JP2000281645A - Hapten compound of chlorphenapyl, antibody and measurement of the same - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain a new compound useful for producing an antibody reactive with chlorphenapyl or its fragment by introducing a functional group utilizable to bonding with a spacer arm and a polymeric compound into chlorphenapyl or its part. SOLUTION: This compound has a structure expressed by formula I [A1 to A3 are each a halogen such as F, Cl or Br, CN, CF3 or a 1-3C alkyl; A4 is a halogen such as F, Cl or Br; (m) is 1-10], e.g. chlorphenapyl hapten. The compound is obtained by reacting a compound of formula II with a compound of the formula: X-(CH2)m-COOP (X is a halogen; P is a protecting group of carboxyl group) in an organic solvent such as N,N-dimethylformamide in the presence of a condensing agent such as sodium hydride at from 0 deg.C to boiling point of a solvent for about 1-5 h and removing a protecting group of carboxyl group from the resultant compound.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、４−ブロモ−２−
（４−クロロフェニル）−１−エトキシメチル−５−ト
リフルオロメチルピロール−３−カルボニトリル（以
下、本明細書中「クロルフェナピル」と言う）のハプテ
ン化合物、抗原、抗体及びそのフラグメントに関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to 4-bromo-2-
The present invention relates to a hapten compound of (4-chlorophenyl) -1-ethoxymethyl-5-trifluoromethylpyrrole-3-carbonitrile (hereinafter, referred to as “chlorfenapyr”), an antigen, an antibody, and a fragment thereof.

【０００２】本発明はさらに、前記抗原、抗体及びその
フラグメントを用いた免疫学的測定方法に関する。[0002] The present invention further relates to an immunological assay method using the antigen, antibody and fragment thereof.

【０００３】[0003]

【従来の技術】クロルフェナピルは、以下の式（２）：BACKGROUND OF THE INVENTION Chlorfenapyr is represented by the following formula (2):

【０００４】[0004]

【化３】 Embedded image

【０００５】で表される構造を有する、フェニルピロー
ル系の殺虫剤である。より詳細には、クロルフェナピル
は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｕｍａｎｕｓの産生
するジオキサピロロマイシンを基に合成された、ピロー
ル環を有する新規骨格の化合物である。ｓｏｕｔｈｅｒ
ｎ ａｒｍｙｗｏｒｍ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｒｉ
ｄａｎｉａ）、ｔｏｂａｃｃｏ ｂｕｄｗｏｒｍ（Ｈｅ
ｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）などの鱗翅目害
虫、ｗｅｓｔｅｒｎ ｐｏｔａｔｏ ｌｅａｆｈｏｐｐ
ｅｒ（Ｅｍｐｏａｓｃａ ａｂｒｕｐｔａ）などの半翅
目害虫、ミナミキイロアザミウマなどのアザミウマ目害
虫、ナミハダニなどのＴｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ属のハダ
ニ、サビダニ類、ホコリダニ類といった幅広いスペクト
ラムの害虫やハダニ類に活性を有する。ワタ、野菜、果
樹におけるこれら害虫に対しては１２５−５００ｇ
ａ．ｉ．／ｈａで有効である。一方、ハダニの天敵であ
る捕食性ダニの１種（Ｍｅｔａｓｅｉｕｌｕｓ ｏｃｃ
ｉｄｅｎｔａｌｉｓ）に対する殺虫活性はハダニに対す
る殺虫活性と比較してかなり低く、実用上の悪影響は少
ないと考えられている。A phenylpyrrole insecticide having a structure represented by the following formula: More specifically, chlorfenapyr is a novel skeleton compound having a pyrrole ring, which is synthesized based on dioxapyrrolomycin produced by Streptomyces fumanus. souther
n armyworm (Spodoptera eri
dania), tobacco budworm (He
liothis virescens), western potato leafhopp
It has activity against a wide spectrum of pests and spider mites such as Hemiptera pests such as er (Empoasca abrupta), thrips pests such as Thrips palmi, and Tetranychus spp. 125-500g against these pests in cotton, vegetables and fruit trees
a. i. / Ha is effective. On the other hand, one species of predatory mite, Metaneiulus occc
insecticidal activity is significantly lower than that of spider mites, and is believed to have little practical adverse effect.

【０００６】クロルフェナピルは経皮活性と経***性を
有するが、少なくとも鱗翅目害虫に対しては経***性の
方が強い。また、速効性は有機リン剤やピレスロイド剤
に比べ劣るが、適度の残効性を持つ。ピレスロイド剤に
抵抗性であるｓｏｙｂｅａｎｌｏｏｐｅｒ（Ｐｓｅｕｄ
ｏｐｌｕｓｉａ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）やｔｏｂａｃｃ
ｏ ｂｕｄｗｏｒｍに対して感受性系統と変わらぬ活性
を示すなど、既存剤との交差抵抗性はみられない。日本
においてもコナガ、ハスモンヨトウ、シロイチモジヨト
ウ、ミナミキイロアザミウマ、ナミハダニ、カンザワハ
ダニなどの難防除害虫に高い防除効果を示すことが知ら
れている。作用機作はミトコンドリアにおける酸化的リ
ン酸化の脱共役である（新農薬の開発展望 第７１頁お
よび第７６頁−第７８頁、 １９９７年１１月２８日
（株）シーエムシー 発行）。[0006] Chlorfenapyr has a transdermal activity and an oral activity, but it is more active at least against lepidopteran pests. In addition, the quick-acting properties are inferior to those of organophosphorus agents and pyrethroids, but have moderate residual effects. Soybeanlooper (Pseud) which is resistant to pyrethroids
oplusia includens) and tobacc
There is no cross-resistance with the existing agents, such as showing the same activity as the susceptible strain to o budworm. Also in Japan, it is known that it shows a high control effect on difficult-to-control pests such as Japanese moth, spodoptera litura, Japanese scorpion armyworm, Thrips palmi nymph, Thrips spider mite, and Kanzawa spider mite. The mechanism of action is uncoupling of oxidative phosphorylation in mitochondria (Prospects for the development of new pesticides 71 and 76-78, November 28, 1997)
Issued by CMC Corporation).

【０００７】近年、土壌、水、大気等の環境中での残留
農薬や、最近特に増加してきた輸入農産物のポストハー
ベスト農薬等の残留に大きな社会的関心が寄せられてい
る。クロルフェナピルについては、環境庁による農薬登
録保留基準値が、例えば、みかんで０．５ｐｐｍ、第二
大粒果実類で１ｐｐｍ、小粒果実類で０．２ｐｐｍ、第
二果菜類で１ｐｐｍ、第一葉菜類で１ｐｐｍ、第二葉菜
類で３ｐｐｍ、根・茎類で０．１ｐｐｍ、てんさい０．
５ｐｐｍ、茶５０ｐｐｍ等定められている（改訂３版
農薬登録保留基準ハンドブック 第２５８頁−第２６０
頁、１９９８年９月２５日、化学工業日報社 発行）。
よって、環境や食品に関する安全確保のためには、これ
らに含有される、クロルフェナピルの量を迅速かつ正確
に測定することが必要である。[0007] In recent years, there has been great social interest in pesticide residues in the environment such as soil, water, and the atmosphere, and in post-harvest pesticides in imported agricultural products, which have recently increased in particular. Regarding chlorfenapyr, the standard value of the registration of agrochemicals by the Environment Agency is, for example, 0.5 ppm for tangerines, 1 ppm for second large fruits, 0.2 ppm for small fruits, 1 ppm for second fruits and vegetables, 1 ppm for first leaf vegetables. , 3 ppm for second leafy vegetables, 0.1 ppm for roots and stems, 0.
5 ppm, tea 50 ppm, etc. (revised 3rd edition)
Pesticide Registration Suspension Standard Handbook 258 pages-260
P., September 25, 1998, published by The Chemical Daily).
Therefore, in order to ensure the safety of the environment and foods, it is necessary to quickly and accurately measure the amount of chlorfenapyr contained therein.

【０００８】従来、例えば農作物中のクロルフェナピル
は、果実、野菜、茶等から抽出し、精製した後、ガスク
ロマトグラフィー（ＧＣ）により分析されてきた。即
ち、例えば、試料をアセトンで抽出し、ヘキサンに転溶
した後、ヘキサン−ジエチルエーテルを溶媒として用い
たケイ酸マグネシウムカラムクロマトグラフィーで精製
後、ＧＣで測定する方法等が採用されている。これらの
方法は、試料の調製が煩雑で多大の手順と時間を必要と
し、分析に熟練を要すること、並びに、測定装置や設備
等に高額の費用を必要とする等の問題点がある。クロル
フェナピルの測定は短時間で膨大な数の試料の分析結果
を出す必要があり、精度面だけでなく、簡便性、迅速性
及び経済性をも具備した新規測定方法が要求されてきて
いる。Conventionally, for example, chlorfenapyr in agricultural crops has been extracted from fruits, vegetables, tea and the like, purified, and analyzed by gas chromatography (GC). That is, for example, a method is employed in which a sample is extracted with acetone, transferred to hexane, purified by magnesium silicate column chromatography using hexane-diethyl ether as a solvent, and then measured by GC. These methods have problems in that the preparation of the sample is complicated, requires a large amount of procedures and time, requires a high level of skill in the analysis, and requires high costs for measuring devices and equipment. In the measurement of chlorfenapyr, it is necessary to obtain an analysis result of an enormous number of samples in a short time, and a new measurement method not only in terms of accuracy but also in simplicity, speed, and economy has been demanded.

【０００９】免疫学的測定方法は、抗体が抗原を特異的
に認識する抗原抗体反応に基づいて抗原や抗体の検出を
行う方法であり、その優れた精度、簡便性、迅速性、経
済性から近年注目を集めてきている。免疫学的測定方法
においては検出方法として非常に多種の標識、例えば、
酵素、放射性トレーサー、化学発光あるいは蛍光物質、
金属原子、ゾル、ラテックス及びバクテリオファージが
適用されてきた。An immunoassay is a method for detecting an antigen or an antibody based on an antigen-antibody reaction in which the antibody specifically recognizes the antigen. Due to its excellent accuracy, simplicity, speed, and economy, In recent years, it has been attracting attention. In an immunoassay, a very wide variety of labels can be used as a detection method, for example,
Enzymes, radiotracers, chemiluminescent or fluorescent substances,
Metal atoms, sols, latexes and bacteriophages have been applied.

【００１０】免疫学的測定方法の中でも、酵素を使用す
る酵素免疫測定法（ＥＩＡ）は経済性・利便性から特に
優れたものとして広く使用されるに至っている。酵素免
疫測定法についての優れた論評が、Ｔｉｊｓｓｅｎ
Ｐ，“Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ
ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ” ｉｎＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｍｓｔｅｒ
ｄａｍ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｏｘｆｏｒｄ ＩＳＢＮ
０−７２０４−４２００−１（１９９０）に記載され
ている。[0010] Among the immunoassays, the enzyme immunoassay (EIA) using an enzyme has been widely used as being particularly excellent in terms of economy and convenience. An excellent review of enzyme immunoassays can be found in Tijssen
P, "Practice and theory of
Enzyme immunoassays ”inL
laboratory technologies in b
iochemistry and molecular
biology, Elsevier Amster
dam New York, Oxford ISBN
0-7204-4200-1 (1990).

【００１１】一般に、分子量が大きな分子については、
それ以上修飾することなく動物に接種することにより、
適当な免疫反応を惹起し、抗原を認識する抗体を産生さ
せることができる。しかし、クロルフェナピルのような
低分子化合物は通常動物に接種したとき免疫応答を引き
出すことができない。これらの分子は免疫原性を有する
高分子化合物に結合させることによって初めて一団のエ
ピトープとして行動し、Ｔ細胞受容体の存在下で免疫応
答を起こし、その結果、一群のＢリンパ球により抗体が
産生される。このように高分子化合物と結合させて初め
て免疫原性を生じる分子を総称して「ハプテン」と言
う。Generally, for a molecule having a large molecular weight,
By inoculating animals without further modification,
An appropriate immune response can be elicited to produce an antibody that recognizes the antigen. However, small molecule compounds such as chlorfenapyr usually cannot elicit an immune response when inoculated into animals. For the first time, these molecules act as a panel of epitopes by binding to immunogenic macromolecules and elicit an immune response in the presence of the T cell receptor, resulting in the production of antibodies by a group of B lymphocytes. Is done. Molecules that produce immunogenicity only when bound to a polymer compound in this way are collectively referred to as “haptens”.

