JP2015509949A - Nemo結合ドメイン融合タンパク質 - Google Patents
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Abstract
核内因子kB必須修飾因子結合(NEMO)ドメイン又はその断片とMCoTI−I/II又はその断片とを含む新規の融合タンパク質、並びに炎症性疾患及び他の医学的状態を治療するためのそれらの使用。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2012年2月23日に出願され、「NEMO BINDING DOMAIN FUSION PROTEINS」と題された米国特許出願第61/602264号に基づく優先権の利益を主張するものである。上記出願の開示全体は、出典明示によりその全体が本明細書に援用される。
本出願は、2012年2月23日に出願され、「NEMO BINDING DOMAIN FUSION PROTEINS」と題された米国特許出願第61/602264号に基づく優先権の利益を主張するものである。上記出願の開示全体は、出典明示によりその全体が本明細書に援用される。
核内因子kB(NF−κβ)必須調節因子(essential modulator)結合ドメイン(NEMO結合ドメイン又はNBD)は、IkBキナーゼ(IKK)複合体の活性化をブロックする。NBDは、細胞に導入された場合、炎症に誘導されるNF−κBの活性化を選択的にブロックすることが示された。この点から、NBDは治療薬として研究されている。
しかし、NBDが有効であるためには、それが細胞に送達される必要がある。したがって、細胞へのNBDの導入を促進するための送達ビヒクルとして細胞透過性ペプチドが使用されている。しかし、そのようなペプチドは治療域が極めて狭い(すなわち、中毒量と治療量との差がほとんどない)ことが見出されており、治療薬としてのペプチドの適用を大幅に制限している。抗炎症動物モデルにおいて、既知のNBDペプチドは1〜20mg/kgの範囲の用量で有効性を示し始めるが、毒性がマウスにおいて50mg/kgを超える用量で観察されている。この毒性は、同様の毒性が不活性変異体NBDペプチドで、又は細胞透過性ペプチド(CPP)単独が送達される場合に観察されることから、そのようなNBDペプチドを送達するのに使用される高濃度のCPPによって生じるようである。したがって、より大きい治療域を有する強力な抗炎症分子が必要である。
開示された融合タンパク質は、NBD又はその断片とMCoTI−I/II又はその断片とを含む。好ましくは、融合タンパク質は、MCoTI−I/IIのループ6をNBD又はその断片と置換して形成される。NBDは例えば配列番号4、22、又は23により表され得る一方、融合タンパク質は配列番号9、10、又は13〜21により表され得る。好ましくは、NBD又はその断片は、融合タンパク質のN末端であり、MCoTI−I/IIのループ6に取って代わる。融合タンパク質は、環状又は直鎖状であってもよく、1つ以上のリンカーをさらに含んでもよい。融合タンパク質はまた薬学的に許容可能な担体中の薬学的組成物として処方(製剤化)することもできる。
ここに開示された融合タンパク質は、被験者の炎症性疾患および他の医学的状態を治療するのに使用することができる。1つの実施態様において、NBD−MCoTI−I/II融合タンパク質を含む薬学的組成物は、それを必要とする被験者に治療的有効量で投与することができる。
定義
本明細書で使用されるとき、次の用語及びその変形形態は、そのような用語が使用される文脈が、異なる意味を明らかに意図しない限り以下に示された意味を有する。
本明細書で使用されるとき、次の用語及びその変形形態は、そのような用語が使用される文脈が、異なる意味を明らかに意図しない限り以下に示された意味を有する。
数値に関して使用される場合の「約」は、示された量のプラスマイナス10パーセントを意味する。例えば、限定するものではないが、「約10」は9から11を意味し、「約10%」は9%から11%を意味する。
「アミノ酸」は、天然のアミノ酸及びアミノ酸類似体(すなわち、D及びL光学異性体を含む非天然、合成、及び修飾アミノ酸)を指す。
「生物活性ペプチド」は、NBDなどの薬学的効果を有するペプチドを指す。生物活性ペプチドは、ペプチド模倣体であってもよい。生物活性ペプチドは、プレプロペプチドの形態で細胞において合成されたタンパク質であってもよく、活性な生成物を得るために次いで切断及び修飾される。生物活性ペプチドは、標的細胞上の特定の受容体に対する結合相互作用を通じて生理的機能を最終的に調節し、生理的応答の誘導をもたらす、ホルモン様又は薬物様活性を有するペプチドであってもよい。その機能特性に従って生物活性ペプチドは、抗菌性、抗血栓性、降圧性、オピオイド性、免疫調節性、無機物結合性、及び抗酸化性などに分類することができる。
「細胞透過性ペプチド」(CPP)は、他の部分と一緒に細胞の形質膜を越えて移行することができるポリペプチドを指す。細胞透過性ペプチドは、他の分子の細胞取り込みを促す特に治療目的のための一般的に短いペプチドである。CPPは、共有結合を介した化学結合又は非共有相互作用のどちらかを通じて送達される分子と結合することができる。
「環状ペプチド」は、アミノ末端及びカルボキシル末端自体が、環状鎖を形成するペプチド結合により連結されているポリペプチド鎖である。
「断片」は、親又は野生型分子に関して切断、欠失、及び/又は修飾を有する分子、特にアミノ酸分子を指す。アミノ酸残基/タンパク質の修飾は当分野でよく知られており、例えば、アシル化、メチル化、リン酸化、硫酸化などが含まれる。
ポリペプチドに関して「融合された」及び「融合」は、2つ以上の前駆体ポリペプチドをつなげて形成されたポリペプチドを指す。これらのポリペプチドは直接つなぎ合わされてもよく、又は他のアミノ酸残基(すなわち、リンカー)がそれらの間にあってもよい。そのため、共に融合されるポリペプチドは、直接又は間接的に(すなわち、リンカーなどを介して)接続され得る。本明細書で使用されるとき、「融合タンパク質」は、NBD又はその断片及びMCoTI−I/II又はその断片の組み合わせを主として指す。本融合タンパク質は、細菌合成又は自動合成などの任意の手段により作製できることが理解されるべきである。
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、及び「ヌクレオチド配列」は互換的に使用され、任意の長さのDNA(すなわち、cDNA、ゲノムDNA、プラスミド、ベクター、ウイルスゲノム、単離DNA、プローブ、プライマーなど)、RNA(すなわち、mRNA、アンチセンスRNA)、又はDNA及びRNAの混合物のポリマーを指す。核酸は、一本鎖もしくは二本鎖、直鎖状もしくは環状、及び/又は天然又は合成ポリヌクレオチドであってもよい。さらに、核酸は、メチル化ヌクレオチド及び/又はヌクレオチド類似体などの非自然発生のヌクレオチドを含み得る。
ポリペプチドに関して「直鎖状」は、共に結合されたアミノ酸の単一の直鎖状ポリマー鎖を含むポリペプチドを指す。直鎖状ポリペプチドは、例えば、自動合成装置を用いて又は組換え方法を通じて形成することができる。直鎖状ポリペプチドは、ジスルフィド結合を含んでもよい。
「ループ6」は、MCoTI−I/IIタンパク質のループ6を指す(配列番号27)。
「医学的状態(Medical condition)」は、疾患及び疾患の症状の両方を指す。
「MCoTI−I/II」は、配列番号25又はその部分を含む分子又はその断片を指す。この配列中のアミノ酸15は、リジン又はグルタミンのどちらかであってもよく、アミノ酸16は、リジン又はアルギニンのどちらかであってもよい。野生型MCoTI−Iにおいて、アミノ酸15及び16はそれぞれグルタミン及びアルギニンであるが、野生型MCoTI−IIにおいてアミノ酸15及び16は、それぞれリジン及びリジンである。MCoTI−I/IIの断片は、例えば、ループ6が欠失されている断片を含み得る。
「NBD」又は「NEMO結合ドメイン」は、核内因子κβ(NF−κβ)必須調節因子結合ドメインペプチド配列を指す。「NBD」は、末端グルタミン残基を有する又は有さない、配列番号4により表されるNBDの完全長配列を指す。「NBD又はその断片」は、配列番号4により表される完全長NBDペプチド配列、又は本明細書に開示された融合タンパク質を作製するのに使用することができるNBDペプチド配列の薬学的に有効な断片、例えば、配列番号22及び配列番号23により表されるNBD断片のどちらかを指す。NBDの断片は、好ましくは、完全長NBD配列の約4個のアミノ酸から約10個のアミノ酸を含み、NBDの切断、アミノ酸欠失、及び/又はアミノ酸修飾を含み得る。
「NBDペプチド」は、NBD及びCPP(MCoTI−I/II又はその断片以外の)を含む分子を指す。NBDペプチドは、NEMOとIKKα及びβとの相互作用を妨げることによりikBキナーゼ(IKK)キナーゼ複合体の活性化をブロックすることが知られている。
