JP2001066309A - ウイルス抗原の調製法 - Google Patents
ウイルス抗原の調製法Info
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- JP2001066309A JP2001066309A JP27320399A JP27320399A JP2001066309A JP 2001066309 A JP2001066309 A JP 2001066309A JP 27320399 A JP27320399 A JP 27320399A JP 27320399 A JP27320399 A JP 27320399A JP 2001066309 A JP2001066309 A JP 2001066309A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 抗原活性を高めたウイルス抗原を得ることが
できるウイルス抗原の調製法を提供する。 【解決手段】 ウイルス抗原にペプチジルプロリルシス
トランスイソメラーゼを反応させる工程からなるウイル
ス抗原の調製法。
できるウイルス抗原の調製法を提供する。 【解決手段】 ウイルス抗原にペプチジルプロリルシス
トランスイソメラーゼを反応させる工程からなるウイル
ス抗原の調製法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、抗原活性を高めたウイ
ルス抗原を得ることができるウイルス抗原の調製法なら
びに得られたウイルス抗原に関する。
ルス抗原を得ることができるウイルス抗原の調製法なら
びに得られたウイルス抗原に関する。
【０００２】
【従来技術】近年、ウイルス感染症の多様化に伴い、ウ
イルス感染を検出することへの重要性が増加している。
そのようなウイルス検出法の一つとして、ウイルスに対
する特異抗体が体内に作られたか否かを測定することに
より感染の有無を調べる免疫診断法がある。
イルス感染を検出することへの重要性が増加している。
そのようなウイルス検出法の一つとして、ウイルスに対
する特異抗体が体内に作られたか否かを測定することに
より感染の有無を調べる免疫診断法がある。
【０００３】例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）で
は、感染時の患者血清中には、直径４２ｎｍのＤａｎｅ
粒子と呼ばれる二本鎖ＤＮＡウイルスの他に、直径２２
ｎｍの小型球状粒子や同じ外径で長さ５０〜７００ｎｍ
の管状粒子が存在することが知られている。これらＨＢ
Ｖには、ＨＢＶの外被（ｓｕｒｆａｃｅ）、芯（ｃｏｒ
ｅ）に対応する表面抗原（ＨＢｓ抗原）、核抗原（ＨＢ
ｃ抗原）等が存在する。
は、感染時の患者血清中には、直径４２ｎｍのＤａｎｅ
粒子と呼ばれる二本鎖ＤＮＡウイルスの他に、直径２２
ｎｍの小型球状粒子や同じ外径で長さ５０〜７００ｎｍ
の管状粒子が存在することが知られている。これらＨＢ
Ｖには、ＨＢＶの外被（ｓｕｒｆａｃｅ）、芯（ｃｏｒ
ｅ）に対応する表面抗原（ＨＢｓ抗原）、核抗原（ＨＢ
ｃ抗原）等が存在する。
【０００４】このような各抗原に対する抗体の検出は、
臨床診断上重要である。特に、ＨＢｓ抗体はＨＢＶに対
する感染防御抗体であるので、過去にＨＢＶの感染があ
り既に排除されている場合やＨＢＶワクチン接種後であ
る場合に血中にＨＢｓ抗体が検出される。従って、ＨＢ
ｓ抗体が陽性であることは、ＨＢＶに対して抵抗性があ
り、再感染のおそれがないことを示すものである。
臨床診断上重要である。特に、ＨＢｓ抗体はＨＢＶに対
する感染防御抗体であるので、過去にＨＢＶの感染があ
り既に排除されている場合やＨＢＶワクチン接種後であ
る場合に血中にＨＢｓ抗体が検出される。従って、ＨＢ
ｓ抗体が陽性であることは、ＨＢＶに対して抵抗性があ
り、再感染のおそれがないことを示すものである。
【０００５】そのようなＨＢｓ抗体を検出する方法にお
いては、ＨＢｓ抗原を酵素で標識したり、不溶性担体に
吸着・固定化したものを試薬として用いる。そのためＨ
Ｂｓ抗原の大量調製系が必要であるが、現在では、その
ようなＨＢｓ抗原は、ＨＢｓ抗原陽性であってＨＢＶが
検出されない患者の血清から抽出された小型球状粒子が
主に用いられているが、血清の供給量が限られている等
の問題点があった。
いては、ＨＢｓ抗原を酵素で標識したり、不溶性担体に
吸着・固定化したものを試薬として用いる。そのためＨ
Ｂｓ抗原の大量調製系が必要であるが、現在では、その
ようなＨＢｓ抗原は、ＨＢｓ抗原陽性であってＨＢＶが
検出されない患者の血清から抽出された小型球状粒子が
主に用いられているが、血清の供給量が限られている等
の問題点があった。
【０００６】近年、遺伝子組み換え技術の進展により、
タンパク質の生産が実用化されており、ＨＢｓ抗原にお
いても、遺伝子組み換え技術による抗原タンパク質の生
産が試みられている。しかしながら、大腸菌を宿主とし
た場合、低分子量タンパク質が生産されるものの、それ
らは集合せず粒子状とはならないため、抗原活性は極め
て弱いものであった（Ｐｕｍｐｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｇｅ
ｎｅ，３０，２０１（１９８４））。また、酵母を宿主
とした場合、細胞から抗原タンパクの分泌が起こらず精
製が困難である等の問題点があった（Ｍｉｙａｎｏｈａ
ｒａ，Ａ ｅｔａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．，８０，１（１９８３））。
タンパク質の生産が実用化されており、ＨＢｓ抗原にお
いても、遺伝子組み換え技術による抗原タンパク質の生
産が試みられている。しかしながら、大腸菌を宿主とし
た場合、低分子量タンパク質が生産されるものの、それ
らは集合せず粒子状とはならないため、抗原活性は極め
て弱いものであった（Ｐｕｍｐｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｇｅ
ｎｅ，３０，２０１（１９８４））。また、酵母を宿主
とした場合、細胞から抗原タンパクの分泌が起こらず精
製が困難である等の問題点があった（Ｍｉｙａｎｏｈａ
ｒａ，Ａ ｅｔａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．，８０，１（１９８３））。
【０００７】そのため、宿主として大腸菌や酵母ではな
く、ＣＨＯ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｌ細胞等の培養細胞を
用いる系が考案、検討され、抗原活性を高めた抗原タン
パク質の生産も報告されている（特開昭６３−２３０６
３９号公報）。しかしながら、このような培養細胞は、
大腸菌や酵母等に比較して格段に培養日数がかかり、操
作も習熟した技術を要するため煩雑なものであり、大量
生産には不適であるという問題点があった。従って、培
養日数が短く、培養操作も簡便である大腸菌や酵母を宿
主とするものであって、抗原活性の高いウイルス抗原を
生産する系の開発が望まれている。
く、ＣＨＯ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｌ細胞等の培養細胞を
用いる系が考案、検討され、抗原活性を高めた抗原タン
パク質の生産も報告されている（特開昭６３−２３０６
３９号公報）。しかしながら、このような培養細胞は、
大腸菌や酵母等に比較して格段に培養日数がかかり、操
作も習熟した技術を要するため煩雑なものであり、大量
生産には不適であるという問題点があった。従って、培
養日数が短く、培養操作も簡便である大腸菌や酵母を宿
主とするものであって、抗原活性の高いウイルス抗原を
生産する系の開発が望まれている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記現状に
鑑み、抗原活性を高めたウイルス抗原を得ることができ
るウイルス抗原の調製法を提供することを目的とする。
鑑み、抗原活性を高めたウイルス抗原を得ることができ
るウイルス抗原の調製法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、ウイルス抗原
にペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ（以
下、「ＰＰＩアーゼ」ともいう。）を反応させる工程か
らなるウイルス抗原の調製法である。
にペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ（以
下、「ＰＰＩアーゼ」ともいう。）を反応させる工程か
らなるウイルス抗原の調製法である。
【００１０】上記ウイルス抗原としては特に限定され
ず、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓ抗
原）、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ抗原）、Ｃ型
肝炎ウイルス抗原（ＨＣＶ抗原）、エイズウイルス抗原
（ＨＩＶ抗原）等が挙げられる。
ず、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓ抗
原）、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ抗原）、Ｃ型
肝炎ウイルス抗原（ＨＣＶ抗原）、エイズウイルス抗原
（ＨＩＶ抗原）等が挙げられる。
【００１１】上記ウイルス抗原は、陽性患者血清等から
直接抽出したものや、大腸菌等の細菌及び酵母；ＣＨＯ
細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｌ細胞等の培養細胞を宿主とした
遺伝子組み換え法により発現されたもの等が挙げられる
が、培養日数が短い点及び培養操作が簡便な点並びに大
量に調製可能である点から、大腸菌等の細菌及び酵母を
宿主とした遺伝子組み換え法により発現されたものが好
ましい。
直接抽出したものや、大腸菌等の細菌及び酵母；ＣＨＯ
細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｌ細胞等の培養細胞を宿主とした
遺伝子組み換え法により発現されたもの等が挙げられる
が、培養日数が短い点及び培養操作が簡便な点並びに大
量に調製可能である点から、大腸菌等の細菌及び酵母を
宿主とした遺伝子組み換え法により発現されたものが好
ましい。
【００１２】例えば、大腸菌を用いた系では、菌体内に
生産されるタンパク質が顆粒として形成され、これら顆
粒化したタンパク質は不溶化して抗原活性を示さない場
合が多かった。顆粒形成がない場合でも、ウイルス抗原
では抗原タンパク質が特有の集合状態、即ち、球状粒子
にならなければ、抗原活性を示さない場合も多い。本発
明では、顆粒化し不溶化したものや球状粒子にならずに
抗原活性が低いウイルス抗原から、抗原活性を高めた粒
子状抗原を調製することができる点からも、細菌及び酵
母を宿主とした遺伝子組み換え法により発現されたもの
に好適に適用できる。
生産されるタンパク質が顆粒として形成され、これら顆
粒化したタンパク質は不溶化して抗原活性を示さない場
合が多かった。顆粒形成がない場合でも、ウイルス抗原
では抗原タンパク質が特有の集合状態、即ち、球状粒子
にならなければ、抗原活性を示さない場合も多い。本発
明では、顆粒化し不溶化したものや球状粒子にならずに
抗原活性が低いウイルス抗原から、抗原活性を高めた粒
子状抗原を調製することができる点からも、細菌及び酵
母を宿主とした遺伝子組み換え法により発現されたもの
に好適に適用できる。
【００１３】本発明のウイルス抗原の調製法において
は、上記ウイルス抗原にＰＰＩアーゼを反応させる工程
を含むものである。上記ウイルス抗原にＰＰＩアーゼを
反応させる工程を含むことによって、ウイルス抗原の立
体構造を安定化させたり、構造変化をすばやく修復する
ことにより、抗原活性の低下を防ぐものである。
は、上記ウイルス抗原にＰＰＩアーゼを反応させる工程
を含むものである。上記ウイルス抗原にＰＰＩアーゼを
反応させる工程を含むことによって、ウイルス抗原の立
体構造を安定化させたり、構造変化をすばやく修復する
ことにより、抗原活性の低下を防ぐものである。
【００１４】本発明で用いるＰＰＩアーゼとは、プロリ
ン残基のＮ末端側ペプチド結合の回転を促進する作用を
有する酵素である。タンパク質中の構成アミノ酸である
プロリン残基のＮ末端側ペプチド結合は、自由に回転で
きず、自発的なシス−トランス異性化が起こりにくい。
その結果、構造変化が生じた際にタンパク質鎖の正常構
造への変換は、そのようなプロリンのシス−トランス異
性化反応等が律速となり、自発的な再生が阻害される。
この異性化反応を促進させるＰＰＩアーゼは、タンパク
質の高次構造の再生を促進し、変性タンパク質を再生さ
せることができる酵素である。
ン残基のＮ末端側ペプチド結合の回転を促進する作用を
有する酵素である。タンパク質中の構成アミノ酸である
プロリン残基のＮ末端側ペプチド結合は、自由に回転で
きず、自発的なシス−トランス異性化が起こりにくい。
その結果、構造変化が生じた際にタンパク質鎖の正常構
造への変換は、そのようなプロリンのシス−トランス異
性化反応等が律速となり、自発的な再生が阻害される。
この異性化反応を促進させるＰＰＩアーゼは、タンパク
質の高次構造の再生を促進し、変性タンパク質を再生さ
せることができる酵素である。
【００１５】本発明で用いられるＰＰＩアーゼとして
は、シクロフィリン（Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ：免疫抑
制剤であるサイクロスポリンＡへの結合タンパク質）タ
イプ及びＦＫＢＰ（免疫抑制剤であるＦＫ５０６への結
合タンパク質）タイプのうち、少なくとも１種以上のＰ
ＰＩアーゼを用いることができる。
は、シクロフィリン（Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ：免疫抑
制剤であるサイクロスポリンＡへの結合タンパク質）タ
イプ及びＦＫＢＰ（免疫抑制剤であるＦＫ５０６への結
合タンパク質）タイプのうち、少なくとも１種以上のＰ
ＰＩアーゼを用いることができる。
【００１６】上記ＰＰＩアーゼは、真核生物、真正細菌
若しくは古細菌から調製したもの、又は、真核生物、真
正細菌若しくは古細菌から調製したＤＮＡから発現され
たものを用いることができる。
若しくは古細菌から調製したもの、又は、真核生物、真
正細菌若しくは古細菌から調製したＤＮＡから発現され
たものを用いることができる。
【００１７】上記真核生物由来のＰＰＩアーゼとしては
特に限定されず、例えば、ブタ由来の１９ＫＰＰＩアー
ゼ、ショウジョウバエ由来のｎｉｎａＡ産物、トマトや
トウモロコシ等の高等植物由来のシクロフィリン（Ｃｙ
ｃｌｏｐｈｉｌｉｎ）、アカパンカビ由来のシクロフィ
リン（Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ）、Ｎｃ−ＦＫＢＰ、酵
母由来のシクロフィリン（Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ）、
ＣＲＧタンパク質、Ｓｃ−ＦＫＢＰ等が挙げられる。ま
た、例えば、シグマ社から市販されているシクロフィリ
ン（Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ）タイプのＰＰＩアーゼ
（子牛胸腺由来）やＦＫＢＰタイプのＰＰＩアーゼ（ヒ
ト由来）等が手軽に入手できる。
特に限定されず、例えば、ブタ由来の１９ＫＰＰＩアー
ゼ、ショウジョウバエ由来のｎｉｎａＡ産物、トマトや
トウモロコシ等の高等植物由来のシクロフィリン（Ｃｙ
ｃｌｏｐｈｉｌｉｎ）、アカパンカビ由来のシクロフィ
リン（Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ）、Ｎｃ−ＦＫＢＰ、酵
母由来のシクロフィリン（Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ）、
ＣＲＧタンパク質、Ｓｃ−ＦＫＢＰ等が挙げられる。ま
た、例えば、シグマ社から市販されているシクロフィリ
ン（Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ）タイプのＰＰＩアーゼ
（子牛胸腺由来）やＦＫＢＰタイプのＰＰＩアーゼ（ヒ
ト由来）等が手軽に入手できる。
【００１８】上記真正細菌由来のＰＰＩアーゼとしては
特に限定されず、例えば、大腸菌由来のＰＰＩアーゼ−
α、ＰＰＩアーゼ−β等が挙げられる（タンパク質核酸
酵素Ｖｏｌ．３６、Ｎｏ．１１（１９９１））。
特に限定されず、例えば、大腸菌由来のＰＰＩアーゼ−
α、ＰＰＩアーゼ−β等が挙げられる（タンパク質核酸
酵素Ｖｏｌ．３６、Ｎｏ．１１（１９９１））。
【００１９】上記古細菌としては、例えば、スルホロバ
ス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）属、デスルホロコッカス
（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ピロディクテ
ィム（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ）属、サーモフィラス
（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｌｕｍ）属、サーモプロテウス（Ｔ
ｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ）属、ピロバキュラム（Ｐｙ
ｒｏｂａｃｕｌｍ）属、ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃ
ｃｕｓ）属、メサノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ）属、メタノコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏ
ｃｏｃｃｕｓ）属、メサノピラス（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙ
ｒｕｓ）属、メサノサーマス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒ
ｍｕｓ）属、アーキアブロブス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏ
ｂｕｓ）属、ハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ）属、メサノプラナス（Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎ
ｕｓ）属、メサノスピリラム（Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒ
ｉｌｌｕｍ）属、メサノサルシア（Ｍｅｔｈａｎｏｓａ
ｒｃｉｎａ）属由来のものが使用できる。上記古細菌の
中でも、特に、メタノコッカス属古細菌から調製したも
の、又は、メタノコッカス属古細菌から調製したＤＮＡ
から発現されたものが好ましい。
ス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）属、デスルホロコッカス
（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ピロディクテ
ィム（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ）属、サーモフィラス
（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｌｕｍ）属、サーモプロテウス（Ｔ
ｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ）属、ピロバキュラム（Ｐｙ
ｒｏｂａｃｕｌｍ）属、ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃ
ｃｕｓ）属、メサノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ）属、メタノコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏ
ｃｏｃｃｕｓ）属、メサノピラス（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙ
ｒｕｓ）属、メサノサーマス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒ
ｍｕｓ）属、アーキアブロブス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏ
ｂｕｓ）属、ハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ）属、メサノプラナス（Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｎ
ｕｓ）属、メサノスピリラム（Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒ
ｉｌｌｕｍ）属、メサノサルシア（Ｍｅｔｈａｎｏｓａ
ｒｃｉｎａ）属由来のものが使用できる。上記古細菌の
中でも、特に、メタノコッカス属古細菌から調製したも
の、又は、メタノコッカス属古細菌から調製したＤＮＡ
から発現されたものが好ましい。
【００２０】上記メタノコッカス属菌とは、海洋性古細
菌のメタン生成菌に属し、水素、二酸化炭素及びギ酸か
らメタンを生成することを特徴とする球状菌群である。
上記メタノコッカス属菌は、その至適生育温度から中温
菌と高温菌に分類され、高温菌にはメタノコッカス・ヤ
ンナシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓ
ｃｈｉｉ：最適温度８５℃）、メタノコッカス・サーモ
リソトロフィカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈ
ｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ：ＡＴＣＣ３５
０９７、最適温度６５℃）の２種がある。最適温度が２
０〜４０℃である中温菌には、メタノコッカス・ボルタ
エ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｕｕｓｖｏｌｔａｅ：ＡＴＣ
Ｃ３３２７３）、メタノコッカス・デルタエ（Ｍｅｔｈ
ａｎｏｃｏｃｕｕｓ ｄｅｌｔａｅ：ＡＴＣＣ３５２９
４）、メタノコッカス・フリシュス（Ｍｅｔｈａｎｏｃ
ｏｃｕｕｓ ｆｒｉｓｉｕｓ：ＡＴＣＣ４３３４０）、
メタノコッカス・マリパルディス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏ
ｃｕｕｓ ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ：ＡＴＣＣ４３００
０）、メタノコッカス・バンニエリ（Ｍｅｔｈａｎｏｃ
ｏｃｕｕｓ ｖａｎｎｉｅｌｉｉ：ＡＴＣＣ３５０８
９）等が挙げられる。
菌のメタン生成菌に属し、水素、二酸化炭素及びギ酸か
らメタンを生成することを特徴とする球状菌群である。
上記メタノコッカス属菌は、その至適生育温度から中温
菌と高温菌に分類され、高温菌にはメタノコッカス・ヤ
ンナシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓ
ｃｈｉｉ：最適温度８５℃）、メタノコッカス・サーモ
リソトロフィカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈ
ｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ：ＡＴＣＣ３５
０９７、最適温度６５℃）の２種がある。最適温度が２
０〜４０℃である中温菌には、メタノコッカス・ボルタ
エ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｕｕｓｖｏｌｔａｅ：ＡＴＣ
Ｃ３３２７３）、メタノコッカス・デルタエ（Ｍｅｔｈ
ａｎｏｃｏｃｕｕｓ ｄｅｌｔａｅ：ＡＴＣＣ３５２９
４）、メタノコッカス・フリシュス（Ｍｅｔｈａｎｏｃ
ｏｃｕｕｓ ｆｒｉｓｉｕｓ：ＡＴＣＣ４３３４０）、
メタノコッカス・マリパルディス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏ
ｃｕｕｓ ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ：ＡＴＣＣ４３００
０）、メタノコッカス・バンニエリ（Ｍｅｔｈａｎｏｃ
ｏｃｕｕｓ ｖａｎｎｉｅｌｉｉ：ＡＴＣＣ３５０８
９）等が挙げられる。
【００２１】上記メタノコッカス属菌は、大腸菌のよう
に７〜８種類のＰＰＩアーゼを有しそれぞれが複雑に作
用しあうといったものでなく、ＰＰＩアーゼを１又は２
種類しか有さないため、タンパク質に対する汎用性は高
い。本発明で用いられるＰＰＩアーゼは、上記メタノコ
ッカス属細菌から直接精製して得ることもできるが、こ
れらの生物のＰＰＩアーゼをコードするＤＮＡ塩基配列
をクローニングし、大腸菌や酵母等の生育の速い生物に
組み込んで調製することが、大量に生産できるので好ま
しい。
に７〜８種類のＰＰＩアーゼを有しそれぞれが複雑に作
用しあうといったものでなく、ＰＰＩアーゼを１又は２
種類しか有さないため、タンパク質に対する汎用性は高
い。本発明で用いられるＰＰＩアーゼは、上記メタノコ
ッカス属細菌から直接精製して得ることもできるが、こ
れらの生物のＰＰＩアーゼをコードするＤＮＡ塩基配列
をクローニングし、大腸菌や酵母等の生育の速い生物に
組み込んで調製することが、大量に生産できるので好ま
しい。
【００２２】上記ＰＰＩアーゼを直接精製して得る方法
としては特に限定されず、例えば、以下の方法によって
得ることができる。上記細菌を、例えば、海水ベース培