【００１２】しかし、低分子化合物を高分子化合物と結
合させたものを抗原としても、得られた抗体は望む分子
を認識しないか、あるいはごく低い親和性しかもたない
場合がしばしばある。そのため、一般に低分子化合物そ
のものではなく、結合に利用できる官能基と共にスペー
サーアーム（結合手）を導入したものをハプテンとして
使用する必要がある。しかしその場合に、結合手／官能
基の配置、結合手の大きさ等の全ての問題を考慮して導
入が適切に行われたものを使用しないと、好ましい抗体
は得られない。適切な導入は個々の分子に応じて工夫し
なければならない。However, even when a low molecular compound is combined with a high molecular compound as an antigen, the resulting antibody often does not recognize the desired molecule or has only a very low affinity. Therefore, it is generally necessary to use not a low molecular compound itself but a hapten into which a spacer arm (bond) is introduced together with a functional group available for bonding. However, in such a case, a preferable antibody cannot be obtained unless one having been appropriately introduced in consideration of all problems such as the arrangement of the bond / functional group and the size of the bond is used. Proper introduction must be devised for each molecule.

【００１３】クロルフェナピルについては、その必要性
が非常に高かったにもかかわらず、適切な抗体はもとよ
り、そのような抗体を作製するためのハプテンも本発明
前には得られていなかった。[0013] Despite the very high need for chlorfenapyr, not only the appropriate antibodies but also the haptens for producing such antibodies had not been obtained prior to the present invention.

【００１４】[0014]

【発明が解決しようとする課題】本発明は、クロルフェ
ナピルに反応する新規な抗体若しくはそのフラグメン
ト、及びその作製方法を提供することを目的とする。
尚、本明細書において抗体の「フラグメント」とは、抗
原と結合可能な抗体の一部分、例えばＦ_ab断片等を意味
する。An object of the present invention is to provide a novel antibody or a fragment thereof that reacts with chlorfenapyr, and a method for producing the same.
As used herein, the term “fragment” of an antibody means a part of an antibody capable of binding to an antigen, for example, a _Fab fragment or the like.

【００１５】本発明はその一態様において、クロルフェ
ナピルに反応性を有するモノクローナル抗体を提供す
る。本発明は、また、クロルフェナピルに反応性を有す
る新規な抗体を作製するための抗原を構成するハプテン
化合物を提供することを目的とする。[0015] In one aspect, the present invention provides a monoclonal antibody reactive to chlorfenapyr. Another object of the present invention is to provide a hapten compound constituting an antigen for producing a novel antibody reactive with chlorfenapyr.

【００１６】本発明は、さらに、クロルフェナピルハプ
テンと高分子化合物との結合体を提供することを目的と
する。本発明は、さらにまた、前記抗体又はそのフラグ
メントを産生するハイブリドーマを提供することを目的
とする。Another object of the present invention is to provide a conjugate of chlorfenapyr hapten and a polymer compound. Another object of the present invention is to provide a hybridoma that produces the antibody or a fragment thereof.

【００１７】本発明は、さらに、前記抗体若しくはその
フラグメント及び／又は前記クロルフェナピルハプテン
と高分子化合物との結合体を使用することを含む、クロ
ルフェナピルの免疫学的測定方法を提供することを目的
とする。Another object of the present invention is to provide a method for immunological measurement of chlorfenapyr, which comprises using a conjugate of the antibody or a fragment thereof and / or the chlorfenapyr hapten with a polymer compound. .

【００１８】[0018]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を重ねた結果、クロルフェナピル又はその部分にスペー
サーアーム及び高分子化合物との結合に利用できる官能
基を導入した、クロルフェナピルの誘導体をハプテンと
して使用することにより、前記化合物に反応性を有する
抗体を得ることに成功し、本発明の完成に至った。Means for Solving the Problems As a result of intensive studies, the present inventors have developed a hapten derivative of chlorfenapyr in which chlorfenapyr or a functional group usable for bonding to a polymer compound is introduced into chlorfenapyr or a portion thereof. As a result, an antibody having reactivity with the compound was successfully obtained, and the present invention was completed.

【００１９】本発明の対象となるクロルフェナピルは、
以下の式（２）：Chlorfenapyr which is an object of the present invention is
The following equation (2):

【００２０】[0020]

【化４】 Embedded image

【００２１】で表される構造を有する化合物である。本
発明の抗体は、例えば、クロルフェナピルの部分にスペ
ーサーアーム及び結合に利用できる官能基を導入した誘
導体をハプテンとして適当な高分子化合物と結合させた
ものを抗原として用いることによって得ることができ
る。例えば、以下の式（１）：A compound having a structure represented by the following formula: The antibody of the present invention can be obtained, for example, by using, as an antigen, a derivative obtained by introducing a spacer arm and a functional group available for binding into a chlorfenapyr portion as a hapten and binding to an appropriate polymer compound. For example, the following equation (1):

【００２２】[0022]

【化５】 Embedded image

【００２３】［式（１）中、Ａ¹ないしＡ³は、同一であ
っても異なっていてもよく、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩか
らなるハロゲン原子、ＣＮ、ＣＦ₃、ならびに炭素数１
ないし３のアルキル基からなるグループから選択され；
Ａ⁴は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩから選択されるハロゲン
原子であり；そしてｍは、１ないし１０の整数である］
で表される構造を有する化合物を、抗体作製のためのハ
プテンとして使用する。[In the formula (1), A ¹ to A ³ may be the same or different, and include a halogen atom composed of F, Cl, Br and I, CN, CF ₃ ,
Selected from the group consisting of 1-3 alkyl groups;
A ⁴ is a halogen atom selected from F, Cl, Br or I; and m is an integer from 1 to 10]
Is used as a hapten for preparing an antibody.

【００２４】式（１）中、好ましくは、Ａ¹がＣＮであ
り、Ａ²がＢｒであり、Ａ³がＣＦ₃であり、Ａ⁴がＣｌで
ある。好ましくは、ｍは５である。本発明は、前記ハプ
テン化合物、ハプテン化合物と高分子化合物との結合
体、クロルフェナピルに反応する抗体及びその作製方
法、並びに該ハプテン化合物又は該抗体を用いるクロル
フェナピルの免疫学的測定方法に関する。クロルフェナピルハプテンの作製 式（１）で表されるクロルフェナピルハプテンは、公知
の方法に従って製造することができる。限定するわけで
はないが、例えば以下のような方法を用いることができ
る。In the formula (1), preferably, A ¹ is CN, A ² is Br, A ³ is CF ₃ and A ⁴ is Cl. Preferably, m is 5. The present invention relates to the hapten compound, a conjugate of the hapten compound and a polymer compound, an antibody that reacts with chlorfenapyr, a method for producing the same, and a method for immunological measurement of chlorfenapyr using the hapten compound or the antibody. Preparation of chlorfenapyr hapten The chlorfenapyr hapten represented by the formula (1) can be produced according to a known method. Although not limited, for example, the following method can be used.

【００２５】例えば、Ａ²がＦ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩから
選択されるハロゲン原子の場合、まず、以下の式（Ｚ
１）：For example, when A ² is a halogen atom selected from F, Cl, Br or I, first, the following formula (Z
1):

【００２６】[0026]

【化６】 Embedded image

【００２７】［式（Ｚ１）中、Ａ¹、Ａ³およびＡ⁴は先
に定義した通りである］で表される構造を有する化合物
に、有機溶媒中、縮合剤の存在下、以下の式（Ｚ２）：In the formula (Z1), A ¹ , A ³ and A ⁴ are as defined above, and a compound represented by the following formula in an organic solvent in the presence of a condensing agent: (Z2):

【００２８】[0028]

【化７】 Embedded image

【００２９】［式（Ｚ２）中、Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又
はＩから選択されるハロゲン原子であり；Ｐは、カルボ
キシル基の保護基であり；そしてｍは先に定義した通り
である］で表される構造を有する化合物を反応させて、
以下の式（Ｚ３）：[In the formula (Z2), X is a halogen atom selected from F, Cl, Br or I; P is a protecting group for a carboxyl group; and m is as defined above. A compound having a structure represented by the following formula:
The following formula (Z3):

【００３０】[0030]

【化８】 Embedded image

【００３１】［式（Ｚ３）中、Ａ¹、Ａ³、Ａ⁴、Ｐおよ
びｍは先に定義した通りである］で表される構造を有す
る化合物を合成する。式（Ｚ１）化合物は、公知の方
法、例えば特開平１−１３５７０１の実施例５６および
５７の記載に準じて合成することができる。A compound having a structure represented by the formula (Z3), wherein A ¹ , A ³ , A ⁴ , P and m are as defined above, is synthesized. The compound of the formula (Z1) can be synthesized according to a known method, for example, as described in Examples 56 and 57 of JP-A-1-135701.

【００３２】Ｐのカルボキシル基の保護基は公知のもの
でよく、具体例として、例えば、メチル基、エチル基、
ｔｅｒｔ−ブチル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジ
ル基、３，４−ジメトキシベンジル基、トリクロロエチ
ル基、トリメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチル
シリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基、トリ
エチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、トリメチ
ルシリルエチル基等を挙げることができる。The protecting group for the carboxyl group of P may be a known group, and specific examples include, for example, a methyl group, an ethyl group,
tert-butyl group, benzyl group, p-methoxybenzyl group, 3,4-dimethoxybenzyl group, trichloroethyl group, trimethylsilyl group, tert-butyldimethylsilyl group, tert-butyldiphenylsilyl group, triethylsilyl group, triisopropylsilyl And a trimethylsilylethyl group.

【００３３】式（Ｚ３）の化合物合成のための有機溶媒
としては、例えば、Ｎ．Ｎ−ジメチルホルムアミド、ベ
ンゼン、トルエン、キシレン、クロロホルム、四塩化炭
素、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトン、アセ
トニトリル、ジメチルスルホキシド等を用いることがで
きる。縮合剤としては、水素化ナトリウム、ナトリウ
ム、ナトリウムメチラート、ナトリウムエチラート等を
用いることができる。As the organic solvent for synthesizing the compound of the formula (Z3), for example, N.P. N-dimethylformamide, benzene, toluene, xylene, chloroform, carbon tetrachloride, tetrahydrofuran, dioxane, acetone, acetonitrile, dimethylsulfoxide and the like can be used. As the condensing agent, sodium hydride, sodium, sodium methylate, sodium ethylate and the like can be used.

【００３４】反応は、０℃から溶媒の沸点の温度、好ま
しくは８０℃から１５０℃で、１０分から１５時間、好
ましくは、１時間から５時間行う 次いで、式（Ｚ３）の化合物からＰで表されるカルボキ
シル基の保護基を除去することにより、以下の式（Ｚ
４）：The reaction is carried out at a temperature from 0 ° C. to the boiling point of the solvent, preferably at 80 ° C. to 150 ° C., for 10 minutes to 15 hours, preferably for 1 hour to 5 hours. By removing the protecting group of the carboxyl group, the following formula (Z
4):

【００３５】[0035]

【化９】 Embedded image

【００３６】［式（Ｚ４）中、Ａ¹、Ａ³、Ａ⁴およびｍ
は先に定義した通りである］で表される構造を有する化
合物を合成する。カルボキシル基の保護基の除去は、ア
ルカリ加水分解、酸加水分解等の公知の方法で行うこと
ができる。In the formula (Z4), A ¹ , A ³ , A ⁴ and m
Is as defined above] to synthesize a compound having a structure represented by the following formula: The removal of the carboxyl-protecting group can be carried out by a known method such as alkali hydrolysis and acid hydrolysis.

【００３７】すなわち、アルカリ加水分解の場合は、式
（Ｚ３）の化合物を、好ましくはメタノール、エタノー
ル、テトラヒドロフラン、エチレングリコール等の有機
溶媒に溶解し、次いで炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリ
ウム、炭酸カリウム、水酸化リチウム、水酸化ナトリウ
ム又は水酸化カリウム等の水溶液を加えて、０℃から溶
媒の沸点、好ましくは０℃から５０℃で、５分から１０
時間、好ましくは３０分から２時間撹拌反応させること
により式（Ｚ４）の化合物を得ることができる。That is, in the case of alkali hydrolysis, the compound of the formula (Z3) is preferably dissolved in an organic solvent such as methanol, ethanol, tetrahydrofuran, ethylene glycol and the like, and then sodium hydrogencarbonate, sodium carbonate, potassium carbonate and water. An aqueous solution such as lithium oxide, sodium hydroxide or potassium hydroxide is added and the mixture is heated at 0 ° C to the boiling point of the solvent, preferably at 0 ° C to 50 ° C for 5 minutes to 10 minutes.
The compound of formula (Z4) can be obtained by stirring and reacting for a period of time, preferably 30 minutes to 2 hours.

【００３８】また、酸加水分解の場合は、式（Ｚ３）の
化合物を、好ましくは酢酸、蟻酸、ベンゼン、ジクロロ
メタン、１，２−ジクロロエタン等の有機溶媒に溶解
し、次いで塩酸、硫酸、三フッ化ホウ素ジエチルエーテ
ル錯体、トリフルオロ酢酸、トリフルオロメタンスルホ
ン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等を加えて、０℃から溶
媒の沸点、好ましくは０℃から５０℃で、５分から１０
時間、好ましくは１時間から５時間撹拌反応させること
により式（Ｚ４）の化合物を得ることができる。In the case of acid hydrolysis, the compound of the formula (Z3) is preferably dissolved in an organic solvent such as acetic acid, formic acid, benzene, dichloromethane, 1,2-dichloroethane and the like. Boron hydride diethyl ether complex, trifluoroacetic acid, trifluoromethanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid and the like are added, and the mixture is heated at 0 ° C to the boiling point of the solvent, preferably at 0 ° C to 50 ° C for 5 minutes to 10 minutes.
The compound of formula (Z4) can be obtained by stirring and reacting for 1 hour to 5 hours.

