JP2000095769A - プロベナゾールのハプテン化合物、抗体及び測定方法 - Google Patents
プロベナゾールのハプテン化合物、抗体及び測定方法Info
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
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Abstract
(57)【要約】 (修正有)
【課題】3−アリルオキシ−1,2−ベンゾイソチアゾ
ール−1,1−ジオキシドのハプテン化合物、抗原、抗
体およびそのフラグメントの製造方法、およびこの化合
物の免疫学的測定方法を提供する。 【解決手段】下記式(1) [式中、nは1−10の整数である]で表される構造を
有する化合物およびこの化合物と高分子化合物又は標識
物質との結合体。
ール−1,1−ジオキシドのハプテン化合物、抗原、抗
体およびそのフラグメントの製造方法、およびこの化合
物の免疫学的測定方法を提供する。 【解決手段】下記式(1) [式中、nは1−10の整数である]で表される構造を
有する化合物およびこの化合物と高分子化合物又は標識
物質との結合体。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、3−アリルオキシ
−1,2−ベンゾイソチアゾール−1,1−ジオキシド
(以下、本明細書中「プロベナゾール」と言う)のハプ
テン化合物、抗原、抗体およびそのフラグメントに関す
る。
−1,2−ベンゾイソチアゾール−1,1−ジオキシド
(以下、本明細書中「プロベナゾール」と言う)のハプ
テン化合物、抗原、抗体およびそのフラグメントに関す
る。
【0002】本発明は、さらに前記抗原、抗体およびそ
のフラグメントを用いた免疫学的測定方法に関する。
のフラグメントを用いた免疫学的測定方法に関する。
【0003】
【従来の技術】プロベナゾールは、以下の式(2):
【化3】 で表される構造を有し、イネいもち病、白葉枯病、もみ
枯細菌病用の薬剤として使用されている。いもち病に対
しては水面施用、根部浸漬、土壌混和、土壌灌注のいず
れの処理方法によっても防除効果が認められる。また野
菜の病害に対しても効果が見られる。
枯細菌病用の薬剤として使用されている。いもち病に対
しては水面施用、根部浸漬、土壌混和、土壌灌注のいず
れの処理方法によっても防除効果が認められる。また野
菜の病害に対しても効果が見られる。
【0004】プロベナゾール剤は水中で広く拡散し、イ
ネの根部や葉鞘から吸収されて地上部へと浸透移行し、
いもち病菌に対して侵入阻止作用、菌糸生育阻止作用、
病斑拡大阻止作用、胞子形成阻止作用を示す。また、付
着器形成阻害作用及び胞子発芽阻止作用も有する。生化
学的実験の結果、本剤で処理したイネでは無処理のもの
に比べていもち病菌感染時に形成されるα−リノレン酸
などの抗菌物質の量が多いことが示された。また、パー
オキシダーゼなどいもち病抵抗性に関連のある酵素の活
性も高まることが報告されている。このように、プロベ
ナゾール剤は、殺菌剤というよりは対病原菌抵抗性誘導
剤といえるものである。ゆえに予防的散布が有効であ
る。効果の持続性は長く、かけ流し、漏水、いっ水など
によって水田から有効成分が流出しない限り安定した防
除効果が得られ、雨間散布も可能である(農薬ハンドブ
ック 1994年版、582頁、246頁−247頁、
(社)日本植物防疫協会;「最新農薬の残留分析法」
第506頁−第508頁、農薬残留分析法研究班編集
中央法規出版 ’95.4.1発行)。
ネの根部や葉鞘から吸収されて地上部へと浸透移行し、
いもち病菌に対して侵入阻止作用、菌糸生育阻止作用、
病斑拡大阻止作用、胞子形成阻止作用を示す。また、付
着器形成阻害作用及び胞子発芽阻止作用も有する。生化
学的実験の結果、本剤で処理したイネでは無処理のもの
に比べていもち病菌感染時に形成されるα−リノレン酸
などの抗菌物質の量が多いことが示された。また、パー
オキシダーゼなどいもち病抵抗性に関連のある酵素の活
性も高まることが報告されている。このように、プロベ
ナゾール剤は、殺菌剤というよりは対病原菌抵抗性誘導
剤といえるものである。ゆえに予防的散布が有効であ
る。効果の持続性は長く、かけ流し、漏水、いっ水など
によって水田から有効成分が流出しない限り安定した防
除効果が得られ、雨間散布も可能である(農薬ハンドブ
ック 1994年版、582頁、246頁−247頁、
(社)日本植物防疫協会;「最新農薬の残留分析法」
第506頁−第508頁、農薬残留分析法研究班編集
中央法規出版 ’95.4.1発行)。
【0005】近年、水、土壌、大気等の環境中や食品の
残留農薬が人の健康に及ぼす影響について大きな社会的
関心が寄せられている。従って、このように広く使用さ
れている農薬であるプロベナゾールについて、環境や食
品の安全性確保のためには、これらに残留するプロベナ
ゾールの量を迅速かつ正確に測定することが必要であ
る。
残留農薬が人の健康に及ぼす影響について大きな社会的
関心が寄せられている。従って、このように広く使用さ
れている農薬であるプロベナゾールについて、環境や食
品の安全性確保のためには、これらに残留するプロベナ
ゾールの量を迅速かつ正確に測定することが必要であ
る。
【0006】プロベナゾールは、現在は、食品衛生法に
基づく残留農薬基準は設定されていない。しかしなが
ら、イネ、野菜を初め広く使用されている農薬であるこ
とから、農薬登録保留基準が定められている。基準値は
米で0.5mg/l、野菜で0.1mg/lとなってい
る。
基づく残留農薬基準は設定されていない。しかしなが
ら、イネ、野菜を初め広く使用されている農薬であるこ
とから、農薬登録保留基準が定められている。基準値は
米で0.5mg/l、野菜で0.1mg/lとなってい
る。
【0007】また、プロベナゾールは公共用水域等にお
ける農薬の水質評価指針として、基準値が0.05mg
/lと定められている。これは、公共用水域の水質保全
対策の一環として、水質汚濁に係る環境基準(いわゆる
水質環境基準)などの他に、農薬成分について環境庁が
示した指針である(最新農薬の規制・基準値便覧 19
95年版 325頁、(社)日本植物防疫協会)。よっ
て、食品や環境に関する安全確保のためには、これらに
含有される、プロベナゾールの量を迅速かつ正確に測定
することが必要である。
ける農薬の水質評価指針として、基準値が0.05mg
/lと定められている。これは、公共用水域の水質保全
対策の一環として、水質汚濁に係る環境基準(いわゆる
水質環境基準)などの他に、農薬成分について環境庁が
示した指針である(最新農薬の規制・基準値便覧 19
95年版 325頁、(社)日本植物防疫協会)。よっ
て、食品や環境に関する安全確保のためには、これらに
含有される、プロベナゾールの量を迅速かつ正確に測定
することが必要である。
【0008】従来、例えば農産物中のプロベナゾール
は、米・野菜等の試料から抽出し、精製した後、ガスク
ロマトグラフィー(GC)により分析されてきた。即
ち、試料をアセトンで抽出し、その濃縮液をヘキサン−
アセトニトリル分配し、フロリジルカラムクロマトグラ
フィーおよびシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精
製後に、GCで分析する方法が採用されてきた(「最新
農薬の残留分析法」、前出)。この方法は、試料の調製
が煩雑で多大の手間と時間を必要とし、分析に熟練を有
すること、並びに、測定装置や設備等に高額の費用を必
要とする等の問題点がある。プロベナゾールの測定は短
時間で膨大な数の試料の分析結果を出す必要があり、精
度面だけでなく、簡便性、迅速性及び経済性をも具備し
た新規測定方法が要求されてきている。
は、米・野菜等の試料から抽出し、精製した後、ガスク
ロマトグラフィー(GC)により分析されてきた。即
ち、試料をアセトンで抽出し、その濃縮液をヘキサン−
アセトニトリル分配し、フロリジルカラムクロマトグラ
フィーおよびシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精
製後に、GCで分析する方法が採用されてきた(「最新
農薬の残留分析法」、前出)。この方法は、試料の調製
が煩雑で多大の手間と時間を必要とし、分析に熟練を有
すること、並びに、測定装置や設備等に高額の費用を必
要とする等の問題点がある。プロベナゾールの測定は短
時間で膨大な数の試料の分析結果を出す必要があり、精
度面だけでなく、簡便性、迅速性及び経済性をも具備し
た新規測定方法が要求されてきている。
【0009】免疫学的測定方法は、抗体が抗原を特異的
に認識する、抗原抗体反応に基づいて抗原の検出を行う
方法であり、その優れた精度、簡便性、迅速性、経済性
から近年注目を集めてきている。免疫学的測定方法にお
いては検出方法として非常に多種の標識、例えば、酵
素、放射性トレーサー、化学発光あるいは蛍光物質、金
属原子、ゾル、ラテックス及びバクテリオファージが適
用されてきた。
に認識する、抗原抗体反応に基づいて抗原の検出を行う
方法であり、その優れた精度、簡便性、迅速性、経済性
から近年注目を集めてきている。免疫学的測定方法にお
いては検出方法として非常に多種の標識、例えば、酵
素、放射性トレーサー、化学発光あるいは蛍光物質、金
属原子、ゾル、ラテックス及びバクテリオファージが適
用されてきた。
【0010】免疫学的測定方法の中でも、酵素を使用す
る酵素免疫測定法(EIA)は経済性・利便性から特に
優れたものとして広く使用されるに至っている。酵素免
疫測定法についての優れた論評が、Tijssen
P,“Practice and theory of
enzyme immunoassays” inL
aboratory techniques in b
iochemistry and molecular
biology, Elsevier Amster
dam New York, Oxford ISBN
0−7204−4200−1(1990)に記載され
ている。
る酵素免疫測定法(EIA)は経済性・利便性から特に
優れたものとして広く使用されるに至っている。酵素免
疫測定法についての優れた論評が、Tijssen
P,“Practice and theory of
enzyme immunoassays” inL
aboratory techniques in b
iochemistry and molecular
biology, Elsevier Amster
dam New York, Oxford ISBN
0−7204−4200−1(1990)に記載され
ている。
【0011】一般に、分子量が大きな分子については、
それ以上修飾することなく動物に接種することにより、
適当な免疫反応を惹起し、抗原を認識する抗体を産生さ
せることができる。しかし、プロベナゾールのような低
分子化合物は通常動物に接種したとき免疫応答を引き出
すことができない。これらの分子は免疫原性を有する高
分子化合物に結合させることによって初めて一団のエピ
トープとして行動し、T細胞受容体の存在下で免疫応答
を起こし、その結果、一群のBリンパ球により抗体が産
生される。このように高分子化合物と結合させて初めて
免疫原性を生じる分子を総称して「ハプテン」と言う。
それ以上修飾することなく動物に接種することにより、
適当な免疫反応を惹起し、抗原を認識する抗体を産生さ
せることができる。しかし、プロベナゾールのような低
分子化合物は通常動物に接種したとき免疫応答を引き出
すことができない。これらの分子は免疫原性を有する高
分子化合物に結合させることによって初めて一団のエピ
トープとして行動し、T細胞受容体の存在下で免疫応答
を起こし、その結果、一群のBリンパ球により抗体が産
生される。このように高分子化合物と結合させて初めて
免疫原性を生じる分子を総称して「ハプテン」と言う。
【0012】しかし、低分子化合物を高分子化合物と結
合させたものを抗原としても、得られた抗体は望む分子
を認識しないか、あるいはごく低い親和性しかもたない
場合がしばしばある。そのため、一般に低分子化合物そ
のものではなく、結合に利用できる官能基と共にスペー
サーアーム(結合手)を導入したものをハプテンとして
使用する必要がある。しかしその場合に、結合手/官能
基の配置、結合手の大きさ等の全ての問題を考慮して導
入が適切に行われたものを使用しないと、好ましい抗体
は得られない。適切な導入は個々の分子に応じて工夫し
なければならない。
合させたものを抗原としても、得られた抗体は望む分子
を認識しないか、あるいはごく低い親和性しかもたない
場合がしばしばある。そのため、一般に低分子化合物そ
のものではなく、結合に利用できる官能基と共にスペー
サーアーム(結合手)を導入したものをハプテンとして
使用する必要がある。しかしその場合に、結合手/官能
基の配置、結合手の大きさ等の全ての問題を考慮して導
入が適切に行われたものを使用しないと、好ましい抗体
