CN103209997A - 高纯度肝素及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供作为药品、化妆品、研究试剂等有用的高纯度肝素及其制备方法，更具体而言，涉及实质上不含抗亚硝酸分解的杂质的肝素，以及如下所述的肝素的制备方法：向5~30重量%的肝素水溶液中混合0.2~1倍量（体积）的乙醇，得到肝素的胶体状沉淀物。

Description

高纯度肝素及其制备方法

技术领域

本专利申请要求日本专利申请第2010-205310号的优先权，在此将其全部内容引述至本说明书中作为参考。

本发明涉及实质上不含引起副作用的物质、安全性高、作为药品、化妆品及研究试剂等有用的高纯度肝素及其制备方法。

背景技术

肝素是存在于肝、小肠、肺和皮肤等的、含有经硫酸化的D-葡糖胺、D-葡糖醛酸、L-艾杜糖醛酸等的酸性粘多糖。

肝素具有较强的抗凝血活性，除应用于弥散性血管内凝血(DIC)的治疗、各种血栓栓塞症（静脉血栓栓塞症、心肌梗塞、肺栓塞、脑栓塞、四肢动脉血栓栓塞、手术中、手术后的血栓栓塞等）的治疗及预防外，还可在使用血液透析、人工心肺机等体外循环装置时或***血管导管时，或是在输血及血液检查等场合下用来防止血液凝固。

此外，公知肝素除了具有抗凝血活性外，还具有脂蛋白脂肪酶活化作用、抗血小板凝集作用、降血压作用、抗补体作用、抑制癌症转移作用、抑制肥大细胞脱颗粒的作用、抑制局部炎症、镇痛以及促进肌肉组织的血液循环等多种生理活性。

肝素主要是从健康的供食用动物的组织中提取/分级来制造的，但从BSE（牛海绵状脑病）问题出现后，作为药物的肝素的来源则基本为猪的小肠粘膜。通常，将猪小肠粘膜悬浮于水类溶剂中进行蛋白质消化，然后加入吸附剂等（非专利文献1），以复合物的形式将肝素及其他粘多糖（主要是硫酸软骨素系列、硫酸乙酰肝素等）提取，将其作为粗原料。接着再对其进行批量混合/分级，得到肝素（所谓的“未分级肝素”）。

用上述方法所得到的肝素（未分级肝素）含有除肝素外的粘多糖（主要是硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素B及硫酸软骨素C），已经知道其含量会随粗原料及制造方法而不同。但是，确认了这种杂质的大致的副作用是可接受的，其结果，在很长一段时间里都将未分级的肝素用作药物。

然而，2008年初在美国和德国报告发生了多起向患者静脉团注（快速静注）未分级的肝素制剂时，出现与以往不同的副作用的病例，最终演变成超过80人死亡的事件。美国FDA对这种未分级的肝素制剂及其原料药进行了分析，结果确认了其与一直以来所使用的产品存在明显差异，进一步地确认到了这种产品中存在过硫酸化硫酸软骨素（Over sulfated chondroitin sulfate：OSCS）(非专利文献2~4)。这种物质是自然界中不存在的物质，据说很可能是在制造原料药时混入的。

日本国内虽然没有重度副作用的报告，但也回收了部分未分级的肝素制剂及低分子肝素（Low molecular weight heparin：LMWH）制剂，向市场稳定供应的问题变得严峻。

许多研究人员根据OSCS的科学合成法、结构解析或动物实验等来探明有害现象的原因，特别是还根据1H-NMR和其他试验方法等对纯度及安全性的确认进行了研究（非专利文献5和6），确认OSCS为造成日本国内有害现象的原因物质，确认/纯度实验的研究通过行政、制剂制造商来实施（非专利文献7和8）。

另一方面，作为肝素的制造或者纯化方法，公知有1）非专利文献1、2）非专利文献9、3）非专利文献10和4）专利文献1等中记载的方法。

但是，能够简便且有效地从肝素中除去OSCS、硫酸软骨素等杂质的方法，至今为止还是未知的。进一步地，简便地检出或测定上述肝素中杂质的方法至今为止是未知的。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Roden，L.，Dorfman，A.，Acta Chemi.Scand.13，2121（1959）

非专利文献2：Nature Biotechnology，2008，26，669-675

非专利文献3：The New England Journal of Medicine，2008，359，2674-2684

非专利文献4：The New England Journal of Medicine，2008，358，2457-2467

非专利文献5：Beyer，T.et al.，Journal of Pharmaceutical and BiomedicalAnalysis，48，13-19(2008)

非专利文献6：Guerrini，M.et al.，Nature Biotechnology26，669-675(2008)