「薬学的」は、被験者における疾患の治癒、緩和、治療又は予防を含む、被験者の生理的機能を回復、修復又は修正する上での効果を指す。「薬学的組成物」及び「医薬」は、薬学的効果を有する組成物である。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は互換的に使用され得、ペプチド結合を介して結合された4個以上のアミノ酸を含むアミノ酸のポリマーを指す。タンパク質は、直鎖状、分枝状、又は環状であり得、自然発生のアミノ酸及び/又はアミノ酸類似体を含み得る。
「被験者」は、本明細書に記載されたような薬学的組成物で治療される個体を指す。被験者は、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。
「治療的有効量」は、被験者に投与される場合、疾患又は他の医学的状態の治療を含む、被験者の生理的機能の回復、修復又は修正に効果を有するのに十分な組成物の量を指す。
「治療域」は、中毒量と治療量との投与量差を指す。
「治療」には、予防的治療、並びに被験者が炎症及び/又は炎症性疾患もしくは状態などの疾患又は他の医学的状態を経験した後の治療の両方が含まれる。例えば、炎症の予防的治療には、被験者が炎症及び/又は炎症性疾患もしくは状態を経験する前の組成物の投与が含まれる。疾患又は状態の「治療」には、低減、改善、除去、ブロック、阻害などが含まれる。
「含む(comprise)」並びに「含む(comprising)」及び「含む(comprises)」などのこの用語の変形形態は、他の追加物、構成要素、整数又はステップを排除することを意図しない。本明細書で使用される用語「a」、「an」、及び「the」並びに類似の指示対象は、文脈におけるそれらの使用の別段の指示がない限り、単数形及び複数形の両方を含むと解釈されるべきである。「本質的に〜から成る(consisting essentially of)」及び該用語の変形形態は、本質的に重要な他の構成要素又はステップの除外を意味するものとする。故に、列挙された構成要素から本質的に成る組成物は、微量汚染物質及び薬学的に許容可能な担体を除外しないことになる。「〜から成る(consisting of)」は、微量を上回る他の構成要素又はステップの除外を意味するものとする。例えば、ポリペプチドが任意の他のアミノ酸は含有しないが列挙されたアミノ酸配列を含有する場合、ポリペプチドはアミノ酸配列「から成る」。そのようなアミノ酸配列が、ほんの数個の追加のアミノ酸残基、すなわち、約1から約10個の追加の残基、より好ましくは1〜5個と一緒に存在する場合、ポリペプチドはアミノ酸配列から「本質的に成る」。アミノ酸配列がポリペプチドの最終アミノ酸配列の少なくとも一部である場合、ポリペプチドはアミノ酸配列を「含む」。
融合タンパク質
図1〜13に示されているように、本発明は、MCoTI−I/II又はその断片に融合されたNBD又はその断片を含む融合タンパク質に関する。NBDは、NF−κβシグナル伝達経路においてIκβ複合体の活性化をブロックしてNF−κβの活性化をブロックすることが知られている。Iκβの活性化のブロックはNF−κβの活性化を妨げ、これによりNF−κβが細胞の細胞質に進入し転写因子として作用するのを妨げる。1つのそのような融合タンパク質がNBD−MCoTI−IIであり、炎症性疾患及び他の医学的状態を治療する方法において医薬として使用することができる。
図1〜13に示されているように、本発明は、MCoTI−I/II又はその断片に融合されたNBD又はその断片を含む融合タンパク質に関する。NBDは、NF−κβシグナル伝達経路においてIκβ複合体の活性化をブロックしてNF−κβの活性化をブロックすることが知られている。Iκβの活性化のブロックはNF−κβの活性化を妨げ、これによりNF−κβが細胞の細胞質に進入し転写因子として作用するのを妨げる。1つのそのような融合タンパク質がNBD−MCoTI−IIであり、炎症性疾患及び他の医学的状態を治療する方法において医薬として使用することができる。
NBD
本融合分子において使用されるNBDは、好ましくは、配列番号4により表された11アミノ酸配列である。しかし、この11アミノ酸配列の治療的に活性な断片もまた、本融合タンパク質を形成するのに使用することができる。例えば、配列番号22により表された6アミノ酸NBD配列(1〜3位の最初の3つのアミノ酸の欠失及びNBDの10〜11位の最後の2つのアミノ酸の欠失)が、本発明の分子を形成するのにMCoTI−I/II又はその断片に融合されてもよい。あるいは、配列番号23により表された9アミノ酸配列(NBDの10〜11位のアミノ酸の欠失)がMCoTI−I/II又はその断片に融合されてもよい。
本融合分子において使用されるNBDは、好ましくは、配列番号4により表された11アミノ酸配列である。しかし、この11アミノ酸配列の治療的に活性な断片もまた、本融合タンパク質を形成するのに使用することができる。例えば、配列番号22により表された6アミノ酸NBD配列(1〜3位の最初の3つのアミノ酸の欠失及びNBDの10〜11位の最後の2つのアミノ酸の欠失)が、本発明の分子を形成するのにMCoTI−I/II又はその断片に融合されてもよい。あるいは、配列番号23により表された9アミノ酸配列(NBDの10〜11位のアミノ酸の欠失)がMCoTI−I/II又はその断片に融合されてもよい。
MCoTI−I/II
MCoTI−I(配列番号24)及びMCoTI−II(配列番号3)は、システインノット微小タンパク質(CKM)である。その天然形態において、これらのポリペプチド(図1に示された1)は、ループ1(11)、ループ2(12)、ループ3(13)、ループ5(15)、及びループ6(16)、及びジスルフィド結合(20)を含む複数のループを含む。MCoTI−I及びMCoTI−IIは、環状ペプチドとして見出されもしくは作製されてもよく(参照番号30により示されたペプチド結合により)、又は直鎖状構築物として作製されてもよい。
MCoTI−I(配列番号24)及びMCoTI−II(配列番号3)は、システインノット微小タンパク質(CKM)である。その天然形態において、これらのポリペプチド(図1に示された1)は、ループ1(11)、ループ2(12)、ループ3(13)、ループ5(15)、及びループ6(16)、及びジスルフィド結合(20)を含む複数のループを含む。MCoTI−I及びMCoTI−IIは、環状ペプチドとして見出されもしくは作製されてもよく(参照番号30により示されたペプチド結合により)、又は直鎖状構築物として作製されてもよい。
CKMは、典型的には50個未満のアミノ酸から成る小さいペプチドである。CKMは、一般的に分子内ジスルフィド結合及び小さい三重らせんβシートに基づき定義された構造を有する薬理活性物質である[(例えば、Craik DJ(2001)Plant cyclotides:circular、knotted peptide toxins.Toxicon 39:1809〜13頁、この内容は全体が参照により本明細書に組み込まれている)参照]。その独特の構造は、信じられないほど高い熱的、化学的及び酵素的安定性に関与している。CKMは65℃で数週間煮沸され、インキュベートされ得、又はさらには構造的及び機能的完全性を失うことなく1N HCl又は1N NaOH中に置かれ得る[(例えば、Austin J(2009)Biosynthesis and biological screening of a genetically encoded library based on the cyclotide MCoTI−I.Chembiochem 10:2663〜70頁;Fridman JSら、(2010)Selective inhibition of JAK1 and JAK2 is efficacious in rodent models of arthritis:preclinical characterization of INCB028050.J Immunol 184:5298〜307;Khaja Kら、(2010)Comparison of Functional Protein Transduction Domains Using the NEMO Binding Domain Peptide.Pharmaceuticals 3:110〜124頁;Kimura RHら、(2009)Engineered knottin peptides:a new class of agents for imaging integrin expression in living subjects.Cancer Res 69:2435〜42頁;及びPeterson Sら、(2011)Effects of Portabella mushrooms on collagen−induced arthritis、inflammatory cytokines、and body composition in dilute brown non−agouti(DBA1)mice.Functional Foods in Health and Disease 1:279〜296頁)参照]。CKMは、髄腔内投与される鎮痛薬、ジコノチド(例えば、Doggrell SA(2004)Intrathecal ziconotide for refractory pain.Expert Opin Investig Drugs 13:875〜7頁参照)を含む。