は得られない。適切な導入は個々の分子に応じて工夫し
なければならない。
【0013】しかしながら、プロベナゾールについては
その必要性が非常に高かったにもかかわらず、適切な抗
体はもとより、抗体を作製するためのハプテンも本発明
前には得られていなかった。
その必要性が非常に高かったにもかかわらず、適切な抗
体はもとより、抗体を作製するためのハプテンも本発明
前には得られていなかった。
【0014】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、プロベナゾ
ールに反応する新規な抗体もしくはそのフラグメント、
及びその作製方法を提供することを目的とする。尚、本
明細書において抗体の「フラグメント」とは、抗原と結
合可能な抗体の一部分、例えばFab断片等を意味する。
ールに反応する新規な抗体もしくはそのフラグメント、
及びその作製方法を提供することを目的とする。尚、本
明細書において抗体の「フラグメント」とは、抗原と結
合可能な抗体の一部分、例えばFab断片等を意味する。
【0015】本発明はその一態様において、プロベナゾ
ールに反応性を有するモノクローナル抗体を提供する。
ールに反応性を有するモノクローナル抗体を提供する。
【0016】本発明は、また、プロベナゾールに反応性
を有する新規な抗体を作製するための抗原を構成するハ
プテン化合物となる、当該化合物の誘導体を提供するこ
とを目的とする。
を有する新規な抗体を作製するための抗原を構成するハ
プテン化合物となる、当該化合物の誘導体を提供するこ
とを目的とする。
【0017】本発明は、さらに、プロベナゾール誘導体
と高分子化合物との結合体を提供することを目的とす
る。当該結合体はプロベナゾールに反応性を有する抗体
を作製するための抗原となる。
と高分子化合物との結合体を提供することを目的とす
る。当該結合体はプロベナゾールに反応性を有する抗体
を作製するための抗原となる。
【0018】本発明は、さらにまた、前記抗体及びその
フラグメントを産生するハイブリドーマを提供すること
を目的とする。
フラグメントを産生するハイブリドーマを提供すること
を目的とする。
【0019】本発明は、さらに、前記抗体もしくはその
フラグメント及び/又は前記プロベナゾール誘導体と高
分子化合物との結合体を使用することを含む、プロベナ
ゾールの免疫学的測定方法を提供することを目的とす
る。
フラグメント及び/又は前記プロベナゾール誘導体と高
分子化合物との結合体を使用することを含む、プロベナ
ゾールの免疫学的測定方法を提供することを目的とす
る。
【0020】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を重ねた結果、プロベナゾールにスペーサーアーム及び
高分子化合物との結合に利用できる官能基を導入した、
プロベナゾールの誘導体をハプテンとして使用すること
により、前記化合物に反応性を有する抗体を得ることに
成功し、本発明の完成に至った。
を重ねた結果、プロベナゾールにスペーサーアーム及び
高分子化合物との結合に利用できる官能基を導入した、
プロベナゾールの誘導体をハプテンとして使用すること
により、前記化合物に反応性を有する抗体を得ることに
成功し、本発明の完成に至った。
【0021】本発明の対象となるプロベナゾールは、以
下の式(2):
下の式(2):
【化4】 で表される化合物である。
【0022】本発明の抗体は、例えば、プロベナゾール
にスペーサーアーム及び結合に利用できる官能基を導入
した誘導体をハプテンとして適当な高分子化合物と結合
させたものを抗原として用いることによって得ることが
できる。例えば、以下の式(1):
にスペーサーアーム及び結合に利用できる官能基を導入
した誘導体をハプテンとして適当な高分子化合物と結合
させたものを抗原として用いることによって得ることが
できる。例えば、以下の式(1):
【化5】 [式(1)中、nは1−10の整数、好ましくは3から
5である]で表される構造を有する化合物を、抗体作製
のためのハプテンとして使用する。
5である]で表される構造を有する化合物を、抗体作製
のためのハプテンとして使用する。
【0023】本発明は、前記ハプテン化合物、ハプテン
化合物と高分子化合物との結合体、プロベナゾールに反
応する抗体及びその作製方法、ならびに該ハプテン化合
物又は該抗体を用いるプロベナゾールの免疫学的測定方
法に関する。
化合物と高分子化合物との結合体、プロベナゾールに反
応する抗体及びその作製方法、ならびに該ハプテン化合
物又は該抗体を用いるプロベナゾールの免疫学的測定方
法に関する。
【0024】プロベナゾールの誘導体の作製 式(1)で表されるプロベナゾール誘導体は、公知の方
法に従って作製することができる。例えば、限定される
わけではないが、以下に記載するような方法がある。
法に従って作製することができる。例えば、限定される
わけではないが、以下に記載するような方法がある。
【0025】先ず、有機溶媒中、以下の式(X1):
【化6】 [式(X1)中、L1はハロゲン原子であり(本明細書
中、ハロゲン原子はF、Cl、BrまたはIを意味す
る);Pはカルボキシル基の保護基であり;そしてnは
先に定義した通りである]で表される構造を有するエス
テル化合物を、以下の式(X2):
中、ハロゲン原子はF、Cl、BrまたはIを意味す
る);Pはカルボキシル基の保護基であり;そしてnは
先に定義した通りである]で表される構造を有するエス
テル化合物を、以下の式(X2):
【化7】 [式(X2)中、Rは、炭素数が1−5の枝分かれして
いてもよいアルキル基であり;そしてMは、銅(I)、
タリウム(I)、銀(I)などの金属、またはナトリウ
ム、カリウム等のアルカリ金属である]で表される構造
を有する金属塩と反応させて、以下の式(X3):
いてもよいアルキル基であり;そしてMは、銅(I)、
タリウム(I)、銀(I)などの金属、またはナトリウ
ム、カリウム等のアルカリ金属である]で表される構造
を有する金属塩と反応させて、以下の式(X3):
【化8】 [式(X3)中、P、Rおよびnは先に定義した通りで
ある]で表される構造を有する化合物を得る。
ある]で表される構造を有する化合物を得る。
【0026】式(X3)の合成には有機溶媒としては、
例えば、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)、ジ
クロロメタン、アセトニトリル、アセトン、ヘキサン、
ペンタン、ベンゼン、トルエン、クロロホルム、1,2
−ジクロロエタン、酢酸エチル、ジグリム、ヘキサメチ
ルリン酸トリアミド等、又はこれらの混合溶媒を用いる
ことができる。反応は、0℃から溶媒の沸点の温度、好
ましくは室温から160℃で、10分から15時間、好
ましくは、1時間から5時間行う。
例えば、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)、ジ
クロロメタン、アセトニトリル、アセトン、ヘキサン、
ペンタン、ベンゼン、トルエン、クロロホルム、1,2
−ジクロロエタン、酢酸エチル、ジグリム、ヘキサメチ
ルリン酸トリアミド等、又はこれらの混合溶媒を用いる
ことができる。反応は、0℃から溶媒の沸点の温度、好
ましくは室温から160℃で、10分から15時間、好
ましくは、1時間から5時間行う。
【0027】Pで示されるカルボキシル基の保護基は公
知のものでよく、具体例として、例えば、メチル基、エ
チル基、tert−ブチル基、ベンジル基、p−メトキ
シベンジル基、3,4−ジメトキシベンジル基、トリク
ロロエチル基、トリメチルシリル基、tert−ブチル
ジメチルシリル基、tert−ブチルジフェニルシリル
基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、
トリメチルシリルエトキシメチル基等を挙げることがで
きる。
知のものでよく、具体例として、例えば、メチル基、エ
チル基、tert−ブチル基、ベンジル基、p−メトキ
シベンジル基、3,4−ジメトキシベンジル基、トリク
ロロエチル基、トリメチルシリル基、tert−ブチル
ジメチルシリル基、tert−ブチルジフェニルシリル
基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、
トリメチルシリルエトキシメチル基等を挙げることがで
きる。
【0028】次に、式(X3)の化合物を、加水分解す
ることにより、以下の式(X4):
ることにより、以下の式(X4):
【化9】 [式(X4)中、Pおよびnは先に定義した通りであ
る]で表される構造を有する化合物を得る。
る]で表される構造を有する化合物を得る。
【0029】例えば、アルカリ加水分解の場合は、式
(X3)の化合物を、好ましくはメタノール、エタノー
ル、テトラヒドロフラン、エチレングリコール等の有機
溶媒に溶解し、次いで水酸化ナトリウム又は水酸化カリ
ウム水溶液を加えて、0℃から溶媒の沸点の温度、好ま
しくは0℃から室温で、5分から5時間、好ましくは3
0分から2時間撹拌反応させることにより式(X4)の
化合物を得ることができる。あるいは、酸加水分解の場
合は、式(X3)のエステル化合物を、好ましくはベン
ゼン、ジクロロメタン、1,2−ジクロロエタン等の有
機溶媒に溶解し、次いで塩酸、硫酸、三フッ化ホウ素、
トリフルオロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、p
−トルエンスルホン酸を加えて、0℃から溶媒の沸点の
温度、好ましくは10℃から100℃で、10分から1
0時間、好ましくは30分から2時間撹拌反応させるこ
とにより式(X4)のエステル化合物を得ることができ
る。
(X3)の化合物を、好ましくはメタノール、エタノー
ル、テトラヒドロフラン、エチレングリコール等の有機
溶媒に溶解し、次いで水酸化ナトリウム又は水酸化カリ
ウム水溶液を加えて、0℃から溶媒の沸点の温度、好ま
しくは0℃から室温で、5分から5時間、好ましくは3
0分から2時間撹拌反応させることにより式(X4)の
化合物を得ることができる。あるいは、酸加水分解の場
合は、式(X3)のエステル化合物を、好ましくはベン
ゼン、ジクロロメタン、1,2−ジクロロエタン等の有
機溶媒に溶解し、次いで塩酸、硫酸、三フッ化ホウ素、
トリフルオロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、p
−トルエンスルホン酸を加えて、0℃から溶媒の沸点の
温度、好ましくは10℃から100℃で、10分から1
0時間、好ましくは30分から2時間撹拌反応させるこ
とにより式(X4)のエステル化合物を得ることができ
る。
【0030】次に、式(X4)の化合物に、以下の式
(X5):
(X5):
【化10】 [式(X5)中、L2は塩素原子または臭素原子であ
り、L1と同一であっても異なってもよい]で表される
構造を有する化合物を反応させて、以下の式(X6):
り、L1と同一であっても異なってもよい]で表される
構造を有する化合物を反応させて、以下の式(X6):
【化11】 [式(X6)中、Pおよびnは先に定義した通りであ
る]で表される構造を有するエステル化合物を得る。反
応は、ピリジン、炭酸カリウム、トリエチルアミン等の
塩基の存在下または非存在下に、アセトン、ベンゼン、
ジオキサン等の有機溶媒中で、0℃から溶媒の沸点の温
度、好ましくは10℃から120℃において、10分か
ら15時間、好ましくは、30分から2時間行う。な
お、触媒として活性炭もしくは活性炭−ジメチルホルム
アミドを使用することもできる。
る]で表される構造を有するエステル化合物を得る。反
応は、ピリジン、炭酸カリウム、トリエチルアミン等の
塩基の存在下または非存在下に、アセトン、ベンゼン、
ジオキサン等の有機溶媒中で、0℃から溶媒の沸点の温
度、好ましくは10℃から120℃において、10分か
ら15時間、好ましくは、30分から2時間行う。な
お、触媒として活性炭もしくは活性炭−ジメチルホルム
アミドを使用することもできる。
【0031】さらに、式(X6)のエステル化合物か
ら、Pで示されるカルボキシル基の保護基を除去するこ
とにより、式(1)のプロベナゾール誘導体を得ること
ができる。カルボキシル基の保護基の除去は、アルカリ
加水分解、酸加水分解等の公知の方法で行うことができ
る。
ら、Pで示されるカルボキシル基の保護基を除去するこ
とにより、式(1)のプロベナゾール誘導体を得ること
ができる。カルボキシル基の保護基の除去は、アルカリ
加水分解、酸加水分解等の公知の方法で行うことができ
る。
【0032】すなわち、酸加水分解の場合は、式(X
6)のエステル化合物を、好ましくはベンゼン、ジクロ
ロメタン、1,2−ジクロロエタン等の有機溶媒に溶解
し、次いで塩酸、硫酸、三フッ化ホウ素、トリフルオロ
酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、p−トルエンス
