ITMI972835A1 - Composizione costituita da frazioni di eparina avente caratteristiche riproducibili con peso molecolare medio di 5200 d - Google Patents
Composizione costituita da frazioni di eparina avente caratteristiche riproducibili con peso molecolare medio di 5200 d Download PDFInfo
- Publication number
- ITMI972835A1 ITMI972835A1 IT97MI002835A ITMI972835A ITMI972835A1 IT MI972835 A1 ITMI972835 A1 IT MI972835A1 IT 97MI002835 A IT97MI002835 A IT 97MI002835A IT MI972835 A ITMI972835 A IT MI972835A IT MI972835 A1 ITMI972835 A1 IT MI972835A1
- Authority
- IT
- Italy
- Prior art keywords
- composition according
- molecular weight
- fractions
- heparin
- fraction
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 41
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 title claims description 30
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 26
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 title claims description 25
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 12
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 10
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 5
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 claims description 4
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 claims description 4
- 239000002565 heparin fraction Substances 0.000 claims description 4
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 claims description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 4
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims description 4
- 230000004075 alteration Effects 0.000 claims description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 3
- OEANUJAFZLQYOD-CXAZCLJRSA-N (2r,3s,4r,5r,6r)-6-[(2r,3r,4r,5r,6r)-5-acetamido-3-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-methoxyoxan-4-yl]oxy-4,5-dihydroxy-3-methoxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](OC)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](OC)[C@H](C(O)=O)O1 OEANUJAFZLQYOD-CXAZCLJRSA-N 0.000 claims description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229920000045 Dermatan sulfate Polymers 0.000 claims description 2
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 claims description 2
- 229920001499 Heparinoid Polymers 0.000 claims description 2
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000002554 heparinoid Substances 0.000 claims description 2
- 229940025770 heparinoids Drugs 0.000 claims description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 claims description 2
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 claims description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 230000002688 persistence Effects 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 239000011591 potassium Substances 0.000 claims description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims 1
- -1 chondroitirio Polymers 0.000 claims 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 claims 1
- 125000001741 organic sulfur group Chemical group 0.000 claims 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 230000008569 process Effects 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N heparin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](OC(O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]3O)C(O)=O)O[C@@H]2O)CS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N 0.000 description 5
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 3
- GUTLYIVDDKVIGB-OUBTZVSYSA-N Cobalt-60 Chemical compound [60Co] GUTLYIVDDKVIGB-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 3
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000950577 Antilla Species 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- 208000001435 Thromboembolism Diseases 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000001858 anti-Xa Effects 0.000 description 2
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 150000002301 glucosamine derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 2
- 239000005297 pyrex Substances 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002567 Chondroitin Polymers 0.000 description 1
- 206010051055 Deep vein thrombosis Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108010022901 Heparin Lyase Proteins 0.000 description 1
- 206010023237 Jugular vein thrombosis Diseases 0.000 description 1
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N Nitrous acid Chemical compound ON=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 238000005574 benzylation reaction Methods 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- DLGJWSVWTWEWBJ-HGGSSLSASA-N chondroitin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1OC1[C@H](O)[C@H](O)C=C(C(O)=O)O1 DLGJWSVWTWEWBJ-HGGSSLSASA-N 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- OWFXIOWLTKNBAP-UHFFFAOYSA-N isoamyl nitrite Chemical compound CC(C)CCON=O OWFXIOWLTKNBAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000009115 maintenance therapy Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 125000000962 organic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000003617 peroxidasic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000011158 quantitative evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
- A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
- A61K31/727—Heparin; Heparan
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
- C08B37/0075—Heparin; Heparan sulfate; Derivatives thereof, e.g. heparosan; Purification or extraction methods thereof
- C08B37/0078—Degradation products
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
Descrizione della domanda di brevetto per invenzione industriale dal titolo: Composizione costituita da frazioni di eparina avente caratteristiche riproducibili con peso molecolare medio di 5200 D
TECNICA ANTERIORE:
Sono noti processi per l'ottenimento di derivati dell’eparina e di glicosaminoglicani in generale aventi basso peso molecolare, ad esempio da 5000 a 8000 D.
Un processo è descritto ad esempio nel brevetto USA n. 4.987.222 nel quale sono impiegate radiazioni gamma da Cobalto 60 per la depolimerizzazione dell’eparina e di altri glicosaminoglicani per l’ottenimento di derivati aventi basso peso molecolare..
