ITRM20070182A1 - ANTAGONISTS OF THE PROCHINETICINE RECEPTORS DERIVED FROM THEM AND THEIR USE - Google Patents

Description

DESCRIZIONE DESCRIPTION

A corredo di una domanda di brevetto per invenzione industriale avente per titolo: “Antagonisti dei recettori delle prochineticine, derivati di essi e loro uso” In support of a patent application for industrial invention entitled: "Antagonists of prokineticin receptors, derivatives of them and their use"

CAMPO TECNICO DELL'INVENZIONE TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION

La presente invenzione concerne derivati della proteina Bv8 aventi un’attività antagonista dei recettori delle prochineticine e il loro uso per il trattamento del dolore. The present invention relates to derivatives of the Bv8 protein having an antagonist activity of prokineticin receptors and their use for the treatment of pain.

STATO DELLA TECNICA STATE OF THE TECHNIQUE

Una conseguenza importante di lesioni tessutali è l'attivazione e la sensibilizzazione dei nocicettori. La sensibilizzazione dei nocicettori favorisce la sensibilità sia agii stimoli nocivi che a quelli normalmente non nocivi, producendo un dolore immediato e di lunga durata. La sensibilizzazione dei nocicettori nella stabilizzazione della lesione è clinicamente rilevante, in quanto molti stati di dolore acuto e cronico sono sensibili a farmaci (es. farmaci anti-infiammatori non-steroidei) che bloccano l’attività delle sostanze producenti la sensibilizzazione dei nocicettori (es. prostanoidi). La sensibilizzazione dei nocicettori è un processo acuto che si verifica entro breve tempo dalla lesione tessutale e che dipende da mediatori extracellulari, che modulano la funzione dei trasduttori sensoriali presenti sui nocicettori. Tuttavia essa comporta anche un processo a lungo termine che coinvolge la trascrizione e il traffico di molecole sensoriali, risultante in una prolungata sensibilizzazione dei nocicettori e quindi in una persistenza del dolore [McMahon et al., 2006]. An important consequence of tissue injury is the activation and sensitization of nociceptors. Sensitization of nociceptors promotes sensitivity to both noxious and normally non-noxious stimuli, producing immediate and long-lasting pain. The sensitization of nociceptors in the stabilization of the lesion is clinically relevant, as many states of acute and chronic pain are sensitive to drugs (e.g. non-steroidal anti-inflammatory drugs) that block the activity of substances producing sensitization of nociceptors (e.g. . prostanoids). Sensitization of nociceptors is an acute process that occurs within a short time of tissue injury and that depends on extracellular mediators, which modulate the function of sensory transducers present on nociceptors. However, it also involves a long-term process involving the transcription and trafficking of sensory molecules, resulting in a prolonged sensitization of nociceptors and therefore in a persistence of pain [McMahon et al., 2006].

I recettori delle prochineticine sono stati recentemente scoperti e denominati recettore 1 (PKR1) e recettore 2 (PKR2, Un et al., 2002; Masuda et al., 2002; Soga et al., 2002). La loro attivazione da parte dei peptidi appartenenti alla famiglia Bv8-EG-VEGF-prochineticine (PKs) (Bv8: Bombina variegata Bv8 proteina mRNA, complete cds. ACCESSION AF168790, EG-VEGF: Homo sapiens prokineticin 1 (PROK1), mRNA. ACCESSION NM_032414, PK1: Homo sapiens prokineticin 1 precursor (PROK1) mRNA, complete cds. ACCESSION AF333024, Human Bv8: Homo sapiens Bv8 protein (BV8) mRNA, partial cds. ACCESSION AF182069, PK2: Rattus norvegicus prokineticin 2 precursor, mRNA, complete cds. ACCESSION AY089984) costituisce un nuovo meccanismo responsabile della sensibilizzazione periferica dei nocicettori a seguito di una lesione. Le prochineticine da mammifero (es. PK1 e PK2) [Li et al., 2001; LeCouter et al., 2001] sono omologhe per parziale identità di sequenza ad una proteina originariamente isolata dal veleno del serpente mamba nero chiamata proteina A (MIT-1, Schweitz et al., 1999; Joubert et al., 1980} e ad una proteina isolata dalla secrezione della pelle della rana Bombina variegata , chiamata Bv8 (Mollay et al., 1999; Kaser et al., 2003]. Bv8 (8-11 kDa) è un valido "tool" farmacologico che ha~permesso di predire e caratterizzare il ruolo fisiologico degli agonisti endogeni, le prochineticine, negli animali. La somministrazione sistemica, spinale e intraplantare di Bv8 diminuisce la soglia nocicettiva ad un ampio spettro di stimoli fisici e chimici [Mollay et al., 1999; Negri et al., 2002, 2006]. The prokineticin receptors have recently been discovered and named receptor 1 (PKR1) and receptor 2 (PKR2, Un et al., 2002; Masuda et al., 2002; Soga et al., 2002). Their activation by peptides belonging to the Bv8-EG-VEGF-prokineticin family (PKs) (Bv8: Bombina variegata Bv8 protein mRNA, complete cds. ACCESSION AF168790, EG-VEGF: Homo sapiens prokineticin 1 (PROK1), mRNA. ACCESSION NM_032414, PK1: Homo sapiens prokineticin 1 precursor (PROK1) mRNA, complete cds. ACCESSION AF333024, Human Bv8: Homo sapiens Bv8 protein (BV8) mRNA, partial cds. ACCESSION AF182069, PK2: Rattus norvegicus prokineticin 2 precursor, cds . ACCESSION AY089984) constitutes a new mechanism responsible for the peripheral sensitization of nociceptors following an injury. Mammalian prokineticins (eg PK1 and PK2) [Li et al., 2001; LeCouter et al., 2001] are homologous by partial sequence identity to a protein originally isolated from the venom of the black mamba snake called protein A (MIT-1, Schweitz et al., 1999; Joubert et al., 1980} and to a protein isolated from the secretion of the skin of the Bombina variegata frog, called Bv8 (Mollay et al., 1999; Kaser et al., 2003]. Bv8 (8-11 kDa) is a valid pharmacological "tool" that allowed to predict and characterize the physiological role of endogenous agonists, prokineticins, in animals. Systemic, spinal and intra-implant administration of Bv8 decreases the nociceptive threshold to a broad spectrum of physical and chemical stimuli [Mollay et al., 1999; Negri et al., 2002 , 2006].

La prochineticina 1 (PK1) e la prochineticina 2 (PK2) sono presenti nel midollo spinale e nelle cellule dei DRG (“dorsal root ganglion”), suggerendo un loro ruolo nella trasmissione di stimoli nocivi. Inoltre, PK2, ma non PK1, è espressa nella pelle, probabilmente nei granulociti, cellule dendritiche e macrofagi, e la sua espressione aumentata durante l'infiammazione [LeCouter et al., 2004; Dorsch et al., 2005], a supporto del suo ruolo potenziante nella mediazione dei dolori infiammatori [Martucci et al. ,2006]. Sia PK1 che PK2 attivano i recettori delle PKs (PKR1 e PKR2) in una maniera non selettiva. {PKR1: Homo sapiens prokineticin receptor 1 (PKR1) mRNA, complete cds. accession AF 506287; Mus musculus prokineticin receptor 1 (Prokrl), mRNA. Accession NM_021381, PKR2: Mus musculus prokineticin receptor 2 (Pkr2) mRNA, complete cds. accession AF487279; Homo sapiens prokineticin receptor 2 (PKR2) mRNA, complete cds. accession AF506288). Prokineticin 1 (PK1) and prokineticin 2 (PK2) are present in the spinal cord and in DRG (dorsal root ganglion) cells, suggesting their role in the transmission of noxious stimuli. Furthermore, PK2, but not PK1, is expressed in the skin, probably in granulocytes, dendritic cells and macrophages, and its expression increased during inflammation [LeCouter et al., 2004; Dorsch et al., 2005], supporting its potentiating role in the mediation of inflammatory pain [Martucci et al. , 2006]. Both PK1 and PK2 activate PKs receptors (PKR1 and PKR2) in a non-selective manner. {PKR1: Homo sapiens prokineticin receptor 1 (PKR1) mRNA, complete cds. accession AF 506287; Mus musculus prokineticin receptor 1 (Prokrl), mRNA. Accession NM_021381, PKR2: Mus musculus prokineticin receptor 2 (Pkr2) mRNA, complete cds. accession AF487279; Homo sapiens prokineticin receptor 2 (PKR2) mRNA, complete cds. accession AF506288).

I recettori PKR1 e PKR2 si accoppiano alle proteine Gq/11 , Gqi e Gs, producendo un aumento nel calcio intracellulare [Lin et al., 2002; Negri et al., 2002; Vellani et al 2006]. Sia PKR1 che PKR2 sono presenti nei DRG e nelle coma dorsali del midollo spinale. PKR1, nelle cellule di piccolo diametro dei DRG, è colocalizzato con il recettore vanilloide TRPV1- (Transient Receptor Potential Vanilloid 1), notoriamente deputato alla percezione di stimoli nocivi, termici e tattili (e riconosciuto come il recettore per la capsaicina). Questo indica che PKR1 si trova su fibre sensitive primarie deputate alla percezione del dolore (nocicettori). In contrasto, PKR2 si trova prevalentemente nelle cellule di diametro medio o largo e non mostra significative co-localizzazioni con TRPV1. Gli agonisti endogeni di questi recettori, le prochineticine (PK), sono espressi in maniera elevata nei leucociti che infiltrano i tessuti infiammati, suggerendo che le PKs liberate nella sede della infiammazione possano attivare i PKRs sulle terminazioni nervose, giocando quindi un ruolo significativo nella sensibilizzazione dei nocicettori [Negri et al., 2002, 2006; Vellani et al 2006]. PKR1 and PKR2 receptors couple to Gq / 11, Gqi and Gs proteins, producing an increase in intracellular calcium [Lin et al., 2002; Negri et al., 2002; Vellani et al 2006]. Both PKR1 and PKR2 are present in DRGs and dorsal coma of the spinal cord. PKR1, in small diameter DRG cells, is colocalized with the TRPV1- (Transient Receptor Potential Vanilloid 1) receptor, known to be responsible for the perception of noxious, thermal and tactile stimuli (and recognized as the receptor for capsaicin). This indicates that PKR1 is found on primary sensory fibers responsible for pain perception (nociceptors). In contrast, PKR2 is predominantly found in cells of medium or large diameter and does not show significant co-localizations with TRPV1. The endogenous agonists of these receptors, prokineticins (PK), are highly expressed in leukocytes that infiltrate inflamed tissues, suggesting that PKs released at the site of inflammation can activate PKRs on nerve endings, thus playing a significant role in sensitization. of nociceptors [Negri et al., 2002, 2006; Vellani et al 2006].

