ITRM20070182A1

ITRM20070182A1 - Antagonisti dei recettori delle prochineticine derivati di essi e loro uso

Info

Publication number: ITRM20070182A1
Authority: IT
Inventors: Lucia Negri
Original assignee: Univ Roma
Priority date: 2007-04-03
Filing date: 2007-04-03
Publication date: 2008-10-04
Also published as: WO2008120263A3; WO2008120263A2

Description

DESCRIZIONE

A corredo di una domanda di brevetto per invenzione industriale avente per titolo: “Antagonisti dei recettori delle prochineticine, derivati di essi e loro uso”

CAMPO TECNICO DELL'INVENZIONE

La presente invenzione concerne derivati della proteina Bv8 aventi un’attività antagonista dei recettori delle prochineticine e il loro uso per il trattamento del dolore.

STATO DELLA TECNICA

Una conseguenza importante di lesioni tessutali è l'attivazione e la sensibilizzazione dei nocicettori. La sensibilizzazione dei nocicettori favorisce la sensibilità sia agii stimoli nocivi che a quelli normalmente non nocivi, producendo un dolore immediato e di lunga durata. La sensibilizzazione dei nocicettori nella stabilizzazione della lesione è clinicamente rilevante, in quanto molti stati di dolore acuto e cronico sono sensibili a farmaci (es. farmaci anti-infiammatori non-steroidei) che bloccano l’attività delle sostanze producenti la sensibilizzazione dei nocicettori (es. prostanoidi). La sensibilizzazione dei nocicettori è un processo acuto che si verifica entro breve tempo dalla lesione tessutale e che dipende da mediatori extracellulari, che modulano la funzione dei trasduttori sensoriali presenti sui nocicettori. Tuttavia essa comporta anche un processo a lungo termine che coinvolge la trascrizione e il traffico di molecole sensoriali, risultante in una prolungata sensibilizzazione dei nocicettori e quindi in una persistenza del dolore [McMahon et al., 2006].

I recettori delle prochineticine sono stati recentemente scoperti e denominati recettore 1 (PKR1) e recettore 2 (PKR2, Un et al., 2002; Masuda et al., 2002; Soga et al., 2002). La loro attivazione da parte dei peptidi appartenenti alla famiglia Bv8-EG-VEGF-prochineticine (PKs) (Bv8: Bombina variegata Bv8 proteina mRNA, complete cds. ACCESSION AF168790, EG-VEGF: Homo sapiens prokineticin 1 (PROK1), mRNA. ACCESSION NM_032414, PK1: Homo sapiens prokineticin 1 precursor (PROK1) mRNA, complete cds. ACCESSION AF333024, Human Bv8: Homo sapiens Bv8 protein (BV8) mRNA, partial cds. ACCESSION AF182069, PK2: Rattus norvegicus prokineticin 2 precursor, mRNA, complete cds. ACCESSION AY089984) costituisce un nuovo meccanismo responsabile della sensibilizzazione periferica dei nocicettori a seguito di una lesione. Le prochineticine da mammifero (es. PK1 e PK2) [Li et al., 2001; LeCouter et al., 2001] sono omologhe per parziale identità di sequenza ad una proteina originariamente isolata dal veleno del serpente mamba nero chiamata proteina A (MIT-1, Schweitz et al., 1999; Joubert et al., 1980} e ad una proteina isolata dalla secrezione della pelle della rana Bombina variegata , chiamata Bv8 (Mollay et al., 1999; Kaser et al., 2003]. Bv8 (8-11 kDa) è un valido "tool" farmacologico che ha~permesso di predire e caratterizzare il ruolo fisiologico degli agonisti endogeni, le prochineticine, negli animali. La somministrazione sistemica, spinale e intraplantare di Bv8 diminuisce la soglia nocicettiva ad un ampio spettro di stimoli fisici e chimici [Mollay et al., 1999; Negri et al., 2002, 2006].

La prochineticina 1 (PK1) e la prochineticina 2 (PK2) sono presenti nel midollo spinale e nelle cellule dei DRG (“dorsal root ganglion”), suggerendo un loro ruolo nella trasmissione di stimoli nocivi. Inoltre, PK2, ma non PK1, è espressa nella pelle, probabilmente nei granulociti, cellule dendritiche e macrofagi, e la sua espressione aumentata durante l'infiammazione [LeCouter et al., 2004; Dorsch et al., 2005], a supporto del suo ruolo potenziante nella mediazione dei dolori infiammatori [Martucci et al. ,2006]. Sia PK1 che PK2 attivano i recettori delle PKs (PKR1 e PKR2) in una maniera non selettiva. {PKR1: Homo sapiens prokineticin receptor 1 (PKR1) mRNA, complete cds. accession AF 506287; Mus musculus prokineticin receptor 1 (Prokrl), mRNA. Accession NM_021381, PKR2: Mus musculus prokineticin receptor 2 (Pkr2) mRNA, complete cds. accession AF487279; Homo sapiens prokineticin receptor 2 (PKR2) mRNA, complete cds. accession AF506288).

I recettori PKR1 e PKR2 si accoppiano alle proteine Gq/11 , Gqi e Gs, producendo un aumento nel calcio intracellulare [Lin et al., 2002; Negri et al., 2002; Vellani et al 2006]. Sia PKR1 che PKR2 sono presenti nei DRG e nelle coma dorsali del midollo spinale. PKR1, nelle cellule di piccolo diametro dei DRG, è colocalizzato con il recettore vanilloide TRPV1- (Transient Receptor Potential Vanilloid 1), notoriamente deputato alla percezione di stimoli nocivi, termici e tattili (e riconosciuto come il recettore per la capsaicina). Questo indica che PKR1 si trova su fibre sensitive primarie deputate alla percezione del dolore (nocicettori). In contrasto, PKR2 si trova prevalentemente nelle cellule di diametro medio o largo e non mostra significative co-localizzazioni con TRPV1. Gli agonisti endogeni di questi recettori, le prochineticine (PK), sono espressi in maniera elevata nei leucociti che infiltrano i tessuti infiammati, suggerendo che le PKs liberate nella sede della infiammazione possano attivare i PKRs sulle terminazioni nervose, giocando quindi un ruolo significativo nella sensibilizzazione dei nocicettori [Negri et al., 2002, 2006; Vellani et al 2006].

