JPH08505527A - 酵母ソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来の調節制御配列を用いる酵母発現促進 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子から誘導され、ベクターが宿主酵母細胞によって複製され保有されるようにＤＮＡセグメント及び外来ペプチドをコードする遺伝子がベクター中で作動可能に連結されたとき、関連外来ポリペプチドの発現を増加するよう機能する単離ＤＮＡセグメントを開示する。該セグメントの機能的活性部分は、（ｉ）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子の転写調節配列、（ii）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子の転写開始調節配列、及び（iii）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子の終結調節配列の制御下にある。外来ＤＮＡ配列に連結されたかかる調節配列を含む酵母細胞を、ソルビトールを含む培地中で外来ポリペプチドが発現され得る条件下に増殖させる。

Description

【発明の詳細な説明】酵母ソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来の調節制御配列を用いる酵母発現 促進 発明の分野 本発明は、酵母宿主系を用いる組み換えＤＮＡ技術に係わる。本発明は特に、 酵母における外来タンパク質の発現を促進し得る酵母ソルビトールデヒドロゲナ ーゼ遺伝子由来のヌクレオチド配列または断片に係わる。発明の背景 組み換えＤＮＡ技術の発達は、酵母における外来遺伝子のクローン化及び発現 を可能にした。哺乳類その他の外来ポリペプチド発現のための宿主としてＳａｃ ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ などの酵母を用いると、より普通 に用いられる大腸菌などの原核宿主には欠けている利点が得られる。例えば、酵 母はグリコシル化可能であるが、原核宿主は可能でない。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉ ａｅ の遺伝システムは、遺伝子発現の制御のための原理も含めて良く解明されて いる。加えて、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは通常、食品医薬品局によって認可さ れている。 酵母宿主系の多大の実用的かつ経済的有用性は、転写を導く様々なプロモータ ー領域、転写を終結させる様々な配 列、及び他の調節配列の同定によって酵母発現を最大限に実現する試みを刺激し た。例えば、酵母アルコールデヒドロゲナーゼは、酵母において様々な遺伝子の 相当レベルの発現達成を可能にするうえできわめて有用な、ただ１個の強力なプ ロモーターを有することが確認されている［Ｈｉｔｚｅｍａｎ等，Ｎａｔｕｒｅ ２９５ ，ｐｐ．７１７−７２２（１９８１）］。米国特許第５，１３９，９３ ６号には、外来遺伝子と、酵母ガラクトシダーゼ（ＧＡＬ１）調節領域と、前記 外来遺伝子の発現を増加させる位置に有るプロモーターとを含むクローニングベ クターが開示されている。米国特許第５，０８９，３９８号には、酵母における 外来ポリペプチドの発現の制御にグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナー ゼ由来のプロモーター領域を用いることが開示されている。即ち、酵母において 様々な遺伝子の相当レベルの発現達成を可能にする宿主系の提供は可能である。発明の概要 本発明によれば、意外にも、酵母ソルビトールデヒドロゲナーゼ（“ＳＤＨ” ）遺伝子に由来するプロモーター、ターミネーター及び他の幾つかの調節領域を 発現ベクター に挿入することによって酵母における外来ポリペプチドの収量を著しく増大させ 得ることが判明した。 本発明は特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅソルビト ールデヒドロゲナーゼ遺伝子から単離したＤＮＡ断片（ｓｅｇｍｅｎｔ）を提供 し、このＤＮＡ断片は、該断片と異種ポリペプチドをコードする遺伝子とがベク ターにおいて作動可能に連結され、このベクターが宿主酵母細胞によって複製及 び保持される場合、前記異種ポリペプチドの産生増加に有用である。上記ＤＮＡ 断片の機能的に活性な部分は、ソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子の転写並び に翻訳開始及び終結調節配列の制御下にある。 本発明はまた、異種ポリペプチドをコードする遺伝子の酵母における発現を可 能にする発現ベクターを提供する。本発明のベクターは特に、Ｓａｃｃｈａｒｏ ｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子の転 写並びに翻訳開始及び終結調節配列と、酵母複製系との制御下に有るＤＮＡ配列 を含む。 本発明の一具体例によれば、酵母において異種ポリペプチドはＳａｃｃｈａｒ ｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ ｅ の、ソルビトールによって誘導されるソルビトールデヒドロゲナーゼの遺伝子 に由来する調節ヌクレオチド断片の導入によって発現され、その際前記ヌクレオ チド断片と異種ポリペプチドをコードする遺伝子とがベクターにおいて作動可能 に連結され、このベクターが酵母細胞によって複製及び保持され、誘導条件下に ポリペプチドが発現される。 本発明の別の具体例によれば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓ ｉａｅ のソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子の転写並びに翻訳開始及び終結調 節配列と、酵母複製系との制御下に有るＤＮＡ配列を含む発現ベクターでＳａｃ ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ が形質転換される。 本発明は更に、第１図の配列を含むＤＮＡ分子またはその縮重均等物も提供し 、前記ＤＮＡ分子によってコードされるポリペプチドは酵母ソルビトールデヒド ロゲナーゼの生物学的活性を有する。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ ｉｓｉａｅ から実質的に精製単離した活性なソルビトールデヒドロゲナーゼも提 供する。 加えて本発明は、アッセイ試薬と、異種ポリペプチドを試薬として、または試 薬の調製に、即ち該ポリペプチドに 対する抗体の産生などに用いる、当業者に公知の様々なアッセイ方法の改良形態 とを提供する。ソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子の転写配列、翻訳開始配列 及び終結調節配列の制御下に有るＤＮＡ挿入配列を含むクローニングベクターで 形質転換した酵母細胞に、異種ポリペプチドを産生させる。試験試料において幾 つかの特異的結合対の存在を検出するのに用いる試験キットも提供し、この試験 キットは、少なくとも１種のＳＤＨ発現異種ポリペプチドまたは該ポリペプチド に特異的な結合要素を収容した容器を含む。図面の簡単な説明 第１図はソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を読み取り 枠の翻訳と共に示す説明図である。核酸番号１〜７７１は転写調節単位を示して いる。核酸番号１８４６〜２７５９は転写終結単位を示している。 第２図はプラスミドｐＸＳ３、ｐＸＳ４、ｐＸＳ４リンカーの構築の概略的説 明図である。これらのベクターは、ＳＤＨ遺伝子のプロモーター配列とターミネ ーター配列とに挟まれた多クローン化部位を有する。ｐＸＳ２、ｐＸＳ３及びｐ ＸＳ４においてポリペプチドは非融合分子として発現される。 第３図は肝炎デルタ抗原（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｄｅｌｔａ ａｎｔｉｇｅｎ ）をコードする遺伝子を含むｐＸＳ３の構築の概略的説明図である。 第４図はｐＸＳ３デルタを導入した形質転換体における肝炎デルタ抗原発現の ウェスタンブロット分析の説明図である。ｐＸＳ３を導入した形質転換体から得 た細胞抽出物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのレーン１において電気泳動に掛けた。ｐＸ Ｓ３デルタを導入した２個の異なる形質転換体から得た溶解物をレーン２、３に 適用した。分析は、肝炎デルタ抗原に対する抗体を含有するヒト血清を用いるウ ェスタンブロット分析によって行なった。 第５図はｐＸＳ２−ＳＯＤ及びｐＸＳ４リンカ−ＳＯＤの構築の概略的説明図 である。 第６図はｐＸＳ２−ＳＯＤで形質転換した酵母における非融合ヒトスーパーオ キシドジスムターゼポリペプチド発現の説明図である。ヒトＳＯＤポリペプチド の発現を、クーマシーブルーでの染色により視覚的に測定した。レーン１は、Ｂ ｉｏ−Ｒａｄから入手した高分子タンパク質マーカーを含有する。レーン２、３ は、ｐＸＳ４及びｐＸＳ２−ＳＯＤをそれぞれ導入した８０００−８Ｂ形質転換 体か らの抽出物を含有する。 第７図はｐＸＳ４リンカーＳＯＤを導入した形質転換体における融合ヒトスー パーオキシドジスムターゼポリペプチド発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の説明図で ある。ゲルをクーマシーブルーで染色した。レーン２は、酵母発現ベクターｐＸ Ｓ４リンカーを導入した形質転換体からの抽出物を含有する。レーン３、４では 、ｐＸＳ４リンカーに挿入されたヒトＳＯＤ遺伝子を有する２個の異なる形質転 換体を電気泳動に掛けた。レーン１には、Ｂｉｏ−Ｒａｄから入手した高分子基 準タンパク質を適用した。発明の詳細な説明 Ａ．定義 本明細書中に用いた次の語の定義を示す。 ソルビトールデヒドロゲナーゼの“生物学的活性”という語は、基質としての ソルビトールに対して選択的酸化特異性を有するポリペプチドを意味する。 “ＤＮＡ発現ベクター”とは、自律的要素であって、そのゲノムに付加的なＤ ＮＡ配列が挿入された後宿主において該宿主の染色体から独立に複製可能な要素 のことであるる。 “遺伝子”とは、その一部が特定のポリペプチドまたはＲＮＡ分子をコードす るＤＮＡ断片のことである。 “異種ポリペプチド”とは、通常は酵母生物によって産生されたり、酵母生物 の生存に必要とされたりしないタンパク質のことである。この語は、上記のよう なポリペプチドをコードするＤＮＡを発現媒体（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｈ ｉｃｌｅ）に、組み換えＤＮＡ技術を用いて機能的に挿入し、その後この媒体を 用いて酵母生物宿主を形質転換することを意図する。ＤＮＡの機能的挿入とは、 異種ポリペプチドをコードするＤＮＡを発現ベクターに、後段に定義するプロモ ーター系の制御下に挿入することである。本発明による異種ポリペプチドには、 ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、ｌｅｕｔｉｎｉｚｉｎｇホルモン（ＬＨ ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）等のホルモン ；リンフォカイン；スーパーオキシドジスムターゼ、クレアチニンキナーゼＭＢ （ＣＫ−ＭＢ）等の酵素；ヒト線維芽細胞等のインターフェロン；***抗原、 インフルエンザ抗原ポリペプチド、肝炎デルタ抗原、Ｂ型肝炎核抗原、肝炎表面 抗原、Ｂ型肝炎Ｅ抗原、ヒト免疫不全ウイルス１及び２（ＨＩＶＩ及び２）、ヒ ト Ｔ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）１及び２等のウイルス抗原または免疫原；並 びにレニン、ヒト血清アルブミン、ヒトインシュリン、ヒトインシュリン様成長 因子−１、様々な糖タンパク質といった他の様々なポリペプチドが非限定的に含 まれる。本発明による異種ポリペプチドは、情緒障害を治療及び／または予防す るワクチン等の医薬組成物中に用い得る。 “プロモーター”とは、通常遺伝子の開始コドンに最も近く位置する５′領域 として説明されるＤＮＡ配列である。プロモーター領域において、隣接遺伝子の 転写または発現が開始される。この部位のことを転写開始部位と呼称する。プロ モーター領域には、作動可能に連結された１種以上の任意の構造遺伝子の発現に 対して制御要素（ｃｏｎｔｒｏｌ）として相互作用するヌクレオチド配列が存在 し得る。 “作動可能に連結”という語は、構造遺伝子によりコードされたポリペプチド の発現開始に対してプロモーターが及ぼす制御を意味する。 “転写開始部位”とは、プロモーターのＤＮＡ配列で、そこにＲＮＡポリメラ ーゼが結合し、それによって５′から３′方向へ連続するコドンの転写を開始す るＤＮＡ配列 のことである。 “転写ターミネーター”とは、ＲＮＡポリメラーゼに転写を終結させる、転写 領域の末端に位置するＤＮＡ配列のことである。Ｂ．酵母発現ベクター 本発明によれば、特定のＤＮＡ断片を、酵母ゲノムにとって外来性である遺伝 子に連結してＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの改質株に導入し、それによって前記株 に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子の転写並 びに翻訳開始及び終結調節配列の制御下にポリペプチドを産生させる。発現は、 新規な組み換えＤＮＡ発現ベクターでＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを形質転換する ことによって実現する。 本発明は特に、（ｉ）酵母選択的マーカー、（ii）酵母複製起点、並びに（ii i）ただ１個の制限部位に関して、該部位に挿入されたポリペプチドコーディン グ配列の発現が実現し得るように配置されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのソルビ トールデヒドロゲナーゼ遺伝子の酵母プロモーター及びターミネーター配列を含 む酵母発現ベクターを提供する。特に、非融合ベクターカセット、及びソルビト ール デヒドロゲナーゼポリペプチドのアミノ末端残基に由来する１１個のアミノ酸を 含む融合ベクターカセットを構築した。上記両カセットを、選択マーカーとして の酵母ＴＲＰ１遺伝子と２μｍ複製起点とを有する３０コピー酵母プラスミドに 挿入した。ソルビトールデヒドロゲナーゼポリペプチドを上記１１アミノ酸と融 合させると、融合ポリペプチドの発現は非融合ポリペプチドに比較して数倍高レ ベルとなる。加えて、多コピープラスミドにおいて発現させた場合、融合相手と してのソルビトールデヒドロゲナーゼを伴った異種ポリペプチドの発現レベルは 、ソルビトールデヒドロゲナーゼ自体の発現レベルより数倍高い。上記のような ポリペプチドは、天然生物から製造した溶解物より安全でかつ費用効果が高いア ッセイ試薬をもたらす。 ベクターの構築には、当業者に公知である任意の酵母複製起点を用い得る。例 えば、本発明は天然酵母プラスミド２μｍの複製領域について説明している。上 記プラスミドは、直ちに検出可能な表現型を与えないという点で潜在型（ｃｒｙ ｐｔｉｃ）であり、細胞１個当たり約１００のコピー数で存在する。 本発明のＳＤＨプロモーターは好ましくは、ＳＤＨ遺伝 子のｍＲＮＡへの転写と、後のｍＲＮＡの翻訳とのためのシグナルを含む酵母ゲ ノム由来の約７７１塩基対の配列である。このＤＮＡ断片中にソルビトールデヒ ドロゲナーゼをコードする配列は存在しないが、この断片は外来遺伝子の発現を 導き得、調節はＳＤＨ遺伝子のためのモードを踏襲する。 本発明のＳＤＨターミネーターは好ましくは、ポリＡ付加部位ＡＡＴＡＡＡを 含む約９１３ヌクレオチドの配列である。 本発明は、酵母からの融合または非融合ポリペプチドの発現を実現する。遺伝 子の５′末端部においてコーディング配列内にただ１個の制限部位ＸｂａＩが存 在する。この部位にＤＮＡ配列を挿入すると、挿入したＤＮＡがコードするアミ ノ酸と融合した、ソルビトールデヒドロゲナーゼポリペプチドのＮ末端の１１ア ミノ酸を含むハイブリッドタンパク質が産生される。高レベルのソルビトールデ ヒドロゲナーゼ発現を実現し得る上記配列に含まれた遺伝情報が融合タンパク質 の発現レベルを上昇させる。 本発明の酵母株は、毒性が低く、かつその遺伝特性が良く知られているために 用いられる通常の実験酵母株のＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ である。この株は大規模培養が容易である。ＤＮＡ断片を 含む本発明の組み換えＤＮＡ物質は、ソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子の転 写並びに翻訳開始及び終結調節配列の制御下にあり、調節を変更する酵母突然変 異体等を非限定的に含めた形質転換可能な任意の酵母細胞においてポリペプチド 産物を発現させるのに用いられる。 大部分の酵母は、通常の実験培地と当業者に公知の方法とを用いて比較的一律 の条件下に培養し得る。当業者は認識していようが、酵母の増殖要件として典型 的なものには、炭素及びエネルギーを供給する有機炭素化合物、ポリペプチド及 び核酸の合成のための有機または無機窒素、様々な無機質、並びにビタミンの混 合物が含まれる。このような増殖要件を満たすのが酵母窒素塩基（ＹＮＢ）であ り、これは、幾つかの微量元素、ビタミン、増殖を刺激する痕跡量のアミノ酸、 並びに主要な無機質であるリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム 及び塩化カルシウムを含有する化学的に定義された培地である。窒素源は硫酸ア ンモニウムとする。炭素源は所望のものを約０．５〜約３％の濃度で添加する。 培地のｐＨ範囲は普通約３．０〜約 ８．０、好ましくは約４．５〜約６．５とする。 本明細書中に述べた遺伝子操作法によって調製した微生物の一例として、現在 Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１２３ ０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤに寄託中の培 養物を示す。それらは次のように確認される。 受託番号 ；株 ；1992年 寄託 受託番号 ；株 ；1992年 寄託 受託番号 ；株 ；1992年 寄託Ｃ．アッセイ方式 本発明は、個体から得た標本中に抗原または抗体を検出する、従来より優れた 方法を提供し、この方法で用いる組み換え抗原は酵母においてベクターにより融 合または非融合ポリペプチドとして発現され、この組み換え抗原の発現は、前記 ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を増加させるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ ｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来のＤＮＡ断 片の制御下に有る。 本発明は、ＳＤＨ発現異種ポリペプチド、または該ポリ ペプチドに特異的な結合要素を含有するアッセイ試薬を提供する。好ましくは、 ＳＤＨ発現異種ポリペプチドは酵素であり得る。最も好ましくは、ＳＤＨ発現異 種ポリペプチドはスーパーオキシドジスムターゼであり得る。本発明のアッセイ 試薬は、当業者に公知であるいかなる診断アッセイにも用い得る。アッセイは好 ましくはイムノアッセイとして行なうが、本発明は免疫反応アッセイに限定され ない。特異的な結合要素を用いるものであればいずれのアッセイも実行可能であ る。本明細書中に用いた“特異的な結合要素”という語は、特異的結合対の構成 要素を意味する。即ち、一方が他方に化学的または物理的手段により特異的に結 合する２種の異なる分子のことである。従って、通常のイムノアッセイの抗原と 抗体との特異的結合対に加えて他の特異的結合対として、ビオチンとアビジン、 炭水化物とレクチン、相補的ヌクレオチド配列同士、エフェクター分子とレセプ ター分子、補因子と酵素、酵素阻害物質と酵素等を挙げることができる。そのう え、特異的結合対は本来の特異的結合要素の類似体、例えば分析対象（ａｎａｌ ｙｔｅ）類似体も構成要素とし得る。免疫反応性の特異的結合要素には、抗原、 抗原フラグメント；モノクローナル及 びポリクローナル両方の抗体及び抗体フラグメント；並びに組み換えＤＮＡ法に よって形成されるものを含めたこれらの複合体が含まれる。 