【００３９】更に、Ｐがベンジル基の場合、除去は水素
による加水素分解によっても行うことができる。更にま
た、Ｐがシリル原子を含む基の場合、脱保護はテトラ−
ｎ−ブチルアンモニウムフルオリド、ピリジニウムフル
オリド等のフッ素アニオンを発生させる試薬によっても
行うことができる。Further, when P is a benzyl group, the removal can be carried out by hydrogenolysis with hydrogen. Furthermore, when P is a group containing a silyl atom, the deprotection is
The reaction can also be performed using a reagent that generates a fluorine anion such as n-butylammonium fluoride and pyridinium fluoride.

【００４０】さらに、式（Ｚ４）の化合物に、有機溶媒
中又は無溶媒で、塩素、臭素、塩化スリフリル、Ｎ−ブ
ロモこはく酸イミド等のハロゲン化剤を反応させること
により、Ａ²がＣｌ又はＢｒから選択されるハロゲン原
子である、式（１）の化合物を得ることができる。Further, by reacting the compound of the formula (Z4) with a halogenating agent such as chlorine, bromine, thrifyl chloride, N-bromosuccinimide in an organic solvent or without solvent, A ² is converted to Cl or A compound of the formula (1), which is a halogen atom selected from Br, can be obtained.

【００４１】有機溶媒としては、酢酸、四塩化炭素、ク
ロロホルム、ジオキサン、テトラヒドロフラン等を用い
ることができ、鉄粉や塩化アルミニウム等の触媒を用い
ることにより、反応を促進することができる。反応は、
０℃から溶媒の沸点の温度、好ましくは室温から１５０
℃で、１０分から５０時間、好ましくは、５時間から２
０時間行う。As the organic solvent, acetic acid, carbon tetrachloride, chloroform, dioxane, tetrahydrofuran or the like can be used, and the reaction can be promoted by using a catalyst such as iron powder or aluminum chloride. The reaction is
0 ° C. to the boiling point of the solvent, preferably room temperature to 150 ° C.
C. for 10 minutes to 50 hours, preferably 5 hours to 2 hours.
Perform for 0 hours.

【００４２】Ａ²がハロゲン原子以外の式（１）の化合
物も、同様に公知の方法を用いて合成することができ
る。上述したような製造方法によって得られた化合物
を、必要に応じシリカゲルクロマトグラフィー又は再結
晶操作等を行うことにより、さらに高純度の精製品とす
ることができる。Compounds of the formula (1) in which A ² is other than a halogen atom can also be synthesized by a known method. By subjecting the compound obtained by the above-mentioned production method to silica gel chromatography or recrystallization operation or the like as necessary, a purified product with higher purity can be obtained.

【００４３】以下、本発明の抗原、抗体の作製、及び免
疫化学的測定法について説明する。尚、これらの調製は
公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究
法（日本生化学会編）等に記載の方法に従って行うこと
ができる。クロルフェナピルハプテンと高分子化合物との結合体の
作製 上述のように合成されたクロルフェナピルハプテンを適
当な高分子化合物に結合させてから免疫用抗原若しくは
固相化用抗原として使用する。Hereinafter, the preparation of the antigen and antibody of the present invention and the immunochemical assay will be described. In addition, these preparations can be carried out according to a known method, for example, a method described in Seikagaku Experimental Lecture, Immunobiochemical Research Method (edited by the Japanese Biochemical Society), or the like. Of conjugates of chlorfenapyr hapten and high molecular compounds
Preparation The chlorfenapyr hapten synthesized as described above is bound to an appropriate polymer compound and then used as an antigen for immunization or an antigen for immobilization.

【００４４】好ましい高分子化合物の例としては、スカ
シガイへモシアニン（以下、「ＫＬＨ」と言う）、卵白
アルブミン（以下、「ＯＶＡ」と言う）、ウシ血清アル
ブミン（以下、「ＢＳＡ」と言う）、ウサギ血清アルブ
ミン（以下、「ＲＳＡ」と言う）などがある。ＫＬＨ及
びＢＳＡが好ましい。Examples of preferred high molecular compounds include keyhole limpet hemocyanin (hereinafter referred to as “KLH”), ovalbumin (hereinafter referred to as “OVA”), bovine serum albumin (hereinafter referred to as “BSA”), Rabbit serum albumin (hereinafter referred to as “RSA”) and the like. KLH and BSA are preferred.

【００４５】クロルフェナピルハプテンと高分子化合物
との結合は、例えば、活性化エステル法（Ａ．Ｅ．ＫＡ
ＲＵ ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈ
ｅｍ．４２ ３０１−３０９（１９９４））、又は混合
酸無水物法（Ｂ．Ｆ．Ｅｒｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３４ １０９０‐１
０９４（１９５４））等の公知の方法によって行うこと
ができる。The binding between chlorfenapyr hapten and a polymer compound can be performed, for example, by the activated ester method (AEKA).
RU et al. : J. Agric. Food Ch
em. 42 301-309 (1994)), or the mixed acid anhydride method (BF Erlanger et a).
l. : J. Biol. Chem. 234 1090-1
094 (1954)).

【００４６】活性化エステル法は、一般に以下のように
行うことができる。まず、ハプテン化合物を有機溶媒に
溶解し、カップリング剤の存在下にてＮ−ヒドロキシこ
はく酸イミドと反応させ、Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミ
ド活性化エステルを生成させる。The activated ester method can be generally carried out as follows. First, a hapten compound is dissolved in an organic solvent and reacted with N-hydroxysuccinimide in the presence of a coupling agent to form an N-hydroxysuccinimide activated ester.

【００４７】カップリング剤としては、縮合反応に慣用
されている通常のカップリング剤を使用でき、例えば、
ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダ
ゾール、水溶性カルボジイミド等が含まれる。有機溶媒
としては、例えば、ジメチルスルホキシド（以下、「Ｄ
ＭＳＯ」と言う）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（以
下、「ＤＭＦ」と言う）、ジオキサン等が使用できる。
反応に使用するハプテン化合物とＮ−ヒドロキシこはく
酸イミドのモル比は好ましくは１：１０から１０：１、
より好ましくは１：１から１：１０、最も好ましくは
１：１である。反応温度は、０℃から１００℃、好まし
くは５℃から５０℃、より好ましくは２２℃から２７℃
で、反応時間は５分から２４時間、好ましくは３０分か
ら６時間、より好ましくは１時間から２時間である。As the coupling agent, an ordinary coupling agent commonly used for a condensation reaction can be used.
Dicyclohexylcarbodiimide, carbonyldiimidazole, water-soluble carbodiimide and the like. Examples of the organic solvent include dimethyl sulfoxide (hereinafter referred to as “D
MSO), N, N-dimethylformamide (hereinafter, referred to as "DMF"), dioxane, and the like.
The molar ratio of the hapten compound and N-hydroxysuccinimide used in the reaction is preferably 1:10 to 10: 1,
More preferably from 1: 1 to 1:10, most preferably 1: 1. The reaction temperature is 0 ° C to 100 ° C, preferably 5 ° C to 50 ° C, more preferably 22 ° C to 27 ° C.
The reaction time is 5 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 6 hours, more preferably 1 hour to 2 hours.

【００４８】カップリング反応後、反応液を高分子化合
物を溶解した溶液に加え反応させると、例えば高分子化
合物が遊離のアミノ基を有する場合、当該アミノ基とハ
プテン化合物のカルボキシル基の間に酸アミド結合が生
成される。反応温度は、０℃から６０℃、好ましくは５
℃から４０℃、反応時間は５分から２４時間、好ましく
は１時間から１６時間、より好ましくは１時間から２時
間である。反応物を、透析、脱塩カラム等によって精製
して、クロルフェナピルハプテンと高分子化合物との結
合体を得ることができる。After the coupling reaction, the reaction solution is added to a solution in which the polymer compound is dissolved and reacted. For example, when the polymer compound has a free amino group, an acid is added between the amino group and the carboxyl group of the hapten compound. An amide bond is formed. The reaction temperature is from 0 ° C to 60 ° C, preferably 5 ° C.
The reaction time is 5 minutes to 24 hours, preferably 1 hour to 16 hours, more preferably 1 hour to 2 hours. The reaction product can be purified by dialysis, a desalting column, or the like to obtain a conjugate of chlorfenapyr hapten and a polymer compound.

【００４９】一方、混合酸無水物法において用いられる
混合酸無水物は、カルボン酸とハロ蟻酸エステルとの反
応により得られ、これを高分子化合物と反応させること
により目的とするハプテン−高分子化合物結合体が製造
される。この反応は塩基性化合物の存在下に行われる。
塩基性化合物としては、例えば、トリブチルアミン、ト
リエチルアミン、トリメチルアミン、Ｎ−メチルモルホ
リン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、ＤＢＮ、
ＤＢＵ、ＤＡＢＣＯ等の有機塩基、炭酸カリウム、炭酸
ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム等
の無機塩基等が挙げられる。該反応は、通常マイナス２
０℃から１５０℃、好ましくは０℃から１００℃におい
て行われ、反応時間は５分から１０時間、好ましくは５
分から２時間である。得られた混合酸無水物と高分子化
合物との反応は、通常マイナス２０℃から１００℃、好
ましくは０℃から５０℃において行われ、反応時間は５
分から１０時間、好ましくは５分から５時間である。混
合酸無水物法は一般に溶媒中で行われる。溶媒として
は、混合酸無水物法に慣用されているいずれの溶媒も使
用可能であり、具体的にはジオキサン、ジエチルエーテ
ル、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン等のエーテ
ル類、ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン
等のハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トルエン、キシ
レン等の芳香族炭化水素類、酢酸メチル、酢酸エチル等
のエステル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチ
ルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸トリアミド等の非
プロトン性極性溶媒等が挙げられる。混合酸無水物法に
おいて使用されるハロ蟻酸エステルとしては、例えばク
ロロ蟻酸メチル、ブロモ蟻酸メチル、クロロ蟻酸エチ
ル、ブロモ蟻酸エチル、クロロ蟻酸イソブチル等が挙げ
られる。当該方法におけるハプテンとハロ蟻酸エステル
と高分子化合物の使用割合は、広い範囲から適宜選択さ
れ得る。On the other hand, the mixed acid anhydride used in the mixed acid anhydride method is obtained by a reaction between a carboxylic acid and a haloformate, and the resulting hapten-polymer compound is reacted with the polymer compound. A conjugate is produced. This reaction is performed in the presence of a basic compound.
Examples of the basic compound include tributylamine, triethylamine, trimethylamine, N-methylmorpholine, pyridine, N, N-dimethylaniline, DBN,
Examples include organic bases such as DBU and DABCO, and inorganic bases such as potassium carbonate, sodium carbonate, potassium hydrogen carbonate, and sodium hydrogen carbonate. The reaction is usually minus 2
The reaction is carried out at 0 ° C to 150 ° C, preferably at 0 ° C to 100 ° C, and the reaction time is 5 minutes to 10 hours, preferably 5 minutes.
Minutes to 2 hours. The reaction between the obtained mixed acid anhydride and the polymer compound is usually performed at a temperature of −20 ° C. to 100 ° C., preferably 0 ° C. to 50 ° C., and the reaction time is 5 minutes.
Minutes to 10 hours, preferably 5 minutes to 5 hours. The mixed anhydride method is generally performed in a solvent. As the solvent, any solvent commonly used in the mixed acid anhydride method can be used, and specifically, ethers such as dioxane, diethyl ether, tetrahydrofuran, and dimethoxyethane, and halogenated compounds such as dichloromethane, chloroform, and dichloroethane. Hydrocarbons, aromatic hydrocarbons such as benzene, toluene and xylene, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, aprotic polar solvents such as N, N-dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, hexamethylphosphoric triamide, etc. Is mentioned. Examples of the haloformate used in the mixed acid anhydride method include methyl chloroformate, methyl bromoformate, ethyl chloroformate, ethyl bromoformate, and isobutyl chloroformate. The proportions of the hapten, the haloformate and the polymer compound used in the method can be appropriately selected from a wide range.

