JP2000281645A - クロルフェナピルのハプテン化合物、抗体及び測定方法 - Google Patents
クロルフェナピルのハプテン化合物、抗体及び測定方法Info
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Abstract
物、抗体及び測定方法を提供することを目的とする。 【解決手段】 本発明のハプテン化合物は、クロルフェ
ナピル又はその部分にスペーサーアーム及び結合のため
の官能基を共有結合させた構造を有する。
Description
(4−クロロフェニル)−1−エトキシメチル−5−ト
リフルオロメチルピロール−3−カルボニトリル(以
下、本明細書中「クロルフェナピル」と言う)のハプテ
ン化合物、抗原、抗体及びそのフラグメントに関する。
フラグメントを用いた免疫学的測定方法に関する。
ル系の殺虫剤である。より詳細には、クロルフェナピル
は、Streptomyces fumanusの産生
するジオキサピロロマイシンを基に合成された、ピロー
ル環を有する新規骨格の化合物である。souther
n armyworm(Spodoptera eri
dania)、tobacco budworm(He
liothis virescens)などの鱗翅目害
虫、western potato leafhopp
er(Empoasca abrupta)などの半翅
目害虫、ミナミキイロアザミウマなどのアザミウマ目害
虫、ナミハダニなどのTetranychus属のハダ
ニ、サビダニ類、ホコリダニ類といった幅広いスペクト
ラムの害虫やハダニ類に活性を有する。ワタ、野菜、果
樹におけるこれら害虫に対しては125−500g
a.i./haで有効である。一方、ハダニの天敵であ
る捕食性ダニの1種(Metaseiulus occ
identalis)に対する殺虫活性はハダニに対す
る殺虫活性と比較してかなり低く、実用上の悪影響は少
ないと考えられている。
有するが、少なくとも鱗翅目害虫に対しては経***性の
方が強い。また、速効性は有機リン剤やピレスロイド剤
に比べ劣るが、適度の残効性を持つ。ピレスロイド剤に
抵抗性であるsoybeanlooper(Pseud
oplusia includens)やtobacc
o budwormに対して感受性系統と変わらぬ活性
を示すなど、既存剤との交差抵抗性はみられない。日本
においてもコナガ、ハスモンヨトウ、シロイチモジヨト
ウ、ミナミキイロアザミウマ、ナミハダニ、カンザワハ
ダニなどの難防除害虫に高い防除効果を示すことが知ら
れている。作用機作はミトコンドリアにおける酸化的リ
ン酸化の脱共役である(新農薬の開発展望 第71頁お
よび第76頁−第78頁、 1997年11月28日
(株)シーエムシー 発行)。
農薬や、最近特に増加してきた輸入農産物のポストハー
ベスト農薬等の残留に大きな社会的関心が寄せられてい
る。クロルフェナピルについては、環境庁による農薬登
録保留基準値が、例えば、みかんで0.5ppm、第二
大粒果実類で1ppm、小粒果実類で0.2ppm、第
二果菜類で1ppm、第一葉菜類で1ppm、第二葉菜
類で3ppm、根・茎類で0.1ppm、てんさい0.
5ppm、茶50ppm等定められている(改訂3版
農薬登録保留基準ハンドブック 第258頁−第260
頁、1998年9月25日、化学工業日報社 発行)。
よって、環境や食品に関する安全確保のためには、これ
らに含有される、クロルフェナピルの量を迅速かつ正確
に測定することが必要である。
は、果実、野菜、茶等から抽出し、精製した後、ガスク
ロマトグラフィー(GC)により分析されてきた。即
ち、例えば、試料をアセトンで抽出し、ヘキサンに転溶
した後、ヘキサン−ジエチルエーテルを溶媒として用い
たケイ酸マグネシウムカラムクロマトグラフィーで精製
後、GCで測定する方法等が採用されている。これらの
方法は、試料の調製が煩雑で多大の手順と時間を必要と
し、分析に熟練を要すること、並びに、測定装置や設備
等に高額の費用を必要とする等の問題点がある。クロル
フェナピルの測定は短時間で膨大な数の試料の分析結果
を出す必要があり、精度面だけでなく、簡便性、迅速性
及び経済性をも具備した新規測定方法が要求されてきて
いる。
に認識する抗原抗体反応に基づいて抗原や抗体の検出を
行う方法であり、その優れた精度、簡便性、迅速性、経
済性から近年注目を集めてきている。免疫学的測定方法
においては検出方法として非常に多種の標識、例えば、
酵素、放射性トレーサー、化学発光あるいは蛍光物質、
金属原子、ゾル、ラテックス及びバクテリオファージが
適用されてきた。
る酵素免疫測定法(EIA)は経済性・利便性から特に
優れたものとして広く使用されるに至っている。酵素免
疫測定法についての優れた論評が、Tijssen
P,“Practice and theory of
enzyme immunoassays” inL
aboratory techniques in b
iochemistry and molecular
biology, Elsevier Amster
dam New York, Oxford ISBN
0−7204−4200−1(1990)に記載され
ている。
それ以上修飾することなく動物に接種することにより、
適当な免疫反応を惹起し、抗原を認識する抗体を産生さ
せることができる。しかし、クロルフェナピルのような
低分子化合物は通常動物に接種したとき免疫応答を引き
出すことができない。これらの分子は免疫原性を有する
高分子化合物に結合させることによって初めて一団のエ
ピトープとして行動し、T細胞受容体の存在下で免疫応
答を起こし、その結果、一群のBリンパ球により抗体が
産生される。このように高分子化合物と結合させて初め
て免疫原性を生じる分子を総称して「ハプテン」と言
う。
合させたものを抗原としても、得られた抗体は望む分子
を認識しないか、あるいはごく低い親和性しかもたない
場合がしばしばある。そのため、一般に低分子化合物そ
のものではなく、結合に利用できる官能基と共にスペー
サーアーム(結合手)を導入したものをハプテンとして
使用する必要がある。しかしその場合に、結合手/官能
基の配置、結合手の大きさ等の全ての問題を考慮して導
入が適切に行われたものを使用しないと、好ましい抗体