本明細書中に用いた“分析対象”という語は、試験試料中に存在し得る検出す るべき物質を意味する。分析対象は、当該物質に関して天然産の特異的結合要素 （抗体など）が存在するか、または特異的結合要素を製造することが可能である 任意物質とし得る。即ち、分析対象とは、アッセイにおいて１種以上の特異的結 合要素と結合し得る物質である。“分析対象”には任意の抗原性物質、ハプテン 、抗体、及びこれらの組み合わせも含まれる。特異的結合対の構成要素として、 “分析対象”は天然産の特異的結合相手（対の片割れ）によって、即ちビタミン Ｂ₁₂測定の場合であれば捕捉及び／または指示試薬中に内因子タンパク質を用い 、炭水化物測定の場合であれば捕捉及び／または指示試薬中にレクチンを用いる などして検出し得る。分析対象には、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモ ン、ステロイド、ビタミン、治療目的で投与されるものも違法な目的で投与され るものも含めた薬物、細菌、ウイルス、及びこれらの物質のうちのいずれかの代 謝産物や、これらの物質のうち のいずれかに対する抗体が含まれ得る。 “固相”（“固体支持体”）は当業者に公知であり、反応トレイのウェルの壁 、試験管、ポリスチレンビーズ、帯磁ビーズ、ニトロセルロースストリップ、膜 、ラテックス粒子などの微粒子等を含む。“固相”は重要でなく、当業者によっ て選択可能である。即ち、ラテックス粒子、微粒子、帯磁または非帯磁ビーズ、 膜、プラスチック管、マイクロタイターウェルの壁、ガラスまたはシリコンチッ プ、及びヒツジ赤血球のいずれもが適当例である。固相上にペプチドを固定する 適当方法には、イオン性相互作用、疎水性相互作用、共有結合による相互作用等 を生起させることが含まれる。本明細書中に用いた“固相”という語は、不溶性 であるか、または後からの反応によって不溶性とし得る任意物質を意味する。固 相の選択は、捕捉試薬を引き付け、かつ固定するその固有の能力に従って行ない 得る。あるいは他の場合には、固相に、捕捉試薬を引き付け、かつ固定する能力 を有する付加的なレセプターを保持させ得る。付加的なレセプターには、捕捉試 薬それ自体か、または捕捉試薬に結合した荷電物質と反対に荷電された荷電物質 が含まれ得る。更に別の変形例として、レセプター分子は固 相上に固定される（固相と結合する）、特異的結合反応によって捕捉試薬を固定 する能力を有する任意の特異的結合要素であり得る。レセプター分子は、アッセ イ実施の前または最中に捕捉試薬を固相物質に間接的に結合させることを可能に する。即ち固相は、プラスチック、誘導体化（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ）プラス チック、帯磁または非帯磁金属、試験管のガラスまたはシリコン面、マイクロタ イターウェル、シート、ビーズ、微粒子、チップ、及び当業者に公知の他の形態 であり得る。 試験試料は哺乳動物の、１種以上の当該分析対象を含有し得るか、または含有 すると考えられ得る全血、または赤血球、リンパ球もしくはリンパ球サブセット 調製物を含めた白血球、血小板、血清及び血漿を含めた全血成分；腹水；唾液； 便；髄液；尿；痰；気管吸引物及び他の身体成分などの生物学的流体とし得る。 試験試料を培養液上清、または培養細胞の懸濁液とすることも可能である。本発 明によりその体液を抗原分析対象または抗体分析対象に関してアッセイし得る哺 乳動物には、ヒト及び霊長類、並びに前記分析対象を保有すると考えられる他の 哺乳動物が含まれる。非生物学的流体試料を用い得ることも予期される。 本発明のアッセイ試薬は、各分析対象に特異的な結合要素に接合したラベルを 含有する指示試薬を包含する。各指示試薬は検出可能なシグナルを、試験試料中 の分析対象の量に関連するレベルで発生する。好ましい一具体例において各指示 試薬には、異なる分析対象に特異的な結合要素を含有させる一方で、検出可能な シグナルを発生し得るシグナル発生化合物（ラベル）は同じものを接合する。通 常、指示試薬は固相物質に捕捉されてから検出または測定される。本発明では、 ＳＤＨ発現ポリペプチドが１種以上の指示試薬の１種以上の成分を包含する。本 発明の実施においては異なるシグナル発生化合物を用い得ることが予期される。 即ち、例えば各指示試薬毎に異なる蛍光化合物をシグナル発生化合物として用い 、異なる波長の読み取りによって検出を確認することが可能である。あるいはま た、アクリジニウム（ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ）またはフェナントリジニウム（ｐ ｈｅｎａｎｔｈｒｉｄｉｎｉｕｍ）化合物などの短命化学発光化合物と、ジオキ セタンなどの長命化学発光化合物とを用いれば、異なる分析対象に関して異なる 時点にシグナルを発生させることができる。異なる時点にシグナルを発生し得る ２種以上の化学発光化合物の使用を 詳述した方法が、本明細書に参考として含まれる、本出願と同じ出願人が出願し た米国特許同時係属出願第６３６，０３８号の主題となっている。アクリジニウ ム及びフェナントリジニウム化合物は、本明細書に参考として含まれる、本出願 と同じ出願人が１９８９年６月２３日付で出願した米国特許同時係属出願第０７ ／２７１，７６３号に開示されている。 指示試薬中の特異的結合要素は、特異的結合対を構成する抗原または抗体要素 とする以外にも、ビオチンまたはアビジン、炭水化物またはレクチン、相補的ヌ クレオチド配列の一方、エフェクター分子またはレセプター分子、酵素補因子ま たは酵素、酵素阻害物質または酵素等を含めた、任意の特異的結合対の一方の構 成要素とし得る。免疫反応性の特異的結合要素は、抗体、抗原、またはサンドイ ッチアッセイでのように分析対象に結合し得るか、競合アッセイでのように捕捉 試薬に結合し得るか、または間接アッセイでのように補助的な特異的結合要素に 結合し得る抗体−抗原複合体であり得る。抗体を用いる場合はモノクローナル抗 体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント、組み換え抗体、これらの混合物、 または抗体と他の特異的結合要 素との混合物を用い得る。上記のような抗体の調製、及びそれらの抗体の特異的 結合要素としての使用への適性の詳細は当業者に良く知られている。 本発明によって製造した異種ポリペプチドを、指示試薬の、外的手段によって 検出できる測定可能なシグナルを発生し得るシグナル発生化合物（ラベル）とす ることができる。考えられる様々なシグナル発生化合物（ラベル）には、色原体 ；酵素、例えばスーパーオキシドジスムターゼ、セイヨウワサビペルオキシダー ゼ、アルカリホスファターゼ及びβ-ガラクトシダーゼなどの触媒が含まれる。 特定ラベルの選択は重要でないが、それ自体でか、または１種以上の付加的物質 との関係においてシグナルを発生し得る物質とする。ラベルまたは特異的結合要 素を変更することによって、様々に異なる指示試薬を製造し得る。特に、他の様 々なイムノアッセイ方式の測定が本発明により可能となる。上記イムノアッセイ 系方式には、競合法、サンドイッチ法及びイムノメトリック法が非限定的に含ま れる。このようなイムノアッセイ系は通常、免疫グロブリン、即ち全抗体または 抗体フラグメントが試験試料由来の特異的分析対象に結合する能力に依存し、ラ ベルまたは検出可能部分 と結合させた本発明の抗体またはそのフラグメントを含有させた標識試薬を用い て結合の程度を測定する。検出可能なラベルには、酵素、放射性ラベル、ビオチ ン、毒素、薬物、ハプテン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、リポソーム、発色団、化学発光体 、有色粒子及び有色微粒子、並びにアミノメチルフルオレセン、５−フルオレセ ニル、６−フルオレセニル、５−カルボキシフルオレセン、６−カルボキシフル オレセン、アミノフルオレセン、チオウレアフルオレセン、メトキシトリアジノ リルアミノフルオレセン、及び同様の蛍光誘導体などの蛍光化合物が非限定的に 含まれる。本明細書中に述べたように、試験試料は天然産の、または人工的に製 造した液体もしくはその抽出物とし得、それらには全血、血清、血漿、尿、便、 唾液、髄液、脳組織等といった生物学的試験試料が非限定的に含まれる。加えて 、試験試料を試験試料の抽出物とするか、またはその誘導体のうちのいずれかと することも可能である。 イムノアッセイのために走査プローブ顕微鏡測定法（ＳＰＭ）を用いることも 、本発明によって製造したＳＤＨ発現異種ポリペプチドまたは該ポリペプチドに 特異的な結合要素を容易に適応させ得る一技術である。走査プローブ顕 微鏡測定法、特に原子力顕微鏡測定法では、捕捉相、例えば少なくとも１種の本 発明のＳＤＨ発現異種ポリペプチドまたは該ポリペプチドに特異的な結合要素を 固相に付着させ、固相表面に存在し得る特異的結合要素複合体を走査プローブ顕 微鏡を用いて検出する。走査トンネル顕微鏡測定法を用いれば、多くのイムノア ッセイ系において抗原−抗体複合体の検出に通常用いなければならないラベルの 必要性が無くなる。このような系は、本明細書に参考として含まれる、本出願と 同じ出願人による係属中の米国特許出願第６６２，１４７号に開示されている。 ＳＰＭを用いての特異的結合反応の監視は様々な方法で実施し得る。一具体例 では、特異的結合相手の一方の結合要素（本発明のモノクローナル抗体である分 析対象特異的な物質）を走査に適した表面に付着させる。分析対象特異的な物質 の付着は当業者に公知の方法に従い、プラスチックまたは金属表面を具えた固相 を含む試験片への吸看によって実現し得る。または、特異的結合相手（分析対象 特異的な物質）を誘導体化プラスチック、金属、ケイ素またはガラス製の固相を 含む試験片に共有結合により付着させる方法を用いることも可能である。共有結 合付着法は当業者に 公知であり、特異的結合相手を試験片に不可逆的に連結する様々な手段を含む。 試験片がケイ素またはガラスである場合は、特異的結合相手を付着させる前に表 面を活性化しなければならない。