Studi in vitro su colture di neuroni isolati da DRG dimostrano la colocalizzazione, in circa il 90% dei neuroni esaminati, dei recettori PKR1 funzionali (cioè rispondenti a Bv8) con ì recettori TRPV1 funzionali (cioè rispondenti a capsaicina), fornendo una base anatomica per le interazioni PKR1/TRPV1. In vitro studies on cultured neurons isolated from DRG demonstrate the colocalization, in about 90% of the examined neurons, of functional PKR1 receptors (i.e. responsive to Bv8) with functional TRPV1 receptors (i.e. responsive to capsaicin), providing an anatomical basis for PKR1 / TRPV1 interactions.

L’autore della presente ha dimostrato che la delezione genetica di PKR1 nel topo previene, o diminuisce considerevolmente, l'attivazione dei nocicettori da parte della capsaicina, deH'infiammazione o dei protoni. Invece la delezione genetica del canale TRPV1 nel topo previene l'attivazione dei nocicettori da parte di Bv8. Questi risultati suggeriscono una interazione reciproca positiva tra il recettore PKR1 , accoppiato alla proteina G, e il canale TRPV1 per la percezione di stimoli nocivi di natura termica, meccanica e chimica [Negri et al., 2006; Vellani et al., 2006]. The author of the present has shown that the genetic deletion of PKR1 in mice prevents, or considerably decreases, the activation of nociceptors by capsaicin, inflammation or protons. On the other hand, the genetic deletion of the TRPV1 channel in mice prevents the activation of nociceptors by Bv8. These results suggest a positive reciprocal interaction between the PKR1 receptor, coupled to the G protein, and the TRPV1 channel for the perception of noxious stimuli of a thermal, mechanical and chemical nature [Negri et al., 2006; Vellani et al., 2006].

Molti stadi hanno sostenuto il potenziale terapeutico di antagonisti del canale TRPV1 [Honore et al., 2005, Ghilardi et al., 2005]. Many stages have supported the therapeutic potential of TRPV1 channel antagonists [Honore et al., 2005, Ghilardi et al., 2005].

L’inattivazione dei recettori delle prochineticine (PKRs) potrebbe risultare terapeuticamente utile per due ragioni principali. Primo, gli antagonisti PKR prevengono le azioni sensibilizzanti delle prochinecitine endogene. In secondo luogo, gli antagonisti PKR possono prevenire l’attivazione del canale TRPV1 da attivatori endogeni del canale. Sarebbero quindi sicuramente utili in tutti i processi dolorosi, in cui la attivazione del canale TRPV1 gioca un ruolo, cioè nei dolori con componenti infiammatorie significative, inclusi i dolori post-operatori e muscolari profondi, e altri tipi di dolore (es. quelli risultanti dal cancro delle ossa). The inactivation of prokineticin receptors (PKRs) could be therapeutically useful for two main reasons. First, PKR antagonists prevent the sensitizing actions of endogenous prokinecithins. Secondly, PKR antagonists can prevent the activation of the TRPV1 channel by endogenous activators of the channel. They would therefore certainly be useful in all painful processes, in which the activation of the TRPV1 channel plays a role, i.e. in pain with significant inflammatory components, including post-operative and deep muscle pain, and other types of pain (e.g. those resulting from bone cancer).

Pertanto bloccando PKR1 , e possibilmente PKR2, si può attenuare in maniera efficace il dolore dovuto a lesioni dei tessuti. Inoltre si può accelerare il recupero di una sensibilità normale a seguito della lesione. Therefore, by blocking PKR1, and possibly PKR2, pain due to tissue injury can be effectively alleviated. In addition, the recovery of normal sensitivity following injury can be accelerated.

Sviluppo di analoghi di Bv8 come potenziali antagonisti Development of Bv8 analogs as potential antagonists

Tecniche di risonanza magnetica nucleare (NMR), [Boisbouvier et al. (1998)] hanno dimostrato che la caratteristica struttura dei ponti disolfuro, precedentemente determinata per la colipasi [Van Tilbeurgh et al., 1992], è presente anche nella proteina isolata dal veleno del mamba nero. Ciò è probabilmente vero anche per le altre proteine della famiglia AVIT (cioè Bv8, EG-VEGF, PKs che hanno tutte la stessa sequenza amminoacidica AVIT alla estremità N-terminale della molecola, Kaser et al., 2003). La proteina del veleno ha una struttura compatta, stabilizzata da cinque ponti disolfuro, con i frammenti N- e C- terminale presenti alla superficie (PDB, No. 1 lTM). Molti residui di amminoacidi carichi sono nascosti dentro la molecola, mentre alcuni residui idrofobici, come Trp24, sono esposti al solvente. La conformazione sferica della proteina è elissoidale: un polo ha una carica netta positiva, mentre il polo opposto è idrofobico. Nuclear magnetic resonance (NMR) techniques, [Boisbouvier et al. (1998)] demonstrated that the characteristic structure of disulfide bridges, previously determined for colipase [Van Tilbeurgh et al., 1992], is also present in the protein isolated from the venom of the black mamba. This is probably also true for the other proteins of the AVIT family (i.e. Bv8, EG-VEGF, PKs which all have the same AVIT amino acid sequence at the N-terminal end of the molecule, Kaser et al., 2003). The venom protein has a compact structure, stabilized by five disulfide bridges, with the N- and C-terminal fragments present at the surface (PDB, No. 1TM). Many charged amino acid residues are hidden inside the molecule, while some hydrophobic residues, such as Trp24, are exposed to the solvent. The spherical conformation of the protein is ellipsoidal: one pole has a net positive charge, while the opposite pole is hydrophobic.

Studi di relazione struttura-attività hanno dimostrato che la porzione N-terminale della molecola è essenziale per legare e attivare i PKRs. Tuttavia la porzione C-terminale contribuisce significativamente all’effetto iperalgesico dovuto all’attivazione di PKR1 e PKR2 sui nocicettori [Bulloc et al 2004; Negri et al., 2005J. Recentemente, un antagonista dei recettori delle prochineticine (PKRs) è stato sviluppato e testato dall'autore della presente invenzione. Si tratta di un analogo di Bv8, mancante dei primi due amminoacidi (dAV-Bv8): questa molecola non mostra alcuna attività biologica, né in vitro né in vivo, ma mantiene la capacità di legare i recettori delle prochineticine con una affinità 200 volte più alta di Bv8. La somministrazione di questo peptide antagonista, in vivo, risulta in uno spostamento verso destra della curva dose-effetto relativa alla iperalgesia meccanica prodotta da Bv8. Tuttavia, l'effetto antagonista di dAV-Bv8 è di breve durata, di circa due ore [Negri et al., 2005]. Structure-activity relationship studies have shown that the N-terminal portion of the molecule is essential for binding and activating PKRs. However, the C-terminal portion significantly contributes to the hyperalgesic effect due to the activation of PKR1 and PKR2 on nociceptors [Bulloc et al 2004; Negri et al., 2005 J. Recently, a prokineticin receptor antagonist (PKRs) has been developed and tested by the author of the present invention. It is an analogue of Bv8, lacking the first two amino acids (dAV-Bv8): this molecule does not show any biological activity, neither in vitro nor in vivo, but retains the ability to bind prokineticin receptors with an affinity of 200 times higher. high of Bv8. In vivo administration of this antagonist peptide results in a rightward shift of the dose-effect curve related to mechanical hyperalgesia produced by Bv8. However, the antagonistic effect of dAV-Bv8 is short-lived, lasting about two hours [Negri et al., 2005].

Le domande di brevetto W02005/042717 e W02005/091925 concernono un metodo per selezionare antagonisti PKR2, anche per la modulazione del dolore. Patent applications WO2005 / 042717 and WO2005 / 091925 concern a method for selecting PKR2 antagonists, also for pain modulation.

La domanda di brevetto W02004/081229 concerne l’uso di Bv8 umano e di EG-VEGF per promuovere l’ematopoiesi, mentre la domanda di brevetto W003/020892 concerne l’uso di polipeptidi Bv8 umancrper indurre la proliferazione e stimolare la crescita delle cellule endoteliali. The patent application W02004 / 081229 concerns the use of human Bv8 and EG-VEGF to promote hematopoiesis, while the patent application W003 / 020892 concerns the use of Bv8 umancr polypeptides to induce proliferation and stimulate cell growth endothelial.

Tuttavia nessuna di queste domande di brevetto indica il ruolo e l'uso di derivati di Bv8 da anfibio nel quale alcune mutazioni sono in grado di produrre varianti antagonisti dei recettori PKR1 e PKR2, e il loro uso nella terapia del dolore. However, none of these patent applications indicate the role and use of amphibian Bv8 derivatives in which some mutations are capable of producing antagonistic variants of the PKR1 and PKR2 receptors, and their use in pain therapy.

Nella presente invenzione, l’autore descrive la potente attività antiiperaigesica di un variante di Bv8, detto [Ala<24>]Bv8, prodotto per via ricombinante, ad esempio nel lievito Pichia pastoris, nel quale il triptofano in posizione 24 è sostituito con una alanina. In the present invention, the author describes the powerful antihyperigesic activity of a variant of Bv8, called [Ala <24>] Bv8, produced recombinantly, for example in the yeast Pichia pastoris, in which the tryptophan in position 24 is replaced with a alanine.

Utilizzando come stampo la struttura tridimensionale del “Mamba Intestinal Toxin 1” (MIT) recentemente risolta, l’autore ha ottenuto un modello di omologia per Bv8. Pertanto, il grado di conservazione evolutiva di ciascun residuo è stato valutato attraverso un’analisi di allineamenti multipli di sequenze di proteine omologhe a Bv8, e i risultati ottenuti sono stati mappati sulla struttura modellata, per permettere l'identificazione di residui funzionali importanti e di regioni variabili. I risultati ottenuti suggeriscono fortemente che ogni modifica in una qualsiasi delle posizioni amminoacidiche da 6 a 40 della struttura primaria di Bv8 produce molecole in grado di comportarsi da antagonisti dei PKR. Using the recently resolved three-dimensional structure of the "Mamba Intestinal Toxin 1" (MIT) as a template, the author obtained a homology model for Bv8. Therefore, the degree of evolutionary conservation of each residue was evaluated through an analysis of multiple alignments of protein sequences homologous to Bv8, and the results obtained were mapped onto the modeled structure, to allow the identification of important functional residues and regions. variables. The results obtained strongly suggest that any modification in any of the amino acid positions 6 to 40 of the primary structure of Bv8 produces molecules capable of behaving as PKR antagonists.

SOMMARIO DELL’INVENZIONE SUMMARY OF THE INVENTION

Forma pertanto oggetto della presente invenzione un peptide derivato dalla proteina Bv8 caratterizzato dal fatto di: Therefore, the subject of the present invention is a peptide derived from the Bv8 protein characterized by the fact of:

- comprendere una sostituzione amminoacidica in almeno una delle posizioni da 6 a 40 della sequenza primaria di Bv8; - comprising an amino acid substitution in at least one of the positions 6 to 40 of the primary sequence of Bv8;

- essere un antagonista funzionale per i recettori delle prochineticine PKR1 e PKR2; - be a functional antagonist for PKR1 and PKR2 prokineticin receptors;

- non avere un’attività iperlagesica. - not have hyperlagesic activity.