Studi in vitro su colture di neuroni isolati da DRG dimostrano la colocalizzazione, in circa il 90% dei neuroni esaminati, dei recettori PKR1 funzionali (cioè rispondenti a Bv8) con ì recettori TRPV1 funzionali (cioè rispondenti a capsaicina), fornendo una base anatomica per le interazioni PKR1/TRPV1.

L’autore della presente ha dimostrato che la delezione genetica di PKR1 nel topo previene, o diminuisce considerevolmente, l'attivazione dei nocicettori da parte della capsaicina, deH'infiammazione o dei protoni. Invece la delezione genetica del canale TRPV1 nel topo previene l'attivazione dei nocicettori da parte di Bv8. Questi risultati suggeriscono una interazione reciproca positiva tra il recettore PKR1 , accoppiato alla proteina G, e il canale TRPV1 per la percezione di stimoli nocivi di natura termica, meccanica e chimica [Negri et al., 2006; Vellani et al., 2006].

Molti stadi hanno sostenuto il potenziale terapeutico di antagonisti del canale TRPV1 [Honore et al., 2005, Ghilardi et al., 2005].

L’inattivazione dei recettori delle prochineticine (PKRs) potrebbe risultare terapeuticamente utile per due ragioni principali. Primo, gli antagonisti PKR prevengono le azioni sensibilizzanti delle prochinecitine endogene. In secondo luogo, gli antagonisti PKR possono prevenire l’attivazione del canale TRPV1 da attivatori endogeni del canale. Sarebbero quindi sicuramente utili in tutti i processi dolorosi, in cui la attivazione del canale TRPV1 gioca un ruolo, cioè nei dolori con componenti infiammatorie significative, inclusi i dolori post-operatori e muscolari profondi, e altri tipi di dolore (es. quelli risultanti dal cancro delle ossa).

Pertanto bloccando PKR1 , e possibilmente PKR2, si può attenuare in maniera efficace il dolore dovuto a lesioni dei tessuti. Inoltre si può accelerare il recupero di una sensibilità normale a seguito della lesione.

Sviluppo di analoghi di Bv8 come potenziali antagonisti

Tecniche di risonanza magnetica nucleare (NMR), [Boisbouvier et al. (1998)] hanno dimostrato che la caratteristica struttura dei ponti disolfuro, precedentemente determinata per la colipasi [Van Tilbeurgh et al., 1992], è presente anche nella proteina isolata dal veleno del mamba nero. Ciò è probabilmente vero anche per le altre proteine della famiglia AVIT (cioè Bv8, EG-VEGF, PKs che hanno tutte la stessa sequenza amminoacidica AVIT alla estremità N-terminale della molecola, Kaser et al., 2003). La proteina del veleno ha una struttura compatta, stabilizzata da cinque ponti disolfuro, con i frammenti N- e C- terminale presenti alla superficie (PDB, No. 1 lTM). Molti residui di amminoacidi carichi sono nascosti dentro la molecola, mentre alcuni residui idrofobici, come Trp24, sono esposti al solvente. La conformazione sferica della proteina è elissoidale: un polo ha una carica netta positiva, mentre il polo opposto è idrofobico.

Studi di relazione struttura-attività hanno dimostrato che la porzione N-terminale della molecola è essenziale per legare e attivare i PKRs. Tuttavia la porzione C-terminale contribuisce significativamente all’effetto iperalgesico dovuto all’attivazione di PKR1 e PKR2 sui nocicettori [Bulloc et al 2004; Negri et al., 2005J. Recentemente, un antagonista dei recettori delle prochineticine (PKRs) è stato sviluppato e testato dall'autore della presente invenzione. Si tratta di un analogo di Bv8, mancante dei primi due amminoacidi (dAV-Bv8): questa molecola non mostra alcuna attività biologica, né in vitro né in vivo, ma mantiene la capacità di legare i recettori delle prochineticine con una affinità 200 volte più alta di Bv8. La somministrazione di questo peptide antagonista, in vivo, risulta in uno spostamento verso destra della curva dose-effetto relativa alla iperalgesia meccanica prodotta da Bv8. Tuttavia, l'effetto antagonista di dAV-Bv8 è di breve durata, di circa due ore [Negri et al., 2005].

Le domande di brevetto W02005/042717 e W02005/091925 concernono un metodo per selezionare antagonisti PKR2, anche per la modulazione del dolore.

La domanda di brevetto W02004/081229 concerne l’uso di Bv8 umano e di EG-VEGF per promuovere l’ematopoiesi, mentre la domanda di brevetto W003/020892 concerne l’uso di polipeptidi Bv8 umancrper indurre la proliferazione e stimolare la crescita delle cellule endoteliali.

Tuttavia nessuna di queste domande di brevetto indica il ruolo e l'uso di derivati di Bv8 da anfibio nel quale alcune mutazioni sono in grado di produrre varianti antagonisti dei recettori PKR1 e PKR2, e il loro uso nella terapia del dolore.

Nella presente invenzione, l’autore descrive la potente attività antiiperaigesica di un variante di Bv8, detto [Ala<24>]Bv8, prodotto per via ricombinante, ad esempio nel lievito Pichia pastoris, nel quale il triptofano in posizione 24 è sostituito con una alanina.

Utilizzando come stampo la struttura tridimensionale del “Mamba Intestinal Toxin 1” (MIT) recentemente risolta, l’autore ha ottenuto un modello di omologia per Bv8. Pertanto, il grado di conservazione evolutiva di ciascun residuo è stato valutato attraverso un’analisi di allineamenti multipli di sequenze di proteine omologhe a Bv8, e i risultati ottenuti sono stati mappati sulla struttura modellata, per permettere l'identificazione di residui funzionali importanti e di regioni variabili. I risultati ottenuti suggeriscono fortemente che ogni modifica in una qualsiasi delle posizioni amminoacidiche da 6 a 40 della struttura primaria di Bv8 produce molecole in grado di comportarsi da antagonisti dei PKR.

SOMMARIO DELL’INVENZIONE

Forma pertanto oggetto della presente invenzione un peptide derivato dalla proteina Bv8 caratterizzato dal fatto di:

- comprendere una sostituzione amminoacidica in almeno una delle posizioni da 6 a 40 della sequenza primaria di Bv8;

- essere un antagonista funzionale per i recettori delle prochineticine PKR1 e PKR2;

- non avere un’attività iperlagesica.

Preferibilmente la sostituzione è una sostituzione del triptofano in posizione 24. Più preferibilmente il peptide è [Ala<24>]Bv8.