トリエトキシアミノプロピルシラン（Ｓｉｇｍ ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手可能）、トリ エトキシビニルシラン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｍｉ ｌ ｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）及び（３−メルカプト−プロピル）−トリメトキシシラン （Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）などの活 性シラン化合物を用いてアミノ、ビニル及びチオールなどの反応基をそれぞれ導 入し得る。このようにして活性化した表面は特異的結合相手を直接連結するのに 用い得（アミノまたはチオールの場合）、あるいはまた活性化した表面をグルタ ルアルデヒド、ビス（スクシンイミジル）スベレート、ＳＰＰＤ（スクシンイミ ジル３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネート）、ＳＭＣＣ（スクシンイミジ ル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート）、 ＳＩＡＢ（スクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート）及び ＳＭＰＢ（スクシ ンイミジル４−［１−マレイミドフェニル］ブチレート）などの連結剤と更に反 応させ、それによって該表面から結合相手を分離することが可能である。ビニル 基は酸化して共有結合付着手段とし得る。ビニル基を、特異的結合相手のために 多数の付着点を用意し得る、ポリアクリル酸など様々なポリマーの重合のための 固定部（ａｎｃｈｏｒ）として用いることも可能である。アミノ面を様々な分子 量の酸化デキストランと反応させれば、異なる寸法及び能力の親水性連結剤を得 ることができる。酸化可能なデキストランの例には、（いずれもＰｈａｒｍａｃ ｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪから入手可能な）ＤｅｘｔｒａｎＴ−４０（ 分子量４０，０００ダルトン）、Ｄｅｘｔｒａｎ Ｔ−１１０（分子量１１０， ０００ダルトン）、Ｄｅｘｔｒａｎ Ｔ−５００（分子量５００，０００ダルト ン）、Ｄｅｘｔｒａｎ Ｔ−２Ｍ（分子量２，０００，０００ダルトン）や（Ｓ ｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手可能な ）Ｆｉｃｏｌｌ（分子量７０，０００ダルトン）が含まれる。また、いずれも本 出願と同じ出願人によって出願され、かつ本明細書に参考として含まれる係属中 の１９８８年１月 ２９日付米国特許出願第１５０，２７８号及び１９８９年７月７日付米国特許出 願第３７５，０２９号に開示された技術及び化学作用を用いることにより、特異 的結合相手を試験片の表面に固定するのに高分子電解質の相互作用を用い得る。 好ましい付着方法は共有結合を利用するものである。特異的結合要素を付着させ た後、試験片表面を血清、タンパク質または他の結合阻止剤で更に処理すること により非特異的結合を最小限に留め得る。試験片表面を製造場所または使用地点 で走査して、該表面がアッセイ目的に適していることを確認することも可能であ る。走査過程が試験片の特異的結合特性を変化させるとは考えられない。Ｄ．精製方法 本発明によって製造したアッセイ試薬は、該アッセイ試薬を定型カラム内など に配置した固体支持物質に固定して試験試料と接触させることによって、抗体な ど特異的結合対の構成要素を単離及び精製するのに用い得る。特異的結合対の構 成要素は固定したアッセイ試薬から、アッセイ試薬と特異的結合対の構成要素と の相互結合作用を妨げる諸条件下に回収可能である。例えば、上記相互結合作用 はｐＨ値の上昇もしくは下降によって、または尿素、グアニジ ニウム、塩酸、ドデシル硫酸ナトリウム等のタンパク質変性剤の使用によって妨 げられ得る。Ｅ．試験キット 本発明は、試験試料中に特異的結合対の構成要素の存在を検出するのに用いる 試験キットも付加的に提供し、この試験キットは、本発明により製造した少なく とも１種のＳＤＨ発現異種ポリペプチドを収容した容器を含む。 異種ポリペプチドは融合または非融合タンパク質として製造し得る。本発明に より開示した発現ベクターはＳＤＨ異種ポリペプチド融合体を高レベルで発現し 得る。実施例７に、ＳＤＨ融合ポリペプチドとしてのスーパーオキシドジスムタ ーゼの発現を説明する。 試験キットは、必要な試薬を、試薬同士の適合性が許せば組成物または混合物 として保持する１個以上の容器の組み合わせとして市販包装形態で提供される。 当然ながら、試験キットは緩衝液、稀釈剤、標準溶液等、当業者に公知であり、 かつ販売上の、また使用者の立場から望ましい場合も有る他の物質を含み得ると 理解されるべきである。 本発明を、以下の実施例によって非限定的に詳述する。 実施例 一般方法 制限エンドヌレアーゼ消化、ＤＮＡ連結及び他のＤＮＡ操作方法には、プラス ミドＤＮＡ調製、ニックトランスレーションによるＤＮＡ標識、及びＭａｎｉａ ｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ.Ｙ．（１９８２） に記載のごときＥ.ｃｏｌｉ形質転換といった標準方法を使用した。酵母の形質 転換はＰｅｒｃｉｖａｌら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６３：３９１（１９ ８７）に従って行った。酵母操作に使用した一般方法はＳｈｅｒｍａｎら，Ｍｅ ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８３ ）に記載されている。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、仔ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ 及び制限酵素は供給者（ＢＲＬ）指示に従って使用した。試薬及び酵素 細菌及び酵母増殖用培地はＤｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈｉｇａｎか ら購入した。ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅ ｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＢＲＬ），Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ ｇ Ｍａｒｙｌａｎｄ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒ ｌｅｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ；またはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎ ｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａは、制限酵素、仔ウシ腸 アルカリ性ホスファターゼ（ＣＩＡＰ）及びＴ４ ＤＮＡリガーゼの販売者であ る。Ｚｙｍｏｌａｓｅ ６０ＴはＭｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｌｋｈ ａｒｔ，Ｉｎｄｉａｎａから購入した。ニックトランスレーションキット及び他 のニックトランスレーション用試薬はＡｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏ ｎ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓから得た。λｇｔ １１酵母ゲノムライブラリーにおいて発現を検出する試薬はＢｉｏ Ｒａｄ，Ｒ ｉｃｈｍｏｎｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから購入した。フェニルメチルスルホニ ルフルオリド（ＰＭＳＦ）はＢＲＬから購入した。宿主細胞培養物、ＤＮＡ源、ベクター Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２株ＴＢ１はＪＭ８３の誘導体（ＢＲＬ）である。酵母株８ ０００−８Ｂ（寄託番号＊＊＊＊）はＤｒ．Ｅ．Ｔ．Ｙｏｕｎｇ，Ｕｎｉｖｅｒ ｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎによって提供さ れた。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ８０００−８Ｂ ＬＡＧ−（寄託番号＊＊＊＊ ）は、炭素源として２％ソルビトールを含むＹＮＢ最少プレート上での増殖を選 択することにより、自然突然変異体として単離された。この突然変異体は、ソル ビトール培地で増殖させたときに異常な遅滞期を示すことがない。突然変異体を 更に特性分析するとａ／ａ二倍体であることが判った。 Ｅ．ｃｏｌｉベクターｐＵＣ１８はＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。λｇｔ１１酵母ゲノムライブラリーはＤｒ ．Ｍ．Ｓｎｙｄｅｒ（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｒｋｅｌ ｅｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から得た。酵母ベクターｐＭＷ５（寄託番号＊＊ ＊＊）及びｐＭＡＣ５６１とも称されるｐｙＣＤＥ１はＤｒ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｄ．Ｈａｌｌ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｗａｓｈｉ ｎｇｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａ ｓｈｉｎｇｔｏｎ）から得た。プラスミドｐＷＭ５１０（寄託番号＊＊＊＊）は Ｄｒ．Ｗｌｏｄｅｋ Ｍａｎｄｅｃｋｉ（Ａｂｏｔ t Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ） から得た。 実施例１ Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ８０００−８Ｂにおけるソルビトールデヒドロゲナ ーゼ活性の単離 （Ｄｒ．