非专利文献7：橋井則貴ら、医药研究39(10)651-659(2008)

非专利文献8：Jia，H.，Nature Biotechnology26，477-478(2008)

非专利文献9：Schiller，S.et al.：J.Biol.Chem.236，983(1961)

非专利文献10：Schmidt，M and Dmochowski，A：Biochim.Biophys.Acta83，137(1964）

专利文献

专利文献1：日本特开2002-293804

发明内容

发明要解决的问题

本发明的课题在于提供实质上不含OSCS、硫酸软骨素等杂质的、安全性高的高纯度肝素及其制造方法，以及在其制造过程中肝素纯度的确认方法。

解决问题的方法

本发明人等为解决上述问题进行了深入研究，结果发现：通过使用乙醇等有机溶剂在给定条件下对肝素进行分级，能够简便且有效地除去OSCS、

硫酸软骨素等杂质，进一步地，由于这些杂质在给定条件下对亚硝酸分解具有抗性，因此，通过在进行该亚硝酸分解后采用HPLC进行分析，能够确认及测定它的存在及含量，从而完成了本发明。

即，本发明中包含以下内容：

[1]肝素，其实质上不含抗亚硝酸分解的杂质。

[2]肝素，其通过下述方法得到，该方法包括：向5~30重量%的肝素水溶液中混合0.2~1倍量（体积）的选自乙醇、甲醇、异丙醇、丙酮及其混合溶剂的有机溶剂，得到肝素的胶体状沉淀物。

[3]上述[2]所述的肝素，其中，在肝素水溶液中以50~500mM的浓度溶解有盐。

[4]上述[3]所述的肝素，其中，盐选自氯化钠及乙酸钠。

[5]上述[1]~[4]中任一项所述的肝素，其为胶体状。

[6]上述[1]~[5]中任一项所述的肝素，其分子量在3000~30000道尔顿范围内。

[7]肝素的制备方法，该方法包括：向5~30重量%的肝素水溶液中混合0.2~1倍量（体积）的选自乙醇、甲醇、异丙醇、丙酮及其混合溶剂的有机溶剂，得到肝素的胶体状沉淀物。

[8]肝素，其通过下述方法得到，该方法包括：向5~30重量%的肝素水溶液中混合0.2~1倍量（体积）的选自乙醇、甲醇、异丙醇、丙酮及其混合溶剂的有机溶剂，得到含有肝素的上清液。

[9]上述[8]所述的肝素，其中，在肝素水溶液中以50~500mM的浓度溶解有盐。

[10]上述[9]所述的肝素，其中，盐选自氯化钠及乙酸钠。

[11]上述[8]~[10]中任一项所述的肝素，其分子量在1500~12000道尔顿范围内。

[12]肝素的制备方法，该方法包括：向5~30重量%的肝素水溶液中混合0.2~1倍量（体积）的选自乙醇、甲醇、异丙醇、丙酮及其混合溶剂的有机溶剂，得到含有肝素的上清液。

[13]药物，其含有上述[1]~[6]及[8]~[11]中任一项所述的肝素。

[14]根据上述[1]~[6]及[8]~[11]中任一项所述的肝素，其作为药物而使用。

[15]药物组合物，其含有上述[1]~[6]及[8]~[11]中任一项所述的肝素。

[16]粘多糖中含有的抗亚硝酸分解的粘多糖或亚硝酸分解性粘多糖的检测或测定方法，该方法包括：将粘多糖进行亚硝酸分解。

发明效果

本发明的高纯度肝素由于不含引起副作用的物质OSCS等、因而安全性高，可优选用作药品、化妆品、研究试剂等使用。

根据本发明的肝素的制备方法，能够简便地得到实质上不含抗亚硝酸分解的杂质的高纯度肝素。此外，该方法有可能在工业中使用。

根据本发明的粘多糖的检出或测定方法，能够简便地确认粘多糖产品中是否混入了对亚硝酸分解显示不同特性的其他粘多糖，因此可以确保产品的安全性等。此外，在制备目标粘多糖的过程中，也能够简便地确认是否混入了对亚硝酸分解显示不同特性的其他粘多糖，因此可以有效管理目标粘多糖的制备工序、避免在中间材料或终产物中混入其他粘多糖。

