ITRM20060518A1 - Derivati isoindolo-chinossalinici ad attivita' antitumorale procedimento per la loro produzione e loro uso - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE
“Derivati isoindolo-chinossalinici ad attività antitumorale, procedimento per la loro produzione e loro uso”
La presente invenzione riguarda nuovi derivati isoindolochinossalinici ad attività antitumorale, un procedimento per la loro produzione e il loro uso in campo medico. Più in particolare, l'invenzione concerne la sintesi e lo studio di derivati isoindolo[2,1-a]chinossalinici che hanno rivelato una potente attività antitumorale in vitro, e vengono quindi proposti per la produzione di farmaci da impiegare nella terapia dei tumori, sia da soli che in combinazione con altri chemioterapici.
Come è noto, il DNA rappresenta uno dei più importanti bersagli per numerosi agenti chemioterapeutici. In modo specifico, tra le molecole antitumorali note sono ampiamente diffusi, ad esempio, gli agenti alchilanti, che possono modificare non selettivamente il DNA e l'RNA delle cellule, e gli antimetaboliti, che mimando le basi del DNA e altre molecole naturali interferiscono con la sintesi degli acidi nucleici, delle proteine e con altri processi metabolici vitali, agendo come antagonisti e inibitori. Le molecole policicliche azotate a struttura planare possono agire come farmacoforì per determinate classi di farmaci antineoplastici, perché possono intercalarsi tra le coppie di basi della doppia elica del DNA. Molecole antitumorali ben note come le acridine, le amsacrine, le antracicline, caratterizzate da sistemi policiclici planari, sono in grado di interferire con gli enzimi che elaborano il DNA (topoisomerasi I e II) mediante la formazione di complessi ternari tra il farmaco, il DNA e l’enzima.
Le chinossaline o 1 ,4-benzodiazine, composti biciclici aromatici contenenti due atomi di azoto, e i chinossalinoni ad esse strutturalmente correlati, rappresentano un’importante classe di composti eterociclici che si trovano in un gran numero di agenti biologicamente e farmacologicamente attivi, e molti di essi hanno dimostrato, a vari livelli sperimentali, attività antineoplastica. Ad esempio, la domanda di brevetto internazionale pubbl. No. WO 94/13647 (cessionaria The Du Pont Merck Pharmaceutical Co.) concerne una classe di esteri di acidi chinossalinossi-fenossipropanoici che risultano attivi come agenti antineoplastici in base a sperimentazioni in vivo in modelli animali. Ancora nel campo delle strutture aromatiche bicicliche, Lawrence et al. (Lawrence, D.S.; Copper, J.E.; Smith, C.D. Structure-activity Studies of Substituted Quinoxalinones as Multiple-Drug-Resistance Antagonists. J. Med. Chem.
2001, 44, 594-601) presentano una classe di fenossimetil-chinossalinoni sostituiti che hanno mostrato un eccellente antagonismo alla P-glicoproteina (una proteina di trasporto la cui sovraespressione può mediare la resistenza ai farmaci) e alla MRP1 (multidrug-related resistance protein 1 , una ulteriore proteina di trasporto che ha diverse caratteristiche in comune con la P-glicoproteina) in linee cellulari resistenti ai farmaci.
Passando alle strutture tricicliche, ad esempio, alcuni piridochinossalinoni funzionalizzati si sono dimostrati attivi nella valutazione in vitro dell'attività antimicrobica nei confronti di un ampio spettro di microrganismi, e uno di essi ha mostrato una promettente attività antitumorale in vitro (Carta, A. et al. Novel functionalized pyrido[2,3-g]quinoxalinones as antibacterial, antifungal and anticancer agents, Il Farmaco, 2001, 56, 933-938). Analogamente, alcune pirrolo[1 ,2-a]chinossaline sono risultate dotate di una potente attività antiproliferativa su linee cellulari derivate da tumori ematologici e solidi (Alleca S. et al Quinoxaline chemistry. Part 16. 4-Substituted anilino and 4-substituted phenoxymethyl pyrrolo[1,2-a]quinoxalines and N-[4-(pyrrolo[1 ,2-a]quinoxalin-4-yl)amino and hydroxymethyl]benzoyl glutamates. Synthesis and evaluation of in vitro biological activity. Il Farmaco, 2003, 58, 639-650).
Le imidazo-chinossaline sono state studiate da Chen e coll., che hanno riportato per una classe di anilino-imidazo[1,5-a]chinossaline una eccellente attività enzimatica nell'inibizione dell'enzima Lek (IC50<5 nM) e della proliferazione di cellule T, attività che è indicata per il trattamento di malattie autoimmuni e infiammatorie mediate da cellule T (Chen P. et. al, Synthesis and SAR of Novel Imidazoquinoxaline-Based Lek Inhibitors: Improvements of Celi Potency, Bioorg. Med. Chem. Leti., 2002, 12, 3153-3156). Come ulteriore esempio di composti azotati triciclici che sono stati proposti per la terapia antiproliferativa, la domanda di brevetto internazionale pubbl. No. WO 2004/085439 (cessionaria Pfizer Products Ine.) concerne una classe di triazolo-chinossaline sostituite (in modo specifico, 4-ammino[1,2,4]triazolo[4,3-a]chinossaline, che sono risultate attive come inibitori delle glicogeno-sintasi chinasi-3 (GSK-3) e quindi, come tali, potenzialmente utili per il trattamento di varie patologie tra cui le patologie tumorali.
Anche derivati chinossalinici tetraciclici sono stati sintetizzati e studiati neil'ambÌto delle ricerche su composti ad attività antineoplastica. In particolare il sistema chinossalinico condensato con gruppi piridinici ha portato a benzo[/]pirido[4,3-ò]chinossaline e a benzo[f]pirido[3,4-b]chinossaline, che si sono dimostrate attive come inibitori delle topoisomerasi I e II, ed hano significative proprietà antitumorali (Nguyen, C.H. et al., Synthesis and biologica! evaluation of amino-substituted benzo[fpyrido[4,-b] and pyrido[3,4-b]quinoxalines: a new class of antineoplastic agents. Anti-Cancer Drug Design, 1995, 10, 277-297). Infine , le bromoindolo-chinossaline sostituite nell’azoto indolico (2-bromoindolo[3,2-b]chinossaline 5-sostituite) hanno mostrato un ampio spettro di attività antitumorale, con valori medi di Gl50, TGl, e LC50di 14,2, 31,6 e 66,2 μΜ rispettivamente. Inoltre, tali composti sono risultati attivi sia nell’inibizione della cdc2 chinasi che nell'inibizione della cdc25 fosfatasi, con IC50di 70 e 25 μM rispettivamente (Abadi A.H. 5-Substituted 2-Bromoindolo[3,2-b]quinoxalines. A Class of Potential Antitumor Agents with cdc25 Phosphatase Inhibitory Properties. Arch. Pharm. Pharm. Med. Chem., 1998, 331, 352-358).
Nell’ambito della ricerca su strutture eterocicliche a più anelli condensati contenenti porzioni pirroliche o indoliche che fossero dotate di attività antineoplastica, condotta dal gruppo di ricerca degli attuali inventori, sono state studiate, ad esempio, la sintesi e le proprietà antimicrobiche e antiproliferative di indolo-cinnoline e di indolo-benzotrioazine, strutture tetracicliche planari, e di pirrolo-tetrazinoni, strutture bicicliche che possiedono lo stesso scheletro dei due agenti antitumorali noti temozolomide e mitozolomide (si vedano, ad esempio, Barraja, P. et al., lndolo[3,2-b]cinnolines with antiproliferative, antifungal and antibacterial activity. Bioorg. Med. Chem., 1999, 7, 1591-1596; Cirrincione, G. et al., Derivatives of thè New Ring System lndolo[1,2-c]benzo [1,2,3]triazine, with Potent Antitumor and Antimicrobal Activity. J.Med Chem., 1999, 42, 2561-2568; Diana, P. et al., Pyrrolo[2,1-d][1 ,2,3,5] tetrazine-4(3H)-ones. New class of azolo-tetrazinones with potent antitumor activity. Bioorg. Med. Chem., 2003, 11, 2371-2380). Nella linea di tale ricerca si è quindi preso in considerazione il sistema isoindolochinossalinico, e in particolare si è studiata la sintesi di nuovi derivati isoindolo-chinossalinici, con lo scopo di valutare la loro potenziale attività antiproliferiativa e i loro bersagli a livello cellulare e molecolare. Scopo della presente invenzione è pertanto quello di fornire nuovi agenti antineoplastici che siano dotati di una notevole attività sul più ampio campo possibile di tipi tumorali e la cui sintesi sia semplice da realizzare e al tempo stesso economica in relazione alle materie prime necessarie.