Ｅ．Ｔ．Ｙｏｕｎｇ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇ ｔｏｎから得た）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株８０００−８Ｂを、唯一の炭素源 として２％ソルビトールまたはマンニトールのいずれかを含む１％酵母抽出物及 び２％ペプトン（“ＹＥＰ”）培地中３０℃で飽和するまで増殖させた。遠心に よって細胞をペレット化し、１ｍＬの水で洗浄し、５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ ７.４，１ｍＭＰＭＳＦ及び２５ｍＭβ−メルカプトエタノールを含む緩衝液（ 以降は抽出緩衝液と記す）５００ｍＬ中に再懸濁させた。酸洗浄したガラスビー ズを用いて懸濁液を撹拌することにより、顕微鏡で細胞破壊が見られるまで細胞 を破壊した。次いで細胞抽出物のソルビトールデヒドロゲナーゼ活性を、Ｗｉｌ ｌｉａｍｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，２８３：２１４−２１６（１９８０）に記載 のごとくアッセイし、Ｆｏｗｌｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍ.，５０：６３ ５−６４５（１９７２）に記載のごとく、但しエタノールに代えて０.２ｍｌの ２０％ソルビトールを使用し、酵素活性に対して染色した。非変性ゲル上で電気 泳動すると、ソルビトールを含む培地中で増殖させたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ８０００−８Ｂの抽出物のみが、青色に染色されたソルビトールデヒドロゲナ ーゼ活性バンドを生成した。マンニトール増殖培養物由来の抽出物を含む同様の ゲルでは、染色されたバンドは見られなかった。ソルビトールデヒドロゲナーゼ のおおよその分子量を決定するため、活性染色バンドに含まれるポリペプチドを 非変性ゲルから抽出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて再度電気泳動した。ソル ビトール誘導細胞中にのみ、見掛けの分子量が４０,０００ダルトンの唯一のバ ンドが存在した。 実施例２ ソルビトールデヒドロゲナーゼに対する抗体の生産 ステップ１：抗体生産用抗原の調製 Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株８０００−８Ｂを、２％ソルビトールを含むＹＥ Ｐ培地２５０ｍ１中３０℃で飽和するまで増殖させた。Ｂｅａｄ−Ｂｅａｔｅｒ （Ｂｉｏｓｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を使用して細胞ペレットを（上 記実施例１に記載の）抽出緩衝液４０ｍＬ中に再懸濁させ、製造業者推奨に従っ て細胞を破壊することにより、大量の抽出物を製造した。抽出物を、０.０６２ ５ＭＴｒｉｓｐＨ６.８，２％ＳＤＳ，１０％グリセロール，５％β−メルカプ トエタノールを含む緩衝液（以降は「試料緩衝液」と記す）と混合し、３分間煮 沸し、７.５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中に４０ｍｌ／レーンの量で添加した。ゲ ルを、２５％イソプロパノール，１０％酢酸，０.５％クマーシーブルー中で５ 分間染色し、５％メタノール及び７％酢酸中で２０分間脱色した。分子量約４０ ,０００ダルトンのタンパク質を含むゲル部分を使用してウサギを免疫した。Ｗ ｈｉｔｅら，Ｃｅｌｌ，３９：１６３−１７１（１９８４）に記載の方法に従っ て抗血清を調製した。ウサギを約５０ｐｇのタンパク質で免疫し、次いで５０ｐ ｇ／ウサギの用量で追加免疫した。前回の追加免疫後１４日間おきに次の５０μ ｇの追加免疫を行った。ステップ２：抗体の単離及び特性分析 ウェスターンブロット分析を使用してウサギの免疫応答をモニターした。Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株８０００−８Ｂを、２％グルコース、マンニトールまた はソルビトー ルのいずれかを含むＹＥＰ培地中で増殖させた。実施例１にごとく細胞抽出物を 調製し、７.５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル及び非変性ゲルにおいて電気泳動した。 ゲルをニトロセルロース上に電気ブロットし、“ＴＢＳ”（１５０ｍＭ ＮａＣ ｌ，５０ｍＭＴｒｉｓ ｐＨ８.１）中５％Ｃａｒｎａｔｉｏｎ脱脂ドライミル クを用いてブロックし、最初の追加免疫後に得たウサギ抗血清の１：１００,０ ００希釈物と一緒にインキュベートした。フィルターを、０.０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳで２回洗浄し、次いでＴＢＳで２回洗浄した。次いでフィル ターをＢｉｏＲａｄヤギ抗ウサギＨＲＰ結合第２抗体と一緒にインキュベートし 、洗浄し、製造業者推奨に従って染色した（ＢｉｏＲａｄ Ｅｘｐｒｅｓｓ−Ｂ ｌｏｔキット）。ＢＲＬ前染色高分子量タンパク質マーカーによって判定したと ころ、分子量約４０,０００ダルトンの免疫反応性バンドは、ソルビトール増殖 細胞の抽出物を含むレーンにのみ現れた。免疫反応性バンドは、ゲル上のソルビ トールデヒドロゲナーゼ活性に対応する位置に認められた。 実施例３ Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅソルビトールデヒドロゲナーゼ 遺伝子の単離 ステップ１：Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を 含むクローンｌＳ３０及びｌＳ３２の単離 Ｄｒ．Ｍ．Ｓｎｙｄｅｒ（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から得 たｌｇｔ１１酵母ゲノムライブラリーから、酵母ソルビトールデヒドロゲナーゼ 遺伝子を単離した。Ｓｙｎｄｅｒら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ.，１５４：１０７ ０１２８（１９８４）に記載の抗体プローブ法を使用し、クローン１Ｓ３０及び ｌＳ３２を単離した。（Ｄｒ．Ｍ．Ｓｎｙｄｅｒから得た）Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｙ１ ０９０を、５０ｍｇ／ｍＬアンピシリン及び０.２％マルトースを含むルリアブ ロス中３７℃で一晩増殖させた。細胞を遠心によって回収し、ペレットを０.４ 倍容の１０ｍＭＭｇＳＯ₄中に再懸濁させた。１０⁵個のファージ粒子を含むｌｇ ｔ１１ライブラリーのアリコートを２００ｍＬの調製Ｙ１０９０細胞と混合した 。混合物を３７℃で２０〜３０分間インキュベートし、ファージを吸収させた。 ＬＢトップアガロース（６.５ｍＬ）を各試料に加え、５０ｍｇ／ｍＬアンピシ リンを含むＬＢプレート上に塗り広げた。ファージ プラークがかろうじて見えるようになるまで（約３〜４時間）プレートを４２℃ でインキュベートした。プレートに、１０ｍＭイソプロピルチオガラクトシド（ ＢＲＬ）中に予め浸漬したニトロセルロースディスクを重層し、３７℃で一晩イ ンキュベートした。次いでフィルターをプレートから注意して持ち上げ、０.０ ６２５Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ６.８，２％ＳＤＳ，１０％グリセロール及び５％Ｂ −ＭＥの溶液を含むペトリ皿中に浮遊させた。２分間インキュベートした後、フ ィルターをＴＢＳで３回洗浄した。次いでフィルターをブロッキング溶液（ＴＢ Ｓ中５％Ｃａｒｎａｔｉｏｎ脱脂ドライミルク）と一緒に室温で１時間インキュ ベートした。ブロッキング溶液を捨て、フィルターを、ブロッキング溶液で１： １００に希釈したウサギ抗血清溶液と４℃で一晩反応させた。次いでフィルター を洗浄し、ＢｉｏＲａｄ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｂｌｏｔ Ｋｉｔに記載のごとくア ルカリ性ホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体と一緒にインキュベートした。製 造業者推奨に従って洗浄及び染色を実施した。陽性プラークを青色プラークとし て可視化すると、スクリーニングした６×１０⁵個のファージから合計８つの陽 性プラークが得られた。（Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ ｌ ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）に記載のご とく）プラークを４回精製した後、５つのλクローンλＳ３０、λＳ３１、λＳ ３２、λＳ３５及びλＳ３６の特性を更に分析した。ステップ２：ｐＳ３０及びｐＳ３２の構築 上述のごとく単離した５つのλクローン由来の挿入物をプラスミドベクターｐ ＵＣ１８中にサブクローニングした。Ｈｅｌｍｓら，ＤＮＡ ４（１）：３９− ４９（１９８５）に記載の方法に従い、クローンλＳ３０、λＳ３１、λＳ３２ 、λＳ３５及びλＳ３６からファージＤＮＡを調製した。ＤＮＡをＥｃｏＲＩで 消化し、ＥｃｏＲＩ消化ｐＵＣ１８（ＢＲＬ）に連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＴＢ１ 中に形質転換した。形質転換混合物のアリコートを、Ｍａｎｉａｔｉｓに記載の 標準方法を使用してアンピシリン及びＸ−Ｇａｌ（ＢＲＬ）を含むＬＢプレート 上で平板培養した。幾つかの白色コロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、Ｅｃ ｏＲＩ消化によって分析した。λｇｔ１１酵母ゲノムライブラリーは共通酵母ゲ ノムＤＮＡから構築されていたので、一部のλクローン中のＥｃｏＲＩ挿入物は 内部ＥｃｏＲＩ 制限部位を有していた。従って５つのλクローン由来のＥｃｏＲＩ挿入物のサブ クローニングから８つのｐＵＣ１８サブクローンが得られた。ＥｃｏＲＩフラグ メントのサイズは０.５〜４.５キロベースであった。 これらのサブクローンの関連を示すため、ｐＳ３０の４.