附图说明

[图1]图1是表示含有其他粘多糖（主要是硫酸乙酰肝素（HS）/硫酸软骨素B（CSB）/硫酸软骨素C（CSC））的未分级肝素（Na盐、UFN-SP）在乙醇分级前、乙醇分级后的上层（上清液）及下层（胶体状沉淀物）中所含物质的分布的HPLC图。图1中的各符号如下所述：A）乙醇分级前（实线）、B）乙醇分级后的下层（胶体状沉淀物）（虚线）、C）乙醇分级后的上层（上清液）（点线）、D）C）中的硫酸化度低的高分子粘多糖（主要是HS/CSB/CSC）(点线)、E）对亚硫酸分解具有抗性的粘多糖（主要是CSB/CSC/过硫酸化硫酸软骨素（OSCS）（点划线）、F）主要是肽葡聚糖（点划线）、G）粘多糖中的析出盐（Na盐）（各线）、H）其他的低分子化合物（乙醇及其他未确认物质）（主要是实线）。

[图2]图2是表示通过亚硝酸分解的OSCS对照物、即含有OSCS的未分级肝素（Na盐、OSHP-SH、OSCS含量约12.5%），OSCS标准品（OSCS-STD），作为OSCS及硫酸软骨素系列的混合物的粗OSCS（CSMS-CE1及-CE2）在亚硝酸分解前后的分子量变化的HPLC图。图2中的各符号如下所述：A）OSHP-SH及OSCS-STD a）亚硝酸分解前的OSHP-SH（实线）b）亚硝酸分解后的OSHP-SH（虚线）c）亚硝酸分解前的OSCS-STD(点线)d）亚硝酸分解后的OSCS-STD(圆点虚线)B）CSMS-CE1及-CE2a）亚硝酸分解后的CSMS-CE1（实线）b）亚硝酸分解后的CSMS-CE2（虚线）c）CSB-STD(点线)。

[图3]图3是表示通过亚硝酸分解的粘多糖对照物、即硫酸软骨素系列（CSA、CSB、CSC、CSD及CSE）、硫酸乙酰肝素（HS）及硫酸角质素（KS）的分子量变化的HPLC图。（亚硝酸分解前：实线，亚硝酸分解后：虚线）。

[图4]图4是表示乙醇分级前的各未分级肝素的Na盐（UFN1~5）及Ca盐（UFC）的亚硝酸分解前的分子量分布的HPLC图。图4中的各符号如下所述：a）UFN1（实线）、b）UFN2（虚线）、c）UFN3（点线）、d）UFN4（点划线）、e）UFN5（双点划线）、f）UFC（▲实线）。

[图5]图5是表示乙醇分级前的各未分级肝素的Na盐（UFN1~5）及Ca盐（UFC）的亚硝酸分解后的分子量分布的HPLC图。图5中的各符号如下所述：a）UFN1（实线）、b）UFN2（虚线）、c）UFN3（点线）、d）UFN4（点划线）、e）UFN5（双点划线）、f）UFC（▲实线）。

[图6]图6是表示乙醇分级后的各未分级肝素的Na盐（UFN1~5）及Ca盐（UFC）的亚硝酸分解前的分子量分布的HPLC图。图6中的各符号如下所述：a）UFN1（实线）、b）UFN2（虚线）、c）UFN3（点线）、d）UFN4（点划线）、e）UFN5（双点划线）、f）UFC（▲实线）。

[图7]图7是表示乙醇分级后的各未分级肝素的Na盐（UFN1~5）及Ca盐（UFC）的亚硝酸分解后的分子量分布的HPLC图。图7中的各符号如下所述：a）UFN1（实线）、b）UFN2（虚线）、c）UFN3（点线）、d）UFN4（点划线）、e）UFN5（双点划线）、f）UFC（▲实线）。

具体实施方式

本发明的高纯度肝素实质上不含抗亚硝酸分解的杂质。

本发明中的“肝素”并无特别限制，可使用由至今公知的原料及制备方法得到的物质，可列举例如所谓的“未分级肝素”，“低分子量肝素”，或具有与“肝素”类似的构成糖组成和结合方式的“硫酸乙酰肝素(heparansulfate)”中的、特别是高分子量或高硫酸含量的“硫酸乙酰肝素”等。

上述“未分级肝素”是指未经解聚处理的肝素，通常为分子量在3000~30000道尔顿范围内的物质。

上述“低分子量肝素”是指未分级肝素经解聚处理而低分子化的物质，通常为分子量在1500~12000道尔顿范围内的物质。

上述“硫酸乙酰肝素”通常是指分子量在3000~30000道尔顿范围内的物质。

而且，本发明中的肝素，一般是指在生物体内发挥出实质上和游离肝素同样的生理活性或药理活性的物质，例如肝素的衍生物及医药上可接受的盐、加成盐、水合物等均包含在本发明的技术范围中。

