JP2000105233A - 小粒子化HBs抗原の調製法並びにこれを用いた免疫測定試薬の製造方法、免疫測定試薬及び免疫測定方法 - Google Patents
小粒子化HBs抗原の調製法並びにこれを用いた免疫測定試薬の製造方法、免疫測定試薬及び免疫測定方法Info
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- JP2000105233A JP2000105233A JP10275007A JP27500798A JP2000105233A JP 2000105233 A JP2000105233 A JP 2000105233A JP 10275007 A JP10275007 A JP 10275007A JP 27500798 A JP27500798 A JP 27500798A JP 2000105233 A JP2000105233 A JP 2000105233A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 抗原活性を保持した小粒子化HBs抗原を得
ることができる小粒子化HBs抗原の調製法を提供す
る。 【解決手段】 界面活性剤、還元剤及びタンパク質変性
剤からなる群より選択される少なくとも1種によって、
HBs抗原を小粒子化処理する工程、並びに、上記小粒
子化処理されたHBs抗原に、分子シャペロンを反応さ
せる工程からなる小粒子化HBs抗原の調製法であっ
て、上記小粒子化処理する工程と上記反応させる工程と
は、同時に行う小粒子化HBs抗原の調製法。
ることができる小粒子化HBs抗原の調製法を提供す
る。 【解決手段】 界面活性剤、還元剤及びタンパク質変性
剤からなる群より選択される少なくとも1種によって、
HBs抗原を小粒子化処理する工程、並びに、上記小粒
子化処理されたHBs抗原に、分子シャペロンを反応さ
せる工程からなる小粒子化HBs抗原の調製法であっ
て、上記小粒子化処理する工程と上記反応させる工程と
は、同時に行う小粒子化HBs抗原の調製法。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、HBs抗原を小粒
子化させる際に伴う構造変化を抑えることによって、抗
原活性を保持した小粒子化HBs抗原を得ることができ
る小粒子化HBs抗原の調製法、並びに、上記小粒子化
HBs抗原を用いた免疫測定試薬の製造方法、免疫測定
試薬及び免疫測定方法に関する。
子化させる際に伴う構造変化を抑えることによって、抗
原活性を保持した小粒子化HBs抗原を得ることができ
る小粒子化HBs抗原の調製法、並びに、上記小粒子化
HBs抗原を用いた免疫測定試薬の製造方法、免疫測定
試薬及び免疫測定方法に関する。
【0002】
【従来の技術】B型肝炎ウイルス(HBV)感染時の患
者血清中には、直径42nmのDane粒子と呼ばれる
二本鎖DNAウイルスの他に、直径22nmの小型球状
粒子や同じ外径で長さ50〜700nmの管状粒子が存
在することが知られている。これらHBVには、HBV
の外被(surface)、芯(core)に対応する
表面抗原(HBs抗原)、核抗原(HBc抗原)等が存
在する。
者血清中には、直径42nmのDane粒子と呼ばれる
二本鎖DNAウイルスの他に、直径22nmの小型球状
粒子や同じ外径で長さ50〜700nmの管状粒子が存
在することが知られている。これらHBVには、HBV
の外被(surface)、芯(core)に対応する
表面抗原(HBs抗原)、核抗原(HBc抗原)等が存
在する。
【0003】このような各抗原に対する抗体の検出は、
臨床診断上重要である。特に、HBs抗体は、HBVに
対する感染防御抗体であるので、過去にHBVの感染が
あり既に排除されている場合やHBVワクチン接種後で
ある場合に血中に検出される。従って、HBs抗体が陽
性であることは、HBVに対して抵抗性があり、再感染
のおそれがないことを示すものである。
臨床診断上重要である。特に、HBs抗体は、HBVに
対する感染防御抗体であるので、過去にHBVの感染が
あり既に排除されている場合やHBVワクチン接種後で
ある場合に血中に検出される。従って、HBs抗体が陽
性であることは、HBVに対して抵抗性があり、再感染
のおそれがないことを示すものである。
【0004】血中のHBs抗体の定量的測定法として
は、通常、抗原抗体反応を利用した免疫測定法が用いら
れ、例えば、酵素標識したHBs抗原を使用する酵素免
疫測定法(EIA)、HBs抗原を血球やラテックス等
の不溶性担体に担持させた血球凝集法やラテックス凝集
法等が挙げられる。
は、通常、抗原抗体反応を利用した免疫測定法が用いら
れ、例えば、酵素標識したHBs抗原を使用する酵素免
疫測定法(EIA)、HBs抗原を血球やラテックス等
の不溶性担体に担持させた血球凝集法やラテックス凝集
法等が挙げられる。
【0005】EIAをワンステップサンドイッチ法で行
う場合、例えば、精製したHBs抗原をビーズやマイク
ロタイタープレートのウェル内壁等の不溶性担体に予め
固定化しておき、これにHBs抗体を含有する検体及び
酵素標識したHBs抗原を含有する溶液を加えて免疫反
応させて固定化HBs抗原−HBs抗体−酵素標識HB
s抗原の免疫複合体を生成させる。洗浄操作後、酵素発
色基質を加え、酵素反応により生じる生産物を検出する
ことにより、検体中のHBs抗体を定量することができ
る。
う場合、例えば、精製したHBs抗原をビーズやマイク
ロタイタープレートのウェル内壁等の不溶性担体に予め
固定化しておき、これにHBs抗体を含有する検体及び
酵素標識したHBs抗原を含有する溶液を加えて免疫反
応させて固定化HBs抗原−HBs抗体−酵素標識HB
s抗原の免疫複合体を生成させる。洗浄操作後、酵素発
色基質を加え、酵素反応により生じる生産物を検出する
ことにより、検体中のHBs抗体を定量することができ
る。
【0006】EIAに使用する酵素標識抗原を調製する
際には、通常、二価性架橋剤を用いるが、抗原と酵素が
ともに分子量の大きい場合には、それらを反応させるに
際して、両者の濃度を上げる必要がある。しかし、HB
s抗原は、分子量300万〜400万という巨大分子で
あり、酵素との結合が可能な濃度に抗原を溶解させるた
めには界面活性剤を多量に使用する必要がある。しか
し、このような条件下では多くの酵素が失活してしまう
ため、酵素標識が困難であった。
際には、通常、二価性架橋剤を用いるが、抗原と酵素が
ともに分子量の大きい場合には、それらを反応させるに
際して、両者の濃度を上げる必要がある。しかし、HB
s抗原は、分子量300万〜400万という巨大分子で
あり、酵素との結合が可能な濃度に抗原を溶解させるた
めには界面活性剤を多量に使用する必要がある。しか
し、このような条件下では多くの酵素が失活してしまう
ため、酵素標識が困難であった。
【0007】また、血球凝集法やラテックス凝集法は、
精製したHBs抗原をラテックスや血球等に担持させ、
これをHBs抗体含有検体と混合して抗原抗体反応させ
て、ラテックスや血球が抗体により架橋・凝集され、こ
の凝集を検出することにより検体中のHBs抗体を定量
することができる。
精製したHBs抗原をラテックスや血球等に担持させ、
これをHBs抗体含有検体と混合して抗原抗体反応させ
て、ラテックスや血球が抗体により架橋・凝集され、こ
の凝集を検出することにより検体中のHBs抗体を定量
することができる。
【0008】ラテックスや血球に担持させる抗原量は、
多ければ多いほど反応性が増加し、試薬の感度が向上す
る。しかしながら、HBs抗原は、上述のように巨大分
子であるために、担体(ラテックスや血球)の表面積当
たりの担持量が少なくなり、充分な試薬感度を得ること
が困難であった。
多ければ多いほど反応性が増加し、試薬の感度が向上す
る。しかしながら、HBs抗原は、上述のように巨大分
子であるために、担体(ラテックスや血球)の表面積当
たりの担持量が少なくなり、充分な試薬感度を得ること
が困難であった。
【0009】特開平6−138123号公報には、HB
s抗原を還元剤を用いてHBs抗原のジスルフィド結合
を開裂し、分子量が50万〜100万の小粒子化したH
Bs抗原を調製し、これを用いて酵素標識体を調製する
方法が開示されている。しかしながら、このような方法
で得られたHBs抗原は、抗原活性の低下が認められて
おり、酵素標識抗原の調製やラテックスや血球等への担
持に用いるのには適したものではなかった。従って、抗
原活性を保持した小粒子化HBs抗原の調製方法が望ま
れていた。
s抗原を還元剤を用いてHBs抗原のジスルフィド結合
を開裂し、分子量が50万〜100万の小粒子化したH
Bs抗原を調製し、これを用いて酵素標識体を調製する
方法が開示されている。しかしながら、このような方法
で得られたHBs抗原は、抗原活性の低下が認められて
おり、酵素標識抗原の調製やラテックスや血球等への担
持に用いるのには適したものではなかった。従って、抗
原活性を保持した小粒子化HBs抗原の調製方法が望ま
れていた。
【0010】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記現状に
鑑み、抗原活性を保持した小粒子化HBs抗原を得るこ
とができる小粒子化HBs抗原の調製法、並びに、上記
小粒子化HBs抗原の調製法により得られた小粒子化H
Bs抗原を用いた免疫測定試薬の製造方法、免疫測定試
薬及び免疫測定方法を提供することを目的とする。
鑑み、抗原活性を保持した小粒子化HBs抗原を得るこ
とができる小粒子化HBs抗原の調製法、並びに、上記
小粒子化HBs抗原の調製法により得られた小粒子化H
Bs抗原を用いた免疫測定試薬の製造方法、免疫測定試
薬及び免疫測定方法を提供することを目的とする。
【0011】
【課題を解決するための手段】本発明は、界面活性剤、
還元剤及びタンパク質変性剤からなる群より選択される
少なくとも1種によって、HBs抗原を小粒子化処理す
る工程、並びに、上記小粒子化処理されたHBs抗原
に、分子シャペロンを反応させる工程からなる小粒子化
HBs抗原の調製法であって、上記小粒子化処理する工
程と上記反応させる工程とは、同時に行う小粒子化HB
s抗原の調製法である。
還元剤及びタンパク質変性剤からなる群より選択される
少なくとも1種によって、HBs抗原を小粒子化処理す
る工程、並びに、上記小粒子化処理されたHBs抗原
に、分子シャペロンを反応させる工程からなる小粒子化
HBs抗原の調製法であって、上記小粒子化処理する工
程と上記反応させる工程とは、同時に行う小粒子化HB
s抗原の調製法である。
【0012】上記HBs抗原は、タンパク質、糖質及び
脂質から構成され、構成するタンパク質が多くのジスル
フィド結合(−SS−結合)を有していることが知られ
ている。上記HBs抗原を小粒子化処理するためには、
(1)還元剤を用いてジスルフィド結合を開裂させる、
(2)界面活性剤を用いて脂質を除去する、及び/又
は、(3)タンパク質変性剤を用いて高次構造をほぐす
ことが有効であるが、いずれの小粒子化処理方法におい
ても、タンパク質の構造変化が生じ、HBs抗原の抗原
活性が損なわれるが、本発明は、上記小粒子化処理した
HBs抗原に分子シャペロンを反応させることにより、
小粒子化処理したHBs抗原の抗体結合部位の構造変化
を抑制させて、抗原活性を保持した小粒子化HBs抗原
を調製するものである。
脂質から構成され、構成するタンパク質が多くのジスル
フィド結合(−SS−結合)を有していることが知られ
ている。上記HBs抗原を小粒子化処理するためには、
(1)還元剤を用いてジスルフィド結合を開裂させる、
(2)界面活性剤を用いて脂質を除去する、及び/又
は、(3)タンパク質変性剤を用いて高次構造をほぐす
ことが有効であるが、いずれの小粒子化処理方法におい
ても、タンパク質の構造変化が生じ、HBs抗原の抗原
活性が損なわれるが、本発明は、上記小粒子化処理した
HBs抗原に分子シャペロンを反応させることにより、
小粒子化処理したHBs抗原の抗体結合部位の構造変化
を抑制させて、抗原活性を保持した小粒子化HBs抗原
を調製するものである。
【0013】本発明の小粒子化HBs抗原の調製法は、
界面活性剤、還元剤及びタンパク質変性剤からなる群よ
り選択される少なくとも1種によって、HBs抗原を小
粒子化処理する工程を含む。本明細書中において、小粒
子化HBs抗原とは、HBs抗原を、界面活性剤、還元
剤及びタンパク質変性剤からなる群より選択される少な
くとも1種で処理することによって得られる、低分子量
化したHBs抗原を意味する。
界面活性剤、還元剤及びタンパク質変性剤からなる群よ
り選択される少なくとも1種によって、HBs抗原を小
粒子化処理する工程を含む。本明細書中において、小粒
子化HBs抗原とは、HBs抗原を、界面活性剤、還元
剤及びタンパク質変性剤からなる群より選択される少な
くとも1種で処理することによって得られる、低分子量
化したHBs抗原を意味する。
【0014】上記界面活性剤は、脂質を除去可能なもの
であれば特に限定されず、例えば、ドデシル硫酸ナトリ
ウム(SDS)、ドデシルスルホン硫酸ナトリウム、コ
ール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、3−
[(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−1
−プロパンスルホン酸(CHAPS)、オクチルグルコ
シド(OG)、オクチルチオグルコシド、ノナノイル−
N−メチルグルカミド(MEGA−9)、ポリオキシエ
チレンドデシルエーテル(Briji)、ポリオキシエ
チレンi−オクチルフェニルエーテル(Triton
X)、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル(N
onidet P−40)、ポリオキシエチレン脂肪酸
エステル(Span)、ポリオキシエチレンソルビトー
ルエステル(Tween)等が挙げられる。上記界面活
性剤の使用濃度は、処理するHBs抗原濃度によって異
なるが、0.01〜1000mMの範囲であることが好
ましい。
であれば特に限定されず、例えば、ドデシル硫酸ナトリ
ウム(SDS)、ドデシルスルホン硫酸ナトリウム、コ
ール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、3−
[(コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−1
−プロパンスルホン酸(CHAPS)、オクチルグルコ
シド(OG)、オクチルチオグルコシド、ノナノイル−
N−メチルグルカミド(MEGA−9)、ポリオキシエ
チレンドデシルエーテル(Briji)、ポリオキシエ
チレンi−オクチルフェニルエーテル(Triton
X)、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル(N
onidet P−40)、ポリオキシエチレン脂肪酸
エステル(Span)、ポリオキシエチレンソルビトー
ルエステル(Tween)等が挙げられる。上記界面活
性剤の使用濃度は、処理するHBs抗原濃度によって異
なるが、0.01〜1000mMの範囲であることが好
ましい。
【0015】上記還元剤は、タンパク質のジスルフィド
結合を解離させるものであれば特に限定されず、例え
ば、β−メルカプトエタノール、2−メルカプトエチル
アミン、ジチオスレイトール、ジチオエリスルトール、
水素化ホウ素ナトリウム、モノチオリン酸等が挙げられ
る。上記還元剤の使用濃度としては、処理するHBs抗
原の濃度によって異なるが、通常は溶液中の濃度が0.