ルホン酸を加えて、0℃から溶媒の沸点の温度、好まし
くは0℃から室温で、5分から10時間、好ましくは1
時間から5時間撹拌反応させることにより式(1)のプ
ロベナゾール誘導体を得ることができる。
6)のエステル化合物を、好ましくはベンゼン、ジクロ
ロメタン、1,2−ジクロロエタン等の有機溶媒に溶解
し、次いで塩酸、硫酸、三フッ化ホウ素、トリフルオロ
酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、p−トルエンス
ルホン酸を加えて、0℃から溶媒の沸点の温度、好まし
くは0℃から室温で、5分から10時間、好ましくは1
時間から5時間撹拌反応させることにより式(1)のプ
ロベナゾール誘導体を得ることができる。
【0033】また、アルカリ加水分解の場合は、式(X
6)のエステル化合物を、好ましくはメタノール、エタ
ノール、テトラヒドロフラン、エチレングリコール等の
有機溶媒に溶解し、次いで水酸化ナトリウム又は水酸化
カリウム水溶液を加えて、0℃から溶媒の沸点の温度、
好ましくは0℃から室温で、5分から5時間、好ましく
は1時間から2時間撹拌反応させることにより式(1)
のプロベナゾール誘導体を得ることができる。
6)のエステル化合物を、好ましくはメタノール、エタ
ノール、テトラヒドロフラン、エチレングリコール等の
有機溶媒に溶解し、次いで水酸化ナトリウム又は水酸化
カリウム水溶液を加えて、0℃から溶媒の沸点の温度、
好ましくは0℃から室温で、5分から5時間、好ましく
は1時間から2時間撹拌反応させることにより式(1)
のプロベナゾール誘導体を得ることができる。
【0034】更に、Pがベンジル基の場合、除去はパラ
ジウムカーボン等の触媒を用いた加水素分解反応あるい
は液体アンモニウム−ナトリウムを用いたバーチ還元に
よっても行うことができる。
ジウムカーボン等の触媒を用いた加水素分解反応あるい
は液体アンモニウム−ナトリウムを用いたバーチ還元に
よっても行うことができる。
【0035】更にまた、Pがシリル基の場合、脱保護は
テトラ−n−ブチルアンモニウムフルオリド、ピリジニ
ウムフルオリド等のフッ素アニオンを発生させる試薬に
よっても行うことができる。
テトラ−n−ブチルアンモニウムフルオリド、ピリジニ
ウムフルオリド等のフッ素アニオンを発生させる試薬に
よっても行うことができる。
【0036】以上の製造法によって得られた化合物を、
必要に応じシリカゲルクロマトグラフィー又は再結晶操
作等を行うことにより、さらに高純度の精製品とするこ
とができる。
必要に応じシリカゲルクロマトグラフィー又は再結晶操
作等を行うことにより、さらに高純度の精製品とするこ
とができる。
【0037】以下、本発明の抗原、抗体の作製、及び免
疫学的測定方法について説明する。尚、これらの調製は
公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究
法(日本生化学会編)等に記載の方法に従って行うこと
ができる。
疫学的測定方法について説明する。尚、これらの調製は
公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究
法(日本生化学会編)等に記載の方法に従って行うこと
ができる。
【0038】プロベナゾール誘導体と高分子化合物との
結合体の作製 上述のように合成されたプロベナゾール誘導体は適当な
高分子化合物に結合させてから免疫用抗原として使用す
る。
結合体の作製 上述のように合成されたプロベナゾール誘導体は適当な
高分子化合物に結合させてから免疫用抗原として使用す
る。
【0039】好ましい高分子化合物の例としては、スカ
シガイヘモシアニン(以下、「KLH」と言う)、卵白
アルブミン(以下、「OVA」と言う)、ウシ血清アル
ブミン(以下、「BSA」と言う)、ウサギ血清アルブ
ミン(以下、「RSA」と言う)などがある。KLHお
よびBSAが好ましい。
シガイヘモシアニン(以下、「KLH」と言う)、卵白
アルブミン(以下、「OVA」と言う)、ウシ血清アル
ブミン(以下、「BSA」と言う)、ウサギ血清アルブ
ミン(以下、「RSA」と言う)などがある。KLHお
よびBSAが好ましい。
【0040】プロベナゾール誘導体と高分子化合物との
結合は、例えば、混合酸無水物法(B.F.Erlan
ger et al.:J.Biol.Chem. 2
341090−1094 (1954))、又は活性化
エステル法(A.E. KARU et al.:J.
Agric. Food Chem. 42 301
−309 (1994))等の公知の方法によって行う
ことができる。
結合は、例えば、混合酸無水物法(B.F.Erlan
ger et al.:J.Biol.Chem. 2
341090−1094 (1954))、又は活性化
エステル法(A.E. KARU et al.:J.
Agric. Food Chem. 42 301
−309 (1994))等の公知の方法によって行う
ことができる。
【0041】混合酸無水物法において用いられる混合酸
無水物は、通常のショッテン−バウマン反応により得ら
れ、これを高分子化合物と反応させることにより目的と
するハプテン−高分子化合物結合体が製造される。ショ
ッテン−バウマン反応は塩基性化合物の存在下に行われ
る。塩基性化合物としてはショッテン−バウマン反応に
慣用の化合物を使用することができ、例えば、トリ−n
−ブチルアミン、N−メチルモルホリン、トリエチルア
ミン、トリメチルアミン、ピリジン、N,N−ジメチル
アニリン、DBN、DBU、DABCO等の有機塩基、
炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭
酸水素ナトリウム等の無機塩基等が挙げられる。該反応
は、通常マイナス20℃から100℃、好ましくは0℃
から50℃において行われ、反応時間は5分から10時
間、好ましくは5分から2時間である。得られた混合酸
無水物と高分子化合物との反応は、通常マイナス20℃
から150℃、好ましくは0℃から100℃において行
われ、反応時間は5分から10時間、好ましくは5分か
ら5時間である。混合酸無水物法は一般に溶媒中で行わ
れる。溶媒としては、混合酸無水物法に慣用されている
いずれの溶媒も使用可能であり、具体的にはジクロロメ
タン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭
化水素類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭
化水素類、ジオキサン、ジエチルエーテル、テトラヒド
ロフラン、ジメトキシエタン等のエーテル類、酢酸メチ
ル、酢酸エチル等のエステル類、N,N−ジメチルホル
ムアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸
トリアミド等の非プロトン性極性溶媒等が挙げられる。
混合酸無水物法において使用されるハロ蟻酸エステルと
しては、例えばクロロ蟻酸メチル、ブロモ蟻酸メチル、
クロロ蟻酸エチル、ブロモ蟻酸エチル、クロロ蟻酸イソ
ブチル等が挙げられる。当該方法におけるハプテンとハ
ロ蟻酸エステルと高分子化合物の使用割合は、広い範囲
から適宜選択され得る。
無水物は、通常のショッテン−バウマン反応により得ら
れ、これを高分子化合物と反応させることにより目的と
するハプテン−高分子化合物結合体が製造される。ショ
ッテン−バウマン反応は塩基性化合物の存在下に行われ
る。塩基性化合物としてはショッテン−バウマン反応に
慣用の化合物を使用することができ、例えば、トリ−n
−ブチルアミン、N−メチルモルホリン、トリエチルア
ミン、トリメチルアミン、ピリジン、N,N−ジメチル
アニリン、DBN、DBU、DABCO等の有機塩基、
炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭
酸水素ナトリウム等の無機塩基等が挙げられる。該反応
は、通常マイナス20℃から100℃、好ましくは0℃
から50℃において行われ、反応時間は5分から10時
間、好ましくは5分から2時間である。得られた混合酸
無水物と高分子化合物との反応は、通常マイナス20℃
から150℃、好ましくは0℃から100℃において行
われ、反応時間は5分から10時間、好ましくは5分か
ら5時間である。混合酸無水物法は一般に溶媒中で行わ
れる。溶媒としては、混合酸無水物法に慣用されている
いずれの溶媒も使用可能であり、具体的にはジクロロメ
タン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭
化水素類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭
化水素類、ジオキサン、ジエチルエーテル、テトラヒド
ロフラン、ジメトキシエタン等のエーテル類、酢酸メチ
ル、酢酸エチル等のエステル類、N,N−ジメチルホル
ムアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸
トリアミド等の非プロトン性極性溶媒等が挙げられる。
混合酸無水物法において使用されるハロ蟻酸エステルと
しては、例えばクロロ蟻酸メチル、ブロモ蟻酸メチル、
クロロ蟻酸エチル、ブロモ蟻酸エチル、クロロ蟻酸イソ
ブチル等が挙げられる。当該方法におけるハプテンとハ
ロ蟻酸エステルと高分子化合物の使用割合は、広い範囲
から適宜選択され得る。
【0042】一方、活性化エステル法は、一般に以下の
ように行うことができる。まず、ハプテン化合物を有機
溶媒に溶解し、カップリング剤の存在下にてN−ヒドロ
キシこはく酸イミドと反応させ、N−ヒドロキシこはく
酸イミドエステルを生成する。
ように行うことができる。まず、ハプテン化合物を有機
溶媒に溶解し、カップリング剤の存在下にてN−ヒドロ
キシこはく酸イミドと反応させ、N−ヒドロキシこはく
酸イミドエステルを生成する。
【0043】カップリング剤としては、縮合反応に慣用
されている通常のカップリング剤を使用でき、例えば、
ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダ
ゾール、水溶性カルボジイミド等が含まれる。有機溶媒
としては、例えば、N,N−ジメチルホルムアミド(以
下、「DMF」と言う)、ジメチルスルホキシド(以
下、「DMSO」と言う)、ジオキサン等が使用でき
る。反応に使用するハプテン化合物とN−ヒドロキシこ
はく酸イミドのモル比は好ましくは1:10から10:
1、より好ましくは、1:1から1:10、最も好まし
くは1:1である。反応温度は、0℃から50℃、好ま
しくは22℃から27℃で、反応時間は5分から24時
間、好ましくは1時間から2時間である。反応温度は各
々の融点以上沸点以下の温度で行うことができる。
されている通常のカップリング剤を使用でき、例えば、
ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダ
ゾール、水溶性カルボジイミド等が含まれる。有機溶媒
としては、例えば、N,N−ジメチルホルムアミド(以
下、「DMF」と言う)、ジメチルスルホキシド(以
下、「DMSO」と言う)、ジオキサン等が使用でき
る。反応に使用するハプテン化合物とN−ヒドロキシこ
はく酸イミドのモル比は好ましくは1:10から10:
1、より好ましくは、1:1から1:10、最も好まし
くは1:1である。反応温度は、0℃から50℃、好ま
しくは22℃から27℃で、反応時間は5分から24時
間、好ましくは1時間から2時間である。反応温度は各
々の融点以上沸点以下の温度で行うことができる。
【0044】カップリング反応後、反応液を遠心し、上
清液を高分子化合物溶解液に加え反応させると、例えば
高分子化合物が遊離のアミノ基を有する場合、当該アミ
ノ基とハプテン化合物のカルボキシル基の間に酸アミド
結合が生成される。反応温度は、0℃から60℃、好ま
しくは5℃から40℃、より好ましくは22℃から27
℃で、反応時間は5分から24時間、好ましくは1時間
から16時間、より好ましくは1時間から2時間であ
る。反応物を、透析、脱塩カラム等によって精製して、
プロベナゾール誘導体と高分子化合物との結合体を得る
ことができる。
清液を高分子化合物溶解液に加え反応させると、例えば
高分子化合物が遊離のアミノ基を有する場合、当該アミ
ノ基とハプテン化合物のカルボキシル基の間に酸アミド
結合が生成される。反応温度は、0℃から60℃、好ま
しくは5℃から40℃、より好ましくは22℃から27
℃で、反応時間は5分から24時間、好ましくは1時間
から16時間、より好ましくは1時間から2時間であ
る。反応物を、透析、脱塩カラム等によって精製して、
プロベナゾール誘導体と高分子化合物との結合体を得る
ことができる。
【0045】また、上記と同様の方法により、酵素等の
標識物質をプロベナゾール誘導体に結合させたものを、