Preferibilmente la sostituzione è una sostituzione del triptofano in posizione 24. Più preferibilmente il peptide è [Ala<24>]Bv8. Preferably the substitution is a substitution of the tryptophan in position 24. More preferably the peptide is [Ala <24>] Bv8.

Forma oggetto dell’invenzione il peptide come descritto sopra per uso medico. The peptide as described above for medical use is the subject of the invention.

Forma altro oggetto dell’invenzione l'uso del peptide come descritto sopra per la preparazione di un medicamento per il trattamento e/o la prevenzione del dolore. Another object of the invention is the use of the peptide as described above for the preparation of a medicament for the treatment and / or prevention of pain.

Preferibilmente il dolore è acuto o cronico. Ancora preferibilmente, il dolore cronico è selezionato tra il gruppo di: dolore cronico infiammatorio, causato da pancreatite, calcoli renali, mal di testa, dismenorrea, dolore muscolo-scheletrico, distorsioni, dolore viscerale, cisti ovariche, prostatite, cistite, cistite interstiziale, dolore postoperatorio, emicrania, nevralgia trigemina, dolore da bruciatura e/o ferita, dolore associato a trauma, dolore neuropatico, dolore associato a malattie muscolo-scheletriche, artrite reumatoide, osteoartrite, spondilite anchilosante, patologie periarticolari, dolore oncologico, dolore da metastasi ossee, dolore da HIV. Preferably the pain is acute or chronic. Still preferably, chronic pain is selected from the group of: chronic inflammatory pain, caused by pancreatitis, kidney stones, headache, dysmenorrhea, musculoskeletal pain, sprains, visceral pain, ovarian cysts, prostatitis, cystitis, interstitial cystitis, postoperative pain, migraine, trigeminal neuralgia, burn and / or wound pain, pain associated with trauma, neuropathic pain, pain associated with musculoskeletal disease, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, ankylosing spondylitis, periarticular disease, cancer pain, pain from bone metastases , HIV pain.

Forma altro oggetto dell’invenzione una composizione farmaceutica comprendente in quantità efficace il peptide come descritto sopra e adiuvanti e/o eccipienti e/o diluenti. Another object of the invention is a pharmaceutical composition comprising in an effective amount the peptide as described above and adjuvants and / or excipients and / or diluents.

La presente invenzione verrà ora descritta in suoi esempi non limitativi, con particolare riferimento alle seguenti figure: The present invention will now be described in its non-limiting examples, with particular reference to the following figures:

Figura-1. Sequenza di cDNA codificante per Bv8 da Bombine variegata maturo. Figure 1. Bv8 coding cDNA sequence from mature Bombine variegata.

Figura 2. Purificazione per RP-HPLC di [Ala<24>]Bv8. Il materiale legato viene eluito da una colonna cromatografica a fase inversa Vydac 208TP52 con un gradiente lineare di Acetonitrile/TFA 0.2% in acqua/TFA 0.2%. La eluizione della proteina mutante avviene al 22.5% di acetonitrile in H2O con un tempo di ritenzione di 104 min. Nella stesse condizioni Bv8 eluisce al 23.5% di acetonitrile in H2O con un tempo di ritenzione di 120 min. Figure 2. RP-HPLC purification of [Ala <24>] Bv8. The bound material is eluted from a Vydac 208TP52 reverse phase chromatography column with a linear gradient of Acetonitrile / TFA 0.2% in water / TFA 0.2%. Elution of the mutant protein occurs at 22.5% acetonitrile in H2O with a retention time of 104 min. Under the same conditions Bv8 elutes 23.5% acetonitrile in H2O with a retention time of 120 min.

Figura 3. Test della pressione sulla zampa del ratto. La somministrazione s.c. di 20 pg/kg di [Ala<24>]Bv8 blocca gli effetti iperalgesia prodotti dalla somministrazione di Bv8 per via s.c. (a), i. pi. (b) e i.t. (c). (d) La somministrazione i.t. di 10 ng di [Ala<24>]Bv8, una dose che blocca sia la prima che la seconda fase di iperalgesia indotta dalla somministrazione i.t. di Bv8, blocca la seconda fase d’iperalgesia indotta dalla somministrazione s.c. di Bv8, che dipende dell’attivazione dei recettori PKRs centrali. La nocicezione meccanica è stata misurata con il paw-pressure test, nel ratto. La variazione percentuale del valore della soglia nocicettiva misurata è calcolata rispetto al valore della soglia nocicettiva di base, cioè prima del trattamento. Figure 3. Rat Paw Pressure Test. Administration s.c. of 20 pg / kg of [Ala <24>] Bv8 blocks the hyperalgesic effects produced by the administration of Bv8 via the s.c. (to the. pi. (b) and i.t. (c). (d) The administration i.t. of 10 ng of [Ala <24>] Bv8, a dose that blocks both the first and second phases of hyperalgesia induced by i.t. of Bv8, blocks the second phase of hyperalgesia induced by SC administration of Bv8, which depends on the activation of central PKRs receptors. Mechanical nociception was measured with the paw-pressure test in the rat. The percentage change in the measured nociceptive threshold value is calculated with respect to the basic nociceptive threshold value, i.e. before treatment.

Figura 4. Test della pressione sulla zampa del ratto. La somministrazione i.t. di [Aia<24>]Bv8 blocca l'effetto iperalgesico prodotto dalla somministrazione di Bv8 i.t. (a), ma è inefficace contro l'iperalgesia periferica locale prodotta dalla somministrazione i.pl. di Bv8 (b). La variazione percentuale del valore della soglia nocicettiva misurata è calcolata rispetto al valore della soglia nocicettiva di base, cioè prima del trattamento. [Ala<24>]Bv8 è somministrato 4 minuti prima di Bv8. Figure 4. Rat Paw Pressure Test. The administration i.t. of [Aia <24>] Bv8 blocks the hyperalgesic effect produced by the administration of Bv8 i.t. (a), but it is ineffective against local peripheral hyperalgesia produced by i.pl. of Bv8 (b). The percentage change in the measured nociceptive threshold value is calculated with respect to the basic nociceptive threshold value, i.e. before treatment. [Ala <24>] Bv8 is administered 4 minutes before Bv8.

Figura 5. Test della pressione sulla zampa del ratto. La curva doserisposta dell’effetto iperalgesico indotto da iniezione i.t. di Bv8 (espressa come area sotto la curva - AUC — di iperalgesia) viene spostata a destra di un ordine di grandezza dalla pre-somministrazione i.t. di 5 ng di [Ala<24>]Bv8. AUC = “area under curve", area sottesa da una curva calcolata per mezzo degli integrali con programma di computer. Figure 5. Rat paw pressure test. The dose response curve of the hyperalgesic effect induced by injection i.t. of Bv8 (expressed as area under the curve - AUC - of hyperalgesia) is shifted to the right by one order of magnitude from i.t. pre-administration. of 5 ng of [Ala <24>] Bv8. AUC = “area under curve”, area subtended by a curve calculated by means of integrals with a computer program.

Figura 6. Effetto anti-iperalgesico di [Ala<24>]Bv8 nel topo. Nel topo, la somministrazione sistemica di [Ala<24>]Bv8 (20 μg/kg, s.c.) abolisce l'iperalgesia termica (test d’immersione della zampa) (a) e riduce significativamente l’allodinia tattile (von Frey) (b) indotta dalla somministrazione locale di Bv8 (0.5 ng = 50 fmol, i.pl.). [Ala<24>]Bv8 (20 μg/kg, s.c.) riduce il “licking” indotto dalla capsaicina (5 nmol, i.pl) (c). Figure 6. Anti-hyperalgesic effect of [Ala <24>] Bv8 in mice. In mice, systemic administration of [Ala <24>] Bv8 (20 μg / kg, s.c.) abolishes thermal hyperalgesia (paw immersion test) (a) and significantly reduces tactile allodynia (von Frey) ( b) induced by the local administration of Bv8 (0.5 ng = 50 fmol, i.pl.). [Ala <24>] Bv8 (20 μg / kg, s.c.) reduces the licking induced by capsaicin (5 nmol, i.pl) (c).

Figura 7. Test della pressione nel modello di infiammazione da CFA nel ratto. Nei ratti, l’iniezione sistemica s.c. e i.v. di [Ala<24>]Bv8, abolisce in maniera dose-dipendente l’iperalgesia indotta dalla infiammazione prodotta con CFA (test di pressione della zampa). L'effetto antiiperalgesico dura rispettivamente 8 ore, 4 ore e 3 ore dopo l’iniezione s.c. di 20, 5, e 2 μg/kg di [Ala<24>]Bv8. La dose di 0.5 μg/kg non produsce effetti (a). Dopo somministrazione i.v., la dose di 0.5 pg/kg abolisce l'iperalgesia per 2 ore; la dose di 0.1 pg/kg, i.v. non ha effetti (b). Figure 7. Pressure testing in the rat CFA inflammation model. In rats, the SC systemic injection and i.v. of [Ala <24>] Bv8, abolishes in a dose-dependent manner the hyperalgesia induced by the inflammation produced with CFA (paw pressure test). The antihyperalgesic effect lasts respectively 8 hours, 4 hours and 3 hours after the SC injection. of 20, 5, and 2 μg / kg of [Ala <24>] Bv8. The dose of 0.5 μg / kg produced no effect (a). After i.v.administration, the dose of 0.5 pg / kg abolishes hyperalgesia for 2 hours; the dose of 0.1 pg / kg, i.v. it has no effect (b).

Figura 8. Test della “Paw-lmmersion" nel modello di infiammazione da CFA nel topo. Nel ratto, [Ala<24>]Bv8 s.c. a 20 μg/kg abolisce l'iperalgesia termica (test d’immersione della zampa a 48°C) per oltre 6 ore. Le misurazioni sono state effettuate su 5 animali di controllo (trattati con salina) e 5 animali trattati con Ala24-Bv8: medie e ANOVA a due vie. La latenza è stata misurata in secondi come indicato nei metodi. Figure 8. "Paw-lmmersion" test in the mouse CFA inflammation model. In the rat, [Ala <24>] Bv8 s.c. at 20 μg / kg abolishes thermal hyperalgesia (paw immersion test at 48 ° C) for over 6 hours Measurements were performed on 5 control animals (treated with saline) and 5 animals treated with Ala24-Bv8: averages and two-way ANOVA Latency was measured in seconds as indicated in the methods.