Forma oggetto dell’invenzione il peptide come descritto sopra per uso medico.

Forma altro oggetto dell’invenzione l'uso del peptide come descritto sopra per la preparazione di un medicamento per il trattamento e/o la prevenzione del dolore.

Preferibilmente il dolore è acuto o cronico. Ancora preferibilmente, il dolore cronico è selezionato tra il gruppo di: dolore cronico infiammatorio, causato da pancreatite, calcoli renali, mal di testa, dismenorrea, dolore muscolo-scheletrico, distorsioni, dolore viscerale, cisti ovariche, prostatite, cistite, cistite interstiziale, dolore postoperatorio, emicrania, nevralgia trigemina, dolore da bruciatura e/o ferita, dolore associato a trauma, dolore neuropatico, dolore associato a malattie muscolo-scheletriche, artrite reumatoide, osteoartrite, spondilite anchilosante, patologie periarticolari, dolore oncologico, dolore da metastasi ossee, dolore da HIV.

Forma altro oggetto dell’invenzione una composizione farmaceutica comprendente in quantità efficace il peptide come descritto sopra e adiuvanti e/o eccipienti e/o diluenti.

La presente invenzione verrà ora descritta in suoi esempi non limitativi, con particolare riferimento alle seguenti figure:

Figura-1. Sequenza di cDNA codificante per Bv8 da Bombine variegata maturo.

Figura 2. Purificazione per RP-HPLC di [Ala<24>]Bv8. Il materiale legato viene eluito da una colonna cromatografica a fase inversa Vydac 208TP52 con un gradiente lineare di Acetonitrile/TFA 0.2% in acqua/TFA 0.2%. La eluizione della proteina mutante avviene al 22.5% di acetonitrile in H2O con un tempo di ritenzione di 104 min. Nella stesse condizioni Bv8 eluisce al 23.5% di acetonitrile in H2O con un tempo di ritenzione di 120 min.

Figura 3. Test della pressione sulla zampa del ratto. La somministrazione s.c. di 20 pg/kg di [Ala<24>]Bv8 blocca gli effetti iperalgesia prodotti dalla somministrazione di Bv8 per via s.c. (a), i. pi. (b) e i.t. (c). (d) La somministrazione i.t. di 10 ng di [Ala<24>]Bv8, una dose che blocca sia la prima che la seconda fase di iperalgesia indotta dalla somministrazione i.t. di Bv8, blocca la seconda fase d’iperalgesia indotta dalla somministrazione s.c. di Bv8, che dipende dell’attivazione dei recettori PKRs centrali. La nocicezione meccanica è stata misurata con il paw-pressure test, nel ratto. La variazione percentuale del valore della soglia nocicettiva misurata è calcolata rispetto al valore della soglia nocicettiva di base, cioè prima del trattamento.

Figura 4. Test della pressione sulla zampa del ratto. La somministrazione i.t. di [Aia<24>]Bv8 blocca l'effetto iperalgesico prodotto dalla somministrazione di Bv8 i.t. (a), ma è inefficace contro l'iperalgesia periferica locale prodotta dalla somministrazione i.pl. di Bv8 (b). La variazione percentuale del valore della soglia nocicettiva misurata è calcolata rispetto al valore della soglia nocicettiva di base, cioè prima del trattamento. [Ala<24>]Bv8 è somministrato 4 minuti prima di Bv8.

Figura 5. Test della pressione sulla zampa del ratto. La curva doserisposta dell’effetto iperalgesico indotto da iniezione i.t. di Bv8 (espressa come area sotto la curva - AUC — di iperalgesia) viene spostata a destra di un ordine di grandezza dalla pre-somministrazione i.t. di 5 ng di [Ala<24>]Bv8. AUC = “area under curve", area sottesa da una curva calcolata per mezzo degli integrali con programma di computer.

Figura 6. Effetto anti-iperalgesico di [Ala<24>]Bv8 nel topo. Nel topo, la somministrazione sistemica di [Ala<24>]Bv8 (20 μg/kg, s.c.) abolisce l'iperalgesia termica (test d’immersione della zampa) (a) e riduce significativamente l’allodinia tattile (von Frey) (b) indotta dalla somministrazione locale di Bv8 (0.5 ng = 50 fmol, i.pl.). [Ala<24>]Bv8 (20 μg/kg, s.c.) riduce il “licking” indotto dalla capsaicina (5 nmol, i.pl) (c).

Figura 7. Test della pressione nel modello di infiammazione da CFA nel ratto. Nei ratti, l’iniezione sistemica s.c. e i.v. di [Ala<24>]Bv8, abolisce in maniera dose-dipendente l’iperalgesia indotta dalla infiammazione prodotta con CFA (test di pressione della zampa). L'effetto antiiperalgesico dura rispettivamente 8 ore, 4 ore e 3 ore dopo l’iniezione s.c. di 20, 5, e 2 μg/kg di [Ala<24>]Bv8. La dose di 0.5 μg/kg non produsce effetti (a). Dopo somministrazione i.v., la dose di 0.5 pg/kg abolisce l'iperalgesia per 2 ore; la dose di 0.1 pg/kg, i.v. non ha effetti (b).

Figura 8. Test della “Paw-lmmersion" nel modello di infiammazione da CFA nel topo. Nel ratto, [Ala<24>]Bv8 s.c. a 20 μg/kg abolisce l'iperalgesia termica (test d’immersione della zampa a 48°C) per oltre 6 ore. Le misurazioni sono state effettuate su 5 animali di controllo (trattati con salina) e 5 animali trattati con Ala24-Bv8: medie e ANOVA a due vie. La latenza è stata misurata in secondi come indicato nei metodi.

Figura 9. L’ipersensibilità (a) termica (piastra calda) e (b) meccanica indotta dall'incisione intraplantare, è stabilizzata 1 giorno dopo l'incisione. La somministrazione sistemica dell’antagonista di PKRs, [Ala<24>]Bv8 (20 pg/kg s.c.) annulla totalmente (A) l’iper-sensibilità termica (misurata in secondi di latenza alla sottrazione della zampa dallo stimolo termico) e l’ipersensibilità meccanica (B) misurata come peso (in grammi) a cui l'animale sottrae la zampa dallo stimolo pressorio.

Figura 10. Elettroforesi su gel dei prodotti di amplificazione, mediante RT-PCR, di mRNA per PK2 nella pelle della zampa sana (A), nella pelle della zampa infiammata 6, 12, 24 h e 30 g dopo la iniezione di CFA (B); nel DRG di un ratto sano (C) e nel DRG di un ratto portatore di zampa infiammata, 24 h dopo la iniezione di CFA (D).