は得られない。適切な導入は個々の分子に応じて工夫し
なければならない。
が非常に高かったにもかかわらず、適切な抗体はもとよ
り、そのような抗体を作製するためのハプテンも本発明
前には得られていなかった。
ナピルに反応する新規な抗体若しくはそのフラグメン
ト、及びその作製方法を提供することを目的とする。
尚、本明細書において抗体の「フラグメント」とは、抗
原と結合可能な抗体の一部分、例えばFab断片等を意味
する。
ナピルに反応性を有するモノクローナル抗体を提供す
る。本発明は、また、クロルフェナピルに反応性を有す
る新規な抗体を作製するための抗原を構成するハプテン
化合物を提供することを目的とする。
テンと高分子化合物との結合体を提供することを目的と
する。本発明は、さらにまた、前記抗体又はそのフラグ
メントを産生するハイブリドーマを提供することを目的
とする。
フラグメント及び/又は前記クロルフェナピルハプテン
と高分子化合物との結合体を使用することを含む、クロ
ルフェナピルの免疫学的測定方法を提供することを目的
とする。
を重ねた結果、クロルフェナピル又はその部分にスペー
サーアーム及び高分子化合物との結合に利用できる官能
基を導入した、クロルフェナピルの誘導体をハプテンと
して使用することにより、前記化合物に反応性を有する
抗体を得ることに成功し、本発明の完成に至った。
以下の式(2):
発明の抗体は、例えば、クロルフェナピルの部分にスペ
ーサーアーム及び結合に利用できる官能基を導入した誘
導体をハプテンとして適当な高分子化合物と結合させた
ものを抗原として用いることによって得ることができ
る。例えば、以下の式(1):
っても異なっていてもよく、F、Cl、BrおよびIか
らなるハロゲン原子、CN、CF3、ならびに炭素数1
ないし3のアルキル基からなるグループから選択され;
A4は、F、Cl、Br又はIから選択されるハロゲン
原子であり;そしてmは、1ないし10の整数である]
で表される構造を有する化合物を、抗体作製のためのハ
プテンとして使用する。
り、A2がBrであり、A3がCF3であり、A4がClで
ある。好ましくは、mは5である。本発明は、前記ハプ
テン化合物、ハプテン化合物と高分子化合物との結合
体、クロルフェナピルに反応する抗体及びその作製方
法、並びに該ハプテン化合物又は該抗体を用いるクロル
フェナピルの免疫学的測定方法に関する。クロルフェナピルハプテンの作製 式(1)で表されるクロルフェナピルハプテンは、公知
の方法に従って製造することができる。限定するわけで
はないが、例えば以下のような方法を用いることができ
る。
選択されるハロゲン原子の場合、まず、以下の式(Z
1):
に定義した通りである]で表される構造を有する化合物
に、有機溶媒中、縮合剤の存在下、以下の式(Z2):
はIから選択されるハロゲン原子であり;Pは、カルボ
キシル基の保護基であり;そしてmは先に定義した通り
である]で表される構造を有する化合物を反応させて、
以下の式(Z3):
びmは先に定義した通りである]で表される構造を有す
る化合物を合成する。式(Z1)化合物は、公知の方
法、例えば特開平1−135701の実施例56および
57の記載に準じて合成することができる。
でよく、具体例として、例えば、メチル基、エチル基、
tert−ブチル基、ベンジル基、p−メトキシベンジ
ル基、3,4−ジメトキシベンジル基、トリクロロエチ
ル基、トリメチルシリル基、tert−ブチルジメチル
シリル基、tert−ブチルジフェニルシリル基、トリ
エチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、トリメチ
ルシリルエチル基等を挙げることができる。
としては、例えば、N.N−ジメチルホルムアミド、ベ
ンゼン、トルエン、キシレン、クロロホルム、四塩化炭
素、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトン、アセ
トニトリル、ジメチルスルホキシド等を用いることがで
きる。縮合剤としては、水素化ナトリウム、ナトリウ
ム、ナトリウムメチラート、ナトリウムエチラート等を
用いることができる。
しくは80℃から150℃で、10分から15時間、好
ましくは、1時間から5時間行う 次いで、式(Z3)の化合物からPで表されるカルボキ
シル基の保護基を除去することにより、以下の式(Z
4):
は先に定義した通りである]で表される構造を有する化
合物を合成する。カルボキシル基の保護基の除去は、ア
ルカリ加水分解、酸加水分解等の公知の方法で行うこと
ができる。
(Z3)の化合物を、好ましくはメタノール、エタノー
ル、テトラヒドロフラン、エチレングリコール等の有機
溶媒に溶解し、次いで炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリ
ウム、炭酸カリウム、水酸化リチウム、水酸化ナトリウ
ム又は水酸化カリウム等の水溶液を加えて、0℃から溶
媒の沸点、好ましくは0℃から50℃で、5分から10
時間、好ましくは30分から2時間撹拌反応させること
により式(Z4)の化合物を得ることができる。
化合物を、好ましくは酢酸、蟻酸、ベンゼン、ジクロロ
メタン、1,2−ジクロロエタン等の有機溶媒に溶解
し、次いで塩酸、硫酸、三フッ化ホウ素ジエチルエーテ
ル錯体、トリフルオロ酢酸、トリフルオロメタンスルホ
ン酸、p−トルエンスルホン酸等を加えて、0℃から溶
媒の沸点、好ましくは0℃から50℃で、5分から10
時間、好ましくは1時間から5時間撹拌反応させること
により式(Z4)の化合物を得ることができる。
による加水素分解によっても行うことができる。更にま
た、Pがシリル原子を含む基の場合、脱保護はテトラ−
n−ブチルアンモニウムフルオリド、ピリジニウムフル
オリド等のフッ素アニオンを発生させる試薬によっても
行うことができる。
中又は無溶媒で、塩素、臭素、塩化スリフリル、N−ブ
ロモこはく酸イミド等のハロゲン化剤を反応させること
により、A2がCl又はBrから選択されるハロゲン原
子である、式(1)の化合物を得ることができる。
ロロホルム、ジオキサン、テトラヒドロフラン等を用い
ることができ、鉄粉や塩化アルミニウム等の触媒を用い
ることにより、反応を促進することができる。反応は、