地（酵母エキス２ｇ、バクトトリプトン２ｇ、酢酸ナト
リウム１ｇ、ＰＩＰＥＳ１．７ｇ、ＤＡＢビタミン溶液
１０ｍＬ／Ｌ海水ｐＨ６．８）中で培養し、嫌気条件及
び水素／炭酸ガス（４：１）の混合ガスの通気下で３７
℃で一昼夜培養し菌体を回収する。回収した菌体を２５
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁することにより
細胞を浸透圧ショックにより破砕し、上清を遠心分離に
より回収した後、疎水クロマトグラフィー（Ｂｕｔｙｌ
ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム：アマシャムファルマシア社
製等）、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Ｓｕｐｅ
ｒｒｏｓｅ１２ＨＲカラム：アマシャムファルマシア社
製等）、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（Ｍｏ
ｎｏＱ：アマシャムファルマシア社製）によりＰＰＩア
ーゼ活性画分を回収することができる。
としては特に限定されず、例えば、以下の方法によって
得ることができる。上記細菌を、例えば、海水ベース培
地（酵母エキス２ｇ、バクトトリプトン２ｇ、酢酸ナト
リウム１ｇ、ＰＩＰＥＳ１．７ｇ、ＤＡＢビタミン溶液
１０ｍＬ／Ｌ海水ｐＨ６．８）中で培養し、嫌気条件及
び水素／炭酸ガス（４：１）の混合ガスの通気下で３７
℃で一昼夜培養し菌体を回収する。回収した菌体を２５
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁することにより
細胞を浸透圧ショックにより破砕し、上清を遠心分離に
より回収した後、疎水クロマトグラフィー（Ｂｕｔｙｌ
ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム：アマシャムファルマシア社
製等）、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Ｓｕｐｅ
ｒｒｏｓｅ１２ＨＲカラム：アマシャムファルマシア社
製等）、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（Ｍｏ
ｎｏＱ：アマシャムファルマシア社製）によりＰＰＩア
ーゼ活性画分を回収することができる。
【００２３】上記得られた画分は、ＳＤＳポリアクリル
アミドゲル電気泳動によって、単一画分であることを確
認することができる。上記精製において、ＰＰＩアーゼ
活性は、α−キモトリプシン反応とのカップリングアッ
セイ法により確認することができる。例えば、ＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液（ｐＨ７．８）中、Ｎ末端がＮ−スクシニル基
及びＣ末端がｐ−ニトロアニリドでそれぞれ修飾された
Ｎ−ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ
又はＮ−ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ｐ
ＮＡのペプチド（最終濃度１７μＭ）を基質として、サ
ンプルをセルに注入した後、２５℃でインキュベート
し、キモトリプシン溶液を添加することにより反応を開
始する。終始攪拌下、ｐＮＡの遊離による３９０ｎｍの
吸収増加をモニターすることにより酵素活性を測定する
ことができる。上記基質であるペプチドとしては、商品
名「Ｎ−ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐ
−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ」（シグマ社製）の市販品
を使用することもできる。
アミドゲル電気泳動によって、単一画分であることを確
認することができる。上記精製において、ＰＰＩアーゼ
活性は、α−キモトリプシン反応とのカップリングアッ
セイ法により確認することができる。例えば、ＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液（ｐＨ７．８）中、Ｎ末端がＮ−スクシニル基
及びＣ末端がｐ−ニトロアニリドでそれぞれ修飾された
Ｎ−ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ
又はＮ−ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ｐ
ＮＡのペプチド（最終濃度１７μＭ）を基質として、サ
ンプルをセルに注入した後、２５℃でインキュベート
し、キモトリプシン溶液を添加することにより反応を開
始する。終始攪拌下、ｐＮＡの遊離による３９０ｎｍの
吸収増加をモニターすることにより酵素活性を測定する
ことができる。上記基質であるペプチドとしては、商品
名「Ｎ−ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐ
−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ」（シグマ社製）の市販品
を使用することもできる。
【００２４】上記メタノコッカス属細菌から調製したＤ
ＮＡから発現させる手法としては、「新生物化学実験の
手引き」（化学同人社）等に記載された遺伝子実験プロ
トコール等の常法を応用することができる。
ＮＡから発現させる手法としては、「新生物化学実験の
手引き」（化学同人社）等に記載された遺伝子実験プロ
トコール等の常法を応用することができる。
【００２５】上記メタノコッカス属細菌のＰＰＩアーゼ
のＤＮＡ配列、酵素確認法等は、例えば、特開平１０−
９１号公報、特願平９−２３５９９９号に記載されてお
り、それを利用することができる。一例として、メタノ
コッカス・サーモリソトロフィカス由来のＰＰＩアーゼ
のＤＮＡ配列を配列表の配列番号１に、そのアミノ酸配
列を配列番号２に示す。上記ＤＮＡから発現させる手法
としては、例えば、適当な制限酵素サイトを含むように
その一部の塩基配列を合成してＰＣＲ用プライマーを作
製する。次いで、メタノコッカス属細菌のゲノムＤＮＡ
を鋳型として、ＰＣＲによって増幅させる。ＰＣＲ産物
から得られるＰＰＩアーゼ遺伝子を適当な耐性マーカー
を含むプラスミドベクターに挿入し、得られたプラスミ
ドで大腸菌や酵母等の生育の速い生物を形質転換する。
形質転換体を培養し、培養菌体より疎水クロマトグラフ
ィー、イオン交換クロマトグラフィー等の常法に従って
精製し、ＰＰＩアーゼを得ることができる。
のＤＮＡ配列、酵素確認法等は、例えば、特開平１０−
９１号公報、特願平９−２３５９９９号に記載されてお
り、それを利用することができる。一例として、メタノ
コッカス・サーモリソトロフィカス由来のＰＰＩアーゼ
のＤＮＡ配列を配列表の配列番号１に、そのアミノ酸配
列を配列番号２に示す。上記ＤＮＡから発現させる手法
としては、例えば、適当な制限酵素サイトを含むように
その一部の塩基配列を合成してＰＣＲ用プライマーを作
製する。次いで、メタノコッカス属細菌のゲノムＤＮＡ
を鋳型として、ＰＣＲによって増幅させる。ＰＣＲ産物
から得られるＰＰＩアーゼ遺伝子を適当な耐性マーカー
を含むプラスミドベクターに挿入し、得られたプラスミ
ドで大腸菌や酵母等の生育の速い生物を形質転換する。
形質転換体を培養し、培養菌体より疎水クロマトグラフ
ィー、イオン交換クロマトグラフィー等の常法に従って
精製し、ＰＰＩアーゼを得ることができる。
【００２６】上記ゲノムＤＮＡとしては、特願平９−３
５０６２３号記載の方法に従って調製することができ
る。例えば、メタノコッカス・サーモリソトロフィカス
ＤＳＭ２０９５株を使用する場合、６５℃、嫌気条
件、Ｈ2 ／ＣＯ2 （４：１）混合ガスの通気（２００ｍ
Ｌ／分）条件下で上記菌株を培養し、菌体１．０ｇを１
０ｍＬのＴＮＥ緩衝液（２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ
８．０）、１００ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭＥＤＴＡ）に
懸濁し、温度を５０℃とした後、これに０．０５ｍＬの
プロテイナーゼＫ溶液 (２０ｍｇ／ｍＬ) を添加し、４
時間振盪培養を行う。この培養液にフェノール処理、ク
ロロホルム処理を行った後、０．０５ｍＬのＲＮａｓｅ
Ａ溶液 (０．５ｍｇ／ｍＬ）を添加し、３７℃で１時
間放置する。放置後の溶液に再び１ｍＬの１０％ＳＤＳ
溶液、０．０５ｍＬのプロテイナーゼＫ溶液 (２０ｍｇ
／ｍＬ）を添加し、再度５０℃で７０分放置する。更
に、これにフェノール処理、クロロホルム処理を行った
後（このときの溶液量は１０ｍＬ）、１ｍＬの３Ｍ酢酸
ナトリウム溶液 (ｐＨ５．２）、２５ｍＬのエタノール
を添加し、−２０℃で２時間放置する。放置後の溶液を
高速遠心機で遠心し、ＤＮＡを沈殿させ、沈殿を３ｍＬ
の７０％エタノール溶液で洗浄し、遠心エバポレーター
で乾固させた後、ＴＮＥ緩衝液０．５ｍＬに溶解する。
この操作により約２ｍｇのゲノムＤＮＡを得ることがで
きる。
５０６２３号記載の方法に従って調製することができ
る。例えば、メタノコッカス・サーモリソトロフィカス
ＤＳＭ２０９５株を使用する場合、６５℃、嫌気条
件、Ｈ2 ／ＣＯ2 （４：１）混合ガスの通気（２００ｍ
Ｌ／分）条件下で上記菌株を培養し、菌体１．０ｇを１
０ｍＬのＴＮＥ緩衝液（２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ
８．０）、１００ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭＥＤＴＡ）に
懸濁し、温度を５０℃とした後、これに０．０５ｍＬの
プロテイナーゼＫ溶液 (２０ｍｇ／ｍＬ) を添加し、４
時間振盪培養を行う。この培養液にフェノール処理、ク
ロロホルム処理を行った後、０．０５ｍＬのＲＮａｓｅ
Ａ溶液 (０．５ｍｇ／ｍＬ）を添加し、３７℃で１時
間放置する。放置後の溶液に再び１ｍＬの１０％ＳＤＳ
溶液、０．０５ｍＬのプロテイナーゼＫ溶液 (２０ｍｇ
／ｍＬ）を添加し、再度５０℃で７０分放置する。更
に、これにフェノール処理、クロロホルム処理を行った
後（このときの溶液量は１０ｍＬ）、１ｍＬの３Ｍ酢酸
ナトリウム溶液 (ｐＨ５．２）、２５ｍＬのエタノール
を添加し、−２０℃で２時間放置する。放置後の溶液を
高速遠心機で遠心し、ＤＮＡを沈殿させ、沈殿を３ｍＬ
の７０％エタノール溶液で洗浄し、遠心エバポレーター
で乾固させた後、ＴＮＥ緩衝液０．５ｍＬに溶解する。
この操作により約２ｍｇのゲノムＤＮＡを得ることがで
きる。
【００２７】上記メタノコッカス属の中で、メタノコッ
カス・サーモリソトロフィカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｔｈｅｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）か
ら得られたＰＰＩアーゼは、熱安定性に優れており、９
０℃及び１００℃といった高温条件下で放置しても失活
しにくい。これまで市販されているＰＰＩアーゼは、６
５℃でほとんど失活してしまうため高温条件下で用いる
ことはできなかった。しかしながら、上記メタノコッカ
ス・サーモリソトロフィカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｔｈｅｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）から
得られたＰＰＩアーゼは、３７〜６５℃といった中温だ
けでなく、８０〜９０℃といった高温条件下でも使用可
能である。更に、これらの耐熱性ＰＰＩアーゼの特徴
は、その活性が長期にわたって保存されるという点であ
る。
カス・サーモリソトロフィカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｔｈｅｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）か
ら得られたＰＰＩアーゼは、熱安定性に優れており、９
０℃及び１００℃といった高温条件下で放置しても失活
しにくい。これまで市販されているＰＰＩアーゼは、６
５℃でほとんど失活してしまうため高温条件下で用いる
ことはできなかった。しかしながら、上記メタノコッカ
ス・サーモリソトロフィカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｔｈｅｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）から
得られたＰＰＩアーゼは、３７〜６５℃といった中温だ
けでなく、８０〜９０℃といった高温条件下でも使用可
能である。更に、これらの耐熱性ＰＰＩアーゼの特徴
は、その活性が長期にわたって保存されるという点であ
る。
【００２８】上記メタノコッカス・サーモリソトロフィ
カス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｍｏｌｉｔｈ
ｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）由来のＰＰＩアーゼは、他のＰ
ＰＩアーゼが有するペプチジルプロリンシスートランス
異性化作用及びポリペプチド鎖の折り畳み作用だけでな
く、シャペロニン様のタンパク質の不可逆的凝集抑制作
用も併せ持つため、ウイルス抗原を安定化する効果が大
きい。
カス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｍｏｌｉｔｈ
ｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）由来のＰＰＩアーゼは、他のＰ
ＰＩアーゼが有するペプチジルプロリンシスートランス
異性化作用及びポリペプチド鎖の折り畳み作用だけでな
く、シャペロニン様のタンパク質の不可逆的凝集抑制作
用も併せ持つため、ウイルス抗原を安定化する効果が大
きい。
【００２９】上記メタノコッカス属の中温菌の中で、特
に、メタノコッカス・ボルタエ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｖｏｌｔａｅ）から得られるＰＰＩアーゼは、
メタノコッカス・サーモリソトロフィカス（Ｍｅｔｈａ
ｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉ
ｃｕｓ）のＰＰＩアーゼと同様に、ペプチジルプロリル
シス−トランス異性化作用及びポリペプチド鎖の折り畳
み作用だけでなく、シャペロニン様のタンパク質の不可
逆的凝集抑制作用も併せ持つため、ウイルス抗原を安定
化する効果が大きい。
に、メタノコッカス・ボルタエ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｖｏｌｔａｅ）から得られるＰＰＩアーゼは、
メタノコッカス・サーモリソトロフィカス（Ｍｅｔｈａ
ｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉ
ｃｕｓ）のＰＰＩアーゼと同様に、ペプチジルプロリル
シス−トランス異性化作用及びポリペプチド鎖の折り畳
み作用だけでなく、シャペロニン様のタンパク質の不可
逆的凝集抑制作用も併せ持つため、ウイルス抗原を安定
化する効果が大きい。
【００３０】上記メタノコッカス・ボルタエ（Ｍｅｔｈ
ａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｖｏｌｔａｅ）は、中温菌である
ため、同菌由来のＰＰＩアーゼは４〜４０℃の広い範囲
でウイルス抗原を安定化する効果がある。
ａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｖｏｌｔａｅ）は、中温菌である
ため、同菌由来のＰＰＩアーゼは４〜４０℃の広い範囲
でウイルス抗原を安定化する効果がある。
【００３１】本発明は、上記ウイルス抗原に上記ＰＰＩ
アーゼを反応させる工程からなる。上記ウイルス抗原の
希釈液としては特に限定されず、例えば、リン酸緩衝
液、トリス緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、ト
リス塩酸緩衝液等が挙げられる。上記希釈液のイオン強
度としてはウイルス抗原に好適なものであれば特に限定
されないが、ＮａＣｌを０．０５〜１Ｍ含むことが好ま
しい。上記希釈液のｐＨは特に限定されず、例えば、ｐ
Ｈ４．５〜９．０の範囲が挙げられる。これにウイルス
抗原を適量添加し、ウイルス抗原液とする。ウイルス抗
原濃度としては特に限定されず、通常、０．００１〜１
０ｍｇ／ｍＬである。
アーゼを反応させる工程からなる。上記ウイルス抗原の
希釈液としては特に限定されず、例えば、リン酸緩衝
液、トリス緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、ト
リス塩酸緩衝液等が挙げられる。上記希釈液のイオン強
度としてはウイルス抗原に好適なものであれば特に限定
されないが、ＮａＣｌを０．０５〜１Ｍ含むことが好ま
しい。上記希釈液のｐＨは特に限定されず、例えば、ｐ
Ｈ４．５〜９．０の範囲が挙げられる。これにウイルス
抗原を適量添加し、ウイルス抗原液とする。ウイルス抗
原濃度としては特に限定されず、通常、０．００１〜１
０ｍｇ／ｍＬである。
【００３２】上記ＰＰＩアーゼを溶解させる液及びその
ｐＨとしては特に限定されず、例えば、上記ウイルス抗
原希釈液として例示したもの等が挙げられ、その緩衝液
の濃度は０．０５〜１Ｍが好ましい。上記希釈液中のイ
オン強度としてはＰＰＩアーゼ反応に好適なものであれ
ば特に限定されず、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣ
ｌ2 、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 等を０．０１〜２Ｍ含むこと
が好ましい。上記ＰＰＩアーゼを溶解させて反応を行う
溶液を、本明細書中においては、粒子構成化反応液とも
いう。このような粒子構成化反応液にＰＰＩアーゼを溶
解して用いるが、その濃度は、通常、０．００１〜１０
ｍｇ／ｍＬである。
ｐＨとしては特に限定されず、例えば、上記ウイルス抗
原希釈液として例示したもの等が挙げられ、その緩衝液
の濃度は０．０５〜１Ｍが好ましい。上記希釈液中のイ
オン強度としてはＰＰＩアーゼ反応に好適なものであれ
ば特に限定されず、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣ
ｌ2 、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 等を０．０１〜２Ｍ含むこと
が好ましい。上記ＰＰＩアーゼを溶解させて反応を行う
溶液を、本明細書中においては、粒子構成化反応液とも
いう。このような粒子構成化反応液にＰＰＩアーゼを溶
解して用いるが、その濃度は、通常、０．００１〜１０
ｍｇ／ｍＬである。
【００３３】上記ウイルス抗原と上記ＰＰＩアーゼとの
反応においては、ＰＰＩアーゼをモル比でウイルス抗原
の０．０１〜２００倍程度となるように混合して作用さ
せる。０．０１倍未満では充分な反応が行われず、２０
０倍を超えると効果が変わらず夾雑物として副反応を起
こす可能性が高い。好ましくは０．０５〜５０倍程度で
ある。
反応においては、ＰＰＩアーゼをモル比でウイルス抗原
の０．０１〜２００倍程度となるように混合して作用さ
せる。０．０１倍未満では充分な反応が行われず、２０
０倍を超えると効果が変わらず夾雑物として副反応を起
こす可能性が高い。好ましくは０．０５〜５０倍程度で
ある。
【００３４】上記ＰＰＩアーゼの反応条件としては、例
えば、４〜６０℃中で３０分〜７２時間インキュベーシ
ョンすることが挙げられる。所望により、更に長時間イ
ンキュベーションしてもよい。
えば、４〜６０℃中で３０分〜７２時間インキュベーシ
ョンすることが挙げられる。所望により、更に長時間イ
ンキュベーションしてもよい。
【００３５】上記粒子構成化反応液中には、ジスルフィ
ド（−ＳＳ−）再結合促進を目的として、ＳＳ結合反応
促進効果を有するプロテインジスルフィドイソメラーゼ
（ＰＤＩ）、チオレドキシン、酸化型グルタチオン、還
元型グルタチオン等を添加してもよい。さらに上記粒子
構成反応液中には、粒子をより構成しやすくするため
に、粒子の外被となりうる脂質膜成分を添加してもよ
い。脂質膜成分は脂質膜を形成できるものであれば特に
限定されず、例えば、ホスファチジルコリン、スフィン
ゴミエリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグ
リセロール、ホスファチジルエタールアミン、ホスファ
チジルイノシトールやカルジオライピン、ホスファチジ
ン酸、セレブロシド、リゾホスファチジルコリン、リゾ
ホスファチジルエタールアミンなどが挙げられる。添加
する方法は上記脂質膜成分をエタノールなどの有機溶媒
に溶解させて添加してもよく、あるいは界面活性剤等の
液に上記脂質膜成分を溶解させて添加し粒子構成後、透
析などで界面活性剤を除去してもよい。脂質膜成分の添
加量は反応液中のウイルス抗原の蛋白濃度（ｍｇ／ｍ
ｌ）に対して０．００５〜５０倍程度の濃度が適してお
り、０．０５〜２０倍程度の濃度が特に適している。
ド（−ＳＳ−）再結合促進を目的として、ＳＳ結合反応
促進効果を有するプロテインジスルフィドイソメラーゼ
（ＰＤＩ）、チオレドキシン、酸化型グルタチオン、還
元型グルタチオン等を添加してもよい。さらに上記粒子
構成反応液中には、粒子をより構成しやすくするため
に、粒子の外被となりうる脂質膜成分を添加してもよ
い。脂質膜成分は脂質膜を形成できるものであれば特に
限定されず、例えば、ホスファチジルコリン、スフィン
ゴミエリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグ
リセロール、ホスファチジルエタールアミン、ホスファ
チジルイノシトールやカルジオライピン、ホスファチジ
ン酸、セレブロシド、リゾホスファチジルコリン、リゾ
ホスファチジルエタールアミンなどが挙げられる。添加
する方法は上記脂質膜成分をエタノールなどの有機溶媒
に溶解させて添加してもよく、あるいは界面活性剤等の
液に上記脂質膜成分を溶解させて添加し粒子構成後、透
析などで界面活性剤を除去してもよい。脂質膜成分の添
加量は反応液中のウイルス抗原の蛋白濃度（ｍｇ／ｍ
ｌ）に対して０．００５〜５０倍程度の濃度が適してお
り、０．０５〜２０倍程度の濃度が特に適している。
【００３６】本発明２は、ウイルス抗原を界面活性剤、
還元剤及びタンパク質変性剤からなる群より選択される
少なくとも一種によって処理する工程、並びに、上記処
理されたウイルス抗原にペプチジルプロリルシストラン
スイソメラーゼを反応させる工程からなるウイルス抗原
の調製法である。
還元剤及びタンパク質変性剤からなる群より選択される
少なくとも一種によって処理する工程、並びに、上記処
理されたウイルス抗原にペプチジルプロリルシストラン
スイソメラーゼを反応させる工程からなるウイルス抗原
の調製法である。
【００３７】本発明２においては、ウイルス抗原を界面
活性剤、還元剤及びタンパク質変性剤からなる群より選
択される少なくとも一種によって処理する工程を含むも
のである。上記ウイルス抗原としては、例えば、本発明
１で例示したもの等が挙げられる。
活性剤、還元剤及びタンパク質変性剤からなる群より選
択される少なくとも一種によって処理する工程を含むも
のである。上記ウイルス抗原としては、例えば、本発明
１で例示したもの等が挙げられる。
【００３８】上記界面活性剤は、脂質を除去可能なもの
であれば特に限定されず、例えば、ドデシル硫酸ナトリ
ウム（ＳＤＳ）、ドデシルスルホン硫酸ナトリウム、コ
ール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、３−
［（コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１
−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、オクチルグルコ
シド（ＯＧ）、オクチルチオグルコシド、ノナノイル−
Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ−９）、ポリオキシエ
チレンドデシルエーテル（Ｂｒｉｊｉ）、ポリオキシエ
チレンｉ−オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ）、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（Ｎ
ｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０）、ポリオキシエチレン脂肪酸
エステル（Ｓｐａｎ）、ポリオキシエチレンソルビトー
ルエステル（Ｔｗｅｅｎ）等が挙げられる。上記界面活
性剤の使用濃度は、処理するウイルス抗原濃度によって
異なるが、０．０１〜２０％の範囲であることが好まし
い。
であれば特に限定されず、例えば、ドデシル硫酸ナトリ
ウム（ＳＤＳ）、ドデシルスルホン硫酸ナトリウム、コ
ール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、３−
［（コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１
−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、オクチルグルコ
シド（ＯＧ）、オクチルチオグルコシド、ノナノイル−
Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ−９）、ポリオキシエ
チレンドデシルエーテル（Ｂｒｉｊｉ）、ポリオキシエ
チレンｉ−オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ）、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（Ｎ
ｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０）、ポリオキシエチレン脂肪酸
エステル（Ｓｐａｎ）、ポリオキシエチレンソルビトー
ルエステル（Ｔｗｅｅｎ）等が挙げられる。上記界面活
性剤の使用濃度は、処理するウイルス抗原濃度によって
異なるが、０．０１〜２０％の範囲であることが好まし
い。
【００３９】上記還元剤は、タンパク質のジスルフィド
結合を解離させるものであれば特に限定されず、例え
ば、β−メルカプトエタノール、２−メルカプトエチル
アミン、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリス
ルトール（ＤＴＥ）、水素化ホウ素ナトリウム、モノチ
オリン酸等が挙げられる。上記還元剤の使用濃度として
は、処理するウイルス抗原の濃度によって異なるが、通
常は溶液中の濃度が０．０１〜２００ｍＭとなるように
用いることができる。
結合を解離させるものであれば特に限定されず、例え
ば、β−メルカプトエタノール、２−メルカプトエチル
アミン、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリス
ルトール（ＤＴＥ）、水素化ホウ素ナトリウム、モノチ
オリン酸等が挙げられる。上記還元剤の使用濃度として
は、処理するウイルス抗原の濃度によって異なるが、通
常は溶液中の濃度が０．０１〜２００ｍＭとなるように
用いることができる。
【００４０】上記タンパク質変性剤は、タンパク質の高
次構造をほぐしポリペプチド側鎖間の水素結合、疎水性
相互作用を解離するものであれば特に限定されず、例え
ば、グアニジン塩酸塩（Ｇｄｍ−ＨＣｌ）、尿素等が挙
げられる。上記タンパク質変成剤の使用濃度は、処理す
るウイルス抗原濃度によって異なるが、０．１〜８Ｍの
範囲が好ましい。
次構造をほぐしポリペプチド側鎖間の水素結合、疎水性
相互作用を解離するものであれば特に限定されず、例え
ば、グアニジン塩酸塩（Ｇｄｍ−ＨＣｌ）、尿素等が挙
げられる。上記タンパク質変成剤の使用濃度は、処理す
るウイルス抗原濃度によって異なるが、０．１〜８Ｍの
範囲が好ましい。
【００４１】上記還元剤、界面活性剤及びタンパク質変
性剤は、それぞれ単独で用いてもよく、又は、混合して
用いてもよい。上記還元剤、界面活性剤及びタンパク質
変性剤を溶解させる緩衝液並びにそのイオン強度及びｐ
Ｈとしては、例えば、本発明１でウイルス抗原希釈液と
して例示したもの等が挙げられる。本明細書において、
上記緩衝液に還元剤、界面活性剤及びタンパク質変性剤
からなる群より選択される少なくとも１種の処理剤を適
当量溶解させた液を、低分子化用液、更に、上記低分子
化用液でウイルス抗原を処理することを、低分子化処理
ともいう。
性剤は、それぞれ単独で用いてもよく、又は、混合して
用いてもよい。上記還元剤、界面活性剤及びタンパク質
変性剤を溶解させる緩衝液並びにそのイオン強度及びｐ
Ｈとしては、例えば、本発明１でウイルス抗原希釈液と
して例示したもの等が挙げられる。本明細書において、
上記緩衝液に還元剤、界面活性剤及びタンパク質変性剤
からなる群より選択される少なくとも１種の処理剤を適
当量溶解させた液を、低分子化用液、更に、上記低分子
化用液でウイルス抗原を処理することを、低分子化処理
ともいう。
【００４２】上記界面活性剤、還元剤及びタンパク質変
性剤からなる群より選択される少なくとも一種によって
ウイルス抗原を処理する工程においては、ウイルス抗原
希釈液と低分子化用液を、処理剤濃度が上記の範囲とな
るように適当量混合し、４〜５０℃、３０分〜４８時間
程度インキュベーションすることにより行うことができ
る。必要に応じて、攪拌操作や超音波処理を行ってもよ
い。上記処理する溶液中のウイルス抗原濃度としては特
に限定されず、通常、０．００１〜１０ｍｇ／ｍＬであ
る。
性剤からなる群より選択される少なくとも一種によって
ウイルス抗原を処理する工程においては、ウイルス抗原
希釈液と低分子化用液を、処理剤濃度が上記の範囲とな
るように適当量混合し、４〜５０℃、３０分〜４８時間
程度インキュベーションすることにより行うことができ
る。必要に応じて、攪拌操作や超音波処理を行ってもよ
い。上記処理する溶液中のウイルス抗原濃度としては特
に限定されず、通常、０．００１〜１０ｍｇ／ｍＬであ
る。
【００４３】本発明２のウイルス抗原の調製法では、そ
の後、上記処理されたウイルス抗原にＰＰＩアーゼを反
応させる工程を行う。本発明２においては、上記界面活
性剤、還元剤及びタンパク質変性剤からなる群より選択
される少なくとも一種による低分子化処理によりダメー
ジを受けたウイルス抗原の立体構造を安定化させたり、
構造変化をすばやく修復することにより、ウイルス抗原
活性の低下を防ぐものである。例えば、遺伝子組み換え
大腸菌の菌体内で顆粒化し不溶化した抗原タンパク質を
低分子化処理したものに対してＰＰＩアーゼを反応させ
て、抗原活性を高めた粒子状抗原を調製したり、陽性患
者血清から抽出される天然型粒子状抗原タンパク質を用
いて低分子化処理した後に、ＰＰＩアーゼを作用させ
て、粒子状に再構成させ処理前より活性を高くした抗原
を調製することができる。
の後、上記処理されたウイルス抗原にＰＰＩアーゼを反
応させる工程を行う。本発明２においては、上記界面活
性剤、還元剤及びタンパク質変性剤からなる群より選択
される少なくとも一種による低分子化処理によりダメー
ジを受けたウイルス抗原の立体構造を安定化させたり、
構造変化をすばやく修復することにより、ウイルス抗原
活性の低下を防ぐものである。例えば、遺伝子組み換え
大腸菌の菌体内で顆粒化し不溶化した抗原タンパク質を
低分子化処理したものに対してＰＰＩアーゼを反応させ
て、抗原活性を高めた粒子状抗原を調製したり、陽性患
者血清から抽出される天然型粒子状抗原タンパク質を用
いて低分子化処理した後に、ＰＰＩアーゼを作用させ
て、粒子状に再構成させ処理前より活性を高くした抗原
を調製することができる。
【００４４】上記ＰＰＩアーゼ及びその反応条件等につ
いては、本発明１で例示したもの等が挙げられる。
いては、本発明１で例示したもの等が挙げられる。
【００４５】本発明１及び本発明２において、上記ＰＰ
Ｉアーゼは溶液状態だけではなく、不溶性担体に固定化
してバイオリアクターとして用いてもよい。この場合、
用いる不溶性担体としては通常の酵素固定化用担体であ
れば特に限定されず、例えば、セルロース、アガロー
ス、デキストラン、キチン、コラーゲン、アミノ酸ポリ
マー、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、イオン交換
樹、ビニルポリマー、ガラスビーズ、セラミック、光架
橋性樹脂、ポリウレタン等が挙げられる。セルロースや
アガロースを臭化シアンで活性化した担体やビニルポリ
マーに官能基を導入した担体がタンパク質の結合用担体
として市販されており、それらを用いてもよい。
Ｉアーゼは溶液状態だけではなく、不溶性担体に固定化
してバイオリアクターとして用いてもよい。この場合、
用いる不溶性担体としては通常の酵素固定化用担体であ
れば特に限定されず、例えば、セルロース、アガロー
ス、デキストラン、キチン、コラーゲン、アミノ酸ポリ
マー、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、イオン交換
樹、ビニルポリマー、ガラスビーズ、セラミック、光架
橋性樹脂、ポリウレタン等が挙げられる。セルロースや
アガロースを臭化シアンで活性化した担体やビニルポリ
マーに官能基を導入した担体がタンパク質の結合用担体
として市販されており、それらを用いてもよい。
【００４６】上記不溶性担体とＰＰＩアーゼとの結合法
としてはタンパク質の固定化等に用いられている方法で
あれば特に限定されず、例えば、共有結合法、物理的吸
着法、イオン結合法、架橋法、包括格子型、マイクロカ
プセル格子型等が挙げられる。上記不溶性担体へのＰＰ
Ｉアーゼの吸着量としては特に限定されず、例えば、不
溶性担体１ｃｍ3 当たりタンパク質量０．１〜１０００
ｍｇが好ましい。
としてはタンパク質の固定化等に用いられている方法で
あれば特に限定されず、例えば、共有結合法、物理的吸
着法、イオン結合法、架橋法、包括格子型、マイクロカ
プセル格子型等が挙げられる。上記不溶性担体へのＰＰ
Ｉアーゼの吸着量としては特に限定されず、例えば、不
溶性担体１ｃｍ3 当たりタンパク質量０．１〜１０００
ｍｇが好ましい。
【００４７】上記ＰＰＩアーゼを結合させた不溶性担体
を用いた反応操作としては特に限定されず、例えば、
（１）ＰＰＩアーゼを結合させた不溶性担体と低分子化
処理終了後のウイルス抗原希釈液及び粒子構成化反応液
とを混合・反応させた後に、遠心分離操作でＰＰＩアー
ゼを結合させた不溶性担体を沈殿させ、上清のウイルス
抗原を回収する方法、（２）ＰＰＩアーゼを結合させた
不溶性担体をカラムに充填し、これに低分子化操作終了
後のウイルス抗原希釈液及び粒子構成化反応液を展開・
反応させた後に、溶出されるウイルス抗原を回収する方
法、（３）低分子化操作終了後のウイルス抗原希釈液及
び粒子構成化反応液とＰＰＩアーゼ結合膜とを混合・反
応させてウイルス抗原を回収する方法等が挙げられる。
上記ＰＰＩアーゼを結合させた不溶性担体は繰り返し使
用が可能である。
を用いた反応操作としては特に限定されず、例えば、
（１）ＰＰＩアーゼを結合させた不溶性担体と低分子化
処理終了後のウイルス抗原希釈液及び粒子構成化反応液
とを混合・反応させた後に、遠心分離操作でＰＰＩアー
ゼを結合させた不溶性担体を沈殿させ、上清のウイルス
抗原を回収する方法、（２）ＰＰＩアーゼを結合させた
不溶性担体をカラムに充填し、これに低分子化操作終了
後のウイルス抗原希釈液及び粒子構成化反応液を展開・
反応させた後に、溶出されるウイルス抗原を回収する方
法、（３）低分子化操作終了後のウイルス抗原希釈液及
び粒子構成化反応液とＰＰＩアーゼ結合膜とを混合・反
応させてウイルス抗原を回収する方法等が挙げられる。
上記ＰＰＩアーゼを結合させた不溶性担体は繰り返し使
用が可能である。
【００４８】本発明１及び本発明２において調製される
ウイルス粒子は、免疫診断薬の抗原；ワクチン等として
使用することができる。上記免疫診断薬は、血清等の検
体中のウイルス抗体の定量的測定等を行うことができ、
抗原抗体反応を利用した免疫測定法を利用することがで
きる。上記免疫測定法においては、（１）本発明により
調製したウイルス抗原を血球やラテックス等の不溶性担
体に担持させた血球凝集法やラテックス凝集法、（２）
本発明により調製したウイルス抗原を酵素で標識した酵
素標識抗原を使用する酵素免疫測定法（ＥＩＡ）等が挙
げられる。
ウイルス粒子は、免疫診断薬の抗原；ワクチン等として
使用することができる。上記免疫診断薬は、血清等の検
体中のウイルス抗体の定量的測定等を行うことができ、
抗原抗体反応を利用した免疫測定法を利用することがで
きる。上記免疫測定法においては、（１）本発明により
調製したウイルス抗原を血球やラテックス等の不溶性担
体に担持させた血球凝集法やラテックス凝集法、（２）
本発明により調製したウイルス抗原を酵素で標識した酵
素標識抗原を使用する酵素免疫測定法（ＥＩＡ）等が挙
げられる。
【００４９】上記血球凝集法やラテックス凝集法におい
ては、本発明により調製したウイルス抗原をラテックス
や血球等に担持させ、これをウイルス抗体含有検体と混
合させる。抗原抗体反応の結果、ラテックスや血球が抗
体により架橋・凝集され、この凝集を検出することによ
り検体中のウイルス抗体を定量することができる。
ては、本発明により調製したウイルス抗原をラテックス
や血球等に担持させ、これをウイルス抗体含有検体と混
合させる。抗原抗体反応の結果、ラテックスや血球が抗
体により架橋・凝集され、この凝集を検出することによ
り検体中のウイルス抗体を定量することができる。
【００５０】上記酵素免疫測定法においては、例えば、
ワンステップサンドイッチ法の場合、本発明により調製
したウイルス抗原をビーズやマイクロタイタープレート
のウェル内壁等の不溶性担体に固定化する。これにウイ
ルス抗体含有検体及び酵素標識したウイルス抗原を加
え、固定化ウイルス抗原−ウイルス抗体−酵素標識ウイ
ルス抗原の免疫複合体を生成させる。洗浄操作後、酵素
基質を加え、酵素反応により生じる生産物を検出するこ
とにより、検体中のウイルス抗体を定量することができ
る。
ワンステップサンドイッチ法の場合、本発明により調製
したウイルス抗原をビーズやマイクロタイタープレート
のウェル内壁等の不溶性担体に固定化する。これにウイ
ルス抗体含有検体及び酵素標識したウイルス抗原を加
え、固定化ウイルス抗原−ウイルス抗体−酵素標識ウイ
ルス抗原の免疫複合体を生成させる。洗浄操作後、酵素
基質を加え、酵素反応により生じる生産物を検出するこ
とにより、検体中のウイルス抗体を定量することができ
る。
【００５１】
【実施例】以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説
明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるもの
ではない。
明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるもの
ではない。
【００５２】参考例１ ＰＰＩアーゼ（メタノコッカス
・サーモリソトロフィカス由来）の調製 （１）発現プラスミドの構築及び大腸菌への形質転換 メタノコッカス・サーモリソトロフィカスのＰＰＩアー
ゼをコードする遺伝子の断片を、工業技術院生命工学工
業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１５６２２として寄託さ
れているプラスミドｐＵＦＫＣ１を鋳型とし、配列表の
配列番号３のフォワードプライマー及び配列番号４のリ
バースプライマーを用いるＰＣＲ法によって増幅させ
た。上記配列番号３に示した配列の５′末端から３〜８
番目の塩基配列は、ＮｃｏＩの認識部位である。また、
上記配列番号４に示した配列の５′末端から３〜８番目
の塩基配列は、ＢａｍＨＩの認識部位である。上記プラ
イマーを用いるＰＣＲ法によって増幅、回収された断片
を、ＢａｍＨＩ及びＮｃｏＩで消化後、同様の制限酵素
処理が施された発現ベクターｐＥＴ−１１ｄ（ストラテ
ィジェン社製）にライゲーションした。その後、これを
ＢＬ２１（ＤＥ３）株（ストラティジェン社製）にトラ
ンスフォーメーションし、アンピシリン１００μｇ／ｍ
Ｌを含むＬＢ培地プレート（トリプトン１０ｇ、酵母エ
キス５ｇ、ＮａＣｌ１０ｇ／１Ｌ（ｐＨ７．０））にて
培養後、コロニーをピックアップし、グリセロールスト
ックとした。
・サーモリソトロフィカス由来）の調製 （１）発現プラスミドの構築及び大腸菌への形質転換 メタノコッカス・サーモリソトロフィカスのＰＰＩアー
ゼをコードする遺伝子の断片を、工業技術院生命工学工
業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１５６２２として寄託さ
れているプラスミドｐＵＦＫＣ１を鋳型とし、配列表の
配列番号３のフォワードプライマー及び配列番号４のリ
バースプライマーを用いるＰＣＲ法によって増幅させ
た。上記配列番号３に示した配列の５′末端から３〜８
番目の塩基配列は、ＮｃｏＩの認識部位である。また、
上記配列番号４に示した配列の５′末端から３〜８番目
の塩基配列は、ＢａｍＨＩの認識部位である。上記プラ
イマーを用いるＰＣＲ法によって増幅、回収された断片
を、ＢａｍＨＩ及びＮｃｏＩで消化後、同様の制限酵素
処理が施された発現ベクターｐＥＴ−１１ｄ（ストラテ
ィジェン社製）にライゲーションした。その後、これを
ＢＬ２１（ＤＥ３）株（ストラティジェン社製）にトラ
ンスフォーメーションし、アンピシリン１００μｇ／ｍ
Ｌを含むＬＢ培地プレート（トリプトン１０ｇ、酵母エ
キス５ｇ、ＮａＣｌ１０ｇ／１Ｌ（ｐＨ７．０））にて
培養後、コロニーをピックアップし、グリセロールスト
ックとした。
【００５３】（２）組み換え大腸菌からのＰＰＩアーゼ
調製 アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ培地２００ｍ
Ｌに、上記発現プラスミドを保持するＢＬ２１（ＤＥ
３）株（組み換え大腸菌）一白金耳を接種し、３７℃で
１６時間予備培養した。この培養液をＬＢ培地６リット
ルに植菌し、ジャーファメンターにより本培養を行っ
た。本培養開始３時間後に、ＩＰＴＧ（和光純薬工業社
製）を１ｍＭ濃度となるように添加し、更に、培養を４
時間継続した。培養終了後、遠心分離にて菌を回収し、
−３０℃にて凍結保存した。次に、回収した組み換え大
腸菌を、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁さ
せ、超音波処理にて菌体破砕した。遠心分離にて上清を
採取し、３０分間、８０℃の水浴中にて加熱処理を行
い、夾雑タンパク質を変性凝集させ、遠心分離にて除去
した。更に、上清に硫酸アンモニウム（和光純薬工業社
製）を８０％飽和となるように添加し塩析を行った。３
０分後に遠心分離にて採取した沈殿部を、１．８Ｍの硫
酸アンモニウムを含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．８）に溶解した。
調製 アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ培地２００ｍ
Ｌに、上記発現プラスミドを保持するＢＬ２１（ＤＥ
３）株（組み換え大腸菌）一白金耳を接種し、３７℃で
１６時間予備培養した。この培養液をＬＢ培地６リット
ルに植菌し、ジャーファメンターにより本培養を行っ
た。本培養開始３時間後に、ＩＰＴＧ（和光純薬工業社
製）を１ｍＭ濃度となるように添加し、更に、培養を４
時間継続した。培養終了後、遠心分離にて菌を回収し、
−３０℃にて凍結保存した。次に、回収した組み換え大
腸菌を、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁さ
せ、超音波処理にて菌体破砕した。遠心分離にて上清を
採取し、３０分間、８０℃の水浴中にて加熱処理を行
い、夾雑タンパク質を変性凝集させ、遠心分離にて除去
した。更に、上清に硫酸アンモニウム（和光純薬工業社
製）を８０％飽和となるように添加し塩析を行った。３
０分後に遠心分離にて採取した沈殿部を、１．８Ｍの硫
酸アンモニウムを含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．８）に溶解した。
【００５４】この溶液を、Ａ液：１．８Ｍ硫酸アンモニ
ウムを含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）で
平衡化したＴＳＫ−Ｇｅｌ Ｅｔｈｅｒ−５ＰＷカラム
（７．５ｍｍ×７．５ｃｍ）（東ソー社製）に供し、５
分後からＢ液：５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）の
６０分間直線グラジエントにてＰＰＩアーゼを溶出し
た。ＰＰＩアーゼは硫酸アンモニウム０．５Ｍ濃度付近
で溶出される画分に現れた。本画分を透析により脱塩
し、以下の実施例に使用した。
ウムを含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）で
平衡化したＴＳＫ−Ｇｅｌ Ｅｔｈｅｒ−５ＰＷカラム
（７．５ｍｍ×７．５ｃｍ）（東ソー社製）に供し、５
分後からＢ液：５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）の
６０分間直線グラジエントにてＰＰＩアーゼを溶出し
た。ＰＰＩアーゼは硫酸アンモニウム０．５Ｍ濃度付近
で溶出される画分に現れた。本画分を透析により脱塩
し、以下の実施例に使用した。
【００５５】参考例２ ＰＰＩアーゼ（メタノコッカス
・ボルタエ由来）の調製 （１）発現プラスミドの構築及び大腸菌への形質転換 特願平９−３５０６２３号記載の方法に従って調製した
メタノコッカス・ボルタエのゲノムＤＮＡを鋳型とし
て、配列表の配列番号５及び配列番号６のプライマーを
用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。ＰＣ
Ｒ産物をｐＴ７ｂｌｕｅ ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅ
ｎ社）にライゲーションした後、それを大腸菌ＪＭ１０
９にトランスフォーメーションし、１００μｇ／ｍＬの
アンピシリンが含有されたＬＢ培地プレートにて一昼夜
３７℃で培養し、ＰＣＲ産物のライブラリーを作製し
た。これをＨｙｂｏｎｄｏ−Ｎ+ メンブラン（アマシャ
ムファルマシア社）に転写した。特開平１０−９１号公
報に記載されたＰＰＩアーゼ遺伝子スクリーニングに用
いられたジゴキシゲニン標識遺伝子をプローブとしてＤ
ＩＧ−ＤＮＡ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ベーリン
ガーマンハイム社）を用いてＭ．ｖｏｌｔａｅ由来ＰＰ
Ｉアーゼ遺伝子をスクリーニングした。得られた陽性ク
ローンからプラスミドを回収し、ＮｃｏＩ及びＢａｍＨ
Ｉによって挿入配列を切り出し、電気泳動によって回収
した。
・ボルタエ由来）の調製 （１）発現プラスミドの構築及び大腸菌への形質転換 特願平９−３５０６２３号記載の方法に従って調製した
メタノコッカス・ボルタエのゲノムＤＮＡを鋳型とし
て、配列表の配列番号５及び配列番号６のプライマーを
用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。ＰＣ
Ｒ産物をｐＴ７ｂｌｕｅ ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅ
ｎ社）にライゲーションした後、それを大腸菌ＪＭ１０
９にトランスフォーメーションし、１００μｇ／ｍＬの
アンピシリンが含有されたＬＢ培地プレートにて一昼夜
３７℃で培養し、ＰＣＲ産物のライブラリーを作製し
た。これをＨｙｂｏｎｄｏ−Ｎ+ メンブラン（アマシャ
ムファルマシア社）に転写した。特開平１０−９１号公
報に記載されたＰＰＩアーゼ遺伝子スクリーニングに用
いられたジゴキシゲニン標識遺伝子をプローブとしてＤ
ＩＧ−ＤＮＡ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ベーリン
ガーマンハイム社）を用いてＭ．ｖｏｌｔａｅ由来ＰＰ
Ｉアーゼ遺伝子をスクリーニングした。得られた陽性ク
ローンからプラスミドを回収し、ＮｃｏＩ及びＢａｍＨ
Ｉによって挿入配列を切り出し、電気泳動によって回収
した。
【００５６】これを、同様の制限酵素処理が施された発
現ベクターｐＥＴ−１１ｄ（ストラタジェン社製）にラ
イゲーションした。その後、これをＢＬ２１（ＤＥ３）
株（ストラティジェン社製）にトランスフォーメーショ
ンし、アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ培地プ
レートにて培養後、コロニーをピックアップし、グリセ
ロールストックとした。
現ベクターｐＥＴ−１１ｄ（ストラタジェン社製）にラ
イゲーションした。その後、これをＢＬ２１（ＤＥ３）
株（ストラティジェン社製）にトランスフォーメーショ
ンし、アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ培地プ
レートにて培養後、コロニーをピックアップし、グリセ
ロールストックとした。
【００５７】（２）組み換え大腸菌からのＰＰＩアーゼ
調製 アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ培地２００ｍ
Ｌに、上記発現プラスミドを保持するＢＬ２１（ＤＥ
３）株（組み換え大腸菌）一白金耳を接種し、３７℃で
１６時間予備培養した。この培養液をＬＢ培地６リット
ルに植菌し、ジャーファメンターにより本培養を行っ
た。本培養開始３時間後に、ＩＰＴＧ（和光純薬工業社
製）を１ｍＭ濃度となるように添加し、更に、培養を４
時間継続した。培養終了後、遠心分離にて菌を回収し、
−３０℃にて凍結保存した。次に、回収した組み換え大
腸菌を、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁さ
せ、超音波処理にて菌体破砕した。遠心分離にて上清を
採取し、硫酸アンモニウム（和光純薬工業社製）を８０
％飽和となるように添加し塩析を行った。３０分後に遠
心分離にて採取した沈殿部を１．８Ｍの硫酸アンモニウ
ムを含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）に溶
解した。
調製 アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ培地２００ｍ
Ｌに、上記発現プラスミドを保持するＢＬ２１（ＤＥ
３）株（組み換え大腸菌）一白金耳を接種し、３７℃で
１６時間予備培養した。この培養液をＬＢ培地６リット
ルに植菌し、ジャーファメンターにより本培養を行っ
た。本培養開始３時間後に、ＩＰＴＧ（和光純薬工業社
製）を１ｍＭ濃度となるように添加し、更に、培養を４
時間継続した。培養終了後、遠心分離にて菌を回収し、
−３０℃にて凍結保存した。次に、回収した組み換え大
腸菌を、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁さ
せ、超音波処理にて菌体破砕した。遠心分離にて上清を
採取し、硫酸アンモニウム（和光純薬工業社製）を８０
％飽和となるように添加し塩析を行った。３０分後に遠
心分離にて採取した沈殿部を１．８Ｍの硫酸アンモニウ
ムを含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）に溶
解した。
【００５８】この液を高速液体クロマトグラフィーを用
いてＰＰＩアーゼの分離、精製を行い、酵素を含む溶出
液を透析により脱塩して、以下の実施例に使用した。
いてＰＰＩアーゼの分離、精製を行い、酵素を含む溶出