Secondo l'invenzione è stato trovato che una classe di nuovi derivati isoindolo[2,1-a]chinossalinici, che possono essere sintetizzati con ottime rese e con semplici reazioni a partire da specifici intermedi noti in letteratura, i 2-(2’-amminoaril)-1-ciano-isoindoli (Diana, P. et al., 19<th>I.C.H.C. Aug 2003, p. 284) possiedono una notevole attività antitumorale, che è stata dimostrata in vitro mediante uno screening primario su un panel di tre linee cellulari tumorali appositamente prescelte (carcinoma polmonare a cellule non piccole, carcinoma mammario e tumore del SNC) ed è stata poi confermata attraverso uno screening in vitro completo contro circa 60 diverse linee cellulari tumorali, appartenenti a diversi tipi di tumori, sia ematologici che solidi.
Formano pertanto oggetto specifico della presente invenzione composti isoindolo-chinossalinici di formula generale (1):
in cui:
R rappresenta H o OH e
R5rappresenta H o CN,
R1, R2, R3e R4sono scelti, ognuno indipendentemente dall'altro, tra H,
un gruppo alchilico, alcossilico, alchenilico o alchinilico con fino a 12 atomi di carbonio,
un gruppo aromatico o aralchilico, isociclico o eterociclico, con fino a 12 atomi di carbonio,
un atomo di alogeno,
detti gruppi essendo eventualmente sostituiti con uno o più gruppi scelti tra ORa, CN, COORa, NO2, alogeni, NRaRb, in cui
Rae Rbsono indipendentemente scelti dal gruppo consistente in H, alchile, alchenile o alchinile lineari, ramificati o ciclici con fino a 12 atomi di carbonio, arile, eterociclo con fino a 12 atomi di carbonio.
Nel caso specifico in cui, nella formula (1) che precede, R rappresenta OH e R5rappresenta H, i composti secondo l'invenzione possono essere rappresentati da una o l’altra delle due strutture limite di formula (2') e (2"):
In questo caso, secondo alcune forme di realizzazione preferite dell'invenzione, R1,R2,R3e R4possono essere scelti, ognuno indipendentemente dall’altro, tra H, un gruppo alchilico con fino a 6 atomi di carbonio, un gruppo alcossilico con fino a 6 atomi di carbonio e un atomo di alogeno. Un sottogruppo particolarmente studiato di composti secondo questa forma di realizzazione preferita è quello in cui Ri rappresenta idrogeno o metile, R4rappresenta idrogeno, R2e R3sono scelti indipendentemente tra idrogeno, metile, metossile e cloro.
Appartiene a tale sottogruppo il composto isoindolo-chinossalinico di formula (2a):
che si è dimostrato , nella sperimentazione condotta nel quadro della presente invenzione , quello con la migliore attività antitumorale in vitro tra i composti esaminati. Altri composti preferiti, che pure sono risultati attivi nell'inibire la crescita delle cellule tumorali utilizzate per la sperimentazione, sono quelli rappresentati dalle seguenti formule:
Nell’ulteriore caso specifico in cui, nella formula (1) che precede, R rappresenta H e R5rappresenta CN, i composti secondo l'invenzione sono descritti dalla formula generale (3):
Tra i composti di formula (3) un sottogruppo preferito è costituito d quelli in cui R1, R2, R3e R4sono scelti, indipendentemente uno dall'altro, tra H, un gruppo alchilico con fino a 6 atomi di carbonio, un gruppo alcossilico con fino a 6 atomi di carbonio e un atomo di alogeno. In modo ancora più specifico, un gruppo preferito di composti di formula (3) è quello in cui Ri rappresenta idrogeno o metile, R4rappresenta idrogeno, R2e R3sono scelti indipendentemente tra idrogeno, metile, metossile o cloro.
Alla precedente definizione rispondono, in particolare, i derivati isoindolo-chinossalinici aventi una delle seguenti formule:
Come già notato, i derivati isoindolo[2,1-a]chinossalinici dell'invenzione sono stati sintetizzati a partire da intermedi chiave, i 2-(2’-amminofenil)-1-ciano-isoindoli di formula (4)
In letteratura, soltanto due derivati isoindolo[2,1-a]chinossalinici erano stati ottenuti come composti indesiderati nel corso del tentativo di sintetizzare il sistema benzoimidazo[2,1-a]isochinolinico (Dyker, G. et al. Oxidative Heterocyclization of 2-Alkylylbenzaldehydes with 1,2-Phenyiendiamine. Eur. J. Org. Chem. 2000, 1433-1441). In tale occasione, la reazione di 2-alchinil-arilaldeidi con o-fenilendiammina aveva dato come risultato una miscela inseparabile del sistema desiderato, benzoimidazo-isochinolinico, e delle isoindolo[2,1-a]chinossaline indesiderate.
Secondo la procedura sintetica proposta per la presente invenzione, le isoindolo-chinossaline di formula (2) [cioè 2' o 2"] possono esere preparate per reazione dei corrispondenti intermedi isoindolici di formula (4) (2-(2'-amminofenil)-1-ciano-isoindoli) con acido acetico. In particolare, il riscaldamento a riflusso dei composti di formula (4) in cui R1-R4rappresentano i gruppi desiderati nel composto finale, in acido acetico, causa la reazione del gruppo amminico con il gruppo carbonitrile, dando origine alla formazione dell'anello chinossalinico. L’idrolisi in situ della funzione imminica formatasi risulta nei corrispondenti isoindolo-chinossalinoni di formula (2’) (isoindolo[2,1-a]chinossalin-6-(5H)oni) con rese eccellenti.
Sempre a partire dagli intermedi di formula (4) recanti le funzioni R1-R4desiderate nel prodotto finale, i composti isoindolo-chinossalinici secondo l'invenzione che rientrano nella formula (3) (11-cianoisoindolo[2,1-a]chinossaline) possono essere preparati altrettanto semplicemente e con ottime rese per reazione di detti intermedi, sempre sotto riscaldamento (ad esempio a riflusso), con acido formico.
La produzione degli intermedi di formula (4) è a sua volta possibile attraverso una sintesi di StrecKer tra le o-fenilendiammine di formula (5):
in cui i sostituenti R1-R4rappresentano gli stessi gruppi della corrispondente formula (1), e la ftalodicarbossialdeide di formula (6):
(6)
La reazione viene condotta in acqua e in presenza di cianuro di potassio e idrogenosolfito di sodio. Tale reazione, quando condotta con la 3-metil-o-1,2-fenilendiammina (composto di formula (5) con R1= Me e R2= R3= R4= H) ha dato, come prodotto di formula (4) oltre all'intermedio desiderato, anche l'isomero 1-ciano-2-(2’-ammino-6’-metil-fenil-isoindolo). Invece, nel caso della 3-metossi-o-1,2-fenilendiammina (composto di formula (5) con Ri = OMe e R2= R3= R4= H) è stato ottenuto soltanto l’intermedio di formula (4) con R2= OMe, a causa dell'aumentata reattività del gruppo amminico posto in para- rispetto al sostituente metossilico.