0℃から溶媒の沸点の温度、好ましくは室温から150
℃で、10分から50時間、好ましくは、5時間から2
0時間行う。
物も、同様に公知の方法を用いて合成することができ
る。上述したような製造方法によって得られた化合物
を、必要に応じシリカゲルクロマトグラフィー又は再結
晶操作等を行うことにより、さらに高純度の精製品とす
ることができる。
疫化学的測定法について説明する。尚、これらの調製は
公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究
法(日本生化学会編)等に記載の方法に従って行うこと
ができる。クロルフェナピルハプテンと高分子化合物との結合体の
作製 上述のように合成されたクロルフェナピルハプテンを適
当な高分子化合物に結合させてから免疫用抗原若しくは
固相化用抗原として使用する。
シガイへモシアニン(以下、「KLH」と言う)、卵白
アルブミン(以下、「OVA」と言う)、ウシ血清アル
ブミン(以下、「BSA」と言う)、ウサギ血清アルブ
ミン(以下、「RSA」と言う)などがある。KLH及
びBSAが好ましい。
との結合は、例えば、活性化エステル法(A.E.KA
RU et al.:J.Agric.Food Ch
em.42 301−309(1994))、又は混合
酸無水物法(B.F.Erlanger et a
l.:J.Biol.Chem.234 1090‐1
094(1954))等の公知の方法によって行うこと
ができる。
行うことができる。まず、ハプテン化合物を有機溶媒に
溶解し、カップリング剤の存在下にてN−ヒドロキシこ
はく酸イミドと反応させ、N−ヒドロキシこはく酸イミ
ド活性化エステルを生成させる。
されている通常のカップリング剤を使用でき、例えば、
ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダ
ゾール、水溶性カルボジイミド等が含まれる。有機溶媒
としては、例えば、ジメチルスルホキシド(以下、「D
MSO」と言う)、N,N−ジメチルホルムアミド(以
下、「DMF」と言う)、ジオキサン等が使用できる。
反応に使用するハプテン化合物とN−ヒドロキシこはく
酸イミドのモル比は好ましくは1:10から10:1、
より好ましくは1:1から1:10、最も好ましくは
1:1である。反応温度は、0℃から100℃、好まし
くは5℃から50℃、より好ましくは22℃から27℃
で、反応時間は5分から24時間、好ましくは30分か
ら6時間、より好ましくは1時間から2時間である。
物を溶解した溶液に加え反応させると、例えば高分子化
合物が遊離のアミノ基を有する場合、当該アミノ基とハ
プテン化合物のカルボキシル基の間に酸アミド結合が生
成される。反応温度は、0℃から60℃、好ましくは5
℃から40℃、反応時間は5分から24時間、好ましく
は1時間から16時間、より好ましくは1時間から2時
間である。反応物を、透析、脱塩カラム等によって精製
して、クロルフェナピルハプテンと高分子化合物との結
合体を得ることができる。
混合酸無水物は、カルボン酸とハロ蟻酸エステルとの反
応により得られ、これを高分子化合物と反応させること
により目的とするハプテン−高分子化合物結合体が製造
される。この反応は塩基性化合物の存在下に行われる。
塩基性化合物としては、例えば、トリブチルアミン、ト
リエチルアミン、トリメチルアミン、N−メチルモルホ
リン、ピリジン、N,N−ジメチルアニリン、DBN、
DBU、DABCO等の有機塩基、炭酸カリウム、炭酸
ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム等
の無機塩基等が挙げられる。該反応は、通常マイナス2
0℃から150℃、好ましくは0℃から100℃におい
て行われ、反応時間は5分から10時間、好ましくは5
分から2時間である。得られた混合酸無水物と高分子化
合物との反応は、通常マイナス20℃から100℃、好
ましくは0℃から50℃において行われ、反応時間は5
分から10時間、好ましくは5分から5時間である。混
合酸無水物法は一般に溶媒中で行われる。溶媒として
は、混合酸無水物法に慣用されているいずれの溶媒も使
用可能であり、具体的にはジオキサン、ジエチルエーテ
ル、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン等のエーテ
ル類、ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン
等のハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トルエン、キシ
レン等の芳香族炭化水素類、酢酸メチル、酢酸エチル等
のエステル類、N,N−ジメチルホルムアミド、ジメチ
ルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸トリアミド等の非
プロトン性極性溶媒等が挙げられる。混合酸無水物法に
おいて使用されるハロ蟻酸エステルとしては、例えばク
ロロ蟻酸メチル、ブロモ蟻酸メチル、クロロ蟻酸エチ
ル、ブロモ蟻酸エチル、クロロ蟻酸イソブチル等が挙げ
られる。当該方法におけるハプテンとハロ蟻酸エステル
と高分子化合物の使用割合は、広い範囲から適宜選択さ
れ得る。
標識物質をクロルフェナピルハプテンに結合させたもの
を、免疫学的測定方法において使用することができる。
標識物質としては、西洋わさびペルオキシダーゼ(以下
「HRP」と言う)、アルカリフォスファターゼ等の酵
素、フルオレセインイソシアネート、ローダミン等の蛍
光物質、32P、125I等の放射性物質、化学発光物質な
どがある。ポリクローナル抗体の作製 クロルフェナピルハプテンと高分子化合物との結合体を
使用して、慣用化された方法により本発明のポリクロー
ナル抗体を作製することができる。例えば、クロルフェ
ナピルハプテン/BSA結合体をリン酸ナトリウム緩衝
液(以下、「PBS」と言う)に溶解し、フロイント完
全アジュバント又は不完全アジュバント、あるいはミョ
ウバン等の補助剤と混合したものを、免疫用抗原として
動物に免疫することによって得ることができる。免疫さ
れる動物としては当該分野で常用されるものをいずれも