液を透析により脱塩して、以下の実施例に使用した。
【００５９】参考例３ ＰＰＩアーゼ固定化担体の調製 参考例１で調製したメタノコッカス・サーモリソトロフ
ィカス由来のＰＰＩアーゼ、及び、不溶性担体としてＣ
ＮＢｒ−活性型Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂゲル（アマシャ
ムファルマシア社製）を用いた。このゲル１ｇを秤量
し、１ｍＭＨＣｌで洗浄、膨潤させた。０．５ＭＮａＣ
ｌを含む０．１ＭＮａＨＣＯ3 溶液（ｐＨ８．３）１０
ｍＬにＰＰＩアーゼ３５ｍｇを溶解させたタンパク溶液
と膨潤させたゲルを混合し、室温にて２時間振盪した。
上清液を除いた後、０．２Ｍグリシン（ｐＨ８．０）を
１０ｍＬ加え、室温にて２時間振盪した。この反応で過
剰の活性基をブロッキングした。次に、０．５ＭＮａＣ
ｌを含む０．１ＭＮａＨＣＯ3溶液（ｐＨ８．３）２０
ｍＬで洗浄した後、０．５ＭＮａＣｌを含む０．１Ｍ、
ｐＨ４の酢酸緩衝液２０ｍＬで洗浄した。再び、同液２
０ｍＬで洗浄し、このゲルをＰＰＩアーゼ結合担体とし
て以下の実施例に用いた。
ィカス由来のＰＰＩアーゼ、及び、不溶性担体としてＣ
ＮＢｒ−活性型Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂゲル（アマシャ
ムファルマシア社製）を用いた。このゲル１ｇを秤量
し、１ｍＭＨＣｌで洗浄、膨潤させた。０．５ＭＮａＣ
ｌを含む０．１ＭＮａＨＣＯ3 溶液（ｐＨ８．３）１０
ｍＬにＰＰＩアーゼ３５ｍｇを溶解させたタンパク溶液
と膨潤させたゲルを混合し、室温にて２時間振盪した。
上清液を除いた後、０．２Ｍグリシン（ｐＨ８．０）を
１０ｍＬ加え、室温にて２時間振盪した。この反応で過
剰の活性基をブロッキングした。次に、０．５ＭＮａＣ
ｌを含む０．１ＭＮａＨＣＯ3溶液（ｐＨ８．３）２０
ｍＬで洗浄した後、０．５ＭＮａＣｌを含む０．１Ｍ、
ｐＨ４の酢酸緩衝液２０ｍＬで洗浄した。再び、同液２
０ｍＬで洗浄し、このゲルをＰＰＩアーゼ結合担体とし
て以下の実施例に用いた。
【００６０】実施例１ 天然型ＨＢｓ抗原の低分子化処
理とＰＰＩアーゼ反応（１） ＨＢｓ抗原は、ヒト陽性血清より精製した。精製法は、
塩化セシウム溶液及びショ糖密度勾配法によって小型球
状粒子抗原を回収し、さらにゲル濾過法によって精製し
た。得られたＨＢｓ抗原を０．２ＭＮａＣｌ／５０ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に３ｍｇ／ｍＬ
となるように溶解し、ＨＢｓ抗原液とした。ＨＢｓ抗原
を４Ｍ尿素／１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）／
０．５％オクチルグルコシド／５０ｍＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ７．０）中で３５℃で１時間インキュベ
ーションし、低分子化処理及びポリペプチドの変性を行
った。処理したＨＢｓ抗原を５０ｍＭリン酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ７．０）／０．１％ＳＤＳを展開液として
ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム（東ソー社）に
よるゲル濾過を行った。天然型及びそれを低分子化処理
したＨＢｓ抗原のクロマトグラムをそれぞれ図１及び図
２に示す。
理とＰＰＩアーゼ反応（１） ＨＢｓ抗原は、ヒト陽性血清より精製した。精製法は、
塩化セシウム溶液及びショ糖密度勾配法によって小型球
状粒子抗原を回収し、さらにゲル濾過法によって精製し
た。得られたＨＢｓ抗原を０．２ＭＮａＣｌ／５０ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に３ｍｇ／ｍＬ
となるように溶解し、ＨＢｓ抗原液とした。ＨＢｓ抗原
を４Ｍ尿素／１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）／
０．５％オクチルグルコシド／５０ｍＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ７．０）中で３５℃で１時間インキュベ
ーションし、低分子化処理及びポリペプチドの変性を行
った。処理したＨＢｓ抗原を５０ｍＭリン酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ７．０）／０．１％ＳＤＳを展開液として
ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム（東ソー社）に
よるゲル濾過を行った。天然型及びそれを低分子化処理
したＨＢｓ抗原のクロマトグラムをそれぞれ図１及び図
２に示す。
【００６１】上記方法によって低分子化処理したＨＢｓ
抗原（１．５ｇ／ｍＬ）５μＬに、参考例１で調製した
メタノコッカス・サーモリソトロフィカス由来組み換え
型ＰＰＩアーゼ１．６ｍｇ／ｍＬを３μＬ、０．０５Ｍ
ＮａＣｌを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．８）を１９７μＬ添加混合し、３５℃で３時間イン
キュベーションした。反応終了後、下記方法に従ったＥ
ＩＡによる抗原性評価、及び、ゲル濾過による分子量分
布の測定を行った。ゲル濾過は５０ｍＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ７．０）／０．１％ＳＤＳを展開液とし
て、ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラムを用いて行
った。クロマトグラムを図３に示す。
抗原（１．５ｇ／ｍＬ）５μＬに、参考例１で調製した
メタノコッカス・サーモリソトロフィカス由来組み換え
型ＰＰＩアーゼ１．６ｍｇ／ｍＬを３μＬ、０．０５Ｍ
ＮａＣｌを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．８）を１９７μＬ添加混合し、３５℃で３時間イン
キュベーションした。反応終了後、下記方法に従ったＥ
ＩＡによる抗原性評価、及び、ゲル濾過による分子量分
布の測定を行った。ゲル濾過は５０ｍＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ７．０）／０．１％ＳＤＳを展開液とし
て、ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラムを用いて行
った。クロマトグラムを図３に示す。
【００６２】評価方法：ＥＩＡによるＨＢｓ抗原の抗原
性評価 実施例１で得られた天然型ＨＢｓ抗原、低分子化処理Ｈ
Ｂｓ抗原及びＰＰＩアーゼ反応させたＨＢｓ抗原をそれ
ぞれ、０．１％ＳＤＳ／５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐ
Ｈ７．５）で０．１５μｇ／ｍＬにまで希釈した後、更
に、０．１％ＳＤＳを含むヒト管理血清、Ｌ−コンセー
ラＮ「ニッスイ」（日水製薬社）で０．０１５μｇ／ｍ
Ｌにまで希釈し、ＨＢｓ抗原測定用ＥＩＡキット「エン
ザイグノストＨＢｓＡｇｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ」（ヘキ
スト・ベーリングイグアノスティック社製）による抗原
性評価を行った。結果を表１に示した。
性評価 実施例１で得られた天然型ＨＢｓ抗原、低分子化処理Ｈ
Ｂｓ抗原及びＰＰＩアーゼ反応させたＨＢｓ抗原をそれ
ぞれ、０．１％ＳＤＳ／５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐ
Ｈ７．５）で０．１５μｇ／ｍＬにまで希釈した後、更
に、０．１％ＳＤＳを含むヒト管理血清、Ｌ−コンセー
ラＮ「ニッスイ」（日水製薬社）で０．０１５μｇ／ｍ
Ｌにまで希釈し、ＨＢｓ抗原測定用ＥＩＡキット「エン
ザイグノストＨＢｓＡｇｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ」（ヘキ
スト・ベーリングイグアノスティック社製）による抗原
性評価を行った。結果を表１に示した。
【００６３】実施例２ 天然型ＨＢｓ抗原の低分子化処
理とＰＰＩアーゼ反応（２） ＨＢｓ抗原の精製及び低分子化処理は実施例１と同様に
行った。上記方法によって処理した低分子化ＨＢｓ抗原
（１．５ｇ／ｍＬ）５μＬに、参考例１で調製したメタ
ノコッカス・サーモリソトロフィカス由来組み換え型Ｐ
ＰＩアーゼ１．６ｍｇ／ｍＬを３μＬ、２．５ｍＭ酸化
型グルタチオン、０．２５ｍＭ還元型グルタチオン及び
牛肝臓由来ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅｉｓｏ
ｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）１．０ｍｇ／ｍＬを含む溶
液を３μＬ、並びに、０．０５ＭＮａＣｌを含む０．１
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．８）を１９５μＬ
添加混合したこと以外は、実施例１と同様に行った。Ｐ
ＰＩアーゼ反応させたＨＢｓ抗原のクロマトグラムを図
４に示す。
理とＰＰＩアーゼ反応（２） ＨＢｓ抗原の精製及び低分子化処理は実施例１と同様に
行った。上記方法によって処理した低分子化ＨＢｓ抗原
（１．５ｇ／ｍＬ）５μＬに、参考例１で調製したメタ
ノコッカス・サーモリソトロフィカス由来組み換え型Ｐ
ＰＩアーゼ１．６ｍｇ／ｍＬを３μＬ、２．５ｍＭ酸化
型グルタチオン、０．２５ｍＭ還元型グルタチオン及び
牛肝臓由来ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅｉｓｏ
ｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）１．０ｍｇ／ｍＬを含む溶
液を３μＬ、並びに、０．０５ＭＮａＣｌを含む０．１
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．８）を１９５μＬ
添加混合したこと以外は、実施例１と同様に行った。Ｐ
ＰＩアーゼ反応させたＨＢｓ抗原のクロマトグラムを図
４に示す。
【００６４】実施例３ 組み換え大腸菌由来組み換え型
ＨＢｓ抗原の低分子化処理とＰＰＩアーゼ反応（１） Ｂ型肝炎陽性患者（血清型：ａｄｗ）からクローニング
されたＨＢｓ抗原Ｓ領域遺伝子（Ｏｎｏ，Ｙ．ｅｔ ａ
ｌ．，１９８３，Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ．
１１，１７４７；ＤＮＡ配列を配列表の配列番号７に示
す。）が導入された大腸菌を２ＸＹ．Ｔ．培地（酵母エ
キス１０ｇ、バクトトリプトン２０ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、
アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、ｐＨ７．８）にて培養
後、ＯＤ６５０ｎｍが０．８〜１．２に到達した時点
で、ＩＰＴＧを１ｍＭになるように添加し、更に１０時
間培養した。培養終了後、菌体を回収し、０．１ＭＮａ
Ｃｌ／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）
中で超音波破砕した。ＨＢｓ遺伝子発現産物（ｒＨＢｓ
−ａｄｗ）は可溶性画分にも生産されていたが、沈殿画
分に多量に生産されていた。沈殿画分を０．１ＭＮａＣ
ｌ／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で
２回、遠心分離で洗浄後、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ７．０）／４Ｍ尿素／１ｍＭＤＴＴに溶解
し、３５℃で１時間処理した。遠心分離によって上清を
回収した。５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
０）／４Ｍ尿素／１ｍＭＤＴＴを展開液として、ＴＳＫ
ｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラムを用いて低分子化組み
換えＨＢｓを精製した。精製した低分子化ｒＨＢｓ−ａ
ｄｗは、限外濾過によって１．５ｍｇ／ｍＬにまで濃縮
した。得られた低分子化ｒＨＢｓ−ａｄｗの、展開液に
５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）／０．
１％ＳＤＳを用いるＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカ
ラムによるゲル濾過のクロマトグラムを図５に示す。
ＨＢｓ抗原の低分子化処理とＰＰＩアーゼ反応（１） Ｂ型肝炎陽性患者（血清型：ａｄｗ）からクローニング
されたＨＢｓ抗原Ｓ領域遺伝子（Ｏｎｏ，Ｙ．ｅｔ ａ
ｌ．，１９８３，Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ．
１１，１７４７；ＤＮＡ配列を配列表の配列番号７に示
す。）が導入された大腸菌を２ＸＹ．Ｔ．培地（酵母エ
キス１０ｇ、バクトトリプトン２０ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、
アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、ｐＨ７．８）にて培養
後、ＯＤ６５０ｎｍが０．８〜１．２に到達した時点
で、ＩＰＴＧを１ｍＭになるように添加し、更に１０時
間培養した。培養終了後、菌体を回収し、０．１ＭＮａ
Ｃｌ／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）
中で超音波破砕した。ＨＢｓ遺伝子発現産物（ｒＨＢｓ
−ａｄｗ）は可溶性画分にも生産されていたが、沈殿画
分に多量に生産されていた。沈殿画分を０．１ＭＮａＣ
ｌ／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で
２回、遠心分離で洗浄後、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ７．０）／４Ｍ尿素／１ｍＭＤＴＴに溶解
し、３５℃で１時間処理した。遠心分離によって上清を
回収した。５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
０）／４Ｍ尿素／１ｍＭＤＴＴを展開液として、ＴＳＫ
ｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラムを用いて低分子化組み
換えＨＢｓを精製した。精製した低分子化ｒＨＢｓ−ａ
ｄｗは、限外濾過によって１．５ｍｇ／ｍＬにまで濃縮
した。得られた低分子化ｒＨＢｓ−ａｄｗの、展開液に
５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）／０．
１％ＳＤＳを用いるＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカ
ラムによるゲル濾過のクロマトグラムを図５に示す。
【００６５】上記で得られた低分子化ｒＨＢｓ−ａｄｗ
５μＬ（１．５ｇ／ｍＬ）を用い、実施例１の０．０５
ＭＮａＣｌを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７．８）の代わりに０．０５ＭＫＣｌを含む０．１Ｍ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．８）を用いたこと以
外は、実施例１と同様にしてＰＰＩアーゼ反応を行っ
た。クロマトグラムを図６に示す。
５μＬ（１．５ｇ／ｍＬ）を用い、実施例１の０．０５
ＭＮａＣｌを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７．８）の代わりに０．０５ＭＫＣｌを含む０．１Ｍ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．８）を用いたこと以
外は、実施例１と同様にしてＰＰＩアーゼ反応を行っ
た。クロマトグラムを図６に示す。
【００６６】実施例４ 組み換え大腸菌由来組み換え型
ＨＢｓ抗原の低分子化処理とＰＰＩアーゼ反応（２） 実施例３の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
０）／４Ｍ尿素／１ｍＭＤＴＴの代わりに、５０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）／４Ｍグアニディ
ウム塩酸塩（Ｇｄｍ−ＨＣｌ）／１ｍＭＤＴＴを用い
て、低分子化処理及びＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬ
カラムによる精製を行ったこと以外は、実施例３と同様
にして、低分子化ｒＨＢｓ−ａｄｗを調製した。
ＨＢｓ抗原の低分子化処理とＰＰＩアーゼ反応（２） 実施例３の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
０）／４Ｍ尿素／１ｍＭＤＴＴの代わりに、５０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）／４Ｍグアニディ
ウム塩酸塩（Ｇｄｍ−ＨＣｌ）／１ｍＭＤＴＴを用い
て、低分子化処理及びＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬ
カラムによる精製を行ったこと以外は、実施例３と同様
にして、低分子化ｒＨＢｓ−ａｄｗを調製した。
【００６７】上記で得られた低分子化ｒＨＢｓ−ａｄｗ
５μＬ（１．５ｇ／ｍＬ）に、参考例１で調製したメタ
ノコッカス・サーモリソトロフィカス由来組み換え型Ｐ
ＰＩアーゼ１．６ｍｇ／ｍＬを３μＬ、０．２５ｍＭ酸
化型グルタチオン、２．５ｍＭ還元型グルタチオン及び
１．０ｍｇ／ｍＬの組み換え大腸菌由来チオレドキシン
（和光純薬社製）を含む溶液を３μＬ、並びに、０．０
５ＫＣｌを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．８）を１９５μＬ添加混合したこと以外は、実施例
１と同様に行った。クロマトグラムを図７に示す。
５μＬ（１．５ｇ／ｍＬ）に、参考例１で調製したメタ
ノコッカス・サーモリソトロフィカス由来組み換え型Ｐ
ＰＩアーゼ１．６ｍｇ／ｍＬを３μＬ、０．２５ｍＭ酸
化型グルタチオン、２．５ｍＭ還元型グルタチオン及び
１．０ｍｇ／ｍＬの組み換え大腸菌由来チオレドキシン
（和光純薬社製）を含む溶液を３μＬ、並びに、０．０
５ＫＣｌを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．８）を１９５μＬ添加混合したこと以外は、実施例
１と同様に行った。クロマトグラムを図７に示す。
【００６８】実施例５ 組み換え大腸菌由来組み換え型
ＨＢｓ抗原の低分子化処理とＰＰＩアーゼ反応（３） Ｂ型肝炎陽性患者（血清型：ａｄｒ）からクローニング
されたＨＢｓ抗原Ｓ領域遺伝子が導入された大腸菌（Ｌ
ｏｎｃａｒｅｖｉｃ，Ｉ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９
０，１８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１
８，４９４０；ＤＮＡ配列を配列表の配列番号９に示
す。）を使用したこと以外は、実施例３と同様にして精
製、低分子化処理を行い、低分子化ｒＨＢｓ−ａｄｒを
調製した。展開液に５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７．０）／０．１％ＳＤＳを用いるＴＳＫｇｅｌ
Ｇ４０００ＳＷＸＬカラムによるゲル濾過のクロマトグ
ラムを図８に示す。
ＨＢｓ抗原の低分子化処理とＰＰＩアーゼ反応（３） Ｂ型肝炎陽性患者（血清型：ａｄｒ）からクローニング
されたＨＢｓ抗原Ｓ領域遺伝子が導入された大腸菌（Ｌ
ｏｎｃａｒｅｖｉｃ，Ｉ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９
０，１８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１
８，４９４０；ＤＮＡ配列を配列表の配列番号９に示
す。）を使用したこと以外は、実施例３と同様にして精
製、低分子化処理を行い、低分子化ｒＨＢｓ−ａｄｒを
調製した。展開液に５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７．０）／０．１％ＳＤＳを用いるＴＳＫｇｅｌ
Ｇ４０００ＳＷＸＬカラムによるゲル濾過のクロマトグ
ラムを図８に示す。
【００６９】上記で得られた低分子化ｒＨＢｓ−ａｄｒ
５μＬ（１．５ｇ／ｍＬ）に、参考例３で調製したメタ
ノコッカス・サーモリソトロフィカス由来組み換え型Ｐ
ＰＩアーゼ結合担体１０μＬ、及び、０．０５ＭＫＣｌ
を含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．８）
を１９５μＬ添加混合し、３５℃で３時間インキュベー
ションした。反応終了後に、１００００ｒｐｍ、１０分
間の遠心分離操作を行い、上清を回収した。この上清液
を用いて、実施例１と同様に、ＥＩＡによる抗原性評
価、ゲル濾過による分子量分布の測定を行った。クロマ
トグラムを図９に示す。
５μＬ（１．５ｇ／ｍＬ）に、参考例３で調製したメタ
ノコッカス・サーモリソトロフィカス由来組み換え型Ｐ
ＰＩアーゼ結合担体１０μＬ、及び、０．０５ＭＫＣｌ
を含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．８）
を１９５μＬ添加混合し、３５℃で３時間インキュベー
ションした。反応終了後に、１００００ｒｐｍ、１０分
間の遠心分離操作を行い、上清を回収した。この上清液
を用いて、実施例１と同様に、ＥＩＡによる抗原性評
価、ゲル濾過による分子量分布の測定を行った。クロマ
トグラムを図９に示す。
【００７０】実施例６ 組み換え大腸菌組み換え型ＨＢ
ｓ抗原の低分子処理及びＰＰＩアーゼ反応（４） 実施例５の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
０）／４Ｍ尿素／１ｍＭＤＴＴの代わりに、５０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）／４Ｍグアニディ
ウム塩酸塩／１ｍＭＤＴＴを用いて、低分子化処理及び
ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラムによる精製を行
ったこと以外は、実施例５と同様にして、低分子化ｒＨ
Ｂｓ−ａｄｗを調製した。
ｓ抗原の低分子処理及びＰＰＩアーゼ反応（４） 実施例５の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
０）／４Ｍ尿素／１ｍＭＤＴＴの代わりに、５０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）／４Ｍグアニディ
ウム塩酸塩／１ｍＭＤＴＴを用いて、低分子化処理及び
ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラムによる精製を行
ったこと以外は、実施例５と同様にして、低分子化ｒＨ
Ｂｓ−ａｄｗを調製した。
【００７１】上記で得られた低分子化ｒＨＢｓ−ａｄｒ
５μＬ（１．５ｇ／ｍＬ）に、参考例２で調製したメタ
ノコッカス・ボルタエ由来組み換え型ＰＰＩアーゼ１．
６ｍｇ／ｍＬを３μＬ、２．５ｍＭ酸化型グルタチオ
ン、０．２５ｍＭ還元型グルタチオン及び牛肝臓由来ｐ
ｒｏｔｅｉｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｉｓｏｍｅｒａｓ
ｅ（宝酒造社製）１．０ｍｇ／ｍＬを含む溶液を３μ
Ｌ、並びに、０．０５ＭＫＣｌを含む０．１Ｍリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ７．８）を１９５μＬ添加混合し
たこと以外は、実施例１と同様に行った。クロマトグラ
ムを図１０に示す。
５μＬ（１．５ｇ／ｍＬ）に、参考例２で調製したメタ
ノコッカス・ボルタエ由来組み換え型ＰＰＩアーゼ１．
６ｍｇ／ｍＬを３μＬ、２．５ｍＭ酸化型グルタチオ
ン、０．２５ｍＭ還元型グルタチオン及び牛肝臓由来ｐ
ｒｏｔｅｉｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｉｓｏｍｅｒａｓ
ｅ（宝酒造社製）１．０ｍｇ／ｍＬを含む溶液を３μ
Ｌ、並びに、０．０５ＭＫＣｌを含む０．１Ｍリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ７．８）を１９５μＬ添加混合し
たこと以外は、実施例１と同様に行った。クロマトグラ
ムを図１０に示す。
【００７２】
【表１】
【００７３】実施例７ 配列表の配列番号１１に示した、ａｄｒ型ＨＢｓ抗原を
コードする２本鎖合成遺伝子（６９７ｂｐ、アミノ酸配
列を配列番号１２に示す）をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで
消化後、同様の制限酵素処理が施されたＴ７プロモータ
ーを保持する発現ベクターに導入し、合成ＨＢｓ遺伝子
発現ベクターｐＴＳＨＢｓを構築した。大腸菌ＢＬ２１
（ＤＥ３）株をｐＴＳＨＢｓで形質転換した後、アンピ
シリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢプレートにま
き、３７℃で一昼夜培養した。
コードする２本鎖合成遺伝子（６９７ｂｐ、アミノ酸配
列を配列番号１２に示す）をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで
消化後、同様の制限酵素処理が施されたＴ７プロモータ
ーを保持する発現ベクターに導入し、合成ＨＢｓ遺伝子
発現ベクターｐＴＳＨＢｓを構築した。大腸菌ＢＬ２１