Costituisce pertanto ulteriore oggetto dell'invenzione un procedimento per la preparazione dei composti isoindolo-chinossalinici di formula (1), come sopra definita, comprendente la fase di far reagire un intermedio della formula generale (4), sopra illustrata, in cui R1, R2, R3e R4hanno il significato già enunciato, con acido acetico, oppure con acido formico, sotto riscaldamento.
Secondo alcune forme di realizzazione preferite dell’invenzione, quando il procedimento proposto è indirizzato alla produzione dei composti isoindolo-chinossalinici di formula (2'), esso comprende la fase di far reagire un intermedio della formula generale (4) con acido acetico a riflusso. Preferibilmente, al termine di detta reazione con acido acetico la miscela di reazione viene rapidamente raffreddata e il precipitato risultante, contenente il composto di formula (2’) desiderato, viene raccolto per filtrazione.
Secondo altre forme di realizzazione dell'invenzione, in cui il procedimento proposto è finalizzato alla produzione dei composti isoindolo-chinossalinici di formula (3), esso comprende la fase di far reagire un intermedio della formula generale (4) con acido formico a riflusso. Anche in questo caso, preferibilmente, al termine della reazione la miscela ottenuta viene rapidamente raffreddata e il precipitato risultante, contenente il composto di formula (3) desiderato, viene raccolto per filtrazione.
Secondo un suo diverso aspetto, l’invenzione ha anche ad oggetto l’uso di uno 0 più composti isoindolo-chinossalinici di formula generale (1), come sopra definita, per la produzione di un preparato farmaceutico, più in particolare un preparato ad attività antitumorale. in base ad alcune forme di realizzazione specifiche dell'invenzione, gli uno o più composti isoindolo-chinossalinici utilizzati sono composti di formula generale (2’) o (2"), mentre in base ad altre forme di realizzazione della stessa invenzione gli uno o più composti isoindolo-chinossalinici utilizzati sono composti di formula generale (3).
Costituisce ulteriore oggetto della presente invenzione un preparato farmaceutico comprendente come principio attivo almeno uno dei composti isoindolo-chinossalinici di formula generale (1), assieme ad uno o più coadiuvanti e/o veicoli farmacologicamente accettabili. In maniera particolarmente preferita il preparato comprende come principio attivo un composto isoindolo-chinossalinico di formula generale generale (2’) o (2").
Come sarà illustrato dettagliatamente nel seguito, uno dei composti di formula (2) secondo l’invenzione ha mostrato un valore di Gl50(inibizione della crescita) a livello nanomolare nei confronti del 88% delle circa 60 linee cellulari tumorali umane in tutti i nove subpanel del test applicato: leucemia, tumore polmonare a cellule non piccole, tumore dei colon; tumore del SNC, melanoma; carcinoma ovarico, tumore renale, carcinoma prostatico, carcinoma mammario.
I preparati farmaceutici adatti per la somministrazione, a scopo terapeutico, degli agenti isoindolo-chinossalinici secondo l’invenzione possono essere formulati secondo tecniche convenzionali note agli esperti del settore, mediante l’uso di eccipienti e veicoli farmaceuticamente accettabili, in modo da ottenere preparati adatti per iniezione parenterale (endovenosa, intramuscolare o sottocutanea), per somministrazione orale in forma solida o liquida, per somministrazione transdermica, rettale, intravaginale o locale, ad esempio sulle mucose del cavo oronasale, e simili.
La percentuale di composto attivo nella composizione e il metodo per trattare i tumori possono essere variati in modo da ottenere un dosaggio ottimale. Il dosaggio da somministrare tiene normalmente in considerazione i seguenti fattori: la via di somministrazione, la durata del trattamento, il peso e le condizioni del paziente, l'efficacia del composto attivo e la responsività del paziente.
Una volta determinato il corretto dosaggio dei principio attivo, la formulazione e la scelta di eccipienti e coadiuvanti adatti ad ogni singola esigenza possono essere fatte sulla base delle comuni conoscenze del settore.
Le caratteristiche specifiche dell'invenzione, così come i vantaggi delia stessa sia in termini di sintesi dei derivati proposti che in termini della loro attività biologica e farmacologica, risulteranno più evidenti con riferimento alla descrizione dettagliata presentata a titolo meramente esemplificativo nel seguito, assieme ai risultati delle sperimentazioni effettuate su di essa. Alcuni risultati sperimentali sono anche illustrati nei disegni allegati, in cui:
la Figura 1 mostra l’effetto del derivato isoindolo-chinossalinico (2a) secondo l’invenzione sull’aggregazione dei microtubulì: tubulina purificata è stata incubata in assenza o in presenza del composto in studio alle concentrazioni indicate, ed è stato rilevato l’andamento nel tempo della fluorescenza, dovuta all’incorporazione di un reporter fluorescente nei microtubuli nel corso della polimerizzazione della tubulina; e
la Figura 2 mostra l’effetto di concentrazioni crescenti del derivato isoindolo-chinossalinico (2a) secondo l'invenzione sul rilassamento del DNA del plasmide pBR322 da parte di topoisomerasi I umana, rilevato per mezzo di elettroforesi su gel di agarosio con (sezione A) o senza (sezione B) bromuro di etidio. (Sc: supercoiled, Rel: relaxed, Nick: nicked).
Per quanto riguarda la sintesi, come già notato, tutti i derivati isoindolo-chìnossalinici descrìtti nel seguito sono stati ottenuti a partire da intermedi di formula (4), i quali a loro volta erano ottenibili a partire dai due composti di partenza delle formule (5), o-fenilendiammina opportunamente sostituita, e (6) ftalodicarbossialdeide. Nella sperimentazione chimica illustrata di seguito tutti i punti di fusione sono stati presi con un apparato capillare Buchi-Tottoli; gli spettri IR sono stati determinati in bromoformio con uno spettrofotometro Jasco FT/IR 5300; gli spettri 1H and<13>C NMR sono stati misurati a 200 e 50,3 MHz rispettivamente, impiegando uno spettrometro Bruker serie AC 200 MHz (TMS come riferimento interno). La cromatografia su colonna è stata eseguita con gel di silice Merck 230-400 Mesh ASTM o con apparato Sepacore Buchi. Le analisi elementari erano nel campo ±0.4% dei valori teorici.
ESEMPIO 1
lsoindolo[2.1 -a]chinossalin-6-(5H)one (2b) Preparazione dell'intermedio di formula (4): 1-ciano-2-(2<,>-amminofenil)-isoindolo
Ad una soluzione di 1,56 g (0,015 mol) di idrogenosolfito di sodio in acqua (38 mi) è stata aggiunta ftalodicarbossialdeide (6) (2 g, 0,015 mol). La miscela è stata tenuta sotto agitazione fino a dissoluzione del solido ed è stata poi aggiunta la o-fenilendiammina di formula (5), in cui tutti i sostituenti R1-R4rappresentano idrogeno (0,015 mol), e la reazione è stata tenuta sotto riscaldamento su un bagno di vapore acqueo per 30 min. Quindi è stato aggiunto KCN (3,39 g, 0,052 mol) in acqua (8,0 mi) e la miscela è stata riscaldata per ulteriori 90 min.
La miscela di reazione è stata poi raffreddata e il solido formato è stato filtrato e purificato per cromatografia.