MCoTI−I又はMCoTI−IIは、本明細書に開示された融合タンパク質の骨格を形成する。MCoTI−Iの配列は配列番号25(図13)により示され、一方、MCoTI−IIの配列は配列番号3(図10)により示される。MCoTI−I及びMCoTI−IIは、トリプシン阻害剤CKMサブファミリーのメンバーである。
NBD−MCoTI−II
本明細書に開示されたNBD−MCoTI−I/IIは、(1)NBD(配列番号4により表された)、又はその断片、及び(2)MCoTI−I/II(配列番号25により表された)、又はその断片の融合により形成される。1つの例において、直鎖形態のMCoTI−IIが本NBD−MCoTI−II融合タンパク質を形成するのに使用されてもよく、配列番号10により表され得る。好ましくは、融合タンパク質は、MCoTI−I/IIのループ6(図1に示された)をNBD又はその断片と置換して形成される。MCoTI−IIのループ6は、配列番号27により表される。そのため、最終融合タンパク質において、上述のアミノ酸配列は好ましくは存在しない。融合は直接、すなわちペプチド単位間にいずれのアミノ酸残基もない状態であってもよく、又は1つ以上のリンカーを介していてもよい。他の実施態様において、本発明の融合タンパク質は環状であってもよく、並びに/又は直鎖状及び環状の両方であってもよい。さらに他の実施態様において、NBD又はその断片は、MCoTI−IIタンパク質配列の他の位置に挿入されてもよい。例えば、本明細書に開示された本発明の融合タンパク質は、ループ6及びMCoTI−IIの1つ以上の他のループの少なくとも一部を置換して形成されてもよく、並びに/又は本明細書に開示された本発明の融合タンパク質は、ループ6の少なくとも一部を置換して形成されてもよく、並びに/又は本明細書に開示された本発明の融合タンパク質は、MCoTI−IIのループ6以外のループの少なくとも一部を置換して形成されてもよい。
本明細書に開示されたNBD−MCoTI−I/IIは、(1)NBD(配列番号4により表された)、又はその断片、及び(2)MCoTI−I/II(配列番号25により表された)、又はその断片の融合により形成される。1つの例において、直鎖形態のMCoTI−IIが本NBD−MCoTI−II融合タンパク質を形成するのに使用されてもよく、配列番号10により表され得る。好ましくは、融合タンパク質は、MCoTI−I/IIのループ6(図1に示された)をNBD又はその断片と置換して形成される。MCoTI−IIのループ6は、配列番号27により表される。そのため、最終融合タンパク質において、上述のアミノ酸配列は好ましくは存在しない。融合は直接、すなわちペプチド単位間にいずれのアミノ酸残基もない状態であってもよく、又は1つ以上のリンカーを介していてもよい。他の実施態様において、本発明の融合タンパク質は環状であってもよく、並びに/又は直鎖状及び環状の両方であってもよい。さらに他の実施態様において、NBD又はその断片は、MCoTI−IIタンパク質配列の他の位置に挿入されてもよい。例えば、本明細書に開示された本発明の融合タンパク質は、ループ6及びMCoTI−IIの1つ以上の他のループの少なくとも一部を置換して形成されてもよく、並びに/又は本明細書に開示された本発明の融合タンパク質は、ループ6の少なくとも一部を置換して形成されてもよく、並びに/又は本明細書に開示された本発明の融合タンパク質は、MCoTI−IIのループ6以外のループの少なくとも一部を置換して形成されてもよい。
1つの実施態様において、NBD−MCoTI−IIは配列番号11により表すことができる。この融合タンパク質において、NBDは、1〜3位に3つのアミノ酸欠失、及び10及び11位に2つのアミノ酸欠失を有する。このNBD断片は、配列番号22により表される。このNBD断片は、好ましくは融合タンパク質のN末端に位置する。他の実施態様において、上記NBD断片は、例えば配列番号14により表されるように、融合タンパク質のN末端に位置しなくてもよい。例えば、NBD断片は、融合タンパク質のN末端のすぐ側にある1つ以上のリンカーに続いてもよい。
あるいは、NBD−MCoTI−IIは、配列番号12により表すことができる。この融合タンパク質において、NBDは10及び11位に2つのアミノ酸欠失を有する。このNBD断片は、配列番号23により表される。該NBD断片は、融合タンパク質のN末端に位置する。他の実施態様において、上記NBD断片は、例えば配列番号15により表されるように、融合タンパク質のN末端に位置しなくてもよい。例えば、このNBD断片は、融合タンパク質のN末端のすぐ側にある1つ以上のリンカーに続いてもよい。
別の実施態様において、NBD−MCoTI−IIは配列番号13により表すことができる。この融合タンパク質において、NBDはMCoTI−I/II骨格のN末端のすぐ側になくてもよい。NBD−MCoTI−IIは、NBD(又はその断片)が1つ以上のリンカーにより隣接された配列番号16〜21により表すこともできる。リンカーは、融合タンパク質のN末端もしくはN末端付近、及び/又はC末端もしくはC末端付近に位置してもよい。リンカーは、MCoTI−I/IIのフレームワーク内でのNBD(又はその断片)の柔軟性を向上させるために使用することができる。好ましくは、リンカーはGly Gly Serである。リンカーはよく知られている。任意のタイプ及び数のリンカーが使用され得る。例えば、3つを超えるアミノ酸リンカーが使用されてもよく、及び/又はより長いリンカーが使用されてもよい。他の実施態様において、リンカーは取り除かれてもよい。
代替の実施態様において、NBD−MCoTI−I/IIペプチドは、NBD配列のサブセット(配列番号11、配列番号12)、又はNBD配列がN末端のすぐ側にないサブセット(配列番号13、配列番号14、配列番号15)を含有してもよい。あるいは、NBD配列は、MCoTI−II骨格のフレームワーク内でのNBDの柔軟性を向上させるために、1つ(配列番号16、配列番号19)、2つ(配列番号17、配列番号20)又は3つ(配列番号18、配列番号21)のリンカー(Gly Gly Ser)もNBDのN及びC末端に含有することができる。
直鎖状MCoTI−I/II
代替の実施態様において、本発明は、インビボで生物活性ペプチドを送達するための直鎖状MCoTI−I/II分子の使用を含み得る。好ましくは、生物活性ペプチドは、MCoTI−I/II分子のN末端に融合される(又はさもなければ共有結合される)。MCoTI−I/II部分もまた、好ましくはMCoTI−I/II分子のループ6を欠き、生物活性ペプチドがループ6の代わりに付加される。
代替の実施態様において、本発明は、インビボで生物活性ペプチドを送達するための直鎖状MCoTI−I/II分子の使用を含み得る。好ましくは、生物活性ペプチドは、MCoTI−I/II分子のN末端に融合される(又はさもなければ共有結合される)。MCoTI−I/II部分もまた、好ましくはMCoTI−I/II分子のループ6を欠き、生物活性ペプチドがループ6の代わりに付加される。
製造方法
本融合タンパク質は、当分野に知られている方法により製造することができる。例えば、Fmocベースの固相ペプチド合成などの自動化ポリペプチド合成が、本タンパク質を作製するのに行われてもよい。あるいは、本融合タンパク質は、細菌、酵母、昆虫、又は哺乳動物細胞を用いるなど組換え方法により作製することができる。HEK細胞、CHO細胞、HeLa細胞、及び当分野に知られている他の細胞などの様々な細胞系が、本タンパク質を組換え的に作製するのに使用され得る。
本融合タンパク質は、当分野に知られている方法により製造することができる。例えば、Fmocベースの固相ペプチド合成などの自動化ポリペプチド合成が、本タンパク質を作製するのに行われてもよい。あるいは、本融合タンパク質は、細菌、酵母、昆虫、又は哺乳動物細胞を用いるなど組換え方法により作製することができる。HEK細胞、CHO細胞、HeLa細胞、及び当分野に知られている他の細胞などの様々な細胞系が、本タンパク質を組換え的に作製するのに使用され得る。