使用できるが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤ
ギ、ウマ等を挙げることができる。
射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射のいずれでもよ
いが、皮下注射又は腹腔内注射が好ましい。免疫は1回
又は適当な間隔で、好ましくは1週間ないし5週間の問
隔で複数回行うことができる。
分離した血清を用い、クロルフェナピルと反応するポリ
クローナル抗体の存在を評価することができる。本発明
においてクロルフェナピルハプテンと高分子化合物との
結合体を免疫用抗原として得られた抗血清は、後述する
間接競合阻害ELISA法において少なくとも約100
0ng/mlの濃度でクロルフェナピルと反応できる
(実施例4)。モノクローナル抗体の作製 クロルフェナピルハプテンと高分子化合物との結合体を
使用して、公知の方法により本発明のモノクローナル抗
体を作製することができる。
少なくとも下記のような作業工程が必要である。 (a)免疫用抗原として使用するクロルフェナピルハプ
テンと高分子化合物との結合体の作製 (b)動物への免疫 (c)血液の採取、アッセイ、及び抗体産生細胞の調製 (d)ミエローマ細胞の調製 (e)抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合とハ
イブリドーマの選択的培養 (f)目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスク
リーニングと細胞クローニング (g)ハイブリドーマの培養又は動物へのハイブリドー
マの移植によるモノクローナル抗体の調製 (h)調製されたモノクローナル抗体の反応性の測定等 モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製す
るための常法は、例えば、ハイブリドーマ テクニック
ス(Hybridoma Techniques),コ
ールド スプリング ハーバー ラボラトリーズ(Co
ld Spring Harbor Laborato
ry,1980年版)、細胞組織化学(山下修二ら、日
本組織細胞化学会編;学際企画、1986年)に記載さ
れている。
モノクローナル抗体の作製方法を説明するが、これに制
限されないことは当業者によって明らかであろう。
(a)−(b)の工程は、ポリクローナル抗体に関して
記述した方法とほぼ同様の方法によって行うことができ
る。
パ球であり、これは一般には脾臓、胸腺、リンパ節、末
梢血液又はこれらの組み合わせから得ることができるが
脾細胞が最も一般的に用いられる。従って、最終免疫
後、抗体産生が確認されたマウスより抗体産生細胞が存
在する部位、例えば脾臓を摘出し、脾細胞を調製する。
ーマ細胞としては、例えば、Balb/cマウス由来骨
髄腫細胞株のP3/X63−Ag8(X63)(Nat
ure,256,495−497(1975))、P3
/X63−Ag8.U1(P3U1)(Current
Topics.in Microbiologyan
d Immunology,81, 1−7(198
7))、P3/NSI−1−Ag 4−1(NS−1)
(Eur.J.Immunol.,6,511−519
(1976))、Sp2/0−Ag14(Sp2/0)
(Nature, 276,269−270(197
8))、FO(J.Immuno.Meth.,35,
1−21(1980))、MPC−11、X63.6
53、S194等の骨髄腫株化細胞、あるいはラット由
来の210.RCY3.Ag 1.2.3.(Y3)
(Nature, 277,131−133,(197
9))等を使用できる。
含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)又はイス
コフ改変ダルベッコ培地(IMDM)で継代培養し、融
合当日に約1×106以上の細胞数を確保する。
えばミルスタイン(Milstein)らの方法(Me
thods in Enzymology,73,3
(1981))等に準じて行うことができる。現在最も
一般的に行われているのはポリエチレングリコール(P
EG)を用いる方法である。PEG法については、例え
ば、細胞組織化学、山下修二ら(上述)に記載されてい
る。別の融合方法としては、電気処理(電気融合)によ
る方法を採用することもできる(大河内悦子ら、実験医
学 5.1315−19、1987)。その他の方法を
適宜採用することもできる。また、細胞の使用比率も公
知の方法と同様でよく、例えばミエローマ細胞に対して
脾細胞を3倍から10倍程度用いればよい。
分泌能及び増殖能を獲得したハイブリドーマ群の選択
は、例えば、ミエローマ細胞株としてヒポキサンチング
アニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損株を使用
した場合、例えば上述のDMEMやIMDMにヒポキサ
ンチン・アミノプテリン・チミジンを添加して調製した
HAT培地の使用により行うことができる。
ーマ群を含む培養上清の一部をとり、例えば後述するE
LISA法により、クロルフェナピルに対する抗体活性
を測定する。
応する抗体を産生することが判明したハイブリドーマの
細胞クローニングを行う。この細胞クローニング法とし
ては、限界希釈により1ウェルに1個のハイブリドーマ
が含まれるように希釈する方法「限界希釈法」;軟寒天
培地上に撒きコロニーをとる方法;マイクロマニピュレ
ーターによって1個の細胞を取り出す方法;セルソータ
ーによって1個の細胞を分離する「ソータークローン
法」等が挙げられる。限界希釈法が簡単であり、よく用
いられる。
ば限界希釈法によりクローニングを1−4回繰り返して
安定して抗体価の得られたものを、抗クロルフェナピル
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択す
る。ハイブリドーマを培養する培地としては、例えば、
ウシ胎児血清(FCS)を含むDMEM又はIMDM等
が用いられる。ハイブリドーマの培養は、例えば二酸化
炭素濃度5−7%程度及び37℃(100%湿度の恒温
器中)で培養するのが好ましい。
培養は、フォローファイバー型の培養装置等によって行