1-ciano-2-(2’-amminofenil)-isoindolo
Il composto è stato purificato per flash-cromatografia utilizzando diclorometano come eiuente a dare un solido: resa 65%; p.f. 150-151°C;
IR 3473, 3363 (NH2), 2202 (CN) cm<-1>;<1>H NMR (DMSO-d6) δ 5.19 (s, 2H, NH2), 6.70 (t, 1H, J=7.2 Hz, H-5’), 6.94 (d, 1H, J=7.2 Hz, H-3’), 7.15-7.19 (m, 3H, H-4’, H-5 e H-6’), 7.31 (t, 1H, J=8.2 Hz, H-6), 7.66 (d, 1H, J=8.2 Hz, H-4), 7.78 (d, 1H, J=8.2 Hz, H-7), 7.86 (s, 1H, H-3);<13>C NMR (DMSO-de) δ 93.9 (s), 114.0 (s), 115.8 (d), 116.1 (d), 117.5 (d), 121.5 (d), 122.2 (d), 122.4 (d, C-7), 122.5 (s), 124.1 (s), 125.5 (d), 127.8 (d), 130.4 (d), 131.2 (s), 144.1 (s). Anal. (C15H1N3) C, H, N.
Isoindolo[2,1 -a]chinossalin-6-(5H)one (2b)
L’intermedio 1-ciano-2-(2’-amminofenil)-isoindolo ottenuto dalla fase precedente (3 mmoli) è stato disciolto in acido acetico (10 ml) e tenuto a riflusso per 30 min. La miscela di reazione è stata versata in acqua ghiacciata (150 ml) e il precipitato risultante è stato raccolto per filtrazione e cristallizzato da etanolo.
Resa 99%; p.f. 255-256°C;
IR; 3390, 3203 (NH), 1685 (CO) cm<-1>;<1>H NMR (DMSO-d6) δ 7.75 (t, 1H, J=7.0 , 1.6 Hz, H-2), 7.78-7.91 (m, 2H, H-3 e l-M), 7.93 (s, 1H, H-11), 7.96 (t, 1H, J=7.8 Hz, H-9), 8,00 (t, 1H, J=7.8 Hz, H-8), 8.27 (dd, 1H, J=7.0, 1.6 Hz, H-1), 8.34 (d, 1H, J=7.8 Hz, H-10), 8.84 (d, 1H, J=7.8 Hz, H-7), 12.35 (bs, 1H, NH);<13>C NMR (DMSO-de) δ 124.1 (d), 127.0 (d), 127.5 (d), 127.8 (d), 127.9 (d), 128.9 (d), 130,9 (d), 131.4 (d), 133.1 (s), 133.4 (d), 135.3 (s), 138.9 (s), 141.0 (s), 143.9 (s), 161.7 (s). Anai. (C15H10N2O) C, H, N.
ESEMPIO 2
4-metil-isoindolo[2, 1 -a]chinossalin-6-(5H)one (2c) La preparazione dell'ntermedio di formula (4): 1-ciano-2-(2’-ammino-3’-metil-fenil)-isoindolo è stata eseguita come nell'Esempio 1 , con la differenza che la o-fenilendiammina di formula (5), era una metilfenilendiammina (Ri = Me).
1 -ciano-2-(2’-ammino-3’-metil-fenil)-isoindolo (4b)
Il composto è stato purificato con l’apparato Sepacore Buchi utilizzando diclorometanoicicloesano (7:3) come eluente a dare il composto 4b: resa 40%; p.f. 62-63°C;
IR 3481, 3388 (NH2), 2200 (CN) cm<'1>; NMR (CDCI3) δ 2.25 (s, 3H, CH3), 3.55 (s, 2H, NH2), 6.80 (t, 1H, J=7.6 Hz, H-5'), 7.10 (d, 1H, J-7.6 Hz, H-6’), 7.14 (d, 1H, J=7.6 Hz, H-4’), 7.23 (t, 1H, J=8.1 Hz, H5), 7.31 (t, 1H, J=8.1 Hz, H-6), 7.44 (s, 1H, H-3), 7.69 (d, 1H, J=8.1 Hz, H-4), 7.73 (d, 1H, J=8.1 Hz, H-7);<13>C NMR (CDCI3) δ 17.6 (q), 92.2 (s), 113.0 (s), 117.9 (d), 118.3 (d), 120.5 (d), 120.9 (d), 123.2 (d), 123.8 (s), 124.1 (s), 124.6 (s), 125.5 <d), 125.9 (d), 131.8 (s), 131.9 (d), 140.5 (s). Anal. (CI6HI3N3) C, H, N.
4-metil-isoindolo[2,1-a]chinossalin-6-(5H)one (2c)
L’intermedio ottenuto dalla fase precedente è stato trattato con acido acetico come nell’Esempio 1.
Resa 98%; p.f. 338-339°C;
IR: 3360, 3284 (NH), 1632 (CO) cm<1>;<1>H NMR (DMSO-d6) δ 2.62 (s, 3H, CH3), 7.32-7.40 (m, 2H, H-9 e H-3), 7.45 (t, 1H, J=6.8 Hz, H-2), 7.51 (t, 1H, J=8.8 Hz, H-8), 7.96 (d, 1H, J=8.8 Hz, H-10), 8.27 (d, 1H, J=6.8 Hz, H-1), 8.47 (d, 1H, J=8.8 Hz, H-7), 9.24 (s, 1H, H-11), 12.53 (bs, IH, NH);<13>C NMR (DMSO-d6) δ 17.8 (q), 104.8(s), 114.8 (d), 117.3 (d), 119.2 (d), 121.5 (d), 122.3 (s), 125.0 (d), 125.1 (s), 125.2 (d), 125.3 (s), 127.1 (d), 127.3 (s x2), 130.0 (d), 147.0 (s). Anal. (C16H12N20) C, H, N.
ESEMPIO 3
3-metossi-isoindolo[2.1-a]chinossalin-6-(5H)one (2a) La preparazione dell’intermedio di formula (4): 1-ciano-2-(2’-ammino-4’-metossi-fenil)-isoindolo è stata eseguita come nell’Esempio 1, con la differenza che la o-fenilendiammina di formula (5), era una metossi-fenilendiammina (R2= OMe).
1 -cìano-2-(2’-ammino-4’-metossi-fenil)-isoindolo (4c)
il composto è stato purificato per flash-cromatografia utilizzando diclorometano come eluente a dare un solido: resa 95%; p.f. 116-117<º>C;
IR 3465, 3375 (NH2), 2198 (CN) cm<-1>; NMR (CDCI3) 6 3.64 (bs, 2H, NH2), 3.80 (s, 3H, CH3), 6.38 (bs, 1H, H-3’), 6.42 (d, 1H, J=7.9 Hz, H-5'), 7.12 (d, 1H, J=7.9 Hz, H-6’), 7.14 (t, 1H, J=8.6 Hz, H-5), 7.29 (t, 1H, J=8.6 Hz, H-6), 7.41 (s, 1H, H-3), 7.66 (d, 1H, J=8.6 Hz, H-4), 7.70 (d, 1H, J=8.6 Hz, H-7);<13>C NMR (CDCI3) δ 55.4 (q), 95.4 (s), 101.4 (d), 104.5 (d), 113.9 (s), 117.5 (s), 118.2 (d), 120.8 (dx2), 123.1 (d), 124.5 (s), 125.8 (d), 128.7 (d), 131.7 (s), 143.3 (s), 161.5 (s). Anal. (CI6H13N30) C, H, N.
3-metossi-isoindolo[2,1-a]chinossalin-6-(5H)one (2a) L'intermedio ottenuto dalla fase precedente è stato trattato con acido acetico come nell’Esempio 1.
Resa 75%; p.f. 293-294<º>C;
IR: 3363, 3280 (NH), 1635 (CO) cm<'1>;<1>H NMR (DMSO-d6) δ 3.84 (3H, s, CH3), 7.04 (s, 1H, H-4), 7.05 (d, 1H, J=9.8 Hz, H-2), 7.40 (t, 1H, J=7.8 Hz, H-9), 7.51 (t, 1H, J=7.8 Hz, H-8), 7.95 (d, 1H, J=7.8 Hz, H-10), 8.36 (d, 1H, J=9.8 Hz, H-1), 8.51 (d, 1H, J=7.8 Hz, H-7), 9.18 (s, 1H, H-11), 13.50 (bs, 1H, NH);<13>C NMR (DMSO-ds) δ 55.7 (q), 101.5 (d), 104.6 (s), 112.7 (d), 115.7 (d), 116.2 (s), 118.2 (d), 119.1 (d), 120.9 (d), 124.3 (d), 124.4 (s), 126.2 (d), 126.6 (s), 128.5 (s), 147.1 (s), 158.9 (s). Anal. (C16Hi2N202) C, H, N.