【００５０】また、上記と同様の方法により、酵素等の
標識物質をクロルフェナピルハプテンに結合させたもの
を、免疫学的測定方法において使用することができる。
標識物質としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下
「ＨＲＰ」と言う）、アルカリフォスファターゼ等の酵
素、フルオレセインイソシアネート、ローダミン等の蛍
光物質、³²Ｐ、¹²⁵Ｉ等の放射性物質、化学発光物質な
どがある。ポリクローナル抗体の作製 クロルフェナピルハプテンと高分子化合物との結合体を
使用して、慣用化された方法により本発明のポリクロー
ナル抗体を作製することができる。例えば、クロルフェ
ナピルハプテン／ＢＳＡ結合体をリン酸ナトリウム緩衝
液（以下、「ＰＢＳ」と言う）に溶解し、フロイント完
全アジュバント又は不完全アジュバント、あるいはミョ
ウバン等の補助剤と混合したものを、免疫用抗原として
動物に免疫することによって得ることができる。免疫さ
れる動物としては当該分野で常用されるものをいずれも
使用できるが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤ
ギ、ウマ等を挙げることができる。Further, a substance obtained by binding a labeling substance such as an enzyme to chlorfenapyr hapten by the same method as described above can be used in an immunological assay.
The labeling substance, (hereinafter referred to "HRP") horseradish peroxidase, an enzyme such as alkaline phosphatase, fluorescein isothiocyanate, a fluorescent substance such as rhodamine, radioactive substances such as ³² P, ¹²⁵ I, and the like chemiluminescent substance. Preparation of Polyclonal Antibody The polyclonal antibody of the present invention can be prepared by a conventional method using a conjugate of chlorfenapyr hapten and a polymer compound. For example, a chlorfenapyr hapten / BSA conjugate dissolved in a sodium phosphate buffer (hereinafter referred to as “PBS”) and mixed with an adjuvant such as Freund's complete adjuvant or incomplete adjuvant, or alum, is used as an antigen for immunization. By immunizing animals. As the animal to be immunized, any of those commonly used in the art can be used, and examples thereof include mice, rats, rabbits, goats, and horses.

【００５１】免疫の際の投与法は、皮下注射、腹腔内注
射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射のいずれでもよ
いが、皮下注射又は腹腔内注射が好ましい。免疫は１回
又は適当な間隔で、好ましくは１週間ないし５週間の問
隔で複数回行うことができる。The administration method upon immunization may be any of subcutaneous injection, intraperitoneal injection, intravenous injection, intradermal injection, and intramuscular injection, but subcutaneous injection or intraperitoneal injection is preferred. Immunization can be performed once or at appropriate intervals, preferably multiple times at intervals of one to five weeks.

【００５２】免疫した動物から血液を採取し、そこから
分離した血清を用い、クロルフェナピルと反応するポリ
クローナル抗体の存在を評価することができる。本発明
においてクロルフェナピルハプテンと高分子化合物との
結合体を免疫用抗原として得られた抗血清は、後述する
間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法において少なくとも約１００
０ｎｇ／ｍｌの濃度でクロルフェナピルと反応できる
（実施例４）。モノクローナル抗体の作製 クロルフェナピルハプテンと高分子化合物との結合体を
使用して、公知の方法により本発明のモノクローナル抗
体を作製することができる。Blood is collected from the immunized animal, and serum separated therefrom can be used to evaluate the presence of a polyclonal antibody that reacts with chlorfenapyr. In the present invention, an antiserum obtained by using a conjugate of chlorfenapyr hapten and a polymer compound as an antigen for immunization has an antiserum of at least about 100 in the indirect competition inhibition ELISA method described below.
It can react with chlorfenapyr at a concentration of 0 ng / ml (Example 4). Preparation of Monoclonal Antibody Using the conjugate of chlorfenapyr hapten and a polymer compound, the monoclonal antibody of the present invention can be prepared by a known method.

【００５３】モノクローナル抗体の製造にあたっては、
少なくとも下記のような作業工程が必要である。 （ａ）免疫用抗原として使用するクロルフェナピルハプ
テンと高分子化合物との結合体の作製 （ｂ）動物への免疫 （ｃ）血液の採取、アッセイ、及び抗体産生細胞の調製 （ｄ）ミエローマ細胞の調製 （ｅ）抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合とハ
イブリドーマの選択的培養 （ｆ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスク
リーニングと細胞クローニング （ｇ）ハイブリドーマの培養又は動物へのハイブリドー
マの移植によるモノクローナル抗体の調製 （ｈ）調製されたモノクローナル抗体の反応性の測定等 モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製す
るための常法は、例えば、ハイブリドーマ テクニック
ス（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ），コ
ールド スプリング ハーバー ラボラトリーズ（Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ，１９８０年版）、細胞組織化学（山下修二ら、日
本組織細胞化学会編；学際企画、１９８６年）に記載さ
れている。In producing a monoclonal antibody,
At least the following work steps are required. (A) Preparation of a conjugate of chlorfenapyrhapten and a polymer compound used as an antigen for immunization (b) Immunization of animals (c) Collection of blood, assay, and preparation of antibody-producing cells (d) Preparation of myeloma cells (E) Cell fusion between antibody-producing cells and myeloma cells and selective culture of hybridomas (f) Screening and cell cloning of hybridomas producing the desired antibody (g) Monoclones by culturing hybridomas or transplanting hybridomas into animals Preparation of Antibodies (h) Measurement of Reactivity of Prepared Monoclonal Antibodies Conventional methods for producing hybridomas that produce monoclonal antibodies include, for example, Hybridoma Technologies, Cold Spring Harbor Laboratories (Co.)
ld Spring Harbor Laborato
ry, 1980 edition), and Cell Histochemistry (Shuji Yamashita et al., edited by the Japanese Society for Tissue and Cellular Chemistry; Interdisciplinary Planning, 1986).

【００５４】以下、本発明のクロルフェナピルに対する
モノクローナル抗体の作製方法を説明するが、これに制
限されないことは当業者によって明らかであろう。
（ａ）−（ｂ）の工程は、ポリクローナル抗体に関して
記述した方法とほぼ同様の方法によって行うことができ
る。Hereinafter, a method for preparing a monoclonal antibody against chlorfenapyr of the present invention will be described, but it will be apparent to those skilled in the art that the present invention is not limited thereto.
The steps (a) and (b) can be performed by a method substantially similar to the method described for the polyclonal antibody.

【００５５】（ｃ）の工程における抗体産生細胞はリン
パ球であり、これは一般には脾臓、胸腺、リンパ節、末
梢血液又はこれらの組み合わせから得ることができるが
脾細胞が最も一般的に用いられる。従って、最終免疫
後、抗体産生が確認されたマウスより抗体産生細胞が存
在する部位、例えば脾臓を摘出し、脾細胞を調製する。The antibody-producing cells in the step (c) are lymphocytes, which can be generally obtained from the spleen, thymus, lymph nodes, peripheral blood or a combination thereof, but spleen cells are most commonly used. . Therefore, after the final immunization, a site where antibody-producing cells are present, for example, a spleen is excised from a mouse in which antibody production has been confirmed, and splenocytes are prepared.

【００５６】（ｄ）の工程に用いることのできるミエロ
ーマ細胞としては、例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来骨
髄腫細胞株のＰ３／Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）（Ｎａｔ
ｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５））、Ｐ３
／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）（Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｔｏｐｉｃｓ．ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎ
ｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１， １−７（１９８
７））、Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａｇ ４−１（ＮＳ−１）
（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１−５１９
（１９７６））、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／０）
（Ｎａｔｕｒｅ， ２７６，２６９−２７０（１９７
８））、ＦＯ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈ．，３５，
１−２１（１９８０））、ＭＰＣ−１１、Ｘ６３．６
５３、Ｓ１９４等の骨髄腫株化細胞、あるいはラット由
来の２１０．ＲＣＹ３．Ａｇ １．２．３．（Ｙ３）
（Ｎａｔｕｒｅ， ２７７，１３１−１３３，（１９７
９））等を使用できる。The myeloma cells that can be used in the step (d) include, for example, P3 / X63-Ag8 (X63) (Nat) of a myeloma cell line derived from a Balb / c mouse.
ure, 256, 495-497 (1975)), P3
/ X63-Ag8. U1 (P3U1) (Current
Topics. in Microbiology
d Immunology, 81, 1-7 (198
7)), P3 / NSI-1-Ag 4-1 (NS-1)
(Eur. J. Immunol., 6, 511-519).
(1976)), Sp2 / 0-Ag14 (Sp2 / 0)
(Nature, 276, 269-270 (197
8)), FO (J. Immuno. Meth., 35,
1-21 (1980)), MPC-11, X63.6.
Myeloma cell lines such as S.53 and S194, or rat-derived 210. RCY3. Ag 1.2.3. (Y3)
(Nature, 277, 131-133, (197
9)) etc. can be used.

【００５７】上述したミエローマ細胞をウシ胎児血清を
含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はイス
コフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で継代培養し、融
合当日に約１×１０⁶以上の細胞数を確保する。The above-mentioned myeloma cells are subcultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) or Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) containing fetal bovine serum, and a cell number of about 1 × 10 ⁶ or more is secured on the day of fusion.

【００５８】（ｅ）の工程の細胞融合は公知の方法、例
えばミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）らの方法（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７３，３
（１９８１））等に準じて行うことができる。現在最も
一般的に行われているのはポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）を用いる方法である。ＰＥＧ法については、例え
ば、細胞組織化学、山下修二ら（上述）に記載されてい
る。別の融合方法としては、電気処理（電気融合）によ
る方法を採用することもできる（大河内悦子ら、実験医
学 ５．１３１５−１９、１９８７）。その他の方法を
適宜採用することもできる。また、細胞の使用比率も公
知の方法と同様でよく、例えばミエローマ細胞に対して
脾細胞を３倍から１０倍程度用いればよい。The cell fusion in the step (e) is carried out by a known method, for example, the method of Milstein et al.
things in Enzymology, 73, 3
(1981)). Currently, the most commonly used is polyethylene glycol (P
EG). The PEG method is described in, for example, Cell Histochemistry, Shuji Yamashita et al. (Supra). As another fusion method, a method by electric treatment (electric fusion) can be adopted (Etsuko Okochi et al., Experimental Medicine 5.1315-19, 1987). Other methods can be appropriately adopted. In addition, the ratio of cells used may be the same as in a known method. For example, spleen cells may be used about 3 to 10 times as much as myeloma cells.

【００５９】脾細胞とミエローマ細胞とが融合し、抗体
分泌能及び増殖能を獲得したハイブリドーマ群の選択
は、例えば、ミエローマ細胞株としてヒポキサンチング
アニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損株を使用
した場合、例えば上述のＤＭＥＭやＩＭＤＭにヒポキサ
ンチン・アミノプテリン・チミジンを添加して調製した
ＨＡＴ培地の使用により行うことができる。The selection of a hybridoma group in which spleen cells and myeloma cells are fused to obtain antibody secretion ability and proliferation ability is performed, for example, when a hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase-deficient strain is used as the myeloma cell line, for example, as described above. It can be performed by using a HAT medium prepared by adding hypoxanthine / aminopterin / thymidine to DMEM or IMDM.

【００６０】（ｆ）の工程では、選択されたハイブリド
ーマ群を含む培養上清の一部をとり、例えば後述するＥ
ＬＩＳＡ法により、クロルフェナピルに対する抗体活性
を測定する。In the step (f), a part of the culture supernatant containing the selected hybridoma group is taken, and for example, E
The antibody activity against chlorfenapyr is measured by the LISA method.

【００６１】さらに、測定によりクロルフェナピルに反
応する抗体を産生することが判明したハイブリドーマの
細胞クローニングを行う。この細胞クローニング法とし
ては、限界希釈により１ウェルに１個のハイブリドーマ
が含まれるように希釈する方法「限界希釈法」；軟寒天
培地上に撒きコロニーをとる方法；マイクロマニピュレ
ーターによって１個の細胞を取り出す方法；セルソータ
ーによって１個の細胞を分離する「ソータークローン
法」等が挙げられる。限界希釈法が簡単であり、よく用
いられる。Further, cell cloning of a hybridoma which has been found by measurement to produce an antibody reactive with chlorfenapyr is performed. As the cell cloning method, a method of limiting the dilution so that one hybridoma is contained in one well by limiting dilution “Limiting dilution method”; a method of collecting a colony spread on a soft agar medium; and a method of separating one cell by a micromanipulator Extraction method: a "sorter clone method" in which one cell is separated by a cell sorter, and the like. The limiting dilution method is simple and often used.

【００６２】抗体価の認められたウェルについて、例え
ば限界希釈法によりクローニングを１−４回繰り返して
安定して抗体価の得られたものを、抗クロルフェナピル
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択す
る。ハイブリドーマを培養する培地としては、例えば、
ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ又はＩＭＤＭ等
が用いられる。ハイブリドーマの培養は、例えば二酸化
炭素濃度５−７％程度及び３７℃（１００％湿度の恒温
器中）で培養するのが好ましい。For the wells in which the antibody titer has been recognized, cloning is repeated 1-4 times, for example, by the limiting dilution method, and those with a stable antibody titer are selected as anti-chlorfenapyr monoclonal antibody-producing hybridoma strains. As a medium for culturing a hybridoma, for example,
DMEM or IMDM containing fetal calf serum (FCS) is used. The hybridoma is preferably cultured, for example, at a carbon dioxide concentration of about 5 to 7% and at 37 ° C. (in a thermostat at 100% humidity).