Altri processi sono basati su trattamenti chimici o enzimatici ottenuti con l’impiego dell’acido nitroso, con un intervento di benzilazione seguito da idrolisi alcalina, da digestione con nitrito di isoamile, da rottura perossidativa, da impiego delle Eparinasi specifiche.
Il processo basato sul trattamento mediante radiazioni gamma presenta il vantaggio di mantenere inalterate, nelle frazioni ottenute, le strutture originarie mentre nei processi basati su reazioni chimiche o enzimatiche tali strutture vengono alterate per cui risultano necessari ulteriori trattamenti di semisintesi e di risolfatazione.
In ogni caso, rimane aperto il problema di individuare e separare frazioni aventi attività specifiche in grado di intervenire con effetti mirati nelle diverse terapie antitromboniche. Inoltre l’impiego terapeutico di una miscela di frazioni a basso peso molecolare per esplicare una costante di attività necessita di una composizione continuativa e ripetibile di quelle frazioni che sono in grado di poter esprimere il massimo intervento farmacologico in assenza di fenomenologie tossiche proprie di determinati pesi molecolari.
SOMMARIO:
Noi abbiamo ora trovato una composizione costituita da frazioni di eparina avente elevate proprietà antitrombotiche e particolarmente adatta per la profilassi e la terapia delle alterazioni deH’omeostasi piasmatica.
Detta composizione è caratterizzata da un peso molecolare medio di 5200 D (±500) con un indice di polidispersione compreso tra 1.04 e 1,10, e dal fatto di essere costituita dalle seguenti frazioni:
- 7.000 D (±500) 11 - 15% in peso
- 6.000 D (±500) 14 - 16%
5.000 D (±500) 28 - 35%
4.000 D (±500) 23 - 27%
3.000 D (±500) 13 - 15%
Dette frazioni conservano inalterate le strutture originarie dell’eparina, in particolare viene conservato inalterato il valore degli indici di solfatazione che costituiscono gli elementi indispensabili per una efficace azione terapeutica.
La composizione secondo la presente invenzione è ottenuta con caratteristiche costanti e riproducibili dal punto di vista qualitativo e quantitativo a partire da eparina sodica di estrazione animale avente peso molecolare medio di 13.000 - 15.000 D mediante trattamento con radiazioni gamma e successivo frazionamento mediante gel permeazione.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE:
Le caratteristiche ed i vantaggi della composizione costituita da frazioni di eparina ottenute da depolimerizzazione mediante trattamento con radiazione gamma secondo la presente invenzione, saranno maggiormente illustrati nel corso della seguente descrizione dettagliata. Il materiale di partenza per la preparazione di detta composizione è costituito da eparina sodica ottenuta da estrazione animale avente peso molecolare medio di 13.000 - 15.000 D, attività di 180 - 190 Ul/mg ed esente da EDTA, metalli pesanti e solventi.
Si prepara una soluzione acquosa di detta eparina a concentrazione compresa fra 5 e 15% peso/volume.
La soluzione, in contenitore di vetro neutro, viene convogliata nella cella di irraggiamento tramite un sistema gestito da un software.
L’impianto di irraggiamento comprende una sorgente radioattiva di 5 mCi di Cobalto 60 e la soluzione di eparina è sottoposta ad un trattamento variabile da 120 kGy a 150 kGy con dosaggi successivi di circa 25 kGy, in dipendenza dal peso molecolare dell'eparina di partenza.
La soluzione irradiata viene trattata mediante ultrafiltrazione a taglio 300 D e successivamente viene purificata, concentrata, filtrata e liofilizzata. Il prodotto liofilizzato viene indicato come “eparina depolimerizzata madre”.
Il prodotto liofilizzato viene disciolto in una soluzione acquosa di NaCI 0,3 M in quantità tale da ottenere una concentrazione compresa fra 10 e 15% peso/volume e la soluzione ottenuta viene trattata con un procedimento di gel permeazione per il frazionamento.
Detto procedimento è effettuato in una colonna contenente resina Sephadex tipo G/50 medium di granulometria compresa fra 50 e 150 micrometri, in grado di separare frazioni a peso molecolare compreso fra 1.000 e 10.000 D.