Figura 11. Andamento temporale della iperalgesia e della espressione di PK2 nella pelle della zampa di ratto dopo iniezione di CFA. Lo sviluppo e la durata della iperalgesia conseguente al processo infiammatorio causato dalla iniezione di CFA correla con l’aumento di espressione della prokineticina2 nella pelle della zampa infiammata.

MATERIALI E METODI

Progettazione del costrutto di [AIa<24>]Bv8 e clonazione nel vettore d’espressione pPIC9K

Bv8 [Bv8: Bombina variegata Bv8 protein mRNA, complete cds. ACCESSION AF168790] è composta di 77 residui amminoacidici, con 10 cisteine formanti cinque ponti disolfuro. E’ noto che la presenza di un numero elevato di ponti disolfuro nella catena polipeptidica rappresenta un ostacolo alla corretta produzione di proteine ricombinanti in Escherichia coli, con frequente formazione di corpi d'inclusione insolubili. Questo è stato anche riscontrato nella produzione di proteine della famiglia AVIT, quali Bv8. Per questi motivi, è stato scelto un lievito, Pichia pastorìs, come sistema per l'espressione ricombinante della proteina. A questo scopo, il cDNA di Bombine variegata codificante per Bv8 è stato clonato in un vettore di inserzione di 9.3 Kb, pPIC9K ( invitrogen ), specifico per P. pastorìs. pPIC9K è in grado di agire come una navetta tra batterio e lievito, essendo presenti due elementi di selezione per i batteri, rispettivamente la resistenza al'ampicillina e alla kanamicina. La presenza del gene HIS 4 permette la generazione di trasformanti stabili di P. pastorìs attraverso ricombinazione omologa tra sequenze condivise dal vettore e dal genoma ospite. Tali sequenze integrate mostrano una forte stabilità in assenza di pressione selettiva anche quando sono presenti come copie multiple.

A monte del sito di clonazione multipla, il vettore contiene il promotore del gene dell'alcool ossidasi 1 (AOX1), frequentemente usato per controllare l’espressione di geni eterologhi. Questo promotore è fortemente represso in cellule cresciute in presenza di glucosio, glicerolo, e altre sorgenti di carbonio, ma è fortemente indotto dal metanolo. Il vettore contiene anche la sequenza codificante per il peptide segnale del fattore a di Saccharomyces cerevisiae, che permette di indirizzare la proteina ricombinante al di fuori della cellula. Questo peptide segnale è composto di una pre-sequenza di 19 residui amminoacidici e da una pro-sequenza di 66 residui. Il processo di maturazione del prodotto consiste di tre fasi: 1) rimozione della presequenza nel reticolo endoplasmatico; 2) taglio in corrispondenza di uno specifico sito all'interno della pro-sequenza da parte della Kex2 e 3) rilascio della proteina matura da parte di Ste13.

Data l’impossibilità di inserire il cDNA direttamente nel sito multiplo di clonazione, si è dovuto amplificare la sequenza codificante il peptide segnale presente sul vettore mediante una PCR preparativa, eseguita con gli oligonucleotidi pa1BamH1 e pa2Xho1 , che contengono rispettivamente i siti riconosciuti dagli enzimi BamHl ed Xhol. Il frammento, chiamato PS BamHl-Xhol, di circa 250 coppie di basi è stato estratto dal gel e digerito con gli enzimi BamHl e Xhol.

li cDNA di Bv8, corrispondente al peptide maturo, privo cioè della sua sequenza segnale, è stato amplificato con gli oligonucleotidi Bv8upXho1 e Bv8EcoRldw, che permette l'introduzione di un sito riconosciuto da EcoRI. Il frammento di circa 300 coppie di basi, chiamato Bv8 EcoRl-Xhol, è stato estratto dal gel e digerito con gli enzimi di restrizione EcoRl e Xhol.

La ligazione dei due frammenti ottenuti è stata utilizzata come stampo per una nuova PCR preparativa eseguita con gli oligonucleotidi pa1-BamHl e Bv8-EcoRldw. Il frammento ottenuto è stato digerito con gli enzimi di restrizione BamHl e EcoRl ed è stato inserito nel vettore pPIC9K precedentemente tagliato con gli stessi enzimi, in modo da eliminare la parte codificante per la sequenza segnale. E' stato estratto il DNA plasmidico da una delle colonie positive, PS-Bv8 #13, e ne è stata determinata la sequenza nucleotidica.

Usando questo costrutto come stampo, l’autore ha prodotto per PCR un DNA codificante per una variante di Bv8, in cui il triptofano in posizione 24 è sostituito con un'alanina. A questo scopo, sono stati prodotti per amplificazione due diversi frammenti: il primo frammento è stato ottenuto usando gli oligonucleotidi pa1-BamHl e Mut-W-dw (Tabella 1), in grado di appaiare sulla regione a monte del triptofano 24 e di introdurre il sito di restrizione Nhel ottenuto con una sostituzione silente di un'unica base. Il secondo frammento è stato ottenuto utilizzando gli oligonucleotidi Bv8-W-up e Bv8EcoRldw (Tabella 1). Il primo si appaia a monte della regione del triptofano 24 e contiene una mutazione di tre basi che permette sia la sostituzione di W24A che l'inserimento del sito di restrizione Nhel.

Tabella 1. Oligonucleotidi usati per l'amplificazione del DNA mediante PCR

Oligonucleotide Sequenza Tm Pa1BamHl 5’-GCG-GAT-CCA-AAC-GAT-GAG- 62.7°C ATT-TCC-3'

Pa2Xhol 5-GCC-TCG-AGA-GAT -ACC-CCT- 64.2°C TCT-TC-3'

Bv8EcoRldw 5 ’-ATA-GAA-TTC-AG A-ACA-CTT - 62.6°C AAA-TTT-TTC-TCC-3’

Bv8kex2Xhol 5’-TTA-TCT -CGA-GAA-AAG-AGC- 71.6°C

TGT-TAT-CAC-TGG-CGC-CTG-TG-

3’

Mut-W-up 5-GCT -GCT -AGC-GCT-GCT -TCA- 69.5°C CGT-AAC-ATC-AG-3’

Mut-W-up 5’-CGC-GCT-AGC-AGC-GCA-GCA- 67.6°C GG-3

Oltre alla sequenza è indicata la temperatura di fusione (Tm). In grassetto sono indicate le basi mutate.

l due frammenti risultanti sono stati digeriti con Nhel e quindi ligati. Il prodotto è stato utilizzato come stampo per una nuova amplificazione PCR utilizzando gli oligonucleotidi pa1-BamHl e Bv8-EcoRldw (Tabella 1). Il nuovo frammento è stato di nuovo digerito con BamHl e EcoRl e inserito nel vettore pPlC9K, precedentemente digerito con gli stessi enzimi, al fine di tagliare la regione codificante per la sequenza segnale. Questo plasmide (Bv8 mut# 2) è stato usato per trasformare E. coli Top10F competente, e sequenziato.

