中、好ましくは、Ａ¹がＣＮであ
り、Ａ²がＢｒであり、Ａ³がＣＦ₃であり、Ａ⁴がＣｌで
ある。好ましくは、ｍは５である。本発明は、前記ハプ
テン化合物、ハプテン化合物と高分子化合物との結合
体、クロルフェナピルに反応する抗体及びその作製方
法、並びに該ハプテン化合物又は該抗体を用いるクロル
フェナピルの免疫学的測定方法に関する。クロルフェナピルハプテンの作製 式（１）で表されるクロルフェナピルハプテンは、公知
の方法に従って製造することができる。限定するわけで
はないが、例えば以下のような方法を用いることができ
る。

【００２５】例えば、Ａ²がＦ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩから
選択されるハロゲン原子の場合、まず、以下の式（Ｚ
１）：

【００２６】

【化６】

【００２７】［式（Ｚ１）中、Ａ¹、Ａ³およびＡ⁴は先
に定義した通りである］で表される構造を有する化合物
に、有機溶媒中、縮合剤の存在下、以下の式（Ｚ２）：

【００２８】

【化７】

【００２９】［式（Ｚ２）中、Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又
はＩから選択されるハロゲン原子であり；Ｐは、カルボ
キシル基の保護基であり；そしてｍは先に定義した通り
である］で表される構造を有する化合物を反応させて、
以下の式（Ｚ３）：

【００３０】

【化８】

【００３１】［式（Ｚ３）中、Ａ¹、Ａ³、Ａ⁴、Ｐおよ
びｍは先に定義した通りである］で表される構造を有す
る化合物を合成する。式（Ｚ１）化合物は、公知の方
法、例えば特開平１−１３５７０１の実施例５６および
５７の記載に準じて合成することができる。

【００３２】Ｐのカルボキシル基の保護基は公知のもの
でよく、具体例として、例えば、メチル基、エチル基、
ｔｅｒｔ−ブチル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジ
ル基、３，４−ジメトキシベンジル基、トリクロロエチ
ル基、トリメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチル
シリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基、トリ
エチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、トリメチ
ルシリルエチル基等を挙げることができる。

【００３３】式（Ｚ３）の化合物合成のための有機溶媒
としては、例えば、Ｎ．Ｎ−ジメチルホルムアミド、ベ
ンゼン、トルエン、キシレン、クロロホルム、四塩化炭
素、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトン、アセ
トニトリル、ジメチルスルホキシド等を用いることがで
きる。縮合剤としては、水素化ナトリウム、ナトリウ
ム、ナトリウムメチラート、ナトリウムエチラート等を
用いることができる。

【００３４】反応は、０℃から溶媒の沸点の温度、好ま
しくは８０℃から１５０℃で、１０分から１５時間、好
ましくは、１時間から５時間行う 次いで、式（Ｚ３）の化合物からＰで表されるカルボキ
シル基の保護基を除去することにより、以下の式（Ｚ
４）：

【００３５】

【化９】

【００３６】［式（Ｚ４）中、Ａ¹、Ａ³、Ａ⁴およびｍ
は先に定義した通りである］で表される構造を有する化
合物を合成する。カルボキシル基の保護基の除去は、ア
ルカリ加水分解、酸加水分解等の公知の方法で行うこと
ができる。

【００３７】すなわち、アルカリ加水分解の場合は、式
（Ｚ３）の化合物を、好ましくはメタノール、エタノー
ル、テトラヒドロフラン、エチレングリコール等の有機
溶媒に溶解し、次いで炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリ
ウム、炭酸カリウム、水酸化リチウム、水酸化ナトリウ
ム又は水酸化カリウム等の水溶液を加えて、０℃から溶
媒の沸点、好ましくは０℃から５０℃で、５分から１０
時間、好ましくは３０分から２時間撹拌反応させること
により式（Ｚ４）の化合物を得ることができる。

【００３８】また、酸加水分解の場合は、式（Ｚ３）の
化合物を、好ましくは酢酸、蟻酸、ベンゼン、ジクロロ
メタン、１，２−ジクロロエタン等の有機溶媒に溶解
し、次いで塩酸、硫酸、三フッ化ホウ素ジエチルエーテ
ル錯体、トリフルオロ酢酸、トリフルオロメタンスルホ
ン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等を加えて、０℃から溶
媒の沸点、好ましくは０℃から５０℃で、５分から１０
時間、好ましくは１時間から５時間撹拌反応させること
により式（Ｚ４）の化合物を得ることができる。

【００３９】更に、Ｐがベンジル基の場合、除去は水素
による加水素分解によっても行うことができる。更にま
た、Ｐがシリル原子を含む基の場合、脱保護はテトラ−
ｎ−ブチルアンモニウムフルオリド、ピリジニウムフル
オリド等のフッ素アニオンを発生させる試薬によっても
行うことができる。

【００４０】さらに、式（Ｚ４）の化合物に、有機溶媒
中又は無溶媒で、塩素、臭素、塩化スリフリル、Ｎ−ブ
ロモこはく酸イミド等のハロゲン化剤を反応させること
により、Ａ²がＣｌ又はＢｒから選択されるハロゲン原
子である、式（１）の化合物を得ることができる。

【００４１】有機溶媒としては、酢酸、四塩化炭素、ク
ロロホルム、ジオキサン、テトラヒドロフラン等を用い
ることができ、鉄粉や塩化アルミニウム等の触媒を用い
ることにより、反応を促進することができる。反応は、
０℃から溶媒の沸点の温度、好ましくは室温から１５０
℃で、１０分から５０時間、好ましくは、５時間から２
０時間行う。