【００６３】（ｇ）の工程で抗体を調製するための大量
培養は、フォローファイバー型の培養装置等によって行
われる。又は、同系統のマウス（例えば、上述のＢａｌ
ｂ／ｃ）あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内でハイブリ
ドーマを増殖させ、腹水液より抗体を調製することも可
能である。The mass culture for preparing the antibody in the step (g) is performed by a follow-fiber type culture device or the like. Alternatively, mice of the same strain (for example, Bal
b / c) or hybridomas can be grown in the peritoneal cavity of Nu / Nu mice, and antibodies can be prepared from ascites fluid.

【００６４】これらにより得られた培養上清液あるいは
腹水液を抗クロルフェナピルモノクローナル抗体として
使用することできるが、さらに透析、硫酸アンモニウム
による塩析、ゲル濾過、凍結乾燥等を行い、抗体画分を
集め精製することにより抗クロルフェナピルモノクロー
ナル抗体を得ることができる。さらに、精製が必要な場
合には、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフ
ィー（ＨＰＬＣ）などの慣用されている方法を組合わせ
ることにより実施できる。The culture supernatant or ascites fluid thus obtained can be used as an anti-chlorfenapyr monoclonal antibody. Further, dialysis, salting out with ammonium sulfate, gel filtration, freeze-drying, etc. are performed to collect and purify the antibody fraction. By doing so, an anti-chlorfenapyr monoclonal antibody can be obtained. Further, when purification is necessary, it can be carried out by combining commonly used methods such as ion exchange column chromatography, affinity chromatography, and high performance liquid chromatography (HPLC).

【００６５】以上のようにして得られた抗クロルフェナ
ピルモノクローナル抗体は、例えば後述するＥＬＩＳＡ
法などの公知の方法を使用して、サブクラス、抗体価等
を決定することができる。抗体によるクロルフェナピルの測定 本発明で使用する抗体によるクロルフェナピルの測定法
としては、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、Ｅ
ＬＩＳＡ法（Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７０，４１９−４３９（１９
８０））、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、凝集
法、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）等の一般
に抗原の検出に使用されている種々の方法（「ハイブリ
ドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプラ
ニング発行、第３０頁−第５３頁、昭和５７年３月５
日）が挙げられる。感度、簡便性等の観点からＥＬＩＳ
Ａ法が汎用されている。The anti-chlorfenapyr monoclonal antibody obtained as described above can be used, for example, in the ELISA described later.
The subclass, antibody titer, and the like can be determined using a known method such as a method. Measurement of chlorfenapyr using an antibody As a method for measuring chlorfenapyr using an antibody used in the present invention, radioisotope immunoassay (RIA), E
LISA method (Engval, E., Methods)
in Enzymol. , 70, 419-439 (19
80)), various methods generally used for detection of antigens such as a fluorescent antibody method, a plaque method, a spot method, an agglutination method, and Ouchterlony (“Hybridoma method and monoclonal antibody”, published by R & D Planning, Inc. Pages 30-53, March 5, 1982
Days). ELIS from the viewpoint of sensitivity, simplicity, etc.
Method A is widely used.

【００６６】クロルフェナピルの測定は、各種ＥＬＩＳ
Ａ法のうち例えば間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により、以
下のような手順により行うことができる。 （ａ）まず、固相化用抗原であるクロルフェナピルハプ
テンと高分子化合物との結合体を担体に固相化する。Chlorfenapyr was measured by various ELISA
Among the methods A, the indirect competitive inhibition ELISA method can be used for the following procedures. (A) First, a conjugate of chlorfenapyr hapten, which is an antigen for immobilization, and a polymer compound is immobilized on a carrier.

【００６７】（ｂ）固相化用抗原が吸着していない固相
表面を抗原と無関係な物質、例えばタンパク質によりブ
ロッキングする。 （ｃ）これに各種濃度のクロルフェナピルを含む試料及
び抗体を加え、該抗体を前記固相化抗原及びクロルフェ
ナピルに競合的に反応させて、固相化抗原−抗体複合体
及び、クロルフェナピル−抗体複合体を生成させる。(B) The surface of the solid phase on which the antigen for immobilization is not adsorbed is blocked by a substance unrelated to the antigen, for example, a protein. (C) A sample and an antibody containing various concentrations of chlorfenapyr are added thereto, and the antibody is allowed to react competitively with the immobilized antigen and chlorfenapyr to form an immobilized antigen-antibody complex and a chlorfenapyr-antibody complex Is generated.

【００６８】（ｄ）固相化抗原−抗体複合体の量を測定
することにより、予め作成した検量線から試料中のクロ
ルフェナピルの量を決定することができる。 （ａ）工程において、固相化用抗原を固相化する担体と
しては、特別な制限はなく、ＥＬＩＳＡ法において常用
されるものをいずれも使用することができる。例えば、
ポリスチレン製の９６ウェルのマイクロタイタープレー
トが挙げられる。(D) By measuring the amount of the immobilized antigen-antibody complex, the amount of chlorfenapyr in the sample can be determined from a previously prepared calibration curve. In the step (a), the carrier for immobilizing the antigen for immobilization is not particularly limited, and any carrier commonly used in the ELISA method can be used. For example,
Examples include a 96-well microtiter plate made of polystyrene.

【００６９】固相化用抗原を担体に固相化させるには、
例えば、固相化用抗原を含む緩衝液を担体上に載せ、イ
ンキュベーションすればよい。緩衝液としては公知のも
のが使用でき、例えば、リン酸緩衝液を挙げることがで
きる。緩衝液中の抗原の濃度は広い範囲から選択できる
が、通常０．０１μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌ程
度、好ましくは０．０５μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌ
が適している。また、担体として９６ウェルのマイクロ
タイタープレートを使用する場合には、３００μｌ／ウ
ェル以下で２０μｌ／ウェルから１５０μｌ／ウェル程
度が望ましい。更に、インキュベーションの条件にも特
に制限はないが、通常４℃程度で一晩インキュベーショ
ンが適している。In order to immobilize the antigen for immobilization on a carrier,
For example, a buffer containing an antigen for immobilization may be placed on a carrier and incubated. As the buffer, a known buffer can be used, and examples thereof include a phosphate buffer. The concentration of the antigen in the buffer can be selected from a wide range, but is usually about 0.01 μg / ml to 100 μg / ml, preferably 0.05 μg / ml to 10 μg / ml.
Is suitable. When a 96-well microtiter plate is used as a carrier, it is desirable that the concentration be about 300 μl / well or less and about 20 μl / well to about 150 μl / well. Furthermore, the conditions for incubation are not particularly limited, but usually incubation at about 4 ° C. overnight is suitable.

【００７０】なお、担体に固相化させる抗原としては、
抗体を作製したクロルフェナピルハプテンと高分子化合
物との結合体自体のみならず、式（１）で表される他の
ハプテンと高分子化合物との結合体を固相化抗原として
使用することも可能である。例えば、式（１）において
Ａ¹、Ａ²、Ａ³、Ａ⁴又はｍが抗体作製用と相違する化合
物を、固相化抗原として使用することもできる。さら
に、式（１）に含まれない他のクロルフェナピル類似化
合物を固相化抗原として使用することも可能である。The antigen to be immobilized on the carrier includes:
Not only the conjugate of chlorfenapyr hapten with which the antibody was prepared and the polymer compound itself, but also the conjugate of another hapten represented by the formula (1) and the polymer compound can be used as the immobilized antigen. is there. For example, in formula (1), a compound in which A ¹ , A ² , A ³ , A ^4, or m is different from that for preparing an antibody can be used as the immobilized antigen. Furthermore, other chlorfenapyr analogs not included in the formula (1) can be used as the immobilized antigen.

【００７１】（ｂ）工程のブロッキングは、抗原（クロ
ルフェナピルハプテンと高分子化合物との結合体）を固
相化した担体において、クロルフェナピルハプテン部分
以外に後で添加する抗体が吸着され得る部分が存在する
場合があり、もっぱらそれを防ぐ目的で行われる。ブロ
ッキング剤として、例えば、ＢＳＡやスキムミルク溶液
を使用できる。あるいは、ブロックエース（「Ｂｌｏｃ
ｋ‐Ａｃｅ」、大日本製薬社製、コードＮｏ．ＵＫ−２
５Ｂ）等のブロッキング剤として市販されているものを
使用することもできる。具体的には、限定されるわけで
はないが、例えば抗原を固相化した部分にブロッキング
剤を含む緩衝液［例えば、１％ＢＳＡと６０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌを添加した８５ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．
０）］を適量加え、約４℃で、１時間ないし５時間イン
キュベーションした後、洗浄液で洗浄することにより行
われる。洗浄液としては特に制限はないが、例えば、Ｐ
ＢＳを用いることができる。In the blocking in the step (b), in the carrier on which the antigen (conjugate of chlorfenapyr hapten and a high molecular compound) is immobilized, there is a portion other than the chlorfenapyr hapten portion to which an antibody to be added later can be adsorbed. May be done solely to prevent it. As a blocking agent, for example, BSA or skim milk solution can be used. Alternatively, block ace ("Bloc
k-Ace ", manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., code No. UK-2
A commercially available blocking agent such as 5B) can also be used. Specifically, for example, but not limited to, a buffer solution containing a blocking agent [eg, 1% BSA and 60 mM Na
85 mM borate buffer (pH 8.
0)], and incubated at about 4 ° C. for 1 to 5 hours, followed by washing with a washing solution. The washing liquid is not particularly limited.
BS can be used.

【００７２】次いで（ｃ）工程において、クロルフェナ
ピルを含む試料と抗体を固相化抗原と接触させ、抗体を
固相化抗原及びクロルフェナピルと反応させることによ
り、固相化抗原−抗体複合体及びクロルフェナピル−抗
体複合体が生成する。Next, in step (c), the sample containing chlorfenapyr and the antibody are brought into contact with the immobilized antigen, and the antibody is reacted with the immobilized antigen and chlorfenapyr, whereby the immobilized antigen-antibody complex and chlorfenapyr- An antibody complex is formed.

【００７３】この際、抗体としては、第一抗体として本
願発明のクロルフェナピルに対する抗体を加え、更に第
二抗体として標識酵素を結合した第一抗体に対する抗体
を順次加えて反応させる。At this time, as the antibody, an antibody against chlorfenapyr of the present invention is added as a first antibody, and an antibody against the first antibody to which a labeling enzyme is bound as a second antibody is sequentially added and reacted.

【００７４】第一抗体は緩衝液に溶解して添加する。限
定されるわけではないが、反応は、１０℃から４０℃、
好ましくは約２５℃で約１時間行えばよい。反応終了
後、緩衝液で担体を洗浄し、固相化抗原に結合しなかっ
た第一抗体を除去する。洗浄液としては、例えば、ＰＢ
Ｓを用いることができる。The first antibody is dissolved in a buffer and added. Although not limited, the reaction is carried out at 10 to 40 ° C,
Preferably, the heating may be performed at about 25 ° C. for about 1 hour. After completion of the reaction, the carrier is washed with a buffer to remove the first antibody that has not bound to the immobilized antigen. As the cleaning liquid, for example, PB
S can be used.

【００７５】次いで第二抗体を添加する。例えば第一抗
体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素
（例えば、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファター
ゼ等）を結合した抗マウス−ヤギ抗体を用いるのが適当
である。担体に結合した第一抗体に好ましくは最終吸光
度が４以下、より好ましくは０．５−３．０となるよう
に希釈した第二抗体を反応させるのが望ましい。希釈に
は緩衝液を用いる。限定されるわけではないが、反応は
室温で約１時間行い、反応後、緩衝液で洗浄する。以上
の反応により、第二抗体が第一抗体に結合する。また、
標識した第一抗体を用いてもよく、その場合、第二抗体
は不要である。Next, a second antibody is added. For example, when a mouse monoclonal antibody is used as the first antibody, it is appropriate to use an anti-mouse-goat antibody conjugated with an enzyme (for example, peroxidase or alkaline phosphatase). It is desirable to react the first antibody bound to the carrier with a second antibody diluted so that the final absorbance is preferably 4 or less, more preferably 0.5 to 3.0. Buffer is used for dilution. Although not limited, the reaction is carried out at room temperature for about 1 hour, and the reaction is followed by washing with a buffer. By the above reaction, the second antibody binds to the first antibody. Also,
A labeled first antibody may be used, in which case a second antibody is not required.

【００７６】次いで（ｄ）工程において担体に結合した
第二抗体の標識物質と反応する発色基質溶液を加え、吸
光度を測定することによって検量線からクロルフェナピ
ルの量を算出することができる。Next, in step (d), a chromogenic substrate solution that reacts with the labeling substance of the second antibody bound to the carrier is added, and the amount of chlorfenapyr can be calculated from the calibration curve by measuring the absorbance.