組換え的に本融合タンパク質を作製する場合、適切なポリヌクレオチド及びベクターが選択される。例えば、配列番号8により表された単離ポリ核酸分子が、細菌合成に使用されてもよい。好ましくは、ポリ核酸はDNA又はRNAであり得る。好ましくは、ベクターは、タンパク質の効率的なトランスフェクション及び効率的な発現に必要な調節エレメントの全てを含む。そのようなベクターは当分野でよく知られており、任意の適切なベクターがこの目的のために選択され得る。組換え細胞のトランスフェクション及び培養は、同様に当分野でよく知られている。好ましくは、そのような組換え細胞及びその任意の子孫細胞は、本融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを含む。そのような細胞系は、本明細書に記載された融合タンパク質(例えば、NBD−MCoTI−II)を連続的に、又はベクターに応じて誘導/活性化時に発現することができる。
本融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、代替の実施態様において、融合タンパク質を被験者に送達するために被験者に直接投与することができる。そのような送達は、当分野に知られている遺伝子療法ベクター及びプロトコルを手段とするであろう。
本融合タンパク質の製造後、そのようなタンパク質は、本明細書に記載された融合タンパク質を含む、すなわち、NBD−MCoTI−I/II、及び薬学的に許容可能な賦形剤を含む薬学的組成物として処方することができる。薬学的組成物は、例えば、乳化剤、緩衝液、不活性(inert)/不活性(inactive)成分、糖、塩などを含むことができる。好ましくは、薬学的組成物は経口投与される。しかし、薬学的組成物は、注射、経口、経皮、及び/又は局所などの(ただし、これらに限定されない)いずれの方法での投与にも適し得る。例えば、経口形態で提供される場合、薬学的組成物は次の特性、すなわち、酵素抵抗性、胃液中での安定性及びGI膜透過性を有するように処方されてもよい。
治療
NBD−MCoTI−I/IIは、NF−κβの活性化を伴う多くの異なる医学的状態、特に炎症性状態又は疾患を、NF−kB経路のTNFα媒介活性化を阻害して治療する方法において医薬として使用することができる。本明細書に記載された本発明のタンパク質、ポリ核酸、及び/又はベクターは、炎症性疾患又は状態を治療するための医薬として使用することができる。この点で、本発明は、NBD−MCoTI−II、本明細書に記載された単離ポリ核酸分子及び/又はベクター、及び/又は本発明による薬学的組成物が患者に投与される、炎症性疾患又は状態を治療するための方法に関する。本発明の融合タンパク質、ポリ核酸、及び/又はベクターは単独で、又は炎症性疾患もしくは状態並びに/又は他の疾患及び状態を治療する他の医薬に加えて投与することができる。例えば、本発明の融合タンパク質、ポリ核酸、及び/又はベクターは、他の既知の医薬と共に治療計画の一環として投与することができる。他の実施態様において、本明細書に記載された本発明のタンパク質、ポリ核酸、及び/又はベクターは医薬として使用されて、該医薬を投与すると改善するように思われるいずれかの他の疾患又は状態を治療することができる。
NBD−MCoTI−I/IIは、NF−κβの活性化を伴う多くの異なる医学的状態、特に炎症性状態又は疾患を、NF−kB経路のTNFα媒介活性化を阻害して治療する方法において医薬として使用することができる。本明細書に記載された本発明のタンパク質、ポリ核酸、及び/又はベクターは、炎症性疾患又は状態を治療するための医薬として使用することができる。この点で、本発明は、NBD−MCoTI−II、本明細書に記載された単離ポリ核酸分子及び/又はベクター、及び/又は本発明による薬学的組成物が患者に投与される、炎症性疾患又は状態を治療するための方法に関する。本発明の融合タンパク質、ポリ核酸、及び/又はベクターは単独で、又は炎症性疾患もしくは状態並びに/又は他の疾患及び状態を治療する他の医薬に加えて投与することができる。例えば、本発明の融合タンパク質、ポリ核酸、及び/又はベクターは、他の既知の医薬と共に治療計画の一環として投与することができる。他の実施態様において、本明細書に記載された本発明のタンパク質、ポリ核酸、及び/又はベクターは医薬として使用されて、該医薬を投与すると改善するように思われるいずれかの他の疾患又は状態を治療することができる。
本明細書に記載された本発明のタンパク質、ポリ核酸、及び/又はベクターは、NF−κβ経路の活性化を阻害及び/又はブロックするのに使用することができる。TNF−α、IL−6、及びIL−1などの炎症性メディエーターは炎症性疾患の発症機序において重要であり、NF−κBの活性化により制御されており、そのためこの分子をブロックすることはそのような状態を治療し得る。NBD−MCoTI−I/IIは、既知の細胞透過性NBDペプチドより106倍強力であることが発見された。効力におけるこの改善は、インビボでの炎症性損傷(例えば、カラゲニン足浮腫(CPE)マウスモデルで示されるような)を改善するのに必要とされる投与量の5000倍の減少になった。したがって、NBD−MCoTI−I/IIは、炎症性疾患を治療するための強力な経口投与可能な薬剤である。
本明細書に記載された方法を用いて治療することができる炎症性疾患及び/又は状態には、アルツハイマー病、強直性脊椎炎、関節炎(すなわち、変形性関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎)、癌、浮腫、腫脹、喘息、アテローム性動脈硬化、クローン病、大腸炎、皮膚炎、憩室炎、線維筋痛、肝炎、過敏性腸症候群、全身性エリテマトーデス、腎炎、パーキンソン病、潰瘍性大腸炎、呑酸/胸焼け、座瘡、喘息、アテローム性動脈硬化、気管支炎、癌、心臓炎、セリアック病、慢性パン(chronic pan)、肝硬変、認知症、糖尿病、ドライアイ、浮腫、気腫、湿疹、胃腸炎、歯肉炎、心臓疾患、高血圧、インスリン耐性、間質性膀胱炎、関節痛/関節炎/関節リウマチ、メタボリック症候群(症候群X)、筋炎、腎炎、肥満、骨減少、骨粗鬆症、歯周病、多発性軟骨炎、乾癬、副鼻腔炎、痙攣性結腸、シェーグレン症候群、全身性カンジダ症、腱炎、UTI、膣炎、呼吸器アレルギー性疾患、過敏性肺疾患、アナフィラキシー又は過敏性反応、薬剤アレルギー、昆虫刺傷アレルギー、炎症性腸疾患、限定されないが自己免疫性血液疾患、自己免疫性甲状腺炎、ベーチェット病、グレーブス病、移植片拒絶、移植片対宿主疾患などの自己免疫疾患などの慢性もしくは急性疾患又は状態が含まれるが、これらに限定されない。さらなる状態及び疾患には、虚血再灌流傷害、サイトカイン誘導毒性などが含まれる。好ましくは、関節炎及び腫脹などの状態が治療される。
本明細書に開示された本発明の融合タンパク質、ポリ核酸、及び/又はベクターは、特定の炎症性疾患又は状態などの特定の疾患又は状態を防ぐのに使用することができる。例えば、本明細書に開示された本発明の融合タンパク質、ポリ核酸、及び/又はベクターは、関節炎性関節損傷を防ぐのに使用することができる。
核内因子κB(NF−κB)の活性化が、ヒトデュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)におけるジストロフィン欠損から生じる筋肉変性に寄与する、筋ジストロフィー及び悪液質などの筋骨格疾患など、NF−κBが病理において役割を果たす他の状態も本発明で治療することができる。また、心臓肥大、虚血、及び再灌流傷害などの心臓状態;脊髄損傷;敗血症;並びに癌も含まれる。例えば、大細胞型B細胞リンパ腫において、恒常的NF−κB活性はNBD−MCoTI−I/IIにより抑制することができる。
NBD−MCoTI−IIの合成
NBD配列(配列番号4)を、図1に示されているようにループ6を置換してMCoTI−II(配列番号3)に移植した。合成は、2つの方法で達成した:1)細菌での発現[(例えば、Austin Jら、(2009)Biosynthesis and biological screening of a genetically encoded library based on the cyclotide MCoTI−I.Chembiochem 10:2663〜70頁、及びSchmoldt HUら、(2005)A fusion protein system for the recombinant production of short disulfide bond rich cystine knot peptides using barnase as a purification handle.Protein Expr Purif 39:82〜9頁参照);これら各々の内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれている]、並びに2)自動ペプチド合成装置での合成[(例えば、Avrutina Oら、(2004)Fmoc−Assisted Synthesis of a 29−Residue Cystine−Knot Trypsin Inhibitor Containing a Guaninyl Amino Acid at the P1−Position.European Journal of Organic Chemistry 2004:4931〜4935頁、及びCamarero JA ら(2004)Fmoc−based synthesis of peptide alpha−thioesters using an aryl hydrazine support.J Org Chem 69:4145〜51頁参照)]。