ESEMPIO 4
2.3-dimetil-isoindolo[2.1-a]chinossalin-6-(5H)one (2d) La preparazione dell’intermedio di formula (4): 1-ciano-2-(2’ammino-4',5’-dimetil-fenil)-isoindolo è stata eseguita come nell’Esempio 1, con la differenza che la o-fenilendiammina di formula (5), era una dimetil-fenilendiammina (R2= R3= Me).
1 -ciano-2-(2’-ammino-4<,>,5<,>-dimetilfenil)-isoindolo (4d)
Il composto è stato purificato per flash-cromatografia utilizzando diclorometano come eluente a dare un solido: resa 85%; p.f. 119-120°C;
IR 3465, 3375 (NH2), 2202 (CN) cm<-1>; NMR (CDCI3) δ 2.17 (s, 3H, CH3), 2.22 (s, 3H, CH3), 3.44 (s, 2H, NH2), 6.64 (s, 1H, H-3’), 6.95 (s, 1H, H-6'), 7.12 (t, 1H, J=7.6 Hz, H-5), 7.27 (t, 1H, J=7.6 Hz, H-6), 7.38 (s, 1H, H-3), 7.64 (d, 1H, J=7.6 Hz, H-4), 7.68 (d, 1H, J=7.6 Hz, H-7);<13>C NMR (CDCI3) δ 18.6 (q), 19.7 (q), 95.1 (s), 114.0 (s), 118.1 (d), 118.2 (d), 120.6 (d), 120.9 (d), 121.8 (s), 123.1 (d), 124.5 (s), 125.8 (d), 127.0 (s), 128.2 (d), 131.7 (s), 139.6 (s), 139.7 (s). Anal. (C17H15N3): C, H, N.
2,3-dimetil-isoindolo[2,1 -a]chinossalin-6-(5H)one (2d)
L'intermedio ottenuto dalla fase precedente è stato trattato con acido acetico come nell’Esempio 1.
Resa 96%; p.f. 370-371 °C;
IR: 3365, 3286 (NH), 1631 (CO) cm<'1>;<1>H NMR (DMSO-d6) δ 2.30 (3H, s, CH3), 2.35 (3H, s, CH3), 7.31 (s, 1H, H-4), 7.46 (t, 1H, J=7.8 Hz, H-9), 7.57 (t, 1H, J=7.8 Hz, H-8), 8.00 (d, 1H, J=7.8 Hz, H-10), 8.09 (s, 1H, H-1), 8.41 (d, 1H, J=7.8 Hz, H-7), 9.02 (s, 1H, H-11), 13.14 (bs, 1H, NH);<13>C NMR (DMSO-d6) δ 19.5 (q), 19.6 (q), 116.7 (d), 117.4 (d), 118.7 (s), 119.1 (d), 119.6 (d), 121.0 (s), 122.0 (d), 125.3 (s), 125.4 (d), 125.8 (s), 127.6 (d), 127.9 (s), 135.9 (s), 139.0 (s), 147.2 (s). Anal. (C17H14N2O)C,H,N.
ESEMPIO 5
2.3-dicloro-isoindolo[2.1-a]chinossalin-6-(5H)one (2e) La preparazione dell’intermedio di formula (4): 1-ciano-2-(2’-ammino-4'5’-dicloro-fenil)-isoindolo è stata eseguita come nell'Esempio 1, con la differenza che la o-fenilendiammina di formula (5), era una dicloro-fenilendiammina (R2= R3= CI), e che in questo caso tale reagente è stato prima disciolto in DMF (15ml) e poi aggiunto alla miscela di reazione.
1 -ciano-2- -ammino-4,5’-diclorofenil)soindolo (4e)
Il composto è stato purificato per flash-cromatografia utilizzando diclorometano come eluente a dare un solido: resa 77%; p.f. 71-72<º>C;
IR 3394, 3340 (NH2), 2200 (CN) cm<-1>;<1>H NMR (DMSO-d6) δ 5.75 (2H, s, NH2), 7.12 (1 H, s, H-3'), 7.16 (1H, t, J=8.4 Hz, H-5), 7.32 (1 H, t, J=8.4 Hz, H-6), 7.58 (1H, s, H-6’), 7.66 (1H, d, J=8.4 Hz, H-4), 7.78 (1H, d, J=8.4 Hz, H-7), 7.91 (1H, s, H-3);<13>C NMR (DMSO-d6) δ 94.0 (s), 113.8 (s), 115.8 (s), 116.2 (d), 117.5 (d), 121.6 (d), 121.7 (s), 122.4 (d), 122.6 (d), 124.2 (e), 125.8 (d), 129.6 (d), 131.2 (s), 132.9 (s), 144.7 (s). Anal. (C15HeCI2N3) C, H, N.
2,3-dicloro-isoindolo[2,1-a]chinossalin-6-(5H)one (2e)
L’intermedio ottenuto dalla fase precedente è stato trattato con acido acetico come nell'Esempio 1.
Resa 87%; p.f. 340-343°C;
IR: 3350, 3302 (NH), 1645 (CO) cm<-1>;<1>H NMR (DMSO-d6) δ 7.43 (t, 1H, J=7.8 Hz, H-9), 7.54 (t, 1H, J=7.8 Hz, H-8), 7.86 (s, 1H, H-4), 7.95 (d, 1H, J=7.8 Hz, H-10), 8.52 (d, 1H, J=7.8 Hz, H-7), 8.85 (s, 1H, H-1), 9.32 (s, 1H, H-11), 12.46 (bs, 1H, NH);<13>C NMR (DMSO-d6) δ 105.1 (s), 117.1 (d), 118.7 (d), 119.2 (d), 119.4 (d), 121.1 (d), 122.0 (s), 124.7 (s), 124.8 (d), 126.5 (s), 126.9 (s), 127.0 (d), 127.2 (s), 130.3 (s), 147.0 (s). Anal. (C15H0CI2N2O) C, H, N.
ESEMPIO 6
11-cianoisoindolo[2.1-a]chinossalina (3a) L’intermedio 1-ciano-2-{2’-amminofenil)-isoindolo ottenuto come nella prima parte dell'Esempio 1 (3 mmoli) è stato disciolto in acido formico al 99% (10 mi) e tenuto a riflusso fino alla completa scomparsa del materiale di partenza, cioè per un tempo totale di 15 h. La miscela di reazione è stata versata in acqua ghiacciata (150 mi) e il precipitato risultante è stato raccolto per filtrazione. Il solido ottenuto è stato purificato per flash-cromatografia utilizzando diclorometano a dare il prodotto del titolo, solido.
Resa 70%; p.f. 237-238°C;
IR: 2192 (CN) cm<'1>;<1>H NMR (DMSO-d6) δ 7.55 (t, 1H, J=7.2 Hz, H-8), 7.68 (t, 1H, J=7.2 Hz, H-9), 7.81 (d, 1H, J=7.2 Hz, H-7), 7.87 (t, 1H, J=8.0 Hz, H-2), 7.90 (t, 1H, J=8.0 Hz, H-3), 8.20 (d, 1H, J=7.2 Hz, H-10), 8.57 (d, 1H, J=8.0 Hz, H-1), 9.06 (d, 1H, J=8.0 Hz, H-4) 9.79 (s, 1H, H-6);<13>C NMR (DMSO-d6) δ 89.4(s), 115.4 (s), 115.7 (d), 116.9 (d), 119.8 (s), 120.3 (d), 121.7 (s), 124.7 (d), 127.2 (s), 128.4 (d), 128.5 (d), 129.0 (d), 139.7 (d), 132.2 (s), 138.5 (s), 143.3 (d), Anal. (C16H9N3) C, H, N.