【００４２】Ａ²がハロゲン原子以外の式（１）の化合
物も、同様に公知の方法を用いて合成することができ
る。上述したような製造方法によって得られた化合物
を、必要に応じシリカゲルクロマトグラフィー又は再結
晶操作等を行うことにより、さらに高純度の精製品とす
ることができる。

【００４３】以下、本発明の抗原、抗体の作製、及び免
疫化学的測定法について説明する。尚、これらの調製は
公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究
法（日本生化学会編）等に記載の方法に従って行うこと
ができる。クロルフェナピルハプテンと高分子化合物との結合体の
作製 上述のように合成されたクロルフェナピルハプテンを適
当な高分子化合物に結合させてから免疫用抗原若しくは
固相化用抗原として使用する。

【００４４】好ましい高分子化合物の例としては、スカ
シガイへモシアニン（以下、「ＫＬＨ」と言う）、卵白
アルブミン（以下、「ＯＶＡ」と言う）、ウシ血清アル
ブミン（以下、「ＢＳＡ」と言う）、ウサギ血清アルブ
ミン（以下、「ＲＳＡ」と言う）などがある。ＫＬＨ及
びＢＳＡが好ましい。

【００４５】クロルフェナピルハプテンと高分子化合物
との結合は、例えば、活性化エステル法（Ａ．Ｅ．ＫＡ
ＲＵ ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈ
ｅｍ．４２ ３０１−３０９（１９９４））、又は混合
酸無水物法（Ｂ．Ｆ．Ｅｒｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３４ １０９０‐１
０９４（１９５４））等の公知の方法によって行うこと
ができる。

【００４６】活性化エステル法は、一般に以下のように
行うことができる。まず、ハプテン化合物を有機溶媒に
溶解し、カップリング剤の存在下にてＮ−ヒドロキシこ
はく酸イミドと反応させ、Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミ
ド活性化エステルを生成させる。

【００４７】カップリング剤としては、縮合反応に慣用
されている通常のカップリング剤を使用でき、例えば、
ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダ
ゾール、水溶性カルボジイミド等が含まれる。有機溶媒
としては、例えば、ジメチルスルホキシド（以下、「Ｄ
ＭＳＯ」と言う）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（以
下、「ＤＭＦ」と言う）、ジオキサン等が使用できる。
反応に使用するハプテン化合物とＮ−ヒドロキシこはく
酸イミドのモル比は好ましくは１：１０から１０：１、
より好ましくは１：１から１：１０、最も好ましくは
１：１である。反応温度は、０℃から１００℃、好まし
くは５℃から５０℃、より好ましくは２２℃から２７℃
で、反応時間は５分から２４時間、好ましくは３０分か
ら６時間、より好ましくは１時間から２時間である。

【００４８】カップリング反応後、反応液を高分子化合
物を溶解した溶液に加え反応させると、例えば高分子化
合物が遊離のアミノ基を有する場合、当該アミノ基とハ
プテン化合物のカルボキシル基の間に酸アミド結合が生
成される。反応温度は、０℃から６０℃、好ましくは５
℃から４０℃、反応時間は５分から２４時間、好ましく
は１時間から１６時間、より好ましくは１時間から２時
間である。反応物を、透析、脱塩カラム等によって精製
して、クロルフェナピルハプテンと高分子化合物との結
合体を得ることができる。

【００４９】一方、混合酸無水物法において用いられる
混合酸無水物は、カルボン酸とハロ蟻酸エステルとの反
応により得られ、これを高分子化合物と反応させること
により目的とするハプテン−高分子化合物結合体が製造
される。この反応は塩基性化合物の存在下に行われる。
塩基性化合物としては、例えば、トリブチルアミン、ト
リエチルアミン、トリメチルアミン、Ｎ−メチルモルホ
リン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、ＤＢＮ、
ＤＢＵ、ＤＡＢＣＯ等の有機塩基、炭酸カリウム、炭酸
ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム等
の無機塩基等が挙げられる。該反応は、通常マイナス２
０℃から１５０℃、好ましくは０℃から１００℃におい
て行われ、反応時間は５分から１０時間、好ましくは５
分から２時間である。得られた混合酸無水物と高分子化
合物との反応は、通常マイナス２０℃から１００℃、好
ましくは０℃から５０℃において行われ、反応時間は５
分から１０時間、好ましくは５分から５時間である。混
合酸無水物法は一般に溶媒中で行われる。溶媒として
は、混合酸無水物法に慣用されているいずれの溶媒も使
用可能であり、具体的にはジオキサン、ジエチルエーテ
ル、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン等のエーテ
ル類、ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン
等のハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トルエン、キシ
レン等の芳香族炭化水素類、酢酸メチル、酢酸エチル等
のエステル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチ
ルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸トリアミド等の非
プロトン性極性溶媒等が挙げられる。混合酸無水物法に
おいて使用されるハロ蟻酸エステルとしては、例えばク
ロロ蟻酸メチル、ブロモ蟻酸メチル、クロロ蟻酸エチ
ル、ブロモ蟻酸エチル、クロロ蟻酸イソブチル等が挙げ
られる。当該方法におけるハプテンとハロ蟻酸エステル
と高分子化合物の使用割合は、広い範囲から適宜選択さ
れ得る。

【００５０】また、上記と同様の方法により、酵素等の
標識物質をクロルフェナピルハプテンに結合させたもの
を、免疫学的測定方法において使用することができる。
標識物質としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下
「ＨＲＰ」と言う）、アルカリフォスファターゼ等の酵
素、フルオレセインイソシアネート、ローダミン等の蛍
光物質、³²Ｐ、¹²⁵Ｉ等の放射性物質、化学発光物質な
どがある。ポリクローナル抗体の作製 クロルフェナピルハプテンと高分子化合物との結合体を
使用して、慣用化された方法により本発明のポリクロー
ナル抗体を作製することができる。例えば、クロルフェ
ナピルハプテン／ＢＳＡ結合体をリン酸ナトリウム緩衝
液（以下、「ＰＢＳ」と言う）に溶解し、フロイント完
全アジュバント又は不完全アジュバント、あるいはミョ
ウバン等の補助剤と混合したものを、免疫用抗原として
動物に免疫することによって得ることができる。免疫さ
れる動物としては当該分野で常用されるものをいずれも
使用できるが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤ
ギ、ウマ等を挙げることができる。