Può essere impiegata ad esempio una colonna pilota tipo BP 252/15 avente le seguenti caratteristiche:
■ altezza: 105 cm;
■ volume della resina: 52 I;
■ flusso: 2 l/h di NaCI 0,3 M.
Operando con i seguenti parametri:
Ve = 171;
Ve/Vo = 1/R = 1,26;
R = 0,79;
K = (Ve - Vo)/(Vt - Vo) = 0,09
dove con Ve viene indicato il volume di eluizione,
con Vo viene indicato il volume morto,
con R viene indicata la costante di ritenzione,
con Vt viene indicato il volume totale del letto di resina,
vengono prodotte mediamente 17 frazioni aventi caratteristiche altamente riproducibili e pesi molecolari che vanno da valori inferiori a 3.000 D a valori superiori a 9.000 D.
La presente invenzione si riferisce alla miscela di frazioni avente la seguente composizione:
Peso molecolare % in peso
- 7.000 D (±500) 11 - 15
- 6.000 D (±500) 14 - 16
- 5.000 D (±500) 28 - 35
- 4.000 D (±500) 23 - 27
- 3.000 D (±500) 13 - 15
Questa miscela rappresenta circa il 50% in peso del totale delle frazioni prodotte.
Detta miscela, che nel seguito verrà indicata come GRAYPARIN, presenta attività biologiche e terapeutiche inaspettate con assenza di effetti emorragizzanti e allergici.
Le caratteristiche chimiche di GRAYPARIN sono riportate nelle tabelle 1 e 2.
Tabella 1:
Tabella 2 (con riferimento alla eparina di partenza)
Rapporti percentuali del contenuto in gruppi organici so fatata ottenuti con analisi all'NMR
Eparina iniziale Grayparin (1) Uronici desolfatati 35 - 38 % 31- 34 %
(2) GICNS036S03 81 - 85 % 83 - 86 %
(3) GIcNAc 12-15% 12-16%
(4) GlcNS033S03 6 - 7 % 7 - 8 %
dove (1) è il rapporto tra gli acidi uronici desolfatati rispetto agli acidi I
uronici totali, (2) è il rapporto tra la glucosammina 6 so fatata e non solfatata, (3) è il rapporto tra le glucosamine N acetilate e solfatate, (4) è il rapporto tra la glucosamina N,3 solfatata e non solfatata.
Questi rapporti confermano là validità della depolimerizzazione ottenuta senza interventi chimici di riassetto molecolare.
Il processo basato sul trattamento mediante radiazioni gamma secondo le presente invenzione presenta infatti il vantaggio di mantenere inalterate, nelle frazioni ottenute, le strutture originarie mentre nei processi basati su reazioni chimiche od enzimatiche tali strutture vengono spesso alterate per cui risultano necessari ulteriori trattamenti di semisintesi e di risolfatazione.
Il processo secondo la presente invenzione esplica il suo intervento esclusivamente sul legame ossigeno dei componenti strutturali della molecola eparinica ed evidenzia la possibilità di ottenere una elevata riproducibilità nella formazione di derivati a pesi molecolari inferiori in assenza totale di impurezze costituite da catalizzatori e da composti chimici organici ed inorganici estranei alla composizione della eparina. Nella Tabella n° 3 vengono riportati i profili di attività biologica Tabella n° 3
APTT antiXa antilla U/mg UaXa/mg Ualla/mg
Grayparin 25 - 60 80 - 100 30 - 50
Le caratteristiche strutturali della Grayparin, determinate mediante NMR sono riportate nella Figura 1 in confronto con la Figura 2 della Eparina Depolimerizzata Madre ed in confronto con la Figura 3 della Eparina di partenza.
Si riportano anche i grafici delle determinazioni in HPLC corrispondenti alla Figura 4 per la Grayparin, alla Figura 5 per l'Eparina depolimerizzata Madre ed alla Figura 6 per l’Eparina di partenza.
Sperimentazioni farmacodinamiche
L’attività antitrombotica della Grayparin è stata saggiata secondo il “Rabbit jugular-vein thrombosis model" secondo Friedman e coll. (Am. J. Physiol. 199:7501960).
Da questo test è risultato che la somministrazione endovenosa (IV) di Grayparin presenta un ED/50 di 2,80 mg/kg sulla base di somministrazioni di 1 ;2 e 4 mg/kg ed una inibizione percentuale pari al 45% dimostrando un evidente potenziale antitrombotico paragonato al ED/50 dell’eparina iniziale pari a 0,3 mg/kg.