われる。又は、同系統のマウス(例えば、上述のBal
b/c)あるいはNu/Nuマウスの腹腔内でハイブリ
ドーマを増殖させ、腹水液より抗体を調製することも可
能である。
腹水液を抗クロルフェナピルモノクローナル抗体として
使用することできるが、さらに透析、硫酸アンモニウム
による塩析、ゲル濾過、凍結乾燥等を行い、抗体画分を
集め精製することにより抗クロルフェナピルモノクロー
ナル抗体を得ることができる。さらに、精製が必要な場
合には、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフ
ィー(HPLC)などの慣用されている方法を組合わせ
ることにより実施できる。
ピルモノクローナル抗体は、例えば後述するELISA
法などの公知の方法を使用して、サブクラス、抗体価等
を決定することができる。抗体によるクロルフェナピルの測定 本発明で使用する抗体によるクロルフェナピルの測定法
としては、放射性同位元素免疫測定法(RIA法)、E
LISA法(Engvall,E.,Methods
in Enzymol.,70,419−439(19
80))、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、凝集
法、オクタロニー(Ouchterlony)等の一般
に抗原の検出に使用されている種々の方法(「ハイブリ
ドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社R&Dプラ
ニング発行、第30頁−第53頁、昭和57年3月5
日)が挙げられる。感度、簡便性等の観点からELIS
A法が汎用されている。
A法のうち例えば間接競合阻害ELISA法により、以
下のような手順により行うことができる。 (a)まず、固相化用抗原であるクロルフェナピルハプ
テンと高分子化合物との結合体を担体に固相化する。
表面を抗原と無関係な物質、例えばタンパク質によりブ
ロッキングする。 (c)これに各種濃度のクロルフェナピルを含む試料及
び抗体を加え、該抗体を前記固相化抗原及びクロルフェ
ナピルに競合的に反応させて、固相化抗原−抗体複合体
及び、クロルフェナピル−抗体複合体を生成させる。
することにより、予め作成した検量線から試料中のクロ
ルフェナピルの量を決定することができる。 (a)工程において、固相化用抗原を固相化する担体と
しては、特別な制限はなく、ELISA法において常用
されるものをいずれも使用することができる。例えば、
ポリスチレン製の96ウェルのマイクロタイタープレー
トが挙げられる。
例えば、固相化用抗原を含む緩衝液を担体上に載せ、イ
ンキュベーションすればよい。緩衝液としては公知のも
のが使用でき、例えば、リン酸緩衝液を挙げることがで
きる。緩衝液中の抗原の濃度は広い範囲から選択できる
が、通常0.01μg/mlから100μg/ml程
度、好ましくは0.05μg/mlから10μg/ml
が適している。また、担体として96ウェルのマイクロ
タイタープレートを使用する場合には、300μl/ウ
ェル以下で20μl/ウェルから150μl/ウェル程
度が望ましい。更に、インキュベーションの条件にも特
に制限はないが、通常4℃程度で一晩インキュベーショ
ンが適している。
抗体を作製したクロルフェナピルハプテンと高分子化合
物との結合体自体のみならず、式(1)で表される他の
ハプテンと高分子化合物との結合体を固相化抗原として
使用することも可能である。例えば、式(1)において
A1、A2、A3、A4又はmが抗体作製用と相違する化合
物を、固相化抗原として使用することもできる。さら
に、式(1)に含まれない他のクロルフェナピル類似化
合物を固相化抗原として使用することも可能である。
ルフェナピルハプテンと高分子化合物との結合体)を固
相化した担体において、クロルフェナピルハプテン部分
以外に後で添加する抗体が吸着され得る部分が存在する
場合があり、もっぱらそれを防ぐ目的で行われる。ブロ
ッキング剤として、例えば、BSAやスキムミルク溶液
を使用できる。あるいは、ブロックエース(「Bloc
k‐Ace」、大日本製薬社製、コードNo.UK−2
5B)等のブロッキング剤として市販されているものを
使用することもできる。具体的には、限定されるわけで
はないが、例えば抗原を固相化した部分にブロッキング
剤を含む緩衝液[例えば、1%BSAと60mM Na
Clを添加した85mM ホウ酸緩衝液(pH8.
0)]を適量加え、約4℃で、1時間ないし5時間イン
キュベーションした後、洗浄液で洗浄することにより行
われる。洗浄液としては特に制限はないが、例えば、P
BSを用いることができる。
ピルを含む試料と抗体を固相化抗原と接触させ、抗体を
固相化抗原及びクロルフェナピルと反応させることによ
り、固相化抗原−抗体複合体及びクロルフェナピル−抗
体複合体が生成する。
願発明のクロルフェナピルに対する抗体を加え、更に第
二抗体として標識酵素を結合した第一抗体に対する抗体
を順次加えて反応させる。
定されるわけではないが、反応は、10℃から40℃、
好ましくは約25℃で約1時間行えばよい。反応終了
後、緩衝液で担体を洗浄し、固相化抗原に結合しなかっ
た第一抗体を除去する。洗浄液としては、例えば、PB
Sを用いることができる。
体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素
(例えば、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファター
ゼ等)を結合した抗マウス−ヤギ抗体を用いるのが適当
である。担体に結合した第一抗体に好ましくは最終吸光
度が4以下、より好ましくは0.5−3.0となるよう
に希釈した第二抗体を反応させるのが望ましい。希釈に
は緩衝液を用いる。限定されるわけではないが、反応は
室温で約1時間行い、反応後、緩衝液で洗浄する。以上
の反応により、第二抗体が第一抗体に結合する。また、
標識した第一抗体を用いてもよく、その場合、第二抗体
は不要である。
第二抗体の標識物質と反応する発色基質溶液を加え、吸
光度を測定することによって検量線からクロルフェナピ
ルの量を算出することができる。
ダーゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素、並び