【００５１】免疫の際の投与法は、皮下注射、腹腔内注
射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射のいずれでもよ
いが、皮下注射又は腹腔内注射が好ましい。免疫は１回
又は適当な間隔で、好ましくは１週間ないし５週間の問
隔で複数回行うことができる。

【００５２】免疫した動物から血液を採取し、そこから
分離した血清を用い、クロルフェナピルと反応するポリ
クローナル抗体の存在を評価することができる。本発明
においてクロルフェナピルハプテンと高分子化合物との
結合体を免疫用抗原として得られた抗血清は、後述する
間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法において少なくとも約１００
０ｎｇ／ｍｌの濃度でクロルフェナピルと反応できる
（実施例４）。モノクローナル抗体の作製 クロルフェナピルハプテンと高分子化合物との結合体を
使用して、公知の方法により本発明のモノクローナル抗
体を作製することができる。

【００５３】モノクローナル抗体の製造にあたっては、
少なくとも下記のような作業工程が必要である。 （ａ）免疫用抗原として使用するクロルフェナピルハプ
テンと高分子化合物との結合体の作製 （ｂ）動物への免疫 （ｃ）血液の採取、アッセイ、及び抗体産生細胞の調製 （ｄ）ミエローマ細胞の調製 （ｅ）抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合とハ
イブリドーマの選択的培養 （ｆ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスク
リーニングと細胞クローニング （ｇ）ハイブリドーマの培養又は動物へのハイブリドー
マの移植によるモノクローナル抗体の調製 （ｈ）調製されたモノクローナル抗体の反応性の測定等 モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製す
るための常法は、例えば、ハイブリドーマ テクニック
ス（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ），コ
ールド スプリング ハーバー ラボラトリーズ（Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ，１９８０年版）、細胞組織化学（山下修二ら、日
本組織細胞化学会編；学際企画、１９８６年）に記載さ
れている。

【００５４】以下、本発明のクロルフェナピルに対する
モノクローナル抗体の作製方法を説明するが、これに制
限されないことは当業者によって明らかであろう。
（ａ）−（ｂ）の工程は、ポリクローナル抗体に関して
記述した方法とほぼ同様の方法によって行うことができ
る。

【００５５】（ｃ）の工程における抗体産生細胞はリン
パ球であり、これは一般には脾臓、胸腺、リンパ節、末
梢血液又はこれらの組み合わせから得ることができるが
脾細胞が最も一般的に用いられる。従って、最終免疫
後、抗体産生が確認されたマウスより抗体産生細胞が存
在する部位、例えば脾臓を摘出し、脾細胞を調製する。

【００５６】（ｄ）の工程に用いることのできるミエロ
ーマ細胞としては、例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来骨
髄腫細胞株のＰ３／Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）（Ｎａｔ
ｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５））、Ｐ３
／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）（Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｔｏｐｉｃｓ．ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎ
ｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１， １−７（１９８
７））、Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａｇ ４−１（ＮＳ−１）
（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１−５１９
（１９７６））、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／０）
（Ｎａｔｕｒｅ， ２７６，２６９−２７０（１９７
８））、ＦＯ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈ．，３５，
１−２１（１９８０））、ＭＰＣ−１１、Ｘ６３．６
５３、Ｓ１９４等の骨髄腫株化細胞、あるいはラット由
来の２１０．ＲＣＹ３．Ａｇ １．２．３．（Ｙ３）
（Ｎａｔｕｒｅ， ２７７，１３１−１３３，（１９７
９））等を使用できる。

【００５７】上述したミエローマ細胞をウシ胎児血清を
含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はイス
コフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で継代培養し、融
合当日に約１×１０⁶以上の細胞数を確保する。

【００５８】（ｅ）の工程の細胞融合は公知の方法、例
えばミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）らの方法（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７３，３
（１９８１））等に準じて行うことができる。現在最も
一般的に行われているのはポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）を用いる方法である。ＰＥＧ法については、例え
ば、細胞組織化学、山下修二ら（上述）に記載されてい
る。別の融合方法としては、電気処理（電気融合）によ
る方法を採用することもできる（大河内悦子ら、実験医
学 ５．１３１５−１９、１９８７）。その他の方法を
適宜採用することもできる。また、細胞の使用比率も公
知の方法と同様でよく、例えばミエローマ細胞に対して
脾細胞を３倍から１０倍程度用いればよい。

【００５９】脾細胞とミエローマ細胞とが融合し、抗体
分泌能及び増殖能を獲得したハイブリドーマ群の選択
は、例えば、ミエローマ細胞株としてヒポキサンチング
アニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損株を使用
した場合、例えば上述のＤＭＥＭやＩＭＤＭにヒポキサ
ンチン・アミノプテリン・チミジンを添加して調製した
ＨＡＴ培地の使用により行うことができる。

【００６０】（ｆ）の工程では、選択されたハイブリド
ーマ群を含む培養上清の一部をとり、例えば後述するＥ
ＬＩＳＡ法により、クロルフェナピルに対する抗体活性
を測定する。