【００７７】第二抗体に結合する酵素としてペルオキシ
ダーゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素、並び
に３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン又はｏ
−フェニレンジアミン（以下、「ＯＰＤ」と言う）を含
む発色基質溶液を使用することができる。限定されるわ
けではないが、発色基質溶液を加え室温で約１０分間反
応させた後、１Ｎの硫酸を加えることにより酵素反応を
停止させる。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジ
ジンを使用する場合、４５０ｎｍの吸光度を測定する。
ＯＰＤを使用する場合、４９２ｎｍの吸光度を測定す
る。一方、第二抗体に結合する酵素としてアルカリホス
ファターゼを使用する場合には、例えばｐ−ニトロフェ
ニルリン酸を基質として発色させ、２ＮのＮａＯＨを加
えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定する
方法が適している。When peroxidase is used as the enzyme that binds to the second antibody, for example, hydrogen peroxide and 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine or o
-A chromogenic substrate solution containing phenylenediamine (hereinafter referred to as "OPD") can be used. Although not limited, a chromogenic substrate solution is added and reacted at room temperature for about 10 minutes, and then the enzyme reaction is stopped by adding 1N sulfuric acid. When 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine is used, the absorbance at 450 nm is measured.
If OPD is used, measure the absorbance at 492 nm. On the other hand, when alkaline phosphatase is used as the enzyme that binds to the second antibody, for example, color is developed using p-nitrophenyl phosphate as a substrate, the enzyme reaction is stopped by adding 2N NaOH, and the absorbance at 415 nm is measured. The method is suitable.

【００７８】クロルフェナピルを添加しない反応溶液の
吸光度に対して、それらを添加して抗体と反応させた溶
液の吸光度の減少率を阻害率として計算する。既知の濃
度のクロルフェナピルを添加した反応液の阻害率により
予め作成しておいた検量線を用いて、試料中のクロルフ
ェナピルの濃度を算出できる。With respect to the absorbance of the reaction solution to which chlorfenapyr was not added, the rate of decrease in the absorbance of the solution in which they were added and reacted with the antibody was calculated as the inhibition rate. The concentration of chlorfenapyr in a sample can be calculated using a calibration curve prepared in advance based on the inhibition rate of a reaction solution to which a known concentration of chlorfenapyr was added.

【００７９】あるいはクロルフェナピルの測定は、例え
ば以下に述べるような本発明のモノクローナル抗体を用
いた直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によって行うこともでき
る。 （ａ）まず、本発明のモノクローナル抗体を、担体に固
相化する。Alternatively, chlorfenapyr can be measured by, for example, a direct competitive inhibition ELISA using the monoclonal antibody of the present invention as described below. (A) First, the monoclonal antibody of the present invention is immobilized on a carrier.

【００８０】（ｂ）抗体が固相化されていない担体表面
を抗原と無関係な物質、例えばタンパク質により、ブロ
ッキングする。 （ｃ）上記工程とは別に、各種濃度のクロルフェナピル
を含む試料に、クロルフェナピルハプテンと酵素を結合
させた酵素結合ハプテンを加えた混合物を調製する。(B) The surface of the carrier on which the antibody is not immobilized is blocked with a substance unrelated to the antigen, for example, a protein. (C) Separately from the above steps, a mixture containing chlorfenapyr hapten and an enzyme-linked hapten in which an enzyme is bound to a sample containing various concentrations of chlorfenapyr is prepared.

【００８１】（ｄ）上記混合物を上記抗体固相化担体と
反応させる。 （ｅ）固相化抗体−酵素結合ハプテン複合体の量を測定
することにより、あらかじめ作成した検量線から試料中
のクロルフェナピルの量を決定する。(D) The mixture is reacted with the antibody-immobilized carrier. (E) By measuring the amount of the immobilized antibody-enzyme-bound hapten complex, the amount of chlorfenapyr in the sample is determined from a previously prepared calibration curve.

【００８２】（ａ）工程においてモノクローナル抗体を
固相化する担体としては、特別な制限はなくＥＬＩＳＡ
法において常用されるものを用いることができ、例えば
９６ウェルのマイクロタイタープレートが挙げられる。
モノクローナル抗体の固相化は、例えばモノクローナル
抗体を含む緩衝液を担体上にのせ、インキュベートする
ことによって行える。緩衝液の組成・濃度は前述の間接
競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを採用できる。The carrier on which the monoclonal antibody is immobilized in step (a) is not particularly limited, and may be an ELISA.
Conventional methods can be used, and examples include a 96-well microtiter plate.
The immobilization of the monoclonal antibody can be carried out, for example, by placing a buffer containing the monoclonal antibody on a carrier and incubating. The composition and concentration of the buffer can be the same as in the indirect competitive inhibition ELISA method described above.

【００８３】（ｂ）工程のブロッキングは、抗体を固相
化した担体において、後に添加する試料中のクロルフェ
ナピル並びに酵素結合ハプテンが、抗原抗体反応とは無
関係に吸着される部分が存在する場合があるので、それ
を防ぐ目的で行う。ブロッキング剤及びその方法は、前
述の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様のものを使用でき
る。In the blocking in the step (b), there may be a case where chlorfenapyr and enzyme-bound hapten in a sample to be added later are adsorbed irrespective of the antigen-antibody reaction in the carrier on which the antibody is immobilized. So do it to prevent it. As the blocking agent and the method therefor, those similar to the indirect competitive inhibition ELISA method described above can be used.

【００８４】（ｃ）工程において用いる酵素結合ハプテ
ンの調製は、クロルフェナピルハプテンを酵素に結合す
る方法であれば特に制限なく、いかなる方法で行っても
よい。例えば、前述した活性化エステル法を採用するこ
とができる。調製した酵素結合ハプテンは、クロルフェ
ナピルを含む試料と混合する。The preparation of the enzyme-bound hapten used in step (c) is not particularly limited as long as it is a method of binding chlorfenapyr hapten to the enzyme, and any method may be used. For example, the activated ester method described above can be employed. The prepared enzyme-linked hapten is mixed with a sample containing chlorfenapyr.

【００８５】なお、酵素等の標識物質に結合させるハプ
テンとしては、間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法における固相
化抗原の場合と同様に、抗体作製に使用したクロルフェ
ナピルハプテン自体のみならず、式（１）で表される他
のハプテンと高分子化合物との結合体を標識競合用抗原
として使用することも可能である。例えば、式（１）に
おいてＡ¹、Ａ²、Ａ³、Ａ⁴又はｍが抗体作製用と相違す
る化合物を、標識競合用抗原として使用することもでき
る。さらに、式（１）に含まれない他のクロルフェナピ
ル類似化合物も、標識競合用抗原として使用可能であ
る。The hapten to be bound to a labeling substance such as an enzyme is not limited to chlorfenapyr hapten itself used in the production of the antibody but also to the formula (1) as in the case of the immobilized antigen in the indirect competitive inhibition ELISA method. It is also possible to use a conjugate of another represented hapten and a polymer compound as an antigen for labeling competition. For example, a compound in which A ¹ , A ² , A ³ , A ^4, or m in formula (1) is different from that for antibody production can be used as the antigen for labeling competition. Furthermore, other chlorfenapyr analogs not included in the formula (1) can also be used as antigens for labeling competition.

【００８６】（ｄ）工程においてクロルフェナピルを含
む試料及び酵素結合ハプテンを抗体固相化担体に接触さ
せ、クロルフェナピルと酵素結合ハプテンとの競合阻害
反応により、これらと固相化担体との複合体が生成す
る。クロルフェナピルを含む試料は適当な緩衝液で希釈
して使用する。限定されるわけではないが、反応は例え
ば、室温でおよそ１時間行う。反応終了後、緩衝液で担
体を洗浄し、固相化抗体と結合しなかった酵素結合ハプ
テンを除去する。洗浄液は、例えばＰＢＳを使用するこ
とができる。In step (d), a sample containing chlorfenapyr and the enzyme-bound hapten are brought into contact with the antibody-immobilized carrier, and a complex between the chlorfenapyr and the enzyme-bound hapten is formed by a competitive inhibition reaction between the chlorfenapyr and the enzyme-bound hapten. I do. The sample containing chlorfenapyr is used after being diluted with an appropriate buffer. Without limitation, the reaction is carried out, for example, at room temperature for approximately one hour. After the completion of the reaction, the carrier is washed with a buffer to remove the enzyme-bound hapten that has not bound to the immobilized antibody. As the washing solution, for example, PBS can be used.

【００８７】さらに、（ｅ）工程において酵素結合ハプ
テンの酵素に反応する発色基質溶液を前述の間接競合阻
害ＥＬＩＳＡ法と同様に加え、吸光度を測定することに
より検量線からクロルフェナピルの量を算出することが
できる。Further, in step (e), a chromogenic substrate solution which reacts with the enzyme of the enzyme-bound hapten is added in the same manner as in the above-described indirect competitive inhibition ELISA method, and the amount of chlorfenapyr is calculated from the calibration curve by measuring the absorbance. Can be.

【００８８】本発明のモノクローナル抗体４２Ｅ−１−
１は、直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法において約０．００５
ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは０．０５
ｎｇ／ｍｌから１０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲でクロルフェ
ナピルと反応する（実施例６、図１）。The monoclonal antibody 42E-1- of the present invention
1 was about 0.005 in the direct competitive inhibition ELISA
ng / ml to 100 ng / ml, preferably 0.05
Reacts with chlorfenapyr in a concentration range of ng / ml to 10 ng / ml (Example 6, FIG. 1).

【００８９】さらに、前述したように直接競合阻害ＥＬ
ＩＳＡ法において抗体作製用と異なるハプテンを標識競
合用抗原として使用でき、その組み合わせによって直接
競合阻害ＥＬＩＳＡ法において固有の反応性を示す。本発明の抗体の交差反応性 上述した直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法又は間接競合阻害法
により、本発明のモノクローナル抗体の交差反応性を調
べることができる。以下、実施例によって本発明を具体
的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定す
るためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づ
いて容易に本発明に修飾、変更を加えることができ、そ
れらは本発明の技術的範囲に含まれる。Further, as described above, the direct competitive inhibition EL
In the ISA method, a hapten different from that used for antibody production can be used as an antigen for labeling competition, and the combination shows a specific reactivity in the direct competitive inhibition ELISA method. Cross-Reactivity of the Antibody of the Present Invention The cross-reactivity of the monoclonal antibody of the present invention can be examined by the above-described direct competition inhibition ELISA or indirect competition inhibition. Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to Examples, but these are not intended to limit the technical scope of the present invention. Those skilled in the art can easily modify and change the present invention based on the description in the present specification, and they are included in the technical scope of the present invention.

【００９０】[0090]

【実施例】実施例１ クロルフェナピルハプテンの合成 EXAMPLES Example 1 Synthesis of Chlorfenapyrhapten

【００９１】[0091]

【化１０】 Embedded image

【００９２】６−［２−（４−クロロフェニル）−３−
シアノ−５−トリフルオロメチル−１−ピロリル］ヘキ
サン酸エチル（１）の合成 ２−（４−クロロフェニル）−３−シアノ−５−トリフ
ルオロメチルピロールは、特開平１−１３５７０１の実
施例５６および５７の記載に準じて、２−（４−クロロ
フェニル）グリシン及び無水トリフルオロ酢酸より合成
した。 6- [2- (4-chlorophenyl) -3-
Cyano-5-trifluoromethyl-1-pyrrolyl] hex
Synthesis of ethyl sanoate (1) 2- (4-chlorophenyl) -3-cyano-5-trifluoromethylpyrrole was prepared according to the description in Examples 56 and 57 of JP-A-1-135701. It was synthesized from (chlorophenyl) glycine and trifluoroacetic anhydride.