免疫測定法において使用することができる。標識物質と
しては、西洋わさびペルオキシダーゼ(以下、「HR
P」と言う)やアルカリフォスファターゼ等の酵素、フ
ルオレセインイソチオシアネートやローダミン等の発色
物質、32P、125I等の放射性物質、化学発光物質など
がある。
標識物質をプロベナゾール誘導体に結合させたものを、
免疫測定法において使用することができる。標識物質と
しては、西洋わさびペルオキシダーゼ(以下、「HR
P」と言う)やアルカリフォスファターゼ等の酵素、フ
ルオレセインイソチオシアネートやローダミン等の発色
物質、32P、125I等の放射性物質、化学発光物質など
がある。
【0046】ポリクローナル抗体の作製 プロベナゾール誘導体と高分子化合物との結合体を使用
して、慣用化された方法により本発明のポリクローナル
抗体を作製することができる。例えば、プロベナゾール
誘導体−KLH結合体をリン酸ナトリウム緩衝液(以
下、「PBS」と言う)に溶解し、フロイント完全アジ
ュバント又は不完全アジュバント、あるいはミョウバン
等の補助剤と混合したものを、免疫用抗原として動物に
免疫することによって得ることができる。免疫される動
物としては当該分野で常用されるものをいずれも使用で
きるが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ
等を挙げることができる。
して、慣用化された方法により本発明のポリクローナル
抗体を作製することができる。例えば、プロベナゾール
誘導体−KLH結合体をリン酸ナトリウム緩衝液(以
下、「PBS」と言う)に溶解し、フロイント完全アジ
ュバント又は不完全アジュバント、あるいはミョウバン
等の補助剤と混合したものを、免疫用抗原として動物に
免疫することによって得ることができる。免疫される動
物としては当該分野で常用されるものをいずれも使用で
きるが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ
等を挙げることができる。
【0047】免疫の際の投与法は、皮下注射、腹腔内注
射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射のいずれでもよ
いが、皮下注射又は腹腔内注射が好ましい。免疫は1回
又は適当な間隔で、好ましくは1週間ないし5週間の間
隔で複数回行うことができる。
射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射のいずれでもよ
いが、皮下注射又は腹腔内注射が好ましい。免疫は1回
又は適当な間隔で、好ましくは1週間ないし5週間の間
隔で複数回行うことができる。
【0048】免疫した動物から血液を採取し、そこから
分離した血清を用い、プロベナゾールと反応するポリク
ローナル抗体の存在を評価することができる。
分離した血清を用い、プロベナゾールと反応するポリク
ローナル抗体の存在を評価することができる。
【0049】モノクローナル抗体の作製 プロベナゾール誘導体と高分子化合物との結合体を使用
して、公知の方法により本発明のモノクローナル抗体を
作製することができる。
して、公知の方法により本発明のモノクローナル抗体を
作製することができる。
【0050】モノクローナル抗体の作製にあたっては、
少なくとも下記のような作業工程が必要である。
少なくとも下記のような作業工程が必要である。
【0051】(a)免疫用抗原として使用するプロベナ
ゾール誘導体と高分子化合物との結合体の作製 (b)動物への免疫 (c)血液の採取、アッセイ、並びに抗体産生細胞の調
製 (d)ミエローマ細胞の調製 (e)抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合とハ
イブリドーマの選択的培養 (f)目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスク
リーニングと細胞クローニング (g)ハイブリドーマの培養又は動物へのハイブリドー
マの移植によるモノクローナル抗体の調製 (h)調製されたモノクローナル抗体の反応性の測定等 モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製す
るための常法は、例えば、ハイブリドーマ テクニック
ス(Hybridoma Techniques),コ
ールド スプリング ハーバー ラボラトリー(Col
d Spring Harbor Laborator
y,1980年版)、細胞組織化学(山下修二ら、日本
組織細胞化学会編;学際企画、1986年)に記載され
ている。
ゾール誘導体と高分子化合物との結合体の作製 (b)動物への免疫 (c)血液の採取、アッセイ、並びに抗体産生細胞の調
製 (d)ミエローマ細胞の調製 (e)抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合とハ
イブリドーマの選択的培養 (f)目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスク
リーニングと細胞クローニング (g)ハイブリドーマの培養又は動物へのハイブリドー
マの移植によるモノクローナル抗体の調製 (h)調製されたモノクローナル抗体の反応性の測定等 モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製す
るための常法は、例えば、ハイブリドーマ テクニック
ス(Hybridoma Techniques),コ
ールド スプリング ハーバー ラボラトリー(Col
d Spring Harbor Laborator
y,1980年版)、細胞組織化学(山下修二ら、日本
組織細胞化学会編;学際企画、1986年)に記載され
ている。
【0052】以下、本発明のプロベナゾールに対するモ
ノクローナル抗体の作製方法を説明するが、これに制限
されないことは当業者によって明らかであろう。
ノクローナル抗体の作製方法を説明するが、これに制限
されないことは当業者によって明らかであろう。
【0053】(a)−(b)の工程は、ポリクローナル
抗体に関して記述した方法とほぼ同様の方法によって行
うことができる。
抗体に関して記述した方法とほぼ同様の方法によって行
うことができる。
【0054】(c)の工程における抗体産生細胞はリン
パ球であり、これは一般には脾臓、胸腺、リンパ節、末
梢血液又はこれらの組み合わせから得ることができるが
脾細胞が最も一般的に用いられる。従って、最終免疫
後、抗体産生が確認されたマウスより抗体産生細胞が存
在する部位、例えば脾臓を摘出し、脾細胞を調製する。
パ球であり、これは一般には脾臓、胸腺、リンパ節、末
梢血液又はこれらの組み合わせから得ることができるが
脾細胞が最も一般的に用いられる。従って、最終免疫
後、抗体産生が確認されたマウスより抗体産生細胞が存
在する部位、例えば脾臓を摘出し、脾細胞を調製する。
【0055】(d)の工程に用いることができるミエロ
ーマ細胞としては、例えば、Balb/cマウス由来骨
髄腫細胞株のP3/X63−Ag8(X63)(Nat
ure,256, 495−497 (1975))、
P3/X63−Ag8.U1(P3U1)(Curre
nt Topics.in Microbiology
and Immunology, 81 1−7
(1987))、P3/NSI−1−Ag4−1(NS
−1)(Eur.J.Immunol., 6,511
−519 (1976))、Sp2/0−Ag14(S
p2/0)(Nature 276, 269−270
(1978))、FO(J.Immuno.Met
h., 35, 1−21 (1980))、MPC−
11、X63.653、S194等の骨髄腫株化細胞、
あるいはラット由来の210.RCY3.Ag1.2.
3.(Y3)(Nature 277, 131−13
3,(1979))等を使用できる。
ーマ細胞としては、例えば、Balb/cマウス由来骨
髄腫細胞株のP3/X63−Ag8(X63)(Nat
ure,256, 495−497 (1975))、
P3/X63−Ag8.U1(P3U1)(Curre
nt Topics.in Microbiology
and Immunology, 81 1−7
(1987))、P3/NSI−1−Ag4−1(NS
−1)(Eur.J.Immunol., 6,511
−519 (1976))、Sp2/0−Ag14(S
p2/0)(Nature 276, 269−270
(1978))、FO(J.Immuno.Met
h., 35, 1−21 (1980))、MPC−
11、X63.653、S194等の骨髄腫株化細胞、
あるいはラット由来の210.RCY3.Ag1.2.
3.(Y3)(Nature 277, 131−13
3,(1979))等を使用できる。
【0056】上述した株化細胞をウシ胎児血清を含むダ
ルベッコ改変イーグル培地(DMEM)又はイスコフ改
変ダルベッコ培地(IMDM)で継代培養し、融合当日
に3×103以上の細胞数を確保する。
ルベッコ改変イーグル培地(DMEM)又はイスコフ改
変ダルベッコ培地(IMDM)で継代培養し、融合当日
に3×103以上の細胞数を確保する。
【0057】(e)の工程の細胞融合は公知の方法、例
えばミルスタイン(Milstein)らの方法(Me
thods in Enzymology, 73,
3(1981))等に準じて行うことができる。現在最
も一般的に行われているのはポリエチレングリコール
(PEG)を用いる方法である。PEG法については、
例えば、細胞組織化学、山下修二ら(上述)に記載され
ている。別の融合方法としては、電気処理(電気融合)
による方法等を適宜採用することもできる(大河内悦子
ら、実験医学 5.1315−19、1987)。その
他の方法を適宜採用することもできる。また、細胞の使
用比率も公知の方法と同様でよく、例えばミエローマ細
胞に対して脾細胞を3倍から10倍程度用いればよい。
えばミルスタイン(Milstein)らの方法(Me
thods in Enzymology, 73,
3(1981))等に準じて行うことができる。現在最
も一般的に行われているのはポリエチレングリコール
(PEG)を用いる方法である。PEG法については、
例えば、細胞組織化学、山下修二ら(上述)に記載され
ている。別の融合方法としては、電気処理(電気融合)
による方法等を適宜採用することもできる(大河内悦子
ら、実験医学 5.1315−19、1987)。その
他の方法を適宜採用することもできる。また、細胞の使
用比率も公知の方法と同様でよく、例えばミエローマ細
胞に対して脾細胞を3倍から10倍程度用いればよい。
【0058】脾細胞とミエローマ細胞とが融合し、抗体
分泌能及び増殖能を獲得したハイブリドーマ群の選択
は、例えば、ミエローマ細胞株としてヒポキサンチング
アニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損株を使用
した場合、例えば上述のDMEMやIMDMにヒポキサ
ンチン・アミノプテリン・チミジンを添加して調製した
HAT培地の使用により行うことができる。
分泌能及び増殖能を獲得したハイブリドーマ群の選択
は、例えば、ミエローマ細胞株としてヒポキサンチング
アニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損株を使用
した場合、例えば上述のDMEMやIMDMにヒポキサ
ンチン・アミノプテリン・チミジンを添加して調製した
HAT培地の使用により行うことができる。
【0059】(f)の工程では、選択されたハイブリド
ーマ群を含む培養上清の一部をとり、例えば後述するE
LISA法により、プロベナゾールに対する抗体活性を
測定する。
ーマ群を含む培養上清の一部をとり、例えば後述するE
LISA法により、プロベナゾールに対する抗体活性を
測定する。
【0060】さらに、測定によりプロベナゾールに反応
する抗体を産生することが判明したハイブリドーマの細
胞クローニングを行う。この細胞クローニング法として
は、限界希釈により1ウェルに1個のハイブリドーマが
含まれるように希釈する方法「限界希釈法」;軟寒天培
地上に撒きコロニーをとる方法;マイクロマニピュレー
ターによって1個の細胞を取り出す方法;セルソーター
によって1個の細胞を分離する「ソータークローン法」
等が挙げられる。限界希釈法が簡単でありよく用いられ
る。
する抗体を産生することが判明したハイブリドーマの細
胞クローニングを行う。この細胞クローニング法として
は、限界希釈により1ウェルに1個のハイブリドーマが
含まれるように希釈する方法「限界希釈法」;軟寒天培
地上に撒きコロニーをとる方法;マイクロマニピュレー
ターによって1個の細胞を取り出す方法;セルソーター
によって1個の細胞を分離する「ソータークローン法」
等が挙げられる。限界希釈法が簡単でありよく用いられ
る。