【００６１】さらに、測定によりクロルフェナピルに反
応する抗体を産生することが判明したハイブリドーマの
細胞クローニングを行う。この細胞クローニング法とし
ては、限界希釈により１ウェルに１個のハイブリドーマ
が含まれるように希釈する方法「限界希釈法」；軟寒天
培地上に撒きコロニーをとる方法；マイクロマニピュレ
ーターによって１個の細胞を取り出す方法；セルソータ
ーによって１個の細胞を分離する「ソータークローン
法」等が挙げられる。限界希釈法が簡単であり、よく用
いられる。

【００６２】抗体価の認められたウェルについて、例え
ば限界希釈法によりクローニングを１−４回繰り返して
安定して抗体価の得られたものを、抗クロルフェナピル
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択す
る。ハイブリドーマを培養する培地としては、例えば、
ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ又はＩＭＤＭ等
が用いられる。ハイブリドーマの培養は、例えば二酸化
炭素濃度５−７％程度及び３７℃（１００％湿度の恒温
器中）で培養するのが好ましい。

【００６３】（ｇ）の工程で抗体を調製するための大量
培養は、フォローファイバー型の培養装置等によって行
われる。又は、同系統のマウス（例えば、上述のＢａｌ
ｂ／ｃ）あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内でハイブリ
ドーマを増殖させ、腹水液より抗体を調製することも可
能である。

【００６４】これらにより得られた培養上清液あるいは
腹水液を抗クロルフェナピルモノクローナル抗体として
使用することできるが、さらに透析、硫酸アンモニウム
による塩析、ゲル濾過、凍結乾燥等を行い、抗体画分を
集め精製することにより抗クロルフェナピルモノクロー
ナル抗体を得ることができる。さらに、精製が必要な場
合には、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフ
ィー（ＨＰＬＣ）などの慣用されている方法を組合わせ
ることにより実施できる。

【００６５】以上のようにして得られた抗クロルフェナ
ピルモノクローナル抗体は、例えば後述するＥＬＩＳＡ
法などの公知の方法を使用して、サブクラス、抗体価等
を決定することができる。抗体によるクロルフェナピルの測定 本発明で使用する抗体によるクロルフェナピルの測定法
としては、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、Ｅ
ＬＩＳＡ法（Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７０，４１９−４３９（１９
８０））、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、凝集
法、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）等の一般
に抗原の検出に使用されている種々の方法（「ハイブリ
ドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプラ
ニング発行、第３０頁−第５３頁、昭和５７年３月５
日）が挙げられる。感度、簡便性等の観点からＥＬＩＳ
Ａ法が汎用されている。

【００６６】クロルフェナピルの測定は、各種ＥＬＩＳ
Ａ法のうち例えば間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により、以
下のような手順により行うことができる。 （ａ）まず、固相化用抗原であるクロルフェナピルハプ
テンと高分子化合物との結合体を担体に固相化する。

【００６７】（ｂ）固相化用抗原が吸着していない固相
表面を抗原と無関係な物質、例えばタンパク質によりブ
ロッキングする。 （ｃ）これに各種濃度のクロルフェナピルを含む試料及
び抗体を加え、該抗体を前記固相化抗原及びクロルフェ
ナピルに競合的に反応させて、固相化抗原−抗体複合体
及び、クロルフェナピル−抗体複合体を生成させる。

【００６８】（ｄ）固相化抗原−抗体複合体の量を測定
することにより、予め作成した検量線から試料中のクロ
ルフェナピルの量を決定することができる。 （ａ）工程において、固相化用抗原を固相化する担体と
しては、特別な制限はなく、ＥＬＩＳＡ法において常用
されるものをいずれも使用することができる。例えば、
ポリスチレン製の９６ウェルのマイクロタイタープレー
トが挙げられる。

【００６９】固相化用抗原を担体に固相化させるには、
例えば、固相化用抗原を含む緩衝液を担体上に載せ、イ
ンキュベーションすればよい。緩衝液としては公知のも
のが使用でき、例えば、リン酸緩衝液を挙げることがで
きる。緩衝液中の抗原の濃度は広い範囲から選択できる
が、通常０．０１μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌ程
度、好ましくは０．０５μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌ
が適している。また、担体として９６ウェルのマイクロ
タイタープレートを使用する場合には、３００μｌ／ウ
ェル以下で２０μｌ／ウェルから１５０μｌ／ウェル程
度が望ましい。更に、インキュベーションの条件にも特
に制限はないが、通常４℃程度で一晩インキュベーショ
ンが適している。

【００７０】なお、担体に固相化させる抗原としては、
抗体を作製したクロルフェナピルハプテンと高分子化合
物との結合体自体のみならず、式（１）で表される他の
ハプテンと高分子化合物との結合体を固相化抗原として
使用することも可能である。例えば、式（１）において
Ａ¹、Ａ²、Ａ³、Ａ⁴又はｍが抗体作製用と相違する化合
物を、固相化抗原として使用することもできる。さら
に、式（１）に含まれない他のクロルフェナピル類似化
合物を固相化抗原として使用することも可能である。

【００７１】（ｂ）工程のブロッキングは、抗原（クロ
ルフェナピルハプテンと高分子化合物との結合体）を固
相化した担体において、クロルフェナピルハプテン部分
以外に後で添加する抗体が吸着され得る部分が存在する
場合があり、もっぱらそれを防ぐ目的で行われる。ブロ
ッキング剤として、例えば、ＢＳＡやスキムミルク溶液
を使用できる。あるいは、ブロックエース（「Ｂｌｏｃ
ｋ‐Ａｃｅ」、大日本製薬社製、コードＮｏ．ＵＫ−２
５Ｂ）等のブロッキング剤として市販されているものを
使用することもできる。具体的には、限定されるわけで
はないが、例えば抗原を固相化した部分にブロッキング
剤を含む緩衝液［例えば、１％ＢＳＡと６０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌを添加した８５ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．
０）］を適量加え、約４℃で、１時間ないし５時間イン
キュベーションした後、洗浄液で洗浄することにより行
われる。洗浄液としては特に制限はないが、例えば、Ｐ
ＢＳを用いることができる。