に3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン又はo
−フェニレンジアミン(以下、「OPD」と言う)を含
む発色基質溶液を使用することができる。限定されるわ
けではないが、発色基質溶液を加え室温で約10分間反
応させた後、1Nの硫酸を加えることにより酵素反応を
停止させる。3,3’,5,5’−テトラメチルベンジ
ジンを使用する場合、450nmの吸光度を測定する。
OPDを使用する場合、492nmの吸光度を測定す
る。一方、第二抗体に結合する酵素としてアルカリホス
ファターゼを使用する場合には、例えばp−ニトロフェ
ニルリン酸を基質として発色させ、2NのNaOHを加
えて酵素反応を止め、415nmでの吸光度を測定する
方法が適している。
吸光度に対して、それらを添加して抗体と反応させた溶
液の吸光度の減少率を阻害率として計算する。既知の濃
度のクロルフェナピルを添加した反応液の阻害率により
予め作成しておいた検量線を用いて、試料中のクロルフ
ェナピルの濃度を算出できる。
ば以下に述べるような本発明のモノクローナル抗体を用
いた直接競合阻害ELISA法によって行うこともでき
る。 (a)まず、本発明のモノクローナル抗体を、担体に固
相化する。
を抗原と無関係な物質、例えばタンパク質により、ブロ
ッキングする。 (c)上記工程とは別に、各種濃度のクロルフェナピル
を含む試料に、クロルフェナピルハプテンと酵素を結合
させた酵素結合ハプテンを加えた混合物を調製する。
反応させる。 (e)固相化抗体−酵素結合ハプテン複合体の量を測定
することにより、あらかじめ作成した検量線から試料中
のクロルフェナピルの量を決定する。
固相化する担体としては、特別な制限はなくELISA
法において常用されるものを用いることができ、例えば
96ウェルのマイクロタイタープレートが挙げられる。
モノクローナル抗体の固相化は、例えばモノクローナル
抗体を含む緩衝液を担体上にのせ、インキュベートする
ことによって行える。緩衝液の組成・濃度は前述の間接
競合阻害ELISA法と同様のものを採用できる。
化した担体において、後に添加する試料中のクロルフェ
ナピル並びに酵素結合ハプテンが、抗原抗体反応とは無
関係に吸着される部分が存在する場合があるので、それ
を防ぐ目的で行う。ブロッキング剤及びその方法は、前
述の間接競合阻害ELISA法と同様のものを使用でき
る。
ンの調製は、クロルフェナピルハプテンを酵素に結合す
る方法であれば特に制限なく、いかなる方法で行っても
よい。例えば、前述した活性化エステル法を採用するこ
とができる。調製した酵素結合ハプテンは、クロルフェ
ナピルを含む試料と混合する。
テンとしては、間接競合阻害ELISA法における固相
化抗原の場合と同様に、抗体作製に使用したクロルフェ
ナピルハプテン自体のみならず、式(1)で表される他
のハプテンと高分子化合物との結合体を標識競合用抗原
として使用することも可能である。例えば、式(1)に
おいてA1、A2、A3、A4又はmが抗体作製用と相違す
る化合物を、標識競合用抗原として使用することもでき
る。さらに、式(1)に含まれない他のクロルフェナピ
ル類似化合物も、標識競合用抗原として使用可能であ
る。
む試料及び酵素結合ハプテンを抗体固相化担体に接触さ
せ、クロルフェナピルと酵素結合ハプテンとの競合阻害
反応により、これらと固相化担体との複合体が生成す
る。クロルフェナピルを含む試料は適当な緩衝液で希釈
して使用する。限定されるわけではないが、反応は例え
ば、室温でおよそ1時間行う。反応終了後、緩衝液で担
体を洗浄し、固相化抗体と結合しなかった酵素結合ハプ
テンを除去する。洗浄液は、例えばPBSを使用するこ
とができる。
テンの酵素に反応する発色基質溶液を前述の間接競合阻
害ELISA法と同様に加え、吸光度を測定することに
より検量線からクロルフェナピルの量を算出することが
できる。
1は、直接競合阻害ELISA法において約0.005
ng/mlから100ng/ml、好ましくは0.05
ng/mlから10ng/mlの濃度範囲でクロルフェ
ナピルと反応する(実施例6、図1)。
ISA法において抗体作製用と異なるハプテンを標識競
合用抗原として使用でき、その組み合わせによって直接
競合阻害ELISA法において固有の反応性を示す。本発明の抗体の交差反応性 上述した直接競合阻害ELISA法又は間接競合阻害法
により、本発明のモノクローナル抗体の交差反応性を調
べることができる。以下、実施例によって本発明を具体
的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定す
るためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づ
いて容易に本発明に修飾、変更を加えることができ、そ
れらは本発明の技術的範囲に含まれる。
シアノ−5−トリフルオロメチル−1−ピロリル]ヘキ
サン酸エチル(1)の合成 2−(4−クロロフェニル)−3−シアノ−5−トリフ
ルオロメチルピロールは、特開平1−135701の実
施例56および57の記載に準じて、2−(4−クロロ
フェニル)グリシン及び無水トリフルオロ酢酸より合成
した。
0ml中の2−(4−クロロフェニル)−3−シアノ−
5−トリフルオロメチルピロール1.44g(5.2m
mol)の溶液に60%水素化ナトリウム0.22g
(5.8mmol)を室温下に徐々に加えた。15分間
撹拌後、6−ブロモヘキサン酸エチル1.40g(6.
2mmol)を加え、140℃で4時間撹拌した。反応
混合物を濃縮し、残渣に150mlの酢酸エチルと50
mlの水を加え、分液した。酢酸エチル層を水洗し、無
水硫酸マグネシウムで乾燥後、濾過、濃縮した。残渣を
カラムクロマトグラフィー(n−ヘキサン:酢酸エチル
=5:1)で精製し、1.60g(収率75%)の
(1)を得た。6−[2−(4−クロロフェニル)−3−シアノ−5−
トリフルオロメチル−1−ピロリル]ヘキサン酸(2)
の合成 エタノール20ml中の6−[2−(4−クロロフェニ
ル)−3−シアノ−5−トリフルオロメチル−1−ピロ
リル]ヘキサン酸エチル(1)0.63g(1.5mm
ol)の溶液に、水15ml中の水酸化ナトリウム0.