ESEMPIO 7
11-ciano-3-metossi-isoindolo[2.1-a]chinossalina (3b)
La preparazione dellintermedio di formula (4): 1-ciano-2-(2’-ammino-4’-metossi-fenil)-isoindolo è stata eseguita come nell'Esempio 3. L'intermedio (3 mmoli) è stato è stato disciolto in acido formico al 99% (10 ml) e tenuto a riflusso fino alla completa scomparsa del materiale di partenza, per un tempo totale di 10 h. La miscela di reazione è stata versata in acqua ghiacciata (150 mi) e il precipitato risultante è stato raccolto per filtrazione. Il solido ottenuto è stato purificato per flash-cromatografia utilizzando diclorometano a dare il prodotto del titolo, solido.
Resa 68%; p.f. 220-221°C;
IR: 2193 (CN) cm<-1>;<1>H NMR (DMSO-d6) δ 3.97 (s, 3H, CH3), 7.31 (dd, 1 H, J=9.6, 3.0 Hz, H-2), 7.46 (t, 1H, J=8.1 Hz, H-8), 7.53 (s, 1H, H-4), 7.58 (t, 1H, J=8.1 Hz, H-9), 7.90 (d, 1H, J= 8.1 Hz, H-10), 8.19 (d, 1H, J= 8.1 Hz, H-7), 9.06 (d, 1H, J= 9.6 Hz, H-1), 8.81 (s, 1H, H-6);<13>C NMR (DMSO-d6) δ 55.8 (q), 90.2 (s), 111.1 (d), 115.6 (s), 117.2 (d), 117.6 (d), 118.6 (d), 118.8 (d), 120.2 (s), 121.2 (s), 122.0 (s), 124.8 (d), 127.9 (d), 132.6 (s), 140.5 (s), 142.3 (d), 159.2 (s). Anal. (C17H1N3O) C, H, N.
ESEMPIO 8
11-ciano-2.3-dimetil-isoindolo[2.1-a]chinossalina (3c)
La preparazione dell'intermedio di formula (4): 1-ciano-2-(2’-ammino-2,3-dimetil-fenil)-isoindolo è stata eseguita come nell'Esempio 4. L’intermedio (3 mmoli) è stato è stato disciolto in acido formico al 99% (10 mi) e tenuto a riflusso fino alla completa scomparsa del materiale di partenza, cioè per un tempo totale di 30 h. La miscela di reazione è stata versata in acqua ghiacciata (150 mi) e il precipitato risultante è stato raccolto per filtrazione. Il solido ottenuto è stato purificato per flash-cromatografia utilizzando diclorometano a dare il prodotto del titolo, solido.
Resa 71%; p.f. 220-221 °C;
IR: 2193 (CN) cm<-1>;<1>H NMR (DMSO-de) δ 2.45 (s, 3H, CH3), 2.54 (s, 3H, CH3), 7.49 (t, 1H, J=7.5 Hz, H-8), 7.60 (t, 1H, J=7.5 Hz, H-9), 7.85-7.88 (m, 2H, H-10 e H-4), 8.33 (d, 1H, J= 7.5 Hz, H-7), 8.85 (s, 1H, H-1), 9.44 (s, 1H, H-6);<13>C NMR (DMSO-d6) δ 19.2 (q), 20.1 (q), 111.2 (s), 113.1 (s), 115.2 (d), 116.6 (d), 119.0 (d), 119.4 (s), 121.0 (s), 124.0 (d), 124.9 (s), 127.4 (d), 130.0 (d), 132.0 (s), 136.7 (s), 137.3 (s), 138.2 (s), 141.0 (d). Anal. (C1eHi3N3) C, H, N.
ESEMPIO 9
11-ciano-2.3-dicloro-isoindolo[2.1-a]chinossalina (3d)
La preparazione dell’intermedio di formula (4): 1-ciano-2-(2’-ammino-2,3-dicloro-fenil)-isoindolo è stata eseguita come nell’Esempio 5. L'intermedio (3 mmoli) è stato è stato disciolto in acido formico al 99% (10 mi) e tenuto a riflusso fino alla completa scomparsa del materiale di partenza, cioè per un tempo totale di 15 h. La miscela di reazione è stata versata in acqua ghiacciata (150 mi) e il precipitato risultante è stato raccolto per filtrazione. Il solido ottenuto è stato purificato per flash-cromatografia utilizzando diclorometano a dare il prodotto del titolo, solido.
Resa 75%; p.f. 279-281<º>C;
IR: 2196 (CN) cm<'1>.<1>H NMR (CDCI3) δ 7.57 (t, 1H, J=8.3 Hz, H-8), 7.68 (t, 1H, J=8.3 Hz, H-9), 8.00 (d, 1H, J=8.3 Hz, H-10), 8.29 (d, 1H, J= 8.3 Hz, H-7), 8.31 (s, 1H, H-1), 9.35 (s, 1H, H-4), 9.46 (s, 1H, H-6);<13>C NMR (CDCI3) δ 86.9 (s), 96.5 (s), 112.5 (s), 117.6 (dx2), 119.1 (s), 121.7 (s), 125.8 (s), 128.8 (dx2), 129.7 (s), 131.8 (d), 143.3 (dx2), 145.1 (s), 152.3 (s). Anal. (C16H7CI2N3) C, H, N.
Studio dell'attività antitumorale dei derivati isoindolo-chinossalinici
Saggi su linee cellulari - inibizione della crescita cellulare e ritotossicità
I derivati isoindolo-chinossalinici dell'invenzione sono stati valutato dal National Cancer Institute (NCI, Bethesda, USA), per mezzo del saggio antitumorale primario a singola dose su tre linee cellulari (MCF7-mammario, NCI-H460-polmonare a cellule non piccole, SF-268-SNC). In questo test, un composto è considerato attivo quando riduce la crescita di almeno una delle linee cellulare al 32% o meno (valori negativi indicano soppressione delle cellule). I risultati ottenuti sono riportati nella seguente Tabella 1.
(segue tabella) TABELLA 1
Saggio antitumorale primario a singoia dose per le isoindolo-chinossaline Comp. Polmonare a cellule
Mammario SNC scelto Comp. non piccole NCI-MCF7 SF-268 per test H460
60 cell.
2b 0 6 9 S 2c 2 27 55 s 2a 0 0 1 s 2e 0 10 13 s 2d 0 0 0 s 3a 91 107 94 N 3b 97 115 96 N 3c 78 97 83 N 3d 104 108 104 N
I composti che hanno superato i criteri stabiliti dal NCI per l'attività in questo saggio sono stati automaticamente sottoposti allo screening contro l'intero panel di linee cellulari tumorali (Monks, A. et al. Feasibility of a High-Flux Anticancer Drug Screen Using a Diverse Panel of Cultured Human Tumor Celi Lines J. Natl. Cancer Inst., 1991, 83, 757-766). Tutti i derivati isoindolo-chinossalinici del tipo della formula (2) sono stati selezionati per la valutazione contro il panel completo di linee cellulari tumorali, che comprende circa 60 diverse linee cellulari neoplastiche umane, raggruppate in nove sottogruppi neoplastici: leucemia, tumore polmonare a cellule non piccole, tumore del colon; tumore del SNC, melanoma; carcinoma ovarico, tumore renale, carcinoma prostatico, carcinoma mammario.