01〜20%となるように用いることができる。
結合を解離させるものであれば特に限定されず、例え
ば、β−メルカプトエタノール、2−メルカプトエチル
アミン、ジチオスレイトール、ジチオエリスルトール、
水素化ホウ素ナトリウム、モノチオリン酸等が挙げられ
る。上記還元剤の使用濃度としては、処理するHBs抗
原の濃度によって異なるが、通常は溶液中の濃度が0.
01〜20%となるように用いることができる。
【0016】上記タンパク質変性剤は、タンパク質の高
次構造をほぐしポリペプチド側鎖間の水素結合、疎水性
相互作用を解離するものであれば特に限定されず、例え
ば、グアニジン塩酸塩、尿素等が挙げられる。上記タン
パク質変成剤の使用濃度は、処理するHBs抗原濃度に
よって異なるが、0.1〜8Mの範囲が好ましい。上記
還元剤、界面活性剤及びタンパク質変性剤は、それぞれ
単独で用いてもよく、又は、混合して用いてもよい。
次構造をほぐしポリペプチド側鎖間の水素結合、疎水性
相互作用を解離するものであれば特に限定されず、例え
ば、グアニジン塩酸塩、尿素等が挙げられる。上記タン
パク質変成剤の使用濃度は、処理するHBs抗原濃度に
よって異なるが、0.1〜8Mの範囲が好ましい。上記
還元剤、界面活性剤及びタンパク質変性剤は、それぞれ
単独で用いてもよく、又は、混合して用いてもよい。
【0017】本発明の小粒子化HBs抗原の調製法は、
上記小粒子化処理されたHBs抗原に、分子シャペロン
を反応させる工程を含む。本発明は、上記小粒子化処理
されたHBs抗原に分子シャペロンを反応させる工程を
含むことによって、分子シャペロンのタンパク質折り畳
み作用により、小粒子化処理したHBs抗原の立体構造
を安定化させたり、構造変化をすばやく修復させて、抗
原活性を保持した小粒子化HBs抗原を調製するもので
ある。
上記小粒子化処理されたHBs抗原に、分子シャペロン
を反応させる工程を含む。本発明は、上記小粒子化処理
されたHBs抗原に分子シャペロンを反応させる工程を
含むことによって、分子シャペロンのタンパク質折り畳
み作用により、小粒子化処理したHBs抗原の立体構造
を安定化させたり、構造変化をすばやく修復させて、抗
原活性を保持した小粒子化HBs抗原を調製するもので
ある。
【0018】本発明で用いる分子シャペロンは、熱ショ
ックタンパク質の一種であり、細胞が温度変化等の様々
な環境ストレスにさらされた際に生産されるものであ
る。上記分子シャペロンは、原核生物、真核生物を問わ
ず広く存在しており、特に大陽菌から生産される分子シ
ャペロンとして、GroEが良く知られている。
ックタンパク質の一種であり、細胞が温度変化等の様々
な環境ストレスにさらされた際に生産されるものであ
る。上記分子シャペロンは、原核生物、真核生物を問わ
ず広く存在しており、特に大陽菌から生産される分子シ
ャペロンとして、GroEが良く知られている。
【0019】上記GroEは、タンパク質の種類を問わ
ず、ATP存在下、非特異的にタンパク質の立体構造形
成に関与することが明らかにされている。例えば、上記
GroEの構成体であるGroELは、7個のサブユニ
ットが環状に連なったドーナツ型構造が2段に重なっ
た、合計14サブユニットからなる特徴的な構造を有し
ている。GroELはドーナツ構造の凹部に変性タンパ
ク質を捕捉し、ATP等のヌクレオチドの消費と補助因
子であるGroESの結合を伴って、効率的に正しい立
体構造のタンパク質へと折り畳むことが知られている。
ず、ATP存在下、非特異的にタンパク質の立体構造形
成に関与することが明らかにされている。例えば、上記
GroEの構成体であるGroELは、7個のサブユニ
ットが環状に連なったドーナツ型構造が2段に重なっ
た、合計14サブユニットからなる特徴的な構造を有し
ている。GroELはドーナツ構造の凹部に変性タンパ
ク質を捕捉し、ATP等のヌクレオチドの消費と補助因
子であるGroESの結合を伴って、効率的に正しい立
体構造のタンパク質へと折り畳むことが知られている。
【0020】上記分子シャペロンは、真核生物、真正細
菌若しくは古細菌から調製したもの、又は、真核生物、
真正細菌若しくは古細菌から調製したDNAから発現さ
れたものを用いることができる。
菌若しくは古細菌から調製したもの、又は、真核生物、
真正細菌若しくは古細菌から調製したDNAから発現さ
れたものを用いることができる。
【0021】上記真核生物由来の分子シャペロンとして
は特に限定されず、例えば、酵母のSsal−4p、S
sclp、Kar2pBip、Grp78;ほ乳類のh
sc70、HSP58、HSP10、HSP90;カビ
類のHSP60;植物由来のrubisco bind
ing protein等が挙げられる。上記真正細菌
由来の分子シャペロンとしては特に限定されず、例え
ば、大腸菌のGroE、DnaK、SecB等が挙げら
れる。
は特に限定されず、例えば、酵母のSsal−4p、S
sclp、Kar2pBip、Grp78;ほ乳類のh
sc70、HSP58、HSP10、HSP90;カビ
類のHSP60;植物由来のrubisco bind
ing protein等が挙げられる。上記真正細菌
由来の分子シャペロンとしては特に限定されず、例え
ば、大腸菌のGroE、DnaK、SecB等が挙げら
れる。
【0022】上記分子シャペロンとしては、古細菌から
調製したもの、又は、古細菌から調製したDNAから発
現されたものが好ましい。上記古細菌由来の分子シャペ
ロンのうち、HSP60に属する分子シャペロンは、大
陽菌のGroELと同様の作用を有するが、GroES
に相当する補助因子なしで同様の作用を示すことがわか
っている。従って、古細菌由来の分子シャペロンを大量
に得ようとする場合、補助因子の調製の手間が操作が省
ける分、作業性に優れる。
調製したもの、又は、古細菌から調製したDNAから発
現されたものが好ましい。上記古細菌由来の分子シャペ
ロンのうち、HSP60に属する分子シャペロンは、大
陽菌のGroELと同様の作用を有するが、GroES
に相当する補助因子なしで同様の作用を示すことがわか
っている。従って、古細菌由来の分子シャペロンを大量
に得ようとする場合、補助因子の調製の手間が操作が省
ける分、作業性に優れる。
【0023】上記古細菌としては、例えば、スルホロバ
ス(Sulfolobus)属、デスルホロコッカス
(Desulfurococcus)属、ピロディクテ
ィム(Pyrodictium)属、サーモフィラス
(Thermofilum)属、サーモプロテウス(T
hermoproteus)属、ピロバキュラム(Py
robaculm)属、ピロコッカス(Pyrococ
cus)属、メサノバクテリウム(Methanoba
cterium)属、メタノコッカス(Methano
coccus)属、メサノピラス(Methanopy
rus)属、メサノサーマス(Methanother
mus)属、アーキアブロブス(Archaeoglo
bus)属、ハロバクテリウム(Halobacter
ium)属、メサノプラナス(Methanoplan
us)属、メサノスピリラム(Methanospir
illum)属、メサノサルシア(Methanosa
rcina)属由来のものが使用できる。上記古細菌の
中でも、特に、メタノコッカス属古細菌から調製したも
の、又は、メタノコッカス属古細菌から調製したDNA
から発現されたものが好ましい。
ス(Sulfolobus)属、デスルホロコッカス
(Desulfurococcus)属、ピロディクテ
ィム(Pyrodictium)属、サーモフィラス
(Thermofilum)属、サーモプロテウス(T
hermoproteus)属、ピロバキュラム(Py
robaculm)属、ピロコッカス(Pyrococ
cus)属、メサノバクテリウム(Methanoba
cterium)属、メタノコッカス(Methano
coccus)属、メサノピラス(Methanopy
rus)属、メサノサーマス(Methanother
mus)属、アーキアブロブス(Archaeoglo
bus)属、ハロバクテリウム(Halobacter
ium)属、メサノプラナス(Methanoplan
us)属、メサノスピリラム(Methanospir
illum)属、メサノサルシア(Methanosa
rcina)属由来のものが使用できる。上記古細菌の
中でも、特に、メタノコッカス属古細菌から調製したも
の、又は、メタノコッカス属古細菌から調製したDNA
から発現されたものが好ましい。
【0024】上記メタノコッカス属菌とは、海洋性古細
菌のメタン生成菌に属し、水素、二酸化炭素及びギ酸か
らメタンを生成することを特徴とする球状菌群である。
上記メタノコッカス属菌は、大腸菌のように7〜8種類
の分子シャペロンを有しそれぞれが複雑に作用しあうと
いったものでなく、分子シャペロンを1又は2種類しか
有さないため、タンパク質に対する汎用性は高い。
菌のメタン生成菌に属し、水素、二酸化炭素及びギ酸か
らメタンを生成することを特徴とする球状菌群である。
上記メタノコッカス属菌は、大腸菌のように7〜8種類
の分子シャペロンを有しそれぞれが複雑に作用しあうと
いったものでなく、分子シャペロンを1又は2種類しか
有さないため、タンパク質に対する汎用性は高い。
【0025】上記メタノコッカス属菌は、その至適生育
温度から中温菌と高温菌に分類され、高温菌にはメタノ
コッカス・ヤンナシイ(Methanococcus
jannaschii:最適温度85℃)、メタノコッ
カス・サーモリソトロフィカス(Methanococ
uus thermolithotrophicus:
ATCC35097、最適温度65℃)の2種がある。
最適温度が20〜40℃である中温菌には、メタノコッ
カス・ボルタエ(Methanococuusvolt
ae:ATCC33273)、メタノコッカス・デルタ
エ(Methanococuus deltae:AT
CC35294)、メタノコッカス・フリシュス(Me
thanococuus frisius:ATCC4
3340)、メタノコッカス・マリパルディス(Met
hanococuus maripaludis:AT
CC43000)、メタノコッカス・バンニエリ(Me
thanococuus vannielii:ATC
C35089)等が挙げられる。
温度から中温菌と高温菌に分類され、高温菌にはメタノ
コッカス・ヤンナシイ(Methanococcus
jannaschii:最適温度85℃)、メタノコッ
カス・サーモリソトロフィカス(Methanococ
uus thermolithotrophicus:
ATCC35097、最適温度65℃)の2種がある。
最適温度が20〜40℃である中温菌には、メタノコッ
カス・ボルタエ(Methanococuusvolt
ae:ATCC33273)、メタノコッカス・デルタ
エ(Methanococuus deltae:AT
CC35294)、メタノコッカス・フリシュス(Me
thanococuus frisius:ATCC4
3340)、メタノコッカス・マリパルディス(Met
hanococuus maripaludis:AT
CC43000)、メタノコッカス・バンニエリ(Me
thanococuus vannielii:ATC
C35089)等が挙げられる。
【0026】上記メタノコッカス属の中で、メタノコッ
カス・サーモリソトロフィカス(Methanococ
cus themolithotrophicus)か
ら得られた分子シャペロンは、熱安定性に優れており、
90℃及び100℃といった高温条件下で放置しても失
活しにくい。これまで市販されている分子シャペロン
は、65℃でほとんど失活してしまうため高温条件下で
用いることはできなかった。しかしながら、上記メタノ
コッカス・サーモリソトロフィカス(Methanoc
occus themolithotrophicu
s)から得られた分子シャペロンは、37〜65℃とい
った中温だけでなく、80〜90℃といった高温条件下
でも使用可能である。更に、これらの耐熱性分子シャペ
ロンの特徴は、その活性が長期にわたって保存されると
いう点である。
カス・サーモリソトロフィカス(Methanococ
cus themolithotrophicus)か
ら得られた分子シャペロンは、熱安定性に優れており、
90℃及び100℃といった高温条件下で放置しても失
活しにくい。これまで市販されている分子シャペロン
は、65℃でほとんど失活してしまうため高温条件下で
用いることはできなかった。しかしながら、上記メタノ
コッカス・サーモリソトロフィカス(Methanoc
occus themolithotrophicu
s)から得られた分子シャペロンは、37〜65℃とい
った中温だけでなく、80〜90℃といった高温条件下
でも使用可能である。更に、これらの耐熱性分子シャペ
ロンの特徴は、その活性が長期にわたって保存されると
いう点である。
【0027】上記メタノコッカス属の中温菌の中で、特
に、メタノコッカス・ボルタエ(Methanococ
cus voltae)から得られる分子シャペロン
は、4〜40℃の広い範囲でHBs抗原を安定化する効
果がある。
に、メタノコッカス・ボルタエ(Methanococ
cus voltae)から得られる分子シャペロン
は、4〜40℃の広い範囲でHBs抗原を安定化する効
果がある。
【0028】本発明で用いられる分子シャペロンは、上
記メタノコッカス属細菌から直接精製して得ることもで
きるが、これらの生物の分子シャペロンをコードするD
NA塩基配列をクローニングし、大腸菌や酵母等の生育
の速い生物に組み込んで調製することが、大量に生産で
きるので好ましい。具体的な手法としては、「新生物化
学実験の手引き」(化学同人社)等に記載された遺伝子
実験プロトコール等の常法を応用することで充分であ
る。
記メタノコッカス属細菌から直接精製して得ることもで
きるが、これらの生物の分子シャペロンをコードするD
NA塩基配列をクローニングし、大腸菌や酵母等の生育
の速い生物に組み込んで調製することが、大量に生産で
きるので好ましい。具体的な手法としては、「新生物化
学実験の手引き」(化学同人社)等に記載された遺伝子
実験プロトコール等の常法を応用することで充分であ
る。
【0029】上記分子シャペロンを真核生物、真正細菌
又は古細菌から直接調製する方法としては、真核生物、
真正細菌又は古細菌を適当な培地及び培養条件下で培養
し、培養した菌体を破砕後、イオン交換クロマトグラフ
ィー、疎水クロマトグラフィー等の従来公知の精製方法
によって得る方法が挙げられる。
又は古細菌から直接調製する方法としては、真核生物、
真正細菌又は古細菌を適当な培地及び培養条件下で培養
し、培養した菌体を破砕後、イオン交換クロマトグラフ
ィー、疎水クロマトグラフィー等の従来公知の精製方法
によって得る方法が挙げられる。
【0030】上記分子シャペロンの確認方法としては、
分子シャペロンはATPアーゼ活性を有するので、La
nzetta P.A著、Anal.Biochem、
100号、95〜97頁記載のATPアーゼ活性測定法
を用いることにより行うことができる。
分子シャペロンはATPアーゼ活性を有するので、La
nzetta P.A著、Anal.Biochem、
100号、95〜97頁記載のATPアーゼ活性測定法
を用いることにより行うことができる。
【0031】上記DNA塩基配列としては、例えば、メ
タノコッカス・サーモリソトロフィカス(Methan
ococcus thermolithotrophi
cus)由来シャペロニンについては、配列表の配列番
号4として記載した。