Figura 9. L’ipersensibilità (a) termica (piastra calda) e (b) meccanica indotta dall'incisione intraplantare, è stabilizzata 1 giorno dopo l'incisione. La somministrazione sistemica dell’antagonista di PKRs, [Ala<24>]Bv8 (20 pg/kg s.c.) annulla totalmente (A) l’iper-sensibilità termica (misurata in secondi di latenza alla sottrazione della zampa dallo stimolo termico) e l’ipersensibilità meccanica (B) misurata come peso (in grammi) a cui l'animale sottrae la zampa dallo stimolo pressorio. Figure 9. The (a) thermal (hot plate) and (b) mechanical hypersensitivity induced by the intra-implant incision is stabilized 1 day after the incision. The systemic administration of the PKRs antagonist, [Ala <24>] Bv8 (20 pg / kg s.c.) totally cancels (A) the thermal hyper-sensitivity (measured in seconds of latency to the subtraction of the paw from the thermal stimulus) and mechanical hypersensitivity (B) measured as the weight (in grams) that the animal removes the paw from the pressure stimulus.

Figura 10. Elettroforesi su gel dei prodotti di amplificazione, mediante RT-PCR, di mRNA per PK2 nella pelle della zampa sana (A), nella pelle della zampa infiammata 6, 12, 24 h e 30 g dopo la iniezione di CFA (B); nel DRG di un ratto sano (C) e nel DRG di un ratto portatore di zampa infiammata, 24 h dopo la iniezione di CFA (D). Figure 10. Gel electrophoresis of the amplification products, by RT-PCR, of mRNA for PK2 in the skin of the healthy paw (A), in the skin of the inflamed paw 6, 12, 24 h and 30 g after CFA injection (B) ; in the DRG of a healthy rat (C) and in the DRG of a rat with an inflamed paw, 24 h after CFA injection (D).

Figura 11. Andamento temporale della iperalgesia e della espressione di PK2 nella pelle della zampa di ratto dopo iniezione di CFA. Lo sviluppo e la durata della iperalgesia conseguente al processo infiammatorio causato dalla iniezione di CFA correla con l’aumento di espressione della prokineticina2 nella pelle della zampa infiammata. Figure 11. Time course of hyperalgesia and PK2 expression in rat paw skin after CFA injection. The development and duration of hyperalgesia resulting from the inflammatory process caused by the injection of CFA correlates with the increased expression of prokineticin2 in the skin of the inflamed paw.

MATERIALI E METODI MATERIALS AND METHODS

Progettazione del costrutto di [AIa<24>]Bv8 e clonazione nel vettore d’espressione pPIC9K Design of the construct of [AIa <24>] Bv8 and cloning in the expression vector pPIC9K

Bv8 [Bv8: Bombina variegata Bv8 protein mRNA, complete cds. ACCESSION AF168790] è composta di 77 residui amminoacidici, con 10 cisteine formanti cinque ponti disolfuro. E’ noto che la presenza di un numero elevato di ponti disolfuro nella catena polipeptidica rappresenta un ostacolo alla corretta produzione di proteine ricombinanti in Escherichia coli, con frequente formazione di corpi d'inclusione insolubili. Questo è stato anche riscontrato nella produzione di proteine della famiglia AVIT, quali Bv8. Per questi motivi, è stato scelto un lievito, Pichia pastorìs, come sistema per l'espressione ricombinante della proteina. A questo scopo, il cDNA di Bombine variegata codificante per Bv8 è stato clonato in un vettore di inserzione di 9.3 Kb, pPIC9K ( invitrogen ), specifico per P. pastorìs. pPIC9K è in grado di agire come una navetta tra batterio e lievito, essendo presenti due elementi di selezione per i batteri, rispettivamente la resistenza al'ampicillina e alla kanamicina. La presenza del gene HIS 4 permette la generazione di trasformanti stabili di P. pastorìs attraverso ricombinazione omologa tra sequenze condivise dal vettore e dal genoma ospite. Tali sequenze integrate mostrano una forte stabilità in assenza di pressione selettiva anche quando sono presenti come copie multiple. Bv8 [Bv8: Bombina variegata Bv8 protein mRNA, complete cds. ACCESSION AF168790] is composed of 77 amino acid residues, with 10 cysteines forming five disulfide bridges. It is known that the presence of a high number of disulfide bridges in the polypeptide chain represents an obstacle to the correct production of recombinant proteins in Escherichia coli, with frequent formation of insoluble inclusion bodies. This has also been found in the production of proteins from the AVIT family, such as Bv8. For these reasons, a yeast, Pichia pastorìs, was chosen as a system for the recombinant expression of the protein. For this purpose, the Bombine variegata cDNA coding for Bv8 was cloned into a 9.3 Kb insertion vector, pPIC9K (invitrogen), specific for P. pastorìs. pPIC9K is able to act as a shuttle between bacterium and yeast, being present two elements of selection for the bacteria, respectively resistance to ampicillin and kanamycin. The presence of the HIS 4 gene allows the generation of stable P. pastorìs transformants through homologous recombination between sequences shared by the vector and the host genome. Such integrated sequences show strong stability in the absence of selective pressure even when they are present as multiple copies.

A monte del sito di clonazione multipla, il vettore contiene il promotore del gene dell'alcool ossidasi 1 (AOX1), frequentemente usato per controllare l’espressione di geni eterologhi. Questo promotore è fortemente represso in cellule cresciute in presenza di glucosio, glicerolo, e altre sorgenti di carbonio, ma è fortemente indotto dal metanolo. Il vettore contiene anche la sequenza codificante per il peptide segnale del fattore a di Saccharomyces cerevisiae, che permette di indirizzare la proteina ricombinante al di fuori della cellula. Questo peptide segnale è composto di una pre-sequenza di 19 residui amminoacidici e da una pro-sequenza di 66 residui. Il processo di maturazione del prodotto consiste di tre fasi: 1) rimozione della presequenza nel reticolo endoplasmatico; 2) taglio in corrispondenza di uno specifico sito all'interno della pro-sequenza da parte della Kex2 e 3) rilascio della proteina matura da parte di Ste13. Upstream of the multiple cloning site, the vector contains the promoter of the alcohol oxidase 1 gene (AOX1), frequently used to control the expression of heterologous genes. This promoter is strongly repressed in cells grown in the presence of glucose, glycerol, and other carbon sources, but is strongly induced by methanol. The vector also contains the coding sequence for the Saccharomyces cerevisiae factor a signal peptide, which allows the recombinant protein to be directed outside the cell. This signal peptide is composed of a pre-sequence of 19 amino acid residues and a pro-sequence of 66 residues. The product maturation process consists of three phases: 1) removal of the presequence in the endoplasmic reticulum; 2) cut at a specific site within the pro-sequence by Kex2 and 3) release of the mature protein by Ste13.

Data l’impossibilità di inserire il cDNA direttamente nel sito multiplo di clonazione, si è dovuto amplificare la sequenza codificante il peptide segnale presente sul vettore mediante una PCR preparativa, eseguita con gli oligonucleotidi pa1BamH1 e pa2Xho1 , che contengono rispettivamente i siti riconosciuti dagli enzimi BamHl ed Xhol. Il frammento, chiamato PS BamHl-Xhol, di circa 250 coppie di basi è stato estratto dal gel e digerito con gli enzimi BamHl e Xhol. Given the impossibility of inserting the cDNA directly into the multiple cloning site, it was necessary to amplify the sequence encoding the signal peptide present on the vector by means of a preparative PCR, performed with the oligonucleotides pa1BamH1 and pa2Xho1, which respectively contain the sites recognized by the BamHl enzymes. and Xhol. The fragment, called PS BamHl-Xhol, of about 250 base pairs was extracted from the gel and digested with the enzymes BamHl and Xhol.

li cDNA di Bv8, corrispondente al peptide maturo, privo cioè della sua sequenza segnale, è stato amplificato con gli oligonucleotidi Bv8upXho1 e Bv8EcoRldw, che permette l'introduzione di un sito riconosciuto da EcoRI. Il frammento di circa 300 coppie di basi, chiamato Bv8 EcoRl-Xhol, è stato estratto dal gel e digerito con gli enzimi di restrizione EcoRl e Xhol. The Bv8 cDNA, corresponding to the mature peptide, ie devoid of its signal sequence, was amplified with the oligonucleotides Bv8upXho1 and Bv8EcoRldw, which allows the introduction of a site recognized by EcoRI. The approximately 300 base-pair fragment, called Bv8 EcoR1-Xhol, was extracted from the gel and digested with the restriction enzymes EcoR1 and Xhol.

La ligazione dei due frammenti ottenuti è stata utilizzata come stampo per una nuova PCR preparativa eseguita con gli oligonucleotidi pa1-BamHl e Bv8-EcoRldw. Il frammento ottenuto è stato digerito con gli enzimi di restrizione BamHl e EcoRl ed è stato inserito nel vettore pPIC9K precedentemente tagliato con gli stessi enzimi, in modo da eliminare la parte codificante per la sequenza segnale. E' stato estratto il DNA plasmidico da una delle colonie positive, PS-Bv8 #13, e ne è stata determinata la sequenza nucleotidica. The ligation of the two fragments obtained was used as a template for a new preparative PCR performed with the oligonucleotides pa1-BamHl and Bv8-EcoRldw. The fragment obtained was digested with the restriction enzymes BamHl and EcoRl and inserted into the pPIC9K vector previously cut with the same enzymes, in order to eliminate the coding part for the signal sequence. Plasmid DNA was extracted from one of the positive colonies, PS-Bv8 # 13, and its nucleotide sequence determined.

Usando questo costrutto come stampo, l’autore ha prodotto per PCR un DNA codificante per una variante di Bv8, in cui il triptofano in posizione 24 è sostituito con un'alanina. A questo scopo, sono stati prodotti per amplificazione due diversi frammenti: il primo frammento è stato ottenuto usando gli oligonucleotidi pa1-BamHl e Mut-W-dw (Tabella 1), in grado di appaiare sulla regione a monte del triptofano 24 e di introdurre il sito di restrizione Nhel ottenuto con una sostituzione silente di un'unica base. Il secondo frammento è stato ottenuto utilizzando gli oligonucleotidi Bv8-W-up e Bv8EcoRldw (Tabella 1). Il primo si appaia a monte della regione del triptofano 24 e contiene una mutazione di tre basi che permette sia la sostituzione di W24A che l'inserimento del sito di restrizione Nhel. Using this construct as a template, the author produced by PCR a DNA encoding a variant of Bv8, in which the tryptophan in position 24 is replaced with an alanine. For this purpose, two different fragments were produced by amplification: the first fragment was obtained using the oligonucleotides pa1-BamHl and Mut-W-dw (Table 1), capable of pairing on the region upstream of tryptophan 24 and introducing the Nhel restriction site obtained with a silent replacement of a single base. The second fragment was obtained using the Bv8-W-up and Bv8EcoRldw oligonucleotides (Table 1). The former pairs upstream of the tryptophan 24 region and contains a three base mutation that allows for both the substitution of W24A and the insertion of the Nhel restriction site.