I seguenti parametri sono stati determinati per ogni linea cellulare: Gl50(concentrazione che inibisce il 50% della crescita cellulare netta), TGI (inibizione della crescita totale) e LC50(concentrazione che causa il 50% di morte cellulare netta). Per ciascuno di questi parametri sono stati calcolati i valori medi del “mean graph midpoint" (MG_MID) (Boyd, M. R. e Paull, K. D., Some practical considerations and applications of thè National Cancer Institute in vitro anticancer drug discovery screen, Drug Dev. Res., 1995, 34, 91-109)
I dati ottenuti sono riportati nella Tabella 2 che segue.
(segue tabella)
Una valutazione dei dati riportati in Tabella 2 ha evidenziato che i composti (2a-e) mostrano attività antineoplastica nei confronti di tutte le linee cellulari umane. Il composto più attivo è risultato essere il metossi-derivato (2a) (MG_MID = 7,32), seguito dal metil-derivato (2c), dal derivato non sostituito (2b) e dal derivato dimetiiico (2d), che hanno mostrato valori di MG_MID simili (5,28, 5,17 e 4,99). Il meno attivo era il dicloro-derivato (2e) (MG_MID = 4,74).
La Tabella 3 che segue riporta i valori di pGI50dei composti delle formule (2a-e) nei confronti di tutte le linee cellulari utilizzate nel test. Le isoindolo-chinossaline hanno mostrato un effetto inibitorio della crescita di tutte le linee cellulari tumorali a concentrazioni tra micromolari e nanomolari.
I derivati di formula (2), con l'eccezione di (2e), si sono mostrati particolarmente efficaci contro il sottogruppo della leucemia. In effetti, I valori di pGI50MG MID calcolati per il sottogruppo della leucemia sono sempre superiori alla media totale dei valori di MG_MID di tutte le linee cellulari (AMG_MID 0,24 - 0,51).
II composto (2a) era selettivo verso l88% delle linee cellulari a valori di GI50dell'ordine di 10<-8>M. Le linee cellulari più sensibili sono HL-60(TB) (pGl507,94), SR (pGI508,00) e K562 (pGl508,05), che appartengono al sottogruppo della leucemia; MALME-3M (pGI508,00) e M14 (pGI508,00) del sottogruppo del melanoma e MDA-MB-435 (pGI508,35), che appartiene al sottogruppo del tumore mammario.
Il composto (2c), recante un gruppo metilico, si è dimostrato selettivo rispetto al sottogruppo della leucemia, avendo tutte le linee cellulari del sottogruppo valori pGI50nel campo 5,70-5,92. Una risposta eccellente è stata anche osservata nel sottogruppo del tumore mammario. Le linee cellulari più sensibili sono risultate le MCF7 (pGIso >8,00), MDA-MB-231/ATCC (pGI505,62) e MDA-MB-435 (pGI505,50). Il derivato (2b) è risultato selettivamente attivo rispetto al carcinoma mammario e specialmente nei confronti di HS 578T (pGIso 6,28) e MDA-MB-231/ATCC (pGI506,02).
Il dicloro-derivato (2e) ha mostrato un basso valore medio di pGI50(4,74), ma una buona selettività nei confronti della linea cellulare HCC-2998 (pGI506,09), appartenente al sottogruppo del tumore del colon.
I dati ottenuti nella valutazione del TGI evidenziano che anche sotto questo profilo il composto più interessante è il (2a), sia in termini di pTGI (MG_MID = 5,87) che in termini di attività contro il maggior numero di linee cellulari (59), seguito, nell'ordine, da (2d), (2c) (2b) e (2e). A livello di LC50, la migliore risposta è stata osservata nel caso del composto (2a) nei confronti della linea cellulare HCC-2998 di tumore del colon (pLC506,30).
(segue tabella)
<a>Dati ottenuti dall'“in vitro disease-oriented human tumor cells screen" del NCI.
<b>pGI50è il -log della concentrazione molare che inibisce il 50% della crescita cellulare netta.<c>Non determinato.<d>MG_MID = mean graph midpoint = valore medio aritmetico per tutte le linee cellulari tumorali saggiate. Se l’effetto indicato non era ottenibile entro l'intervallo di concentrazione usato, la concentrazione più alta saggiata è stata utilizzata per il calcolo.
Effetto sulla polimerizzazione dei microtubuli in vitro
I test di immunofluorescenza e i saggi di determinazione dell'indice mitotico condotti sulle isoindolo-chinossaline della presente invenzione, e in modo particolare sui composti di formula (2a), hanno suggerito che questi composti interferiscono con la formazione o con la stabilità del reticolo di microtubuli nelle cellule, ed è noto che i microtubuli sono i maggiori responsabili della divisione mitotica.
Pertanto, è stata condotta una ulteriore sperimentazione per valutare gli effetti dei composti dell'invenzione sulla polimerizzazione della proteina dei microtubuli isolata da cervello porcino. Il saggio utilizza un composto fluorescente che si lega alla tubulina e ai microtubuli: la polimerizzazione è seguita da incremento della fluorescenza a causa dell’incorporazione di un reporter fluorescente nei microtubuli quando la polimerizzazione ha luogo (Bonne D., et al. 4',6-diamidino-2-phenylindole, a fluorescent probe for tubulin and microtubule. J. Biol. Chem.
1985, 260: 2819-2825).
Per la sperimentazione è stato utilizzato un kit per il saggio della polimerizzazione dei microtubuli (Cytoskeleton USA) seguendo il protocollo raccomandato dal produttore. Il saggio è stato eseguito in piastre da microtitolazione da 96 pozzetti e la reazione è stata iniziata attraverso l'aggiunta di tubulina. La piastra è stata incubata a 37°C in un lettore di micropiastre a fluorescenza (Fluoroskan Ascent FL Labsystems) e la misura di fluorescenza (λex 355 nm; λm450 nm) è stata determinata ogni minuto per 60 min. Come composti di riferimento, sono stati usati taxol (Cytoskeleton USA) e colchicina (Sigma).
I risultati, che sono mostrati nella Figura 1, evidenziano che nel campione di controllo (tubulina senza l'aggiunta di composti in prova) la fluorescenza aumenta nel tempo. Al contrario, tutti e quattro i campioni studiati inducono chiaramente un'inibizione, dipendente dalla concentrazione, della polimerizzazione di tubulina.
Una completa inibizione dell’aggregazione di microtubuli è stata osservata per il composto di formula (2a) alia concentrazione 5 μm.
In successive prove è stato investigato l’effetto del composto (2a) su microtubuli preassemblati. Nessuno dei composti saggiati è risultato in grado di indurre la depolimerizzazione dei microtubuli (dati non mostrati), indicando che l'azione di questi composti è strettamente correlata all'interferenza con l'aggregazione dei microtubuli.
Saggio della topoisomerasi
Esperimenti di rilassamento del DNA sono stati effettuati sia con topoisomerasi I che con topoisomerasi II.
DNA supercoiled di pBR322 (Fermentas) è stato incubato con 5 unità di topoisomerasi I umana a 37°C per 30 min in tampone di rilassamento (50 mM Tris-HCI pH 7,8, 50 mM KCI, 10 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitolo, 1 mM EDTA) in presenza di concentrazioni variabili (da 0,5 a 50 μΜ) del composto in studio.
Le reazioni sono state terminate per aggiunta di SDS allo 0,25% e di Proteinasi K a 250 pg/ml. Campioni di DNA sono stati quindi aggiunti al tampone di carica e sottoposti ad elettroforesi in un gel di agarosio all’1% a temperatura ambiente durante la notte a 20 V. I gel sono stati colorati con bromuro di etidio (1 mg/ml), lavati e dopo la colo razione il gel è stato lavato con acqua e le bande di DNA sono state determinate sotto radiazione UV con un transilluminatore. Sono state fatte fotografie con una macchina digitale Kodak DC256 e la quantificazione delle bande è stata ottenuta per mezzo del software analizzatore di immagine Quantity One (BIO RAD, Milano Italia). Simili esperimenti sono stati condotti utilizzando gel di agarosio contenenti etidio.