【0061】抗体価の認められたウェルについて、例え
ば限界希釈法によりクローニングを1回から4回繰り返
して安定して抗体価の得られたものを、抗プロベナゾー
ルモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択
する。ハイブリドーマを培養する培地としては、例え
ば、ウシ胎児血清(FCS)を含むDMEM又はIMD
M等が用いられる。ハイブリドーマの培養は、例えば二
酸化炭素濃度5−7%程度及び37℃(100%湿度の
恒温器中)で培養するのが好ましい。
ば限界希釈法によりクローニングを1回から4回繰り返
して安定して抗体価の得られたものを、抗プロベナゾー
ルモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択
する。ハイブリドーマを培養する培地としては、例え
ば、ウシ胎児血清(FCS)を含むDMEM又はIMD
M等が用いられる。ハイブリドーマの培養は、例えば二
酸化炭素濃度5−7%程度及び37℃(100%湿度の
恒温器中)で培養するのが好ましい。
【0062】(g)の工程で抗体を調製するための大量
培養は、フォローファイバー型の培養装置等によって行
われる。又は、同系統のマウス(例えば、上述のBal
b/c)あるいはNu/Nuマウスの腹腔内でハイブリ
ドーマを増殖させ、腹水液より抗体を調製することも可
能である。
培養は、フォローファイバー型の培養装置等によって行
われる。又は、同系統のマウス(例えば、上述のBal
b/c)あるいはNu/Nuマウスの腹腔内でハイブリ
ドーマを増殖させ、腹水液より抗体を調製することも可
能である。
【0063】これらにより得られた培養上清液あるいは
腹水液を抗プロベナゾールモノクローナル抗体として使
用することできるが、さらに透析、硫酸アンモニウムに
よる塩析、ゲル濾過、凍結乾燥等を行い、抗体画分を集
め精製することにより抗プロベナゾールモノクローナル
抗体を得ることができる。さらに精製が必要な場合に
は、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニテ
ィークロマトグラフィー、オープンカラムクロマトグラ
フィー、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)など
の慣用されている方法を使用して抗体画分を集める操作
を1回又は複数回、あるいはこれらを組み合わせて行う
ことにより実施できる。
腹水液を抗プロベナゾールモノクローナル抗体として使
用することできるが、さらに透析、硫酸アンモニウムに
よる塩析、ゲル濾過、凍結乾燥等を行い、抗体画分を集
め精製することにより抗プロベナゾールモノクローナル
抗体を得ることができる。さらに精製が必要な場合に
は、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニテ
ィークロマトグラフィー、オープンカラムクロマトグラ
フィー、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)など
の慣用されている方法を使用して抗体画分を集める操作
を1回又は複数回、あるいはこれらを組み合わせて行う
ことにより実施できる。
【0064】以上のようにして得られた抗プロベナゾー
ルモノクローナル抗体は、例えば後述するELISA法
などの公知の方法を使用して、サブクラス、抗体価等を
決定することができる。
ルモノクローナル抗体は、例えば後述するELISA法
などの公知の方法を使用して、サブクラス、抗体価等を
決定することができる。
【0065】抗体によるプロベナゾールの測定 本発明で使用する抗体によるプロベナゾールの測定方法
としては、放射性同位元素免疫測定方法(RIA法)、
ELISA法(Engvall,E.,Methods
in Enzymol., 70, 419−439
(1980))、蛍光抗体法、プラーク法、スポット
法、凝集法、オクタロニー(Ouchterlony)
法等の一般に抗原の検出に使用されている種々の方法
(「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会
社R&Dプラニング発行、第30頁−第53頁、昭和5
7年3月5日)が挙げられる。感度、簡便性等の観点か
らELISA法が汎用されている。
としては、放射性同位元素免疫測定方法(RIA法)、
ELISA法(Engvall,E.,Methods
in Enzymol., 70, 419−439
(1980))、蛍光抗体法、プラーク法、スポット
法、凝集法、オクタロニー(Ouchterlony)
法等の一般に抗原の検出に使用されている種々の方法
(「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会
社R&Dプラニング発行、第30頁−第53頁、昭和5
7年3月5日)が挙げられる。感度、簡便性等の観点か
らELISA法が汎用されている。
【0066】プロベナゾールの測定は、各種ELISA
法のうち例えば間接競合阻害ELISA法により、以下
のような手順により行うことができる。
法のうち例えば間接競合阻害ELISA法により、以下
のような手順により行うことができる。
【0067】(a)まず、抗原であるプロベナゾール誘
導体と高分子化合物との結合体を担体に固相化する。
導体と高分子化合物との結合体を担体に固相化する。
【0068】(b)抗原が吸着していない固相表面を抗
原と無関係な、例えばタンパク質によりブロッキングす
る。
原と無関係な、例えばタンパク質によりブロッキングす
る。
【0069】(c)これに各種濃度のプロベナゾールを
含む試料及び抗体を加え、該抗体を前記固相化抗原及び
プロベナゾールに競合的に反応させて、固相化抗原−抗
体複合体及びプロベナゾール−抗体複合体を生成させ
る。
含む試料及び抗体を加え、該抗体を前記固相化抗原及び
プロベナゾールに競合的に反応させて、固相化抗原−抗
体複合体及びプロベナゾール−抗体複合体を生成させ
る。
【0070】(d)固相化抗原−抗体複合体の量を測定
することにより、予め作成した検量線から試料中のプロ
ベナゾールの量を決定することができる。
することにより、予め作成した検量線から試料中のプロ
ベナゾールの量を決定することができる。
【0071】(a)工程において、抗原を固相化する担
体としては、特別な制限はなく、ELISA法において
常用されるものをいずれも使用することができる。例え
ば、ポリスチレン製の96ウェルのマイクロタイタープ
レートが挙げられる。
体としては、特別な制限はなく、ELISA法において
常用されるものをいずれも使用することができる。例え
ば、ポリスチレン製の96ウェルのマイクロタイタープ
レートが挙げられる。
【0072】抗原を担体に固相化させるには、例えば、
抗原を含む緩衝液を担体上に加え、インキュベーション
すればよい。緩衝液としては公知のものが使用でき、例
えば、145mM NaClを含む10mMのPBSを
挙げることができる。緩衝液中の抗原の濃度は広い範囲
から選択できるが、通常0.01μg/mlから100
μg/ml程度、好ましくは0.05μg/mlから5
μg/mlが適している。また、担体として96ウェル
のマイクロタイタープレートを使用する場合には、30
0μl/ウェル以下で20μl/ウェルから150μl
/ウェル程度が望ましい。更に、インキュベーションの
条件にも特に制限はないが、通常4℃程度で一晩インキ
ュベーションが適している。
抗原を含む緩衝液を担体上に加え、インキュベーション
すればよい。緩衝液としては公知のものが使用でき、例
えば、145mM NaClを含む10mMのPBSを
挙げることができる。緩衝液中の抗原の濃度は広い範囲
から選択できるが、通常0.01μg/mlから100
μg/ml程度、好ましくは0.05μg/mlから5
μg/mlが適している。また、担体として96ウェル
のマイクロタイタープレートを使用する場合には、30
0μl/ウェル以下で20μl/ウェルから150μl
/ウェル程度が望ましい。更に、インキュベーションの
条件にも特に制限はないが、通常4℃程度で一晩インキ
ュベーションが適している。
【0073】なお、担体に固相化させる抗原としては、
抗体作製に使用したプロベナゾール誘導体と高分子化合
物との結合体自体のみならず、式(1)で表される他の
誘導体と高分子化合物との結合体を用いることもでき
る。例えば、式(1)で表される化合物でnの相違する
抗原を各々抗体作製用と固相化用に用いることもでき
る。さらに、式(1)に含まれない他のプロベナゾール
類似化合物も、固相化抗原として使用することも可能で
ある。
抗体作製に使用したプロベナゾール誘導体と高分子化合
物との結合体自体のみならず、式(1)で表される他の
誘導体と高分子化合物との結合体を用いることもでき
る。例えば、式(1)で表される化合物でnの相違する
抗原を各々抗体作製用と固相化用に用いることもでき
る。さらに、式(1)に含まれない他のプロベナゾール
類似化合物も、固相化抗原として使用することも可能で
ある。
【0074】(b)工程のブロッキングは、抗原(プロ
ベナゾール誘導体と高分子化合物との結合体)を固相化
した担体において、プロベナゾール誘導体部分以外に後
で添加する抗体が吸着され得る部分が存在する場合があ
り、もっぱらそれを防ぐ目的で行われる。ブロッキング
剤として、例えば、BSAやスキムミルク溶液を使用で
きる。あるいは、ブロックエース(「Block Ac
e」、大日本製薬、コードNo.UK−25B)等のブ
ロッキング剤として市販されているものを使用すること
もできる。具体的には、限定されるわけではないが、例
えば抗原を固相化した部分に、適当に希釈したブロック
エースを適量加え、約4℃で、一晩インキュベーション
した後、緩衝液で洗浄することにより行われる。緩衝液
としては特に制限はないが、例えば、10mM PBS
(pH7.2)、0.8%(w/v)NaCl、0.0
2%(w/v)KCl、0.02%(v/v)Twee
n20の組成のものが適している。
ベナゾール誘導体と高分子化合物との結合体)を固相化
した担体において、プロベナゾール誘導体部分以外に後
で添加する抗体が吸着され得る部分が存在する場合があ
り、もっぱらそれを防ぐ目的で行われる。ブロッキング
剤として、例えば、BSAやスキムミルク溶液を使用で
きる。あるいは、ブロックエース(「Block Ac
e」、大日本製薬、コードNo.UK−25B)等のブ
ロッキング剤として市販されているものを使用すること
もできる。具体的には、限定されるわけではないが、例
えば抗原を固相化した部分に、適当に希釈したブロック
エースを適量加え、約4℃で、一晩インキュベーション
した後、緩衝液で洗浄することにより行われる。緩衝液
としては特に制限はないが、例えば、10mM PBS
(pH7.2)、0.8%(w/v)NaCl、0.0
2%(w/v)KCl、0.02%(v/v)Twee
n20の組成のものが適している。
【0075】次いで(c)工程において、プロベナゾー
ルを含む試料と抗体を固相化抗原と接触させ、抗体を固
相化抗原及びプロベナゾールと反応させることにより、
固相化抗原−抗体複合体及びプロベナゾール−抗体複合
体が生成する。
ルを含む試料と抗体を固相化抗原と接触させ、抗体を固
相化抗原及びプロベナゾールと反応させることにより、
固相化抗原−抗体複合体及びプロベナゾール−抗体複合
体が生成する。
【0076】この際、抗体としては、第一抗体として本
願発明のプロベナゾールに対する抗体を加え、更に第二
抗体として標識酵素を結合した第一抗体に対する抗体を
順次加えて反応させる。
願発明のプロベナゾールに対する抗体を加え、更に第二
抗体として標識酵素を結合した第一抗体に対する抗体を
順次加えて反応させる。
【0077】第一抗体は緩衝液に溶解して添加する。限
定されるわけではないが、反応は、37℃程度で約1時
間行えばよい。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、固
相化抗原に結合しなかった第一抗体を除去する。緩衝液
としては、例えば、10mMPBS(pH7.2)、
0.8%(w/v)NaCl、0.02%(w/v)K
Clの組成のものが好ましい。
定されるわけではないが、反応は、37℃程度で約1時
間行えばよい。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、固
相化抗原に結合しなかった第一抗体を除去する。緩衝液
としては、例えば、10mMPBS(pH7.2)、
0.8%(w/v)NaCl、0.02%(w/v)K
Clの組成のものが好ましい。
【0078】次いで第二抗体を添加する。例えば第一抗
体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素
(例えば、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファター
ゼ等)を結合した抗マウス抗体−ヤギ抗体を用いるのが
適当である。担体に結合した第一抗体に約500−10
000倍、好ましくは最終吸光度が4以下、より好まし
くは0.5−3.0となるように希釈した第二抗体を反
応させるのが望ましい。希釈には緩衝液を用いる。限定
されるわけではないが、反応は約37℃で約1時間行
い、反応後、緩衝液で洗浄する。以上の反応により、第
二抗体が第一抗体に結合する。また、標識した第一抗体
を用いてもよく、その場合、第二抗体は不要である。
体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素
(例えば、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファター
ゼ等)を結合した抗マウス抗体−ヤギ抗体を用いるのが
適当である。担体に結合した第一抗体に約500−10
000倍、好ましくは最終吸光度が4以下、より好まし
くは0.5−3.0となるように希釈した第二抗体を反
応させるのが望ましい。希釈には緩衝液を用いる。限定
されるわけではないが、反応は約37℃で約1時間行
い、反応後、緩衝液で洗浄する。以上の反応により、第
二抗体が第一抗体に結合する。また、標識した第一抗体
を用いてもよく、その場合、第二抗体は不要である。
【0079】次いで(d)工程において担体に結合した
第二抗体の酵素と反応する発色基質溶液を加え、吸光度
を測定することによって検量線からプロベナゾールの量
を算出することができる。
第二抗体の酵素と反応する発色基質溶液を加え、吸光度
を測定することによって検量線からプロベナゾールの量
を算出することができる。
【0080】第二抗体に結合する酵素としてペルオキシ
ダーゼを使用する場合には、例えば過酸化水素、並びに
3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン又はo−
フェニレンジアミン(以下、「OPD」と言う)を含む
発色基質溶液を使用することができる。限定されるわけ
ではないが、発色基質溶液を加え約25℃で約20分間
反応させた後、2Nの硫酸を加えることにより酵素反応
を停止させる。OPDを使用する場合、480−500
nmの吸光度を測定する。3,3’,5,5’−テトラ
メチルベンジジンを使用する場合、450nmの吸光度
を測定する。一方、第二抗体に結合する酵素としてアル
カリホスファターゼを使用する場合には、例えばp−ニ
トロフェニルリン酸を基質として発色させ、2NのNa
OHを加えて酵素反応を止め、415nmでの吸光度を
測定する方法が適している。
ダーゼを使用する場合には、例えば過酸化水素、並びに
3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン又はo−
フェニレンジアミン(以下、「OPD」と言う)を含む
発色基質溶液を使用することができる。限定されるわけ
ではないが、発色基質溶液を加え約25℃で約20分間
反応させた後、2Nの硫酸を加えることにより酵素反応
を停止させる。OPDを使用する場合、480−500
nmの吸光度を測定する。3,3’,5,5’−テトラ
メチルベンジジンを使用する場合、450nmの吸光度
を測定する。一方、第二抗体に結合する酵素としてアル
カリホスファターゼを使用する場合には、例えばp−ニ
トロフェニルリン酸を基質として発色させ、2NのNa
OHを加えて酵素反応を止め、415nmでの吸光度を
測定する方法が適している。
【0081】プロベナゾールを添加しない反応溶液の吸
光度に対して、プロベナゾールを添加して抗体と反応さ
せた溶液の吸光度の減少率を阻害率として計算する。既
知の濃度のプロベナゾールを添加した反応液の阻害率に
より予め作製しておいた検量線を用いて、試料中のプロ
ベナゾールの濃度を算出できる。
光度に対して、プロベナゾールを添加して抗体と反応さ
せた溶液の吸光度の減少率を阻害率として計算する。既
知の濃度のプロベナゾールを添加した反応液の阻害率に
より予め作製しておいた検量線を用いて、試料中のプロ
ベナゾールの濃度を算出できる。
【0082】あるいは、プロベナゾールの測定は、例え
ば以下に述べるような本発明のモノクローナル抗体を用
いた直接競合阻害ELISA法によって行うこともでき
る。
ば以下に述べるような本発明のモノクローナル抗体を用
いた直接競合阻害ELISA法によって行うこともでき
る。
【0083】(a)まず、本発明のモノクローナル抗体
を担体に固相化する。
を担体に固相化する。
【0084】(b)抗体が固相化されていない担体表面
を抗原と無関係な、例えばタンパク質によりブロッキン
グする。
を抗原と無関係な、例えばタンパク質によりブロッキン
グする。
【0085】(c)各種濃度のプロベナゾールを含む試
料、並びにプロベナゾール誘導体と酵素を結合させた酵
素結合ハプテンを、担体に固相化した抗体と反応させ
る。
料、並びにプロベナゾール誘導体と酵素を結合させた酵
素結合ハプテンを、担体に固相化した抗体と反応させ
る。
【0086】(d)固相化抗体−酵素結合ハプテン複合
体の量を測定することにより、あらかじめ作成した検量
線から試料中のプロベナゾールの量を決定する。
体の量を測定することにより、あらかじめ作成した検量
線から試料中のプロベナゾールの量を決定する。
【0087】(a)工程においてモノクローナル抗体を
固相化する担体としては、特別な制限はなくELISA
法において常用されるものを用いることができ、例えば
96ウェルのマイクロタイタープレートが挙げられる。
モノクローナル抗体の固相化は、例えばモノクローナル
抗体を含む緩衝液を担体上にのせ、インキュベートする
ことによって行える。緩衝液の組成・濃度は前述の間接
競合阻害ELISA法と同様のものを採用できる。ある
いは、アミノ基結合型のマイクロタイタープレートに化
学結合法を用いて抗体を結合させたものを使用すること
もできる。
固相化する担体としては、特別な制限はなくELISA
法において常用されるものを用いることができ、例えば
96ウェルのマイクロタイタープレートが挙げられる。
モノクローナル抗体の固相化は、例えばモノクローナル
抗体を含む緩衝液を担体上にのせ、インキュベートする
ことによって行える。緩衝液の組成・濃度は前述の間接
競合阻害ELISA法と同様のものを採用できる。ある
いは、アミノ基結合型のマイクロタイタープレートに化
学結合法を用いて抗体を結合させたものを使用すること
もできる。
【0088】(b)工程のブロッキングは、抗体を固相
化した担体において、後に添加する試料中のプロベナゾ
ール及び酵素結合ハプテンが抗原抗体反応とは無関係に
吸着される部分が存在する場合があるので、それを防ぐ
目的で行う。ブロッキング剤及びその方法は、前述の間
接競合阻害ELISA法と同様のものを採用できる。
化した担体において、後に添加する試料中のプロベナゾ
ール及び酵素結合ハプテンが抗原抗体反応とは無関係に
吸着される部分が存在する場合があるので、それを防ぐ
目的で行う。ブロッキング剤及びその方法は、前述の間
接競合阻害ELISA法と同様のものを採用できる。
【0089】(c)工程において用いる酵素結合ハプテ
ンの調製は、プロベナゾール誘導体を酵素に結合する方
法であれば、特に制限なくいかなる方法で行ってもよ
い。例えば、前述した活性化エステル法を採用すること
ができる。調製した酵素結合ハプテンは、プロベナゾー
ルを含む試料と混合する。
ンの調製は、プロベナゾール誘導体を酵素に結合する方
法であれば、特に制限なくいかなる方法で行ってもよ
い。例えば、前述した活性化エステル法を採用すること
ができる。調製した酵素結合ハプテンは、プロベナゾー
ルを含む試料と混合する。
【0090】なお、酵素に結合させるハプテンとして
は、間接競合阻害ELISA法における固相化抗原の場
合と同様に、抗体作製に使用したプロベナゾール誘導体
のみならず、式(1)で表される他の誘導体を用いるこ
ともできる。例えば、式(1)においてnの数が相違す
る化合物を各々抗体作製用と標識競合化合物として用い
ることもできる。さらに、式(1)に含まれない他のプ
ロベナゾール類似化合物も、酵素に結合させるハプテン
として使用可能である。
は、間接競合阻害ELISA法における固相化抗原の場
合と同様に、抗体作製に使用したプロベナゾール誘導体
のみならず、式(1)で表される他の誘導体を用いるこ
ともできる。例えば、式(1)においてnの数が相違す
る化合物を各々抗体作製用と標識競合化合物として用い
ることもできる。さらに、式(1)に含まれない他のプ
ロベナゾール類似化合物も、酵素に結合させるハプテン
として使用可能である。
【0091】(c)工程においてプロベナゾールを含む
試料及び酵素結合ハプテンを抗体固相化担体に接触さ
せ、プロベナゾールと酵素結合ハプテンとの競合阻害反
応により、これらと固相化抗体との複合体が生成する。
プロベナゾールを含む試料は適当な緩衝液で希釈して使
用する。限定されるわけではないが、反応は例えば室温
で約1時間行う。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、
固相化抗体と結合しなかった酵素結合ハプテンを除去す
る。緩衝液は、例えばPBSを採用することができる。
試料及び酵素結合ハプテンを抗体固相化担体に接触さ
せ、プロベナゾールと酵素結合ハプテンとの競合阻害反
応により、これらと固相化抗体との複合体が生成する。
プロベナゾールを含む試料は適当な緩衝液で希釈して使
用する。限定されるわけではないが、反応は例えば室温
で約1時間行う。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、
固相化抗体と結合しなかった酵素結合ハプテンを除去す
る。緩衝液は、例えばPBSを採用することができる。
【0092】さらに、(d)工程において酵素結合ハプ
テンの酵素に反応する発色基質溶液を前述の間接競合阻
害ELISA法と同様に加え、吸光度を測定することに
より検量線からプロベナゾールの量を算出することがで
きる。
テンの酵素に反応する発色基質溶液を前述の間接競合阻
害ELISA法と同様に加え、吸光度を測定することに
より検量線からプロベナゾールの量を算出することがで
きる。
【0093】本発明のモノクローナル抗体PBZ1−1
3は、直接競合阻害ELISA法において約1ng/m
lから10000ng/ml、好ましくは10ng/m
lから1000ng/mlの範囲でプロベナゾールを測
定できる(実施例8および図1)。
3は、直接競合阻害ELISA法において約1ng/m
lから10000ng/ml、好ましくは10ng/m
lから1000ng/mlの範囲でプロベナゾールを測
定できる(実施例8および図1)。
【0094】本発明の抗体の交差反応性 上述した直接競合阻害ELISA法又は間接競合阻害E
LISA法により、本発明のモノクローナル抗体の交差
反応性を調べることができる。
LISA法により、本発明のモノクローナル抗体の交差
反応性を調べることができる。
【0095】例えば、本発明のモノクローナル抗体PB
Z1−13は、間接競合阻害ELISA法において類似
する他の化合物であるホスメット、サリチオン及びベノ
ミルとはいずれも交差反応性を示さない(実施例9およ
び図2)。
Z1−13は、間接競合阻害ELISA法において類似
する他の化合物であるホスメット、サリチオン及びベノ
ミルとはいずれも交差反応性を示さない(実施例9およ
び図2)。
【0096】以下、実施例によって本発明を具体的に説
明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するため
のものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容
易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは
本発明の技術的範囲に含まれる。
明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するため
のものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容
易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは
本発明の技術的範囲に含まれる。
【0097】
【実施例】実施例1 プロベナゾール誘導体の合成
【化12】 6−アセトキシヘキサン酸 tert−ブチルエステル
(1)の合成 N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)30mlに6
−ブロモヘキサン酸tert−ブチルエステル2.5g
(10mmol)および酢酸銀2.0g(11mmo
l)を入れ、環流下に3時間反応させた。反応混合物を
濃縮し、残渣に酢酸エチル100mlを加え、濾過し
