ITMI20112441A1 - Composizioni comprendenti fattori di crescita, fattori chemiotattici e antibatterici/antivirali, immunoglobuline e citochine per la terapia della enterocolite acuta necrotizzante (nec) nei prematuri e nei neonati a termine e per la prevenzione delle - Google Patents
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Description
“COMPOSIZIONI COMPRENDENTI FATTORI DI CRESCITA, FATTORI CHEMIOTATTICI E ANTIBATTERICI/ANTIVIRALI, IMMUNOGLOBULINE E CITOCHINE PER LA TERAPIA DELLA ENTEROCOLITE ACUTA NECROTIZZANTE (NEC) NEI PREMATURI E NEI NEONATI A TERMINE E PER LA PREVENZIONE DELLE PATOLOGIE A BREVE E A LUNGO TERMINE DOVUTE ALL’ALIMENTAZIONE CON LATTE ARTIFICIALEâ€
La presente invenzione ha per oggetto composizioni comprendenti fattori di crescita, citochine, fattori antibatterici e anticorpi per la terapia della enterocolite acuta necrotizzante (NEC) nei prematuri e nei neonati a termine e per la prevenzione delle patologie a breve e a lungo termine dovute all’alimentazione con latte artificiale.
Stato della tecnica
L’enterite necrotizzante (NEC) à ̈ una patologia acuta caratterizzata da necrosi della mucosa intestinale che interessa più comunemente la zona ileo-colica. La progressione della necrosi può arrivare a coinvolgere l'intero spessore della parete intestinale, determinando una perforazione, con peritonite e sepsi fino all’exitus.
La causa della NEC non à ̈ nota. Secondo la teoria patogenetica formulata da J.R. Llyod nel 1969, la NEC sarebbe l’evento finale di una “cascata†che coinvolge l’ischemia intestinale, alterazioni della barriera mucosale, traslocazione e colonizzazione batterica, fino alla perforazione intestinale. Sicuramente si tratta di una patologia a genesi multifattoriale, in cui giocano un ruolo importante l’immaturità della motilità del tratto gastroenterico, delle capacità digestive, della regolazione del circolo, della funzione di barriera e delle difese immunitarie del neonato. Schematicamente à ̈ possibile individuare tre meccanismi: squilibrio della vascolarizzazione intestinale, alterata composizione della flora batterica e alterazione del meccanismo di barriera della mucosa intestinale.
L’enterocolite necrotizzante (NEC) à ̈ dunque una malattia infiammatoria intestinale ed à ̈ una delle più comuni emergenze gastrointestinali nei neonati. L’insorgenza della NEC avviene spesso nei primi tre mesi di vita e i neonati che hanno un peso alla nascita molto basso (inferiore a 1000 g) e nascono sotto le 28 settimane di gestazione sono i più suscettibili all’insorgenza della malattia. I neonati a termine rappresentano circa il 10% di tutti i casi di NEC, mentre i prematuri rappresentano circa il 90%. Con un’incidenza dall’1% al 5% per tutti i neonati ammessi alle unità di trattamento per le NEC c’à ̈ una prevalenza dal 7% al 14% di neonati con basso peso alla nascita (500-1500g) e una mortalità che va dal 20% al 50%. La NEC continua a rappresentare un importante problema clinico. I progressi nelle cure ostetriche e neonatali hanno migliorato la sopravvivenza per i neonati più piccoli e immaturi e dal momento che più neonati pretermine a basso peso sopravvivono al periodo neonatale, la popolazione a rischio di NEC aumenta. Non à ̈ stata identificata sostanziale associazione tra sesso, razza e NEC. A causa del trattamento inadeguato e della mancanza di strategie preventive circa dal 20% al 40% dei neonati con NEC vengono sottoposti ad intervento chirurgico e dal 10% al 30% sviluppano una significativa morbidità che comprende danni allo sviluppo neurologico, alla vista e all’udito, ritardo nella crescita, anomalie nella nutrizione, diarrea, ostruzione intestinale e sindrome dell’intestino corto. La mortalità a seguito di intervento chirurgico à ̈ di circa il 50%. La NEC rappresenta anche un carico per il servizio sanitario con spese annue di ospedalizzazione di circa 6,5 milioni di $ negli Stati Uniti. Pertanto, la NEC continua ad essere un importante problema di salute per i neonati pretermine, per i neonati a termine, ma sottopeso, e per il 10% dei neonati a termine.