５ｋｂＥｃｏＲＩ挿 入物を使用し、サザンハイブリダイゼーションによって８つのサブクローンをプ ローブした。ｐＳ３０及びｐＳ３２がｐＳ３０挿入物にハイブリダイズし、これ ら２つのクローンが相互に関連があることが判った。クローンｐＳ３０及びｐＳ ３２を次なる分析に選択し、交換可能であると見なした。ｐＳ３０及びｐＳ３２ 中のＥｃｏＲＩ挿入物はそれぞれ４.５ｋｂ及び３.０ｋｂであった。ステップ３：ｐＳ３０においてコードされるソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝 子の同定 炭素源として２％グルコース、ソルビトールまたはマンニトールのいずれかを 含むＹＥＰ培地中で株８０００−８Ｂを対数増殖期まで増殖させた。Ｄｅｎｉｓ ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ.，６（１１）：４０２６−４０３０（１９８ ６）に記載の方法に従って細胞ペレットから全Ｒ ＮＡを調製した。細胞ペレットをＲＮＡ抽出緩衝液（０.１ＭＮａＣｌ，０.１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ７.５，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０.１％ＳＤＳ）中でガラスビーズ を用いて破壊した。フェノール、クロロホルム及びイソアミルアルコールの混合 物を用いてポリペプチドを抽出してから、ＲＮＡを水性懸濁液から沈殿させた。 ３種の異なる培養物由来の全ＲＮＡ １０μｇを、Ｍａｎｉａｔｉｓらに記載の ごとく１.５％アガロースホルムアルデヒドゲル上で電気泳動した。ＲＮＡを、 ＡｍｅｒｓｈａｍＨｙｂｏｎｄ指示マニュアルに記載のごとくＨｙｂｏｎｄ−Ｎ 紙上にブロットし、プレハイブリダイズし、ハイブリダイズし、洗浄した。Ａｍ ｅｒｓｈａｍ Ｎｉｃｋ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｎ Ｋｉｔを使用し、プラスミド ｐＳ３０及びｐＰＹＫを用いてニックトランスレーションによって放射性プロー ブを作製した。Ｄ．Ｏｌｓｏｎ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇ ｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ）から得たプラスミドｐＰＹＫは、高基底レベルで構成 的に発現される酵母解糖性タンパク質ピルビン酸キナーゼのコーディング配列を 含む。従ってプラスミドｐＰＹＫは、種々の糖質と一緒に増殖させた培養物中に 作製された特異的ｍＲＮＡ転写物（〜１.７ｋ ｂ）にハイブリダイズするはずである。ｐＰＹＫプローブが３種全ての培養物に おいて発現された特異的〜１.７ｋｂメッセージにハイブリダイズしたノーザン ブロットハイブリダイゼーション実験の結果から、ＲＮＡ調製は完全であると推 定された。ＲＮＡラダー（ｌａｄｄｅｒ）（ＢＲＬ）を使用してｍＲＮＡ転写物 のサイズを決定した。ステップ４：酵母由来のソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子の配列決定 クローンｐＳ３０及びｐＳ３２を使用してソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝 子の完全ＤＮＡ配列を生成した。まず一部重複ゲノムクローン（ｐＳ３０及びｐ Ｓ３２）の特異的フラグメントの５′末端を標識し、それらをＭａｘａｍ ＆ Ｇｉｌｂｅｒｔ化学分解することにより、配列データを得た。このデータから、 ゲノムクローンｐＳ３２由来の３つのＨｉｎｄIIIフラグメントのクローニング を可能にするより詳細な制限マップ情報を得た。約０.５、０.７及び１.５ｋｂ のフラグメントをｍｐ１１（Ｍ１３クローニング／配列ベクター）中にサブクロ ーニングした。チェーンターミネーター法を使用して各サブクローン化フラグメ ントの完全配列データを得た。「遺伝子ウォーキング（ｇ ｅｎｅ ｗａｌｋｉｎｇ）」用の慣用ＤＮＡプライマーを使用し、サブクローン 化フラグメント全体の配列を逆方向で決定した。ＤＮＡ配列決定反応産物を８Ｍ 尿素及び６％または４％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、標準オートラ ジオグラフィーフィルムを使用して画像化した。該遺伝子の配列を図１に示す。 ＤＮＡ配列の分析から、３５７アミノ酸ポリペプチドをコードする読み枠（ＯＲ Ｆ）が明らかとなった。酵母酵素の推定アミノ酸配列を公知のヒツジ肝酵素配列 と比較すると、２つのポリペプチド間において全体で６０.８４％のアミノ酸相 同が明らかとなった。更に、酵母ソルビトールデヒドロゲナーゼポリペプチドの 推定アミノ酸配列では、ヒツジ肝ＳＤＨの２２残基のうち１９が厳正に保存され ていた。 実施例４ 酵母発現ベクターｐｘＳ２、ｐｘＳ３、ｐｘＳ４及びｐｘＳ４リンカーの構築 （Ｄｒ．Ｂ．Ｄ．Ｈａｌｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔ ｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡから得た）酵母プラスミドｐＭＷ５へのＳＤＨ遺伝 子のプロモーター／ターミネーター及び調節配列の組込みを以下に記述する。 プラスミドｐＷＭ５１０をまずＴａｑＩで消化し、次いでクレノウポリメラー ゼで処理し、ブラント末端を有するＤＮＡを生成した。再連結したプラスミドを Ｅ．ｃｏｌｉＴＢ１中に形質転換し、失活化ＴａｑＩ部位を有するｐＷＭ５１０ の存在についてクローンを分析した。プラスミド上に唯一のＰｓｔＩ部位を与え るべく、構築物（ｐＷＭ５１０ΔＴａｑ）を含む形質転換体由来のＤＮＡをＥｃ ｏＲＩで処理し、次いでクローンポリメラーゼで処理し、ＰｓｔＩリンカー（Ｂ ＲＬ）をブラント末端化ＤＮＡに連結した。 ＳＤＨ遺伝子の５′プロモーター及びコーディング配列の０.５ｋｂＰｓｔＩ フラグメント含有部分をｐＳ３２から切り出し、実施例３のごとく調製し、ｐＷ Ｍ５１０ΔＴａｑＩ ＰｓｔリンカーのＰｓｔＩ部位に連結し、プラスミドｐＡ Ｓ１を形成した。 ＴａｑＩ／ＳｓｐＩを用いて別々に分析し、ＰｓｔＩフラグメントを適正な向 きで含むクローンを同定した。１４３ｂｐ ＴａｑＩ／ＰｓｔＩフラグメントを 合成アダプターＤＮＡで置き換えるため、ｐＡＳ１をＴａｑＩ及びＳｓｐＩで消 化した。唯一のＳｓｐＩ部位はｐＷＭ５１０ＤＮ Ａ配列上のＰＳｔＩ部位の下流に存在した。アダプターＤＮＡは、５′ジメトキ シトリチルヌクレオシドβ−シアノエチルホスホルアミダイトを使用してＡｐｐ ｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ３８０Ａによって合成した４つの別個のオリゴヌ クレオチドから組立てた。４つのオリゴヌクレオチドをアニーリングし、ｐＡＳ ＩのＴａｑＩ／ＳｓｐＩ部位に連結した。アダプターＤＮＡの配列を以下に示す 。 唯一のクローニング部位ＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ及びＳａｌＩのほか に、アダプターＤＮＡの３′末端には唯一のＮｒｕＩ部位が含まれていた。連結 ＤＮＡを含む形質転換体を、ＮｒｕＩ及びＰｓｔＩを用いてミニプレップＤＮＡ を分析することによりアダプター分子の存在につ いて分析した。プラスミドｐＡＳ２はアダプターＤＮＡを有するとして同定され た。 別の実験で、ＳＤＨ遺伝子を含む３ｋｂ ＥｃｏＲＩ酵母ＤＮＡフラグメント をｐＳ３２から切り取り、ｐＷＭ５１０ΔＴａｑのＥｃｏＲＩ部位に連結した。 唯一のクローニング部位を備えたアダプターＤＮＡを含むＰｓｔＩ／ＮｒｕＩフ ラグメントをｐＡＳ２から得、ｐＷＭ５１０ΔＴａｑＳ３２のＰｓｔＩ及びＮｃ ｏＩ部位に挿入した。この操作は、ＮｃｏＩ部位をクレノウポリメラーゼで処理 したから行った。１.５、２ｋｂフラグメントを遊離したミニプレップＤＮＡの ＥｃｏＲＩ制限分析から、アダプターＤＮＡを備えたプラスミドｐＡＳ３を含む 形質転換体が同定された。ＳＤＨ遺伝子由来のプロモーター、ターミネーター及 び調節配列を備えたＳＤＨ発現カセットを含むＥｃｏＲＩフラグメントを酵母プ ラスミドｐＭＷ５のＥｃｏＲＩ部位に移入した。ｐＭＷ５は予め操作して唯一の ＢａｍＨＩ部位を除去しておいた。幾つかの単離体由来のＤＮＡをＥｃｏＲＩ制 限分析することにより、ＳＤＨカセットを含む形質転換体を同定した。プラスミ ドｐＸＳ２及びｐＸＳ３は適正な２ｋｂ挿入物を有した。プラスミドｐＸＳ２は 、 ＸｈｏＩで消化することにより判定すると、２つのＳＤＨ発現カセットを含むこ とが更に判った。唯一のＳａｌＩ部位を含む酵母発現プラスミドを構築するため 、ｐＸＳ３用のＥｃｏＲＩフラグメントを切り取り、酵母プラスミドｐＭＷ５Δ ＢａｍΔＳａｌ（ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ部位を失活化すべく再操作したｐＭＷ ５）に連結した。幾つかの形質転換体から調製したプラスミドＤＮＡを制限分析 することにより、唯一のＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、ＳａｌＩ部位を備え たプラスミドｐｘＳ４を含むクローンを同定した。 ソルビトールデヒドロゲナーゼポリペプチドのＮ末端アミノ酸のプロモーター ／ターミネーター及びコーディング配列を含むＳＤＨ発現カセットを含むｐｘＳ ４リンカーの構築を図２に示す。ＡｐｐＬｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ ３４ ０Ａ合成装置によって２つのオリゴヌクレオチドを前述のごとく合成した。２つ のオリゴヌクレオチドは、アニーリングし、ｐｘＳ４のＮｃｏＩ／ＳａｌＩ部位 に連結すると、ソルビトールデヒドロゲナーゼポリペプチドのＮ末端の１１アミ ノ酸のコーディング配列を含むＳＤＨ発現カセットとなるはずである。この構築 物においてはイニ シエーターＡＴＧコドンにあるＮｃｏＩ部位も破壊されていた。アダプターＤＮ Ａは唯一のＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ及びＳａｌＩクローニング部位を与える。アダ プターＤＮＡ配列を以下に示す。 