Il test del “Bleeding time” è stato condotto secondo la metodica “Tari Transection” secondo Dejana e coll. (Thromb. Haemostasis 48:108:1982). I tempi di sanguinamene della Grayparin in paragone con l'eparina iniziale alla dose di 0,5 mg/kg somministrati 15’ prima del taglio sono indicati nei seguenti intervalli:
Soluzione fisiologica = 148" 29,6
Grayparin = 293" ± 28,3
Eparina iniziale = 825" ± 51 ,3
Questi valori mettono in evidenza l’effetto della particolare composizione della Grayparin che presenta un basso indice di bleeding rispetto agli alti valori dell’eparina per la totale assenza di frazioni a peso molecolare superiore a 9.000 D.
La sperimentazione farmacocinetica è stata condotta su scimmie utilizzando il Normal Monkey Plasma e valutando la permanenza della Grayparin nel tempo.
Nella Tabella n. 4 si fa riferimento ai valori plasmatici espressi come valutazione quantitativa ponderale antiXa.
Tabella n. 4
Tempo in minuti Valori IV mcg/ml Valori SC mcg/ml
0 0 0
15 19 0
30 18,6 1,2
60 15,7 2.4
120 9,4 2,6
240 5,6 3.5
360 4,0 2.6
Grayparin = 1 mg/kg; IV = somministrazione endovenosa; SC= somministrazione sottocutanea. Nella Tabella n. 5 si fa riferimetno ai valori plasmatici espressi come valutazione quantitativa ponderale antilla.
Tabella n. 5
Tempo in minuti Valori IV mcg/ml Valori SC mcg/ml
0 0 o
15 20 0
30 20 1,1
60 20 1.5
120 8.8 5.6
240 1 ,0 7.7
360 1,6 1,9
Grayparin 1 mg/kg; IV somministrazione endovenosa; SC· somministrazione sottocutanea.
La farmacocinetica della Grayparin nella somministrazione endovenosa (IV) dimostra la presenza piasmatica del fattore attivo con un massimo a 60 minuti seguito da una persistenza oltre i 360 minuti; la somministrazione sottocutanea (SC) esprime valori interessanti di concentrazione, specialmente nel caso del test antiXa, in quanto altamente prolungati nel tempo e, come tali, validi per una terapia di mantenimento.
Questi risultati confermano la validità strutturale dei componenti della Grayparin, identificabili con gli elementi primari naturali riconosciuti come unici fattori attivi per le funzioni biologiche dell’organismo |che operano sempre con composizioni ottenute da depolimerizzazioni biologiche di un componente di deposito altamente polimerizzato.
Questi risultati confermano la validità del processo fisico di scomposizione della struttura polimerica del'eparina secondo la presente invenzione che è basata su schemi di intervento non demolitivo assimilabile ai fenomeni biologici di scissione molecolare naturale.
Tutti i dati tecnico-biologici riportati nel presente brevetto sono ottenuti da Grayparin in forma di sale sodico, ma possono essere ottenuti anche dai corrispondenti sali di calcio, potassio, litio, magnesio.
Inoltre una miscela di frazioni analoghe può essere ottenuta a partire da altri glicosaminoglicani come Dermatano, Condroitino, Eparano, Eparide ed eparinoidi in genere.
La Grayparin può essere impiegata, come sostanza singola od in miscela con altre sostanze terapeutiche, per la preparazione di composizioni farmaceutiche per somministrazione sottocutanea, intramuscolare, endovenosa, topica ed aerosol, in miscela con solventi o eccipienti farmaceuticamente accettabili.
Dette composizioni farmaceutiche risultano atte alla prevenzione delle tromboembolie post-operatorie, alla profilassi dei pazienti uremici sottoposti a dialisi cronica, alla prevenzione e alla terapia delle tombosi venose profonde ed in genere verso le alterazioni della omeostasi piasmatica.
In particolare, per quanto riguarda la prevenzione della trombosi venosa profonda è prevista la somministrazione mediante iniezione subcutanea di 100 Ul per kg di peso corporeo ogni 12 ore per almeno 10 giorni.
Per la prevenzione delle tromboembolie post-operatorie è prevista la somministrazione subcutanea di 2500-5000 Ul ogni 24 ore per almeno 7 giorni.