【００７２】次いで（ｃ）工程において、クロルフェナ
ピルを含む試料と抗体を固相化抗原と接触させ、抗体を
固相化抗原及びクロルフェナピルと反応させることによ
り、固相化抗原−抗体複合体及びクロルフェナピル−抗
体複合体が生成する。

【００７３】この際、抗体としては、第一抗体として本
願発明のクロルフェナピルに対する抗体を加え、更に第
二抗体として標識酵素を結合した第一抗体に対する抗体
を順次加えて反応させる。

【００７４】第一抗体は緩衝液に溶解して添加する。限
定されるわけではないが、反応は、１０℃から４０℃、
好ましくは約２５℃で約１時間行えばよい。反応終了
後、緩衝液で担体を洗浄し、固相化抗原に結合しなかっ
た第一抗体を除去する。洗浄液としては、例えば、ＰＢ
Ｓを用いることができる。

【００７５】次いで第二抗体を添加する。例えば第一抗
体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素
（例えば、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファター
ゼ等）を結合した抗マウス−ヤギ抗体を用いるのが適当
である。担体に結合した第一抗体に好ましくは最終吸光
度が４以下、より好ましくは０．５−３．０となるよう
に希釈した第二抗体を反応させるのが望ましい。希釈に
は緩衝液を用いる。限定されるわけではないが、反応は
室温で約１時間行い、反応後、緩衝液で洗浄する。以上
の反応により、第二抗体が第一抗体に結合する。また、
標識した第一抗体を用いてもよく、その場合、第二抗体
は不要である。

【００７６】次いで（ｄ）工程において担体に結合した
第二抗体の標識物質と反応する発色基質溶液を加え、吸
光度を測定することによって検量線からクロルフェナピ
ルの量を算出することができる。

【００７７】第二抗体に結合する酵素としてペルオキシ
ダーゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素、並び
に３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン又はｏ
−フェニレンジアミン（以下、「ＯＰＤ」と言う）を含
む発色基質溶液を使用することができる。限定されるわ
けではないが、発色基質溶液を加え室温で約１０分間反
応させた後、１Ｎの硫酸を加えることにより酵素反応を
停止させる。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジ
ジンを使用する場合、４５０ｎｍの吸光度を測定する。
ＯＰＤを使用する場合、４９２ｎｍの吸光度を測定す
る。一方、第二抗体に結合する酵素としてアルカリホス
ファターゼを使用する場合には、例えばｐ−ニトロフェ
ニルリン酸を基質として発色させ、２ＮのＮａＯＨを加
えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定する
方法が適している。

【００７８】クロルフェナピルを添加しない反応溶液の
吸光度に対して、それらを添加して抗体と反応させた溶
液の吸光度の減少率を阻害率として計算する。既知の濃
度のクロルフェナピルを添加した反応液の阻害率により
予め作成しておいた検量線を用いて、試料中のクロルフ
ェナピルの濃度を算出できる。

【００７９】あるいはクロルフェナピルの測定は、例え
ば以下に述べるような本発明のモノクローナル抗体を用
いた直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によって行うこともでき
る。 （ａ）まず、本発明のモノクローナル抗体を、担体に固
相化する。

【００８０】（ｂ）抗体が固相化されていない担体表面
を抗原と無関係な物質、例えばタンパク質により、ブロ
ッキングする。 （ｃ）上記工程とは別に、各種濃度のクロルフェナピル
を含む試料に、クロルフェナピルハプテンと酵素を結合
させた酵素結合ハプテンを加えた混合物を調製する。

【００８１】（ｄ）上記混合物を上記抗体固相化担体と
反応させる。 （ｅ）固相化抗体−酵素結合ハプテン複合体の量を測定
することにより、あらかじめ作成した検量線から試料中
のクロルフェナピルの量を決定する。

【００８２】（ａ）工程においてモノクローナル抗体を
固相化する担体としては、特別な制限はなくＥＬＩＳＡ
法において常用されるものを用いることができ、例えば
９６ウェルのマイクロタイタープレートが挙げられる。
モノクローナル抗体の固相化は、例えばモノクローナル
抗体を含む緩衝液を担体上にのせ、インキュベートする
ことによって行える。緩衝液の組成・濃度は前述の間接
競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを採用できる。

【００８３】（ｂ）工程のブロッキングは、抗体を固相
化した担体において、後に添加する試料中のクロルフェ
ナピル並びに酵素結合ハプテンが、抗原抗体反応とは無
関係に吸着される部分が存在する場合があるので、それ
を防ぐ目的で行う。ブロッキング剤及びその方法は、前
述の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを使用でき
る。

【００８４】（ｃ）工程において用いる酵素結合ハプテ
ンの調製は、クロルフェナピルハプテンを酵素に結合す
る方法であれば特に制限なく、いかなる方法で行っても
よい。例えば、前述した活性化エステル法を採用するこ
とができる。調製した酵素結合ハプテンは、クロルフェ
ナピルを含む試料と混合する。

【００８５】なお、酵素等の標識物質に結合させるハプ
テンとしては、間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法における固相
化抗原の場合と同様に、抗体作製に使用したクロルフェ
ナピルハプテン自体のみならず、式（１）で表される他
のハプテンと高分子化合物との結合体を標識競合用抗原
として使用することも可能である。例えば、式（１）に
おいてＡ¹、Ａ²、Ａ³、Ａ⁴又はｍが抗体作製用と相違す
る化合物を、標識競合用抗原として使用することもでき
る。さらに、式（１）に含まれない他のクロルフェナピ
ル類似化合物も、標識競合用抗原として使用可能であ
る。