Il colon à ̈ la parte più comunemente colpita dalla NEC. La severità della necrosi della parete intestinale varia da una necrosi piccola e localizzata di un tratto di intestino fino alla necrosi transmurale di tutto il colon nei casi più severi. Negli stadi più avanzati della NEC i riscontri patologici comprendono sanguinamento gastrointestinale, infiammazione, enorme crescita batterica, distensione addominale con molteplici anse dilatate dell’intestino tenue, perforazione intestinale, necrosi coagulativa, ipotensione, shock settico, pneumoperitoneo e liquido intraaddominale. Nel 1978, Bell e colleghi hanno proposto un sistema uniforme di stadiazione dei neonati con NEC. Hanno classificato i neonati con stadio I (sospetto), stadio II (conclamato) e stadio III (avanzato). I criteri di stadiazione di Bell per la NEC rappresentano le linee guida per il trattamento. Idealmente si dovrebbero intraprendere interventi nutrizionali quando un neonato ha uno o più fattori di rischio di sviluppare NEC o à ̈ al primissimo stadio della patologia.
Si ipotizza che una sequenza ipossia-ischemia-riperfusione possa danneggiare la mucosa intestinale fino alla necrosi. In seguito ad un insulto ipossico si ha un riflesso primitivo di centralizzazione del circolo cioà ̈ una ridistribuzione del flusso ematico con perfusione preferenziale del cuore e del cervello a scapito di altri distretti, quali l’intestino. La lesione ischemica può essere conseguente a condizioni di riduzione del flusso mesenterico per fattori estrinseci, quali exsanguinotrasfusioni, cardiopatie congenite, pervietà del dotto di Botallo, o per fattori intrinseci, ovvero per un alterato bilancio tra mediatori della vasocostrizione (che hanno come effettore finale l’endotelina1) e mediatori della vasodilatazione che agiscono tramite l’ossido nitrico (NO).
Gli studi epidemiologici hanno evidenziato l’associazione con specifici germi e virus (p. es.: Klebsiella, Escherichia coli, Clostridium difficile, Clostridium sp, rotavirus, stafilococchi ecc.), ma spesso non à ̈ possibile identificare alcun patogeno specifico. Depone per una causa infettiva il fatto che la pneumatosi intestinale, che à ̈ l’immagine radiologica tipica di tale malattia, à ̈ dovuta alla produzione batterica di gas idrogeno a livello della mucosa intestinale. Recentemente una precoce e anomala colonizzazione delle feci con Clostridium perfringens à ̈ stata correlata con un tardivo sviluppo di NEC. Il Clostridium perfringens à ̈ stato isolato dal 40% di neonati con NEC, paragonato con il 13% di confronto.
L’esposizione dei pretermine ad alimentazione con latte artificiale, l’uso precoce e prolungato di antibiotici ad ampio spettro e lo sviluppo di una flora batterica patologica porta ad un’abnorme colonizzazione del tratto gastroenterico da parte di bacteroides, clostridi ed enterobacteriaceae capaci di attivare una cascata infiammatoria con apoptosi delle cellule e danno della barriera mucosale. Viceversa la presenza di microorganismi commensali quali bifidobatteri e lattobacilli, tipici della normale flora intestinale e del neonato a termine allattato al seno, à ̈ essenziale per il priming e la regolazione delle difese immunitarie.
La flora infatti aumenta e mantiene l’integrità della barriera mucosale, riducendo la permeabilità , aumentando la produzione di muco, consolidando le giunzioni intercellulari e inibendo la traslocazione batterica.
La barriera mucosale à ̈ composta da un singolo strato di cellule epiteliali che fungono da interfaccia tra il contenuto luminale e le strutture subepiteliali. Questa barriera blocca la traslocazione batterica attraverso meccanismi strutturali quali le tight junctions e difese biochimiche come il lisozima. L’immaturità delle cellule intestinali può portare ad un eccessivo rilascio di sostanze ossidanti e di proteasi che distruggono la barriera, viceversa un’inadeguata risposta infiammatoria potrebbe lasciare indifesa la mucosa.