需要说明的是，这里所说的分子量是指在水性溶剂中，通过采用尺寸排除色谱法的HPLC法所确定的重均分子量。

本发明中的“亚硝酸分解”，只要是在能实质上分解肝素、且不分解后述的OSCS、硫酸软骨素等杂质的条件下进行的亚硝酸分解处理即可，例如意指：在pH1.0~7.0（优选为pH2.0~5.0）、反应温度-10℃~40℃（优选为-5℃~10℃）、反应时间0.5~60分钟（优选为5~15分钟）、相对于1g对象物质（肝素等）的亚硝酸（特别是亚硝酸Na）的使用量为10~1000mg（优选为50~100mg）等较低pH、低温下且短时间的条件下的亚硝酸分解处理。

上述“抗亚硝酸分解的杂质”是指对上述亚硝酸分解显示抗性的肝素中的杂质，例如，对肝素进行上述亚硝酸分解后，使用HPLC（例如后述条件下）对其进行分析时，在亚硝酸分解前的肝素的洗脱位置所对应的位置洗脱的物质。作为这类物质，可列举例如：过硫酸化硫酸软骨素（OSCS）、硫酸软骨素A（4-硫酸软骨素：CSA）、B（硫酸皮肤素：CSB）、C（6-硫酸软骨素、CSC）、D（2，6-硫酸软骨素：CSD）、E（4，6-硫酸软骨素：CSE）等的在粘多糖基本骨架中具有半乳糖胺和糖醛酸（葡糖醛酸或艾杜糖醛酸）的二糖单元结构的物质、或在基本骨架中具有葡糖胺和半乳糖的二糖单元结构的硫酸角质素（KC）。

上述“实质上不含”“抗亚硝酸分解的杂质”意指：与使用参考了日本药局方第15改正解说书中记载的“帕肝素钠”标准实验法的“分子量”项下条件的高效液相色谱法（HPLC）对作为对象的肝素进行分析时，所得到的肝素的洗脱位置（例如，在以下的具体例中洗脱时间为10~20分钟）处显示的通过折射率(RI)检出的峰的总面积值相比，将该肝素通过上述亚硝酸分解后，使用同样条件的HPLC进行分析时，肝素的洗脱位置处显示的峰的总面积值为5%以下，优选为1%以下，更优选为0.5%以下。

作为上述HPLC的条件的具体例，可列举例如下述条件：

检测***：SHIMADZU制造的管理***（LC solution）、示差折射计（RI：RID-10A）

色谱柱及保护柱：TOSO制造TSK gel G-2000SWXL及TSK guard columnSWXL

柱温：40℃

流动相：0.2mol/L硫酸Na（pH5.0）

流速：0.5mL/分钟

本发明的高纯度肝素例如能够通过下述方法来制备，该方法包括：在给定的条件下，使用乙醇等有机溶剂对含有抗亚硝酸分解的杂质等的原料肝素进行分级。

作为用于上述分级的有机溶剂，可列举例如乙醇、甲醇、异丙醇或丙酮或其混合物。在这些溶剂中，考虑到在终产物中的残留的情况下，最优选乙醇。

以下，作为本发明的一例，列举使用乙醇作为有机溶剂的情况（乙醇分级）来进行说明，但在使用其他有机溶剂来替代乙醇的情况时，同样也能够实施本发明。

作为本发明中的乙醇分级，具有如下所述特征：向5~30重量%（优选为10~20重量%）的肝素水溶液中混合0.2~1倍量（优选为0.4~0.6倍量）（体积）的乙醇，得到肝素的胶体状沉淀物。该方法简便，具有在工业上使用的可能性。

一直以来，为了得到作为白色沉淀的肝素，利用的是乙醇沉淀法。但是，以往的乙醇沉淀法所适用的肝素水溶液中的肝素浓度为1~5重量%，与本发明中乙醇分级所使用的肝素浓度相比低得多。此外，向肝素水溶液中混合的乙醇的量为2~10倍量（体积），与本发明中乙醇分级所使用的乙醇的量相比显著地多。即，本发明中的乙醇分级显著区别于以往的乙醇沉淀法。

作为上述乙醇分级中的原料肝素，并无特别限制，可使用未分级肝素的原料、未分级肝素、低分子量肝素等的各个纯化阶段的肝素以及不同杂质浓度的肝素。但是，在以胶体状沉淀物形式回收所希望得到的肝素的情况下，原料肝素的分子量优选为3000~30000道尔顿，更优选为5000~15000道尔顿。

在上述乙醇分级时，将原料肝素溶解于纯化水、注射用水等水中，制备成在上述浓度范围内的肝素水溶液。

上述肝素水溶液，根据肝素的特性，在溶剂中生成沉淀会随着水溶液pH的上升而变得更加灵敏，此外，在溶剂中生成沉淀会随着pH的降低而变得更加缓慢，从这一点考虑，优选其pH在酸性~中性附近，例如pH2.5~7.5，优选为pH4.0~7.0。