た。濾液の酢酸エチル溶液を水洗、無水硫酸マグネシウ
ムで乾燥後、濃縮し、(1)の粗精製物2.0g(収率8
7%)を得た。
(1)の合成 N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)30mlに6
−ブロモヘキサン酸tert−ブチルエステル2.5g
(10mmol)および酢酸銀2.0g(11mmo
l)を入れ、環流下に3時間反応させた。反応混合物を
濃縮し、残渣に酢酸エチル100mlを加え、濾過し
た。濾液の酢酸エチル溶液を水洗、無水硫酸マグネシウ
ムで乾燥後、濃縮し、(1)の粗精製物2.0g(収率8
7%)を得た。
【0098】6−ヒドロキシヘキサン酸 tert−ブ
チルエステル(2)の合成 エタノール10mlに6−アセトキシヘキサン酸 te
rt−ブチルエステル(1)1.6g(7.0mmol)
を溶かし、この溶液に水10mlに溶かした水酸化ナト
リウム0.6g(15mmol)を加え、室温で1時間
撹拌した。反応混合物からエタノールを減圧濃縮で除
き、残渣を30mlのジエチルエーテルで3回抽出し
た。エーテル層を水洗、無水硫酸マグネシウムで乾燥
後、濃縮し、(2)の粗精製物1.0g(収率77%)を
得た。
チルエステル(2)の合成 エタノール10mlに6−アセトキシヘキサン酸 te
rt−ブチルエステル(1)1.6g(7.0mmol)
を溶かし、この溶液に水10mlに溶かした水酸化ナト
リウム0.6g(15mmol)を加え、室温で1時間
撹拌した。反応混合物からエタノールを減圧濃縮で除
き、残渣を30mlのジエチルエーテルで3回抽出し
た。エーテル層を水洗、無水硫酸マグネシウムで乾燥
後、濃縮し、(2)の粗精製物1.0g(収率77%)を
得た。
【0099】6−(1,1−ジオキソ−1、2−ベンズ
イソチアゾール−3−イルオキシ)ヘキサン酸 te
rt−ブチルエステル(3)の合成 ピリジン10mlに6−ヒドロキシヘキサン酸 ter
t−ブチルエステル(2)1.0g(5.3mmol)
を入れ、撹拌下に3−クロロ−1,2−ベンズイソチア
ゾール 1,1−ジオキシド1.1g(5.3mmo
l)を徐々に加えた。室温で1時間撹拌後、濃縮した。
残渣を100mlの酢酸エチルで抽出し、酢酸エチル層
を水洗、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濃縮した。残
渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ(n−ヘキサ
ン:酢酸エチル=3:1)で精製し、1.4g(収率7
4%)の(3)を得た。
イソチアゾール−3−イルオキシ)ヘキサン酸 te
rt−ブチルエステル(3)の合成 ピリジン10mlに6−ヒドロキシヘキサン酸 ter
t−ブチルエステル(2)1.0g(5.3mmol)
を入れ、撹拌下に3−クロロ−1,2−ベンズイソチア
ゾール 1,1−ジオキシド1.1g(5.3mmo
l)を徐々に加えた。室温で1時間撹拌後、濃縮した。
残渣を100mlの酢酸エチルで抽出し、酢酸エチル層
を水洗、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濃縮した。残
渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ(n−ヘキサ
ン:酢酸エチル=3:1)で精製し、1.4g(収率7
4%)の(3)を得た。
【0100】6−(1,1−ジオキソ−1,2−ベンズ
イソチアゾール−3−イルオキシ)ヘキサン酸(4)の
合成 ジクロロメタン30mlに6−(1,1−ジオキソ−
1,2−ベンズイソチアゾール−3−イルオキシ)ヘキ
サン酸 tert−ブチルエステル(3)1.2g
(3.4mmol)とトリフルオロ酢酸3mlを入れ、
室温下に2時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、残渣の
結晶をベンゼンから再結晶させ0.90g(収率90%)
の(4)を得た。このプロベナゾール誘導体の物性値を
以下に示す。
イソチアゾール−3−イルオキシ)ヘキサン酸(4)の
合成 ジクロロメタン30mlに6−(1,1−ジオキソ−
1,2−ベンズイソチアゾール−3−イルオキシ)ヘキ
サン酸 tert−ブチルエステル(3)1.2g
(3.4mmol)とトリフルオロ酢酸3mlを入れ、
室温下に2時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、残渣の
結晶をベンゼンから再結晶させ0.90g(収率90%)
の(4)を得た。このプロベナゾール誘導体の物性値を
以下に示す。
【0101】 融点;134−136℃1 H−NMR(DMSO−D6,400MHz) δ 1.45(2H,m,CH2), 1.58(2H,m,CH2), 1.84(2H,m,CH2), 2.25(2H,t,CH2), 4.56(2H,t,CH2), 7.90(3H,m,Ar:H), 8.14(1H,d,Ar:H), 12.06(1H,br,COOH)実施例2 免疫用抗原の作製 プロベナゾール誘導体とKLHとの結合体を以下のよう
に混合酸無水物法により作製した。
に混合酸無水物法により作製した。
【0102】実施例1によって作製されたプロベナゾー
ル誘導体の7mgを無水ジオキサン0.7mlに溶解
し、10℃から12℃に冷却した後、トリ−N−ブチル
アミン4μlおよびクロロ蟻酸イソブチル24μlを添加
し、10℃から12℃にて30分間撹拌した(以下、こ
れを「A液」とする)。
ル誘導体の7mgを無水ジオキサン0.7mlに溶解
し、10℃から12℃に冷却した後、トリ−N−ブチル
アミン4μlおよびクロロ蟻酸イソブチル24μlを添加
し、10℃から12℃にて30分間撹拌した(以下、こ
れを「A液」とする)。
【0103】一方、蒸留水1mlにKLHを20mg溶
解し、0.5%NaHCO3(pH9.4)を外液とし
て一晩透析した。透析後3000rpm、30分間遠心
し得られた上清1.5mlにA液をゆっくり添加した。
4℃にて2時間反応させた後、スパーテル1杯のグリシ
ンを添加してさらに4℃にて30分間撹拌することによ
り反応を終了させた。この反応液を145mM NaC
l−10mM PBS(pH7.4)中で1週間透析し
て免疫用抗原を得た。このようにして得られたプロベナ
ゾール−KLH結合体を免疫用抗原として用いた。
解し、0.5%NaHCO3(pH9.4)を外液とし
て一晩透析した。透析後3000rpm、30分間遠心
し得られた上清1.5mlにA液をゆっくり添加した。
4℃にて2時間反応させた後、スパーテル1杯のグリシ
ンを添加してさらに4℃にて30分間撹拌することによ
り反応を終了させた。この反応液を145mM NaC
l−10mM PBS(pH7.4)中で1週間透析し
て免疫用抗原を得た。このようにして得られたプロベナ
ゾール−KLH結合体を免疫用抗原として用いた。
【0104】実施例3 スクリーニング用抗原の作製 スクリーニング用抗原として実施例2と同様の方法によ
りプロベナゾール誘導体−BSA結合体を得た。
りプロベナゾール誘導体−BSA結合体を得た。
【0105】実施例4 免疫感作 実施例2で調整した免疫用抗原を用いて、マウスに免疫
をおこなった。免疫用抗原100μgをPBS100μl
に溶解し、等量のフロイント完全アジュバントと混合し
た後、Balb/cマウスに接種した。17日後にフロ
イント不完全アジュバントを用いて調製した免疫用抗原
を、前記と同様の操作によりマウスに追加免疫をおこな
った。また、41日後にはPBSに溶解した免疫抗原を
マウスに追加免疫した。
をおこなった。免疫用抗原100μgをPBS100μl
に溶解し、等量のフロイント完全アジュバントと混合し
た後、Balb/cマウスに接種した。17日後にフロ
イント不完全アジュバントを用いて調製した免疫用抗原
を、前記と同様の操作によりマウスに追加免疫をおこな
った。また、41日後にはPBSに溶解した免疫抗原を
マウスに追加免疫した。
【0106】実施例5 抗血清によるプロベナゾールと
の反応性 実施例4で調製した抗血清について、以下の間接競合阻
害ELISA法でプロベナゾールを測定し、抗血清の力
価を評価した。
の反応性 実施例4で調製した抗血清について、以下の間接競合阻
害ELISA法でプロベナゾールを測定し、抗血清の力
価を評価した。
【0107】実施例3で調製したスクリーニング用抗原
の溶液(0.1μg/ml)を100μl/ウェルにて9
6ウェルプレートにコーティングした。洗浄の後、4倍
に希釈したブロックエース(「Block Ace」:
大日本製薬、コードNo.UK−25B)でブロッキン
グした後、抗血清希釈液と各種濃度のプロベナゾールあ
るいはその類似化合物を含む10%メタノール溶液とを
等量混合し、その100μlをウェルに入れ、37℃に
て1時間反応させた。
の溶液(0.1μg/ml)を100μl/ウェルにて9
6ウェルプレートにコーティングした。洗浄の後、4倍
に希釈したブロックエース(「Block Ace」:
大日本製薬、コードNo.UK−25B)でブロッキン
グした後、抗血清希釈液と各種濃度のプロベナゾールあ
るいはその類似化合物を含む10%メタノール溶液とを
等量混合し、その100μlをウェルに入れ、37℃に
て1時間反応させた。
【0108】反応終了後、0.05%Tween20−
PBSにて1回洗浄の後、PBSを用いて5000倍希
釈したペルオキシダーゼ結合抗マウスIgGヤギ抗体
(カッペル社製)を100μlずつ各ウェルに添加し、
37℃にて1時間反応させた。さらに反応終了後、0.
05%Tween20−PBSにて2回洗浄し、0.4
mg/mlのOPD及び0.04%過酸化水素を含む
0.05Mリン酸クエン酸緩衝液(pH4.5)を10
0μlずつ各ウェルに入れ、室温にて20分間放置し発
色させた。反応後、2N硫酸100μlを各ウェルに加
え、反応を停止させた後、490nmの吸光度を測定し
た。
PBSにて1回洗浄の後、PBSを用いて5000倍希
釈したペルオキシダーゼ結合抗マウスIgGヤギ抗体
(カッペル社製)を100μlずつ各ウェルに添加し、
37℃にて1時間反応させた。さらに反応終了後、0.
05%Tween20−PBSにて2回洗浄し、0.4
mg/mlのOPD及び0.04%過酸化水素を含む
0.05Mリン酸クエン酸緩衝液(pH4.5)を10
0μlずつ各ウェルに入れ、室温にて20分間放置し発
色させた。反応後、2N硫酸100μlを各ウェルに加
え、反応を停止させた後、490nmの吸光度を測定し
た。
【0109】実施例6 ハイブリドーマの作製 実施例4に続き、血清中の抗プロベナゾール抗体の活性
が高くなったマウスの脾臓細胞と、マウスミエローマ細
胞(P3U1)とを電気融合法にて細胞融合を行った。
細胞増殖が認められた培養上清液について以下の方法で
プロベナゾールに対する抗体活性を調べた。
が高くなったマウスの脾臓細胞と、マウスミエローマ細
胞(P3U1)とを電気融合法にて細胞融合を行った。
細胞増殖が認められた培養上清液について以下の方法で
プロベナゾールに対する抗体活性を調べた。
【0110】実施例3で調製したスクリーニング用抗原
の溶液(0.1μg/ml)を50μl/ウェルにて96ウ
ェルプレートにコーティングした。洗浄の後、4倍に希
釈したブロックエースでブロッキングした後、培養上清
液と各種濃度のプロベナゾール又はその類似化合物を含
む10%メタノール溶液とを等量混合し、その100μ
lをウェルに入れ、37℃にて1時間反応させた。反応
終了後、0.05%Tween20−PBSにて1回洗
浄の後、PBSを用いて、5000倍希釈したペルオキ
シダーゼ結合抗マウスIgGヤギ抗体(カッペル社製)
を50μlずつ各ウェルにて37℃1時間反応させた。
さらに反応終了後、0.05%Tween20−PBS
にて2回洗浄の後、0.4mg/mlのOPD及び0.
04%過酸化水素を含む0.05Mリン酸クエン酸緩衝
液(pH4.5)を100μlずつ各ウェルにいれ室温
にて20分間放置し、発色させた。反応後、2N硫酸1
00μlを各ウェルに加え、反応を停止させた後、49
0nmの吸光度を測定し、特異性のある抗体活性が認め
られたものを選抜した。
の溶液(0.1μg/ml)を50μl/ウェルにて96ウ
ェルプレートにコーティングした。洗浄の後、4倍に希
釈したブロックエースでブロッキングした後、培養上清
液と各種濃度のプロベナゾール又はその類似化合物を含
む10%メタノール溶液とを等量混合し、その100μ
lをウェルに入れ、37℃にて1時間反応させた。反応
終了後、0.05%Tween20−PBSにて1回洗
浄の後、PBSを用いて、5000倍希釈したペルオキ
シダーゼ結合抗マウスIgGヤギ抗体(カッペル社製)
を50μlずつ各ウェルにて37℃1時間反応させた。
さらに反応終了後、0.05%Tween20−PBS
にて2回洗浄の後、0.4mg/mlのOPD及び0.