Tabella 1. Oligonucleotidi usati per l'amplificazione del DNA mediante PCR Table 1. Oligonucleotides used for DNA amplification by PCR

Oligonucleotide Sequenza Tm Pa1BamHl 5’-GCG-GAT-CCA-AAC-GAT-GAG- 62.7°C ATT-TCC-3' Oligonucleotide Sequence Tm Pa1BamHl 5'-GCG-GAT-CCA-AAC-GAT-GAG- 62.7 ° C ATT-TCC-3 '

Pa2Xhol 5-GCC-TCG-AGA-GAT -ACC-CCT- 64.2°C TCT-TC-3' Pa2Xhol 5-GCC-TCG-AGA-GAT -ACC-CCT- 64.2 ° C TCT-TC-3 '

Bv8EcoRldw 5 ’-ATA-GAA-TTC-AG A-ACA-CTT - 62.6°C AAA-TTT-TTC-TCC-3’ Bv8EcoRldw 5 '-ATA-GAA-TTC-AG A-ACA-CTT - 62.6 ° C AAA-TTT-TTC-TCC-3'

Bv8kex2Xhol 5’-TTA-TCT -CGA-GAA-AAG-AGC- 71.6°C Bv8kex2Xhol 5'-TTA-TCT -CGA-GAA-AAG-AGC- 71.6 ° C

TGT-TAT-CAC-TGG-CGC-CTG-TG- TGT-TAT-CAC-TGG-CGC-CTG-TG-

3’ 3 '

Mut-W-up 5-GCT -GCT -AGC-GCT-GCT -TCA- 69.5°C CGT-AAC-ATC-AG-3’ Mut-W-up 5-GCT -GCT -AGC-GCT-GCT -TCA- 69.5 ° C CGT-AAC-ATC-AG-3 '

Mut-W-up 5’-CGC-GCT-AGC-AGC-GCA-GCA- 67.6°C GG-3 Mut-W-up 5'-CGC-GCT-AGC-AGC-GCA-GCA- 67.6 ° C GG-3

Oltre alla sequenza è indicata la temperatura di fusione (Tm). In grassetto sono indicate le basi mutate. In addition to the sequence, the melting temperature (Tm) is indicated. The changed bases are indicated in bold.

l due frammenti risultanti sono stati digeriti con Nhel e quindi ligati. Il prodotto è stato utilizzato come stampo per una nuova amplificazione PCR utilizzando gli oligonucleotidi pa1-BamHl e Bv8-EcoRldw (Tabella 1). Il nuovo frammento è stato di nuovo digerito con BamHl e EcoRl e inserito nel vettore pPlC9K, precedentemente digerito con gli stessi enzimi, al fine di tagliare la regione codificante per la sequenza segnale. Questo plasmide (Bv8 mut# 2) è stato usato per trasformare E. coli Top10F competente, e sequenziato. The resulting two fragments were digested with Nhel and then ligated. The product was used as a template for a new PCR amplification using the oligonucleotides pa1-BamHl and Bv8-EcoRldw (Table 1). The new fragment was digested again with BamHl and EcoRl and inserted into the pPlC9K vector, previously digested with the same enzymes, in order to cut the coding region for the signal sequence. This plasmid (Bv8 mut # 2) was used to transform competent E. coli Top10F, and sequenced.

Il plasmide Bv8 mut#2 è stato linearizzato con Sa/l per favorire l'integrazione nel ceppo ospite P. pastorìs GS15(his4) auxotrofo per istidina e usato per trasformare il lievito per elettroporazione. The plasmid Bv8 mut # 2 was linearized with Sa / l to facilitate integration into the host strain P. pastorìs GS15 (his4) auxotroph for histidine and used to transform yeast by electroporation.

La selezione di trasformanti His<+>è stata fatta su un terreno minimo MD selettivo. Per confermare la presenza dell’espressione della cassetta di Bv8 nei trasformanti His<+>di P. pastorìs, l’autore ha effettuato un screening delle colonie a mezzo di PCR usando inneschi specifici, Pa1-BamHl e Bv8-EcoRldw (Tabella 1). The selection of His <+> transformants was done on a selective MD minimal medium. To confirm the presence of the expression of the Bv8 cassette in the His <+> transformants of P. pastorìs, the author performed a screening of the colonies by means of PCR using specific primers, Pa1-BamHl and Bv8-EcoRldw (Table 1) .

Espressione di [Ala24]Bv8 in P. pastorìs Expression of [Ala24] Bv8 in P. pastorìs

P. pastorìs recombinante è stato cresciuto in un terreno di coltura con glicerolo come fonte di carbonio e di energia per ottenere alta densità cellulare. Le cellule sono state separate attraverso centrifugazione e risospese in un terreno contenente metanolo per indurre la sovraespressione della proteina ricombinante grazie al promotore AOX1. Recombinant P. pastorìs was grown in a culture medium with glycerol as a carbon and energy source to achieve high cell density. The cells were separated by centrifugation and resuspended in a medium containing methanol to induce overexpression of the recombinant protein thanks to the AOX1 promoter.

Dieci cloni ricombinanti di P. pastorìs sono stati analizzati per i loro livelli di espressione su piccola scala e la resa della proteina ricombinante è stato determinata per HPLC in fase inversa. Seguendo questo approccio, l’autore ha selezionato il clone di P. pastorìs capace di produrre alti livelli di Bv8, per un’espressione successiva su larga scala. Le condizioni ottimali sono state determinate attraverso il monitoraggio del contenuto in Bv8 nelle colture in differenti concentrazioni di metanolo, a diversi tempi e temperature di crescita. Il picco d'espressione di Bv8 ricombinante è stato osservato dopo 120 ore d’induzione con metanolo all’1% a 30°C. Ten recombinant clones of P. pastorìs were analyzed for their small-scale expression levels and the yield of the recombinant protein was determined by reverse-phase HPLC. Following this approach, the author selected the P. pastorìs clone capable of producing high levels of Bv8, for subsequent large-scale expression. Optimal conditions were determined by monitoring the Bv8 content in cultures in different concentrations of methanol, at different growth times and temperatures. The peak expression of recombinant Bv8 was observed after 120 hours of induction with 1% methanol at 30 ° C.

Purificazione di [Ala<24>]Bv8 Purification of [Ala <24>] Bv8

I supernatanti delle colture d’espressione sono stati concentrati e, come prima tappa di purificazione, caricati su una colonna CM-Sephadex. A pH 7, Bv8, con un pi di 8.46, si lega alla resina e viene eluita con un tampone BES, pH 7.0/0.2 M NaCl. Frazioni di Bv8 ricombinante sono state raggruppate e dializzate contro un tampone Tris-HCI 20 mM, pH 7.0. Quindi, la proteina è stata purificata mediante HPLC in fase inversa su una colonna C18 (Fig. 3). In queste condizioni d'espressione, il rendimento di [Ala<24>]Bv8 è approssimativamente 1 mg per litro di coltura. The supernatants of the expression cultures were concentrated and, as a first step of purification, loaded on a CM-Sephadex column. At pH 7, Bv8, with a pi of 8.46, binds to the resin and is eluted with a BES buffer, pH 7.0 / 0.2 M NaCl. Recombinant Bv8 fractions were pooled and dialyzed against a 20 mM Tris-HCI buffer, pH 7.0. Then, the protein was purified by reverse-phase HPLC on a C18 column (Fig. 3). Under these conditions of expression, the yield of [Ala <24>] Bv8 is approximately 1 mg per liter of culture.

Saggi di legame Binding essays

Cellule CHO confluenti (circa 20 x 10<6>) sono state lavate con PBS/EDTA, distaccate dalle piastre di coltura e raccolte per centrifugazione. Il precipitato risultante è stato omogenizzato in 10 mi di un tampone di omogeneizzazione a freddo (50 mM Tris-HCl, pH 7.4) da un omogenizzatore Polytron (PT3000, Kinematica) a 16,000 r.p.m. per 2 minuti. L'omogenato è stato centrifugato a una bassa velocità (700 g per 15 min a 4°C) e il supematante che ne risulta è stato centrifugato a 100,000 g per 60 minuti a 4°C. Il precipitato risultante è stato ri-sospeso in 10 mi 50mM Tris-HCl, pH 7.4, e tenuto a -80°C fino aH’utilizzo. La concentrazione proteica è stata determinata dal kit di saggio proteico BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockfort, IL, U.S.A.). Le membrane (20 pg di proteine per PKR1 e 40 pg di proteine per PKR2) sono state incubate con 4 pM [<125>l]MIT (PerkinElmer,<125>I-MIT: Kd PKR1 = 0.72 nM; Kd PKR2 = 0.29 nM) e concentrazioni stabilite variabili di Bv8, e [Ala<24>]Bv8 in un volume finale di 1ml a 37°C per 90 min. Ogni concentrazione è stata saggiata due volte. Dopo l'incubazione, i campioni sono stati raffreddati e le membrane raccolte su filtri Whatman GF/B precedentemente imbevuti in 0.5% di politilenimine (Sigma-Aldrich, Milano, Italy), lavate nove volte con 2ml di 50mM Tris-HCl freddo, pH 7.4, e trasferite in fiale di conteggio. La radioattività è stata misurata in un contatore gamma (Packard, Cobra 11 auto-gamma). Il legame non specifico è stato determinato in presenza di 0.1 mM di Bv8. Lo spostamento delle curve e i valori IC50sono stati calcolati con un software PRISM (GraphPad Software, San Diego, CA, U.S.A.). Confluent CHO cells (approximately 20 x 10 <6>) were washed with PBS / EDTA, detached from the culture plates and collected by centrifugation. The resulting precipitate was homogenized in 10 ml of a cold homogenization buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.4) by a Polytron homogenizer (PT3000, Kinematica) at 16,000 r.p.m. for 2 minutes. The homogenate was centrifuged at a low speed (700 g for 15 min at 4 ° C) and the resulting supernatant was centrifuged at 100,000 g for 60 minutes at 4 ° C. The resulting precipitate was re-suspended in 10 ml 50mM Tris-HCl, pH 7.4, and kept at -80 ° C until use. Protein concentration was determined by the BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockfort, IL, U.S.A.). Membranes (20µg protein for PKR1 and 40µg protein for PKR2) were incubated with 4 µM [<125> l] MIT (PerkinElmer, <125> I-MIT: Kd PKR1 = 0.72 nM; Kd PKR2 = 0.29 nM) and variable established concentrations of Bv8, and [Ala <24>] Bv8 in a final volume of 1ml at 37 ° C for 90 min. Each concentration was tested twice. After incubation, the samples were cooled and the membranes collected on Whatman GF / B filters previously soaked in 0.5% polythyleneimine (Sigma-Aldrich, Milan, Italy), washed nine times with 2ml of cold 50mM Tris-HCl, pH 7.4, and transferred into counting vials. Radioactivity was measured in a gamma counter (Packard, Cobra 11 auto-gamma). Non-specific binding was determined in the presence of 0.1 mM of Bv8. The displacement of the curves and the IC50 values were calculated with a PRISM software (GraphPad Software, San Diego, CA, U.S.A.).