另外，对于上述肝素水溶液，根据肝素的特性，在溶剂中生成沉淀会随着离子强度的上升而变得更加灵敏，此外，在溶剂中生成沉淀会随着离子强度的降低而变得更加缓慢，再者，在盐浓度低的情况下难以形成胶体状沉淀，需要进行离心操作等，因此优选为溶解有盐的水溶液。作为其盐浓度，例如为50~500mM，优选为100~250mM。由于主要使用肝素作为药物，作为盐可列举例如氯化钠、乙酸钠等药学上可接受的盐。

因此，肝素水溶液可以是将肝素溶解于生理盐水中得到的水溶液。

上述乙醇分级中的处理温度及处理时间，只要是能得到肝素的胶体状沉淀物的处理温度及处理时间即可，并无特别限制。可以在例如-10~40℃（优选为5~25℃）的温度下，进行例如0.5~48小时（优选为4~24小时）的处理。

通过上述乙醇分级，作为杂质的抗亚硝酸分解的杂质残留在上清液中，肝素则变成胶体状，沉淀出来。因而，能够通过将胶体状沉淀物与上清液分离，得到实质上不含抗亚硝酸分解的杂质的高纯度肝素。

本发明中的“胶体状”肝素或者“胶体状”沉淀物，是指肝素形成胶体状的分散相，在本发明分级中所使用的水及有机溶剂的混合液中，形成界面及层，并沉淀出来的物质，例如，是指使用从通常用的微米级分子筛到超滤膜这样的滤纸（例如，分子量截留尺寸为500~50000MW）实质上难以进行滤取(使用滤纸难以将此沉淀物与水/有机溶剂混合液分离)的状态。

另一方面，将分子量为1500~12000，平均分子量优选为2500~7500的肝素作为原料肝素的情况下，上述通过乙醇等的有机溶剂的分级，优选按照下述方式进行。

作为该分级中使用的有机溶剂，可列举例如乙醇、甲醇、异丙醇或丙酮或其混合物。在这些溶剂中，考虑到在终产物中的残留的情况下，最优选乙醇。

以下，作为上述分级的一例，列举使用乙醇作为有机溶剂的情况（乙醇分级）来进行说明，但在使用其他有机溶剂来替代乙醇的情况下，同样也能够实施本发明。

将上述原料肝素溶解于纯化水、注射用水等水中，制备成在上述浓度范围内的水溶液。在溶剂中生成沉淀会随着水溶液pH的上升而变得更加灵敏，此外，在溶剂中生成沉淀会随着pH的降低而变得更加缓慢，从这一点考虑，优选其pH在酸性~中性附近，例如pH2.5~7.5，优选为pH4.0~7.0。

另外，在溶剂中生成沉淀会随着离子强度的上升而变得更加灵敏，此外，在溶剂中生成沉淀会随着离子强度的降低而变得更加缓慢，再者，在盐浓度低的情况下难以形成胶体状沉淀，需要进行离心操作，因此优选为溶解有盐的水溶液。作为其盐浓度，例如为50~500mM，优选为100~250mM。作为盐可列举例如氯化钠、乙酸钠等药学上可接受的盐。

乙醇分级是向5~30重量%（优选为10~20重量%）的肝素水溶液中混合0.2~1倍量（优选为0.25~0.6倍量）（体积）的乙醇，得到抗亚硝酸分解的杂质的沉淀物。

这种情况下，作为杂质的抗亚硝酸分解的杂质沉淀下来，而肝素则残留在上清液中。因而，能够通过将上清液与沉淀物进行分离，得到实质上不含抗亚硝酸分解的杂质的高纯度肝素。

在上述乙醇分级后，能够通过现有方法进行纯化处理（乙醇沉淀法等）、干燥处理（减压干燥等）等，得到白色粉末形式的、实质上不含抗亚硝酸分解的杂质的高纯度肝素。

按照本发明得到的高纯度肝素实质上不含作为引发副作用的物质的OSCS等杂质，因而安全性高，而且显示出与现有的肝素相同的生理活性，因此能够非常适用于与现有肝素同样的医药用途中。例如，本发明的高纯度肝素具有较强的抗凝血活性，除应用于弥散性血管内凝血(DIC)的治疗、各种血栓栓塞症（静脉血栓栓塞症、心肌梗塞、肺栓塞、脑栓塞、四肢动脉血栓栓塞、手术中、手术后的血栓栓塞等）的治疗及预防外，还可在使用血液透析、人工心肺机等体外循环装置时或***血管导管时，或是在输血及血液检查等场合下用来防止血液凝固。进一步地，由于本发明的高纯度肝素具有脂蛋白脂肪酶活化作用、抗血小板凝集作用、降血压作用、抗补体作用、抑制癌症转移作用、抑制肥大细胞脱颗粒的作用、抑制局部炎症、镇痛以及促进肌肉组织的血液循环等多种生理活性，因此能够基于这些作用用于各种疾病的预防或是作为治疗药物来使用。