NBD配列(配列番号4)を、図1に示されているようにループ6を置換してMCoTI−II(配列番号3)に移植した。合成は、2つの方法で達成した:1)細菌での発現[(例えば、Austin Jら、(2009)Biosynthesis and biological screening of a genetically encoded library based on the cyclotide MCoTI−I.Chembiochem 10:2663〜70頁、及びSchmoldt HUら、(2005)A fusion protein system for the recombinant production of short disulfide bond rich cystine knot peptides using barnase as a purification handle.Protein Expr Purif 39:82〜9頁参照);これら各々の内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれている]、並びに2)自動ペプチド合成装置での合成[(例えば、Avrutina Oら、(2004)Fmoc−Assisted Synthesis of a 29−Residue Cystine−Knot Trypsin Inhibitor Containing a Guaninyl Amino Acid at the P1−Position.European Journal of Organic Chemistry 2004:4931〜4935頁、及びCamarero JA ら(2004)Fmoc−based synthesis of peptide alpha−thioesters using an aryl hydrazine support.J Org Chem 69:4145〜51頁参照)]。
NBD−MCoTI−IIは、細菌合成及び自動合成アプローチの両方を用いて合成した。細菌合成は、環状の天然の折り畳まれたNBD−MCoTI−IIをもたらした。自動合成に対して本発明者らは、直鎖状バージョンのNBD−MCoTI−IIを生成した。両方のアプローチを以下により詳細に記載する。
NBD−MCoTI−IIの細菌合成。NBD−MCoTI−II構築物の生成
相補的センス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて生成したNBD−MCoTI−IIをコードする遺伝子を、細菌におけるタンパク質発現のための適切なプラスミドにサブクローニングした。細菌において発現する場合、NBD−MCoTI−IIはその天然の折り畳まれたコンフォメーションで精製した。しかし、NBD−MCoTI−IIは、複数のカラム/HPLCを用いて細菌タンパク質から離して精製しなければならなかった。野生型MCoTI−II−インテイン−キチン結合ドメイン(CBD)融合タンパク質は、次のように生成した。MCoTI−IIのタンパク質配列(配列番号3)をコードするセンス(配列番号1)及びアンチセンス(配列番号2)オリゴヌクレオチドをアニーリングして二本鎖カセットを生成した。ベクターpTXB1(インテイン−CBDコード領域を含有する)に該カセットをサブクローニングするために、5’Nde I及び3’Sap I部位を含めた。A Bgl II制限酵素認識部位もループ6の後に含めて、NEMO結合ドメイン配列(NBD)(配列番号4)をコードするcDNA配列へのサブクローニングを可能にした。MCoTI−IIのcDNA配列は、インテイン−CBDコード領域をコードするcDNA領域のすぐ上流、及び該領域とインフレームになるようにpTXB1にサブクローニングした。
相補的センス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて生成したNBD−MCoTI−IIをコードする遺伝子を、細菌におけるタンパク質発現のための適切なプラスミドにサブクローニングした。細菌において発現する場合、NBD−MCoTI−IIはその天然の折り畳まれたコンフォメーションで精製した。しかし、NBD−MCoTI−IIは、複数のカラム/HPLCを用いて細菌タンパク質から離して精製しなければならなかった。野生型MCoTI−II−インテイン−キチン結合ドメイン(CBD)融合タンパク質は、次のように生成した。MCoTI−IIのタンパク質配列(配列番号3)をコードするセンス(配列番号1)及びアンチセンス(配列番号2)オリゴヌクレオチドをアニーリングして二本鎖カセットを生成した。ベクターpTXB1(インテイン−CBDコード領域を含有する)に該カセットをサブクローニングするために、5’Nde I及び3’Sap I部位を含めた。A Bgl II制限酵素認識部位もループ6の後に含めて、NEMO結合ドメイン配列(NBD)(配列番号4)をコードするcDNA配列へのサブクローニングを可能にした。MCoTI−IIのcDNA配列は、インテイン−CBDコード領域をコードするcDNA領域のすぐ上流、及び該領域とインフレームになるようにpTXB1にサブクローニングした。
NBD−MCoTI−IIカセットは、NBD配列及びMCoTI−IIペプチド(配列番号7)の一部をコードするセンス(配列番号5)及びアンチセンス(配列番号6)オリゴヌクレオチドをアニーリングして生成した。NBDコード配列を野生型MCoTI−II−インテイン−CBD:pTXB1にサブクローニングするために、5’Nde I及び3’Bgl II部位を含めた。MCoTI−II:pTXB1のNde I/Bgl II部位へのNBDコード領域のサブクローニングは、野生型ループ6コード領域をNBDコード領域と置換し、構築物NBD−MCoTI−II:pTXB1をもたらした。細菌においてNBD−MCoTI−IIを発現するためのヌクレオチド及びタンパク質配列は、それぞれ配列番号8及び配列番号9に示されている。
NBD−MCoTI−IIの発現及び精製
野生型及びNBD−MCoTI−IIの細菌発現は、大腸菌Origami(EMD Chemicals,Inc.)で行った。野生型MCoTI−II:pTXB1又はNBD−MCoTI−II:pTXB1のどちらかをトランスフェクトした大腸菌を、対数期増殖に達するまでアンピシリンの存在下、LB培地で37℃で増殖させた。対数期増殖に達した後、細胞を30℃に馴化させ、IPTGを添加し(0.3μMの最終濃度で)、30℃で2時間増殖させた。細胞を遠心分離により回収し、−80℃で貯蔵した。
野生型及びNBD−MCoTI−IIの細菌発現は、大腸菌Origami(EMD Chemicals,Inc.)で行った。野生型MCoTI−II:pTXB1又はNBD−MCoTI−II:pTXB1のどちらかをトランスフェクトした大腸菌を、対数期増殖に達するまでアンピシリンの存在下、LB培地で37℃で増殖させた。対数期増殖に達した後、細胞を30℃に馴化させ、IPTGを添加し(0.3μMの最終濃度で)、30℃で2時間増殖させた。細胞を遠心分離により回収し、−80℃で貯蔵した。
野生型又はNBD−MCoTI−IIを発現する大腸菌を、プロテアーゼ阻害剤及びベンゾナーゼを含有するBugbuster溶液(EMD Chemicals,Inc.)に室温で20分間溶解した。遠心分離(10,000×g、4℃、1時間)により得られた清澄化溶解物を、キチンビーズ(NEB,Inc.から入手可能)(30倍容量のHEPES緩衝液:20mM HEPES、pH8.0、500mM NaCl及び500MgCl2で洗浄した)に添加し、1時間混合しながら4℃でインキュベートした。カラムを流し、0.1%トリトン−X−100を含む50倍容積のHEPES緩衝液と、これに続く50倍容積のHEPES緩衝液で洗浄した。カラムをHEPES緩衝液中、30mM DTTで一晩処理し、環化され折り畳まれた野生型又はNBD−MCoTI−IIの溶出液を得た。溶出液を凍結乾燥し、滅菌水に再懸濁し、溶媒A(0.1%水性TFA)に対し0〜60%溶媒B(90%ACN/0.1%TFA)の直線勾配を用いて、流速1.0ml/分でC18カラムの逆相HPLCにより野生型又はNBD−MCoTI−IIを精製した。活性ピークを回収し、ACNを回転蒸発により除去し、凍結乾燥した。処理後の最終NBD−MCoTI−IIタンパク質配列は、配列番号10により表すことができる(ただし、上述の処理の産物は環状タンパク質であると理解されるべきであり、配列番号10におけるN末端及びC末端の指定は任意である)。
NBD−MCoTI−IIの自動合成