Il plasmide Bv8 mut#2 è stato linearizzato con Sa/l per favorire l'integrazione nel ceppo ospite P. pastorìs GS15(his4) auxotrofo per istidina e usato per trasformare il lievito per elettroporazione.

La selezione di trasformanti His<+>è stata fatta su un terreno minimo MD selettivo. Per confermare la presenza dell’espressione della cassetta di Bv8 nei trasformanti His<+>di P. pastorìs, l’autore ha effettuato un screening delle colonie a mezzo di PCR usando inneschi specifici, Pa1-BamHl e Bv8-EcoRldw (Tabella 1).

Espressione di [Ala24]Bv8 in P. pastorìs

P. pastorìs recombinante è stato cresciuto in un terreno di coltura con glicerolo come fonte di carbonio e di energia per ottenere alta densità cellulare. Le cellule sono state separate attraverso centrifugazione e risospese in un terreno contenente metanolo per indurre la sovraespressione della proteina ricombinante grazie al promotore AOX1.

Dieci cloni ricombinanti di P. pastorìs sono stati analizzati per i loro livelli di espressione su piccola scala e la resa della proteina ricombinante è stato determinata per HPLC in fase inversa. Seguendo questo approccio, l’autore ha selezionato il clone di P. pastorìs capace di produrre alti livelli di Bv8, per un’espressione successiva su larga scala. Le condizioni ottimali sono state determinate attraverso il monitoraggio del contenuto in Bv8 nelle colture in differenti concentrazioni di metanolo, a diversi tempi e temperature di crescita. Il picco d'espressione di Bv8 ricombinante è stato osservato dopo 120 ore d’induzione con metanolo all’1% a 30°C.

Purificazione di [Ala<24>]Bv8

I supernatanti delle colture d’espressione sono stati concentrati e, come prima tappa di purificazione, caricati su una colonna CM-Sephadex. A pH 7, Bv8, con un pi di 8.46, si lega alla resina e viene eluita con un tampone BES, pH 7.0/0.2 M NaCl. Frazioni di Bv8 ricombinante sono state raggruppate e dializzate contro un tampone Tris-HCI 20 mM, pH 7.0. Quindi, la proteina è stata purificata mediante HPLC in fase inversa su una colonna C18 (Fig. 3). In queste condizioni d'espressione, il rendimento di [Ala<24>]Bv8 è approssimativamente 1 mg per litro di coltura.

Saggi di legame

Cellule CHO confluenti (circa 20 x 10<6>) sono state lavate con PBS/EDTA, distaccate dalle piastre di coltura e raccolte per centrifugazione. Il precipitato risultante è stato omogenizzato in 10 mi di un tampone di omogeneizzazione a freddo (50 mM Tris-HCl, pH 7.4) da un omogenizzatore Polytron (PT3000, Kinematica) a 16,000 r.p.m. per 2 minuti. L'omogenato è stato centrifugato a una bassa velocità (700 g per 15 min a 4°C) e il supematante che ne risulta è stato centrifugato a 100,000 g per 60 minuti a 4°C. Il precipitato risultante è stato ri-sospeso in 10 mi 50mM Tris-HCl, pH 7.4, e tenuto a -80°C fino aH’utilizzo. La concentrazione proteica è stata determinata dal kit di saggio proteico BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockfort, IL, U.S.A.). Le membrane (20 pg di proteine per PKR1 e 40 pg di proteine per PKR2) sono state incubate con 4 pM [<125>l]MIT (PerkinElmer,<125>I-MIT: Kd PKR1 = 0.72 nM; Kd PKR2 = 0.29 nM) e concentrazioni stabilite variabili di Bv8, e [Ala<24>]Bv8 in un volume finale di 1ml a 37°C per 90 min. Ogni concentrazione è stata saggiata due volte. Dopo l'incubazione, i campioni sono stati raffreddati e le membrane raccolte su filtri Whatman GF/B precedentemente imbevuti in 0.5% di politilenimine (Sigma-Aldrich, Milano, Italy), lavate nove volte con 2ml di 50mM Tris-HCl freddo, pH 7.4, e trasferite in fiale di conteggio. La radioattività è stata misurata in un contatore gamma (Packard, Cobra 11 auto-gamma). Il legame non specifico è stato determinato in presenza di 0.1 mM di Bv8. Lo spostamento delle curve e i valori IC50sono stati calcolati con un software PRISM (GraphPad Software, San Diego, CA, U.S.A.).

Misurazione della nocicezione

Sensibilità tattile

La sensibilità tattile della regione plantare delle zampe posteriori dei topi e ratti (abituati a un pavimento di rete metallica) è stata sondata con filamenti flessibili calibrati in modo da applicare pressioni variabili da 0.41, 0.70, 1.20, 2.00, 3.63, 5.50, 8.5 e 15.1 g (Test di vonFrey). Lo stimolo pressorio viene alternativamente aumentato e diminuito (metodo up-down), per ottenere una varietà di risposte positive e negative<43,44>. Il 50% di soglia di ritiro della zampa è stato determinato come segue: (10<[Xf+kd]>)/10,000 [Xf= ultimo filamento von Frey utilizzato, k = valore Dixon e d = intervallo di stimolo (differenza in grammi fra i vari filamenti)].

Ipersensibilità termica

I ratti vengono posti su una piastra di vetro chiaro pre-riscaldata e lasciati abituare all’ambiente per circa 30 min. Le zampe posteriori vengono quindi esposte a stimoli termici infrarossi e (con un timer) la latenza tra la applicazione dello stimolo ed il ritiro della zampa viene misurata. Un tempo massimo di 32 secondi è stato utilizzato come “cut-off" per prevenire danni al tessuto (Piantar Test, Ugo Basile, Comerio, Italy).