本发明的高纯度肝素与现有的肝素相同，可以通过常规的方法来制剂化，作为注射剂或口服剂来给药。例如通过以下所述的给药方法进行给药，其给药量或给药速度通常是在给予本制剂后，在测定全血凝固时间或全血活化部分凝血激酶时间的同时，根据年龄、病例、适应领域或者目的来确定。

例如，在静脉滴注给药法中，用1000ml的5%葡萄糖注射液、生理盐水或林格氏液将相当于5,000~50,000肝素单位的量的肝素稀释，以1分钟20~30滴左右的速度进行静脉滴注给药。此外，在静脉间歇注射法中，每4~8小时向静脉内注射相当于5,000~50,000肝素单位的量的肝素。在皮下注射、肌内注射法中，每4小时一次性地进行皮下注射或肌内注射相当于5,000~10,000肝素单位的量的肝素。

在体外循环中（血液透析、人工心肺）使用的情况下，在使用人工肾时，每个患者的适宜用量是基于透析前的肝素感受性试验的结果算出的，但在全身肝素化法的情况下，通常在开始透析前，给予相当于1,000~3,000肝素单位的量的肝素，在透析开始后，每1小时持续追加相当于500~1,500肝素单位的量的肝素，或者每1小时间歇性地追加给予相当于500~1,500肝素单位的量的肝素。在局部肝素化法的情况下，每1小时持续注入相当于1,500~2,500肝素单位的量的肝素。此外，在使用人工心肺机灌流时，根据手术方式、方法的不同，给予相当于150~300肝素单位/kg的量、并且根据体外循环时间的延长来适当追加给药。

在口服给药的情况下，在1天内1次~数次服用将相当于500~2000肝素单位/g的量的肝素。在外用制剂的情况下，使用相当于100~500肝素单位/g的量的肝素的软膏，将适量软膏在1天内1次~数次涂抹或者涂覆到纱布等上延展后再贴上使用。

在栓剂的情况下，将相当于1,000~4,000肝素单位/g的量的肝素在1天内1~2次应用于***或者***中。

此外，与现有的肝素相同，本发明的高纯度肝素能够优选作为化妆品、研究试剂等使用。

此外，本发明提供粘多糖中含有的抗亚硝酸分解的粘多糖或亚硝酸分解性粘多糖的检出或测定方法，该方法包括：将粘多糖进行亚硝酸分解。

作为上述方法中的“抗亚硝酸分解的粘多糖”，可列举上述作为抗亚硝酸分解的杂质所举例的粘多糖。此外，“亚硝酸分解性粘多糖”是指通过上述亚硝酸分解所分解的粘多糖，可列举例如：肝素、硫酸乙酰肝素等。

此外，上述方法中的“亚硝酸分解”与上述亚硝酸分解相同。

作为上述方法中所使用的粘多糖，并无特别限制，可列举例如：肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸角质素等。

粘多糖经亚硝酸分解后，例如，可以使用上述HPLC法检出或测定该粘多糖中含有的抗亚硝酸分解的粘多糖或者亚硝酸分解性粘多糖。即，将对象粘多糖进行上述的亚硝酸分解后，采用HPLC分析时，对象粘多糖为亚硝酸分解性粘多糖（肝素等）、而且对象粘多糖中含有抗亚硝酸分解的粘多糖（硫酸软骨素等）的情况下，相当于亚硝酸分解前的亚硝酸分解性粘多糖的峰会消失，同时相当于抗亚硝酸分解的粘多糖的峰被检出。相反地，当对象粘多糖为抗亚硝酸分解的粘多糖（硫酸软骨素等）、而且对象粘多糖中含有亚硝酸分解性粘多糖（肝素等）的情况下，对于亚硝酸分解前的抗亚硝酸分解的粘多糖所对应的峰，在亚硝酸分解后，仅有相当于亚硝酸分解性粘多糖部分的峰会缩小。

按照上述粘多糖的检出或测定方法，能够简便地确认是否在粘多糖产品中混入了对亚硝酸分解显示不同特性的其他粘多糖，因此可以确保产品的安全性等。此外，即便在制备目标粘多糖的过程中，也能够简便地确认是否混入了对亚硝酸分解显示不同特性的其他粘多糖，因此可以有效的管理目标粘多糖的制备工艺，避免在中间材料或终产物中混入其他粘多糖。