NBD−MCoTI−IIをFmocベースの固相ペプチド合成と、これに続く任意選択の頭尾環化により化学的に合成した。自動合成を用いる場合、ペプチドは天然のコンフォメーションに折り畳まれなければならないことがある[(例えば、Aboye TLら、(2011)Interlocking disulfides in circular proteins:toward efficient oxidative folding of cyclotides.Antioxid Redox Signal 14:77〜86頁;Cemazar Mら、(2006)Knots in rings.The circular knotted protein Momordica cochinchinensis trypsin inhibitor−II folds via a stable two−disulfide intermediate.J Biol Chem 281:8224〜32頁;及びCemazar Mら、(2008)The structure of a two−disulfide intermediate assists in elucidating the oxidative folding pathway of a cyclic cystine knot protein.Structure 16:842〜510頁参照);これらの内容は全体が参照により本明細書に組み込まれている]。これを達成するために、NBD−MCoTI−IIを還元及び酸化グルタチオンを含有する緩衝液に入れた。適正な折り畳みは、1H−1H TOCSY NMRにより決定した(例えば、Austin Jら、(2009)Biosynthesis and biological screening of a genetically encoded library based on the cyclotide MCoTI−I.Chembiochem 10:2663〜70頁参照、この内容は全体が参照により本明細書に組み込まれている)。
NBD−MCoTI−IIをFmocベースの固相ペプチド合成と、これに続く任意選択の頭尾環化により化学的に合成した。自動合成を用いる場合、ペプチドは天然のコンフォメーションに折り畳まれなければならないことがある[(例えば、Aboye TLら、(2011)Interlocking disulfides in circular proteins:toward efficient oxidative folding of cyclotides.Antioxid Redox Signal 14:77〜86頁;Cemazar Mら、(2006)Knots in rings.The circular knotted protein Momordica cochinchinensis trypsin inhibitor−II folds via a stable two−disulfide intermediate.J Biol Chem 281:8224〜32頁;及びCemazar Mら、(2008)The structure of a two−disulfide intermediate assists in elucidating the oxidative folding pathway of a cyclic cystine knot protein.Structure 16:842〜510頁参照);これらの内容は全体が参照により本明細書に組み込まれている]。これを達成するために、NBD−MCoTI−IIを還元及び酸化グルタチオンを含有する緩衝液に入れた。適正な折り畳みは、1H−1H TOCSY NMRにより決定した(例えば、Austin Jら、(2009)Biosynthesis and biological screening of a genetically encoded library based on the cyclotide MCoTI−I.Chembiochem 10:2663〜70頁参照、この内容は全体が参照により本明細書に組み込まれている)。
本発明者らは、ループ6がNBD配列(配列番号4)と置換されるNBD−MCoTI−IIの直鎖バージョン(配列番号10)をデザインした。本発明者らは、直鎖状NBD−MCoTI−IIを生成するために上記のような自動化学合成を利用した。
NBD−MCoTI−IIによるNF−κB経路の阻害
細胞透過性NBDペプチドは、インビトロ結合アッセイ及び細胞ベースのアッセイ、並びにインビボ齧歯類モデルにおいて、NF−κBシグナル伝達及び炎症反応を阻害することが実証されている[(例えば、Dai Sら、(2004)The IkappaB kinase(IKK)inhibitor,NEMO−binding domain peptide,blocks osteoclastogenesis and bone erosion in inflammatory arthritis.J Biol Chem 279:37219〜22頁;Darwech Iら、(2009)Impediment of NEMO oligomerization inhibits osteoclastogenesis and osteolysis.J Cell Biochem 108:1337〜45頁;di Meglio Pら、(2005)Amelioration of acute inflammation by systemic administration of a cell−permeable peptide inhibitor of NF−kappaB activation.Arthritis Rheum 52:951〜8頁;Khaja Kら、(2010)Comparison of Functional Protein Transduction Domains Using the NEMO Binding Domain Peptide.Pharmaceuticals 3:110〜124頁;May MJ、Marienfeld RB、及びGhosh S(2002)Characterization of the Ikappa B−kinase NEMO binding domain.J Biol Chem 277:45992〜6000頁;Peterson JMら、(2011)Peptide−based inhibition of NF−kappaB rescues diaphragm muscle contractile dysfunction in a murine model of Duchenne muscular dystrophy.Mol Med;Tilstra Jら、(2007)Protein transduction:identification,characterization and optimization.Biochem Soc Trans 35:811〜5頁参照)、これらの内容は全体が参照により本明細書に組み込まれている]。
細胞透過性NBDペプチドは、インビトロ結合アッセイ及び細胞ベースのアッセイ、並びにインビボ齧歯類モデルにおいて、NF−κBシグナル伝達及び炎症反応を阻害することが実証されている[(例えば、Dai Sら、(2004)The IkappaB kinase(IKK)inhibitor,NEMO−binding domain peptide,blocks osteoclastogenesis and bone erosion in inflammatory arthritis.J Biol Chem 279:37219〜22頁;Darwech Iら、(2009)Impediment of NEMO oligomerization inhibits osteoclastogenesis and osteolysis.J Cell Biochem 108:1337〜45頁;di Meglio Pら、(2005)Amelioration of acute inflammation by systemic administration of a cell−permeable peptide inhibitor of NF−kappaB activation.Arthritis Rheum 52:951〜8頁;Khaja Kら、(2010)Comparison of Functional Protein Transduction Domains Using the NEMO Binding Domain Peptide.Pharmaceuticals 3:110〜124頁;May MJ、Marienfeld RB、及びGhosh S(2002)Characterization of the Ikappa B−kinase NEMO binding domain.J Biol Chem 277:45992〜6000頁;Peterson JMら、(2011)Peptide−based inhibition of NF−kappaB rescues diaphragm muscle contractile dysfunction in a murine model of Duchenne muscular dystrophy.Mol Med;Tilstra Jら、(2007)Protein transduction:identification,characterization and optimization.Biochem Soc Trans 35:811〜5頁参照)、これらの内容は全体が参照により本明細書に組み込まれている]。