A scopo illustrativo vengono riportati i seguenti esempi di preparazioni che, secondo la presente invenzione, mantengono costante la composizione quali-quantitativa delle frazioni attraverso una tecnologia che attua un intervento della radiazione in funzione del peso molecolare della eparina di partenza.
ESEMPIO 1
100 g di eparina sodica ottenuta da estrazione anima ed avente un'attività di 190 Ul/mg e P.M.= 15.175 D (composizione percentuale delle frazioni in Tabella A) vengono disciolti in 1 I di acqua bidistillata e disaerata. La soluzione viene travasata in contenitore pyrex che viene chiuso con tappo di vetro dopo gorgogliamento con Argon,
La soluzione viene trattata con una dose complessiva di 130 KGy a dosaggi successivi di circa 25 KGy di radiazione gamma da Co60.
La soluzione irradiata viene trattata mediante ultrafiltazione a taglio 300 D e purificata con successivi passaggi in NaCI al 3%. La soluzione concentrata ài 10% viene liofilizzata ed il prodotto liofilizzato (Eparina depolimerizzata madre n° 1) viene sciolta al 10% in soluzione 0,3 M di NaCI e frazionata mediante colonna di Gel Permeazione su Sephadex G/50 medium (Lotto n° 1/A)
La tabella B riporta i valori percentuali delle frazioni ottenute.
TABELLA A TABELLA B
La preparazione della composizione secondo la presente invenzione (GRAYPARIN) viene otenuta dalla miscelazione delle frazioni comprese tra 7.000 D e 3.000D per otenere un peso molecolare medio di 5.200 D (± 500).
La miscela in soluzione acquosa a concentrazione di 5 g/l viene sotoposta a dissalazione su membrane a cut off di 1000 D e poi concentrata fino a concentrazione di 50 g/l. La soluzione concentrata viene liofilizzata dopo essere stata sotoposta a filtrazione sterile.
Si otengono circa 40 g di una composizione con le seguenti caratteristiche;
P. M. medio 5.200 D (± 500)
Distribuzione pesi molecolari: < 3.000 D = 1,5% - > 7.000 D = 8%
Indice di polidispersione: <1,1
Rapporto Solfati/Carbossili : >2
Attività anti Xa : >80 U anti Xa/mg
ESEMPIO 2
100 g di Eparina sodica ottenuta da estrazione animale ed avente un'attività di 186 Ul/mg e PM 14.200 Da (composizione in tabella C) vengono sciolti in 1 I di acqua bidistiliata e disaerata. La soluzione viene travasata in contenitore di pyrex e gorgogliata con Argon. La chiusura del contenitore con tappo di vetro è immediata. La soluzione viene trattata con una dose complessiva di 125 KGy a dosaggi successivi di radiazione gamma da Cobalto 60. Seguono le operazioni descritte nell’esempio n. 1 ottenendo l’Eparina depolimerizzata madre che viene frazionata (Lotto n° 2/A) con le percentuali di frazioni della Tabella D.
La preparazione della composizione secondo la presente invenzione (GRAYPARIN) viene otenuta dalla miscelazione delle frazioni comprese tra 7.000 D e 3.000 D per otenere un peso molecolare medio di 5.200 D (± 500).
Seguono le operazioni descrite nell’esempio n° 1 e si otiene un prodoto avente le stesse caratteristiche.
ESEMPIO 3
100 g di Eparina sodica ottenuta da estrazione anima e ed avente un’attività di 185 Ul/mg e PM 12.910 D (composizione in Tabella E) dopo le operazioni di dissoluzione, vengono irradiati co una dose complessiva di 120 KGy secondo le modalità dell'esempio 1 .
L'Eparina depolimerizzata madre, dopo frazionamento mediante Gel permeazione (Lotto n° 3/A) presenta le frazioni indicate nel a tabella F.
La preparazione della composizione secondo la presen e invenzione (GRAYPARIN) viene ottenuta dalla miscelazione delle frazioni comprese tra 7.000 D e 3.000 D per ottenere un peso molecolare medio di 5.200 D (± 500).
Seguono le operazioni descritte nell'esempio n° e si ottiene un prodotto avente le stesse caratteristiche.