以下，列举实施例对本发明进行更为具体的说明，但本发明并不限定于这些实施例。

实施例

[试验方法]

（1）亚硝酸分解

为了减少在高温时弱酸性环境（pH4.0附近）的副作用，本处理全部在冰浴中进行。此外，为了避免反应结束后过剩的亚硝酸Na的蓄积，向各试样中所添加的亚硝酸Na的量为：每1g试样中加入60mg。

向预先溶解于注射用水（日本药局方合格品）的各试样溶液中，加入给定量的亚硝酸Na并进行搅拌，然后用HCl将pH调整至1.5左右开始反应。30分钟后，用NaOH将pH调节至5.0以结束反应，添加乙醇进行固化、干燥，得到白色粉末。

（2）HPLC法

按照HPLC法来确认各试样中所含物质的分子量分布。HPLC法的条件以日本药局方第15改正解说书中所记载的“帕肝素钠”标准实验法的“分子量”项为准。所使用的HPLC条件如下所示。

检测***：SHIMADZU制造的管理***（LC solution）、示差折射计（RI：RID-10A）

色谱柱及保护柱：TOSO制造TSK gel G-2000SWXL及TSK guard columnSWXL

柱温：40℃

流动相：0.2mol/L硫酸Na（pH5.0）

流速：0.5mL/分钟

[参考例1]

按照上述方法，将过硫酸化硫酸软骨素（OSCS）标准品（OSCS-STD，日本公定书协会）、含有OSCS的未分级肝素（Na盐，OSHP-SH、OSCS含量约12.5％，C公司制造批号1060-07-0033）、作为OSCS及硫酸软骨素系列的混合物的粗OSCS（CSMS-CE1及-CE2，其是通过将N公司制造的含有OSCS的未分级肝素（Na盐：批号PH-64107及pH-64507）中的肝素/硫酸乙酰肝素的含量减少至约95%以下而制得的），进行亚硝酸分解，通过上述的方法进行HPLC分析，确认了亚硝酸分解前后的分子量变化（图2）。其结果是：关于OSCS-STD、CSMS-CE1及CE2，并未确认到伴随2糖单元峰位移的分解及低分子化。关于OSHP-SH（OSCS含量约12.5%），确认到了伴随2糖单元峰位移的分解及低分子化，通过RI检出的亚硝酸分解中的未分解物的峰面积值约为亚硝酸分解前的峰的面积值的12.1%。此外，OSHP-SH的未分解物的峰，显示出与OSCS-STD的峰接近的分子量（图2-A）。此外，CSMS-CE1及-CE2的峰，显示出与硫酸软骨素B（CSB-STB，纯度＞95％，由猪小肠粘膜提取物制备）的峰接近的分子量（图2-B）。

[参考例2]

硫酸软骨素系列（特级试剂）的A、B、C、D及E型（CSA、CSB、CSC、CSD及CSE）、硫酸乙酰肝素（HS）及硫酸角质素（KS）是从生化学工业（株）处购入的，通过上述方法进行亚硝酸分解，并按照上述的方法进行HPLC分析，确认到了亚硝酸分解前后的分子量变化（图3，位于点线左侧）。其结果为：关于硫酸软骨素系列及KS，并未确认到伴随2糖单元峰位移的分解及低分子化。另一方面，确认到了HS具有伴随2糖单元峰位移的分解及低分子化（图3，位于点线右侧）。

从参考例1及参考例2的结果中发现，过硫酸化硫酸软骨素（OSCS）及硫酸软骨素系列（CSA、CSB、CSC、CSD及CSE）具有抗亚硝酸分解特性，另一方面，硫酸乙酰肝素（HS）则会通过亚硝酸分解而发生分解。

[实施例1]

量取作为试样的含有其他粘多糖（主要是硫酸乙酰肝素/硫酸软骨素B/硫酸软骨素C）的未分级肝素（Na盐，UFN-SP，C公司制造批号1035-0792）（500g）置于10L的化学空心罐(化学ホ一ロ一タンク)中，加入生理盐水（日本药局方合格品）至5L（pH6.0）。向该溶液中加入乙醇（2.5L；和光纯药（株）、特级试剂）搅拌后，在室温（25℃）静置24小时以上（乙醇分级）。确认分配成胶体状沉淀物（下层）与上清液（上层）两层后，将上清液转移至30L化学空心罐中，加入乙醇（20L）进行剧烈搅拌。将胶体状沉淀物转移至30L化学空心罐中，加入生理盐水（3L）进行搅拌后，加入乙醇（20L）进行剧烈搅拌。在实施了各处理后，静置24小时。分别通过布氏漏斗将两个罐底中沉淀的白色析出物进行回收后，用乙醇洗净，在五氧化二磷存在的条件下，在室温减压干燥24小时。最终从胶体状沉淀物中回收了418.2g的白色粉末（回收率83.6%）。