【００９３】次いで、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド２
０ｍｌ中の２−（４−クロロフェニル）−３−シアノ−
５−トリフルオロメチルピロール１．４４ｇ（５．２ｍ
ｍｏｌ）の溶液に６０％水素化ナトリウム０．２２ｇ
（５．８ｍｍｏｌ）を室温下に徐々に加えた。１５分間
撹拌後、６−ブロモヘキサン酸エチル１．４０ｇ（６．
２ｍｍｏｌ）を加え、１４０℃で４時間撹拌した。反応
混合物を濃縮し、残渣に１５０ｍｌの酢酸エチルと５０
ｍｌの水を加え、分液した。酢酸エチル層を水洗し、無
水硫酸マグネシウムで乾燥後、濾過、濃縮した。残渣を
カラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル
＝５：１）で精製し、１．６０ｇ（収率７５％）の
（１）を得た。６−［２−（４−クロロフェニル）−３−シアノ−５−
トリフルオロメチル−１−ピロリル］ヘキサン酸（２）
の合成 エタノール２０ｍｌ中の６−［２−（４−クロロフェニ
ル）−３−シアノ−５−トリフルオロメチル−１−ピロ
リル］ヘキサン酸エチル（１）０．６３ｇ（１．５ｍｍ
ｏｌ）の溶液に、水１５ｍｌ中の水酸化ナトリウム０．
６ｇ（１５ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。室温で１時間撹
拌した。減圧下にエタノールを留去し、残渣を希塩酸で
酸性にし、酢酸エチル５０ｍｌで３回抽出した。酢酸エ
チル層を水洗し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濃縮
した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ｎ−ヘキ
サン：酢酸エチル＝３：１）で精製し０．２７ｇ（収率
４６％）の（２）を得た。６−［４−ブロモ−２−（４−クロロフェニル）−３−
シアノ−５−トリフルオロメチル−１−ピロリル］ヘキ
サン酸（３）の合成 酢酸１ｍｌ中の６−［２−（４−クロロフェニル）−３
−シアノ−５−トリフルオロメチル−１−ピロリル］ヘ
キサン酸（２）０．２３ｇ（０．６０ｍｍｏｌ）と鉄粉
１０ｍｇの溶液に撹拌下８０℃で臭素０．２９ｇ（１．
８ｍｍｏｌ）を徐々に加え、さらに８０℃で１５時間撹
拌した。反応混合物を濃縮し、残渣に水５ｍｌを加え、
酢酸エチル１５ｍｌで３回抽出した。酢酸エチル層を水
洗し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濃縮した。残渣
を分取用ＨＰＬＣ（ アセトニトリル：水＝７：３）で
精製し１７ｍｇ（収率６．０％）の（３）を得た。 融点：１１５−１１７℃ 上記クロルフェナピルハプテン（３）の¹Ｈ−ＮＭＲに
よる物性データ（ケミカルシフトδ）を以下に示す。Next, N, N-dimethylformamide 2
2- (4-chlorophenyl) -3-cyano- in 0 ml
1.44 g of 5-trifluoromethylpyrrole (5.2 m
mol) in a solution of 0.22 g of 60% sodium hydride
(5.8 mmol) was slowly added at room temperature. After stirring for 15 minutes, 1.40 g of ethyl 6-bromohexanoate (6.
2 mmol) and stirred at 140 ° C. for 4 hours. The reaction mixture was concentrated, and the residue was mixed with 150 ml of ethyl acetate and 50 ml.
ml of water was added and the layers were separated. The ethyl acetate layer was washed with water, dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered and concentrated. The residue was purified by column chromatography (n-hexane: ethyl acetate = 5: 1) to obtain 1.60 g (yield 75%) of (1). 6- [2- (4-chlorophenyl) -3-cyano-5
Trifluoromethyl-1-pyrrolyl] hexanoic acid (2)
Of 6 in the synthesis of ethanol 20ml of [2- (4-chlorophenyl) -3-cyano-5-trifluoromethyl-1-pyrrolyl] hexanoate (1) 0.63 g (1.5 mm
ol) in a solution of sodium hydroxide in 15 ml of water.
6 g (15 mmol) of the solution were added. Stirred at room temperature for 1 hour. Ethanol was distilled off under reduced pressure, the residue was acidified with diluted hydrochloric acid, and extracted three times with 50 ml of ethyl acetate. The ethyl acetate layer was washed with water, dried over anhydrous magnesium sulfate, and concentrated. The residue was purified by silica gel chromatography (n-hexane: ethyl acetate = 3: 1) to obtain 0.27 g (yield 46%) of (2). 6- [4-bromo-2- (4-chlorophenyl) -3-
Cyano-5-trifluoromethyl-1-pyrrolyl] hex
Synthesis of Sannic acid (3) 6- [2- (4-Chlorophenyl) -3 in 1 ml of acetic acid
-Cyano-5-trifluoromethyl-1-pyrrolyl] hexanoic acid (2) in a solution of 0.23 g (0.60 mmol) and 10 mg of iron powder at 80 ° C. with stirring at 0.29 g of bromine (1.
8 mmol) was added slowly, and the mixture was further stirred at 80 ° C. for 15 hours. The reaction mixture was concentrated, 5 ml of water was added to the residue,
Extracted three times with 15 ml of ethyl acetate. The ethyl acetate layer was washed with water, dried over anhydrous magnesium sulfate, and concentrated. The residue was purified by preparative HPLC (acetonitrile: water = 7: 3) to give 17 mg (6.0% yield) of (3). Melting point: 115-117 ° C. Physical properties data (chemical shift δ) of the above chlorfenapyr hapten (3) by ¹ H-NMR are shown below.

【００９４】[0094]

【表１】表１¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−Ｄ₆，４００ＭＨｚ） δ １．０５（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂）， １．２７（２Ｈ，
ｍ，ＣＨ₂），１．４５（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂）， ２．０
５（２Ｈ，ｔ，ＣＨ₂），３．９９（２Ｈ，ｔ，Ｃ
Ｈ₂）， ７．６７（４Ｈ，ｍ，４Ａｒ：Ｈ），１１．
９７（１Ｈ，ｓ，ＣＯＯＨ）実施例２ 免疫用抗原およびスクリーニング用抗原の作
製 免疫用抗原およびスクリーニング用抗原として、クロル
フェナピルハプテンとＢＳＡとの結合体を活性化エステ
ル法を用いて作製した。Table 1 ¹ H-NMR (DMSO-D ₆ , 400 MHz) δ 1.05 (2H, m, CH ₂ ), 1.27 (2H,
m, CH ₂ ), 1.45 (2H, m, CH ₂ ), 2.0
5 (2H, t, CH ₂ ), 3.99 (2H, t, C
_{H 2), 7.67 (4H,} m, 4Ar: H), 11.
97 (1H, s, COOH) Example 2 Production of Antigen for Immunization and Antigen for Screening
As an antigen for immunization and an antigen for screening, a conjugate of chlorfenapyr hapten and BSA was prepared by the activated ester method.

【００９５】実施例１で作製したクロルフェナピルハプ
テン０．２ｍｍｏｌをＤＭＦ １．０ｍＬに溶解し、Ｎ
−ヒドロキシこはく酸イミド０．２ｍｍｏｌ及び１−エ
チル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイ
ミド０．２ｍｍｏｌを加え、室温で３．５時間撹拌し
た。反応後、１００００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清
と沈殿に分離した。The chlorfenapyr hapten (0.2 mmol) prepared in Example 1 was dissolved in DMF (1.0 mL).
0.2 mmol of -hydroxysuccinimide and 0.2 mmol of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide were added, and the mixture was stirred at room temperature for 3.5 hours. After the reaction, the mixture was centrifuged at 10,000 rpm for 15 minutes to separate into a supernatant and a precipitate.

【００９６】一方、ＢＳＡ ５０ｍｇを１４５ｍＭ Ｎ
ａＣｌ−０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２：以下
「ＰＢＳ」と言う）５．０ｍｌに溶解し、ＤＭＦ １．
０５ｍｌを加えた溶液を調製しておき、この溶液に上記
の上清０．２５ｍｌを加え、４℃にて１６時間反応させ
た。反応後、蒸留水にて４℃で透析し、クロルフェナピ
ルとＢＳＡとの結合体（以下、「クロルフェナピルハプ
テン／ＢＳＡ結合体」と言う）を調製した。以降、免疫
用抗原として用いた。On the other hand, 50 mg of BSA was added to 145 mM N
Dissolved in 5.0 ml of aCl-0.01M phosphate buffer (pH 7.2: hereinafter referred to as “PBS”), and added DMF
A solution to which 05 ml was added was prepared, and 0.25 ml of the above-mentioned supernatant was added to this solution, followed by reaction at 4 ° C. for 16 hours. After the reaction, the mixture was dialyzed against distilled water at 4 ° C. to prepare a conjugate of chlorfenapyr and BSA (hereinafter referred to as “chlorfenapyr hapten / BSA conjugate”). Hereinafter, it was used as an antigen for immunization.

【００９７】また、同様の方法を用いて、クロルフェナ
ピルハプテンとＲＳＡとの結合体（以下、「クロルフェ
ナピルハプテン／ＲＳＡ結合体」と言う）、および、ク
ロルフェナピルハプテンとＨＲＰとの結合体との結合体
（以下、「クロルフェナピルハプテン／ＨＲＰ結合体」
と言う）も作製した。実施例３ 免疫感作 免疫にはＢａｌｂ／ｃマウスを用いた。実施例２で作製
したクロルフェナピルハプテン／ＢＳＡ結合体１００μ
ｇをＰＢＳ ５０μｌに溶解し、等量のフロイント完全
アジュバンドと混合して、Ｂａｌｂ／ｃマウスの皮下に
接種した。さらに、４週間後にフロイント不完全アジュ
バンドを用いて前記と同様に調製した免疫用抗原を追加
免疫した。また、６週間目に１８０μｌのＰＢＳに溶解
したクロルフェナピルハプテン／ＢＳＡ結合体３０μｇ
をマウス尾静脈より追加免疫した。実施例４ 抗血清のクロルフェナピルに対する反応性 実施例３におけるマウス尾静脈への接種直前、採血した
抗血清を希釈調製して、以下に詳述する間接競合阻害Ｅ
ＬＩＳＡ法にてクロルフェナピルを測定し、抗血清を評
価した。Further, using the same method, a conjugate of chlorfenapyrhapten and RSA (hereinafter referred to as “chlorfenapyrhapten / RSA conjugate”) and a conjugate of chlorfenapyrhapten and HRP ( Hereinafter, "chlorfenapyr hapten / HRP conjugate"
Was also made. Example 3 Immunization Balb / c mice were used for immunization. Chlorfenapyr hapten / BSA conjugate prepared in Example 2
g was dissolved in 50 μl of PBS, mixed with an equal volume of complete Freund's adjuvant, and subcutaneously inoculated into Balb / c mice. Further, four weeks later, the immunizing antigen prepared in the same manner as described above was boosted with Freund's incomplete adjuvant. Also, at 6 weeks, 30 μg of the chlorfenapyr hapten / BSA conjugate dissolved in 180 μl of PBS
Was boosted from the tail vein of the mouse. Example 4 Reactivity of antiserum to chlorfenapyr Immediately before inoculation into the tail vein of mice in Example 3, blood serum collected was diluted and prepared for indirect competitive inhibition E described in detail below.
Chlorfenapyr was measured by the LISA method, and the antiserum was evaluated.

【００９８】免疫用抗原と同様に、実施例２で調製した
クロルフェナピルハプテン／ＲＳＡ結合体の溶液（０．
５μｇ／ｍＬ）を５０μｌ／ウェルの量で９６ウェルマ
イクロプレートにコーティングし（２５ｎｇ／５０μｌ
／ウェル）、４倍希釈したブロックエース（「Ｂｌｏｃ
ｋ Ａｃｅ」、雪印乳業社製、コードＮｏ．ＵＫ−２５
Ｂ）でブロッキングしてアッセイ用プレートを作製し
た。次いで、抗血清１００００倍希釈液と、各種濃度の
クロルフェナピルを含む２０％メタノール溶液とを等量
混合し、その５０μＬを各ウェルに入れ、室温で１時間
反応させた。Similarly to the immunizing antigen, the solution of the chlorfenapyr hapten / RSA conjugate prepared in Example 2 (0.
5 μg / mL) in a volume of 50 μl / well on a 96-well microplate (25 ng / 50 μl)
/ Well), 4-fold diluted Block Ace (“Bloc
k Ace ", manufactured by Snow Brand Milk Products Co., Ltd., code No. UK-25
The plate for assay was prepared by blocking in B). Next, a 10000-fold dilution of antiserum and 20% methanol solution containing various concentrations of chlorfenapyr were mixed in equal amounts, 50 μL of the mixture was added to each well, and reacted at room temperature for 1 hour.

【００９９】ＰＢＳで洗浄した後に、１０倍希釈のブロ
ックエースを用いて２０００倍に希釈したペルオキシダ
ーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｔａｇｏ社製）を５
０μｌ／ウェルの量で加え、室温にて１時間反応させ
た。ＰＢＳで洗浄した後に、２ｍｇ／ｍＬのＯＰＤ及び
０．０２％の過酸化水素を含む０．１Ｍクエン酸−リン
酸緩衝液（ｐＨ５．０）を５０μｌ／ウェルの量で加
え、室温にて１０分間反応させて発色させた。After washing with PBS, a peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG antibody (manufactured by Tago), diluted 2000-fold with Block Ace diluted 10-fold, was added.
It was added in an amount of 0 μl / well and allowed to react at room temperature for 1 hour. After washing with PBS, 0.1 M citrate-phosphate buffer (pH 5.0) containing 2 mg / mL OPD and 0.02% hydrogen peroxide was added in an amount of 50 μl / well, and the mixture was added at room temperature for 10 μl. The color was developed by reacting for a minute.

【０１００】次に、１Ｎ硫酸を５０μｌ／ウェルの量で
加えて反応を停止し、４９０ｎｍの吸光度を測定した。
結果の一例を表２に示す。Next, 1N sulfuric acid was added in an amount of 50 μl / well to stop the reaction, and the absorbance at 490 nm was measured.
Table 2 shows an example of the results.