MCoTI−IIに移植されたNBD配列がNF−κBシグナル伝達を阻害する能力を依然として示すことを実証するために、本発明者らは細胞ベースのアッセイを利用した。HEK293細胞に、分泌アルカリホスファターゼ(SEAP)(発現が、5つのNF−κB部位を含有するELAM−1複合プロモーターの制御下にある)をコードするプラスミドpNiFty−SEAPをトランスフェクトした。TNFαによる細胞の処理は、IkBキナーゼ複合体の活性化を引き起こし、今度は、NF−κBがSEAP発現をもたらす。本発明者らは、NBDペプチドで処理したpNiFty−SEAPトランスフェクトHEK293細胞(図2;図3、パネルB)が、TNFα媒介SEAP発現の発現を約60μMのIC50で濃度依存的にブロックすることを確認した。対照としてのNBDペプチドの変異不活性形態は、TNFα媒介SEAP発現をブロックしなかった(図2)。細菌において生成された環状化NBD−MCoTI−II(データ不図示)又は自動合成により生成された直鎖状NBD−MCoTI−II(図2;図3パネルA)による細胞の処理は、TNFα媒介SEAP発現をブロックしたが、WT MCoTI−IIはブロックしなかった(図2)。この結果は、MCoTI−IIの骨格に移植されたNBD配列が、細胞に進入し細胞質におけるNF−κBシグナル伝達を阻害する能力を保持することを示している。最も重要には、直鎖状NBD−MCoTI−IIは、NBDペプチドより106倍強力な60pMのIC50でTNFα媒介SEAP発現をブロックした。最終的に、WT及びNBD−MCoTI−IIは、最大1μMの濃度で明らかな細胞毒性は引き起こさなかった。
NBD−MCoTI−IIはインビボで炎症反応を減少させる
直鎖状NBD−MCoTI−IIの抗炎症活性は、マウスCPEモデルにおいて2つの用量(5及び25μg/kg)でテストした。マウスに、左後足の足底下部領域にカラゲニン注射して浮腫を誘導する1時間前に、NBD−MCoTI−II、デキサメタゾン(10mg/kg)又は生理食塩水のどちらかを投与(腹腔内)した。次いで腫脹を、カラゲニン注射2、4、6及び12時間後に水置換方法により測定した。直鎖状NBD−MCoTI−IIは、4、6及び12時間での腫脹を著しく減少させた(図4)。12時間で、5及び25μg/kg NBD MCoTI−IIは、腫脹をそれぞれ30及び50%減少させた(図5)。比較として、5μg/kgのNBD−MCoTI−IIは、25mg/kgのNBDペプチドと同様の効果があり(図4、di Meglio Pら、(2005)Amelioration of acute inflammation by systemic administration of a cell−permeable peptide inhibitor of NF−κβ activation.Arthritis Rheum 52:951〜8頁、この内容は全体が参照により本明細書に組み込まれている)、直鎖状NBD−MCoTI−IIのインビボ効力がNBDペプチドに対して観察されたものより5000倍大きいことを示している(図5)。
直鎖状NBD−MCoTI−IIの抗炎症活性は、マウスCPEモデルにおいて2つの用量(5及び25μg/kg)でテストした。マウスに、左後足の足底下部領域にカラゲニン注射して浮腫を誘導する1時間前に、NBD−MCoTI−II、デキサメタゾン(10mg/kg)又は生理食塩水のどちらかを投与(腹腔内)した。次いで腫脹を、カラゲニン注射2、4、6及び12時間後に水置換方法により測定した。直鎖状NBD−MCoTI−IIは、4、6及び12時間での腫脹を著しく減少させた(図4)。12時間で、5及び25μg/kg NBD MCoTI−IIは、腫脹をそれぞれ30及び50%減少させた(図5)。比較として、5μg/kgのNBD−MCoTI−IIは、25mg/kgのNBDペプチドと同様の効果があり(図4、di Meglio Pら、(2005)Amelioration of acute inflammation by systemic administration of a cell−permeable peptide inhibitor of NF−κβ activation.Arthritis Rheum 52:951〜8頁、この内容は全体が参照により本明細書に組み込まれている)、直鎖状NBD−MCoTI−IIのインビボ効力がNBDペプチドに対して観察されたものより5000倍大きいことを示している(図5)。
NBD−MCoTI−IIは治療マウスCIAモデルにおける炎症反応を減少させる
次に本発明者らは、治療モードでのマウスCIAモデル(抗関節炎活性を評価するための標準モデル)において直鎖状NBD−MCoTI−IIの有効性をテストした。マウスにII型コラーゲンを注射した。CIAは、完全フロイントアジュバントと混合したII型コラーゲン(100μg)の尾注射によりオスDBA/1Jマウスにおいて誘導した。21日目に、コラーゲン(100μg)/不完全フロイントアジュバントのブースター注射(腹腔内)を投与した。関節炎の重症度(関節炎指標(AI))は次のように各足でスコア化した:0−紅斑及び腫脹の証拠なし、1−足中部(足根骨)又は足首関節に限局した紅斑及び軽度の腫脹、2−足首から足中部に広がる紅斑及び軽度の腫脹、3−足首から中足関節に広がる紅斑及び中程度の腫脹、並びに4−紅斑及び重度の腫脹が足首、足及び指を包含する。AIスコアを各足で測定し、合計した(マウス1匹当たり最大スコア16)。AIスコアが27日目に3.1の平均に達した後、マウスを3つの治療群に分け、毎日、生理食塩水、100μg/kg NBD−MCoTI−II及び3mg/kgデキサメタゾンを14日間投与(腹腔内)した。AIスコア、体重、足の厚み及び苦痛のいずれかの徴候を毎日モニターした。29日目までNBD−MCoTI−II(100μg/kg)は、陽性対照デキサメタゾンと同様に直ちに及び有意に(p<0.01)関節炎の進行を止めた(図6)。NBD−MCoTI−IIによる関節炎疾患進行の著しい阻害は、試験期間の間持続した。NBD−MCoTI−IIは、マウスCIAモデルにおける関節炎症状の改善において、PfizerのJAK 1/2阻害剤CP690550(Xeljanz(商標))及び抗TNF Ab対照と少なくとも同程度に有効であった(Milici AJら、(2008)Cartilage preservation by inhibition of Janus kinase 3 in two rodent models of rheumatoid arthritis, Arthritis Res Ther 10:R14参照)。最終的に、NBD−MCoTI−IIはCIAに伴う足の厚みの増大も有意に(p<0.01)ブロックした(図7)。該効果は試験期間中持続した。
次に本発明者らは、治療モードでのマウスCIAモデル(抗関節炎活性を評価するための標準モデル)において直鎖状NBD−MCoTI−IIの有効性をテストした。マウスにII型コラーゲンを注射した。CIAは、完全フロイントアジュバントと混合したII型コラーゲン(100μg)の尾注射によりオスDBA/1Jマウスにおいて誘導した。21日目に、コラーゲン(100μg)/不完全フロイントアジュバントのブースター注射(腹腔内)を投与した。関節炎の重症度(関節炎指標(AI))は次のように各足でスコア化した:0−紅斑及び腫脹の証拠なし、1−足中部(足根骨)又は足首関節に限局した紅斑及び軽度の腫脹、2−足首から足中部に広がる紅斑及び軽度の腫脹、3−足首から中足関節に広がる紅斑及び中程度の腫脹、並びに4−紅斑及び重度の腫脹が足首、足及び指を包含する。AIスコアを各足で測定し、合計した(マウス1匹当たり最大スコア16)。AIスコアが27日目に3.1の平均に達した後、マウスを3つの治療群に分け、毎日、生理食塩水、100μg/kg NBD−MCoTI−II及び3mg/kgデキサメタゾンを14日間投与(腹腔内)した。AIスコア、体重、足の厚み及び苦痛のいずれかの徴候を毎日モニターした。29日目までNBD−MCoTI−II(100μg/kg)は、陽性対照デキサメタゾンと同様に直ちに及び有意に(p<0.01)関節炎の進行を止めた(図6)。NBD−MCoTI−IIによる関節炎疾患進行の著しい阻害は、試験期間の間持続した。NBD−MCoTI−IIは、マウスCIAモデルにおける関節炎症状の改善において、PfizerのJAK 1/2阻害剤CP690550(Xeljanz(商標))及び抗TNF Ab対照と少なくとも同程度に有効であった(Milici AJら、(2008)Cartilage preservation by inhibition of Janus kinase 3 in two rodent models of rheumatoid arthritis, Arthritis Res Ther 10:R14参照)。最終的に、NBD−MCoTI−IIはCIAに伴う足の厚みの増大も有意に(p<0.01)ブロックした(図7)。該効果は試験期間中持続した。