（ＤＥ３）株をｐＴＳＨＢｓで形質転換した後、アンピ
シリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢプレートにま
き、３７℃で一昼夜培養した。
【００７４】生育してきたコロニー１０個を、アンピシ
リン（１００μｇ／ｍｌ）を含む２ＸＬＢ液体培地に植
菌し、３５℃で培養した。培養液のＯＤ６５０が０．８
５に到達した時点で、１ｍＭＩＰＴＧを添加し、さらに
１０時間培養した。培養終了後、遠心分離によって菌体
を回収した。超音波処理によって菌体を破砕した後、遠
心分離によって沈殿画分と可溶性画分に分離した。各画
分におけるＨＢｓ蛋白質の発現をＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動によって確認した結果、２５ｋＤａ
のＨＢｓ蛋白質に相当するバンドが不溶性画分に大量に
存在することがわかった。
リン（１００μｇ／ｍｌ）を含む２ＸＬＢ液体培地に植
菌し、３５℃で培養した。培養液のＯＤ６５０が０．８
５に到達した時点で、１ｍＭＩＰＴＧを添加し、さらに
１０時間培養した。培養終了後、遠心分離によって菌体
を回収した。超音波処理によって菌体を破砕した後、遠
心分離によって沈殿画分と可溶性画分に分離した。各画
分におけるＨＢｓ蛋白質の発現をＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動によって確認した結果、２５ｋＤａ
のＨＢｓ蛋白質に相当するバンドが不溶性画分に大量に
存在することがわかった。
【００７５】不溶性画分を０．１５ＭＮａＣｌを含む５
０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で充分に洗浄
した後、これを６Ｍグアニジン塩酸塩／１ｍＭＤＴＴ／
５０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．８）に溶解し、
３５℃で１時間可溶化処理した。これを処理液と同様の
展開液を用いるＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム
によるゲル濾過により精製した。精製されたフラクショ
ンを分画分子量５０００の限外濾過によって１０ｍｇ／
ｍｌにまで濃縮した。
０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で充分に洗浄
した後、これを６Ｍグアニジン塩酸塩／１ｍＭＤＴＴ／
５０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．８）に溶解し、
３５℃で１時間可溶化処理した。これを処理液と同様の
展開液を用いるＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム
によるゲル濾過により精製した。精製されたフラクショ
ンを分画分子量５０００の限外濾過によって１０ｍｇ／
ｍｌにまで濃縮した。
【００７６】可溶化ＨＢｓ５μｌに、参考例１で調製し
たメタノコッカス・サーモリソトロフィカス由来組み換
え型ＰＰＩアーゼ１．６ｍｇ／ｍｌを３μｌ、０．２５
ｍＭ酸化型グルタチオン、２．５ｍＭ還元型グルタチオ
ン及び１．０ｍｇ／ｍｌの組み換え大腸菌由来チオレド
キシン（和光純薬社）を含む溶液を３μｌ並びに０．０
５ＭＫＣｌを含む０．１ＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐＨ
７．８）を１９５μｌ添加混合し、３５℃で２時間反応
させた。反応終了後、ＴＳＫｇｅｌＧ４０００カラムに
よるゲル濾過によって再生ＨＢｓ抗原を分析した結果
を、図１１に示す。ＨＢｓ抗原は保持時間６．８分のピ
ークとして現れ、均一な粒子構造を形成していることを
示す。
たメタノコッカス・サーモリソトロフィカス由来組み換
え型ＰＰＩアーゼ１．６ｍｇ／ｍｌを３μｌ、０．２５
ｍＭ酸化型グルタチオン、２．５ｍＭ還元型グルタチオ
ン及び１．０ｍｇ／ｍｌの組み換え大腸菌由来チオレド
キシン（和光純薬社）を含む溶液を３μｌ並びに０．０
５ＭＫＣｌを含む０．１ＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐＨ
７．８）を１９５μｌ添加混合し、３５℃で２時間反応
させた。反応終了後、ＴＳＫｇｅｌＧ４０００カラムに
よるゲル濾過によって再生ＨＢｓ抗原を分析した結果
を、図１１に示す。ＨＢｓ抗原は保持時間６．８分のピ
ークとして現れ、均一な粒子構造を形成していることを
示す。
【００７７】回収された組み換え型ＨＢｓ抗原を０．１
５μｇ／ｍｌに５０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）で希釈した後、さらにヒト管理血清Ｌ−コンセーラ
Ｎ「ニッスイ」（日水製薬）でさらに０．０１５μｇ／
ｍｌにまで希釈した。抗原希釈液の抗原性をＨＢｓ抗原
測定用ＥＩＡキット、エンザイグノストーＨＢｓＡｇｍ
ｏｎｏｃｌｏｎａｌ（ヘキスト・ベーリングダイアグノ
スティック社製）によって評価した。結果を表２に示
す。本実施例のコントロールとして実施例１で調製され
た陽性患者由来小型球状粒子及び標準血清についても同
様の抗原性評価を行った。
５μｇ／ｍｌに５０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）で希釈した後、さらにヒト管理血清Ｌ−コンセーラ
Ｎ「ニッスイ」（日水製薬）でさらに０．０１５μｇ／
ｍｌにまで希釈した。抗原希釈液の抗原性をＨＢｓ抗原
測定用ＥＩＡキット、エンザイグノストーＨＢｓＡｇｍ
ｏｎｏｃｌｏｎａｌ（ヘキスト・ベーリングダイアグノ
スティック社製）によって評価した。結果を表２に示
す。本実施例のコントロールとして実施例１で調製され
た陽性患者由来小型球状粒子及び標準血清についても同
様の抗原性評価を行った。
【００７８】
【表２】
【００７９】実施例８ 配列表の配列番号１３に示したＨＢｃ（Ｂ型肝炎コア抗
原）抗原をコードする２本鎖合成遺伝子（５６８ｂｐ、
アミノ酸配列を配列番号１４に示す）をＮｄｅＩ及びＢ
ａｍＨＩで消化後、同様の制限酵素処理が施されたＴ７
プロモーターを保持する発現ベクターに導入し、合成Ｈ
Ｂｃ遺伝子発現ベクターｐＴＨＢｃを構築した。大腸菌
ＢＬ２１（ＤＥ３）株をｐＴＨＢｃで形質転換した後、
アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢプレート
にまき、３７℃で一昼夜培養した。
原）抗原をコードする２本鎖合成遺伝子（５６８ｂｐ、
アミノ酸配列を配列番号１４に示す）をＮｄｅＩ及びＢ
ａｍＨＩで消化後、同様の制限酵素処理が施されたＴ７
プロモーターを保持する発現ベクターに導入し、合成Ｈ
Ｂｃ遺伝子発現ベクターｐＴＨＢｃを構築した。大腸菌
ＢＬ２１（ＤＥ３）株をｐＴＨＢｃで形質転換した後、
アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢプレート
にまき、３７℃で一昼夜培養した。
【００８０】生育してきたコロニー１０個を、アンピシ
リン（１００μｇ／ｍｌ）を含む２ＸＬＢ液体培地に植
菌し、３５℃で培養した。培養液のＯＤ６５０が０．８
５に到達した時点で、１ｍＭＩＰＴＧを添加し、さらに
１０時間培養した。培養終了後、遠心分離によって菌体
を回収した。超音波処理によって菌体を破砕した後、遠
心分離によって沈殿画分と可溶性画分に分離した。各画
分におけるＨＢｃ蛋白質の発現をＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動によって確認した結果、２１ｋＤａ
のＨＢｃ蛋白質に相当するバンドが不溶性画分に大量に
存在することがわかった。
リン（１００μｇ／ｍｌ）を含む２ＸＬＢ液体培地に植
菌し、３５℃で培養した。培養液のＯＤ６５０が０．８
５に到達した時点で、１ｍＭＩＰＴＧを添加し、さらに
１０時間培養した。培養終了後、遠心分離によって菌体
を回収した。超音波処理によって菌体を破砕した後、遠
心分離によって沈殿画分と可溶性画分に分離した。各画
分におけるＨＢｃ蛋白質の発現をＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動によって確認した結果、２１ｋＤａ
のＨＢｃ蛋白質に相当するバンドが不溶性画分に大量に
存在することがわかった。
【００８１】不溶性画分を０．１５ＭＮａＣｌを含む５
０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で充分に洗浄
した後、これを６Ｍグアニジン塩酸塩／１ｍＭＤＴＴ／
０．５％オクチルグルコシド／５０ｍＭＮａ−リン酸緩
衝液（ｐＨ７．８）に溶解し、３５℃で１時間可溶化処
理した。これを処理液と同様の展開液を用いるＴＳＫｇ
ｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラムによるゲル濾過により精
製した。精製されたフラクションを分画分子量５０００
の限外濾過によって５．０ｍｇ／ｍｌにまで濃縮した。
０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で充分に洗浄
した後、これを６Ｍグアニジン塩酸塩／１ｍＭＤＴＴ／
０．５％オクチルグルコシド／５０ｍＭＮａ−リン酸緩
衝液（ｐＨ７．８）に溶解し、３５℃で１時間可溶化処
理した。これを処理液と同様の展開液を用いるＴＳＫｇ
ｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラムによるゲル濾過により精
製した。精製されたフラクションを分画分子量５０００
の限外濾過によって５．０ｍｇ／ｍｌにまで濃縮した。
【００８２】可溶化ＨＢｃ５μｌに、３μｌの参考例１
で調製したメタノコッカス・サーモリソトロフィカス由
来組み換え型ＰＰＩアーゼ１．６ｍｇ／ｍｌ及び０．０
５ＭＫＣｌを含む０．１ＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐＨ
７．８）を１９５μｌ添加混合し、３５℃で２時間反応
させた。反応終了後、ＴＳＫｇｅｌＧ４０００カラムに
よるゲル濾過によって再生ＨＢｃ抗原を分析した結果
を、図１２に示す。ＨＢｃ抗原は保持時間６．８分のピ
ークとして現れ、均一な粒子構造を形成していることを
示す。なお、ＰＰＩアーゼを含まない０．１ＭＮａ−リ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．８）を１９５μｌ添加混合した場
合は沈殿が生じた。
で調製したメタノコッカス・サーモリソトロフィカス由
来組み換え型ＰＰＩアーゼ１．６ｍｇ／ｍｌ及び０．０
５ＭＫＣｌを含む０．１ＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐＨ
７．８）を１９５μｌ添加混合し、３５℃で２時間反応
させた。反応終了後、ＴＳＫｇｅｌＧ４０００カラムに
よるゲル濾過によって再生ＨＢｃ抗原を分析した結果
を、図１２に示す。ＨＢｃ抗原は保持時間６．８分のピ
ークとして現れ、均一な粒子構造を形成していることを
示す。なお、ＰＰＩアーゼを含まない０．１ＭＮａ−リ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．８）を１９５μｌ添加混合した場
合は沈殿が生じた。
【００８３】精製されたＨＢｃ粒子はＥＬＩＳＡによっ
て評価した。９６穴マイクロタータープレートに抗ＨＢ
ｃポリクローナル抗体（カルテット社製）をコートし、
次に牛血清アルブミンでコートした後、５０ｍＭＮａ−
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１０倍希釈した後、これ
に常法によってパーオキシダーゼ標識した抗ＨＢｃモノ
クローナル抗体（ケミコン社製）を作用させた。洗浄操
作後、これに発色基質してＡＢＴＳ（アジノエチルベン
ゾチアゾリンスルホン酸）を加え、発色させた後、４０
５ｎｍの吸収を測定した。結果を表３に示す。本実施例
のコントロールとして標準血清についても同様の抗原性
評価を行った。
て評価した。９６穴マイクロタータープレートに抗ＨＢ
ｃポリクローナル抗体（カルテット社製）をコートし、
次に牛血清アルブミンでコートした後、５０ｍＭＮａ−
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１０倍希釈した後、これ
に常法によってパーオキシダーゼ標識した抗ＨＢｃモノ
クローナル抗体（ケミコン社製）を作用させた。洗浄操
作後、これに発色基質してＡＢＴＳ（アジノエチルベン
ゾチアゾリンスルホン酸）を加え、発色させた後、４０
５ｎｍの吸収を測定した。結果を表３に示す。本実施例
のコントロールとして標準血清についても同様の抗原性
評価を行った。
【００８４】
【表３】
【００８５】実施例９ 配列１５に示したＨＣＶｃ（Ｃ型肝炎コア抗原）抗原を
コードする２本鎖合成遺伝子（５９０ｂｐ、アミノ酸配
列を配列番号１６に示す）をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで
消化後、同様の制限酵素処理が施されたＴ７プロモータ
ーを保持する発現ベクターに導入し、合成ＨＣＶｃ遺伝
子発現ベクターｐＴＨＣＶｃを構築した。大腸菌ＢＬ２
１（ＤＥ３）株をｐＴＨＣＶｃで形質転換した後、アン
ピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢプレートにま
き、３７℃で一昼夜培養した。
コードする２本鎖合成遺伝子（５９０ｂｐ、アミノ酸配
列を配列番号１６に示す）をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで
消化後、同様の制限酵素処理が施されたＴ７プロモータ
ーを保持する発現ベクターに導入し、合成ＨＣＶｃ遺伝
子発現ベクターｐＴＨＣＶｃを構築した。大腸菌ＢＬ２
１（ＤＥ３）株をｐＴＨＣＶｃで形質転換した後、アン
ピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢプレートにま
き、３７℃で一昼夜培養した。
【００８６】生育してきたコロニー１０個を、アンピシ
リン（１００μｇ／ｍｌ）を含む２ＸＬＢ液体培地に植
菌し、３５℃で培養した。培養液のＯＤ６５０が０．８
５に到達した時点で、１ｍＭＩＰＴＧを添加し、さらに
１０時間培養した。培養終了後、遠心分離によって菌体
を回収した。超音波処理によって菌体を破砕した後、遠
心分離によって沈殿画分と可溶性画分に分離した。各画
分におけるＨＣＶｃ蛋白質の発現をＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動によって確認した結果、２１ｋＤ
ａのＨＣＶｃ蛋白質に相当するバンドが不溶性画分に大
量に存在することがわかった。
リン（１００μｇ／ｍｌ）を含む２ＸＬＢ液体培地に植
菌し、３５℃で培養した。培養液のＯＤ６５０が０．８
５に到達した時点で、１ｍＭＩＰＴＧを添加し、さらに
１０時間培養した。培養終了後、遠心分離によって菌体
を回収した。超音波処理によって菌体を破砕した後、遠
心分離によって沈殿画分と可溶性画分に分離した。各画
分におけるＨＣＶｃ蛋白質の発現をＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動によって確認した結果、２１ｋＤ
ａのＨＣＶｃ蛋白質に相当するバンドが不溶性画分に大
量に存在することがわかった。
【００８７】不溶性画分を０．１５ＭＮａＣｌを含む５
０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で充分に洗浄
した後、これを６Ｍグアニジン塩酸塩／１ｍＭＤＴＴ／
５０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．８）に溶解し、
３５℃で１時間可溶化処理した。これを処理液と同様の
展開液を用いるＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム
によるゲル濾過により精製した。精製されたフラクショ
ンを分画分子量５０００の限外濾過によって１０ｍｇ／
ｍｌにまで濃縮した。
０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で充分に洗浄
した後、これを６Ｍグアニジン塩酸塩／１ｍＭＤＴＴ／
５０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．８）に溶解し、
３５℃で１時間可溶化処理した。これを処理液と同様の
展開液を用いるＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム
によるゲル濾過により精製した。精製されたフラクショ
ンを分画分子量５０００の限外濾過によって１０ｍｇ／
ｍｌにまで濃縮した。
【００８８】可溶化ＨＣＶｃ５μｌに、３μｌの参考例
１で調製したメタノコッカス・サーモリソトロフィカス
由来組み換え型ＰＰＩアーゼ１．６ｍｇ／ｍｌ及び０．
０５ＭＮａＣｌを含む０．１ＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．８）を１９５μｌ添加混合し、３５℃で２時間反
応させた。反応終了後、ＴＳＫｇｅｌＧ４０００カラム
によるゲル濾過によって再生ＨＣＶｃ抗原を分析した結
果を、図１３に示す。ＨＣＶｃ抗原は保持時間６．８分
のピークとして現れ、均一な粒子構造を形成しているこ
とを示す。なお、ＰＰＩアーゼを含まない０．１ＭＮａ
−リン酸緩衝液（ｐＨ７．８）を１９５μｌ添加混合し
た場合は沈殿が生じた。
１で調製したメタノコッカス・サーモリソトロフィカス
由来組み換え型ＰＰＩアーゼ１．６ｍｇ／ｍｌ及び０．
０５ＭＮａＣｌを含む０．１ＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．８）を１９５μｌ添加混合し、３５℃で２時間反
応させた。反応終了後、ＴＳＫｇｅｌＧ４０００カラム
によるゲル濾過によって再生ＨＣＶｃ抗原を分析した結
果を、図１３に示す。ＨＣＶｃ抗原は保持時間６．８分
のピークとして現れ、均一な粒子構造を形成しているこ
とを示す。なお、ＰＰＩアーゼを含まない０．１ＭＮａ
−リン酸緩衝液（ｐＨ７．８）を１９５μｌ添加混合し
た場合は沈殿が生じた。
【００８９】精製されたＨＣＶｃ粒子を９６穴マイクロ
タイタープレートにコートした後、牛血清アルブミンで
ブロッキングを施し、ＰＢＳ−Ｔ緩衝液（１０ｍＭＮａ
−リン酸緩衝液ｐＨ７．５／０．８％塩化ナトリウム／
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。次にＰＢ
Ｓ−Ｔ緩衝液で希釈したヒト陽性あるいは陰性血清を加
え反応させた。ＰＢＳ−Ｔ緩衝液で洗浄後、ペルオキシ
ダーゼ標識ヒトＩｇＧ抗体（バイオジェネシス社製）を
作用させた。反応終了後、ＰＢＳ−Ｔ緩衝液で４回洗浄
し、基質発色液（フェニルジアミン及び過酸化水素を含
む）を加え反応させた。４Ｎ硫酸添加によって反応を止
めた後、４９０ｎｍにおける吸収を測定した。結果を表
４に示す。本実施例のコントロールとして標準血清につ
いても同様の抗原性評価を行った。
タイタープレートにコートした後、牛血清アルブミンで
ブロッキングを施し、ＰＢＳ−Ｔ緩衝液（１０ｍＭＮａ
−リン酸緩衝液ｐＨ７．５／０．８％塩化ナトリウム／
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。次にＰＢ
Ｓ−Ｔ緩衝液で希釈したヒト陽性あるいは陰性血清を加
え反応させた。ＰＢＳ−Ｔ緩衝液で洗浄後、ペルオキシ
ダーゼ標識ヒトＩｇＧ抗体（バイオジェネシス社製）を
作用させた。反応終了後、ＰＢＳ−Ｔ緩衝液で４回洗浄
し、基質発色液（フェニルジアミン及び過酸化水素を含
む）を加え反応させた。４Ｎ硫酸添加によって反応を止
めた後、４９０ｎｍにおける吸収を測定した。結果を表
４に示す。本実施例のコントロールとして標準血清につ
いても同様の抗原性評価を行った。
【００９０】
【表４】
【００９１】実施例１０ 配列17に示したＨＣＶ−Ｅ１（Ｃ型肝炎ウィルス表面抗
原Ｅ１蛋白質）をコードする２本鎖合成遺伝子（５９１
ｂｐ、アミノ酸配列を配列番号18に示す）をＮｄｅＩ及
びＢａｍＨＩで消化後、同様の制限酵素処理が施された
Ｔ７プロモーターを保持する発現ベクターに導入し、合
成ＨＣＶ−Ｅ１遺伝子発現ベクターｐＴＨＣＶＥ１を構
築した。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株をｐＴＨＣＶＥ１
で形質転換した後、カルベニシリン（１００μｇ／ｍ
ｌ）を含むＬＢプレートにまき、３７℃で一昼夜培養し
た。
原Ｅ１蛋白質）をコードする２本鎖合成遺伝子（５９１
ｂｐ、アミノ酸配列を配列番号18に示す）をＮｄｅＩ及
びＢａｍＨＩで消化後、同様の制限酵素処理が施された
Ｔ７プロモーターを保持する発現ベクターに導入し、合
成ＨＣＶ−Ｅ１遺伝子発現ベクターｐＴＨＣＶＥ１を構
築した。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株をｐＴＨＣＶＥ１
で形質転換した後、カルベニシリン（１００μｇ／ｍ
ｌ）を含むＬＢプレートにまき、３７℃で一昼夜培養し
た。
【００９２】生育してきたコロニー１０個をカルベニシ
リン（１００μｇ／ｍｌ）を含む２ＸＬＢ液体培地に植
菌し、３５℃で培養した。培養液のＯＤ６００が０．４
から１．０に到達した時点で、１ｍＭＩＰＴＧを添加
し、さらに１０時間培養した。培養終了後、遠心分離に
よって菌体を回収後、超音波破砕した。遠心分離によっ
て沈殿画分と可溶性画分に分離した後、それぞれにおけ
るＨＣＶ−Ｅ１蛋白質（２１ｋＤａ）の存在をＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。そ
の結果、沈殿画分に存在することがわかった。
リン（１００μｇ／ｍｌ）を含む２ＸＬＢ液体培地に植
菌し、３５℃で培養した。培養液のＯＤ６００が０．４
から１．０に到達した時点で、１ｍＭＩＰＴＧを添加
し、さらに１０時間培養した。培養終了後、遠心分離に
よって菌体を回収後、超音波破砕した。遠心分離によっ
て沈殿画分と可溶性画分に分離した後、それぞれにおけ
るＨＣＶ−Ｅ１蛋白質（２１ｋＤａ）の存在をＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。そ
の結果、沈殿画分に存在することがわかった。
【００９３】沈殿画分を０．１５ＭＮａＣｌを含む５０
ｍＭ Ｋ−燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、こ
れを６Ｍグアニディウム塩酸塩／１ｍＭＤＴＴ／５０ｍ
ＭＫ−燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した。遠心分離
で不溶性成分を除去した後、同様の液を展開液としてＴ
ＳＫｇｅｌＧ２０００ＳＷＸＬによって分離した。ＨＣ
Ｖ−Ｅ１蛋白質の存在するフラクションを回収し、限外
ろ過によって５０ｍｇ／ｍｌにまで濃縮した。
ｍＭ Ｋ−燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、こ
れを６Ｍグアニディウム塩酸塩／１ｍＭＤＴＴ／５０ｍ
ＭＫ−燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した。遠心分離
で不溶性成分を除去した後、同様の液を展開液としてＴ
ＳＫｇｅｌＧ２０００ＳＷＸＬによって分離した。ＨＣ
Ｖ−Ｅ１蛋白質の存在するフラクションを回収し、限外
ろ過によって５０ｍｇ／ｍｌにまで濃縮した。
【００９４】得られたＨＣＶ−Ｅ１蛋白質溶液５μｌ
に、３μｌの参考例１で調製したメタノコッカス・サー
モリソトロフィカス由来組み換え型ＰＰＩアーゼ１．６
ｍｇ／ｍｌ及び０．０５ＭＮａＣｌを含む０．１ＭＫ−
燐酸緩衝液（ｐＨ７．８）を１９５μｌ添加混合し、３
５℃で２時間反応させた。反応終了後、遠心分離を行っ
た後、上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
で分析した結果、ＨＣＶ−Ｅ１蛋白質が可溶性蛋白とし
て存在していることが判明した。本ＨＣＶ−Ｅ１蛋白質
を含む反応液を、ＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷカ
ラムによって、分離した後、ＨＣＶ−Ｅ１蛋白質を含む
フラクションをＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム
によるゲルろ過によって再生ＨＣＶ−Ｅ１蛋白質の分子
量分布を調べた。その結果、ＨＣＶ−Ｅ１蛋白質は図１
４に示すように保持時間６．９分のピークとして現れ、
均一な粒子構造を形成していると判断できた。
に、３μｌの参考例１で調製したメタノコッカス・サー
モリソトロフィカス由来組み換え型ＰＰＩアーゼ１．６
ｍｇ／ｍｌ及び０．０５ＭＮａＣｌを含む０．１ＭＫ−
燐酸緩衝液（ｐＨ７．８）を１９５μｌ添加混合し、３
５℃で２時間反応させた。反応終了後、遠心分離を行っ
た後、上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
で分析した結果、ＨＣＶ−Ｅ１蛋白質が可溶性蛋白とし
て存在していることが判明した。本ＨＣＶ−Ｅ１蛋白質
を含む反応液を、ＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷカ
ラムによって、分離した後、ＨＣＶ−Ｅ１蛋白質を含む
フラクションをＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム
によるゲルろ過によって再生ＨＣＶ−Ｅ１蛋白質の分子
量分布を調べた。その結果、ＨＣＶ−Ｅ１蛋白質は図１
４に示すように保持時間６．９分のピークとして現れ、
均一な粒子構造を形成していると判断できた。
【００９５】ゲルろ過によって精製されたＨＣＶ−Ｅ１
粒子と実施例９で調製されたＨＣＶｃ粒子を蛋白質量で