【００８６】（ｄ）工程においてクロルフェナピルを含
む試料及び酵素結合ハプテンを抗体固相化担体に接触さ
せ、クロルフェナピルと酵素結合ハプテンとの競合阻害
反応により、これらと固相化担体との複合体が生成す
る。クロルフェナピルを含む試料は適当な緩衝液で希釈
して使用する。限定されるわけではないが、反応は例え
ば、室温でおよそ１時間行う。反応終了後、緩衝液で担
体を洗浄し、固相化抗体と結合しなかった酵素結合ハプ
テンを除去する。洗浄液は、例えばＰＢＳを使用するこ
とができる。

【００８７】さらに、（ｅ）工程において酵素結合ハプ
テンの酵素に反応する発色基質溶液を前述の間接競合阻
害ＥＬＩＳＡ法と同様に加え、吸光度を測定することに
より検量線からクロルフェナピルの量を算出することが
できる。

【００８８】本発明のモノクローナル抗体４２Ｅ−１−
１は、直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法において約０．００５
ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは０．０５
ｎｇ／ｍｌから１０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲でクロルフェ
ナピルと反応する（実施例６、図１）。

【００８９】さらに、前述したように直接競合阻害ＥＬ
ＩＳＡ法において抗体作製用と異なるハプテンを標識競
合用抗原として使用でき、その組み合わせによって直接
競合阻害ＥＬＩＳＡ法において固有の反応性を示す。本発明の抗体の交差反応性 上述した直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法又は間接競合阻害法
により、本発明のモノクローナル抗体の交差反応性を調
べることができる。以下、実施例によって本発明を具体
的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定す
るためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づ
いて容易に本発明に修飾、変更を加えることができ、そ
れらは本発明の技術的範囲に含まれる。

【００９０】

【実施例】実施例１ クロルフェナピルハプテンの合成

【００９１】

【化１０】

【００９２】６−［２−（４−クロロフェニル）−３−
シアノ−５−トリフルオロメチル−１−ピロリル］ヘキ
サン酸エチル（１）の合成 ２−（４−クロロフェニル）−３−シアノ−５−トリフ
ルオロメチルピロールは、特開平１−１３５７０１の実
施例５６および５７の記載に準じて、２−（４−クロロ
フェニル）グリシン及び無水トリフルオロ酢酸より合成
した。

【００９３】次いで、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド２
０ｍｌ中の２−（４−クロロフェニル）−３−シアノ−
５−トリフルオロメチルピロール１．４４ｇ（５．２ｍ
ｍｏｌ）の溶液に６０％水素化ナトリウム０．２２ｇ
（５．８ｍｍｏｌ）を室温下に徐々に加えた。１５分間
撹拌後、６−ブロモヘキサン酸エチル１．４０ｇ（６．
２ｍｍｏｌ）を加え、１４０℃で４時間撹拌した。反応
混合物を濃縮し、残渣に１５０ｍｌの酢酸エチルと５０
ｍｌの水を加え、分液した。酢酸エチル層を水洗し、無
水硫酸マグネシウムで乾燥後、濾過、濃縮した。残渣を
カラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル
＝５：１）で精製し、１．６０ｇ（収率７５％）の
（１）を得た。６−［２−（４−クロロフェニル）−３−シアノ−５−
トリフルオロメチル−１−ピロリル］ヘキサン酸（２）
の合成 エタノール２０ｍｌ中の６−［２−（４−クロロフェニ
ル）−３−シアノ−５−トリフルオロメチル−１−ピロ
リル］ヘキサン酸エチル（１）０．６３ｇ（１．５ｍｍ
ｏｌ）の溶液に、水１５ｍｌ中の水酸化ナトリウム０．
６ｇ（１５ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。室温で１時間撹
拌した。減圧下にエタノールを留去し、残渣を希塩酸で
酸性にし、酢酸エチル５０ｍｌで３回抽出した。酢酸エ
チル層を水洗し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濃縮
した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキ
サン：酢酸エチル＝３：１）で精製し０．２７ｇ（収率
４６％）の（２）を得た。６−［４−ブロモ−２−（４−クロロフェニル）−３−
シアノ−５−トリフルオロメチル−１−ピロリル］ヘキ
サン酸（３）の合成 酢酸１ｍｌ中の６−［２−（４−クロロフェニル）−３
−シアノ−５−トリフルオロメチル−１−ピロリル］ヘ
キサン酸（２）０．２３ｇ（０．６０ｍｍｏｌ）と鉄粉
１０ｍｇの溶液に撹拌下８０℃で臭素０．２９ｇ（１．
８ｍｍｏｌ）を徐々に加え、さらに８０℃で１５時間撹
拌した。反応混合物を濃縮し、残渣に水５ｍｌを加え、
酢酸エチル１５ｍｌで３回抽出した。酢酸エチル層を水
洗し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濃縮した。残渣
を分取用ＨＰＬＣ（ アセトニトリル：水＝７：３）で
精製し１７ｍｇ（収率６．０％）の（３）を得た。 融点：１１５−１１７℃ 上記クロルフェナピルハプテン（３）の¹Ｈ−ＮＭＲに
よる物性データ（ケミカルシフトδ）を以下に示す。

【００９４】

【表１】表１¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−Ｄ₆，４００ＭＨｚ） δ １．０５（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂）， １．２７（２Ｈ，
ｍ，ＣＨ₂），１．４５（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂）， ２．０
５（２Ｈ，ｔ，ＣＨ₂），３．９９（２Ｈ，ｔ，Ｃ
Ｈ₂）， ７．６７（４Ｈ，ｍ，４Ａｒ：Ｈ），１１．
９７（１Ｈ，ｓ，ＣＯＯＨ）実施例２ 免疫用抗原およびスクリーニング用抗原の作
製 免疫用抗原およびスクリーニング用抗原として、クロル
フェナピルハプテンとＢＳＡとの結合体を活性化エステ
ル法を用いて作製した。