直鎖状NBD−MCoTI−IIの有効性をさらに評価するために、本発明者らは、生理食塩水及びNBD−MCoTI−II(100μg/kg)で治療したCIAマウスの関節試験の組織病理学的分析を行った。生理食塩水で治療したマウスは、炎症、パンヌス、軟骨損傷及び骨吸収に関する測定可能なスコア(図8、パネルB)により示された著しい関節損傷を示した(図8、パネルA)。著しく対照的に、NBD−MCoTI−II(100μg/kg)によるCIAマウスの治療は、組織病理学的スコアによる関節損傷をゼロ又はほぼゼロで防いだ(図8、パネルA及びB)。
NBD−MCoTI−II対既存の抗関節炎薬の有効性を比較するために、本発明者らは、炎症、パンヌス、軟骨損傷及び骨吸収の個々のスコアから、それらを加算してCIAマウスの組織病理学的総合スコアを計算した。NBD−MCoTI−II(100μg/kg)の組織病理学的総合スコア対既存の抗関節炎薬エンブレル(商標)(15mg/kg)、オレンシア(商標)(5mg/kg)、ゼルヤンツ(商標)(10mg/kg)及びINCB028050(15/mg)の公表値の比較が図9に示されている。データは、生理食塩水で治療したCIAマウスの組織病理学的総合スコアのパーセントとして示される。図9は、NBD−MCoTI−IIが、既存の抗関節炎薬(例えば、Seeuws S.ら、(2010)A multiparameter approach to monitor disease activity in collagen−induced arthritis.Arthritis Res Ther 12:R160;Milici AJら、(2008)Cartilage preservation by inhibition of Janus kinase 3 in two rodent models of rheumatoid arthritis.Arthritis Res Ther 10:R14;及びFridman JSら、(2010)Selective inhibition of JAK1 and JAK2 is efficacious in rodent models of arthritis:preclinical characterization of INCB028050.J Immunol 184:5298〜307頁(これらの内容は全体が参照により本明細書に組み込まれている)に示されたエンブレル(商標)、オレンシア(商標)、ゼルヤンツ(商標)及びINCB028050に関するデータ)と比較して、組織病理学的総合スコアの著しい低下を示すことを示している。NBD−MCoTI−IIはほとんどゼロの組織病理学的総合スコアであったが、既存の抗関節炎薬は、組織病理学的総合スコアを約40〜60%低下させることができるのみであった。故に、直鎖状NBD−MCoTI−IIは関節損傷を防いだが、他の抗関節炎薬は関節損傷を低減することができるのみであった。
脾腫は関節炎を伴い、マウスCIAモデルにおいて観察されている[(例えば、Foell JLら、(2004)Engagement of the CD137(4−1BB)costimulatory molecule inhibits and reverses the autoimmune process in collagen−induced arthritis and establishes lasting disease resistance.Immunology 113:89〜98頁;及びLiu Yら、(2011)Therapeutic effects of TACI−Ig on collagen−induced arthritis by regulating T and B lymphocytes function in DBA/1 mice.Eur J Pharmacol 654:304〜14頁参照);これら各々の内容は全体が参照により本明細書に組み込まれている)]。本発明者らの試験において、生理食塩水治療CIAマウスは、平均重量が135±27mgの肥大した脾臓を有した(オスDBA/1Jマウスにおける正常な脾臓重量は約80mg)である[(例えば、Peterson Sら、(2011)Effects of Portabella mushrooms on collagen−induced arthritis、inflammatory cytokines、and body composition in dilute brown non−agouti(DBA1)mice.Functional Foods in Health and Disease 1:279〜296頁参照)、この内容は全体が参照により本明細書に組み込まれている]。NBD−MCoTI−II治療は、脾臓重量を100±17mgまで有意に(p<0.01)減少させた。
NBD−MCoTI−IIは、毒性又は苦痛の明白な徴候を示さなかった。マウス体重は、生理食塩水対照と比べて変わらなかった。一般的な血液化学検査、腎臓機能検査、肝臓酵素レベル(ALT、AST)及び血球数を含む臨床血液分析は、正常範囲内であった。腎臓、肝臓及び腸重量は正常範囲内であり、生理食塩水治療CIAマウスとNBD−MCoTI−II治療CIAマウスの間に差は観察されなかった。
本発明は、特定の好ましい実施態様に関してかなり詳細に記載されてきたが、他の実施態様が可能である。例えば、本方法について開示されたステップは限定を意図するものでもなく、各ステップが方法にとって必ず不可欠であることを示すものでもなく、代わりに例示的なステップのみである。したがって、添付の特許請求の範囲の範囲は、この開示に含有された好ましい実施態様の記載に限定されるべきではない。
本明細書の値の範囲の列挙は、該範囲内にある各別個の値に個別に言及する簡単な方法として役立つことが意図されるのみである。本明細書で特に指示がない限り、各別個の値は、本明細書に個別に列挙されているかのように本明細書に援用される。本明細書に引用された全ての参考文献は、全体が出典明示により援用される。
Claims (19)
- NBD又はその断片とMCoTI−I/II又はその断片とを含む融合タンパク質。
- 融合タンパク質がMCoTI−I/IIのループ6をNBD又はその断片と置換することにより形成される、請求項1の融合タンパク質。
- NBDが配列番号4により表される、請求項2の融合タンパク質。
- 融合タンパク質が直鎖状分子である、請求項2の融合タンパク質。
- 融合タンパク質が配列番号10により表される配列を有する、請求項4の融合タンパク質。
- 融合タンパク質が環状ペプチドである、請求項2の融合タンパク質。
- 融合タンパク質が配列番号9により表される、請求項2の融合タンパク質。
- NBDの断片が配列番号22により表される、請求項2の融合タンパク質。
- NBDの断片が配列番号23により表される、請求項2の融合タンパク質。
- NBD又はその断片が融合タンパク質のN末端にある、請求項2の融合タンパク質。
- NBD又はその断片が融合タンパク質のN末端の直ぐにはない、請求項2の融合タンパク質。
- 融合タンパク質が配列番号13〜21から成る群から選択される配列により表される、請求項10の融合タンパク質。
- 融合タンパク質が1つ以上のリンカーを含む、請求項1の融合タンパク質。
- 請求項1〜13のいずれかに記載の融合タンパク質と薬学的に許容可能な担体を含有する薬学的組成物。
- 被験者における炎症性疾患を治療するための請求項1〜13のいずれかに記載の融合タンパク質の使用。
- 被験者の医学的状態を治療するための請求項1〜13のいずれかに記載の融合タンパク質の使用であって、医学的状態が少なくとも一部は核内因子kB(NF−κβ)の活性化に起因する、使用。
- 医学的状態が、移植片対宿主疾患、敗血症、筋ジストロフィー、悪液質、心臓肥大、心臓虚血、再灌流傷害、脊髄損傷、及び癌から成る群から選択される、請求項16の融合タンパク質の使用。
- 被験者の炎症性疾患を治療する方法において、請求項1〜13のいずれかの融合タンパク質を含有する薬学的組成物の治療的有効量を前記被験者に投与することを含む、方法。
- 哺乳動物におけるNF−κβ経路の活性化を阻害する方法において、請求項14に記載の薬学的組成物の治療的有効量を哺乳動物に投与することを含む、方法。
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