6g(15mmol)の溶液を加えた。室温で1時間撹
拌した。減圧下にエタノールを留去し、残渣を希塩酸で
酸性にし、酢酸エチル50mlで3回抽出した。酢酸エ
チル層を水洗し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濃縮
した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(n−ヘキ
サン:酢酸エチル=3:1)で精製し0.27g(収率
46%)の(2)を得た。6−[4−ブロモ−2−(4−クロロフェニル)−3−
シアノ−5−トリフルオロメチル−1−ピロリル]ヘキ
サン酸(3)の合成 酢酸1ml中の6−[2−(4−クロロフェニル)−3
−シアノ−5−トリフルオロメチル−1−ピロリル]ヘ
キサン酸(2)0.23g(0.60mmol)と鉄粉
10mgの溶液に撹拌下80℃で臭素0.29g(1.
8mmol)を徐々に加え、さらに80℃で15時間撹
拌した。反応混合物を濃縮し、残渣に水5mlを加え、
酢酸エチル15mlで3回抽出した。酢酸エチル層を水
洗し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濃縮した。残渣
を分取用HPLC( アセトニトリル:水=7:3)で
精製し17mg(収率6.0%)の(3)を得た。 融点:115−117℃ 上記クロルフェナピルハプテン(3)の1H−NMRに
よる物性データ(ケミカルシフトδ)を以下に示す。
m,CH2),1.45(2H,m,CH2), 2.0
5(2H,t,CH2),3.99(2H,t,C
H2), 7.67(4H,m,4Ar:H),11.
97(1H,s,COOH)実施例2 免疫用抗原およびスクリーニング用抗原の作
製 免疫用抗原およびスクリーニング用抗原として、クロル
フェナピルハプテンとBSAとの結合体を活性化エステ
ル法を用いて作製した。
テン0.2mmolをDMF 1.0mLに溶解し、N
−ヒドロキシこはく酸イミド0.2mmol及び1−エ
チル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイ
ミド0.2mmolを加え、室温で3.5時間撹拌し
た。反応後、10000rpmで15分間遠心し、上清
と沈殿に分離した。
aCl−0.01Mリン酸緩衝液(pH7.2:以下
「PBS」と言う)5.0mlに溶解し、DMF 1.
05mlを加えた溶液を調製しておき、この溶液に上記
の上清0.25mlを加え、4℃にて16時間反応させ
た。反応後、蒸留水にて4℃で透析し、クロルフェナピ
ルとBSAとの結合体(以下、「クロルフェナピルハプ
テン/BSA結合体」と言う)を調製した。以降、免疫
用抗原として用いた。
ピルハプテンとRSAとの結合体(以下、「クロルフェ
ナピルハプテン/RSA結合体」と言う)、および、ク
ロルフェナピルハプテンとHRPとの結合体との結合体
(以下、「クロルフェナピルハプテン/HRP結合体」
と言う)も作製した。実施例3 免疫感作 免疫にはBalb/cマウスを用いた。実施例2で作製
したクロルフェナピルハプテン/BSA結合体100μ
gをPBS 50μlに溶解し、等量のフロイント完全
アジュバンドと混合して、Balb/cマウスの皮下に
接種した。さらに、4週間後にフロイント不完全アジュ
バンドを用いて前記と同様に調製した免疫用抗原を追加
免疫した。また、6週間目に180μlのPBSに溶解
したクロルフェナピルハプテン/BSA結合体30μg
をマウス尾静脈より追加免疫した。実施例4 抗血清のクロルフェナピルに対する反応性 実施例3におけるマウス尾静脈への接種直前、採血した
抗血清を希釈調製して、以下に詳述する間接競合阻害E
LISA法にてクロルフェナピルを測定し、抗血清を評
価した。
クロルフェナピルハプテン/RSA結合体の溶液(0.
5μg/mL)を50μl/ウェルの量で96ウェルマ
イクロプレートにコーティングし(25ng/50μl
/ウェル)、4倍希釈したブロックエース(「Bloc
k Ace」、雪印乳業社製、コードNo.UK−25
B)でブロッキングしてアッセイ用プレートを作製し
た。次いで、抗血清10000倍希釈液と、各種濃度の
クロルフェナピルを含む20%メタノール溶液とを等量
混合し、その50μLを各ウェルに入れ、室温で1時間
反応させた。
ックエースを用いて2000倍に希釈したペルオキシダ
ーゼ結合ヤギ抗マウスIgG抗体(Tago社製)を5
0μl/ウェルの量で加え、室温にて1時間反応させ
た。PBSで洗浄した後に、2mg/mLのOPD及び
0.02%の過酸化水素を含む0.1Mクエン酸−リン
酸緩衝液(pH5.0)を50μl/ウェルの量で加
え、室温にて10分間反応させて発色させた。
加えて反応を停止し、490nmの吸光度を測定した。
結果の一例を表2に示す。
/mlにおいて阻害反応が認められたことから、用いた
抗血清はクロルフェナピルに対して反応性があることが
確認された。実施例5 ハイブリドーマの作製 実施例3に続いて、血清中の抗クロルフェナピル抗体活
性が高くなったマウスの脾細胞と、ミエローマ細胞(S
p2/0−Ag14)とを山下修二らの方法(組織細胞
化学:日本組織細胞化学会編:学際企画.1986年)
に従ってポリエチレングリコール法により融合し、培養
した。実施例4と同様の方法でコーティング及びブロッ
キングしたプレートに細胞の増殖が認められた培養上清
液をそれぞれ50μL/ウェルの量で加え、室温にて1
時間反応させた。
クエースを用いて2000倍に希釈したペルオキシダー
ゼ結合抗マウスIgGヤギ抗体(Tago社製)を50
μl/ウェルの量で加え、室温にて1時間反応させた。
PBSで洗浄した後に、2mg/mlのOPD及び0.