等量づつ９６穴マイクロタイタープレートにコートした
後、牛血清アルブミンでブロッキングを施し、実施例９
と同一の方法でヒト陽性血清で抗原性の評価を行った。
結果を表５に示す。また、本評価のコントロールとして
実施例９で調製されたＨＣＶｃ粒子のみを含むサンプル
についても同様の評価を行った。
粒子と実施例９で調製されたＨＣＶｃ粒子を蛋白質量で
等量づつ９６穴マイクロタイタープレートにコートした
後、牛血清アルブミンでブロッキングを施し、実施例９
と同一の方法でヒト陽性血清で抗原性の評価を行った。
結果を表５に示す。また、本評価のコントロールとして
実施例９で調製されたＨＣＶｃ粒子のみを含むサンプル
についても同様の評価を行った。
【００９６】
【表５】
【００９７】実施例１１ 配列表の配列番号１９に示したＨＩＶコア抗原蛋白質ｐ
２４をコードする２本鎖合成遺伝子（７１５ｂｐ、アミ
ノ酸配列を配列番号２０に示す）をＮｄｅＩ及びＢａｍ
ＨＩで消化後、同様の制限酵素処理が施されたＴ７プロ
モーターを保持する発現ベクターに導入し、合成ＨＩＶ
遺伝子発現ベクターｐＴＨＩＶを構築した。大腸菌ＢＬ
２１（ＤＥ３）株をｐＴＨＩＶで形質転換した後、アン
ピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢプレートにま
き、３７℃で一昼夜培養した。
２４をコードする２本鎖合成遺伝子（７１５ｂｐ、アミ
ノ酸配列を配列番号２０に示す）をＮｄｅＩ及びＢａｍ
ＨＩで消化後、同様の制限酵素処理が施されたＴ７プロ
モーターを保持する発現ベクターに導入し、合成ＨＩＶ
遺伝子発現ベクターｐＴＨＩＶを構築した。大腸菌ＢＬ
２１（ＤＥ３）株をｐＴＨＩＶで形質転換した後、アン
ピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢプレートにま
き、３７℃で一昼夜培養した。
【００９８】生育してきたコロニー１０個を、アンピシ
リン（１００μｇ／ｍｌ）を含む２ＸＬＢ液体培地に植
菌し、３７℃で培養した。培養液のＯＤ６００が０．８
５に到達した時点で、１ｍＭＩＰＴＧを添加し、さらに
１０時間培養した。培養終了後、遠心分離によって菌体
を回収した。超音波処理によって菌体を破砕した後、遠
心分離によって沈殿画分と可溶性画分に分離した。各画
分におけるＨＩＶコア抗原蛋白質ｐ２４の発現をＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって確認した結
果、２６ｋＤａのｐ２４蛋白質に相当するバンドが可溶
性画分に大量に存在することがわかった。
リン（１００μｇ／ｍｌ）を含む２ＸＬＢ液体培地に植
菌し、３７℃で培養した。培養液のＯＤ６００が０．８
５に到達した時点で、１ｍＭＩＰＴＧを添加し、さらに
１０時間培養した。培養終了後、遠心分離によって菌体
を回収した。超音波処理によって菌体を破砕した後、遠
心分離によって沈殿画分と可溶性画分に分離した。各画
分におけるＨＩＶコア抗原蛋白質ｐ２４の発現をＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって確認した結
果、２６ｋＤａのｐ２４蛋白質に相当するバンドが可溶
性画分に大量に存在することがわかった。
【００９９】可溶性画分を５０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液
（ｐＨ７．８）／１ｍＭＤＴＴ／０．５％オクチルグル
コシドの展開液を用いるＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸ
Ｌカラムによるゲル濾過により精製した。精製されたフ
ラクションを分画分子量５０００の限外濾過によって
５．０ｍｇ／ｍｌにまで濃縮した。５μｌの可溶化ＨＩ
Ｖコア抗原蛋白質ｐ２４に、８Ｍグアニジン塩酸塩／１
ｍＭＤＴＴ／０．５％オクチルグルコシド／５０ｍＭＮ
ａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．８）５μｌを添加し、その
後、３μｌの参考例１で調製したメタノコッカス・サー
モリソトロフィカス由来組み換え型ＰＰＩアーゼ１．６
ｍｇ／ｍｌ及び０．０５ＭＫＣｌを含む０．１ＭＮａ−
リン酸緩衝液（ｐＨ７．８）を１９０μｌ添加混合し、
３５℃で２時間反応させた。
（ｐＨ７．８）／１ｍＭＤＴＴ／０．５％オクチルグル
コシドの展開液を用いるＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸ
Ｌカラムによるゲル濾過により精製した。精製されたフ
ラクションを分画分子量５０００の限外濾過によって
５．０ｍｇ／ｍｌにまで濃縮した。５μｌの可溶化ＨＩ
Ｖコア抗原蛋白質ｐ２４に、８Ｍグアニジン塩酸塩／１
ｍＭＤＴＴ／０．５％オクチルグルコシド／５０ｍＭＮ
ａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．８）５μｌを添加し、その
後、３μｌの参考例１で調製したメタノコッカス・サー
モリソトロフィカス由来組み換え型ＰＰＩアーゼ１．６
ｍｇ／ｍｌ及び０．０５ＭＫＣｌを含む０．１ＭＮａ−
リン酸緩衝液（ｐＨ７．８）を１９０μｌ添加混合し、
３５℃で２時間反応させた。
【０１００】反応終了後の組み換え型ＨＩＶ抗原０．１
５μｇ／ｍｌを５０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）で希釈した後、さらにヒト管理血清Ｌ−コンセーラ
Ｎ「ニッスイ」（日水製薬）でさらに０．０１５μｇ／
ｍｌにまで希釈した。抗原希釈液の抗原性をＨＩＶ抗原
・ＥＩＡキット、ＨＩＶ抗原・ＥＩＡII「アボット」
（ダイナボット（株）社製）によって評価した。また、
コントロールとして標準血清についても同様の抗原性評
価を行った。
５μｇ／ｍｌを５０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）で希釈した後、さらにヒト管理血清Ｌ−コンセーラ
Ｎ「ニッスイ」（日水製薬）でさらに０．０１５μｇ／
ｍｌにまで希釈した。抗原希釈液の抗原性をＨＩＶ抗原
・ＥＩＡキット、ＨＩＶ抗原・ＥＩＡII「アボット」
（ダイナボット（株）社製）によって評価した。また、
コントロールとして標準血清についても同様の抗原性評
価を行った。
【０１０１】実施例１２ （ＰＰＩアーゼ反応系のみ） ５μｌの可溶化ＨＩＶコア抗原蛋白質ｐ２４に、添加す
る液を８Ｍグアニジン塩酸塩／１ｍＭＤＴＴ／０．５％
オクチルグルコシド／５０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．８）のかわりに５０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．８）とした以外は実施例１１と同様の反応を行
い、抗原性を評価した。
る液を８Ｍグアニジン塩酸塩／１ｍＭＤＴＴ／０．５％
オクチルグルコシド／５０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．８）のかわりに５０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．８）とした以外は実施例１１と同様の反応を行
い、抗原性を評価した。
【０１０２】比較例１ （変性処理反応およびＰＰＩア
ーゼ反応を行わない系） ５μｌの可溶化ＨＩＶコア抗原蛋白質ｐ２４に、添加す
る液を８Ｍグアニジン塩酸塩／１ｍＭＤＴＴ／０．５％
オクチルグルコシド／５０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．８）のかわりに５０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．８）、さらに組み換え型ＰＰＩアーゼ１．６ｍｇ
／ｍｌ及び０．０５ＭＫＣｌを含む０．１ＭＮａ−リン
酸緩衝液（ｐＨ７．８）のかわりに０．１ＭＮａ−リン
酸緩衝液（ｐＨ７．８）とした以外は実施例１１と同様
の反応を行い、抗原性を評価した。
ーゼ反応を行わない系） ５μｌの可溶化ＨＩＶコア抗原蛋白質ｐ２４に、添加す
る液を８Ｍグアニジン塩酸塩／１ｍＭＤＴＴ／０．５％
オクチルグルコシド／５０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．８）のかわりに５０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．８）、さらに組み換え型ＰＰＩアーゼ１．６ｍｇ
／ｍｌ及び０．０５ＭＫＣｌを含む０．１ＭＮａ−リン
酸緩衝液（ｐＨ７．８）のかわりに０．１ＭＮａ−リン
酸緩衝液（ｐＨ７．８）とした以外は実施例１１と同様
の反応を行い、抗原性を評価した。
【０１０３】
【表６】
【０１０４】表１〜６に示されるように、天然型ＨＢｓ
抗原、又は、不活性な組み換え型ＨＢｓ抗原、ＨＢｃ抗
原、ＨＣＶ抗原若しくはＨＩＶ抗原を、尿素、グアニジ
ウム塩酸塩等の変性剤の存在下で、ジチオスレイトール
等の還元剤やオクチルグルコシド等の界面活性剤を作用
させて低分子化あるいは変性処理した後、ＰＰＩアーゼ
を反応させること、あるいは可溶化ＨＩＶ抗原にＰＰＩ
アーゼを反応させることによって、より強い抗原活性を
有したウイルス抗原を得ることが可能であることが判明
した。
抗原、又は、不活性な組み換え型ＨＢｓ抗原、ＨＢｃ抗
原、ＨＣＶ抗原若しくはＨＩＶ抗原を、尿素、グアニジ
ウム塩酸塩等の変性剤の存在下で、ジチオスレイトール
等の還元剤やオクチルグルコシド等の界面活性剤を作用
させて低分子化あるいは変性処理した後、ＰＰＩアーゼ
を反応させること、あるいは可溶化ＨＩＶ抗原にＰＰＩ
アーゼを反応させることによって、より強い抗原活性を
有したウイルス抗原を得ることが可能であることが判明
した。
【０１０５】
【発明の効果】本発明は、上述の構成よりなるので、抗
原活性を高めたウイルス抗原を得ることができ、それを
用いることにより免疫測定試薬の製造等に有用である。
また、本発明のウイルス抗原の調製法は、細菌又は酵母
を宿主とした遺伝子組み換え法により得られたウイルス
抗原に対して適用できるので、短い培養日数で簡便な操
作で大量にウイルス抗原を提供することが可能になる。
原活性を高めたウイルス抗原を得ることができ、それを
用いることにより免疫測定試薬の製造等に有用である。
また、本発明のウイルス抗原の調製法は、細菌又は酵母
を宿主とした遺伝子組み換え法により得られたウイルス
抗原に対して適用できるので、短い培養日数で簡便な操
作で大量にウイルス抗原を提供することが可能になる。
【０１０６】
【配列表】 <110> 積水化学工業株式会社 SEKISUI CHEMICAL CO., LTD. 株式会社海洋バイオテクノロジー研究所 Marine Biotechnology Institute Co., Ltd. <120> ウイルス抗原の調製法 <130> 99P02404 <150> JP P1998-377103 <151> 1998-12-28 <150> JP P1999-136346 <151> 1999-05-17 <160> 20 <210> 1 <211> 608 <212> DNA <213> Methanococcus thermolithotrophicus <220> <221> CDS <222> 82..543 <400> 1 tgtaataaat ccattaatcg tggtagcaat aataaaatat atataccaat acagtttgag 60 ttatgatatc gacataagca t gtg att ttt ttg gta gat aaa gga gtt aaa 111 Val Ile Phe Leu Val Asp Lys Gly Val Lys 1 5 10 ata aaa gta gac tac ata ggt aaa ctt gaa agt gga gat gtc ttt gac 159 Ile Lys Val Asp Tyr Ile Gly Lys Leu Glu Ser Gly Asp Val Phe Asp 15 20 25 act tcc ata gaa gag gta gca aaa gaa gct gga ata tac gcg cct gat 207 Thr Ser Ile Glu Glu Val Ala Lys Glu Ala Gly Ile Tyr Ala Pro Asp 30 35 40 aga gaa tat gaa cct cta gag ttc gtt gta gga gaa ggt cag ttg att 255 Arg Glu Tyr Glu Pro Leu Glu Phe Val Val Gly Glu Gly Gln Leu Ile 45 50 55 caa ggt ttt gaa gaa gct gtt tta gac atg gaa gtc ggg gac gaa aaa 303 Gln Gly Phe Glu Glu Ala Val Leu Asp Met Glu Val Gly Asp Glu Lys 60 65 70 acc gta aaa atc cct gca gag aaa gca tac ggt aac aga aat gaa atg 351 Thr Val Lys Ile Pro Ala Glu Lys Ala Tyr Gly Asn Arg Asn Glu Met 75 80 85 90 tta ata cag aaa ata cca aga gat gct ttt aaa gaa gct gat ttt gaa 399 Leu Ile Gln Lys Ile Pro Arg Asp Ala Phe Lys Glu Ala Asp Phe Glu 95 100 105 cct gaa gaa gga atg gta atc ctt gca gaa gga att cct gct aca ata 447 Pro Glu Glu GIy Met Val Ile Leu Ala Glu Gry Ile Pro Ala Thr Ile 110 115 120 acc gaa gtt aca gat aat gag gta act tta gac ttt aac cat gaa ctt 495 Thr Glu Val Thr Asp Asn Glu Val Thr Leu Asp Phe Asn His Glu Leu 125 130 135 gca gga aaa gat tta gta ttt aca att aaa att att gaa gtt gtc gaa 543 Ala Gly Lys Asp Leu Val Phe Thr Ile Lys Ile Ile Glu Val Val Glu 140 145 150 taattatcat tataacattc cgccgagatt aaataaaatc acttgtgatt ttatatcttt 603 acccg 608 <210> 2 <211> 154 <212> PRT <213> Methanococcus thermolithotrophicus <400> 2 Val Ile Phe Leu Val Asp Lys Gly Val Lys Ile Lys Val Asp Tyr Ile 1 5 10 15 Gly Lys Leu Glu Ser Gly Asp Val Phe Asp Thr Ser Ile Glu Glu Val 20 25 30 Ala Lys Glu Ala Gly Ile Tyr Ala Pro Asp Arg Glu Tyr Glu Pro Leu 35 40 45 Glu Phe Val Val Gly Glu Gly Gln Leu Ile Gln Gly Phe Glu Glu Ala 50 55 60 Val Leu Asp Met Glu Val Gly Asp Glu Lys Thr Val Lys Ile Pro Ala 65 70 75 80 Glu Lys Ala Tyr Gly Asn Arg Asn Glu Met Leu Ile Gln Lys Ile Pro 85 90 95 Arg Asp Ala Phe Lys Glu Ala Asp Phe Glu Pro Glu Glu GIy Met Val 100 105 110 Ile Leu Ala Glu Gry Ile Pro Ala Thr Ile Thr Glu Val Thr Asp Asn 115 120 125 Glu Val Thr Leu Asp Phe Asn His Glu Leu Ala Gly Lys Asp Leu Val 130 135 140 Phe Thr Ile Lys Ile Ile Glu Val Val Glu 145 150 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 配列表フリーテキスト フォワードプライマー <400> 3 ggccatggta gataaaggag ttaaaataa 29 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 配列表フリーテキスト リバースプライマー <400> 4 ccggatcctt attcgacaac ttcaataatt 30 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> variation <222> 5 <221> variation <222> 16 <221> variation <222> 25 <223> 配列表フリーテキスト プライマー <400> 5 gsccnwtggb gataangcha tccgnccgc 29 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> variation <222> 4 <221> variation <222> 25 <223> 配列表フリーテキスト プライマー <400> 6 atgncstcca tccgyatgcg atgcnggtcw 30 <210> 7 <211> 678 <212> DNA <213> Type B hepatitis virus <220> <221> CDS <222> 1..678 <400> 7 atg gag aac atc aca tca gga ttc cta gga ccc ctg ctc gtg tta cag 48 Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln 1 5 10 15 gcg ggg ttt ttc ttg ttg aca aga atc ctc aca ata ccg cag agt cta 96 Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu 20 25 30 gac tcg tgg tgg act tct ctc aat ttt cta ggg gga tca ccc gtg tgt 144 Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ser Pro Val Cys 35 40 45 ctt ggc caa aat tcg cag tcc cca acc tcc aat cac tca cca acc tcc 192 Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser 50 55 60 tgt cct cca att tgt cct ggt tat cgc tgg atg tgt ctg cgg cgt ttt 240 Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe 65 70 75 80 atc ata ttc ctc ttc atc ctg ctg cta tgc ctc atc ttc tta ttg gtt 288 Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val 85 90 95 ctt ctg gat tat caa ggt atg ttg ccc gtt tgt cct cta att cca gga 336 Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly 100 105 110 tca aca aca acc agt acg gga cca tgc aaa acc tgc acg act cct gct 384 Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala 115 120 125 caa ggc aac tct aag ttt ccc tca tgt tgc tgt aca aaa cct acg gat 432 Gln Gly Asn Ser Lys Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp 130 135 140 gga aat tgc acc tgt att ccc atc cca tcg tcc tgg gct ttc gca aaa 480 Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys 145 150 155 160 tac cta tgg gag tgg gcc tca gtc cgt ttc tct tgg ctc agt tta cta 528 Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu 165 170 175 gtg cca ttt gtt cag tgg ttc gta ggg ctt tcc ccc act gtt tgg ctt 576 Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu 180 185 190 tca gct ata tgg atg atg tgg tat tgg ggg cca agt ctg tac agc atc 624 Ser Ala Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile 195 200 205 gtg agt ccc ttt ata ccg ctg tta cca att ttc ttt tgt ctc tgg gta 672 Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val 210 215 220 tac att 678 Tyr Ile 225 <210> 8 <211> 226 <212> PRT <213> Type B hepatitis virus <400> 8 Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln 1 5 10 15 Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu 20 25 30 Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ser Pro Val Cys 35 40 45 Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser 50 55 60 Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe 65 70 75 80 Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val 85 90 95 Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly 100 105 110 Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala 115 120 125 Gln Gly Asn Ser Lys Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp 130 135 140 Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys 145 150 155 160 Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu 165 170 175 Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu 180 185 190 Ser Ala Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile 195 200 205 Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val 210 215 220 Tyr Ile 225 <210> 9 <211> 681 <212> DNA <213> Type B hepatitis virus <220> <221> CDS <222> 1..678 <400> 9 atg gag aac aca aca tca gga ttc cta gga ccc ctg ctc gtg tta cag 48 Met Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln 1 5 10 15 gcg ggg ttt ttc ttg ttg aca aga atc cta aca ata cca cag agt cta 96 Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu 20 25 30 gac tcg tgg tgg act tct ctc aat ttt cta ggg gga gca ccc acg tgt 144 Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys 35 40 45 cct ggc caa aat tcg cag tcc cca acc tcc aat