Misurazione della nocicezione Measurement of nociception

Sensibilità tattile Tactile sensitivity

La sensibilità tattile della regione plantare delle zampe posteriori dei topi e ratti (abituati a un pavimento di rete metallica) è stata sondata con filamenti flessibili calibrati in modo da applicare pressioni variabili da 0.41, 0.70, 1.20, 2.00, 3.63, 5.50, 8.5 e 15.1 g (Test di vonFrey). Lo stimolo pressorio viene alternativamente aumentato e diminuito (metodo up-down), per ottenere una varietà di risposte positive e negative<43,44>. Il 50% di soglia di ritiro della zampa è stato determinato come segue: (10<[Xf+kd]>)/10,000 [Xf= ultimo filamento von Frey utilizzato, k = valore Dixon e d = intervallo di stimolo (differenza in grammi fra i vari filamenti)]. The tactile sensitivity of the plantar region of the hind legs of mice and rats (accustomed to a wire mesh floor) was probed with flexible filaments calibrated to apply pressures varying from 0.41, 0.70, 1.20, 2.00, 3.63, 5.50, 8.5 and 15.1 g (vonFrey test). The pressure stimulus is alternately increased and decreased (up-down method), to obtain a variety of positive and negative responses <43.44>. The 50% paw withdrawal threshold was determined as follows: (10 <[Xf + kd]>) / 10,000 [Xf = last von Frey filament used, k = Dixon value and d = stimulus interval (difference in grams between the various filaments)].

Ipersensibilità termica Thermal hypersensitivity

I ratti vengono posti su una piastra di vetro chiaro pre-riscaldata e lasciati abituare all’ambiente per circa 30 min. Le zampe posteriori vengono quindi esposte a stimoli termici infrarossi e (con un timer) la latenza tra la applicazione dello stimolo ed il ritiro della zampa viene misurata. Un tempo massimo di 32 secondi è stato utilizzato come “cut-off" per prevenire danni al tessuto (Piantar Test, Ugo Basile, Comerio, Italy). The rats are placed on a pre-heated clear glass plate and allowed to get used to the environment for about 30 min. The hind legs are then exposed to infrared thermal stimuli and (with a timer) the latency between the application of the stimulus and the withdrawal of the leg is measured. A maximum time of 32 seconds was used as a “cut-off” to prevent tissue damage (Piantar Test, Ugo Basile, Comerio, Italy).

Il test di immersione della zampa viene effettuato immergendo la zampa posteriore del topo in acqua calda (48°c) e misurando la latenza di ritiro della zampa. The paw dipping test is done by immersing the mouse's hind leg in hot water (48 ° C) and measuring the paw withdrawal latency.

Sensibilità meccanica Randall-Selitto Randall-Selitto mechanical sensitivity

La soglia a stimoli nocivi di tipo meccanico è misurata con un analgesimetro (Ugo Basile, Comerio, Italy). Il test è realizzato applicando una pressione gradualmente crescente (su scala lineare) alla zampa posteriore del ratto, fino a quando il ratto ritrae la zampa. Un “cut-off" di 400 g è stato utilizzato per evitare potenziali danni al tessuto. The threshold to mechanical noxious stimuli is measured with an analgesimeter (Ugo Basile, Comerio, Italy). The test is performed by applying gradually increasing pressure (on a linear scale) to the rat's hind leg, until the rat retracts the paw. A 400 g cut-off was used to avoid potential tissue damage.

Somministrazione di farmaci Administration of drugs

Bv8, e [Ala<24>]Bv8 sono stati iniettati per via sottocutanea (s.c.), per via intratecale (i.t.) o nella zampa (i.pl.). Per le iniezioni i.pl., i farmaci dissolti in 0.9% NaCI sono stati iniettati nelle regioni piantare (20 μl) e dorsale (20 μl) della zampa con una microsiringa attraverso un ago di 30 gauge. Un volume uguale di soluzione salina è stato iniettato in ratti di controllo. Bv8, and [Ala <24>] Bv8 were injected subcutaneously (s.c.), intrathecally (i.t.) or in the paw (i.pl.). For i.pl.injections, drugs dissolved in 0.9% NaCI were injected into the plantar (20 μl) and dorsal (20 μl) regions of the paw with a microsyringe through a 30 gauge needle. An equal volume of saline was injected into control rats.

Per le applicazioni i.t., cateteri cronici lombari i.t. sono stati inseriti nei ratti sotto anestesia di ketamina-xylazina (60 mg/kg 10mg/kg , i.p.) come già descritto (Negri et al., 2002). Il veicolo l.t. è un fluido cerebrospinale artificiale, e ogni ratto ha ricevuto 5 μl del veicolo o della soluzione di composti testati dissolti nel veicolo, seguiti da 5 μl di fluido cerebrospinale. Per la somministrazione sistemica, i composti dissolti in soluzione salina sono stati iniettati a un volume di 2ml/kg del tragitto s.c. I controlli sono stati iniettati con un volume uguale di soluzione salina. For i.t. applications, chronic lumbar catheters i.t. were inserted into rats under ketamine-xylazine anesthesia (60 mg / kg 10mg / kg, i.p.) as already described (Negri et al., 2002). The vehicle l.t. is an artificial cerebrospinal fluid, and each rat received 5 μl of the tested vehicle or compound solution dissolved in the vehicle, followed by 5 μl of cerebrospinal fluid. For systemic administration, compounds dissolved in saline were injected at a volume of 2ml / kg of the s.c path. Controls were injected with an equal volume of saline.

Modelli animali di dolore Animal models of pain

Infiammazione della zampa indotta da CFA. CFA-induced inflammation of the paw.

La zampa sinistra del topo o del ratto viene infiammata con (20 or 100 μl) iniezioni di “complete Freund’s adjuvant" (CFA) e la zampa destra , iniettata con salina, serve di controllo. L’edema della zampa indotto da CFA è stato valutato misurando il volume della zampa con uno pletismometro 7140 (Ugo Basile). L’ipersensibilità termica, tattile e meccanica si sviluppa entro 6 ore dalla iniezione di CFA, è massima dopo 12-24 ore e ritorna ai valori di base entro 4 giorni dalla iniezione. La soglia nocicettiva a stimoli tattili (von Frey), termici (calore radiante) e meccanici (Randall Selitto) della zampa infiammata e della zampa di controllo è valutata come sopra descritto. A 2 ore, 6 ore, 12 ore, 1 giorno, 2, 3 e 4 giorni successivi alla iniezione di CFA, gruppi separati di ratti vengono testati per l'ipersensibilità termica, tattile e meccanica, prima della iniezione dell'antagonista e poi testati a 15, 30, 60, 90, 120, e 180 minuti dopo la iniezione dell'antagonista per determinare l'andamento temporale dell’attività del farmaco. Per ciascuna dose sono stati saggiati gruppi separati di animali per determinare la curva dose-risposta dell’antagonista PKR. The left paw of the mouse or rat is inflamed with (20 or 100 μl) injections of "complete Freund's adjuvant" (CFA) and the right paw, injected with saline, serves as control. assessed by measuring the volume of the paw with a plethysmometer 7140 (Ugo Basile). Thermal, tactile and mechanical hypersensitivity develops within 6 hours of the CFA injection, is maximum after 12-24 hours and returns to basic values within 4 days of Injection. The nociceptive threshold to tactile (von Frey), thermal (radiant heat) and mechanical (Randall Selitto) stimuli of the inflamed paw and the control paw is evaluated as described above. At 2 hours, 6 hours, 12 hours, 1 day , 2, 3 and 4 days following the CFA injection, separate groups of rats are tested for thermal, tactile and mechanical hypersensitivity, prior to injection of the antagonist and then tested at 15, 30, 60, 90, 120, and 180 minutes after injection of the antagonist to determine the time course of drug activity. For each dose, separate groups of animals were tested to determine the dose-response curve of the PKR antagonist.

Modello di dolore postoperatorio ( incisione plantare) Postoperative Pain Model (Plantar Incision)

I ratti sono stati anestetizzati con isofluorano, per inalazione. La regione piantare della zampa sinistra è stata preparata, e una incisione longitudinale di 1 cm è stata effettuata attraverso la striscia di pelle e il muscolo della superficiale plantare. La pelle è stata chiusa con due suture di nylon 5-0 e la ferita coperta con pomata antibiotico prima del ricovero. Le suture sono state rimosse dopo due giorni dall’intervento. I ratti utilizzati come controllo, ricevevano anestesia e preparazione chirurgica, ma non l’incisione. L’ipersensibilità termica, tattile e meccanica sviluppa entro due ore dall’incisione, comincia a diminuire 4 giorni dopo l’operazione, e entro 7 giorni ritorna ai valori di prima dell’incisione (valori di base). The rats were anesthetized with isofluorane, by inhalation. The plantar region of the left paw was prepared, and a 1 cm longitudinal incision was made through the skin strip and the superficial plantar muscle. The skin was closed with two 5-0 nylon sutures and the wound covered with antibiotic ointment before admission. The sutures were removed two days after surgery. The rats used as controls received anesthesia and surgical preparation, but not the incision. Thermal, tactile and mechanical hypersensitivity develops within two hours of the incision, begins to decrease 4 days after the operation, and within 7 days returns to the values before the incision (basic values).

La soglia nocicettiva a stimoli tattili, termici e meccanici della zampa infiammata e della zampa di controllo è valutata come sopra descritto. A 2 ore, 1 giorno, e 4 giorni successivi alla incisione, gruppi separati di ratti sono stati saggiati per ipersensibilità termica, tattile e meccanica, prima della iniezione dell’antagonista e poi testati a 15, 30, 60, 90, 120, e 180 minuti dopo la iniezione dell’antagonista per determinare l’andamento temporale dell'attività del farmaco. Per ciascuna dose sono stati saggiati gruppi separati di animali per determinare la curva dose-risposta dell’antagonista PKR. The nociceptive threshold to tactile, thermal and mechanical stimuli of the inflamed paw and the control paw is assessed as described above. At 2 hours, 1 day, and 4 days following incision, separate groups of rats were tested for thermal, tactile, and mechanical hypersensitivity, prior to antagonist injection and then tested at 15, 30, 60, 90, 120, and 180 minutes after injection of the antagonist to determine the time course of drug activity. For each dose, separate groups of animals were tested to determine the dose-response curve of the PKR antagonist.

RISULTATI RESULTS

Affinità dei recettore Affinity of the receptor

[Ala<24>]Bv8 lega sia PKR1 che PKR2; la sua affinità per i PKRSs è stata determinata come concentrazione necessaria per spiazzare il 50% di 125l-MIT legato a preparazioni di membrane di cellule CHO transfettate con PKR1 o PKR2 (Tabella 2). [Ala <24>] Bv8 binds both PKR1 and PKR2; its affinity for PKRSs was determined as the concentration required to displace 50% of 125l-MIT bound to membrane preparations of CHO cells transfected with PKR1 or PKR2 (Table 2).