02%の過酸化水素を含む0.1M クエン酸−リン酸
緩衝液(pH5.0)を50μl/ウェルの量で加え、
室温にて10分間発色させた。
加えて、反応を停止し、490nmの吸光度を測定し、
反応性を示す細胞(ハイブリドーマ)を選抜した。次
に、各ウェルのクロルフェナピルとの反応性を実施例4
に記載した間接競合阻害ELISA法で調べ、目的の抗
体を産生している細胞について限界希釈法によりクロー
ニングを行った。その結果、数株のハイブリドーマが抗
クロルフェナピル抗体を産生する細胞としてクローン化
された。そのうちの42E1−1−1を平成11年3月
16日に、寄託番号FERM P−17311で、工業
技術院生命工学工業技術研究所(〒305ー0046
茨城県つくば市東1丁目1番3号)に寄託した。実施例6 直接競合阻害ELISA法によるクロルフェ
ナピルの測定 実施例5で得られたハイブリドーマ42E1−1−1を
マウスの腹腔に移植し、10日ないし15日後に得られ
た腹水を採取し、アフィニティークロマトグラフィーに
よりモノクローナル抗体42E1−1−1を精製した。
(以降、モノクローナル抗体は、これらを産生するハイ
ブリドーマと同一の名称を用いる。)この42E1−1
−1抗体を用いて、直接競合阻害ELISA法にてクロ
ルフェナピルの量を測定した。
g/ml)を50μl/ウェルの量で96ウェルマイク
ロプレートに入れ、4℃で一晩静置してコーティング
し、さらに4倍希釈のブロックエース(雪印乳業社製)
でブロッキングを行い、アッセイ用のプレートを作製し
た。各濃度のクロルフェナピルを含む20%メタノール
溶液及び実施例2で作製したクロルフェナピルハプテン
/HRP結合体を含むPBS溶液の等量混合液を50μ
lずつ各ウェルに入れ、25℃で1.5時間反応させ
た。
LのOPD及び0.02%の過酸化水素を含むクエン酸
−リン酸緩衝液(pH5.0)を50μLずつ各ウェル
に入れ、室温で10分間静置して発色反応を行った。
加えて発色反応を停止させ、490nmの吸光度を測定
した。この結果を図1に示した。この直接競合阻害EL
ISA法を用いると、本発明のモノクローナル抗体42
E1−1−1は、クロルフェナピルを0.005ng/
mlないし100ng/mLの範囲で測定することがで
きた。
−1−1の直接競合阻害ELISA法によるクロルフェ
ナピルの測定を示す。
Claims (11)
- 【請求項1】以下の式(1): 【化1】 [式(1)中、 A1ないしA3は、同一であっても異なっていてもよく、
F、Cl、BrおよびIからなるハロゲン原子、CN、
CF3、ならびに炭素数1ないし3のアルキル基からな
るグループから選択され;A4は、F、Cl、Br又は
Iから選択されるハロゲン原子であり;そしてmは、1
ないし10の整数である]で表される構造を有する化合
物。 - 【請求項2】式(1)において、A1がCNであり、A2
がBrであり、A3がCF3であり、A4がClであり、
そしてmが5である、請求項1に記載の化合物。 - 【請求項3】請求項1又は2に記載の化合物と高分子化
合物又は標識物質との結合体。 - 【請求項4】請求項1又は2に記載の化合物と高分子化
合物を結合させることにより抗原を作製し、当該抗原を
用いることにより、以下の式(2): 【化2】 で表される構造を有する化合物に反応性を示す抗体を製
造することを特徴とする、式(2)で表される構造を有
する化合物に反応性を示す抗体又はそのフラグメントの
製造方法。 - 【請求項5】請求項3に記載の結合体を抗原として用い
ることにより製造された、式(2)の化合物に反応性を
示す抗体又はそのフラグメント。 - 【請求項6】モノクローナル抗体である、請求項5に記
載の抗体又はフラグメント。 - 【請求項7】モノクローナル抗体42E1−1−1であ
る、請求項5若しくは6に記載の抗体又はフラグメン
ト。 - 【請求項8】請求項5ないし7のいずれか1項に記載の
抗体又はフラグメントを産生するハイブリドーマ。 - 【請求項9】寄託番号FERM P−17311で寄託
されている、請求項8に記載のハイブリドーマ。 - 【請求項10】請求項5ないし7のいずれか1項に記載
の抗体又はフラグメントを用いることを特徴とする、式
(2)で表される化合物の免疫学的測定方法。 - 【請求項11】さらに、請求項1若しくは2に記載の化
合物、又は請求項3に記載の結合体を用いることを含
む、請求項10に記載の免疫学的測定方法。
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JP08317199A JP3842919B2 (ja) | 1999-03-26 | 1999-03-26 | クロルフェナピルのハプテン化合物、抗体及び測定方法 |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JP2006282547A (ja) * | 2005-03-31 | 2006-10-19 | Horiba Ltd | ニテンピラムのハプテン化合物、抗体、ハイブリドーマ、およびその測定手段、測定用キットまたは測定方法 |
CN103539716A (zh) * | 2013-10-31 | 2014-01-29 | 青岛农业大学 | 一组2-对氯苯基-4-取代甲基-5-三氟甲基-3-氰基吡咯化合物 |
CN111965359A (zh) * | 2020-07-20 | 2020-11-20 | 北京勤邦生物技术有限公司 | 一种检测溴虫腈的试纸条及方法 |
-
1999
- 1999-03-26 JP JP08317199A patent/JP3842919B2/ja not_active Expired - Fee Related
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CN111965359A (zh) * | 2020-07-20 | 2020-11-20 | 北京勤邦生物技术有限公司 | 一种检测溴虫腈的试纸条及方法 |
CN111965359B (zh) * | 2020-07-20 | 2023-06-16 | 北京勤邦科技股份有限公司 | 一种检测溴虫腈的试纸条及方法 |
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