【００９５】実施例１で作製したクロルフェナピルハプ
テン０．２ｍｍｏｌをＤＭＦ １．０ｍＬに溶解し、Ｎ
−ヒドロキシこはく酸イミド０．２ｍｍｏｌ及び１−エ
チル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイ
ミド０．２ｍｍｏｌを加え、室温で３．５時間撹拌し
た。反応後、１００００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清
と沈殿に分離した。

【００９６】一方、ＢＳＡ ５０ｍｇを１４５ｍＭ Ｎ
ａＣｌ−０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２：以下
「ＰＢＳ」と言う）５．０ｍｌに溶解し、ＤＭＦ １．
０５ｍｌを加えた溶液を調製しておき、この溶液に上記
の上清０．２５ｍｌを加え、４℃にて１６時間反応させ
た。反応後、蒸留水にて４℃で透析し、クロルフェナピ
ルとＢＳＡとの結合体（以下、「クロルフェナピルハプ
テン／ＢＳＡ結合体」と言う）を調製した。以降、免疫
用抗原として用いた。

【００９７】また、同様の方法を用いて、クロルフェナ
ピルハプテンとＲＳＡとの結合体（以下、「クロルフェ
ナピルハプテン／ＲＳＡ結合体」と言う）、および、ク
ロルフェナピルハプテンとＨＲＰとの結合体との結合体
（以下、「クロルフェナピルハプテン／ＨＲＰ結合体」
と言う）も作製した。実施例３ 免疫感作 免疫にはＢａｌｂ／ｃマウスを用いた。実施例２で作製
したクロルフェナピルハプテン／ＢＳＡ結合体１００μ
ｇをＰＢＳ ５０μｌに溶解し、等量のフロイント完全
アジュバンドと混合して、Ｂａｌｂ／ｃマウスの皮下に
接種した。さらに、４週間後にフロイント不完全アジュ
バンドを用いて前記と同様に調製した免疫用抗原を追加
免疫した。また、６週間目に１８０μｌのＰＢＳに溶解
したクロルフェナピルハプテン／ＢＳＡ結合体３０μｇ
をマウス尾静脈より追加免疫した。実施例４ 抗血清のクロルフェナピルに対する反応性 実施例３におけるマウス尾静脈への接種直前、採血した
抗血清を希釈調製して、以下に詳述する間接競合阻害Ｅ
ＬＩＳＡ法にてクロルフェナピルを測定し、抗血清を評
価した。

【００９８】免疫用抗原と同様に、実施例２で調製した
クロルフェナピルハプテン／ＲＳＡ結合体の溶液（０．
５μｇ／ｍＬ）を５０μｌ／ウェルの量で９６ウェルマ
イクロプレートにコーティングし（２５ｎｇ／５０μｌ
／ウェル）、４倍希釈したブロックエース（「Ｂｌｏｃ
ｋ Ａｃｅ」、雪印乳業社製、コードＮｏ．ＵＫ−２５
Ｂ）でブロッキングしてアッセイ用プレートを作製し
た。次いで、抗血清１００００倍希釈液と、各種濃度の
クロルフェナピルを含む２０％メタノール溶液とを等量
混合し、その５０μＬを各ウェルに入れ、室温で１時間
反応させた。

【００９９】ＰＢＳで洗浄した後に、１０倍希釈のブロ
ックエースを用いて２０００倍に希釈したペルオキシダ
ーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｔａｇｏ社製）を５
０μｌ／ウェルの量で加え、室温にて１時間反応させ
た。ＰＢＳで洗浄した後に、２ｍｇ／ｍＬのＯＰＤ及び
０．０２％の過酸化水素を含む０．１Ｍクエン酸−リン
酸緩衝液（ｐＨ５．０）を５０μｌ／ウェルの量で加
え、室温にて１０分間反応させて発色させた。

【０１００】次に、１Ｎ硫酸を５０μｌ／ウェルの量で
加えて反応を停止し、４９０ｎｍの吸光度を測定した。
結果の一例を表２に示す。

【０１０１】

【表２】

【０１０２】表２より、クロルフェナピル１０００ｎｇ
／ｍｌにおいて阻害反応が認められたことから、用いた
抗血清はクロルフェナピルに対して反応性があることが
確認された。実施例５ ハイブリドーマの作製 実施例３に続いて、血清中の抗クロルフェナピル抗体活
性が高くなったマウスの脾細胞と、ミエローマ細胞（Ｓ
ｐ２／０−Ａｇ１４）とを山下修二らの方法（組織細胞
化学：日本組織細胞化学会編：学際企画．１９８６年）
に従ってポリエチレングリコール法により融合し、培養
した。実施例４と同様の方法でコーティング及びブロッ
キングしたプレートに細胞の増殖が認められた培養上清
液をそれぞれ５０μＬ／ウェルの量で加え、室温にて１
時間反応させた。

【０１０３】ＰＢＳで洗浄した後、１０倍希釈のブロッ
クエースを用いて２０００倍に希釈したペルオキシダー
ゼ結合抗マウスＩｇＧヤギ抗体（Ｔａｇｏ社製）を５０
μｌ／ウェルの量で加え、室温にて１時間反応させた。
ＰＢＳで洗浄した後に、２ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ及び０．
０２％の過酸化水素を含む０．１Ｍ クエン酸−リン酸
緩衝液（ｐＨ５．０）を５０μｌ／ウェルの量で加え、
室温にて１０分間発色させた。