【０１０１】[0101]

【表２】 [Table 2]

【０１０２】表２より、クロルフェナピル１０００ｎｇ
／ｍｌにおいて阻害反応が認められたことから、用いた
抗血清はクロルフェナピルに対して反応性があることが
確認された。実施例５ ハイブリドーマの作製 実施例３に続いて、血清中の抗クロルフェナピル抗体活
性が高くなったマウスの脾細胞と、ミエローマ細胞（Ｓ
ｐ２／０−Ａｇ１４）とを山下修二らの方法（組織細胞
化学：日本組織細胞化学会編：学際企画．１９８６年）
に従ってポリエチレングリコール法により融合し、培養
した。実施例４と同様の方法でコーティング及びブロッ
キングしたプレートに細胞の増殖が認められた培養上清
液をそれぞれ５０μＬ／ウェルの量で加え、室温にて１
時間反応させた。From Table 2, it can be seen that chlorfenapyr is 1000 ng.
/ Ml, it was confirmed that the antiserum used was reactive with chlorfenapyr. Example 5 Preparation of Hybridomas Following Example 3, spleen cells from mice with increased anti-chlorfenapyr antibody activity in serum and myeloma cells (S
p2 / 0-Ag14) and the method of Shuji Yamashita et al. (Histocytochemistry: Japan Society for Histocellular Chemistry: Interdisciplinary Planning, 1986)
And fused by the polyethylene glycol method according to the above. The culture supernatant in which cell growth was observed was added to the plate coated and blocked in the same manner as in Example 4 in an amount of 50 μL / well, and the mixture was added at room temperature for 1 hour.
Allowed to react for hours.

【０１０３】ＰＢＳで洗浄した後、１０倍希釈のブロッ
クエースを用いて２０００倍に希釈したペルオキシダー
ゼ結合抗マウスＩｇＧヤギ抗体（Ｔａｇｏ社製）を５０
μｌ／ウェルの量で加え、室温にて１時間反応させた。
ＰＢＳで洗浄した後に、２ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ及び０．
０２％の過酸化水素を含む０．１Ｍ クエン酸−リン酸
緩衝液（ｐＨ５．０）を５０μｌ／ウェルの量で加え、
室温にて１０分間発色させた。After washing with PBS, 50 parts of a peroxidase-conjugated anti-mouse IgG goat antibody (manufactured by Tago) diluted 2000-fold with Block Ace diluted 10-fold was used.
The solution was added in an amount of μl / well and reacted at room temperature for 1 hour.
After washing with PBS, 2 mg / ml OPD and 0.
0.1 M citrate-phosphate buffer (pH 5.0) containing 02% hydrogen peroxide was added in an amount of 50 μl / well,
Color was developed for 10 minutes at room temperature.

【０１０４】次に、１Ｎ硫酸を５０μｌ／ウェルの量で
加えて、反応を停止し、４９０ｎｍの吸光度を測定し、
反応性を示す細胞（ハイブリドーマ）を選抜した。次
に、各ウェルのクロルフェナピルとの反応性を実施例４
に記載した間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法で調べ、目的の抗
体を産生している細胞について限界希釈法によりクロー
ニングを行った。その結果、数株のハイブリドーマが抗
クロルフェナピル抗体を産生する細胞としてクローン化
された。そのうちの４２Ｅ１−１−１を平成１１年３月
１６日に、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７３１１で、工業
技術院生命工学工業技術研究所（〒３０５ー００４６
茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託した。実施例６ 直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるクロルフェ
ナピルの測定 実施例５で得られたハイブリドーマ４２Ｅ１−１−１を
マウスの腹腔に移植し、１０日ないし１５日後に得られ
た腹水を採取し、アフィニティークロマトグラフィーに
よりモノクローナル抗体４２Ｅ１−１−１を精製した。
（以降、モノクローナル抗体は、これらを産生するハイ
ブリドーマと同一の名称を用いる。）この４２Ｅ１−１
−１抗体を用いて、直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法にてクロ
ルフェナピルの量を測定した。Next, 1N sulfuric acid was added in an amount of 50 μl / well to stop the reaction, and the absorbance at 490 nm was measured.
Reactive cells (hybridomas) were selected. Next, the reactivity of each well with chlorfenapyr was determined in Example 4.
The cells were produced by the indirect competitive inhibition ELISA described in (1) above, and cells producing the desired antibody were cloned by the limiting dilution method. As a result, several strains of hybridomas were cloned as cells producing anti-chlorfenapyr antibodies. Among them, 42E1-1-1 was obtained on March 16, 1999 under the accession number FERM P-17311 by the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (〒305-0046).
Deposited at 1-3-1-3 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture). Example 6 Chlorfe by Direct Competition Inhibition ELISA
Measurement of Napyr Hybridoma 42E1-1-1 obtained in Example 5 was transplanted into the peritoneal cavity of a mouse, and ascites fluid obtained 10 to 15 days later was collected, and monoclonal antibody 42E1-1-1 was purified by affinity chromatography. Purified.
(Hereinafter, monoclonal antibodies use the same names as the hybridomas that produce them.)
Using the -1 antibody, the amount of chlorfenapyr was measured by a direct competitive inhibition ELISA method.

【０１０５】上記の４２Ｅ１−１−１抗体溶液（１０μ
ｇ／ｍｌ）を５０μｌ／ウェルの量で９６ウェルマイク
ロプレートに入れ、４℃で一晩静置してコーティング
し、さらに４倍希釈のブロックエース（雪印乳業社製）
でブロッキングを行い、アッセイ用のプレートを作製し
た。各濃度のクロルフェナピルを含む２０％メタノール
溶液及び実施例２で作製したクロルフェナピルハプテン
／ＨＲＰ結合体を含むＰＢＳ溶液の等量混合液を５０μ
ｌずつ各ウェルに入れ、２５℃で１．５時間反応させ
た。The above 42E1-1-1 antibody solution (10 μl
g / ml) in a 96-well microplate in an amount of 50 μl / well, coating was allowed to stand at 4 ° C. overnight, and a 4-fold dilution of Block Ace (manufactured by Snow Brand Milk Products)
Was performed to prepare a plate for assay. An equal volume mixture of a 20% methanol solution containing each concentration of chlorfenapyr and a PBS solution containing the chlorfenapyr hapten / HRP conjugate prepared in Example 2 was mixed with 50 μl.
1 well was placed in each well and reacted at 25 ° C. for 1.5 hours.

【０１０６】反応後、ＰＢＳで洗浄した後、２ｍｇ／ｍ
ＬのＯＰＤ及び０．０２％の過酸化水素を含むクエン酸
−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を５０μＬずつ各ウェル
に入れ、室温で１０分間静置して発色反応を行った。After the reaction, the plate was washed with PBS, and then 2 mg / m 2
50 μL of a citrate-phosphate buffer (pH 5.0) containing L OPD and 0.02% hydrogen peroxide was added to each well, and allowed to stand at room temperature for 10 minutes to perform a color reaction.

【０１０７】次に、１Ｎ硫酸を５０μＬずつ各ウェルに
加えて発色反応を停止させ、４９０ｎｍの吸光度を測定
した。この結果を図１に示した。この直接競合阻害ＥＬ
ＩＳＡ法を用いると、本発明のモノクローナル抗体４２
Ｅ１−１−１は、クロルフェナピルを０．００５ｎｇ／
ｍｌないし１００ｎｇ／ｍＬの範囲で測定することがで
きた。Next, 50 μL of 1N sulfuric acid was added to each well to stop the color reaction, and the absorbance at 490 nm was measured. The result is shown in FIG. This direct competitive inhibition EL
Using the ISA method, the monoclonal antibody 42 of the present invention
E1-1-1 contains chlorfenapyr in an amount of 0.005 ng /
It could be measured in the range from ml to 100 ng / mL.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】図１は、本発明のモノクローナル抗体４２Ｅ１
−１−１の直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるクロルフェ
ナピルの測定を示す。FIG. 1 shows the monoclonal antibody 42E1 of the present invention.
1 shows measurement of chlorfenapyr by a direct competitive inhibition ELISA method of 1-1.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ０７Ｋ 19/00 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ｃ０７Ｋ 19/00 15/00 Ｃ (72)発明者 面田 内記 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内 (72)発明者 渡辺 基之 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内 (72)発明者 渡邊 繁幸 東京都港区浜松町１丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA53 DA02 GA03 GA18 HA15 4B064 AG27 CA20 CC24 DA11 DA13 DA16 4B065 AA91X AA92X AB05 AC14 BA08 BA24 CA25 CA46 4C069 AC06 AC07 AC08 BA01 BB08 BB12 BC01 BD09 4H045 AA11 AA20 AA30 CA42 DA76 DA86 EA50 FA50 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C12P 21/08 G01N 33/577 B G01N 33/53 C07K 19/00 33/577 C12N 5/00 B // C07K 19/00 15/00 C (72) Inventor Uchida Naiki 1-27-114 Hamamatsucho, Minato-ku, Tokyo Inside the Institute for Environmental Immunity Technology (72) Inventor Motoyuki Watanabe Hamamatsu, Minato-ku, Tokyo 1-27-14, Machi, in the Institute of Environmental Immune Technology (72) Inventor Shigeyuki Watanabe 1-27-14, Hamamatsucho, Minato-ku, Tokyo F-term in the Institute of Environmental Immune Technology 4B024 AA11 BA53 DA02 GA03 GA18 HA15 4B064 AG27 CA20 CC24 DA11 DA13 DA16 4B065 AA91X AA92X AB05 AC14 BA08 BA24 CA25 CA46 4C069 AC06 AC07 AC08 BA01 BB08 BB12 BC01 BD09 4H045 AA11 AA20 AA30 CA42 DA76 DA86 EA50 FA50

Claims (11)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】以下の式（１）： 【化１】 ［式（１）中、 Ａ¹ないしＡ³は、同一であっても異なっていてもよく、
Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなるハロゲン原子、ＣＮ、
ＣＦ₃、ならびに炭素数１ないし３のアルキル基からな
るグループから選択され；Ａ⁴は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又は
Ｉから選択されるハロゲン原子であり；そしてｍは、１
ないし１０の整数である］で表される構造を有する化合
物。(1) The following formula (1): [In the formula (1), A ¹ to A ³ may be the same or different,
A halogen atom consisting of F, Cl, Br and I, CN,
A ⁴ is selected from the group consisting of CF ₃ , and an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms; A ⁴ is a halogen atom selected from F, Cl, Br or I;
And an integer of from 10 to 10]. 【請求項２】式（１）において、Ａ¹がＣＮであり、Ａ²
がＢｒであり、Ａ³がＣＦ₃であり、Ａ⁴がＣｌであり、
そしてｍが５である、請求項１に記載の化合物。2. In the formula (1), A ¹ is CN and A ²
Is Br, A ³ is CF ₃ , A ⁴ is Cl,
The compound according to claim 1, wherein m is 5. 【請求項３】請求項１又は２に記載の化合物と高分子化
合物又は標識物質との結合体。3. A conjugate of the compound according to claim 1 or 2 with a polymer compound or a labeling substance. 【請求項４】請求項１又は２に記載の化合物と高分子化
合物を結合させることにより抗原を作製し、当該抗原を
用いることにより、以下の式（２）： 【化２】 で表される構造を有する化合物に反応性を示す抗体を製
造することを特徴とする、式（２）で表される構造を有
する化合物に反応性を示す抗体又はそのフラグメントの
製造方法。4. An antigen is prepared by binding the compound according to claim 1 or 2 with a polymer compound, and the antigen is used to obtain the following formula (2): A method for producing an antibody or a fragment thereof reactive to a compound having a structure represented by the formula (2), characterized by producing an antibody reactive to a compound having a structure represented by the formula: 【請求項５】請求項３に記載の結合体を抗原として用い
ることにより製造された、式（２）の化合物に反応性を
示す抗体又はそのフラグメント。5. An antibody or a fragment thereof, which is produced by using the conjugate according to claim 3 as an antigen, and which is reactive with the compound of the formula (2). 【請求項６】モノクローナル抗体である、請求項５に記
載の抗体又はフラグメント。6. The antibody or fragment according to claim 5, which is a monoclonal antibody. 【請求項７】モノクローナル抗体４２Ｅ１−１−１であ
る、請求項５若しくは６に記載の抗体又はフラグメン
ト。7. The antibody or fragment according to claim 5, which is the monoclonal antibody 42E1-1-1. 【請求項８】請求項５ないし７のいずれか１項に記載の
抗体又はフラグメントを産生するハイブリドーマ。A hybridoma that produces the antibody or fragment according to any one of claims 5 to 7. 【請求項９】寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７３１１で寄託
されている、請求項８に記載のハイブリドーマ。9. The hybridoma according to claim 8, which has been deposited under accession number FERM P-17311. 【請求項１０】請求項５ないし７のいずれか１項に記載
の抗体又はフラグメントを用いることを特徴とする、式
（２）で表される化合物の免疫学的測定方法。10. An immunoassay for a compound represented by the formula (2), comprising using the antibody or fragment according to any one of claims 5 to 7. 【請求項１１】さらに、請求項１若しくは２に記載の化
合物、又は請求項３に記載の結合体を用いることを含
む、請求項１０に記載の免疫学的測定方法。11. The immunological assay method according to claim 10, further comprising using the compound according to claim 1 or the conjugate according to claim 3.