Anche se il parto pretermine, incidenti da ipossia-ischemia, formula nutrizionale e anomala colonizzazione batterica sono riconosciuti fattori di rischio, il ruolo della genetica e di mediatori vasoattivi /infiammatori non à ̈ chiaro.
L’allattamento al seno à ̈ il trattamento preventivo più efficace. Recenti progressi nella prevenzione dell’enterocolite necrotizzante si sono concentrati su nutrienti bioattivi e fattori trofici contenuti nel latte materno.
Nonostante il tratto gastrointestinale del neonato sia sterile alla nascita, la colonizzazione batterica avviene in poche ore. Il contatto con la flora vaginale materna da inizio a questo processo che à ̈ ulteriormente implementato dalla nutrizione orale e dall’esposizione all’ambiente. Di fatto, neonati allattati al seno hanno 10X minor probabilità di sviluppare NEC rispetto ai neonati nutriti con formule nutrizionali, questo suggerisce che il latte materno contiene molteplici fattori bioattivi che influenzano l’immunità , l’infiammazione e la protezione della mucosa. Il latte materno aumenta considerevolmente la diversità della colonizzazione batterica intestinale e contiene fattori immunomodulanti come immunoglobuline IgG e IgA, leucociti, mucina, lisozima, citochine, lattoferrina, fattori di crescita, agenti antibatterici, enzimi, oligosaccaridi e acidi grassi polinsaturi non contenuti nei preparati a base di latte artificiale in commercio. Questi fattori sono in grado di indurre protezione della mucosa e di neutralizzare potenti citochine pro infiammatorie e fosfolipidi.
Tutti questi fattori, escluse le immunoglobuline, sono distrutti da trattamenti sopra i 54°C e da radiazioni γ superiori a 10 Gray.
E’ dimostrata l’utilità del latte materno come profilassi della NEC. E’ dimostrato inoltre che l’allattamento con latte formula à ̈ la causa di molte patologie a breve e a lungo termine nei nuovi nati. Le patologie a breve termine comprendono lesioni infiammatorie e degenerative del tratto gastrointestinale, dei polmoni e patologie neuromuscolari mentre le patologie a lungo termine comprendono la diminuzione del quoziente di intelligenza e la propensione al cancro. Gli anticorpi, le sostanze antibatteriche e antivirali, le citochine e i fattori di crescita naturalmente presenti nel latte materno sono in parte producibili con l’ingegneria genetica (non tutti e a costi altissimi) oppure possono essere isolati dal siero di mammiferi, dalla placenta e dal colostro.
Descrizione dell’invenzione
Secondo la corrente letteratura scientifica, l’azione terapeutica delle cellule staminali può essere riconducibile a due meccanismi: differenziazione delle cellule staminali in cellule residenti e rilascio di fattori trofici rigenerativi da parte delle cellule staminali. I rispettivi contributi di questi due meccanismi rimangono da chiarire, anche se à ̈ stato ipotizzato che non siano le cellule staminali a trasformarsi in cellule mature del tessuto leso, ma che esse trasmettano dei fattori vitali a questo tessuto, che può così tornare a proliferare e a differenziarsi, rigenerandosi (Fig. 1).
La terapia con cellule staminali presenta molti problemi legati non solo ai costi e a complicazioni tecniche ed applicative, ma anche a scrupoli etici e religiosi.
La terapia con cellule staminali à ̈ attuabile solo per via iniettiva o, in alcuni casi, topica, e non per via orale. Il sovranatante delle cellule staminali in coltura contiene fattori di crescita, citochine, fattori chemiotattici ecc. che si ritiene siano responsabili dell’effetto benefico della terapia staminale sulla crescita e/o riparazione dei tessuti.
L’eventuale utilizzo dei fattori vitali isolabili dal sovranatante delle cellule staminali presenta, tuttavia, non solo gli stessi problemi etici dell’uso delle cellule staminali stesse ma anche costi molto elevati.