【０１０４】次に、１Ｎ硫酸を５０μｌ／ウェルの量で
加えて、反応を停止し、４９０ｎｍの吸光度を測定し、
反応性を示す細胞（ハイブリドーマ）を選抜した。次
に、各ウェルのクロルフェナピルとの反応性を実施例４
に記載した間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法で調べ、目的の抗
体を産生している細胞について限界希釈法によりクロー
ニングを行った。その結果、数株のハイブリドーマが抗
クロルフェナピル抗体を産生する細胞としてクローン化
された。そのうちの４２Ｅ１−１−１を平成１１年３月
１６日に、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７３１１で、工業
技術院生命工学工業技術研究所（〒３０５ー００４６
茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託した。実施例６ 直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるクロルフェ
ナピルの測定 実施例５で得られたハイブリドーマ４２Ｅ１−１−１を
マウスの腹腔に移植し、１０日ないし１５日後に得られ
た腹水を採取し、アフィニティークロマトグラフィーに
よりモノクローナル抗体４２Ｅ１−１−１を精製した。
（以降、モノクローナル抗体は、これらを産生するハイ
ブリドーマと同一の名称を用いる。）この４２Ｅ１−１
−１抗体を用いて、直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法にてクロ
ルフェナピルの量を測定した。

【０１０５】上記の４２Ｅ１−１−１抗体溶液（１０μ
ｇ／ｍｌ）を５０μｌ／ウェルの量で９６ウェルマイク
ロプレートに入れ、４℃で一晩静置してコーティング
し、さらに４倍希釈のブロックエース（雪印乳業社製）
でブロッキングを行い、アッセイ用のプレートを作製し
た。各濃度のクロルフェナピルを含む２０％メタノール
溶液及び実施例２で作製したクロルフェナピルハプテン
／ＨＲＰ結合体を含むＰＢＳ溶液の等量混合液を５０μ
ｌずつ各ウェルに入れ、２５℃で１．５時間反応させ
た。

【０１０６】反応後、ＰＢＳで洗浄した後、２ｍｇ／ｍ
ＬのＯＰＤ及び０．０２％の過酸化水素を含むクエン酸
−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を５０μＬずつ各ウェル
に入れ、室温で１０分間静置して発色反応を行った。

【０１０７】次に、１Ｎ硫酸を５０μＬずつ各ウェルに
加えて発色反応を停止させ、４９０ｎｍの吸光度を測定
した。この結果を図１に示した。この直接競合阻害ＥＬ
ＩＳＡ法を用いると、本発明のモノクローナル抗体４２
Ｅ１−１−１は、クロルフェナピルを０．００５ｎｇ／
ｍｌないし１００ｎｇ／ｍＬの範囲で測定することがで
きた。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明のモノクローナル抗体４２Ｅ１
−１−１の直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるクロルフェ
ナピルの測定を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ０７Ｋ 19/00 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ｃ０７Ｋ 19/00 15/00 Ｃ (72)発明者 面田 内記 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内 (72)発明者 渡辺 基之 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内 (72)発明者 渡邊 繁幸 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA53 DA02 GA03 GA18 HA15 4B064 AG27 CA20 CC24 DA11 DA13 DA16 4B065 AA91X AA92X AB05 AC14 BA08 BA24 CA25 CA46 4C069 AC06 AC07 AC08 BA01 BB08 BB12 BC01 BD09 4H045 AA11 AA20 AA30 CA42 DA76 DA86 EA50 FA50

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の式（１）： 【化１】 ［式（１）中、 Ａ¹ないしＡ³は、同一であっても異なっていてもよく、
   Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなるハロゲン原子、ＣＮ、
   ＣＦ₃、ならびに炭素数１ないし３のアルキル基からな
   るグループから選択され；Ａ⁴は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又は
   Ｉから選択されるハロゲン原子であり；そしてｍは、１
   ないし１０の整数である］で表される構造を有する化合
   物。
2. 【請求項２】式（１）において、Ａ¹がＣＮであり、Ａ²
   がＢｒであり、Ａ³がＣＦ₃であり、Ａ⁴がＣｌであり、
   そしてｍが５である、請求項１に記載の化合物。
3. 【請求項３】請求項１又は２に記載の化合物と高分子化
   合物又は標識物質との結合体。
4. 【請求項４】請求項１又は２に記載の化合物と高分子化
   合物を結合させることにより抗原を作製し、当該抗原を
   用いることにより、以下の式（２）： 【化２】 で表される構造を有する化合物に反応性を示す抗体を製
   造することを特徴とする、式（２）で表される構造を有
   する化合物に反応性を示す抗体又はそのフラグメントの
   製造方法。
5. 【請求項５】請求項３に記載の結合体を抗原として用い
   ることにより製造された、式（２）の化合物に反応性を
   示す抗体又はそのフラグメント。
6. 【請求項６】モノクローナル抗体である、請求項５に記
   載の抗体又はフラグメント。
7. 【請求項７】モノクローナル抗体４２Ｅ１−１−１であ
   る、請求項５若しくは６に記載の抗体又はフラグメン
   ト。
8. 【請求項８】請求項５ないし７のいずれか１項に記載の
   抗体又はフラグメントを産生するハイブリドーマ。
9. 【請求項９】寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７３１１で寄託
   されている、請求項８に記載のハイブリドーマ。
10. 【請求項１０】請求項５ないし７のいずれか１項に記載
    の抗体又はフラグメントを用いることを特徴とする、式
    （２）で表される化合物の免疫学的測定方法。
11. 【請求項１１】さらに、請求項１若しくは２に記載の化
    合物、又は請求項３に記載の結合体を用いることを含
    む、請求項１０に記載の免疫学的測定方法。