cag tca cca acc tct 192 Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn Gln Ser Pro Thr Ser 50 55 60 tgt cct cca att tgt cct ggc tat cgc tgg atg tgt ctg cgg cgt ttt 240 Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe 65 70 75 80 atc ata ttc ctc ttc atc ctg ctg cta tgc ctc atc ttc ttg ttg gtt 288 Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val 85 90 95 ctt ctg gac tac caa ggt atg ttg ccc gtt tgt cct cta ctt cca gga 336 Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly 100 105 110 aca tca act acc agc acg gga cca tgc aag acc tgc acg att cct gct 384 Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala 115 120 125 caa gga acc tct atg ttt ccc tct tgt tgc tgt aca aaa cct tcg gac 432 Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp 130 135 140 gga aac tgc act tgt att ccc atc cca tca tcc tgg gct ttc gca aga 480 Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg 145 150 155 160 ttc cta tgg gag ggg gcc tca gtc cgt ttc tcc tgg ctc agt tca cta 528 Phe Leu Trp Glu Gly Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Ser Leu 165 170 175 gtg cca ttt gtt cag tgg ttc gta ggg ctt tcc ccc act gtt tgg ctt 576 Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu 180 185 190 tca gtt ata tgg atg atg tgg tat tgg gga cca agt ctg tac aac atc 624 Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile 195 200 205 ttg agt ccc ttt tta cct cta tta cca att ttc ttt tgt ctt tgg gta 672 Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val 210 215 220 tac att taa 681 Tyr Ile 225 <210> 10 <211> 226 <212> PRT <213> Type B hepatitis virus <400> 10 Met Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln 1 5 10 15 Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu 20 25 30 Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys 35 40 45 Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn Gln Ser Pro Thr Ser 50 55 60 Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe 65 70 75 80 Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val 85 90 95 Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly 100 105 110 Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala 115 120 125 Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp 130 135 140 Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg 145 150 155 160 Phe Leu Trp Glu Gly Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Ser Leu 165 170 175 Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu 180 185 190 Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile 195 200 205 Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val 210 215 220 Tyr Ile 225 <210> 11 <211> 697 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> CDS <222> (6)..(689) <220> <223> 配列表フリーテキスト ａｄｒ型ＨＢｓ抗原をコードする２本鎖合成遺伝子 <400> 11 ggcat atg gaa aac act act tct ggt ttc ctg ggt ccg ctg ctg gta ctg 50 Met Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu 1 5 10 15 cag gca ggt ttc ttc ctg ctg aca cgt atc ctc aca att cca cag tct 98 Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser 20 25 30 ctg gac tct tgg tgg act tct ctc aat ttt ctg ggt ggt gca ccg act 146 Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr 35 40 45 tgc cct ggc caa aat tct cag tcc cca acc tcc aat cac tct cca acc 194 Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr 50 55 60 tct tgc cct cca att tgc cct ggc tat cgc tgg atg tgc ctg cgt cgt 242 Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg 65 70 75 ttt atc att ttc ctc ttc atc ctg ctg ctg tgc ctc atc ttc ctg ctg 290 Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu 80 85 90 95 gtt ctt ctg gac tac caa ggt atg ctg cca gtt tgc cct ctg ctt cca 338 Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro 100 105 110 ggt aca tct acc acc agc act ggt cca tgc aag acc tgc act att cct 386 Gly Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro 115 120 125 gct caa ggt acc tct atg ttt ccg tct tgc tgc tgc aca aaa cct tct 434 Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser 130 135 140 gac ggt aac tgc act tgc att ccg atc cca tct tcc tgg gct ttc gca 482 Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala 145 150 155 cgt ttc ctg tgg gag tgg gcc tct gtc cgt ttc tcc tgg ctc tct ctg 530 Arg Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu 160 165 170 175 ctg gtg cca ttt gtt cag tgg ttc gta ggt ctg tct ccg act gtt tgg 578 Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp 180 185 190 ctg tct gtt att tgg atg atg tgg tat tgg ggt cca tct ctg tac aac 626 Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn 195 200 205 atc ctg tct ccg ttt ctg cct ctg ctg cca att ttc ttc tgc ctt tgg 674 Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp 210 215 220 gta tac att taa tag ggatccgg 697 Val Tyr Ile 225 <210> 12 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 12 Met Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln 1 5 10 15 Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu 20 25 30 Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys 35 40 45 Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser 50 55 60 Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe 65 70 75 80 Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val 85 90 95 Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly 100 105 110 Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala 115 120 125 Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp 130 135 140 Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg 145 150 155 160 Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu 165 170 175 Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu 180 185 190 Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile 195 200 205 Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val 210 215 220 Tyr Ile 225 <210> 13 <211> 568 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> CDS <222> (6)..(560) <220> <223> 配列表フリーテキスト ＨＢｃ抗原をコードする２本鎖合成遺伝子 <400> 13 ggcat atg gac atc gac ccg tac aaa gaa ttc ggt gct tct gtt gaa ctg 50 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu 1 5 10 15 ctg tct ttt ctg cct tct gac ttc ttt cct tct att cgt gat ctc ctc 98 Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu 20 25 30 gac acc gcc tct gct ctg tat cgt gag gcc ctc gag tct ccg gaa cat 146 Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His 35 40 45 tgc tct cct cac cat aca gca ctc cgt caa gct atc ctg tgc tgg ggt 194 Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly 50 55 60 gag ctg atg aat ctg gcc acc tgg gtg ggt agc aat ctg gaa gac cca 242 Glu Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro 65 70 75 gca tcc agc gaa ctt gta gtc agc tat gtc aat gtt aat atg ggc ctg 290 Ala Ser Ser Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu 80 85 90 95 aaa atc cgt caa ctg ctg tgg ttt cac att tcc tgc ctt act ttt ggc 338 Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly 100 105 110 cgt gaa act gtt ctt gag tat ctg gtg tct ttt ggt gtg tgg att cgc 386 Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg 115 120 125 act cct ccg gct tac cgt cca cca aat gcc cct atc ctg tct aca ctt 434 Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu 130 135 140 ccg gaa act act gtt gtt cgt cgt cgt ggc cgt tcc cct cgt cgc cgt 482 Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg 145 150 155 act ccg tct cct cgc cgt cgt cgt tct caa tct ccg cgt cgc cgt cgc 530 Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg 160 165 170 175 tct caa tct cgt gaa tct caa tgc taa tag ggatccgg 568 Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 180 185 <210> 14 <211> 183 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 14 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60 Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala 65 70 75 80 Ser Ser Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95 Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110 Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr 115 120 125 Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140 Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr 145 150 155 160 Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser 165 170 175 Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 180 <210> 15 <211> 592 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 配列表フリーテキスト ＨＣＶｃ抗原をコードする２本鎖合成遺伝子 <220> <221> CDS <222> (6)..(590) <400> 15 ggcat atg tct act aac ccg aaa ccg cag cgt aaa act aaa cgt aac act 50 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr 1 5 10 15 aac cgt cgc cca cag gac gtc aag ttc cct ggt ggt ggt cag atc gtt 98 Asn Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val 20 25 30 ggt ggc gtt tac ctg ctt cca cgc cgt ggc cca cgt ctg ggt gtg cgt 146 Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg 35 40 45 gcg act cgt aag act tcc gag cgc tct caa cct cgt ggt cgt cgt caa 194 Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln 50 55 60 cct atc ccg aag gct cgt cgt cca gag ggt cgt gcc tgg gct cag cca 242 Pro Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ala Trp Ala Gln Pro 65 70 75 ggt tac cct tgg cca ctc tat ggc aat gag ggc atg ggt tgg gca ggt 290 Gly Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Met Gly Trp Ala Gly 80 85 90 95 tgg ctc ctg tct cca cgc ggt tcc cgt cct agc tgg ggt ccg act gac 338 Trp Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp 100 105 110 cca cgt cgt cgc tct cgt aac ctg ggt aag gtc atc gat acc ctc aca 386 Pro Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr 115 120 125 tgc ggc ttc gcc gac ctc atg ggt tac att ccg ctc gtc ggt gcc cca 434 Cys Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro 130 135 140 ctg ggt ggt gct gcc cgt gcc ctg gcg cat ggc gtc cgt gtt ctg gaa 482 Leu Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu 145 150 155 gac ggc gtg aac tat gca aca ggt aat ctg cca ggt tgc tct ttc tct 530 Asp Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser 160 165 170 175 atc ttc ctc ctg gct ctg ctg tcc tgc ctg acc atc cca gcc tcc gct 578 Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala 180 185 190 taa tag gga tcc gg 592 <210> 16 <211> 191 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 16 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn 1 5 10 15 Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly 20 25 30 Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala 35 40 45 Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro 50 55 60 Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ala Trp Ala Gln Pro Gly 65 70 75 80 Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Met Gly Trp Ala Gly Trp 85 90 95 Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro 100 105 110 Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys 115 120 125 Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu 130 135 140 Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp 145 150 155 160 Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile 165 170 175 Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala 180 185 190 <210> 17 <211> 594 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> CDS <222> (4)..