04%過酸化水素を含む0.05Mリン酸クエン酸緩衝
液(pH4.5)を100μlずつ各ウェルにいれ室温
にて20分間放置し、発色させた。反応後、2N硫酸1
00μlを各ウェルに加え、反応を停止させた後、49
0nmの吸光度を測定し、特異性のある抗体活性が認め
られたものを選抜した。
【0111】次に、選抜されたウェルの細胞について限
界希釈法を用いた細胞クローニングをおこなった。その
結果、抗プロベナゾール抗体を産生するハイブリドーマ
細胞株をクローン化した。そのうちのPBZ1−13を
平成10年7月23日に寄託番号FERM−16906
として工業技術院生命工学工業研究所(〒305−00
46 茨城県つくば市東1丁目1番3号)に寄託した。
界希釈法を用いた細胞クローニングをおこなった。その
結果、抗プロベナゾール抗体を産生するハイブリドーマ
細胞株をクローン化した。そのうちのPBZ1−13を
平成10年7月23日に寄託番号FERM−16906
として工業技術院生命工学工業研究所(〒305−00
46 茨城県つくば市東1丁目1番3号)に寄託した。
【0112】実施例7 プロベナゾール誘導体とHRP
との結合体作製 実施例2と同様な混合無水物法により実施例1で作製し
たプロベナゾールハプテンとHRPの結合体を作製し
た。1mgのプロベナゾール誘導体を無水ジオキサン
0.2mlに溶解した後、トリ−N−ブチルアミン0.
5μl、クロロ蟻酸イソブチル0.3μlを添加し、10
℃から12℃にて30分間撹拌した。(以下、これを
「B液」とする)一方、0.5%NaHCO3をNaO
HでpH9.4に調整した溶液1mlにHRP5mgを
溶解し、B液をこの中に滴下した。4℃にて2時間撹拌
し、さらにグリシンを添加して30分間撹拌することに
より反応を終了させた。反応物をPBSにて透析するこ
とにより、精製HRP結合プロベナゾール誘導体を得
た。
との結合体作製 実施例2と同様な混合無水物法により実施例1で作製し
たプロベナゾールハプテンとHRPの結合体を作製し
た。1mgのプロベナゾール誘導体を無水ジオキサン
0.2mlに溶解した後、トリ−N−ブチルアミン0.
5μl、クロロ蟻酸イソブチル0.3μlを添加し、10
℃から12℃にて30分間撹拌した。(以下、これを
「B液」とする)一方、0.5%NaHCO3をNaO
HでpH9.4に調整した溶液1mlにHRP5mgを
溶解し、B液をこの中に滴下した。4℃にて2時間撹拌
し、さらにグリシンを添加して30分間撹拌することに
より反応を終了させた。反応物をPBSにて透析するこ
とにより、精製HRP結合プロベナゾール誘導体を得
た。
【0113】実施例8 直接競合阻害ELISA法によ
るプロベナゾールの測定 実施例6で得られたハイブリドーマ細胞(PBZ1−1
3)をマウスの腹腔に移植し、10−15日後に得られ
た腹水を採取し、硫安分画法によりモノクローナル抗体
を精製した。この操作によって、抗プロベナゾール抗体
PBZ1−13を用いて以下の試験法にてプロベナゾー
ルを測定した。
るプロベナゾールの測定 実施例6で得られたハイブリドーマ細胞(PBZ1−1
3)をマウスの腹腔に移植し、10−15日後に得られ
た腹水を採取し、硫安分画法によりモノクローナル抗体
を精製した。この操作によって、抗プロベナゾール抗体
PBZ1−13を用いて以下の試験法にてプロベナゾー
ルを測定した。
【0114】モノクローナル抗体溶液(PBZ1−13
抗体40μg/ml)を100μl/ウェルで96ウェ
ルプレートに加え、4℃で一晩静置し、翌日4倍希釈し
たブロックエースでブロッキングした。その後、プロベ
ナゾール及び実施例7で作製した適度に希釈されたHR
P結合プロベナゾールハプテンを含む10%メタノール
−PBS溶液を50μl/ウェルで加え、37℃1時間
静置した。反応終了後、0.05%Tween20−P
BSにて2回洗浄の後、0.4mg/mlのOPD及び
0.04%過酸化水素を含む0.05Mリン酸クエン酸
緩衝液(pH4.5)を100μlずつ各ウェルにいれ
室温にて20分間放置し、発色させた。反応後、2N硫
酸100μlを各ウェルに加え、反応を停止させた後、
490nmの吸光度を測定した。
抗体40μg/ml)を100μl/ウェルで96ウェ
ルプレートに加え、4℃で一晩静置し、翌日4倍希釈し
たブロックエースでブロッキングした。その後、プロベ
ナゾール及び実施例7で作製した適度に希釈されたHR
P結合プロベナゾールハプテンを含む10%メタノール
−PBS溶液を50μl/ウェルで加え、37℃1時間
静置した。反応終了後、0.05%Tween20−P
BSにて2回洗浄の後、0.4mg/mlのOPD及び
0.04%過酸化水素を含む0.05Mリン酸クエン酸
緩衝液(pH4.5)を100μlずつ各ウェルにいれ
室温にて20分間放置し、発色させた。反応後、2N硫
酸100μlを各ウェルに加え、反応を停止させた後、
490nmの吸光度を測定した。
【0115】結果を図1に示す。直接競合阻害ELIS
A法においても本発明のモノクローナル抗体PBZ1−
13はプロベナゾールを測定することができ、その測定
範囲はプロベナゾール1ng/mlから10000ng
/mlであった。
A法においても本発明のモノクローナル抗体PBZ1−
13はプロベナゾールを測定することができ、その測定
範囲はプロベナゾール1ng/mlから10000ng
/mlであった。
【0116】実施例9 モノクローナル抗体の評価 プロベナゾール誘導体を用いて得られたモノクローナル
抗体PBZ1−13について、実施例8と同様の方法を
用いてプロベナゾールおよび他の類似化合物に対する反
応性について調べた。
抗体PBZ1−13について、実施例8と同様の方法を
用いてプロベナゾールおよび他の類似化合物に対する反
応性について調べた。
【0117】結果を図2に示す。ここで、%最高吸光度
は以下の計算式で計算した。
は以下の計算式で計算した。
【0118】
【化13】 交差反応性は、%最高吸光度が50を示すときのプロベ
ナゾールの濃度(μg/ml)を%最高吸光度が50を
示すときの対象化合物(ホスメット等)の濃度(μg/
ml)で除して100を乗じた数値(%)で判定する。
ナゾールの濃度(μg/ml)を%最高吸光度が50を
示すときの対象化合物(ホスメット等)の濃度(μg/
ml)で除して100を乗じた数値(%)で判定する。
【0119】図2に示されるようにモノクローナル抗体
PBZ1−13は他の類似化合物であるホスメット、サ
リチオン、ベノミルとはいずれも交差反応性は1%以下
であった(図2)。
PBZ1−13は他の類似化合物であるホスメット、サ
リチオン、ベノミルとはいずれも交差反応性は1%以下
であった(図2)。
【図1】図1は、本発明のモノクローナル抗体PBZ1
−13を用いた直接競合阻害ELISA法によるプロベ
ナゾールの測定を示す。
−13を用いた直接競合阻害ELISA法によるプロベ
ナゾールの測定を示す。
【図2】図2は、本発明のモノクロ−ナル抗体PBZ1
−13を用いた直接競合阻害ELISA法によるプロベ
ナゾール及び他の類似化合物との交差反応性を示す。
−13を用いた直接競合阻害ELISA法によるプロベ
ナゾール及び他の類似化合物との交差反応性を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 香川 康浩 東京都港区浜松町1丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内 (72)発明者 渡辺 和明 東京都港区浜松町1丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内 (72)発明者 斉藤 恵 東京都港区浜松町1丁目27番14号 株式会 社環境免疫技術研究所内 Fターム(参考) 4C033 AA01 AA06 AA12 4H045 AA11 AA20 AA30 BA72 DA76 DA86 EA50 FA42 FA72 GA10
Claims (10)
- 【請求項1】以下の式(1): 【化1】 [式(1)中、nは1−10の整数である]で表される
構造を有する化合物。 - 【請求項2】請求項1に記載の化合物と高分子化合物又
は標識物質との結合体。 - 【請求項3】請求項1に記載の化合物と高分子化合物を
結合させることにより抗原を作製し、当該抗原を用いる
ことにより、以下の式(2): 【化2】 で表される構造を有する化合物に反応性を示す抗体を製
造することを特徴とする、式(2)の化合物に反応性を
示す抗体又はそのフラグメントの製造方法。 - 【請求項4】請求項2に記載の結合体を抗原として用い
ることにより製造された、式(2)の化合物と反応性を
示す抗体又はそのフラグメント。 - 【請求項5】モノクローナル抗体である、請求項4に記
載の抗体又はそのフラグメント。 - 【請求項6】モノクローナル抗体PBZ1−13であ
る、請求項4又は5に記載の抗体又はそのフラグメン
ト。 - 【請求項7】請求項4ないし6のいずれか1項に記載の
抗体を産生するハイブリドーマ。 - 【請求項8】寄託番号FREM P−16906で寄託
されている請求項7に記載のハイブリドーマ。 - 【請求項9】請求項4ないし6のいずれか1項に記載の
抗体又はフラグメントを用いることを特徴とする、式
(2)で表される化合物の免疫学的測定方法。 - 【請求項10】さらに、請求項1に記載の化合物又は請
求項2に記載の結合体を用いることを含む、請求項9に
記載の免疫学的測定方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP10268616A JP2000095769A (ja) | 1998-09-22 | 1998-09-22 | プロベナゾールのハプテン化合物、抗体及び測定方法 |
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP10268616A JP2000095769A (ja) | 1998-09-22 | 1998-09-22 | プロベナゾールのハプテン化合物、抗体及び測定方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2000095769A true JP2000095769A (ja) | 2000-04-04 |
JP2000095769A5 JP2000095769A5 (ja) | 2005-10-27 |
Family
ID=17461029
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP10268616A Withdrawn JP2000095769A (ja) | 1998-09-22 | 1998-09-22 | プロベナゾールのハプテン化合物、抗体及び測定方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2000095769A (ja) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015072275A (ja) * | 2006-11-01 | 2015-04-16 | ベンタナ・メデイカル・システムズ・インコーポレーテツド | ハプテン、ハプテンコンジュゲート、その組成物ならびにそれらの製造および使用の方法 |
CN110326149A (zh) * | 2017-02-15 | 2019-10-11 | 株式会社村田制作所 | 二次电池用电解液、二次电池、电池包、电动车辆、电力储存***、电动工具及电子设备 |
CN110698424A (zh) * | 2019-11-05 | 2020-01-17 | 天津北方食品有限公司 | 一种烯丙苯噻唑的制备方法 |
CN110759872A (zh) * | 2019-10-16 | 2020-02-07 | 天津北方食品有限公司 | 一种烯丙苯噻唑中糖精的去除方法 |
CN115322969A (zh) * | 2022-06-09 | 2022-11-11 | 江南大学 | 抗敌菌灵单克隆抗体、单克隆细胞株及应用 |
-
1998
- 1998-09-22 JP JP10268616A patent/JP2000095769A/ja not_active Withdrawn
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015072275A (ja) * | 2006-11-01 | 2015-04-16 | ベンタナ・メデイカル・システムズ・インコーポレーテツド | ハプテン、ハプテンコンジュゲート、その組成物ならびにそれらの製造および使用の方法 |
CN110326149A (zh) * | 2017-02-15 | 2019-10-11 | 株式会社村田制作所 | 二次电池用电解液、二次电池、电池包、电动车辆、电力储存***、电动工具及电子设备 |
CN110759872A (zh) * | 2019-10-16 | 2020-02-07 | 天津北方食品有限公司 | 一种烯丙苯噻唑中糖精的去除方法 |
CN110698424A (zh) * | 2019-11-05 | 2020-01-17 | 天津北方食品有限公司 | 一种烯丙苯噻唑的制备方法 |
CN115322969A (zh) * | 2022-06-09 | 2022-11-11 | 江南大学 | 抗敌菌灵单克隆抗体、单克隆细胞株及应用 |
CN115322969B (zh) * | 2022-06-09 | 2023-08-22 | 江南大学 | 抗敌菌灵单克隆抗体、单克隆细胞株及应用 |
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