タノコッカス・サーモリソトロフィカス(Methan
ococcus thermolithotrophi
cus)由来シャペロニンについては、配列表の配列番
号4として記載した。
【0032】具体的には、上記古細菌としてメタノコッ
カス・サーモリソトロフィカス(Methanococ
cus thermolithotrophicus)
を用いて、このシャペロニンを得る方法としては次の方
法が採用できる。即ち、工業技術院生命工学工業技術研
究所に寄託番号FERM P―16438として寄託さ
れているプラスミドpETTSIは、メタノコッカス・
サーモリソトロフィカスのシャペロニンをコードする遺
伝子を含むプラスミドであるが、これを鋳型とし、適当
な制限酵素サイトを含むプライマーを用い、常法に従っ
てPCR法によって増幅させる。PCR産物から得られ
る遺伝子の断片を、耐性マーカーを含むプラスミドに挿
入し、組み換えプラスミドで大腸菌や酵母等を形質転換
する。この形質転換体を培養し、培養菌体を破砕後、イ
オン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー
等の従来公知の精製方法によって、メタノコッカス・サ
ーモリソトロフィカスのシャペロニンを得ることができ
る。
カス・サーモリソトロフィカス(Methanococ
cus thermolithotrophicus)
を用いて、このシャペロニンを得る方法としては次の方
法が採用できる。即ち、工業技術院生命工学工業技術研
究所に寄託番号FERM P―16438として寄託さ
れているプラスミドpETTSIは、メタノコッカス・
サーモリソトロフィカスのシャペロニンをコードする遺
伝子を含むプラスミドであるが、これを鋳型とし、適当
な制限酵素サイトを含むプライマーを用い、常法に従っ
てPCR法によって増幅させる。PCR産物から得られ
る遺伝子の断片を、耐性マーカーを含むプラスミドに挿
入し、組み換えプラスミドで大腸菌や酵母等を形質転換
する。この形質転換体を培養し、培養菌体を破砕後、イ
オン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー
等の従来公知の精製方法によって、メタノコッカス・サ
ーモリソトロフィカスのシャペロニンを得ることができ
る。
【0033】上記分子シャペロンは、サブユニット14
〜16個がドーナツ型2段構造を形成したオリゴマーと
して反応を起こす。即ち、オリゴマー体に変性タンパク
質が結合して折り畳み反応の結果、タンパク質が正常な
構造に戻り、その後オリゴマー体分子シャペロンから遊
離する。
〜16個がドーナツ型2段構造を形成したオリゴマーと
して反応を起こす。即ち、オリゴマー体に変性タンパク
質が結合して折り畳み反応の結果、タンパク質が正常な
構造に戻り、その後オリゴマー体分子シャペロンから遊
離する。
【0034】上記オリゴマー構造体を形成、維持させた
り、活性を発現させるには、通常、溶液中に塩化マグネ
シウム及びATP(アデノシン三リン酸)、並びに、硫
酸アンモニウム及び塩化カリウムが必要である。特に、
ATPは、分子シャペロンとタンパク質が解離する際に
不可欠な因子である。
り、活性を発現させるには、通常、溶液中に塩化マグネ
シウム及びATP(アデノシン三リン酸)、並びに、硫
酸アンモニウム及び塩化カリウムが必要である。特に、
ATPは、分子シャペロンとタンパク質が解離する際に
不可欠な因子である。
【0035】上記塩化マグネシウム及びATP並びに硫
酸アンモニウム及び塩化カリウムの反応液中における濃
度としては特に限定されず、例えば、塩化マグネシウム
は10〜200mM、硫酸アンモニウム及び塩化カリウ
ムは100〜500mM、ATPは0.5〜10mMの
範囲が好ましい。
酸アンモニウム及び塩化カリウムの反応液中における濃
度としては特に限定されず、例えば、塩化マグネシウム
は10〜200mM、硫酸アンモニウム及び塩化カリウ
ムは100〜500mM、ATPは0.5〜10mMの
範囲が好ましい。
【0036】本発明の小粒子化HBs抗原の調製法にお
いて、HBs抗原を小粒子化処理する工程と、上記小粒
子化処理されたHBs抗原に分子シャペロンを反応させ
る工程とは、同時に行う。
いて、HBs抗原を小粒子化処理する工程と、上記小粒
子化処理されたHBs抗原に分子シャペロンを反応させ
る工程とは、同時に行う。
【0037】上記小粒子化処理する工程と上記反応させ
る工程とを同時に行う方法としては特に限定されず、例
えば、HBs抗原を希釈した溶液(以下、「HBs抗原
希釈液」ともいう)、並びに、還元剤、界面活性剤及び
タンパク質変性剤からなる群より選択される少なくとも
1種の処理剤を溶解した溶液(以下、「小粒子化用液」
ともいう)を混合した液に、分子シャペロンを添加して
反応させることができる。上記方法によって、抗原活性
を有した小粒子化HBs抗原を得ることができる。
る工程とを同時に行う方法としては特に限定されず、例
えば、HBs抗原を希釈した溶液(以下、「HBs抗原
希釈液」ともいう)、並びに、還元剤、界面活性剤及び
タンパク質変性剤からなる群より選択される少なくとも
1種の処理剤を溶解した溶液(以下、「小粒子化用液」
ともいう)を混合した液に、分子シャペロンを添加して
反応させることができる。上記方法によって、抗原活性
を有した小粒子化HBs抗原を得ることができる。
【0038】上記分子シャペロンの使用濃度としては、
モル比で、HBs抗原の0.01〜200倍、好ましく
は1〜20倍程度である。上記HBs抗原の処理濃度と
しては特に限定されず、0.001〜10mg/mLが
通常用いられる。上記反応温度及び時間としては特に限
定されず、例えば、4〜60℃、30分〜48時間の範
囲等が挙げられる。
モル比で、HBs抗原の0.01〜200倍、好ましく
は1〜20倍程度である。上記HBs抗原の処理濃度と
しては特に限定されず、0.001〜10mg/mLが
通常用いられる。上記反応温度及び時間としては特に限
定されず、例えば、4〜60℃、30分〜48時間の範
囲等が挙げられる。
【0039】上記HBs抗原を予め希釈しておく希釈液
としては特に限定されず、例えば、リン酸緩衝液、トリ
ス緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、トリス塩酸
緩衝液等が挙げられる。上記希釈液のイオン強度として
は、HBs抗原を希釈するのに好適なものであれば特に
限定されないが、NaClを0.05〜1Mとなるよう
にしたものが好ましい。上記希釈液のpHは特に限定さ
れないが、4.5〜9.0の範囲が好ましい。
としては特に限定されず、例えば、リン酸緩衝液、トリ
ス緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、トリス塩酸
緩衝液等が挙げられる。上記希釈液のイオン強度として
は、HBs抗原を希釈するのに好適なものであれば特に
限定されないが、NaClを0.05〜1Mとなるよう
にしたものが好ましい。上記希釈液のpHは特に限定さ
れないが、4.5〜9.0の範囲が好ましい。
【0040】上記還元剤、界面活性剤及びタンパク質変
性剤からなる群より選択される少なくとも1種の処理剤
を溶解させておく緩衝液としては特に限定されず、上記
HBs抗原の希釈液で例示したもの等が挙げられる。
性剤からなる群より選択される少なくとも1種の処理剤
を溶解させておく緩衝液としては特に限定されず、上記
HBs抗原の希釈液で例示したもの等が挙げられる。
【0041】本発明2は、界面活性剤、還元剤及びタン
パク質変性剤からなる群より選択される少なくとも1種
によって、HBs抗原を小粒子化処理する工程、並び
に、上記小粒子化処理されたHBs抗原に、分子シャペ
ロンを反応させる工程からなる小粒子化HBs抗原の調
製法であって、上記反応させる工程は、上記小粒子化処
理する工程を行った後に行う小粒子化HBs抗原の調製
法である。
パク質変性剤からなる群より選択される少なくとも1種
によって、HBs抗原を小粒子化処理する工程、並び
に、上記小粒子化処理されたHBs抗原に、分子シャペ
ロンを反応させる工程からなる小粒子化HBs抗原の調
製法であって、上記反応させる工程は、上記小粒子化処
理する工程を行った後に行う小粒子化HBs抗原の調製
法である。
【0042】本発明2は、小粒子化処理する工程を行っ
た後に、小粒子化処理されたHBs抗原に分子シャペロ
ンを反応させる工程を行うことによって、分子シャペロ
ンのタンパク質折り畳み作用により、HBs抗原中の変
化した抗体結合部位の構造の再構成を行わせしめ、抗原
活性を保持した小粒子化HBs抗原を調製するものであ
る。
た後に、小粒子化処理されたHBs抗原に分子シャペロ
ンを反応させる工程を行うことによって、分子シャペロ
ンのタンパク質折り畳み作用により、HBs抗原中の変
化した抗体結合部位の構造の再構成を行わせしめ、抗原
活性を保持した小粒子化HBs抗原を調製するものであ
る。
【0043】本発明2の小粒子化HBs抗原の調製法に
おいて、小粒子化処理する工程を行った後、反応させる
工程を行う方法としては特に限定されず、例えば、HB
s抗原希釈液と小粒子化用液を混合、反応させた後、分
子シャペロンを添加する方法等が挙げられる。上記小粒
子化処理の温度及び時間としては、例えば、10〜60
℃、1〜10時間の範囲等が挙げられる。上記分子シャ
ペロンの反応における温度及び時間としては特に限定さ
れず、例えば、4〜50℃、30分〜48時間の範囲等
が挙げられる。
おいて、小粒子化処理する工程を行った後、反応させる
工程を行う方法としては特に限定されず、例えば、HB
s抗原希釈液と小粒子化用液を混合、反応させた後、分
子シャペロンを添加する方法等が挙げられる。上記小粒
子化処理の温度及び時間としては、例えば、10〜60
℃、1〜10時間の範囲等が挙げられる。上記分子シャ
ペロンの反応における温度及び時間としては特に限定さ
れず、例えば、4〜50℃、30分〜48時間の範囲等
が挙げられる。
【0044】本発明1及び本発明2において、上記分子
シャペロンは、溶液状態だけではなく、不溶性担体に固
定化してバイオリアクターとして用いることができる。
上記不溶性担体としては、通常の酵素固定化用担体であ
れば特に限定されず、例えば、セルロース、アガロー
ス、デキストラン、キチン、コラーゲン、アミノ酸ポリ
マー、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、イオン交換
樹脂、ビニルポリマー、ガラスビーズ、セラミック、光
架橋性樹脂、ポリウレタン等が挙げられる。上記不溶性
担体としては、また、セルロースやアガロースを臭化シ
アンで活性化した担体や、ビニルポリマーに官能基を導
入した担体が、タンパク質の結合用担体として市販され
ており、それらを用いることもできる。
シャペロンは、溶液状態だけではなく、不溶性担体に固
定化してバイオリアクターとして用いることができる。
上記不溶性担体としては、通常の酵素固定化用担体であ
れば特に限定されず、例えば、セルロース、アガロー
ス、デキストラン、キチン、コラーゲン、アミノ酸ポリ
マー、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、イオン交換
樹脂、ビニルポリマー、ガラスビーズ、セラミック、光
架橋性樹脂、ポリウレタン等が挙げられる。上記不溶性
担体としては、また、セルロースやアガロースを臭化シ
アンで活性化した担体や、ビニルポリマーに官能基を導
入した担体が、タンパク質の結合用担体として市販され
ており、それらを用いることもできる。
【0045】上記分子シャペロンと不溶性担体との結合
法は、タンパク質の固定等に用いられているものであれ
ば特に限定されず、例えば、共有結合法、物理的吸着
法、イオン結合法、架橋法、包括格子型法、マイクロカ
プセル格子型法等が挙げられる。上記分子シャペロン
は、ヒスチジン6残基又はグルタチオントランスフェラ
ーゼ(GST)等の融合タンパク質として発現させれ
ば、市販のアフィニティ担体との結合を行うことができ
るため、容易に分子シャペロン結合担体を得ることがで
きる。上記分子シャペロンの不溶性担体への吸着量は特
に限定されないが、担体1cm 3 当たりタンパク量とし
て0.1〜1000mgが望ましい。
法は、タンパク質の固定等に用いられているものであれ
ば特に限定されず、例えば、共有結合法、物理的吸着
法、イオン結合法、架橋法、包括格子型法、マイクロカ
プセル格子型法等が挙げられる。上記分子シャペロン
は、ヒスチジン6残基又はグルタチオントランスフェラ
ーゼ(GST)等の融合タンパク質として発現させれ
ば、市販のアフィニティ担体との結合を行うことができ
るため、容易に分子シャペロン結合担体を得ることがで
きる。上記分子シャペロンの不溶性担体への吸着量は特
に限定されないが、担体1cm 3 当たりタンパク量とし
て0.1〜1000mgが望ましい。
【0046】上記分子シャペロン結合担体を用いたHB
s小粒子化抗原への作用方法としては特に限定されず、
例えば、分子シャペロン結合担体を塩化マグネシウム及
びATP並びに塩化カリウム及び硫酸アンモニウムを適
当量溶解させた緩衝液に懸濁させた後、 (1)分子シャペロン結合担体懸濁液、HBs抗原希釈
液及び小粒子化処理用液を混合、反応させた後に、遠心
分離操作等により分子シャペロン結合担体を沈殿させ
て、上清に含まれる小粒子化HBs抗原を回収する方
法、又は、分子シャペロン結合担体と小粒子化操作終了
後のHBs抗原希釈液−小粒子化処理用液混合液を混
合、反応させた後に、上記と同様にして小粒子化HBs
抗原を回収する方法、
s小粒子化抗原への作用方法としては特に限定されず、
例えば、分子シャペロン結合担体を塩化マグネシウム及
びATP並びに塩化カリウム及び硫酸アンモニウムを適
当量溶解させた緩衝液に懸濁させた後、 (1)分子シャペロン結合担体懸濁液、HBs抗原希釈
液及び小粒子化処理用液を混合、反応させた後に、遠心
分離操作等により分子シャペロン結合担体を沈殿させ
て、上清に含まれる小粒子化HBs抗原を回収する方
法、又は、分子シャペロン結合担体と小粒子化操作終了
後のHBs抗原希釈液−小粒子化処理用液混合液を混
合、反応させた後に、上記と同様にして小粒子化HBs
抗原を回収する方法、
【0047】(2)分子シャペロン結合担体懸濁液をカ
ラムに充填し、これにHBs抗原希釈液及び小粒子化処
理用液を展開、反応させた後に溶出される小粒子化HB
s抗原を回収する方法、又は、分子シャペロン結合担体
をカラムに充填し、これに小粒子化操作終了後のHBs
抗原希釈液−小粒子化処理用液混合液を展開・反応させ
た後に溶出される小粒子化HBs抗原を回収する方法、
ラムに充填し、これにHBs抗原希釈液及び小粒子化処
理用液を展開、反応させた後に溶出される小粒子化HB
s抗原を回収する方法、又は、分子シャペロン結合担体
をカラムに充填し、これに小粒子化操作終了後のHBs
抗原希釈液−小粒子化処理用液混合液を展開・反応させ
た後に溶出される小粒子化HBs抗原を回収する方法、
【0048】(3)分子シャペロン結合膜とHBs抗原
希釈液及び小粒子化処理用液を混合、反応させて小粒子
化HBs抗原を回収する方法、又は、分子シャペロン結
合膜と小粒子化処理操作終了後のHBs抗原希釈液−小
粒子化処理用液混合液を混合、反応させて小粒子化HB
s抗原を回収する方法等が挙げられる。上記分子シャペ
ロン固定化担体は繰り返し使用が可能である。
希釈液及び小粒子化処理用液を混合、反応させて小粒子
化HBs抗原を回収する方法、又は、分子シャペロン結