プラスミドＤＮＡｐｘＳ４をＮｃｏＩ及びＳａｌＩで消化し、数倍過剰量のア ニーリングしたオリゴヌクレオチドに連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＢＩ中に形質転 換した。アンピシリンを５０ｍｇ／リットルの濃度で含むＬＢプレート上で形質 転換体を単離した。幾つかの形質転換体由来のＤＮＡを精製し、ＮｃｏＩで制限 した。ＮｃｏＩ部位を持たないプラスミドを含む単離物からプラスミドＤＮＡを 抽出した。ＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、ＳａｌＩ及びＥｃｏＲＩそれぞれ の消化物により、単離物はアダプターＤＮＡを含むことが確認された。このプラ スミドをｐｘＳ４リンカーと命名した。 実施例５ 発現ベクターｐｘＳ３を使用した酵母中での肝炎デルタ抗 原の発現 ステップ１：ｐｘＳ３Δの構築 肝炎デルタ抗原をコードするＤＮＡを、（Ｄｒ．Ｊ．Ｔａｙｌｏｒ，Ｆｏｘ， Ｃｈａｓｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａから得た ）ｐＧＢ４−Ｖ５から得た。デルタ抗原配列の大部分を含む６００塩基対のＳｓ ｔII／ＳａｌＩフラグメントをまずｐＢＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＳｓ ｔII／ＳａｌＩ部位にサブクローニングした（図３）。ＳｓｔII及びＳａｌＩを 用いてプラスミドＤＮＡを制限分析することにより、６００塩基対フラグメント を含む形質転換体を同定した。クローンｐＢＳΔは、適正な挿入物を有するとし て同定された。 デルタ抗原遺伝子のＳｓｔII／ＳａｌＩフラグメントにはないＮ末端の９つの アミノ酸残基をコードする合成アダプターＤＮＡをｐＢＳΔのＳｓｔＩ／Ｓｓｔ II部位に連結した。アダプターＤＮＡの配列を以下に示す。 ＮｃｏＩを用いて制限分析することによりプラスミドｐ ＢＳΔを含むクローンを同定し、次いでＮｃｏＩ／ＳａｌＩフラグメントをｐｘ Ｓ３のＮｃｏＩ／ＳｍａＩ部位に挿入した。まず、このフラグメントのＳａｌＩ 末端をクレノウポリメラーゼを用いてブラント末端化した。ＥｃｏＲＩを用いて プラスミドＤＮＡを制限分析し、デルタ抗原ポリペプチド全体をコードするＤＮ Ａを含むクローンを同定した。デルタ抗原遺伝子中の診断ＥｃｏＲＩ部位を使用 し、ｐｘＳ３Δのアイデンティティを確認した。ステップ２：ｐｘＳ３Δ（またはｐｘＳ３デルタ）由来の肝炎デルタ抗原を発現 するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ８０００−８ＢＬＡＧのウェスターンブロット 分析 上述のごときＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ８０００−８Ｂ ＬＡＧを、Ｐｅｒ ｃｉｖａｌら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６３：３９１（１９８７）に記載 のごとくコンピテントにし、ｐｘＳ３Δを用いて形質転換し、ＹＮＢ最少ＴＲＰ プレート上で形質転換体を単離及び精製した。個々の形質転換体を選択下のＹＮ Ｂ最少培地中で増殖させた。炭素源及びＳＤＨプロモーター誘導物質（inducer ）を与えるべく、２％ソルビトールを添加した。細胞を３０℃で４８時間増殖さ せた。細胞ペレットを蒸留水中で洗浄し、 溶解用緩衝液（０.０５ＭＰＫＯ₄,ｐＨ７.４，１ｍＭ ＰＭＳＦ）中に再懸濁さ せた。ガラスビーズを用いて細胞を９０秒間破壊することにより細胞溶解物を調 製した。肝炎デルタ抗原の発現をウェスターンブロット分析によって判定した。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動した抽出物のウェスターンブロット分析による 肝炎デルタ抗原発現の検出を図４に示す。肝炎デルタ抗原を発現する形質転換体 の抽出物を含むレーン２と３のみで、強力な免疫反応性バンドが明示された。こ のデータは結果的に、プラスミドｐｘＳ３から肝炎データ抗原が産生されたこと を示している。 実施例６ ８０００−８ＢＬＡＧにおいてヒトスーパーオキシドジスムターゼポリペプチド を発現するためのｐｘＳ２の使用 ステップ１：ｐｘＳ２−ＳＯＤの構築 ヒトスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）をコードするＤＮＡ源は（Ｊ． Ｏｓｔｂｅｒｇ，Ｍ．Ｋｌａｓｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬから得た）ｐＳＯＤであった。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ３４０合成装置を使用して７つの 別個のオリゴヌクレオチドを合成し、それらをＭａｎｄｅｃｋｉら，Ｇｅｎｅ， ９４：１０３（１９９０）によって記載されているＦｏｋ １法を使用してＳＯ Ｄ遺伝子中に組込んだ。制限酵素ＢａｍＨＩ及びＮｃｏＩを使用してｐＳＯＤか らヒトＳＯＤ遺伝子を含む０.５ｋｂフラグメントを切り出した。クレノウポリ メラーゼを使用し、ＢａｍＨＩによって生成された付着末端をブラント末端化し た。フラグメントをｐｘＳ２のＮｃｏＩ及びＳｍａＩ部位に連結し、連結反応物 をＥ．ｃｏｌｉ株ＴＢＩ中に形質転換した。幾つかの異なる形質転換体から抽出 したプラスミドＤＮＡを制限分析することによりＳＯＤ遺伝子を含む形質転換体 を同定した。続いてＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＶを用いて分析し、ＳＯＤ遺伝子挿入 物を適正な向きで含むプラスミドを同定した。プラスミドｐｘＳ２−ＳＯＤがＳ ＯＤ遺伝子を含むとして同定された（図５）。ステップ２：ｐｘＳ２−ＳＯＤを用いて形質転換した８０００−８ＢＬＡＧにお けるヒトスーパーオキシドジスムターゼポリペプチドの発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ 分析 前述のごとく調製したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ８０００−８Ｂ ＬＡＧ中 にプラスミドｐｘＳ４及びｐｘＳ２− ＳＯＤを形質転換した。トリプトファンを含まない培地中で形質転換体を単離し た。ｐｘＳ４、ｐｘＳ２−ＳＯＤの個々の単離物を、２％ソルビトール，０.５ ％グルコース，２５ｍＭ ＣｕＳＯ₄，２５ｍＭ ＺｎＳＯ₄を含むＹＮＢ液体培 地１０ｍｌ中に接種した。飽和培養物の２００μＬアリコートを、２％ソルビト ール，０.３％グルコース，２５ｍＭ ＣｕＳＯ₄，２５ｍＭ ＺｎＳＯ₄を含む ＹＮＢ液体培地２５ｍｌ中に接種し、３０℃でインキュベートした。かかる培養 物１０ｍＬから得た細胞溶解物を前述のごとく更に処理した。未融合のスーパー オキシドジスムターゼのＳＤＳ分析を図６に示す。この結果から、優勢なポリペ プチドバンドは２０キロダルトンポリペプチドとして移動したものであることが 判る。ゲルのデンシトメーター分析からは、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ ポリペプチドの発現は全可溶性酵母ポリペプチドの６％を占めていたことが判っ た。 実施例７ 酵母発現ベクターｐＸＳ４リンカー由来のヒトスーパーオキシドジスムターゼ（ ＳＯＤ）ポリペプチドの発現 ステップ１：ｐＸＳ４リンカーＳＯＤの構築 化学的に合成されたスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子はＪ．Ｏｓｔｂｅｒ ｇ及びＭ.Ｋｌａｓｓ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔ ｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）によって与えられた。クローンｐＳ３０は、酵母ＳＤＨ遺 伝子全体をコードする〜４.５ｋｂの酵母ゲノムフラグメントを含む。ＳＤＨ遺 伝子の約２／３を含むｐＳ３０由来のＮｃｏＩフラグメントを、化学合成ヒトス ーパーオキシドジスムターゼ遺伝子を含むプラスミドｐＳＯＤの唯一のＮｃｏＩ 部位に挿入した。ＰＳｔＩによる制限分析を使用し、スーパーオキシドジスムタ ーゼポリペプチドとヒトＳＯＤの融合体をコードするクローン＃６８を同定した 。このプラスミドを、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子のＤＮＡ源とし て使用した。 クローン＃６８由来の０.５ｋｂのＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを単離 し、クレノウポリメラーゼで処理して付着末端を充填した。このフラグメントを 、ＳｍａＩ及びＢａｍＨＩ部位をクレノウポリメラーゼで予めブラント末端化し ておいてｐＸＳ４リンカーに連結した。幾つかの候補クローン由来のＤＮＡを単 離し、ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩを用いた制限分析によってＳＯＤ遺伝子の存在を 検査 した。クローンｐＸＳ４リンカーＳＯＤはＳＯＤ遺伝子を適正な向きで含んでい た。ステップ２：ｐＸＳ４リンカーＳＯＤを用いて形質転換した酵母株８０００−８ ＢＬＡＧにおけるヒトスーパーオキシドジスムターゼポリペプチドの発現の分析 Ｐｅｒｃｉｖａｌら，前出の形質転換方法を使用し、ｐＸＳ４リンカー及びｐ ＸＳ４リンカーＳＯＤを８０００−８Ｂ ＬＡＧ中に導入した。プラスミドを選 択するトリプトファン選択下で形質転換体を単離した。個々の形質転換体を、ト リプトファンを含まないＹＮＢ最少培地において精製した。 ２種の異なるプラスミドを含む形質転換体を、２％ソルビトール及び各々２５ ｍＭのＣｕＳＯ₄及びＺｎＳＯ₄を含むＹＮＢ液体培地１０ｍＬ中でトリプトファ ン選択下で増殖させた。細胞を３０℃で４８時間インキュベートした。細胞ペレ ットを３ｍＬの蒸留水で洗浄し、０.５ｍＬ抽出緩衝液（０.０５ＭＫＰＯ₄ｐＨ ７.４，２ｍＭβ−メルカプト−エタノール，１ｍＭ ＰＭＳＦ）中に再懸濁さ せ、ガラスビーズと共に２分間撹拌した。等容積の抽出物を溶解用緩衝液と混合 し、３分間煮沸し、抽出物のアリコート をＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、クーマシーブルーで染色した 。