Il test di immersione della zampa viene effettuato immergendo la zampa posteriore del topo in acqua calda (48°c) e misurando la latenza di ritiro della zampa.

Sensibilità meccanica Randall-Selitto

La soglia a stimoli nocivi di tipo meccanico è misurata con un analgesimetro (Ugo Basile, Comerio, Italy). Il test è realizzato applicando una pressione gradualmente crescente (su scala lineare) alla zampa posteriore del ratto, fino a quando il ratto ritrae la zampa. Un “cut-off" di 400 g è stato utilizzato per evitare potenziali danni al tessuto.

Somministrazione di farmaci

Bv8, e [Ala<24>]Bv8 sono stati iniettati per via sottocutanea (s.c.), per via intratecale (i.t.) o nella zampa (i.pl.). Per le iniezioni i.pl., i farmaci dissolti in 0.9% NaCI sono stati iniettati nelle regioni piantare (20 μl) e dorsale (20 μl) della zampa con una microsiringa attraverso un ago di 30 gauge. Un volume uguale di soluzione salina è stato iniettato in ratti di controllo.

Per le applicazioni i.t., cateteri cronici lombari i.t. sono stati inseriti nei ratti sotto anestesia di ketamina-xylazina (60 mg/kg 10mg/kg , i.p.) come già descritto (Negri et al., 2002). Il veicolo l.t. è un fluido cerebrospinale artificiale, e ogni ratto ha ricevuto 5 μl del veicolo o della soluzione di composti testati dissolti nel veicolo, seguiti da 5 μl di fluido cerebrospinale. Per la somministrazione sistemica, i composti dissolti in soluzione salina sono stati iniettati a un volume di 2ml/kg del tragitto s.c. I controlli sono stati iniettati con un volume uguale di soluzione salina.

Modelli animali di dolore

Infiammazione della zampa indotta da CFA.

La zampa sinistra del topo o del ratto viene infiammata con (20 or 100 μl) iniezioni di “complete Freund’s adjuvant" (CFA) e la zampa destra , iniettata con salina, serve di controllo. L’edema della zampa indotto da CFA è stato valutato misurando il volume della zampa con uno pletismometro 7140 (Ugo Basile). L’ipersensibilità termica, tattile e meccanica si sviluppa entro 6 ore dalla iniezione di CFA, è massima dopo 12-24 ore e ritorna ai valori di base entro 4 giorni dalla iniezione. La soglia nocicettiva a stimoli tattili (von Frey), termici (calore radiante) e meccanici (Randall Selitto) della zampa infiammata e della zampa di controllo è valutata come sopra descritto. A 2 ore, 6 ore, 12 ore, 1 giorno, 2, 3 e 4 giorni successivi alla iniezione di CFA, gruppi separati di ratti vengono testati per l'ipersensibilità termica, tattile e meccanica, prima della iniezione dell'antagonista e poi testati a 15, 30, 60, 90, 120, e 180 minuti dopo la iniezione dell'antagonista per determinare l'andamento temporale dell’attività del farmaco. Per ciascuna dose sono stati saggiati gruppi separati di animali per determinare la curva dose-risposta dell’antagonista PKR.

Modello di dolore postoperatorio ( incisione plantare)

I ratti sono stati anestetizzati con isofluorano, per inalazione. La regione piantare della zampa sinistra è stata preparata, e una incisione longitudinale di 1 cm è stata effettuata attraverso la striscia di pelle e il muscolo della superficiale plantare. La pelle è stata chiusa con due suture di nylon 5-0 e la ferita coperta con pomata antibiotico prima del ricovero. Le suture sono state rimosse dopo due giorni dall’intervento. I ratti utilizzati come controllo, ricevevano anestesia e preparazione chirurgica, ma non l’incisione. L’ipersensibilità termica, tattile e meccanica sviluppa entro due ore dall’incisione, comincia a diminuire 4 giorni dopo l’operazione, e entro 7 giorni ritorna ai valori di prima dell’incisione (valori di base).

La soglia nocicettiva a stimoli tattili, termici e meccanici della zampa infiammata e della zampa di controllo è valutata come sopra descritto. A 2 ore, 1 giorno, e 4 giorni successivi alla incisione, gruppi separati di ratti sono stati saggiati per ipersensibilità termica, tattile e meccanica, prima della iniezione dell’antagonista e poi testati a 15, 30, 60, 90, 120, e 180 minuti dopo la iniezione dell’antagonista per determinare l’andamento temporale dell'attività del farmaco. Per ciascuna dose sono stati saggiati gruppi separati di animali per determinare la curva dose-risposta dell’antagonista PKR.

RISULTATI

Affinità dei recettore

[Ala<24>]Bv8 lega sia PKR1 che PKR2; la sua affinità per i PKRSs è stata determinata come concentrazione necessaria per spiazzare il 50% di 125l-MIT legato a preparazioni di membrane di cellule CHO transfettate con PKR1 o PKR2 (Tabella 2).

Tabella 2: Affinità delle proteine Bv8 e [Ala24]Bv8 per i recettori delle prochineticine espressa come concentrazione che inibisce il legame di [<125>l]MIT-1 (in nM) alle preparazioni di membrane da cellule CHO trasfettate stabilmente con i recettori PKR1 or PKR2.

lC50(nM)

PKR1 PKR2

Bv8 1.0 1.07

[Ala24]Bv8 30.5 8.60

La sostituzione di Trp24 con Ala riduce di 30 volte l'affinità di [Ala24]Bv8 per i recettori PKR1 e di solo 8 volte per i recettori PKR2 rispetto a Bv8.

Attività antinocicettiva

Modelli d’iperalgesia indotta da Bv8

L’autore ha già dimostrato che, nei ratti e nei topi, l'iniezione s.c. (200 ng/kg) o l'iniezione i.t. (0.5 ng/ratto) di Bv8 produce una caratteristica iperalgesia bifasica a stimoli termici, meccanici e tattili, e che iniezioni locali (intraplantari) di Bv8 (0.5ng) elicita forte e localizzata ipersensibilità termica e meccanica simile a quella della fase iniziale d’iperalgesia indotta da una somministrazione sistemica di Bv8 ma senza la seconda fase d'ipersensibilità. Perciò, la risposta iperalgesica bifasica alla somministrazione sistemica di Bv8 appare mediata attraverso l'attività prochineticinica alla periferia (prima fase soltanto) e dei siti centrali (sia nella prima che nella seconda fase).