Claims (13)
- RIVENDICAZIONI 1. Composizione costituita da frazioni di eparina avente caratteristiche riproducibili ottenuta da depolimerizzazione mediante radiazione gamma e successivo frazionamento mediante gel permeazione, caratterizzata dal fatto di avere peso molecolare medio di 5.200 D (± 500) e di essere costituita da 11 - 15% della frazione avente peso molecolare di 7.000 D (± 500), da 14 - 16% della frazione avente peso molecolare di 6.000 D (± 500), da 28 - 35% della frazione avente peso molecolare di 5.000 D (± 500), da 23 27% della frazione avente peso molecolare di 4.000 D (± 500) e da 13 - 15% della frazione avente peso molecolare di 3.000 D (± 500).
- 2. Composizione secondo la rivendicazione 1, caratterizzata dal fatto di avere un indice di polidispersione dei pesi molecolari compreso fra 1,04 e 1,1.
- 3. Composizione secondo la rivendicazione 1, caratterizzata dal fatto di avere un’assorbanza a 260 nm < 0,200 e un’assorbanza a 280 nm <0,150.
- 4. Composizione secondo la rivendicazione 1 , caratterizzat ia dal fatto di mantenere i valori di solfatazione corrispondenti ai valori della eparina di partenza.
- 5. Composizione secondo la rivendicazione 1 , caratterizzata dal fatto di avere un contenuto di zolfo organico >10%.
- 6. Composizione secondo la rivendicazione 1, caratterizzata da una attività in APTT, antiXa ed antilla rispettivamente di 25-60U/mg, 80-100 UaXa/mg e 30-50 Ualla/mg.
- 7. Composizione secondo la rivendicazione 1 , caratterizzata dal fatto di possedere una attività antitrombotica, ED/50 di 2,80 mg/kg.
- 8. Composizione secondo la rivendicazione 1, caratterizzata da un indice di bleeding di 293 ± 28,3 sec. alla dose di 0,3 mg/kg.
- 9. Composizione secondo la rivendicazione 1, caratterizzata dalla persistenza piasmatica di oltre 360 minuti delle frazioni attive.
- 10. Composizione secondo la rivendicazione 1, caratterizzata dal fatto di essere salificata con un catione scelto dal gruppo costituito dal sodio, potassio, litio, calcio e magnesio.
- 11. Composizione secondo la rivendicazione 1 , caratterizzata dal fatto che dette frazioni derivano da Dermatano, Condroitirio, Eparano, Eparide ed Eparinoidi.
- 12. Impiego della composizione secondo la rivendicazione 1 per la preparazione di composizioni farmaceutiche atte alla profilassi e terapia delle alterazioni dell’omeostasi piasmatica, sia come sostanza singola che in associazione con altre sostanze terapeutiche.
- 13. Composizioni farmaceutiche comprendenti una dose efficace della composizione secondo la rivendicazione 1 in miscela con solventi o eccipienti farmaceuticamente accettabili, in forma atta alla somministrazione endovenosa, intramuscolare, sottocutanea, intradermica o in forma di pomata, gel o spray, atte alla profilassi e terapia dell’omeostasi piasmatica.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT97MI002835A IT1296998B1 (it) | 1997-12-19 | 1997-12-19 | Composizione costituita da frazioni di eparina avente caratteristiche riproducibili con peso molecolare medio di 5200 d |
| US09/213,538 US20020010152A1 (en) | 1997-12-19 | 1998-12-17 | Composition consisting of heparin fractions having reproducible characteristics with average molecular weight equal to 5200d |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT97MI002835A IT1296998B1 (it) | 1997-12-19 | 1997-12-19 | Composizione costituita da frazioni di eparina avente caratteristiche riproducibili con peso molecolare medio di 5200 d |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ITMI972835A1 true ITMI972835A1 (it) | 1999-06-19 |
| IT1296998B1 IT1296998B1 (it) | 1999-08-03 |
Family
ID=11378419
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| IT97MI002835A IT1296998B1 (it) | 1997-12-19 | 1997-12-19 | Composizione costituita da frazioni di eparina avente caratteristiche riproducibili con peso molecolare medio di 5200 d |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20020010152A1 (it) |