合膜と小粒子化処理操作終了後のHBs抗原希釈液−小
粒子化処理用液混合液を混合、反応させて小粒子化HB
s抗原を回収する方法等が挙げられる。上記分子シャペ
ロン固定化担体は繰り返し使用が可能である。
【0049】本発明1及び本発明2の小粒子化HBs抗
原の調製法により得られた小粒子化HBs抗原は、酵素
標識することによって、免疫測定試薬を製造することが
できる。
原の調製法により得られた小粒子化HBs抗原は、酵素
標識することによって、免疫測定試薬を製造することが
できる。
【0050】上記酵素標識の方法としては、二架性架橋
剤を用いた直接架橋法、及び、ビオチン−アビジン架橋
法を用いた標識アビジン−ビオチン法が挙げられる。上
記直接架橋法としては、二架性架橋剤を精製水又はジメ
チルスルホキサイド(DMSO)に溶解し、小粒子化H
Bs抗原を緩衝液を用いて適当量希釈した液に、モル比
で5〜100倍程度になるように添加し、一定温度で1
〜24時間程度インキュベーションする。この反応液
を、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーを行い、未反応
の二架性架橋剤を除去して、官能基を導入した標識HB
s抗原を得ることができる。
剤を用いた直接架橋法、及び、ビオチン−アビジン架橋
法を用いた標識アビジン−ビオチン法が挙げられる。上
記直接架橋法としては、二架性架橋剤を精製水又はジメ
チルスルホキサイド(DMSO)に溶解し、小粒子化H
Bs抗原を緩衝液を用いて適当量希釈した液に、モル比
で5〜100倍程度になるように添加し、一定温度で1
〜24時間程度インキュベーションする。この反応液
を、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーを行い、未反応
の二架性架橋剤を除去して、官能基を導入した標識HB
s抗原を得ることができる。
【0051】次いで、上記官能基を導入した標識HBs
抗原に、酵素を適当量溶解した液を添加して反応を行
い、酵素標識HBs抗原液を調製することができる。反
応終了後に、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーを行
い、未反応酵素や未反応HBs抗原を除去して、酵素標
識HBs抗原を回収することができる。
抗原に、酵素を適当量溶解した液を添加して反応を行
い、酵素標識HBs抗原液を調製することができる。反
応終了後に、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーを行
い、未反応酵素や未反応HBs抗原を除去して、酵素標
識HBs抗原を回収することができる。
【0052】上記二架性架橋剤としては、ホモ架橋剤及
びヘテロ架橋剤が挙げられる。上記ホモ架橋剤として
は、例えば、エチレングリコール−o,o−ビススクシ
ニミジルサクシナト、4,4′−ジチオビス1−アザイ
ドベンゼン等が挙げられる。上記ヘテロ架橋剤として
は、例えば、スクシニニミジル トランス4−N−マレ
イミジルメチルシクロヘキサン−1−カルボキシレイト
(SMCC)、N−4−マレイミドブチリロキシイスク
シニミド(GMBS)、N−6−マレイミドカプロイロ
キッシスクシニミド(EMCS)、及び、それらのスル
ホン化試薬等が挙げられる。
びヘテロ架橋剤が挙げられる。上記ホモ架橋剤として
は、例えば、エチレングリコール−o,o−ビススクシ
ニミジルサクシナト、4,4′−ジチオビス1−アザイ
ドベンゼン等が挙げられる。上記ヘテロ架橋剤として
は、例えば、スクシニニミジル トランス4−N−マレ
イミジルメチルシクロヘキサン−1−カルボキシレイト
(SMCC)、N−4−マレイミドブチリロキシイスク
シニミド(GMBS)、N−6−マレイミドカプロイロ
キッシスクシニミド(EMCS)、及び、それらのスル
ホン化試薬等が挙げられる。
【0053】上記酵素標識に用いる酵素としては特に限
定されず、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ(以下
POD)、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシ
ダーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ等の
通常EIAに用いられる酵素が好適である。
定されず、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ(以下
POD)、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシ
ダーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ等の
通常EIAに用いられる酵素が好適である。
【0054】上記二架性架橋剤を用いる場合、上記酵素
標識に用いる酵素がアミノ基とチオール基の両方を有す
る場合とアミノ基だけを有する場合があるので、架橋剤
との組み合わせに留意する。例えば、上記酵素標識に用
いる酵素がPODの場合アミノ基のみを有するのでヘテ
ロ架橋剤を用い、上記酵素標識に用いる酵素がβ−ガラ
クトシダーゼの場合はアミノ基とチオール基の両方を有
しているので、ヘテロ、ホモ架橋剤のいずれも用いるこ
とができる。
標識に用いる酵素がアミノ基とチオール基の両方を有す
る場合とアミノ基だけを有する場合があるので、架橋剤
との組み合わせに留意する。例えば、上記酵素標識に用
いる酵素がPODの場合アミノ基のみを有するのでヘテ
ロ架橋剤を用い、上記酵素標識に用いる酵素がβ−ガラ
クトシダーゼの場合はアミノ基とチオール基の両方を有
しているので、ヘテロ、ホモ架橋剤のいずれも用いるこ
とができる。
【0055】上記標識アビジン−ビオチン法では、小粒
子化HBs抗原を好適な緩衝液を用いて適当量希釈した
HBs抗原液に、ビオチン試薬を精製水又はDMSOに
溶解した液を、モル比でHBs抗原の10〜100倍程
度になるように添加し、25℃付近で4〜18時間程度
インキュベーションする。この液を、ゲル濾過カラムク
ロマトグラフィーを用いて、遊離のビオチン試薬を除去
し、ビオチン標識HBs抗原を得ることができる。
子化HBs抗原を好適な緩衝液を用いて適当量希釈した
HBs抗原液に、ビオチン試薬を精製水又はDMSOに
溶解した液を、モル比でHBs抗原の10〜100倍程
度になるように添加し、25℃付近で4〜18時間程度
インキュベーションする。この液を、ゲル濾過カラムク
ロマトグラフィーを用いて、遊離のビオチン試薬を除去
し、ビオチン標識HBs抗原を得ることができる。
【0056】次いで、上記調製したビオチン標識HBs
抗原とアビジン/ストレプトアビジン標識酵素とを、3
7℃で30分〜2時間程度反応させた後、ゲル濾過カラ
ムクロマトグラフィーにより、未標識のビオチン標識H
Bs抗原とアビジン/ストレプトアビジンを除去して、
酵素標識HBs抗原を回収することができる。
抗原とアビジン/ストレプトアビジン標識酵素とを、3
7℃で30分〜2時間程度反応させた後、ゲル濾過カラ
ムクロマトグラフィーにより、未標識のビオチン標識H
Bs抗原とアビジン/ストレプトアビジンを除去して、
酵素標識HBs抗原を回収することができる。
【0057】上記小粒子化HBs抗原をビオチン化する
ビオチン化試薬には、N−スクシニミジル D−ビオチ
ン、スルホスクシニミジル D−ビオチン、スルホスク
シニミジルN−N−D−ビオチニル−6−アミノヘキサ
ノイル−6−アミノヘキサネイト等のリジン残基のε−
アミノ基等の遊離のアミノ基と結合する活性エステルタ
イプ;N′−[2−N−マレイミドエチル−N−ピペラ
ジリル D−ビオチナミド ハイドロクロライド、6−
N−2−Nマレイミドエチル−N−ピペラジニルアミド
ヘキシ D−ビオチナミド ハイドロクロライド等の
システイン残基等のチオール基と結合するマレイミドタ
イプが挙げられる。
ビオチン化試薬には、N−スクシニミジル D−ビオチ
ン、スルホスクシニミジル D−ビオチン、スルホスク
シニミジルN−N−D−ビオチニル−6−アミノヘキサ
ノイル−6−アミノヘキサネイト等のリジン残基のε−
アミノ基等の遊離のアミノ基と結合する活性エステルタ
イプ;N′−[2−N−マレイミドエチル−N−ピペラ
ジリル D−ビオチナミド ハイドロクロライド、6−
N−2−Nマレイミドエチル−N−ピペラジニルアミド
ヘキシ D−ビオチナミド ハイドロクロライド等の
システイン残基等のチオール基と結合するマレイミドタ
イプが挙げられる。
【0058】上記標識に用いる酵素としては、上記直接
架橋法で例示したもの等が挙げられる。上記アビジン/
ストレプトアビジン標識酵素は、上記酵素をアビジン/
ストレプトアビジンで標識したものを調製することもで
きるが、アビジン/ストレプトアビジン標識酵素は市販
されており入手が容易であるのでこれらを用いてもよ
い。
架橋法で例示したもの等が挙げられる。上記アビジン/
ストレプトアビジン標識酵素は、上記酵素をアビジン/
ストレプトアビジンで標識したものを調製することもで
きるが、アビジン/ストレプトアビジン標識酵素は市販
されており入手が容易であるのでこれらを用いてもよ
い。
【0059】本発明1及び本発明2の小粒子化HBs抗
原の調製法により得られた小粒子化HBs抗原は、ま
た、不溶性担体に担持させることによって、免疫測定試
薬を製造することができる。
原の調製法により得られた小粒子化HBs抗原は、ま
た、不溶性担体に担持させることによって、免疫測定試
薬を製造することができる。
【0060】上記不溶性担体としては、疎水性の表面を
有する不活性担体、及び、部分的に疎水性表面を有する
不活性担体が挙げられ、例えば、ラテックス、プラスチ
ックビーズ、プラスチックプレート等の合成高分子化合
物からなるもの;シリカ等の無機材料からなるもの;タ
ンニン酸処理した赤血球;ニトロセルロース等の高分子
膜等が挙げられる。
有する不活性担体、及び、部分的に疎水性表面を有する
不活性担体が挙げられ、例えば、ラテックス、プラスチ
ックビーズ、プラスチックプレート等の合成高分子化合
物からなるもの;シリカ等の無機材料からなるもの;タ
ンニン酸処理した赤血球;ニトロセルロース等の高分子
膜等が挙げられる。
【0061】上記不溶性担体の表面には、化学結合を目
的とする種々の官能基が存在してもよく、また、アビジ
ン−ビオチン等の親和性を利用して物質を固定化するた
めのスペーサー等を有していてもよい。
的とする種々の官能基が存在してもよく、また、アビジ
ン−ビオチン等の親和性を利用して物質を固定化するた
めのスペーサー等を有していてもよい。
【0062】上記不溶性担体として、工業的に安定した
品質で大量生産しうるラテックス;プラスチックビー
ズ、プラスチックプレート等のプラスチック成型品が好
ましい。特に、検査の全自動化処理による検査時間の短
縮及び省力化が可能なこと等から、ラテックスがより好
ましい。上記ラテックスとしては、ポリスチレン系、合
成ゴム系等特に限定されないが、好ましくはポリスチレ
ン系のものである。上記ラテックスの平均粒径は0.0
5μm〜2.0μmのものが好ましく、より好ましく
は、0.1μm〜0.5μmのものである。
品質で大量生産しうるラテックス;プラスチックビー
ズ、プラスチックプレート等のプラスチック成型品が好
ましい。特に、検査の全自動化処理による検査時間の短
縮及び省力化が可能なこと等から、ラテックスがより好
ましい。上記ラテックスとしては、ポリスチレン系、合
成ゴム系等特に限定されないが、好ましくはポリスチレ
ン系のものである。上記ラテックスの平均粒径は0.0
5μm〜2.0μmのものが好ましく、より好ましく
は、0.1μm〜0.5μmのものである。
【0063】上記不溶性担体への担持方法としては、例
えば、本発明1又は本発明2によって得られた小粒子化
HBs抗原を好適な緩衝液で希釈し、これをHBs抗原
液とする。上記HBs抗原液と上記不溶性担体とを、p
H4.5〜9.0の水性媒体中で接触させ、所定時間イ
ンキュベートすることによりHBs抗原を担体に固定化
することができる。上記小粒子化HBs抗原を担持させ
た不溶性担体を保存する液、及び、抗原抗体反応の反応
液として使用する水性媒体としては特に限定されず、例
えば、上記小粒子化HBs抗原の調製法においてHBs
抗原の希釈緩衝液としては例示したもの等の一般に用い
られている緩衝液が好ましい。
えば、本発明1又は本発明2によって得られた小粒子化
HBs抗原を好適な緩衝液で希釈し、これをHBs抗原
液とする。上記HBs抗原液と上記不溶性担体とを、p
H4.5〜9.0の水性媒体中で接触させ、所定時間イ
ンキュベートすることによりHBs抗原を担体に固定化
することができる。上記小粒子化HBs抗原を担持させ
た不溶性担体を保存する液、及び、抗原抗体反応の反応
液として使用する水性媒体としては特に限定されず、例
えば、上記小粒子化HBs抗原の調製法においてHBs
抗原の希釈緩衝液としては例示したもの等の一般に用い
られている緩衝液が好ましい。
【0064】上記酵素標識した小粒子化HBs抗原、及
び、上記不溶性担体に担持させた小粒子化HBs抗原
は、免疫測定試薬として使用した場合、高感度な免疫測
定法を行うことができる。例えば、ワンステップサンド
イッチ法によるEIAに使用する場合には、上記小粒子
化HBs抗原を担持した不溶性担体に、検体及び上記酵
素標識した小粒子化HBs抗原を加え、一定時間免疫反
応させる。洗浄後、酵素発色基質を加え、酵素反応によ
り生じる生成物を検出し、同時に処理したHBs抗体濃
度既知の標準溶液から得られる標準曲線と比較すること
によって、検体中のHBs抗体の量を測定することがで
きる。また、上記不溶性担体に担持させた小粒子化HB
s抗原は、ラテックス凝集法や血球凝集法等による免疫
測定方法にも好適に使用することができ、その操作方法
としては、例えば、上記不溶性担体に担持させた小粒子
化HBs抗原と検体とを混合して、免疫凝集反応後、こ
の凝集を検出することにより、検体中のHBs抗体の量
を測定することができる。
び、上記不溶性担体に担持させた小粒子化HBs抗原
は、免疫測定試薬として使用した場合、高感度な免疫測
定法を行うことができる。例えば、ワンステップサンド
イッチ法によるEIAに使用する場合には、上記小粒子
化HBs抗原を担持した不溶性担体に、検体及び上記酵
素標識した小粒子化HBs抗原を加え、一定時間免疫反
応させる。洗浄後、酵素発色基質を加え、酵素反応によ
り生じる生成物を検出し、同時に処理したHBs抗体濃
度既知の標準溶液から得られる標準曲線と比較すること
によって、検体中のHBs抗体の量を測定することがで
きる。また、上記不溶性担体に担持させた小粒子化HB
s抗原は、ラテックス凝集法や血球凝集法等による免疫
測定方法にも好適に使用することができ、その操作方法
としては、例えば、上記不溶性担体に担持させた小粒子
化HBs抗原と検体とを混合して、免疫凝集反応後、こ
の凝集を検出することにより、検体中のHBs抗体の量
を測定することができる。
【0065】
【実施例】以下に本発明の実施例を掲げて更に詳しく説
明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものでは
ない。参考例1に、メタノコッカス属古細菌由来分子シ
ャペロンの調製方法の一例を記載したがこれに限定され
るものではなく、他の分子シャペロンも同様の方法にて
調製することができる。
明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものでは
ない。参考例1に、メタノコッカス属古細菌由来分子シ
ャペロンの調製方法の一例を記載したがこれに限定され
るものではなく、他の分子シャペロンも同様の方法にて
調製することができる。
【0066】参考例1では、メタノコッカス・サーモリ
ソトロフィカス由来分子シャペロンの遺伝子組み換え技
術による調製法を記載した。参考例2では、同分子シャ
ペロンの固定化担体の調製法を記載した。実施例1〜4
では、分子シャペロンを用いた小粒子化HBs抗原の調
製方法を記載した(実施例1〜3では、メタノコッカス
・サーモリソトロフィカス由来の分子シャペロン、実施
例4ではメタノコッカス・ボルタエ由来の分子シャペロ
ンを使用した)。実施例5及び6では、実施例1及び2
で調製した小粒子化HBs抗原を用いた酵素標識抗原の
調製、及び、それを用いた免疫測定方法を記載した。比
較例1では、小粒子化処理していない精製HBs抗原
を、比較例2では、分子シャペロンを用いないで調製し
た小粒子化HBs抗原を、それぞれ用いて実施例5と同
様の酵素標識抗原の調製、及び、それを用いた免疫測定
方法を記載した。実施例7及び8では、実施例3及び4
で調製した小粒子化HBs抗原を用いたラテックス試薬
の調製、及び、それを用いた免疫測定方法を記載した。
比較例3では、小粒子化処理していない精製HBs抗原
を、比較例4では分子シャペロンを用いないで調製した
小粒子化HBs抗原を、それぞれ用いて実施例7と同様
のラテックス試薬の調製、及び、それを用いた免疫測定
方法を記載した。
ソトロフィカス由来分子シャペロンの遺伝子組み換え技
術による調製法を記載した。参考例2では、同分子シャ
ペロンの固定化担体の調製法を記載した。実施例1〜4
では、分子シャペロンを用いた小粒子化HBs抗原の調
製方法を記載した(実施例1〜3では、メタノコッカス
・サーモリソトロフィカス由来の分子シャペロン、実施
例4ではメタノコッカス・ボルタエ由来の分子シャペロ
ンを使用した)。実施例5及び6では、実施例1及び2
で調製した小粒子化HBs抗原を用いた酵素標識抗原の
調製、及び、それを用いた免疫測定方法を記載した。比
較例1では、小粒子化処理していない精製HBs抗原
を、比較例2では、分子シャペロンを用いないで調製し
た小粒子化HBs抗原を、それぞれ用いて実施例5と同
様の酵素標識抗原の調製、及び、それを用いた免疫測定
方法を記載した。実施例7及び8では、実施例3及び4
で調製した小粒子化HBs抗原を用いたラテックス試薬
の調製、及び、それを用いた免疫測定方法を記載した。
比較例3では、小粒子化処理していない精製HBs抗原
を、比較例4では分子シャペロンを用いないで調製した
小粒子化HBs抗原を、それぞれ用いて実施例7と同様
のラテックス試薬の調製、及び、それを用いた免疫測定
方法を記載した。
【0067】参考例1 分子シャペロン(メタノコッカ
ス・サーモリソトロフィカス由来)の調製 (1)発現プラスミドの構築及び大腸菌への形質転換 メタノコッカス・サーモリソトロフィカスの分子シャペ
ロンをコードする遺伝子の断片を、工業技術院生命工学
工業技術研究所にFERM P−16438として寄託
されているプラスミドpUTTS1を鋳型とし、配列番
号1のフォワードプライマー及び配列番号2のリバース
プライマーを用いるPCR法によって増幅させた。上記
プライマーを用いるPCR法によって増幅、回収された
断片を、BamHI及びNcoIで消化後、同様の制限
酵素処理が施された発現ベクターpET−11d(スト
ラティジェン社製)にライゲーションした。その後、こ
れをBL21(DE3)株(ストラティジェン社製)に
トランスフォーメーションし、アンピシリン100μg
/mLを含むLB培地プレート(トリプトン10g、酵
母エキス5g、NaCl10g/1L(pH7.0))
にて培養後、コロニーをピックアップし、グリセロール
ストックとした。
ス・サーモリソトロフィカス由来)の調製 (1)発現プラスミドの構築及び大腸菌への形質転換 メタノコッカス・サーモリソトロフィカスの分子シャペ
ロンをコードする遺伝子の断片を、工業技術院生命工学
工業技術研究所にFERM P−16438として寄託
されているプラスミドpUTTS1を鋳型とし、配列番
号1のフォワードプライマー及び配列番号2のリバース
プライマーを用いるPCR法によって増幅させた。上記
プライマーを用いるPCR法によって増幅、回収された
断片を、BamHI及びNcoIで消化後、同様の制限
酵素処理が施された発現ベクターpET−11d(スト
ラティジェン社製)にライゲーションした。その後、こ
れをBL21(DE3)株(ストラティジェン社製)に
トランスフォーメーションし、アンピシリン100μg
/mLを含むLB培地プレート(トリプトン10g、酵
母エキス5g、NaCl10g/1L(pH7.0))
にて培養後、コロニーをピックアップし、グリセロール
ストックとした。
【0068】(2)組み換え大腸菌からの分子シャペロ
ン調製 アンピシリン100μg/mLを含むLB培地200m
Lに、上記発現プラスミドを保持するBL21(DE
3)株(組み換え大腸菌)一白金耳を接種し、37℃で
16時間予備培養した。この培養液をLB培地6リット
ルに植菌し、ジャーファメンターにより本培養を行っ
た。本培養開始3時間後に、IPTG(和光純薬工業社
製)を1mM濃度となるように添加し、更に、培養を4
時間継続した。培養終了後、遠心分離にて菌を回収し、
−30℃にて凍結保存した。次に、回収した組み換え大
腸菌を、50mMTris−HCl緩衝液(pH7.
5、5mMMgCl2 )に懸濁させ、超音波破砕処理し
た。遠心分離にて上清を採取し、90分間、65℃の水
浴中にて加熱処理を行い、夾雑タンパク質を変性凝集さ
せ、遠心分離にて除去した。更に、上清に硫酸アンモニ
ウム(和光純薬工業社製)を80%飽和となるように添
加し、沈殿物を1.8Mの硫酸アンモニウムを含有する
50mMリン酸緩衝液(pH7.8)に溶解した。
ン調製 アンピシリン100μg/mLを含むLB培地200m
Lに、上記発現プラスミドを保持するBL21(DE
3)株(組み換え大腸菌)一白金耳を接種し、37℃で
16時間予備培養した。この培養液をLB培地6リット
ルに植菌し、ジャーファメンターにより本培養を行っ
た。本培養開始3時間後に、IPTG(和光純薬工業社
製)を1mM濃度となるように添加し、更に、培養を4
時間継続した。培養終了後、遠心分離にて菌を回収し、
−30℃にて凍結保存した。次に、回収した組み換え大
腸菌を、50mMTris−HCl緩衝液(pH7.
5、5mMMgCl2 )に懸濁させ、超音波破砕処理し
た。遠心分離にて上清を採取し、90分間、65℃の水
浴中にて加熱処理を行い、夾雑タンパク質を変性凝集さ
せ、遠心分離にて除去した。更に、上清に硫酸アンモニ
ウム(和光純薬工業社製)を80%飽和となるように添
加し、沈殿物を1.8Mの硫酸アンモニウムを含有する
50mMリン酸緩衝液(pH7.8)に溶解した。
【0069】この溶液を、TSK−Gel Ether
−5PWカラムによる疎水クロマトグラフィーにより精
製した。分子シャペロンに相当するサイズのタンパク質
が存在するフラクションを回収し、25mMHEPES
(pH6.8)−KOH、5%グリセロール緩衝液で透
析した。透析内液を、TSK−Gel SuperQ−
5PWカラムによる陰イオンクロマトグラフィーにより
精製した。分子シャペロンに相当するサイズのタンパク
質が存在するフラクションを回収した後、これを限外濾
過によって濃縮し、濃縮液をTSKgel G3000
SWXLカラムによるゲル濾過(流速:0.5mL/
分、展開液:25mMHepes−KOH(pH6.
8)、25mMMgCl2 、5%グリセロール)により
精製し、メタノコッカス・サーモリソトロフィカス由来
分子シャペロンを含むフラクションを得た。
−5PWカラムによる疎水クロマトグラフィーにより精
製した。分子シャペロンに相当するサイズのタンパク質
が存在するフラクションを回収し、25mMHEPES
(pH6.8)−KOH、5%グリセロール緩衝液で透
析した。透析内液を、TSK−Gel SuperQ−
5PWカラムによる陰イオンクロマトグラフィーにより
精製した。分子シャペロンに相当するサイズのタンパク
質が存在するフラクションを回収した後、これを限外濾
過によって濃縮し、濃縮液をTSKgel G3000
SWXLカラムによるゲル濾過(流速:0.5mL/
分、展開液:25mMHepes−KOH(pH6.
8)、25mMMgCl2 、5%グリセロール)により
精製し、メタノコッカス・サーモリソトロフィカス由来
分子シャペロンを含むフラクションを得た。
【0070】なお、分子シャペロンの分子量は、SDS
−PAGEにおいて約60KDaであり、この分子量を
有する画分をトレースすることにより確認した。また、
分子シャペロンは、ATPアーゼ活性を有するので、L
anzetta P.A著、Anal.Bioche
m、100号、95〜97頁記載のATPアーゼ活性測
定法を用いることにより評価した。
−PAGEにおいて約60KDaであり、この分子量を
有する画分をトレースすることにより確認した。また、
分子シャペロンは、ATPアーゼ活性を有するので、L
anzetta P.A著、Anal.Bioche
m、100号、95〜97頁記載のATPアーゼ活性測
定法を用いることにより評価した。
【0071】本フラクションに塩化マグネシウム、AT
P及び硫酸アンモニウムをそれぞれ50mM、2mM及
び300mMとなるように添加し、30℃にて5時間イ
ンキュベーションした。この溶液を再びゲル濾過に供
し、分子シャペロンの16量体フラクションを得た。こ
の画分を以下の実施例に供した。
P及び硫酸アンモニウムをそれぞれ50mM、2mM及
び300mMとなるように添加し、30℃にて5時間イ
ンキュベーションした。この溶液を再びゲル濾過に供
し、分子シャペロンの16量体フラクションを得た。こ
の画分を以下の実施例に供した。
【0072】実施例1 小粒子化HBs抗原の調製 (1)試薬及び材料 HBs抗原:ヒト陽性血漿より精製した。精製方法は、
塩化セシウム溶液及びショ糖溶液による密度勾配法によ
り小型球状粒子抗原を回収し、更にゲル濾過法により精
製した。得られたHBs抗原を、50mMリン酸ナトリ
ウム緩衝液(pH7.5)+0.2M NaClを用い
て2mg/mLとなるように調製し、これをHBs抗原
液とした。小粒子化用液:50mMリン酸ナトリウム緩
衝液(pH7.5)+0.2M NaClに、2%オク
チルグルコシド(同仁化学社製)及び10mMジチオス
レイトール(和光純薬社製)となるようにそれぞれ添加
して、これを小粒子化用液とした。分子シャペロン溶
液:塩化マグネシウムを75mM、ATPを3mM及び
塩化カリウムを450mMとなるように添加した50m
Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)に、参考例1
で調製したメタノコッカス・サーモリソトロフィカス由
来の分子シャペロンを3mg/mLとなるように希釈し
たものを分子シャペロン溶液とした。 管理血清:日水製薬社製、L−コンセーラN「ニッス
イ」を融解して用いた。HBs抗原量測定用キット:ヘ
キストジャパン社製、エンザイグノストHBsAgモノ
クローナルを用いた。
塩化セシウム溶液及びショ糖溶液による密度勾配法によ
り小型球状粒子抗原を回収し、更にゲル濾過法により精
製した。得られたHBs抗原を、50mMリン酸ナトリ
ウム緩衝液(pH7.5)+0.2M NaClを用い
て2mg/mLとなるように調製し、これをHBs抗原
液とした。小粒子化用液:50mMリン酸ナトリウム緩
衝液(pH7.5)+0.2M NaClに、2%オク
チルグルコシド(同仁化学社製)及び10mMジチオス
レイトール(和光純薬社製)となるようにそれぞれ添加
して、これを小粒子化用液とした。分子シャペロン溶
液:塩化マグネシウムを75mM、ATPを3mM及び
塩化カリウムを450mMとなるように添加した50m
Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)に、参考例1
で調製したメタノコッカス・サーモリソトロフィカス由
来の分子シャペロンを3mg/mLとなるように希釈し
たものを分子シャペロン溶液とした。 管理血清:日水製薬社製、L−コンセーラN「ニッス
イ」を融解して用いた。HBs抗原量測定用キット:ヘ
キストジャパン社製、エンザイグノストHBsAgモノ
クローナルを用いた。
【0073】(2)小粒子化方法 HBs抗原溶液2.5mL、小粒子化用液7.5mL、
分子シャペロン溶液10mLを同時に混合し、25℃に
て2時間インキュベーションした。インキュベーション
終了後に透析処理を行い、小粒子化剤等を除去した。抗
原含有液の小量を用いて、抗原性をHBs抗原測定キッ
トを用いて測定した結果、小粒子化操作前の抗原液とほ
ぼ同等の抗原活性を保持していることを確認した。
分子シャペロン溶液10mLを同時に混合し、25℃に
て2時間インキュベーションした。インキュベーション
終了後に透析処理を行い、小粒子化剤等を除去した。抗
原含有液の小量を用いて、抗原性をHBs抗原測定キッ
トを用いて測定した結果、小粒子化操作前の抗原液とほ
ぼ同等の抗原活性を保持していることを確認した。
【0074】(3)分子量の測定 この操作で得られた小粒子化HBs抗原の分子量分布を
調べるために高速液体クロマトグラフィーによる解析を
行った。高速液体クロマトグラフィーは島津社製HPL
C−10Aシステムを、カラムは東ソー社製のゲル濾過
クロマト用カラムTSKgelG4000SWXLを用
い、溶離液として50mMリン酸ナトリウム緩衝液(p
H7.5)+0.1M NaClにオクチルグルコシド
0.2%添加した液を用いた。検出は280nmの吸光
度を測定することにより行い、また分子量標準物質とし
て東ソー社製のTSK標準ポリエチレンオキシドを用い
て較正曲線を作製し、これをもとに分子量分布を求め
た。その結果、分子量分布30〜60万付近に小粒子化
HBs抗原と推定されるピークが認められた。
調べるために高速液体クロマトグラフィーによる解析を
行った。高速液体クロマトグラフィーは島津社製HPL
C−10Aシステムを、カラムは東ソー社製のゲル濾過
クロマト用カラムTSKgelG4000SWXLを用
い、溶離液として50mMリン酸ナトリウム緩衝液(p
H7.5)+0.1M NaClにオクチルグルコシド
0.2%添加した液を用いた。検出は280nmの吸光
度を測定することにより行い、また分子量標準物質とし
て東ソー社製のTSK標準ポリエチレンオキシドを用い
て較正曲線を作製し、これをもとに分子量分布を求め
た。その結果、分子量分布30〜60万付近に小粒子化
HBs抗原と推定されるピークが認められた。
【0075】実施例2 小粒子化HBs抗原の調製 (1)試薬及び材料 小粒子化用液及び分子シャペロン溶液として下記のもの
を使用したこと以外は、実施例1と同様のものを使用し
た。小粒子化用液:50mMリン酸ナトリウム緩衝液
(pH7.5)+0.2M NaClに、1%オクチル
グルコシド(同仁化学社製)、10mMジチオスレイト
ール(和光純薬社製)、8Mグアニジン塩酸塩(和光純
薬社製)となるようにそれぞれ添加して、これを小粒子
化用液とした。分子シャペロン溶液:塩化マグネシウム
50mM、ATP2mM及び塩化カリウム300mMと
なるように添加した50mMリン酸ナトリウム緩衝液
(pH7.5)に、参考例1で調製したメタノコッカス
・サーモリソトロフィカス由来の分子シャペロンを0.