Il gel mostrato nella Figura 2 (sezione A) indica che a basse concentrazioni l’intensità della banda che migra più lentamente (corrispondente a DNA nicked totalmente rilassato) è aumentata significativamente, mentre a concentrazione maggiore il rilassamento del DNA è stato inibito, come osservato con l'avvelenante di riferimento per la toposomerasi I, la camptotecina, usata alla concentrazione di 20 μΜ.
Per escludere un effetto aspecifico dovuto all'interazione diretta del composto (2a) con il DNA, il test di rilassamento è stato ripetuto su bromuro di etidio contenente gel di agarosio, come mostrato nella Figura 2 (sezione B). In queste condizioni è stata osservata la presenza di molecole di DNA nicked, indicando che il composto (2a) può stimolare la scissione del DNA da parte della topoisomerasi I.
Analoghi esperimenti sono stati condotti con la topoisomerasi II umana, e i risultati hanno indicato che il composto (2a) non ha nessun effetto su questo enzima (dati non mostrati).
Conclusioni
I risultati complessivi della sperimentazione parzialmente illustrata in quanto precede mostrano che i derivati isoindolo[2,1-a]chinossalinici dell’invenzione possiedono un'elevata attività citotossica, e che essi agiscono attraverso l’inibizione della polimerizzazione della tubulina e dell’attività della topoisomerasi I.
I composti dell'invenzione si sono mostrati in grado di inibire la polimerizzazione tubulinica in vitro in maniera dipendente dalla concentrazione, in modo simile alla colchicina e alla vinblastina, con ciò indicando che tali composti possono essere classificati come agenti depolimerizzanti dei microtubuli. Inoltre, la determinazione dell'indice mitotico e gli studi di immunofluorescenza confermano l’interazione con la tubulina. È da notare, a questo proposito, che la struttura dei derivati isoindolo-chinossalinici dell’invenzione non assomiglia a nessuna delle strutture di noti agenti antimitotici.
I risultati spettrofotometrici indicano che il composto di formula (2a) si lega al DNA per intercalazione, e conseguentemente la macromolecola può essere considerata un potenziale target di questa classe di composti. In letteratura è noto che gli intercalatori di DNA possono essere inibitori della topoisomerasi I e/o della topoisomerasi II. Utilizzando un saggio di rilassamento del DNA è stato dimostrato che il composto preferito della presente invenzione inibisce l’attività catalitica della topoisomerasi I ma non quella della topoisomerasi II.
In conclusione, i risultati sopra sintetizzati dimostrano l’attività antitumorale in vitro dei derivati isoindolo[2,1-a]chinossalinici dell'invenzione, e in modo particolare quella del derivato isoindolo-chinossalinico di formula (2a), attività che appare esplicarsi attraverso due distinti meccanismi d’azione.
La presente invenzione è stata descritta con riferimento ad alcune sue forme di realizzazione specifiche, ma è da intendersi che variazioni o modifiche potranno essere ad essa apportate dagli esperti nel ramo senza per questo uscire dal relativo ambito di protezione.
Claims (21)
- RIVENDICAZIONI 1. Composto isoindolo-chinossalinico di formula generale (1):
- in cui: R rappresenta H o OH e R5rappresenta H o CN, R1, R2, R3e R4sono scelti, ognuno indipendentemente dall’altro, tra H, un gruppo alchilico, alcossilico, alchenilico o alchinilico con fino a 12 atomi di carbonio, un gruppo aromatico o aralchilico, isociclico o eterociclico, con fino a 12 atomi di carbonio, un atomo di alogeno, detti gruppi essendo eventualmente sostituiti con uno o più gruppi scelti tra ORa, CN, COORa, NO2, alogeni, NRaRb, in cui Rae Rbsono indipendentemente scelti dal gruppo consistente in H, alchile, alchenile o alchinile lineari, ramificati o ciclici con fino a 12 atomi di carbonio, arile, eterociclo con fino a 12 atomi di carbonio. 2. Composto isoindolo-chinossalinico secondo la rivendicazione 1 , in cui R rappresenta OH e R5rappresenta H, in una delle sue forme isomeriche di formula (2’) o (2"):
- 3. Composto secondo la rivendicazione 2, in cui R1, R2R3e R4sono scelti, ognuno indipendentemente dall’altro, tra H, un gruppo alchilico con fino a 6 atomi di carbonio, un gruppo alcossilico con fino a 6 atomi di carbonio e un atomo di alogeno.
- 4. Composto secondo la rivendicazione 3, in cui Rappresenta idrogeno o metile, R4rappresenta idrogeno, R2e R3sono scelti indipendentemente tra idrogeno, metile, metossile o cloro.
- 5. Composto secondo la rivendicazione 4, di formula (2a):
- 6. Composto secondo la rivendicazione 4, avente una delie seguenti formule:
- 7. Composto isoindolo-chinossalinico secondo la rivendicazione 1, in cui R rappresenta H e R5rappresenta CN, formula (3):
- 8. Composto secondo la rivendicazione 7, in cui R1, R2, R3e R4sono scelti, ognuno indipendentemente dall'altro, tra H, un gruppo alchi lico con fino a 6 atomi di carbonio, un gruppo alcossilico con fino a 6 atomi di carbonio e un atomo di alogeno.
- 9. Composto secondo la rivendicazione 8, in cui R1rappresenta idrogeno o metile, R4rappresenta idrogeno, R2e R3sono scelti indipendentemente tra idrogeno, metile, metossile o cloro.
- 10. Composto secondo la rivendicazione 9, avente una delle seguenti formule:
- 11. Procedimento per la preparazione dei composti isoindolochinossalinici di formula (1), come definita nella rivendicazione 1, comprendente la fase di far reagire un intermedio di formula generale (4):in cui R1, R2, Ra e R4hanno il significato enunciato nella rivendicazione 1 , con acido acetico, oppure con acido formico, sotto riscaldamento.
- 12. Procedimento secondo la rivendicazione 11, per la produzione dei composti isoindolo-chinossalinici di formula (2'), comprendente la fase di far reagire un intermedio della formula generale (4) con acido acetico a riflusso.
- 13. Procedimento secondo la rivendicazione 12, in cui al termine di detta reazione con acido acetico la miscela di reazione viene rapidamente raffreddata e il precipitato risultante, contenente il composto di formula (2’) desiderato, viene raccolto per filtrazione.
- 14. Procedimento secondo la rivendicazione 11, per la produzione dei composti isoindolo-chinossalinici di formula (3), comprendente la fase di far reagire un intermedio della formula generale (4) con acido formico a riflusso.
- 15. Procedimento secondo la rivendicazione 14, in cui al termine di detta reazione con acido formico la miscela di reazione viene rapidamente raffreddata e il precipitato risultante, contenente il composto di formula (3) desiderato, viene raccolto per filtrazione.
- 16. Uso di uno o più composti isoindolo-chinossalinici di formula generale (1), come definita nella rivendicazione 1, per la produzione di un preparato farmaceutico.
- 17. Uso secondo la rivendicazione 16, in cui detto preparato farmaceutico è un preparato antitumorale.
- 18. Uso di uno o più composti isoindolo-chinossalinici di formula generale (2') o (2"), come definita nella rivendicazione 2, per la produzione di un preparato farmaceutico antitumorale.
- 19. Uso di uno o più composti isoindolo-chinossalinici di formula generale (3), come definita nella rivendicazione 7, per la produzione di un preparato farmaceutico antitumorale.
- 20. Preparato farmaceutico comprendente come principio attivo almeno uno dei composti isoindolo-chinossalinici di formula generale (1), come definiti nelle rivendicazioni 1-10, assieme ad uno o più coadiuvanti e/o veicoli farmacologicamente accettabili.
- 21. Preparato farmaceutico secondo la rivendicazione 20 comprendente come principio attivo un composto isoindolo-chinossalinico di formula generale (2’) o (2"), come definita nella rivendicazione 2.
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