データを図８に示す。このデータから、優勢なポリペプチドバンドは分子量２ ０キロダルトンに移動したものであることが判る。ゲル走査から、ヒトＳＯＤポ リペプチドを酵母ソルビトールデヒドロゲナーゼポリペプチドとの融合体として 発現する８０００−８ＢＬＡＧにおいて１５％程度の発現レベルが得られたこと が判った。 本発明の実施態様は他のタイプの異種ポリペプチドにも適用可能であり、限定 的なものではなく、実施例であることは当業者には理解されよう。従って本明細 書は、本発明を記載の特定の実施態様に制限するものではなく、上述の及び請求 の範囲に記載の本発明の主題及び思想内にある全ての均等物を含むものとする。配列表 配列番号１： 配列の長さ：2774 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA ハイポセティカル：NO アンチセンス：NO 起源： 生物名：SACCHAROMYCES CEREVISIAE 株名：800B 配列の特徴： 特徴を表わす記号：CDS 存在位置：788..1856 配列： 配列番号２： 配列の長さ：356 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： 配列番号３： 配列の長さ：162 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列： 配列番号４： 配列の長さ：45 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA ヒポセティカル：YES 起源： 生物名：SACCHAROMYCES CEREVISIAE 配列：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ // Ｃ１２Ｑ 1/26 6807−4Ｂ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅソルビトールデヒドロ ゲナーゼ遺伝子由来のＤＮＡセグメントであって、ベクターが宿主酵母細胞によ って複製され保有されるようにベクター中で異種ポリペプチドをコードする遺伝 子に作動可能に連結されたとき、前記異種ポリペプチドの発現を増加するＤＮＡ セグメント。 ２．前記セグメントの機能的活性部分が、 （ａ）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのソルビトールデ ヒドロゲナーゼ遺伝子の転写調節配列、 （ｂ）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのソルビトールデ ヒドロゲナーゼ遺伝子の転写開始調節配列、及び （ｃ）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのソルビトールデ ヒドロゲナーゼ遺伝子の終結調節配列 を含む請求項１に記載のＤＮＡセグメント。 ３．前記転写調節配列がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの ソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝 子のプロモーターであり、前記終結調節配列がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃ ｅｒｅｖｉｓｉａｅのソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子のターミネーターで ある請求項２に記載のＤＮＡセグメント。 ４．ソルビトールデヒドロゲナーゼポリペプチドのＮ末端の１１個のアミノ酸残 基をコードするＤＮＡ配列を含む請求項１に記載のＤＮＡ配列。 ５．前記機能的活性部分が、図１の核酸番号１〜７７１及び核酸番号１８４８〜 ２７６０を含む請求項２に記載のＤＮＡセグメント。 ６．図１の核酸番号７７２〜８０５を含む請求項４に記載のＤＮＡセグメント。 ７．前記宿主酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである 請求項１に記載のＤＮＡセグメント。 ８．前記異種ポリペプチドがスーパーオキシドジスムターゼである請求項１に記 載のＤＮＡセグメント。 ９．前記異種ポリペプチドが肝炎デルタ抗原である請求項１に記載のＤＮＡセグ メント。 １０．酵母中で外来ポリペプチドを発現し得る発現ベクターであって、（ａ）Ｓ ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒ ｅｖｉｓｉａｅのソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子の転写調節配列、転写開 始調節配列及び終結調節配列の制御下にあるＤＮＡ配列、及び（ｂ）酵母複製系 を含む発現ベクター。 １１．前記転写及び終結調節配列が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ ｉｓｉａｅのソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター及びターミネ ーターを含む請求項１０に記載の発現ベクター。 １２．ソルビトールデヒドロゲナーゼポリペプチドのＮ末端の１１個のアミノ酸 残基をコードするＤＮＡ配列を含む請求項１０に記載の発現ベクター。 １３．前記ＤＮＡ調節配列が、図１の核酸番号１〜７７１及び核酸番号１８４８ 〜２７６０を含む請求項１０に記載の発現ベクター。 １４．前記ＤＮＡ調節配列が更に、図１の核酸番号７７２〜８０５を含む請求項 １３に記載の発現ベクター。 １５．請求項１０に記載の発現ベクターを用いて形質転換された酵母宿主細胞。 １６．Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである請求項１５に 記載の酵母宿主細胞。 １７．酵母中で異種ポリペプチドを生産する方法であって、ベクター中で外来ポ リペプチドをコードする遺伝子に作動可能に連結されており、ソルビトールによ って誘導されるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅソルビトー ルデヒドロゲナーゼ遺伝子由来の調節ヌクレオチドセグメントを導入するステッ プを含み、それによって前記ベクターが前記細胞によって複製され保有され、前 記遺伝子が誘導条件下で発現される方法。 １８．前記調節ヌクレオチドセグメントが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅ ｒｅｖｉｓｉａｅのソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子の転写調節配列、転写 開始調節配列及び終結調節配列の制御下にある請求項１７に記載の方法。 １９．前記転写開始調節配列が前記ソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロ モーターであり、前記終結調節配列が前記ソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子 のターミネーターである請求項１８に記載の方法。 ２０．前記調節ヌクレオチドセグメントが更に、ソルビトールデヒドロゲナーゼ ポリペプチドのＮ末端の１１個のアミノ酸残基をコードするＤＮＡ配列を含む請 求項１７に記載の方法。 ２１．前記調節ヌクレオチドセグメントが、図１の核酸番号１〜７７１及び核酸 番号１８４８〜２７６０を含む請求項２０に記載の方法。 ２２．前記ＤＮＡ調節配列が更に、図１の核酸番号７７２〜８０５を含む請求項 １７に記載の方法。 ２３．図１の配列またはその縮重均等物からなるＤＮＡ分子であって、該ＤＮＡ 分子によってコードされるポリペプチドが酵母ソルビトールデヒドロゲナーゼの 生物学的活性を有するＤＮＡ分子。 ２４．Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから単離及び精製さ れた請求項２３に記載のＤＮＡ配列。 ２５．図１に示したポリペプチド配列をコードする請求項２４に記載のＤＮＡ配 列。 ２６．Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のソルビトール デヒドロゲナーゼ活性を有する実質的に純粋な形態のポリペプチド。 ２７．図１に示したアミノ酸配列を有する、ソルビトールデヒドロゲナーゼ活性 を有する実質的に純粋な形態のポリペプチド。 ２８．ＳＤＨ発現異種ポリペプチドまたはその特異的結合 メンバーを含むアッセイ試薬。 ２９．前記ＳＤＨ発現異種ポリペプチドが酵素である請求項２８に記載のアッセ イ試薬。 ３０．前記ＳＤＨ発現異種ポリペプチドがスーパーオキシドジスムターゼである 請求項２９に記載のアッセイ試薬。 ３１．前記ＳＤＨ発現異種ポリペプチドが特異的結合対のメンバーである請求項 ２８に記載のアッセイ試薬。 ３２．前記ＳＤＨ発現異種ポリペプチドが肝炎デルタ抗原である請求項２８に記 載のアッセイ試薬。 ３３．試験試料中の特異的結合対のメンバーを検出する方法であって、試験試料 を、少なくとも１種のＳＤＨ発現異種ポリペプドまたはその特異的結合メンバー を含むアッセイ試薬に接触させることを含む方法。 ３４．前記ＳＤＨ発現異種ポリペプチドが酵素である請求項３３に記載の方法。 ３５．前記ＳＤＨ発現異種ポリペプチドがスーパーオキシドジスムターゼである 請求項３４に記載の方法。 ３６．前記ＳＤＨ発現異種ポリペプチドが特異的結合対のメンバーである請求項 ３３に記載の方法。 ３７．前記ＳＤＨ発現異種ポリペプチドが肝炎デルタ抗原 である請求項３６に記載の方法。 ３８．試験試料中の特異的結合対のメンバーの存在を検出することに使用する試 験キットであって、少なくとも１種のＳＤＨ発現ポリペプドまたはその特異的結 合メンバーを含むアッセイ試薬を有する容器を具備する試験キット。 ３９．前記ＳＤＨ発現異種ポリペプチドが酵素である請求項３８に記載の試験キ ット。 ４０．前記ＳＤＨ発現異種ポリペプチドがスーパーオキシドジスムターゼである 請求項３９に記載の試験キット。 ４１．前記ＳＤＨ発現異種ポリペプチドが特異的結合対のメンバーである請求項 ３８に記載の試験キット。 ４２．前記ＳＤＨ発現異種ポリペプチドが肝炎デルタ抗原である請求項４１に記 載の試験キット。