Tabella 2: Affinità delle proteine Bv8 e [Ala24]Bv8 per i recettori delle prochineticine espressa come concentrazione che inibisce il legame di [<125>l]MIT-1 (in nM) alle preparazioni di membrane da cellule CHO trasfettate stabilmente con i recettori PKR1 or PKR2. Table 2: Affinity of Bv8 and [Ala24] Bv8 proteins for prokineticin receptors expressed as a concentration inhibiting binding of [<125> l] MIT-1 (in nM) to membrane preparations from CHO cells stably transfected with receptors PKR1 or PKR2.

lC50(nM) LC50 (nM)

PKR1 PKR2 PKR1 PKR2

Bv8 1.0 1.07 Bv8 1.0 1.07

[Ala24]Bv8 30.5 8.60 [Ala24] Bv8 30.5 8.60

La sostituzione di Trp24 con Ala riduce di 30 volte l'affinità di [Ala24]Bv8 per i recettori PKR1 e di solo 8 volte per i recettori PKR2 rispetto a Bv8. Replacing Trp24 with Ala reduces the affinity of [Ala24] Bv8 for PKR1 receptors by 30 times and only 8 times for PKR2 receptors compared to Bv8.

Attività antinocicettiva Antinociceptive activity

Modelli d’iperalgesia indotta da Bv8 Models of hyperalgesia induced by Bv8

L’autore ha già dimostrato che, nei ratti e nei topi, l'iniezione s.c. (200 ng/kg) o l'iniezione i.t. (0.5 ng/ratto) di Bv8 produce una caratteristica iperalgesia bifasica a stimoli termici, meccanici e tattili, e che iniezioni locali (intraplantari) di Bv8 (0.5ng) elicita forte e localizzata ipersensibilità termica e meccanica simile a quella della fase iniziale d’iperalgesia indotta da una somministrazione sistemica di Bv8 ma senza la seconda fase d'ipersensibilità. Perciò, la risposta iperalgesica bifasica alla somministrazione sistemica di Bv8 appare mediata attraverso l'attività prochineticinica alla periferia (prima fase soltanto) e dei siti centrali (sia nella prima che nella seconda fase). The author has already shown that, in rats and mice, the SC injection (200 ng / kg) or i.t. injection (0.5 ng / rat) of Bv8 produces a characteristic biphasic hyperalgesia to thermal, mechanical and tactile stimuli, and that local (intra-implant) injections of Bv8 (0.5ng) elicits strong and localized thermal and mechanical hypersensitivity similar to that of the initial phase of hyperalgesia induced by a systemic administration of Bv8 but without the second phase of hypersensitivity. Therefore, the biphasic hyperalgesic response to systemic administration of Bv8 appears to be mediated through prokineticin activity at the periphery (first phase only) and central sites (both in the first and second phases).

La muteina di Bv8, [Ala<24>]Bv8, a dosi fino a 50 volte superiori delle dosi iperalgesiche di Bv8, non mostra alcun effetto iperalgesico. Tuttavia, se precedentemente somministrata (5-15 min), è in grado di bloccare l'ipersensibilità termica, meccanica e tattile indotta dalla successiva somministrazione di Bv8. Bv8 mutein, [Ala <24>] Bv8, at doses up to 50 times higher than the hyperalgesic doses of Bv8, exhibits no hyperalgesic effect. However, if previously administered (5-15 min), it is able to block the thermal, mechanical and tactile hypersensitivity induced by the subsequent administration of Bv8.

Nei ratti, la somministrazione s.c. (-15 min) di [Ala<24>]Bv8 (2 μg/kg - 20 μg/kg) abolisce la prima e la seconda fase d’ipersensibilità meccanica indotta dalla somministrazione s.c. (200 ng /kg) e dalla somministrazione intratecale (0.5 ng/rat) di Bv8 (Fig 3a, 3c). Una dose significativamente più bassa (0.1 μg/kg, s.c., -15 min) è sufficiente ad eliminare l'iperalgesia locale indotta da iniezione intraplantare di 0.5 ng di Bv8 (Fig 3b). Questi risultati indicano che la somministrazione sistemica dell'antagonista PKR blocca sia i PKRs periferici che quelli spinali. In rats, SC administration (-15 min) of [Ala <24>] Bv8 (2 μg / kg - 20 μg / kg) abolishes the first and second phase of mechanical hypersensitivity induced by SC administration (200 ng / kg) and intrathecal administration (0.5 ng / rat) of Bv8 (Fig 3a, 3c). A significantly lower dose (0.1 μg / kg, s.c., -15 min) is sufficient to eliminate the local hyperalgesia induced by intra-implant injection of 0.5 ng of Bv8 (Fig 3b). These results indicate that systemic administration of the PKR antagonist blocks both peripheral and spinal PKRs.

La pre-iniezione intratecale (-5 min) di [Ala<24>]Bv8 alla dose di 2 ng riduce, mentre la dose di 5 ng abolisce la prima e seconda fase di iperalgesia indotta da Bv8 (da 0.5 a 3 ng/ratto di Bv8, i.t.) (Fig 4a, 5). Intrathecal pre-injection (-5 min) of [Ala <24>] Bv8 at a dose of 2 ng reduces, while the dose of 5 ng abolishes the first and second phase of Bv8-induced hyperalgesia (0.5 to 3 ng / rat of Bv8, i.t.) (Fig 4a, 5).

[Ala<24>]Bv8 fino a 10 ng i.t. (-5 min) non cambia l'iperalgesia locale indotta da Bv8. [Ala<24>]Bv8 non riesce a bloccare l'iperalgesia indotta da iniezione i.pl. di Bv8 (Fig 4b) né la prima fase dell'iperalgesia indotta dalla iniezione s.c. di Bv8 (Fig 3d). Tuttavia, [Ala<24>]Bv8 abolisce la seconda fase d’iperalgesia che dipende dall’attivazione dei siti centrali (Fig 3d). [Ala <24>] Bv8 up to 10 ng i.t. (-5 min) does not change the local hyperalgesia induced by Bv8. [Ala <24>] Bv8 fails to block i.pl injection-induced hyperalgesia. of Bv8 (Fig 4b) nor the first phase of the hyperalgesia induced by the SC injection. of Bv8 (Fig 3d). However, [Ala <24>] Bv8 abolishes the second phase of hyperalgesia which depends on the activation of the central sites (Fig 3d).

Nel topo, la somministrazione sistemica di [Ala<24>]Bv8 (20 μg/kg, s.c.) abolisce l’iperalgesia termica e riduce significativamente l’allodinia tattile indotta dalla somministrazione locale di Bv8 (0.5 ng, i.pl.) indicando un ruolo dei PKRs periferici nell’ipersensibilità termica e tattile (Fig 6a, b). La muteina [Ala<24>]Bv8 inoltre riduce il “flinching” indotto dalla capsaicina (Fig 6c), in accordo con la ridotta sensibilità alla capsaicina dei topi mancanti del recettore PKR1. Questi dati confermano la già evidenziata interazione fra PKR ed il recettore vanilloide TRPV1. In mice, systemic administration of [Ala <24>] Bv8 (20 μg / kg, s.c.) abolishes thermal hyperalgesia and significantly reduces tactile allodynia induced by local administration of Bv8 (0.5 ng, i.pl.) indicating a role of peripheral PKRs in thermal and tactile hypersensitivity (Fig 6a, b). Mutein [Ala <24>] Bv8 also reduces the flinching induced by capsaicin (Fig 6c), in agreement with the reduced sensitivity to capsaicin of mice lacking the PKR1 receptor. These data confirm the already highlighted interaction between PKR and the TRPV1 vanilloid receptor.

Modelli di dolore infiammatorio (infiammazione della zampa indotta da CFA) Patterns of inflammatory pain (CFA-induced inflammation of the paw)

[Ala<24>]Bv8 (20 μg/kg, s.c.) abolisce l'ipersensibilità meccanica e tattile indotta da CFA. Da notare, la somministrazione sistemica di questa dose di [Ala<24>]Bv8 non è in grado di alterare (a temperatura corporea nell'arco di 8 ore successive alla somministrazione: la temperatura corporea varia da 37.5 ± .2°C a 38 ± 0.03°C in ratti trattati con soluzione salina e da 37.5 ± 0.2°C a 38.1 ± 0.03°C in ratti trattati con [Ala<24>]Bv8 (p< 0.05, paired t-test, n=6). [Ala <24>] Bv8 (20 μg / kg, s.c.) abolishes the mechanical and tactile hypersensitivity induced by CFA. Of note, the systemic administration of this dose of [Ala <24>] Bv8 is not capable of altering (at body temperature within 8 hours following administration: body temperature ranges from 37.5 ± .2 ° C to 38 ± 0.03 ° C in rats treated with saline and from 37.5 ± 0.2 ° C to 38.1 ± 0.03 ° C in rats treated with [Ala <24>] Bv8 (p <0.05, paired t-test, n = 6).

Nei ratti, l'iniezione sistemica s.c. e i.v. di [Ala<24>]Bv8, abolisce in maniera dose-dipendente l'iperalgesia meccanica indotta da CFA (test di pressione della zampa). L'effetto anti-iperalgesico dura per 8 ore, 4 ore e 3 ore dopo l’iniezione s.c. di 20, 5, e 2 μg/kg, rispettivamente (fig. In rats, SC systemic injection and i.v. of [Ala <24>] Bv8, abolishes in a dose-dependent manner the mechanical hyperalgesia induced by CFA (paw pressure test). The anti-hyperalgesic effect lasts for 8 hours, 4 hours and 3 hours after the SC injection. of 20, 5, and 2 μg / kg, respectively (fig.

7). La dose di 0.5 μg/kg non ha effetto quando viene iniettata s.c., ma abolisce l'iperalgesia per 2 ore quando viene iniettata i.v. La dose i.v. di 0.1 μg/kg non ha effetto. 7). The 0.5 μg / kg dose has no effect when s.c. is injected, but abolishes hyperalgesia for 2 hours when i.v. is injected. The i.v. 0.1 μg / kg has no effect.

Nel topo, [Ala<24>]Bv8 alla dose di 20 μg/kg abolisce l'iperalgesia termica (test di Immersione della zampa a 48°C) per più di 6 ore (Fig 8). In mice, [Ala <24>] Bv8 at a dose of 20 μg / kg abolishes thermal hyperalgesia (Leg Immersion test at 48 ° C) for more than 6 hours (Fig 8).