| IT (1) | IT1296998B1 (it) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7781416B2 (en) * | 2000-01-25 | 2010-08-24 | Sigma-Tau Research Switzerland S.A. | Derivatives of partially desulphated glycosaminoglycans as heparanase inhibitors, endowed with antiangiogenic activity and devoid of anticoagulating effect |
| IT1316986B1 (it) * | 2000-01-25 | 2003-05-26 | Sigma Tau Ind Farmaceuti | Derivati glicosamminoglicani parzialmente desolfatati nonanticoagulanti ad attivita' antiangiogenica. |
| US20080139503A1 (en) * | 2000-01-25 | 2008-06-12 | Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A. | Derivatives of partially desulphated glycosaminoglycans as heparanase inhibitors, endowed with antiangiogenic activity and devoid of anticoagulating effect |
| ITMI20021372A1 (it) * | 2002-06-21 | 2003-12-22 | Derivati Organici Lab | Processo per la depolimerizzazione fisica dei glicosamminogliacani e prodotti da esso ottenuti |
| GB0327723D0 (en) * | 2003-09-15 | 2003-12-31 | Vectura Ltd | Pharmaceutical compositions |
| CN102585023B (zh) * | 2012-01-03 | 2015-04-29 | 浙江大学 | 海参多糖的电离辐射降解法 |
-
1997
- 1997-12-19 IT IT97MI002835A patent/IT1296998B1/it active IP Right Grant
-
1998
- 1998-12-17 US US09/213,538 patent/US20020010152A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20020010152A1 (en) | 2002-01-24 |
| IT1296998B1 (it) | 1999-08-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE3851973T2 (de) | Heparine mit niedrigem Molekulargewicht und regelmässiger Struktur, ihre Herstellung und biologische Verwendungen. | |
| JP3529835B2 (ja) | 精製ヘパリン画分およびその製造方法、並びにこれを含有する薬剤組成物 | |
| EP0340628B1 (en) | Sulfoamino derivatives of chondroitin sulfates, of dermaten sulfate and of hyaluronic acid and their pharmacological properties | |
| DE69023957T2 (de) | Sulfatierte Polysaccharide, Antikoagulierungs- und Antikomplementärmittel, hergestellt aus Fukanen aus braunen Algen, und Verfahren zu deren Herstellung. | |
| EP0347588B1 (en) | Heparin derivatives and process for their preparation | |
| DK2794666T3 (en) | Use of chemically modified heparin derivatives in sickle cell disease | |
| US5034520A (en) | Process for recovering heparinic oligosaccharides with an affinity for cell growth factors | |
| RU2617764C2 (ru) | Неантикоагулянтные гликозаминогликаны, содержащие повторяющиеся дисахаридные звенья, и их медицинское применение | |
| JPH02206601A (ja) | 抗トロンビン作用を有するオリゴサッカライドフラクションの製法 | |
| Spadarella et al. | From unfractionated heparin to pentasaccharide: Paradigm of rigorous science growing in the understanding of the in vivo thrombin generation | |
| DE68904264T2 (de) | Fragmente und fraktionen von heparin mit wirkung gegen hiv. | |
| ITMI972835A1 (it) | Composizione costituita da frazioni di eparina avente caratteristiche riproducibili con peso molecolare medio di 5200 d | |
| EA033936B1 (ru) | Усовершенствованный способ получения сульфатированной ha высокой степени чистоты | |
| CN103209997A (zh) | 高纯度肝素及其制备方法 | |
| Zhang et al. | Interactions of marine sulfated glycans with antithrombin and platelet factor 4 | |
| ITCO960031A1 (it) | Fucani a basso peso molecolare aventi attivita' anticoagulante antitrombinica e antitrombotica | |
| Drozd et al. | Pharmacodynamic parameters of anticoagulants based on sulfated polysaccharides from marine algae | |
| JP2006327955A (ja) | 低分子量コンドロイチン硫酸を含む医薬 | |
| ITMI20010779A1 (it) | Uso di polisaccaridi batterici solfati atti all'inibizione dell'angiogenesi | |
| US20220096530A1 (en) | Safe bovine heparin, preparation method, and application | |
| US20100196510A1 (en) | Composition and treatment | |
| CN105237656A (zh) | 一种提纯透明质酸钠的方法 | |
| Kouta | Comparative Studies on Biochemical and Pharmacological Profiles of Bovine, Ovine and Porcine Heparins | |
| CN105399870A (zh) | 一种低抗凝肝素、其低聚糖及其制备方法和在制备抗阿尔兹海默症的药物中的应用 | |
| Rodrigo et al. | Low Molecular Weight Heparins, Biological Drugs close to Non-Biological Complex Drugs |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 0001 | Granted |