5mg/mLとなるように希釈したものを分子シャペロ
ン溶液とした。
を使用したこと以外は、実施例1と同様のものを使用し
た。小粒子化用液:50mMリン酸ナトリウム緩衝液
(pH7.5)+0.2M NaClに、1%オクチル
グルコシド(同仁化学社製)、10mMジチオスレイト
ール(和光純薬社製)、8Mグアニジン塩酸塩(和光純
薬社製)となるようにそれぞれ添加して、これを小粒子
化用液とした。分子シャペロン溶液:塩化マグネシウム
50mM、ATP2mM及び塩化カリウム300mMと
なるように添加した50mMリン酸ナトリウム緩衝液
(pH7.5)に、参考例1で調製したメタノコッカス
・サーモリソトロフィカス由来の分子シャペロンを0.
5mg/mLとなるように希釈したものを分子シャペロ
ン溶液とした。
【0076】(2)小粒子化方法 HBs抗原溶液2.5mL及び小粒子化用液7.5mL
を混合し、30℃にて1時間インキュベーションした。
この液全量を分子シャペロン溶液90mLに添加、混合
し、25℃で2時間インキュベーションを行った。イン
キュベート終了後に、セントリプレップ10を用いて遠
心濃縮を行い、全量を10mLまで濃縮し、更に、透析
処理により小粒子化剤等を除去した。抗原含有液の少量
をとり、その抗原性をHBs抗原測定キットを用いて測
定した結果、小粒子化操作前の抗原液とほぼ同等の抗原
活性を保持していることを確認した。
を混合し、30℃にて1時間インキュベーションした。
この液全量を分子シャペロン溶液90mLに添加、混合
し、25℃で2時間インキュベーションを行った。イン
キュベート終了後に、セントリプレップ10を用いて遠
心濃縮を行い、全量を10mLまで濃縮し、更に、透析
処理により小粒子化剤等を除去した。抗原含有液の少量
をとり、その抗原性をHBs抗原測定キットを用いて測
定した結果、小粒子化操作前の抗原液とほぼ同等の抗原
活性を保持していることを確認した。
【0077】(3)分子量の測定 実施例1と同様に行った。その結果、分子量分布20〜
40万付近にピークが認められた。
40万付近にピークが認められた。
【0078】参考例2 分子シャペロン固定化担体の調
製 参考例1で用いた配列表の配列番号2のリバースプライ
マーの代わりに配列表の配列番号3のプライマーを用
い、分子シャペロンペプチド鎖のC末端側にヒスチジン
6残基を導入した。参考例1と同様の方法で調製したH
is(6)−分子シャペロンモノマー1.0mgを、N
i2+をキレート担持させたHi−TrapChelat
ingゲル1g(ファルマシア社製)の20mMリン酸
ナトリウム緩衝液(pH7.5)にて吸着固定させた。
一方、参考例1で得られた分子シャペロン16量体溶液
に、EDTAを10mMとなるように添加し3時間反応
させることにより得た分子シャペロンモノマー(タンパ
ク質量として20mg)を、上記で得られたHis
(6)−分子シャペロンモノマーが吸着されたHi−T
rap Chelatingゲル1gに添加し、更に、
塩化マグネシウム、ATP及び硫酸アンモニウムをそれ
ぞれ50mM、2mM及び300mMとなるように添加
して、30℃にて5時間インキュベーションした。得ら
れた分子シャペロンオリゴマー結合担体を以下の実施例
に用いた。
製 参考例1で用いた配列表の配列番号2のリバースプライ
マーの代わりに配列表の配列番号3のプライマーを用
い、分子シャペロンペプチド鎖のC末端側にヒスチジン
6残基を導入した。参考例1と同様の方法で調製したH
is(6)−分子シャペロンモノマー1.0mgを、N
i2+をキレート担持させたHi−TrapChelat
ingゲル1g(ファルマシア社製)の20mMリン酸
ナトリウム緩衝液(pH7.5)にて吸着固定させた。
一方、参考例1で得られた分子シャペロン16量体溶液
に、EDTAを10mMとなるように添加し3時間反応
させることにより得た分子シャペロンモノマー(タンパ
ク質量として20mg)を、上記で得られたHis
(6)−分子シャペロンモノマーが吸着されたHi−T
rap Chelatingゲル1gに添加し、更に、
塩化マグネシウム、ATP及び硫酸アンモニウムをそれ
ぞれ50mM、2mM及び300mMとなるように添加
して、30℃にて5時間インキュベーションした。得ら
れた分子シャペロンオリゴマー結合担体を以下の実施例
に用いた。
【0079】実施例3 小粒子化HBs抗原の調製 (1)試薬及び材料 実施例1の小粒子化用液及び分子シャペロン溶液の代わ
りに下記のものを使用したこと以外は、実施例1と同様
のものを使用した。小粒子化用液:50mMリン酸ナト
リウム緩衝液(pH7.5)+0.2M NaClに、
8M尿素(和光純薬社製)、10mMジチオエリスリト
ール(和光純薬社製)、1.6%MEGA9(同仁化学
社製)となるようにそれぞれ添加して、これを小粒子化
用液とした。分子シャペロン溶液:参考例2で調製した
メタノコッカス・サーモリソトロフィカス由来の分子シ
ャペロンオリゴマー結合担体を用いた。塩化マグネシウ
ム50mM、ATP2mM及び塩化カリウム300mM
となるように添加した100mMリン酸ナトリウム緩衝
液(pH7.5)45mLに、分子シャペロン結合担体
ゲル5mLを加え懸濁したスラリーを調製した。
りに下記のものを使用したこと以外は、実施例1と同様
のものを使用した。小粒子化用液:50mMリン酸ナト
リウム緩衝液(pH7.5)+0.2M NaClに、
8M尿素(和光純薬社製)、10mMジチオエリスリト
ール(和光純薬社製)、1.6%MEGA9(同仁化学
社製)となるようにそれぞれ添加して、これを小粒子化
用液とした。分子シャペロン溶液:参考例2で調製した
メタノコッカス・サーモリソトロフィカス由来の分子シ
ャペロンオリゴマー結合担体を用いた。塩化マグネシウ
ム50mM、ATP2mM及び塩化カリウム300mM
となるように添加した100mMリン酸ナトリウム緩衝
液(pH7.5)45mLに、分子シャペロン結合担体
ゲル5mLを加え懸濁したスラリーを調製した。
【0080】(2)小粒子化方法 HBs抗原溶液2.5mLと小粒子化用液7.5mLを
混合し、30℃にて1時間インキュベーションした。こ
の液を、分子シャペロン結合担体ゲル5mLを45mL
の100mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)に
懸濁させたスラリーに添加、混合し25℃にて4時間イ
ンキュベーションを行った。反応終了後、同液を100
00rpm、20分間遠心分離操作を行い、上清液を回
収し、透析を行って小粒子化剤等を除去した。抗原含有
液の抗原性をHBs抗原測定キットを用いて測定した結
果、小粒子化操作前の抗原液とほぼ同等の抗原活性を保
持していることを確認した。
混合し、30℃にて1時間インキュベーションした。こ
の液を、分子シャペロン結合担体ゲル5mLを45mL
の100mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)に
懸濁させたスラリーに添加、混合し25℃にて4時間イ
ンキュベーションを行った。反応終了後、同液を100
00rpm、20分間遠心分離操作を行い、上清液を回
収し、透析を行って小粒子化剤等を除去した。抗原含有
液の抗原性をHBs抗原測定キットを用いて測定した結
果、小粒子化操作前の抗原液とほぼ同等の抗原活性を保
持していることを確認した。
【0081】(3)分子量の測定 実施例1と同様にして行った結果、約50〜80万のと
ころにメインピークが出現した。
ころにメインピークが出現した。
【0082】実施例4 小粒子化HBs抗原の調製 (1)試薬及び材料 分子シャペロン溶液として下記のものを使用したこと以
外は、実施例2と同様のものを使用した。分子シャペロ
ン溶液:参考例1と同様にして調製したメタノコッカス
・ボルタエ由来の分子シャペロンを用いた。同分子シャ
ペロンを、塩化マグネシウム75mM、ATP3mM及
び塩化カリウム450mMとなるように添加した50m
Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)に、0.2m
g/mLとなるように希釈したものを分子シャペロン溶
液とした。
外は、実施例2と同様のものを使用した。分子シャペロ
ン溶液:参考例1と同様にして調製したメタノコッカス
・ボルタエ由来の分子シャペロンを用いた。同分子シャ
ペロンを、塩化マグネシウム75mM、ATP3mM及
び塩化カリウム450mMとなるように添加した50m
Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)に、0.2m
g/mLとなるように希釈したものを分子シャペロン溶
液とした。
【0083】(2)小粒子化方法 実施例2と同様にして小粒子化を行った。小粒子化処理
後、抗原含有液の少量をとり、その抗原性をHBs抗原
測定キットを用いて測定した結果、小粒子化操作前の抗
原液とほぼ同等の抗原活性を保持していることを確認し
た。
後、抗原含有液の少量をとり、その抗原性をHBs抗原
測定キットを用いて測定した結果、小粒子化操作前の抗
原液とほぼ同等の抗原活性を保持していることを確認し
た。
【0084】(3)分子量の測定 実施例1と同様に行った。その結果、分子量分布30〜
50万付近にピークが認められた。
50万付近にピークが認められた。
【0085】実施例5 HBs抗原標識酵素を用いたH
Bs抗体試薬測定 (1)HBs抗原標識酵素の調製 実施例1で得た小粒子化HBs抗原を用いた。100m
Mリン酸ナトリウム緩衝液+0.1MNaCl液を用い
て、小粒子化HBs抗原が500μg/mLとなるよう
に希釈し、精製水で溶解したN−4−マレイミドブチリ
ロキシスルホサクシニミド ナトリウム塩3.8mg/
mLを5μL加え、20℃で60分間インキュベーショ
ンした。反応後にセファデックスG−25(ファルマシ
ア社製)を担体(カラムサイズ:16×300mm)と
したゲル濾過カラムクロマトグラフィーを行い、マレイ
ミド化した小粒子化HBs抗原を得た。
Bs抗体試薬測定 (1)HBs抗原標識酵素の調製 実施例1で得た小粒子化HBs抗原を用いた。100m
Mリン酸ナトリウム緩衝液+0.1MNaCl液を用い
て、小粒子化HBs抗原が500μg/mLとなるよう
に希釈し、精製水で溶解したN−4−マレイミドブチリ
ロキシスルホサクシニミド ナトリウム塩3.8mg/
mLを5μL加え、20℃で60分間インキュベーショ
ンした。反応後にセファデックスG−25(ファルマシ
ア社製)を担体(カラムサイズ:16×300mm)と
したゲル濾過カラムクロマトグラフィーを行い、マレイ
ミド化した小粒子化HBs抗原を得た。
【0086】このマレイミド化した小粒子化HBs抗原
液(200μg)に、100mMリン酸緩衝液(pH
7.0、10mMMgCl2 、5mMEDTA)に溶解
したβ−ガラクトシダーゼ(ベーリンガーマンハイム社
製:EIAグレード)500μgを混合し、30℃で3
0分間インキュベーションした。反応後に、60mMリ
ン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4、10mMEDT
A、1mMMgCl2 、0.1%BSA、0.1%ナト
リウムアジド)0.1mLを加えた。反応後に、20m
Mトリス−塩酸緩衝液(pH7.5、0.1MNaC
l)で平衡に達したDEAE−Toyopearlカラ
ム(カラムサイズ:12×150mm)にアプライし、
20mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)を用い、N
aClを0.1〜0.5Mとしたグラジエントをかけ、
溶出するβ−ガラクトシダーゼ標識HBs抗原複合体を
調製した。
液(200μg)に、100mMリン酸緩衝液(pH
7.0、10mMMgCl2 、5mMEDTA)に溶解
したβ−ガラクトシダーゼ(ベーリンガーマンハイム社
製:EIAグレード)500μgを混合し、30℃で3
0分間インキュベーションした。反応後に、60mMリ
ン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4、10mMEDT
A、1mMMgCl2 、0.1%BSA、0.1%ナト
リウムアジド)0.1mLを加えた。反応後に、20m
Mトリス−塩酸緩衝液(pH7.5、0.1MNaC
l)で平衡に達したDEAE−Toyopearlカラ
ム(カラムサイズ:12×150mm)にアプライし、
20mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)を用い、N
aClを0.1〜0.5Mとしたグラジエントをかけ、
溶出するβ−ガラクトシダーゼ標識HBs抗原複合体を
調製した。
【0087】(2)HBs抗原の固定化 実施例1で得た精製HBs抗原を、0.1M炭酸緩衝液
(pH9.6)で10μg/mLの濃度に調製し、ヌン
ク−イムノモジュールマキシソープF16ブラック(ヌ
ンク社製)に100μL/ウエルにて分注し、室温で2
時間静置した。このプレートを生理食塩水で洗浄し、
0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)、0.15MN
aCl、100mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.