Modello di dolore post operatorio (incisione plantare) Post-operative pain model (plantar incision)

La somministrazione sistemica di [Ala<24>]Bv8, abolisce l’ipersensibilità termica e tattile indotta dall'incisione. La somministrazione di [Ala<24>]Bv8 (20 μg/kg s.c.) 1 giorno dopo l’incisione riporta la soglia nocicettiva termica e meccanica ai valori basali (cioè di prima della incisione), comparabili con la soglia nocicettiva termica e meccanica dei ratti di controllo (Sham) entro 30 minuti dalla somministrazione (Figura 9a, b rispettivamente), indicando che la somministrazione acuta dell’antagonista PKR, [Ala<24>]Bv8, abolisce l’ipersensibilità termica e meccanica indotta dall'incisione. Questo effetto antiiperalgesico ha lunga durata, e diminuisce 7 ore dopo l'iniezione. The systemic administration of [Ala <24>] Bv8 abolishes the thermal and tactile hypersensitivity induced by the incision. Administration of [Ala <24>] Bv8 (20 μg / kg s.c.) 1 day after incision brings the thermal and mechanical nociceptive threshold back to basal values (i.e. before the incision), comparable with the thermal and mechanical nociceptive threshold of control rats (Sham) within 30 minutes of dosing (Figure 9a, b respectively), indicating that acute administration of the PKR antagonist, [Ala <24>] Bv8, abolishes incision-induced thermal and mechanical hypersensitivity. This antihyperalgesic effect has a long duration and diminishes 7 hours after injection.

Espressione di PKs nel tessuto PKs expression in tissue

Gli studi di RT-PCR indicano che l'infiammazione indotta da CFA della zampa del ratto produce un drammatico aumento della espressione di PK2, massimo tra 12 e 24 h, nella pelle della zampa infiammata (Fig 10a), ma produce un significativo aumento della espressione di PK2 anche nei DRG L4-5, cioè in quelli che ricevono le fibre nocicettive afferenti dalla zampa infiammata (Fig 10b). L'aumento nel mRNA di PK2 indotto dal CFA è tempo-dipende, essendo già significativo entro la prima ora e raggiungendo un massimo (aumento di 1000 volte) 9 ore dopo il CFA. I livelli di mRNA di PK2 diminuiscono 24 ore dopo il CFA, ma rimangono significativamente più alti dei valori basali ancora 30 giorni dopo il CFA. Lo sviluppo e la durata dell'iperalgesia è correlata al drammatico aumento dell’espressione di PK2 (Fig 11). 24 ore dopo la somministrazione di CFA nella zampa, sono aumentati anche i livelli di mRNA di PK2 nel DRG. RT-PCR studies indicate that CFA-induced inflammation of the rat paw produces a dramatic increase in PK2 expression, maximum between 12 and 24 h, in the skin of the inflamed paw (Fig 10a), but produces a significant increase in PK2 expression also in L4-5 DRGs, that is, in those receiving afferent nociceptive fibers from the inflamed paw (Fig 10b). The increase in PK2 mRNA induced by CFA is time-dependent, already being significant within the first hour and reaching a maximum (1000 fold increase) 9 hours after the CFA. PK2 mRNA levels decrease 24 hours after CFA, but remain significantly higher than baseline still 30 days after CFA. The development and duration of hyperalgesia is related to the dramatic increase in PK2 expression (Fig 11). 24 hours after administration of CFA in the paw, PK2 mRNA levels in the DRG also increased.

CONCLUSIONI CONCLUSIONS

E' stato mostrato che la somministrazione di prochineticine non mammifere, come Bv8, abbassa la soglia dei nocicettori ad un ampio spettro di stimoli fisici e chimici attraverso l’attivazione dei PKRs su neuroni sensitivi primari. Il caratteristico andamento temporale dell’ipersensibilità indotta da Bv8 è in accordo con un’attività prochineticinica alla periferia (solo nella prima fase) e ai siti centrali (sia nella prima che nella seconda fase). L'iniezione di CFA nella zampa di ratto ha prodotto una drammatica sovraregolazione di mRNA di PK2, nella pelle infiammata ma anche nei DRG (4° e 5° lombare) . In vitro, Bv8 produce chemiotassi di macrofagi e un aumento del rilascio di citochine indotto da LPS. It has been shown that the administration of non-mammalian prokineticins, such as Bv8, lowers the threshold of nociceptors to a broad spectrum of physical and chemical stimuli through the activation of PKRs on primary sensory neurons. The characteristic temporal course of hypersensitivity induced by Bv8 is in agreement with prokineticin activity at the periphery (only in the first phase) and at the central sites (both in the first and in the second phase). Injection of CFA into the rat paw produced a dramatic upregulation of PK2 mRNA, in the inflamed skin but also in the DRGs (4th and 5th lumbar). In vitro, Bv8 produces macrophage chemotaxis and an increase in LPS-induced cytokine release.

Inoltre, la chemotassi indotta da Bv8 e l’aumentato rilascio di citochine indotto da LPS in presenza di Bv8 non sono stati osservati in macrofagi di topi knockout per i recettori PKR1 , indicando che queste risposte pro-infiammatorie sono mediate proprio dai recettori PKR1 [Martucci et al., 2006]. Questi dati evidenziano il ruolo di PKs e PKRs nel dolore indotto da infiammazione e indicano che il blocco dell’attivazione dei PKRs neuronali potrebbe ridurre la sensibilizzazione al dolore. Inoltre, il blocco dei PKRs leucocitari potrebbe prevenire l'infiltrazione di cellule immunitarie nell’area lesa. E’ stato dimostrato che il recettore PKR1 è necessario per la percezione di quei segnali dolorosi, notoriamente mediati dal recettore vanilloide TRPV1. Gli antagonisti TRPV1 finora studiati sono efficaci come antiiperalgesici in quei processi patologici nei quali si produce acidosi-tessutale, come nel caso di infiammazione, di ferite e di processi cancerogeni. Tuttavia, i recettori TRPV1 sono presenti nel sistema nervoso centrale; studi preclinici hanno dimostrato consistentemente che antagonisti di TRPV1 producono un significativo ed indesiderato aumento della temperatura corporea. L'aumento della temperatura corporea sembra essere un effetto di classe, piuttosto che essere ristretto ad una distinta struttura chimica. Un farmaco ideale dovrebbe essere in grado di limitare l'attività dei canali TRPV1 negli stati di dolore, senza produrre gli effetti collaterali degli antagonisti di TRPV1. Un potenziale bersaglio è rappresentato dai recettori prochineticinici che sono essenziali nell'attivazione dei recettori TRPV1 . Furthermore, Bv8-induced chemotaxis and LPS-induced increased cytokine release in the presence of Bv8 were not observed in macrophages from PKR1 receptor knockout mice, indicating that these pro-inflammatory responses are mediated by PKR1 receptors [Martucci et al., 2006]. These data highlight the role of PKs and PKRs in inflammation-induced pain and indicate that blocking the activation of neuronal PKRs could reduce pain sensitization. Furthermore, the blocking of leukocyte PKRs could prevent the infiltration of immune cells into the injured area. It has been shown that the PKR1 receptor is necessary for the perception of those painful signals, known to be mediated by the vanilloid TRPV1 receptor. The TRPV1 antagonists studied so far are effective as antihyperalgesics in those pathological processes in which tissue-acidosis is produced, such as in the case of inflammation, wounds and carcinogenic processes. However, TRPV1 receptors are present in the central nervous system; preclinical studies have consistently shown that TRPV1 antagonists produce a significant and undesirable increase in body temperature. The rise in body temperature appears to be a class effect, rather than being restricted to a distinct chemical structure. An ideal drug should be able to limit the activity of TRPV1 channels in pain states, without producing the side effects of TRPV1 antagonists. A potential target is represented by prokineticin receptors which are essential in the activation of TRPV1 receptors.

In accordo, la presente invenzione ha dimostrato che il blocco dei recettori PKRs con antagonisti non selettivi, come [Ala<24>]Bv8, abolisce l’ipersensibilità termica, meccanica e tattile prodotta dall'infiammazione e dall'incisione della zampa, supportando il ruolo dei PKRs nel dolore indotto da infiammazione. Accordingly, the present invention demonstrated that blocking of PKRs receptors with non-selective antagonists, such as [Ala <24>] Bv8, abolishes the thermal, mechanical and tactile hypersensitivity produced by inflammation and incision of the paw, supporting the role of PKRs in inflammation-induced pain.

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Claims (8)

RIVENDICAZIONI 1. Peptide derivato dalla proteina Bv8 caratterizzato dal fatto di: - comprendere una sostituzione amminoacidica in almeno una delle posizioni da 6 a 40 della sequenza primaria di Bv8; - essere un antagonista funzionale per i recettori delle prochineticine PKR1 e PKR2; - non avere un’attività iperlagesica. CLAIMS 1. Peptide derived from the Bv8 protein characterized by the fact of: - comprising an amino acid substitution in at least one of the positions 6 to 40 of the primary sequence of Bv8; - be a functional antagonist for PKR1 and PKR2 prokineticin receptors; - not have hyperlagesic activity. 2. Peptide secondo la rivendicazione 1 in cui la sostituzione è una sostituzione del triptofano in posizione 24. 2. A peptide according to claim 1 wherein the substitution is a substitution of the tryptophan at position 24. 3. Peptide secondo la rivendicazione 2 essendo [Ala<24>]Bv8. 3. Peptide according to claim 2 being [Ala <24>] Bv8. 4. Peptide secondo una qualsiasi rivendicazione precedente per uso medico. 4. Peptide according to any preceding claim for medical use. 5. Uso di un peptide secondo la rivendicazione 1 per la preparazione di un medicamento per il trattamento e/o la prevenzione del dolore. Use of a peptide according to claim 1 for the preparation of a medicament for the treatment and / or prevention of pain. 6. Uso secondo la rivendicazione 5 in cui il dolore è acuto o cronico. Use according to claim 5 wherein the pain is acute or chronic. 7. Uso secondo la rivendicazione 6 in cui il dolore cronico è selezionato tra il gruppo di: dolore cronico infiammatorio, causato da pancreatite, calcoli renali, mal di testa, dismenorrea, dolore muscoloscheletrico, distorsioni, dolore viscerale, cisti ovariche, prostatite, cistite, cistite interstiziale, dolore post-operatorio, emicrania, nevralgia trigemina, dolore da bruciatura e/o ferita, dolore associato a trauma, dolore neuropatico, dolore associato a malattie muscolo-scheletriche, artrite reumatoide, osteoartrite, spondilite anchilosante, patologie periarticolari, dolore oncologico, dolore da metastasi ossee, dolore da HIV. 7. Use according to claim 6 wherein chronic pain is selected from the group of: chronic inflammatory pain, caused by pancreatitis, kidney stones, headache, dysmenorrhea, musculoskeletal pain, sprains, visceral pain, ovarian cysts, prostatitis, cystitis , interstitial cystitis, post-operative pain, migraine, trigeminal neuralgia, burn and / or wound pain, pain associated with trauma, neuropathic pain, pain associated with musculoskeletal disease, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, ankylosing spondylitis, periarticular disease, pain cancer, bone metastasis pain, HIV pain. 8. Composizione farmaceutica comprendente in quantità efficace il peptide secondo la rivendicazione 4 e adìuvanti e/o eccipienti e/o diluenti.8. Pharmaceutical composition comprising in effective quantity the peptide according to claim 4 and adjuvants and / or excipients and / or diluents.