La muteina di Bv8, [Ala<24>]Bv8, a dosi fino a 50 volte superiori delle dosi iperalgesiche di Bv8, non mostra alcun effetto iperalgesico. Tuttavia, se precedentemente somministrata (5-15 min), è in grado di bloccare l'ipersensibilità termica, meccanica e tattile indotta dalla successiva somministrazione di Bv8.

Nei ratti, la somministrazione s.c. (-15 min) di [Ala<24>]Bv8 (2 μg/kg - 20 μg/kg) abolisce la prima e la seconda fase d’ipersensibilità meccanica indotta dalla somministrazione s.c. (200 ng /kg) e dalla somministrazione intratecale (0.5 ng/rat) di Bv8 (Fig 3a, 3c). Una dose significativamente più bassa (0.1 μg/kg, s.c., -15 min) è sufficiente ad eliminare l'iperalgesia locale indotta da iniezione intraplantare di 0.5 ng di Bv8 (Fig 3b). Questi risultati indicano che la somministrazione sistemica dell'antagonista PKR blocca sia i PKRs periferici che quelli spinali.

La pre-iniezione intratecale (-5 min) di [Ala<24>]Bv8 alla dose di 2 ng riduce, mentre la dose di 5 ng abolisce la prima e seconda fase di iperalgesia indotta da Bv8 (da 0.5 a 3 ng/ratto di Bv8, i.t.) (Fig 4a, 5).

[Ala<24>]Bv8 fino a 10 ng i.t. (-5 min) non cambia l'iperalgesia locale indotta da Bv8. [Ala<24>]Bv8 non riesce a bloccare l'iperalgesia indotta da iniezione i.pl. di Bv8 (Fig 4b) né la prima fase dell'iperalgesia indotta dalla iniezione s.c. di Bv8 (Fig 3d). Tuttavia, [Ala<24>]Bv8 abolisce la seconda fase d’iperalgesia che dipende dall’attivazione dei siti centrali (Fig 3d).

Nel topo, la somministrazione sistemica di [Ala<24>]Bv8 (20 μg/kg, s.c.) abolisce l’iperalgesia termica e riduce significativamente l’allodinia tattile indotta dalla somministrazione locale di Bv8 (0.5 ng, i.pl.) indicando un ruolo dei PKRs periferici nell’ipersensibilità termica e tattile (Fig 6a, b). La muteina [Ala<24>]Bv8 inoltre riduce il “flinching” indotto dalla capsaicina (Fig 6c), in accordo con la ridotta sensibilità alla capsaicina dei topi mancanti del recettore PKR1. Questi dati confermano la già evidenziata interazione fra PKR ed il recettore vanilloide TRPV1.

Modelli di dolore infiammatorio (infiammazione della zampa indotta da CFA)

[Ala<24>]Bv8 (20 μg/kg, s.c.) abolisce l'ipersensibilità meccanica e tattile indotta da CFA. Da notare, la somministrazione sistemica di questa dose di [Ala<24>]Bv8 non è in grado di alterare (a temperatura corporea nell'arco di 8 ore successive alla somministrazione: la temperatura corporea varia da 37.5 ± .2°C a 38 ± 0.03°C in ratti trattati con soluzione salina e da 37.5 ± 0.2°C a 38.1 ± 0.03°C in ratti trattati con [Ala<24>]Bv8 (p< 0.05, paired t-test, n=6).

Nei ratti, l'iniezione sistemica s.c. e i.v. di [Ala<24>]Bv8, abolisce in maniera dose-dipendente l'iperalgesia meccanica indotta da CFA (test di pressione della zampa). L'effetto anti-iperalgesico dura per 8 ore, 4 ore e 3 ore dopo l’iniezione s.c. di 20, 5, e 2 μg/kg, rispettivamente (fig.

7). La dose di 0.5 μg/kg non ha effetto quando viene iniettata s.c., ma abolisce l'iperalgesia per 2 ore quando viene iniettata i.v. La dose i.v. di 0.1 μg/kg non ha effetto.

Nel topo, [Ala<24>]Bv8 alla dose di 20 μg/kg abolisce l'iperalgesia termica (test di Immersione della zampa a 48°C) per più di 6 ore (Fig 8).

Modello di dolore post operatorio (incisione plantare)

La somministrazione sistemica di [Ala<24>]Bv8, abolisce l’ipersensibilità termica e tattile indotta dall'incisione. La somministrazione di [Ala<24>]Bv8 (20 μg/kg s.c.) 1 giorno dopo l’incisione riporta la soglia nocicettiva termica e meccanica ai valori basali (cioè di prima della incisione), comparabili con la soglia nocicettiva termica e meccanica dei ratti di controllo (Sham) entro 30 minuti dalla somministrazione (Figura 9a, b rispettivamente), indicando che la somministrazione acuta dell’antagonista PKR, [Ala<24>]Bv8, abolisce l’ipersensibilità termica e meccanica indotta dall'incisione. Questo effetto antiiperalgesico ha lunga durata, e diminuisce 7 ore dopo l'iniezione.

Espressione di PKs nel tessuto

Gli studi di RT-PCR indicano che l'infiammazione indotta da CFA della zampa del ratto produce un drammatico aumento della espressione di PK2, massimo tra 12 e 24 h, nella pelle della zampa infiammata (Fig 10a), ma produce un significativo aumento della espressione di PK2 anche nei DRG L4-5, cioè in quelli che ricevono le fibre nocicettive afferenti dalla zampa infiammata (Fig 10b). L'aumento nel mRNA di PK2 indotto dal CFA è tempo-dipende, essendo già significativo entro la prima ora e raggiungendo un massimo (aumento di 1000 volte) 9 ore dopo il CFA. I livelli di mRNA di PK2 diminuiscono 24 ore dopo il CFA, ma rimangono significativamente più alti dei valori basali ancora 30 giorni dopo il CFA. Lo sviluppo e la durata dell'iperalgesia è correlata al drammatico aumento dell’espressione di PK2 (Fig 11). 24 ore dopo la somministrazione di CFA nella zampa, sono aumentati anche i livelli di mRNA di PK2 nel DRG.