0)を300μL/ウエルにて分注し、室温で1時間ブ
ロックした。再び生理食塩水で洗浄し、1%β−シクロ
デキストリン、0.5%BSA、0.15MNaCl、
100mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)を3
00μL/ウエルにて分注し、室温で30分間コーティ
ングした。次いで、コーティング液を除去し、室温で真
空乾燥させた。
(pH9.6)で10μg/mLの濃度に調製し、ヌン
ク−イムノモジュールマキシソープF16ブラック(ヌ
ンク社製)に100μL/ウエルにて分注し、室温で2
時間静置した。このプレートを生理食塩水で洗浄し、
0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)、0.15MN
aCl、100mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.
0)を300μL/ウエルにて分注し、室温で1時間ブ
ロックした。再び生理食塩水で洗浄し、1%β−シクロ
デキストリン、0.5%BSA、0.15MNaCl、
100mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)を3
00μL/ウエルにて分注し、室温で30分間コーティ
ングした。次いで、コーティング液を除去し、室温で真
空乾燥させた。
【0088】(3)HBs抗体の測定 上記(2)項で調製したHBs抗原プレートのウェル
に、(1)で得たβ−ガラクトシダーゼ標識HBs抗原
液を5U/mLに調製したコンジュゲート液500μL
を加え、37℃で5分間プレ加温した。検体50μLを
加え、37℃で8分間振盪しながらインキュベーション
した。次いで、生理食塩水で5回洗浄し、よく水分を除
去した後、蛍光基質を用いた酵素活性測定を行った。即
ち、予め37℃に加温しておいた基質溶液(450μM
4−メチルウンベリフェリル−β−D−ガククトシド、
75mMNaCl、0.04%MgC12 、0.05%
BSA、3%エチレングリコール)100μLを各ウエ
ルに添加し、30℃で90分間インキュベートした。
0.1Mグリシン−NaOH緩衝液(pH10.3)1
50μLを加えて酵素反応を停止し、励起波長360n
m、測定波長450nmで蛍光強度を測定した。
に、(1)で得たβ−ガラクトシダーゼ標識HBs抗原
液を5U/mLに調製したコンジュゲート液500μL
を加え、37℃で5分間プレ加温した。検体50μLを
加え、37℃で8分間振盪しながらインキュベーション
した。次いで、生理食塩水で5回洗浄し、よく水分を除
去した後、蛍光基質を用いた酵素活性測定を行った。即
ち、予め37℃に加温しておいた基質溶液(450μM
4−メチルウンベリフェリル−β−D−ガククトシド、
75mMNaCl、0.04%MgC12 、0.05%
BSA、3%エチレングリコール)100μLを各ウエ
ルに添加し、30℃で90分間インキュベートした。
0.1Mグリシン−NaOH緩衝液(pH10.3)1
50μLを加えて酵素反応を停止し、励起波長360n
m、測定波長450nmで蛍光強度を測定した。
【0089】(4)標準HBs抗体液 HBs抗体を0、12.5、25、50、100mIU
/mL濃度で含むヒト血清を標準品として使用した。上
記(3)項の測定法に従って、測定値を求め、検量線を
作成した。得られた結果を表1及び図1に示す。
/mL濃度で含むヒト血清を標準品として使用した。上
記(3)項の測定法に従って、測定値を求め、検量線を
作成した。得られた結果を表1及び図1に示す。
【0090】実施例6 HBs抗原標識酵素を用いたH
Bs抗体試薬測定 (1)HBs抗原標識酵素の調製 実施例2で得た小粒子化HBs抗原を用いた。100m
Mリン酸ナトリウム緩衝液+0.1MNaCl液を用い
て、抗原500μg/mLに希釈し、DMSOで溶解し
たN−スクシニミジルD−ビオチン3.4mg/mLを
5μL加え、30℃で20分間インキュベーションし
た。反応後に、セファクリルS−300HR(ファルマ
シア社製)を担体(カラムサイズ:16×300mm)
としたゲル濾過カラムクロマトグラフィーを行い、ビオ
チン化した小粒子化HBs抗原を得た。このビオチン化
小粒子化HBs抗原液(250μg)にβ−ガラクトシ
ダーゼ標識ストレプトアビジン(ベーリンガマンハイム
社製:500U)を混合し、37℃で1時間インキュベ
ーションした。反応後に凝集体形成を防ぐことを目的と
して、未反応のビオチン結合部位をブロックするためd
−ビオチン2mgを加えて、更に30分間インキュベー
ションした。反応後に、セントリプレップ−10(アミ
コン社製)で濃縮し1.5mLとして、セファクリルS
−400HR(ファルマシア社製)を担体(カラムサイ
ズ:16×300mm)としたゲル濾過カラムクロマト
グラフィーを行い、β−ガラクトシダーゼ標識HBs抗
原複合体を調製した。
Bs抗体試薬測定 (1)HBs抗原標識酵素の調製 実施例2で得た小粒子化HBs抗原を用いた。100m
Mリン酸ナトリウム緩衝液+0.1MNaCl液を用い
て、抗原500μg/mLに希釈し、DMSOで溶解し
たN−スクシニミジルD−ビオチン3.4mg/mLを
5μL加え、30℃で20分間インキュベーションし
た。反応後に、セファクリルS−300HR(ファルマ
シア社製)を担体(カラムサイズ:16×300mm)
としたゲル濾過カラムクロマトグラフィーを行い、ビオ
チン化した小粒子化HBs抗原を得た。このビオチン化
小粒子化HBs抗原液(250μg)にβ−ガラクトシ
ダーゼ標識ストレプトアビジン(ベーリンガマンハイム
社製:500U)を混合し、37℃で1時間インキュベ
ーションした。反応後に凝集体形成を防ぐことを目的と
して、未反応のビオチン結合部位をブロックするためd
−ビオチン2mgを加えて、更に30分間インキュベー
ションした。反応後に、セントリプレップ−10(アミ
コン社製)で濃縮し1.5mLとして、セファクリルS
−400HR(ファルマシア社製)を担体(カラムサイ
ズ:16×300mm)としたゲル濾過カラムクロマト
グラフィーを行い、β−ガラクトシダーゼ標識HBs抗
原複合体を調製した。
【0091】HBs抗原の固定化、HBs抗体の測定、
及び、標準HBs抗体液の調製と測定は、実施例5と同
様に行った。得られた結果を表1及び図1に示す。
及び、標準HBs抗体液の調製と測定は、実施例5と同
様に行った。得られた結果を表1及び図1に示す。
【0092】比較例1 β−ガラクトシダーゼ標識する抗原として、実施例1で
調製した小粒子化HBs抗原の代わりに小粒子化処理し
ていない精製HBs抗原を用いたこと以外は、実施例5
と同様に行った。得られた結果を表1及び図1に示す。
調製した小粒子化HBs抗原の代わりに小粒子化処理し
ていない精製HBs抗原を用いたこと以外は、実施例5
と同様に行った。得られた結果を表1及び図1に示す。
【0093】比較例2 β−ガラクトシダーゼ標識する抗原を、実施例1におい
て分子シャペロン溶液の代わりに50mMリン酸緩衝液
を添加して調製した小粒子化HBs抗原を用いたこと以
外は、実施例5と同様に行った。得られた結果を表1及
び図1に示す。
て分子シャペロン溶液の代わりに50mMリン酸緩衝液
を添加して調製した小粒子化HBs抗原を用いたこと以
外は、実施例5と同様に行った。得られた結果を表1及
び図1に示す。
【0094】
【表1】
【0095】実施例7 HBs抗体測定用ラテックス試
薬の調製(1) (1)HBs抗原感作ラテックス試薬の調製 実施例3で得られた小粒子化HBs抗原を50mMリン
酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)を用いて2.0mg
/mLに希釈し、7.5mLに平均粒径0.3μmのポ
リスチレンラテックス(固形分10%(W/V)、積水
化学工業社製)1mLと36mMリン酸ナトリウム緩衝
液+0.1MNaCl)を添加し、30℃にて60分間
攪拌した。次いで、この液にウシ血清アルブミン(BS
A)を1重量%含有するリン酸−食塩緩衝液(0.05
Mリン酸緩衝液(pH7.0)、0.1MNaCl、以
下PBSともいう)を添加し、30℃にて60分間攪拌
した後、4℃にて20分間、18000rpmで遠心分
離することにより洗浄した。洗浄操作は3回行った。得
られた沈殿物にBSAを1重量%含有するPBSを10
mL添加し、ラテックスを懸濁した後、超音波破砕機に
て分散処理を行い、固形分0.1%(W/V)のHBs
抗原感作ラテックス液を調製した。
薬の調製(1) (1)HBs抗原感作ラテックス試薬の調製 実施例3で得られた小粒子化HBs抗原を50mMリン
酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)を用いて2.0mg
/mLに希釈し、7.5mLに平均粒径0.3μmのポ
リスチレンラテックス(固形分10%(W/V)、積水
化学工業社製)1mLと36mMリン酸ナトリウム緩衝
液+0.1MNaCl)を添加し、30℃にて60分間
攪拌した。次いで、この液にウシ血清アルブミン(BS
A)を1重量%含有するリン酸−食塩緩衝液(0.05
Mリン酸緩衝液(pH7.0)、0.1MNaCl、以
下PBSともいう)を添加し、30℃にて60分間攪拌
した後、4℃にて20分間、18000rpmで遠心分
離することにより洗浄した。洗浄操作は3回行った。得
られた沈殿物にBSAを1重量%含有するPBSを10
mL添加し、ラテックスを懸濁した後、超音波破砕機に
て分散処理を行い、固形分0.1%(W/V)のHBs
抗原感作ラテックス液を調製した。
【0096】(2)検体希釈液の調製 平均分子量500,000のポリエチレングリコール
(以下、PEGともいう:和光純薬社製)を、BSAを
1重量%含有するPBSに、0.9重量%の濃度となる
ように溶解した。
(以下、PEGともいう:和光純薬社製)を、BSAを
1重量%含有するPBSに、0.9重量%の濃度となる
ように溶解した。
【0097】(3)HBs抗体測定試薬 本実施例のHBs抗体測定試薬は、上記(1)項のHB
s抗原感作ラテックスからなる第1試薬と、上記(2)
項のPEG溶液からなる第2試薬とから構成される2液
系の試薬である。
s抗原感作ラテックスからなる第1試薬と、上記(2)
項のPEG溶液からなる第2試薬とから構成される2液
系の試薬である。
【0098】(4)標準HBs抗体液 HBs抗体を0、300、600、1200、1800
mIU/mL濃度で含むヒト血清を標準品として使用し
た。
mIU/mL濃度で含むヒト血清を標準品として使用し
た。
【0099】(5)測定方法 検体20μLと上記(2)項の検体希釈液120μLを
混合し、37℃で適時保持した後、上記(1)項のHB
s抗原感作ラテックス液120μLを添加攪拌した。こ
の後、1分後及び5分後の波長750nmでの吸光度を
測定し、この差を吸光度変化量(△Abs)とした。測
定は日立自動分析7150形を使用した。標準HBs抗
体液を測定して、検量線を作成した。得られた結果を表
2及び図2に示す。
混合し、37℃で適時保持した後、上記(1)項のHB
s抗原感作ラテックス液120μLを添加攪拌した。こ
の後、1分後及び5分後の波長750nmでの吸光度を
測定し、この差を吸光度変化量(△Abs)とした。測
定は日立自動分析7150形を使用した。標準HBs抗
体液を測定して、検量線を作成した。得られた結果を表
2及び図2に示す。
【0100】実施例8 HBs抗体測定用ラテックス試
薬の調製(2) 実施例4で得られた小粒子化HBs抗原を用いた以外
は、実施例7と同様にしてHBs抗体測定用のラテック
ス試薬を調製し、検量線を作成した。得られた結果を表
2及び図2に示す。
薬の調製(2) 実施例4で得られた小粒子化HBs抗原を用いた以外
は、実施例7と同様にしてHBs抗体測定用のラテック
ス試薬を調製し、検量線を作成した。得られた結果を表
2及び図2に示す。
【0101】比較例3 ラテックスに感作する抗原を、実施例1で調製した小粒
子化HBs抗原の代わりに小粒子化処理していない精製
HBs抗原を用いた以外は実施例7と同様に行った。得
られた結果を表2及び図2に示す。
子化HBs抗原の代わりに小粒子化処理していない精製
HBs抗原を用いた以外は実施例7と同様に行った。得
られた結果を表2及び図2に示す。
【0102】比較例4 ラテックスに感作する抗原を、実施例1において分子シ
ャペロン溶液のかわりに50mMリン酸緩衝液を添加し
て調製した小粒子化HBs抗原を用いた以外は実施例7
と同様に行った。得られた結果を表2及び図2に示す。
ャペロン溶液のかわりに50mMリン酸緩衝液を添加し
て調製した小粒子化HBs抗原を用いた以外は実施例7
と同様に行った。得られた結果を表2及び図2に示す。
【0103】
【表2】
【0104】
【発明の効果】本発明の小粒子化HBs抗原の調製法
は、上述の構成よりなるので、活性を保持した小粒子化
HBs抗原を得ることが可能となった。また、それを用
いることにより、高感度な免疫測定法を行うことができ
る酵素標識抗原試薬やラテックス凝集試薬を得ることが
可能となった。
は、上述の構成よりなるので、活性を保持した小粒子化
HBs抗原を得ることが可能となった。また、それを用
いることにより、高感度な免疫測定法を行うことができ
る酵素標識抗原試薬やラテックス凝集試薬を得ることが
可能となった。
【0105】
【配列表】 配列番号:1 配列の長さ:22 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸、合成DNA 配列 GGCCATGGCA GCTAACCAGC CA 22
【0106】 配列番号:2 配列の長さ:28 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸、合成DNA 配列 CCGGATCCTT ACATCATTCC GCCCATAC 28
【0107】 配列番号:3 配列の長さ:46 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸、合成DNA 配列 CCGGATCCTT AATGGTGATG GTGATGGTGC ATCATTCCGC CCATAC 46
【0108】 配列番号:4 配列の長さ:1680 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 配列の特徴 起源 生物種:メタノコッカス・サーモリソトロフィカス 株名:DSM2095株 配列 TCTAATACAC TTATAAAAAA GGGGTGAAAT C ATG GCA GCT AAC CAG CCA GTA 52 Met Ala Ala Asn Gln Pro Val 1 5 GTA GTA TTA CCT GAA AAC GTA AAA AGA TTT ATG GGA AGA GAT GCT CAA 100 Val Val Leu Pro Glu Asn Val Lys Arg Phe Met Gly Arg Asp Ala Gln 10 15 20 AGA ATG AAC ATC TTA GCA GGA AGA ATT ATC GGT GAG ACA GTA AGA TCC 148 Arg Met Asn Ile Leu Ala Gly Arg Ile Ile Gly Glu Thr Val Arg Ser 25 30 35 ACA TTA GGT CCA AAG GGA ATG GAC AAA ATG TTA GTA GAT GAT TTA GGT 196 Thr Leu Gly Pro Lys Gly Met Asp Lys Met Leu Val Asp Asp Leu Gly 40 45 50 55 GAC ATT GTT GTT ACA AAT GAC GGT GTT ACA ATC TTA AAA GAA ATG AGT 244 Asp Ile Val Val Thr Asn Asp Gly Val Thr Ile Leu Lys Glu Met Ser 60 65 70 GTA GAA CAC CCA GCA GCT AAA ATG TTA ATT GAA GTT GCA AAA ACA CAA 292 Val Glu His Pro Ala Ala Lys Met Leu Ile Glu Val Ala Lys Thr Gln 75 80 85 GAA AAA GAA GTT GGA GAC GGT ACA ACA ACA GCT GTT GTT ATC GCT GGT 340 Glu Lys Glu Val Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Val Val Ile Ala Gly 90 95 100 GAA TTA TTA AGA AAA GCT GAG GAA TTG TTA GAC CAA AAC GTA CAC CCA 388 Glu Leu Leu Arg