关于上述的UFN-SP，通过上述HPLC法对乙醇分级前、乙醇分级后的上层（上清液）及下层（胶体状沉淀物）中所包含的物质分布进行了确认。其结果如图1所示。

同时，按照上述方法将得到的产物进行亚硝酸分解，通过上述方法进行了HPLC分析，以洗脱时间在10~20分钟之间出现的峰的总面积来求出亚硝酸分解前后的产物中所含物质（肝素及抗亚硝酸分解的杂质）的量。其结果如表1所示。

[比较例1]

按照上述方法对上述UFN-SP进行了亚硝酸分解。通过上述HPLC法对亚硝酸分解前后的试样中所含的物质分布进行了确认。此外，通过上述的方法进行了HPLC分析，以洗脱时间在10~20分钟之间出现的峰的总面积来求出亚硝酸分解前后的产物中所含物质（肝素及抗亚硝酸分解的杂质）的量。其结果如表1所示。

[比较例2~7]

采用上述的方法对已经过下述确认的Na盐5个试样（UFN1~5）及Ca盐1个试样（UFC）进行了亚硝酸分解：在采用¹H-NMR法的试验中，肉眼未检出来自OSCS的信号，或者来自OSCS的信号不是来自肝素的¹³C的卫星峰(satellite signal)。通过上述HPLC法对亚硝酸分解前后的试样中所含物质的分布进行了确认（图4及5）。此外，通过上述的方法进行了HPLC分析，以洗脱时间在10~20分钟之间出现的峰的总面积来求出亚硝酸分解前后的产物中所含物质（肝素及抗亚硝酸分解的杂质）的量。其结果如表1所示。

[实施例2~7]

关于与上述比较例1~6相同的试样，也与实施例1同样地进行了乙醇分级。接着，采用上述方法对得到的各产物进行了亚硝酸分解。通过上述HPLC法对亚硝酸分解前后的试样中所含物质的分布进行了确认（图6及7）。此外，通过上述的方法进行了HPLC分析，以洗脱时间在10~20分钟之间出现的峰的总面积来求出亚硝酸分解前后的产物中所含物质（肝素及抗亚硝酸分解的杂质）的量。其结果如表1所示。

[表1]

※洗脱时间在10～20分钟之间出现的峰的总面积

Claims (16)

1.肝素，其实质上不含抗亚硝酸分解的杂质。

2.肝素，其通过下述方法得到，该方法包括：

向5~30重量%的肝素水溶液中混合0.2~1倍量（体积）的选自乙醇、甲醇、异丙醇、丙酮及其混合溶剂的有机溶剂，得到肝素的胶体状沉淀物。

3.根据权利要求2所述的肝素，其中，在肝素水溶液中以50~500mM的浓度溶解有盐。

4.根据权利要求3所述的肝素，其中，盐选自氯化钠及乙酸钠。

5.根据权利要求1~4中任一项所述的肝素，其为胶体状。

6.根据权利要求1~5中任一项所述的肝素，其分子量在3000~30000道尔顿范围内。

7.肝素的制备方法，该方法包括：

向5~30重量%的肝素水溶液中混合0.2~1倍量（体积）的选自乙醇、甲醇、异丙醇、丙酮及其混合溶剂的有机溶剂，得到肝素的胶体状沉淀物。

8.肝素，其通过下述方法得到，该方法包括：

向5~30重量%的肝素水溶液中混合0.2~1倍量（体积）的选自乙醇、甲醇、异丙醇、丙酮及其混合溶剂的有机溶剂，得到含有肝素的上清液。

9.根据权利要求8所述的肝素，其中，在肝素水溶液中以50~500mM的浓度溶解有盐。

10.根据权利要求9所述的肝素，其中，盐选自氯化钠及乙酸钠。

11.根据权利要求8~10中任一项所述的肝素，其分子量在1500~12000道尔顿范围内。

12.肝素的制备方法，该方法包括：

向5~30重量%的肝素水溶液中混合0.2~1倍量（体积）的选自乙醇、甲醇、异丙醇、丙酮及其混合溶剂的有机溶剂，得到含有肝素的上清液。

13.药物，其含有权利要求1~6及8~11中任一项所述的肝素。

14.根据权利要求1~6及8~11中任一项所述的肝素，其作为药物而使用。

15.药物组合物，其含有权利要求1~6及8~11中任一项所述的肝素。

16.粘多糖中含有的抗亚硝酸分解的粘多糖或亚硝酸分解性粘多糖的检测或测定方法，该方法包括：将粘多糖进行亚硝酸分解。

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