CONCLUSIONI

E' stato mostrato che la somministrazione di prochineticine non mammifere, come Bv8, abbassa la soglia dei nocicettori ad un ampio spettro di stimoli fisici e chimici attraverso l’attivazione dei PKRs su neuroni sensitivi primari. Il caratteristico andamento temporale dell’ipersensibilità indotta da Bv8 è in accordo con un’attività prochineticinica alla periferia (solo nella prima fase) e ai siti centrali (sia nella prima che nella seconda fase). L'iniezione di CFA nella zampa di ratto ha prodotto una drammatica sovraregolazione di mRNA di PK2, nella pelle infiammata ma anche nei DRG (4° e 5° lombare) . In vitro, Bv8 produce chemiotassi di macrofagi e un aumento del rilascio di citochine indotto da LPS.

Inoltre, la chemotassi indotta da Bv8 e l’aumentato rilascio di citochine indotto da LPS in presenza di Bv8 non sono stati osservati in macrofagi di topi knockout per i recettori PKR1 , indicando che queste risposte pro-infiammatorie sono mediate proprio dai recettori PKR1 [Martucci et al., 2006]. Questi dati evidenziano il ruolo di PKs e PKRs nel dolore indotto da infiammazione e indicano che il blocco dell’attivazione dei PKRs neuronali potrebbe ridurre la sensibilizzazione al dolore. Inoltre, il blocco dei PKRs leucocitari potrebbe prevenire l'infiltrazione di cellule immunitarie nell’area lesa. E’ stato dimostrato che il recettore PKR1 è necessario per la percezione di quei segnali dolorosi, notoriamente mediati dal recettore vanilloide TRPV1. Gli antagonisti TRPV1 finora studiati sono efficaci come antiiperalgesici in quei processi patologici nei quali si produce acidosi-tessutale, come nel caso di infiammazione, di ferite e di processi cancerogeni. Tuttavia, i recettori TRPV1 sono presenti nel sistema nervoso centrale; studi preclinici hanno dimostrato consistentemente che antagonisti di TRPV1 producono un significativo ed indesiderato aumento della temperatura corporea. L'aumento della temperatura corporea sembra essere un effetto di classe, piuttosto che essere ristretto ad una distinta struttura chimica. Un farmaco ideale dovrebbe essere in grado di limitare l'attività dei canali TRPV1 negli stati di dolore, senza produrre gli effetti collaterali degli antagonisti di TRPV1. Un potenziale bersaglio è rappresentato dai recettori prochineticinici che sono essenziali nell'attivazione dei recettori TRPV1 .

In accordo, la presente invenzione ha dimostrato che il blocco dei recettori PKRs con antagonisti non selettivi, come [Ala<24>]Bv8, abolisce l’ipersensibilità termica, meccanica e tattile prodotta dall'infiammazione e dall'incisione della zampa, supportando il ruolo dei PKRs nel dolore indotto da infiammazione.

BIBLIOGRAFIA

Boisbouvier, J., et al., (1998) J. Mol. Biol, 283, 205-219.

Builock, C. M., et al., Mol Pharmacol 65, 582-588 (2004).

Dorsch M., et al., . J.Leukocyte Biol,. 78 , August 2005.

Ghilardi, J. R. et al. J Neurosci 25, 3126-31 (2005).

Honore, P. et al. J Pharmacol Exp Ther 314, 410-21 (2005).

Joubert F.J. & Strydom D.J. (1980). Hoppe Seylers Z.Physiol. Chem., 361,1787-1794.

Kaser A , Winklmayr M., Lepperdinger G., Kreil G. (2003). EMBO Rep., 4, 469-473.

LeCouter J, et al., Nature, 412, 876-884.

Lecouter J, Zlot C.,(2004). PNAS, 101, 16813-16818.

Li M, Bullock Cm, et al., (2001). Mol. Pharm., 59, 692-698.

Ln Dch., et al., (2002). J. Biol. Chem., 277, 19276

McMahon, S., Bennet, D. & Bevan, S. in Wall and Malzack's Textbook of Pain (eds. McMahon, S. & Koltzenburg, M.) 49-72 (Elsevier Churchill Livingstone, London, 2006).

Martucci C, et al., (2006). Br J Pharmacol., 147, 225-234.

Masuda Y., et al., (2002). Biochem. Biophys. Res. Comm., 293, 396-402.

Mollay C, et al., (1999). Eur. J. Pharmacol., 374,189-196.

Negri, L. et al. J Neurosci 26, 6716-27 (2006).

Negri, L. et al. Br J Pharmacol 137 , 1147-54 (2002).

Negri L., et al., (2005). Br. J. Pharmacol., 146, 625-632

Schweitz H., et al., (1999). Toxicon, 28, 847-856.

Soga T, et ai., (2002) Biocem. BiophisActa, 1579, 173-179.

Van Tilbeurgh, H., et al., (1992). Nature , 359, 159-162.

Vellani, V. et al. J Neurosci 26, 5109-16 (2006).

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Peptide derivato dalla proteina Bv8 caratterizzato dal fatto di: - comprendere una sostituzione amminoacidica in almeno una delle posizioni da 6 a 40 della sequenza primaria di Bv8; - essere un antagonista funzionale per i recettori delle prochineticine PKR1 e PKR2; - non avere un’attività iperlagesica.
2. Peptide secondo la rivendicazione 1 in cui la sostituzione è una sostituzione del triptofano in posizione 24.
3. Peptide secondo la rivendicazione 2 essendo [Ala<24>]Bv8.
4. Peptide secondo una qualsiasi rivendicazione precedente per uso medico.
5. Uso di un peptide secondo la rivendicazione 1 per la preparazione di un medicamento per il trattamento e/o la prevenzione del dolore.
6. Uso secondo la rivendicazione 5 in cui il dolore è acuto o cronico.
7. Uso secondo la rivendicazione 6 in cui il dolore cronico è selezionato tra il gruppo di: dolore cronico infiammatorio, causato da pancreatite, calcoli renali, mal di testa, dismenorrea, dolore muscoloscheletrico, distorsioni, dolore viscerale, cisti ovariche, prostatite, cistite, cistite interstiziale, dolore post-operatorio, emicrania, nevralgia trigemina, dolore da bruciatura e/o ferita, dolore associato a trauma, dolore neuropatico, dolore associato a malattie muscolo-scheletriche, artrite reumatoide, osteoartrite, spondilite anchilosante, patologie periarticolari, dolore oncologico, dolore da metastasi ossee, dolore da HIV.
8. Composizione farmaceutica comprendente in quantità efficace il peptide secondo la rivendicazione 4 e adìuvanti e/o eccipienti e/o diluenti.