Lys Ala Glu Glu Leu Leu Asp Gln Lys Val His Pro 105 110 115 ACA ATT GTT ATT AAA GGT TAC CAG TTA GCA GTT CAA AAA GCA CAA GAA 436 Thr Ile Val Ile Lys Gly Thr Gln Leu Ala Val Gln Lys Ala Gln Glu 120 125 130 135 GTA TTA AAA GAA ATA GCA ATG GAT GTA AAA GCA GAC GAT AAA GAA ATA 484 Val Leu Lys Glu Ile Ala Met Asp Val Lys Ala Asp Asp Lys Glu Ile 140 145 150 TTA CAC AAA ATA GCA ATG ACC TCA ATT ACT GGA AAA GGT GCA GAA AAA 532 Leu His Lys Ile Ala Met Thr Ser Ile Thr Gly Lys Gly Ala Glu Lys 155 160 165 GCT AAA GAA AAA TTG GGA GAA ATG ATC GTT GAA GCT GTT ACT GCA GTT 580 Ala Lys Glu Lys Leu Gly Glu Met Ile Val Glu Ala Val Thr Ala Val 170 175 180 GTA GAC GAA AGT GGA AAA GTT GAC AAA GAT TTA ATA AAA ATC GAG AAG 628 Val Asp Glu Ser Gly Lys Val Asp Lys Asp Leu Ile Lys Ile Glu Lys 185 190 195 AAA GAA GGA GCT TCA GTT GAC GAA ACC GAA TTA ATC AAT GGT GTA TTA 676 Lys Glu Gly Ala Ser Val Asp Glu Thr Glu Leu Ile Asn Gly Val Leu 200 205 210 215 ATA GAC AAA GAA AGA GTA AGC CCA CAA ATG CCT AAG AAG ATA GAA AAC 724 Ile Asp Lys Glu Arg Val Ser Pro Gln Met Pro Lys Lys Ile Glu Asn 220 225 230 GCA AAG ATC GCA TTA TTG AAC TGC CCA ATC GAA GTT AAA GAA ACA GAA 772 Ala Lys Ile Ala Leu Leu Asn Cys Pro Ile Glu Val Lys Glu Tha Glu 235 240 245 ACA GAT GCA GAA ATT AGA ATC ACA GAT CCT ACA AAA TTA ATG GAA TTC 820 Thr Asp Ala Glu Ile Arg Ile Thr Asp Pro Thr Lys Leu Met Glu Phe 250 255 260 ATT GAA CAA GAA GAA AAA ATG TTA AAA GAT ATG GTA GAT ACC ATA AAA 868 Ile Glu Gln Glu Glu Lys Met Leu Lys Asp Met Val Asp Thr Ile Lys 265 270 275 GCT TCA GGA GCA AAC GTT TTA TTC TGC CAA AAA GGT ATC GAT GAC TTA 916 Ala Gln His Tyr Asn Val Leu Phe Cys Gln Lys Gly Ile Asp Asp Leu 280 285 290 295 GCA CAA CAC TAC TTA GCA AAA GAA GGA ATC CTT GCA GTA AGA AGA GTC 964 Ala Gln His Tyr Leu Ala Lys Glu Glu Ile Leu Ala Val Arg Arg Val 300 305 310 AAA AAA TCA GAC ATG GAA AAA TTA TCA AAA GCT ACT GGA GCT AAC GTA 1012 Lys Lys Ser Asp Met glu Lys Leu Ser Lys Ala Thr Gly Ala Asn Val 315 320 325 GTA ACA AAC ATC AAA GAC TTA AAA GCT GAA GAT TTA GGG GAA GCA GGA 1060 Val Thr Asn Ile Lys Asp Leu Lys Ala Glu Asp Leu Gly Glu Ala Gly 330 335 340 ATT GTA GAA GAA AGA AAA ATT GCT GGA GAC GCA ATG ATC TTC GTT GAA 1108 Ile Val Glu Glu Arg Lys Ile Ala Gly Asp Ala Met Ile Phe Val Glu 345 350 355 GAA TGC AAA CAT CCA AAA GCA GTA ACA ATG TTA ATA AGA GGT ACA ACA 1156 Glu Cys Lys His Pro Lys Ala Val Thr Met Leu Ile Arg Gly Thr Thr 360 365 370 375 GAA CAC GTA ATT GAA GAA GTA GCA AGA GCT GTA GAT GAT GCT ATT GGA 1204 Glu His Val Ile Glu Glu Val Ala Arg Ala Val Asp Asp Ala Ile Gly 380 385 390 GTT GTA GCA TGT ACC ATC GAA GAC GGT AAG ATC GTT GCA GGT GGT GGA 1252 Val Val Ala Cys Thr Ile Glu Asp Gly Lys Ile Val Ala Gly Gly Gly 395 400 405 GCT GCA GAG ATA GAA TTA GCA ATG AAA TTA AGA GAC TAC GCT GAA GGA 1300 Ala Ala Glu Ile Glu Leu Ala Met Lys Leu Arg Asp Tyr Ala Glu Gly 410 415 420 GTA AGT GGA AGA GAA CAA TTG GCA GTT AGA GCA TTT GCA GAT GCT TTA 1348 Val Ser Gly Arg Glu Gln Leu Ala Val Arg Ala Phe Ala Asp Ala Leu 425 430 435 GAA GTA GTT CCA AGA ACA TTA GCA GAA AAC GCA GGT TTA GAT GCA ATT 1396 Glu Val Val Pro Arg Thr Leu Ala Glu Asn Ala Gly Leu Asp Ala Ile 440 445 450 455 GAA ATG CTC GTT AAA TTA AGA GCT AAA CAT GCA GAA GGA AAT AAC GCA 1444 Glu Met Leu Val Lys Leu Arg Ala Lys His Ala Glu Gly Asn Asn Ala 460 465 470 TAC TAT GGG TTA AAC GTC TTC ACA GGC GAT GTT GAA AAC ATG ACT GAA 1492 Tyr Tyr Gly Leu Asn Val Phe Thr Gly Asp Val Glu Asn Met Thr Glu 475 480 485 AAC GGA GTA GTT GAA CCA TTA AGA GTT AAA ACT CAA GCT ATA CAA TCA 1540 Asn Gly Val Val Glu Pro Leu Arg Val Lys Thr Gln Ala Ile Gln Ser 490 495 500 GCT ACA GAA GCT ACA GAA ATG TTA TTA AGA ATA GAC GAT GTA ATC GCT 1588 Ala Thr Glu Ala Thr Glu Met Leu Leu Arg Ile Asp Asp Val Ile Ala 505 510 515 GCA GAA AAA TTA AGC GGC GGA TCT GGC GGA GAC ATG GGA GAC ATG GGC 1636 Ala Glu Lys Leu Ser Gly Gly Ser Gly Gly Asp Met Gly Asp Met Gly 520 525 530 535 GGA ATG GGA GGT ATG GGC GGA ATG ATG TAATTCCCCC TACGTCC 1680 Gly Met Gly Gly Met Gly Gly Met Met 540
【図1】実施例5及び6並びに比較例1及び2における
抗HBs抗体の抗体量と蛍光強度との関係を示すグラフ
である。縦軸は蛍光強度、横軸は抗HBs抗体の抗体量
を示す単位(mIU/mL)である。
抗HBs抗体の抗体量と蛍光強度との関係を示すグラフ
である。縦軸は蛍光強度、横軸は抗HBs抗体の抗体量
を示す単位(mIU/mL)である。
【図2】実施例7及び8並びに比較例3及び4における
抗HBs抗体の抗体量と吸光度変化量との関係を示すグ
ラフである。縦軸は吸光度変化量、横軸は抗HBs抗体
の抗体量を示す単位(mIU/mL)である。
抗HBs抗体の抗体量と吸光度変化量との関係を示すグ
ラフである。縦軸は吸光度変化量、横軸は抗HBs抗体
の抗体量を示す単位(mIU/mL)である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 古谷 昌弘 大阪府三島郡島本町百山2−1 積水化学 工業株式会社内 (72)発明者 高橋 英之 大阪府三島郡島本町百山2−1 積水化学 工業株式会社内
Claims (10)
- 【請求項1】 界面活性剤、還元剤及びタンパク質変性
剤からなる群より選択される少なくとも1種によって、
HBs抗原を小粒子化処理する工程、並びに、前記小粒
子化処理されたHBs抗原に、分子シャペロンを反応さ
せる工程からなる小粒子化HBs抗原の調製法であっ
て、前記小粒子化処理する工程と前記反応させる工程と
は、同時に行うことを特徴とする小粒子化HBs抗原の
調製法。 - 【請求項2】 界面活性剤、還元剤及びタンパク質変性
剤からなる群より選択される少なくとも1種によって、
HBs抗原を小粒子化処理する工程、並びに、前記小粒
子化処理されたHBs抗原に、分子シャペロンを反応さ
せる工程からなる小粒子化HBs抗原の調製法であっ
て、前記反応させる工程は、前記小粒子化処理する工程
を行った後に行うことを特徴とする小粒子化HBs抗原
の調製法。 - 【請求項3】 分子シャペロンは、不溶性担体に結合さ
れたものである請求項1又は2記載の小粒子化HBs抗
原の調製法。 - 【請求項4】 分子シャペロンは、古細菌から調製した
もの、又は、古細菌から調製したDNAから発現された
ものである請求項1、2又は3記載の小粒子化HBs抗
原の調製法。 - 【請求項5】 古細菌は、メタノコッカス属に属する菌
である請求項4記載の小粒子化HBs抗原の調製法。 - 【請求項6】 メタノコッカス属に属する菌は、メタノ
コッカス・サーモリソトロフィカス(Methanoc
occus thermolithotrophicu
s)又はメタノコッカス・ボルタエ(Methanoc
occus voltae)である請求項5記載の小粒
子化HBs抗原の調製法。 - 【請求項7】 請求項1、2、3、4、5又は6記載の
小粒子化HBs抗原の調製法により得られた小粒子化H
Bs抗原を、酵素標識することを特徴とする免疫測定試
薬の製造方法。 - 【請求項8】 請求項1、2、3、4、5又は6記載の
小粒子化HBs抗原の調製法により得られた小粒子化H
Bs抗原を、不溶性担体に担持させることを特徴とする
免疫測定試薬の製造方法。 - 【請求項9】 請求項7又は8記載の免疫測定試薬の製
造方法により製造されてなることを特徴とする免疫測定
試薬。 - 【請求項10】 請求項9記載の免疫測定試薬を用いる
ことを特徴とする免疫測定方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP10275007A JP2000105233A (ja) | 1998-09-29 | 1998-09-29 | 小粒子化HBs抗原の調製法並びにこれを用いた免疫測定試薬の製造方法、免疫測定試薬及び免疫測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP10275007A JP2000105233A (ja) | 1998-09-29 | 1998-09-29 | 小粒子化HBs抗原の調製法並びにこれを用いた免疫測定試薬の製造方法、免疫測定試薬及び免疫測定方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2000105233A true JP2000105233A (ja) | 2000-04-11 |
Family
ID=17549595
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP10275007A Pending JP2000105233A (ja) | 1998-09-29 | 1998-09-29 | 小粒子化HBs抗原の調製法並びにこれを用いた免疫測定試薬の製造方法、免疫測定試薬及び免疫測定方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2000105233A (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005111620A1 (ja) * | 2004-05-19 | 2005-11-24 | Advanced Life Science Institute, Inc. | B型肝炎ウィルスの検出方法 |
WO2008053900A1 (fr) * | 2006-10-30 | 2008-05-08 | Advanced Life Science Institute, Inc. | Procédé d'analyse immunologique à sensibilité élevée et réactif d'analyse immunologique pour le virus de l'hépatite b |
WO2019194280A1 (ja) * | 2018-04-06 | 2019-10-10 | 富士レビオ株式会社 | B型肝炎ウイルス抗原の免疫測定方法 |
-
1998
- 1998-09-29 JP JP10275007A patent/JP2000105233A/ja active Pending
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005111620A1 (ja) * | 2004-05-19 | 2005-11-24 | Advanced Life Science Institute, Inc. | B型肝炎ウィルスの検出方法 |
JPWO2005111620A1 (ja) * | 2004-05-19 | 2008-03-27 | 株式会社先端生命科学研究所 | B型肝炎ウイルスの検出方法 |
WO2008053900A1 (fr) * | 2006-10-30 | 2008-05-08 | Advanced Life Science Institute, Inc. | Procédé d'analyse immunologique à sensibilité élevée et réactif d'analyse immunologique pour le virus de l'hépatite b |
JP5332011B2 (ja) * | 2006-10-30 | 2013-11-06 | 株式会社先端生命科学研究所 | B型肝炎ウイルスの高感度免疫学的分析方法及び免疫学的分析用試薬 |
WO2019194280A1 (ja) * | 2018-04-06 | 2019-10-10 | 富士レビオ株式会社 | B型肝炎ウイルス抗原の免疫測定方法 |
JPWO2019194280A1 (ja) * | 2018-04-06 | 2021-05-20 | 富士レビオ株式会社 | B型肝炎ウイルス抗原の免疫測定方法 |
JP7320492B2 (ja) | 2018-04-06 | 2023-08-03 | 富士レビオ株式会社 | B型肝炎ウイルス抗原の免疫測定方法 |
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