(582) <223> 配列表フリーテキスト ＨＣＶ−Ｅ１をコードする２本鎖合成遺伝子 <400> 17 cat atg tat gag gtg cgc aac gcg tcc ggg gtg tac cat gtc acg aac 48 Met Tyr Glu Val Arg Asn Ala Ser Gly Val Tyr His Val Thr Asn 1 5 10 15 gac tgc tct aac gca agc att gtg tat gag gca gcg gac atg atc atg 96 Asp Cys Ser Asn Ala Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Met Ile Met 20 25 30 cat acc ccc ggg tgt gtg ccc tgc gtt cgg gag gcc aat tcc tcc cgc 144 His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Ala Asn Ser Ser Arg 35 40 45 tgc tgg gta gcg ctc act ccc acg ctc gcg gcc agg aac tcc agc gtc 192 Cys Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Arg Asn Ser Ser Val 50 55 60 cca act acg aca ata cga cgc cac gtc gat ttg ctc gtt ggg gcg gct 240 Pro Thr Thr Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu Leu Val Gly Ala Ala 65 70 75 gct ttc tgc tcc gct atg tac gtg ggg gat ctc tgc gga tct gtt ttc 288 Ala Phe Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe 80 85 90 95 ctc gtc tcc cag ctg ttc acc ttc tcg cct cgc cgg cat gag acg gta 336 Leu Val Ser Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Glu Thr Val 100 105 110 cag gac tgc aat tgt tca atc tat ccc ggc cac gta tca ggt cac cgc 384 Gln Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Val Ser Gly His Arg 115 120 125 atg gct tgg gat atg atg atg aac tgg tca cct aca aca gcc cta gtg 432 Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val 130 135 140 gta tcg cag cta ctc cgg atc cca caa gct gtc atg gac atg gtg gcg 480 Val Ser Gln Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Val Met Asp Met Val Ala 145 150 155 ggg gcc cac tgg gga gtc ctg gcg ggc ctt gcc tac tat tcc atg gtg 528 Gly Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Val 160 165 170 175 ggg aac tgg gct aag gtc ttg att gtg atg cta ctc ttt gcc ggc gtt 576 Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu Ile Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val 180 185 190 gac ggg taataggaat tc 594 Asp Gly <210> 18 <211> 193 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 18 Met Tyr Glu Val Arg Asn Ala Ser Gly Val Tyr His Val Thr Asn Asp 1 5 10 15 Cys Ser Asn Ala Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Met Ile Met His 20 25 30 Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Ala Asn Ser Ser Arg Cys 35 40 45 Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Arg Asn Ser Ser Val Pro 50 55 60 Thr Thr Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu Leu Val Gly Ala Ala Ala 65 70 75 80 Phe Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu 85 90 95 Val Ser Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Glu Thr Val Gln 100 105 110 Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Val Ser Gly His Arg Met 115 120 125 Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val Val 130 135 140 Ser Gln Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Val Met Asp Met Val Ala Gly 145 150 155 160 Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Val Gly 165 170 175 Asn Trp Ala Lys Val Leu Ile Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp 180 185 190 Gly <210> 19 <211> 715 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> CDS <222> (6)..(701) <223> 配列表フリーテキスト ＨＩＶコア抗原蛋白質ｐ２４をコードする２本鎖合成遺伝子 <400> 19 ggcat atg ccg ata gtg cag aac tta cag ggg caa atg gta cat cag gcc 50 Met Pro Ile Val Gln Asn Leu Gln Gly Gln Met Val His Gln Ala 1 5 10 15 atc tca cct aga act tta aat gca tgg gtt aaa gta ata gag gag aag 98 Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Ile Glu Glu Lys 20 25 30 gct ttc agc cca gaa gta ata ccc atg ttt tca gca tta tca gaa gga 146 Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly 35 40 45 gcc acc cca caa gat tta aac acc atg cta aac aca gtg ggg gga cat 194 Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly Gly His 50 55 60 cag gca gct atg cag atg tta aaa gag acc atc aat gag gaa gct gca 242 Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu Ala Ala 65 70 75 gaa tgg gat aga tta cat cca gcg cat gca ggg ccc aat gca cca ggc 290 Glu Trp Asp Arg Leu His Pro Ala His Ala Gly Pro Asn Ala Pro Gly 80 85 90 95 cag atg aga gaa cca agg gga agt gac ata gca gga act act agt acc 338 Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Thr 100 105 110 ctt cag gaa cag ata gga tgg atg aca agt aat cca cct gta cca gta 386 Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Ser Asn Pro Pro Val Pro Val 115 120 125 gga gaa atc tat aaa aga tgg ata atc ctg ggg tta aat aaa ata gta 434 Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val 130 135 140 aga atg tat agt cct gtc agc att ctg gac ata aga caa gga cca aag 482 Arg Met Tyr Ser Pro Val Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly Pro Lys 145 150 155 gaa ccc ttt aga gat tat gta gac cgg ttc tat aaa act cta aga gcc 530 Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala 160 165 170 175 gag caa gct tca cag gat gta aaa aat tgg atg aca gaa acc ttg ttg 578 Glu Gln Ala Ser Gln Asp Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu 180 185 190 gtc caa aat gca aac cca gat tgt aag act att tta aaa gca ttg gga 626 Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala Leu Gly 195 200 205 cca gca gct aca tta gaa gaa atg atg aca gca tgt cag gga gtg gga 674 Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly 210 215 220 gga ccc agc cat aag gca aga att ttg taatagggat ccgg 715 Gly Pro Ser His Lys Ala Arg Ile Leu 225 230 <210> 20 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 20 Met Pro Ile Val Gln Asn Leu Gln Gly Gln Met Val His Gln Ala Ile 1 5 10 15 Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Ile Glu Glu Lys Ala 20 25 30 Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly Ala 35 40 45 Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly Gly His Gln 50 55 60 Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu Ala Ala Glu 65 70 75 80 Trp Asp Arg Leu His Pro Ala His Ala Gly Pro Asn Ala Pro Gly Gln 85 90 95 Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu 100 105 110 Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Ser Asn Pro Pro Val Pro Val Gly 115 120 125 Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg 130 135 140 Met Tyr Ser Pro Val Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly Pro Lys Glu 145 150 155 160 Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu 165 170 175 Gln Ala Ser Gln Asp Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu Val 180 185 190 Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala Leu Gly Pro 195 200 205 Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly 210 215 220 Pro Ser His Lys Ala Arg Ile Leu 225 230
【図１】実施例１における、天然型ＨＢｓ抗原（未処
理）のゲル濾過カラムクロマトグラフィーのチャートで
ある。縦軸は吸光度の強さ、横軸はカラムの保持時間を
示す単位である。
理）のゲル濾過カラムクロマトグラフィーのチャートで
ある。縦軸は吸光度の強さ、横軸はカラムの保持時間を
示す単位である。
【図２】実施例１における、低分子化処理した天然型Ｈ
Ｂｓ抗原のゲル濾過カラムクロマトグラフィーのチャー
トである。縦軸は吸光度の強さ、横軸はカラムの保持時
間を示す単位である。
Ｂｓ抗原のゲル濾過カラムクロマトグラフィーのチャー
トである。縦軸は吸光度の強さ、横軸はカラムの保持時
間を示す単位である。
【図３】実施例１における、低分子化処理後にＰＰＩア
ーゼ反応させた天然型ＨＢｓ抗原のゲル濾過カラムクロ
マトグラフィーのチャートである。縦軸は吸光度の強
さ、横軸はカラムの保持時間を示す単位である。
ーゼ反応させた天然型ＨＢｓ抗原のゲル濾過カラムクロ
マトグラフィーのチャートである。縦軸は吸光度の強
さ、横軸はカラムの保持時間を示す単位である。
【図４】実施例２における、低分子化処理後にＰＰＩア
ーゼ反応させた天然型ＨＢｓ抗原のゲル濾過カラムクロ
マトグラフィーのチャートである。縦軸は吸光度の強
さ、横軸はカラムの保持時間を示す単位である。
ーゼ反応させた天然型ＨＢｓ抗原のゲル濾過カラムクロ
マトグラフィーのチャートである。縦軸は吸光度の強
さ、横軸はカラムの保持時間を示す単位である。
【図５】実施例３における、低分子化処理した組み換え
型ａｄｗ型ＨＢｓ抗原のゲル濾過カラムクロマトグラフ
ィーのチャートである。縦軸は吸光度の強さ、横軸はカ
ラムの保持時間を示す単位である。
型ａｄｗ型ＨＢｓ抗原のゲル濾過カラムクロマトグラフ
ィーのチャートである。縦軸は吸光度の強さ、横軸はカ
ラムの保持時間を示す単位である。
【図６】実施例３における、低分子化処理後にＰＰＩア
ーゼ反応させた組み換え型ａｄｗ型ＨＢｓ抗原のゲル濾
過カラムクロマトグラフィーのチャートである。縦軸は
吸光度の強さ、横軸はカラムの保持時間を示す単位であ
る。
ーゼ反応させた組み換え型ａｄｗ型ＨＢｓ抗原のゲル濾
過カラムクロマトグラフィーのチャートである。縦軸は
吸光度の強さ、横軸はカラムの保持時間を示す単位であ
る。
【図７】実施例４における、低分子化処理後にＰＰＩア
ーゼ反応させた組み換え型ａｄｗ型ＨＢｓ抗原のゲル濾
過カラムクロマトグラフィーのチャートである。縦軸は
吸光度の強さ、横軸はカラムの保持時間を示す単位であ
る。
ーゼ反応させた組み換え型ａｄｗ型ＨＢｓ抗原のゲル濾
過カラムクロマトグラフィーのチャートである。縦軸は
吸光度の強さ、横軸はカラムの保持時間を示す単位であ
る。
【図８】実施例５における、低分子化処理した組み換え
型ａｄｒ型ＨＢｓ抗原のゲル濾過カラムクロマトグラフ
ィーのチャートである。縦軸は吸光度の強さ、横軸はカ
ラムの保持時間を示す単位である。
型ａｄｒ型ＨＢｓ抗原のゲル濾過カラムクロマトグラフ
ィーのチャートである。縦軸は吸光度の強さ、横軸はカ
ラムの保持時間を示す単位である。
【図９】実施例５における、低分子化処理後にＰＰＩア
ーゼ反応させた組み換え型ａｄｒ型ＨＢｓ抗原のゲル濾
過カラムクロマトグラフィーのチャートである。縦軸は
吸光度の強さ、横軸はカラムの保持時間を示す単位であ
る。
ーゼ反応させた組み換え型ａｄｒ型ＨＢｓ抗原のゲル濾
過カラムクロマトグラフィーのチャートである。縦軸は
吸光度の強さ、横軸はカラムの保持時間を示す単位であ
る。
【図１０】実施例６における、低分子化処理後にＰＰＩ
アーゼ反応させた組み換え型ａｄｒ型ＨＢｓ抗原のゲル
濾過カラムクロマトグラフィーのチャートである。縦軸
は吸光度の強さ、横軸はカラムの保持時間を示す単位で
ある。
アーゼ反応させた組み換え型ａｄｒ型ＨＢｓ抗原のゲル
濾過カラムクロマトグラフィーのチャートである。縦軸
は吸光度の強さ、横軸はカラムの保持時間を示す単位で
ある。
【図１１】実施例７における、低分子化処理後にＰＰＩ
アーゼ反応させた組み換え型ａｄｒ型ＨＢｓ抗原のゲル
濾過カラムクロマトグラフィーのチャートである。縦軸
は吸光度の強さ、横軸はカラムの保持時間を示す単位で
ある。
アーゼ反応させた組み換え型ａｄｒ型ＨＢｓ抗原のゲル
濾過カラムクロマトグラフィーのチャートである。縦軸
は吸光度の強さ、横軸はカラムの保持時間を示す単位で
ある。
【図１２】実施例８における、低分子化処理後にＰＰＩ
アーゼ反応させた組み換え型ＨＢｃ抗原のゲル濾過カラ
ムクロマトグラフィーのチャートである。縦軸は吸光度
の強さ、横軸はカラムの保持時間を示す単位である。
アーゼ反応させた組み換え型ＨＢｃ抗原のゲル濾過カラ
ムクロマトグラフィーのチャートである。縦軸は吸光度
の強さ、横軸はカラムの保持時間を示す単位である。
【図１３】実施例９における、低分子化処理後にＰＰＩ
アーゼ反応させた組み換え型ＨＣＶｃ抗原のゲル濾過カ
ラムクロマトグラフィーのチャートである。縦軸は吸光
度の強さ、横軸はカラムの保持時間を示す単位である。
アーゼ反応させた組み換え型ＨＣＶｃ抗原のゲル濾過カ
ラムクロマトグラフィーのチャートである。縦軸は吸光
度の強さ、横軸はカラムの保持時間を示す単位である。
【図１４】実施例１０における、低分子化処理後にＰＰ
Ｉアーゼ反応させた組み換え型ＨＣＶ−Ｅ１抗原のゲル
濾過カラムクロマトグラフィーのチャートである。縦軸
は吸光度の強さ、横軸はカラムの保持時間を示す単位で
ある。
Ｉアーゼ反応させた組み換え型ＨＣＶ−Ｅ１抗原のゲル
濾過カラムクロマトグラフィーのチャートである。縦軸
は吸光度の強さ、横軸はカラムの保持時間を示す単位で
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 古谷 昌弘 大阪府三島郡島本町百山２−１ 積水化学 工業株式会社内 (72)発明者 土居 淳 大阪府三島郡島本町百山２−１ 積水化学 工業株式会社内 (72)発明者 井手野 晃 岩手県釜石市平田第３地割75番１ 株式会 社海洋バイオテクノロジー研究所釜石研究 所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA07 BA33 BA35 CA02 DA06 DA12 EA04 FA02 GA11 4B064 AG01 AG32 AG33 CA02 CA06 CA19 CB28 CC24 DA15 4H045 AA11 AA20 BA10 CA02 CA05 CA11 DA86 DA89 EA53 FA73 FA74 GA15 GA22 HA05
Claims (9)
- 【請求項１】 ウイルス抗原にペプチジルプロリルシス
トランスイソメラーゼを反応させる工程からなることを
特徴とするウイルス抗原の調製法。 - 【請求項２】 ウイルス抗原を界面活性剤、還元剤及び
タンパク質変性剤からなる群より選択される少なくとも
一種によって処理する工程、並びに、前記処理されたウ
イルス抗原にペプチジルプロリルシストランスイソメラ
ーゼを反応させる工程からなることを特徴とするウイル
ス抗原の調製法。 - 【請求項３】 ウイルス抗原は、細菌及び酵母を宿主と
した遺伝子組み換え法により発現されたものである請求
項１又は２記載のウイルス抗原の調製法。 - 【請求項４】 ペプチジルプロリルシストランスイソメ
ラーゼは、不溶性担体に結合されたものである請求項
１、２又は３記載のウイルス抗原の調製法。 - 【請求項５】 ウイルス抗原は、Ｂ型肝炎ウイルス抗
原、Ｃ型肝炎ウイルス抗原又はエイズウイルス抗原であ
る請求項１、２、３又は４記載のウイルス抗原の調製
法。 - 【請求項６】 ペプチジルプロリルシストランスイソメ
ラーゼは、古細菌から調製したもの、又は、古細菌から
調製したＤＮＡから発現されたものである請求項１、
２、３、４又は５記載のウイルス抗原の調製法。 - 【請求項７】 古細菌は、メタノコッカス属に属する菌
である請求項６記載のウイルス抗原の調製法。 - 【請求項８】 メタノコッカス属に属する菌は、メタノ
コッカス・サーモリソトロフィカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕ
ｓ）又はメタノコッカス・ボルタエ（Ｍｅｔｈａｎｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｖｏｌｔａｅ）である請求項７記載のウイ
ルス抗原の調製法。 - 【請求項９】 請求項１、２、３、４、５、６、７又は
８記載のウイルス抗原の調製法により得られたウイルス
抗原。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27320399A JP2001066309A (ja) | 1998-12-28 | 1999-09-27 | ウイルス抗原の調製法 |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP37710398 | 1998-12-28 | ||
| JP10-377103 | 1998-12-28 | ||
| JP11-136346 | 1999-05-17 | ||
| JP11136346A JP2000249704A (ja) | 1998-12-28 | 1999-05-17 | ウイルス抗原の調製法 |
| JP27320399A JP2001066309A (ja) | 1998-12-28 | 1999-09-27 | ウイルス抗原の調製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001066309A true JP2001066309A (ja) | 2001-03-16 |
Family
ID=27317255
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27320399A Pending JP2001066309A (ja) | 1998-12-28 | 1999-09-27 | ウイルス抗原の調製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001066309A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004092221A1 (ja) * | 2003-04-18 | 2004-10-28 | Sekisui Chemical Co. Ltd. | 免疫原及び免疫用組成物、並びにそれらを使用する抗体の製造方法 |
| WO2005063964A1 (ja) * | 2003-12-25 | 2005-07-14 | Sekisui Chemical Co., Ltd. | ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ、発現ベクター、形質転換体、融合タンパク質、融合タンパク質の製造方法、目的タンパク質の製造方法、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの精製方法、及び融合タンパク質の精製方法 |
| WO2016017037A1 (ja) * | 2014-08-01 | 2016-02-04 | 株式会社ビークル | 免疫学的測定法に用いられるウイルス様粒子、それに用いられるブロッキング剤、及びこれらを含むキット |
| WO2022045151A1 (ja) * | 2020-08-24 | 2022-03-03 | 天野エンザイム株式会社 | 改変タンパク質の製造方法 |
-
1999
- 1999-09-27 JP JP27320399A patent/JP2001066309A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| JPWO2004092221A1 (ja) * | 2003-04-18 | 2006-07-06 | 積水化学工業株式会社 | 免疫原及び免疫用組成物、並びにそれらを使用する抗体の製造方法 |
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| WO2016017037A1 (ja) * | 2014-08-01 | 2016-02-04 | 株式会社ビークル | 免疫学的測定法に用いられるウイルス様粒子、それに用いられるブロッキング剤、及びこれらを含むキット |
| JP5867890B1 (ja) * | 2014-08-01 | 2016-02-24 | 株式会社ビークル | 免疫学的測定法に用いられるウイルス様粒子、それに用いられるブロッキング剤、及びこれらを含むキット |
| WO2022045151A1 (ja) * | 2020-08-24 | 2022-03-03 | 天野エンザイム株式会社 | 改変タンパク質の製造方法 |
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