Si à ̈ sorprendentemente scoperto che nei liquidi biologici e in alcuni tessuti dei mammiferi sono presenti gli stessi fattori attivi rilasciati dalle cellule staminali e pertanto presenti nel sovranatante delle colture delle cellule staminali stesse. Le migliori sorgenti di questi fattori sono il siero, la placenta e il colostro dei mammiferi.
La Tabella riporta il confronto qualiquantitativo fra i fattori presenti nel sovranatante delle colture di cellule staminali e i fattori isolati da queste nuove sorgenti da noi denominati POOL OF MATERNAL FACTORS (P.M.F.).
Tabella
P.M.F. Mesenchymal NAME (pg/ml) stem cells (pg/ml) IL-1 ra IL-1 receptor antagonist 29.05 0.0 IL-1b Interleukin -1b 0.09 0.0 IL-2 Interleukin-2 32.05 0.0 IL-4 Interleukin-4 0.17 21.12 IL-6 Interleukin-6 1.26 293.01 IL-8 Interleukin -8 0.71 359.56 IL-9 Interleukin 3.66 0.78 IL-10 Interlenkin- 10 2.83 0.99 IL-12 Interlenkin- 12 1.73 0.0 IL-15 Interlenkin- 15 4.33 0.5 IL- 17 Interlenkin- 17 21.95 0.32 Eotaxin Eotaxin 5.01 0.0 I\F-y Gamma -interferon 5.97 1 1.14 MCP-1 Monocyte chemotactic factor- 1 4,12 11.23
PDGF Platelet derived growth factor 11.55 3.08 TM Iunior necrosis factor 40.00 12.30
Vascular endothelial growth 4 1.00 208.04 VEGF factor
HGF Hepatocyte growth factor 52.3 100.74 F GF Fibroblast growth factor 180.15 18.21 TGF- 64.00 51.32 beta1 transforming growth factor
IGF-1 insulin-like growth factor 160 0.0 GM- Granulocyte/monocyte-colony 183.85 0.0 GSF stimulating factor
FIF leukemia inhibitorl factor 15.20 27.32 SCF stem cell factor 10.55 4.54 SDF-1 stromal derived factor- 1 41.75 28.8 NGF Nerve growth factor 8.33 0.0 BMP-2 Bone morphogenic protein 25.01 2.65
RNA 189 ng/ml 48 pg/tnl
Presenza di fattori di crescita/citochine in Ρ.Μ.F, (pg/ml) e nel di Cellule Staminali Mesenchimali (1 milione di cellule).
E’ evidente (tabella) la maggior concentrazione di quasi tutti i fattori presenti nel P.M.F. rispetto a quella presente nel sovranatante delle cellule staminali.
E’ inoltre evidente la possibilità di utilizzare concentrazioni terapeutiche anche molto alte di P.M.F., ad esempio dosi da 0,5/1 g per via topica o iniettiva e dosi fino a 20/30 g per via orale, rispetto alle massime concentrazioni terapeutiche utilizzate di cellule staminali che corrispondono a 1/2 milioni/Kg e pertanto a un massimo di 140 milioni per terapia e, dunque, a valori di fattori sempre dell’ordine dei picogrammi.
L’oggetto dell’invenzione à ̈ quindi un composto (P.M.F.) contenente in altissima concentrazione tutti i fattori attivi presenti nel sovranatante delle cellule staminali ma isolati, con semplici metodiche estrattive, da fonti naturali molto economiche, di facile reperibilità e senza problemi etici.
Inoltre P.M.F., isolato dai liquidi biologici e dai tessuti di mammiferi, contiene anche fattori antibatterici (transferrina, lisozima, lactoperossidasi, lactoferrina) e anticorpi delle classi IgG e IgA. (P.M.F. Ab).
L’assenza di anticorpi e di antibatterici del sovranatante delle cellule staminali à ̈ un’ulteriore ragione per l’utilizzo di P.M.F. Ab in molti usi terapeutici, topici e per via orale.
Il siero presenta il massimo picco dei fattori negli ultimi giorni prima del parto, il colostro nelle prime ore dopo il parto e non oltre la 6° ora.
Già dopo 12 ore dal parto i fattori diminuiscono notevolmente, a 24 h molti di loro non sono più dosabili.
Questi fattori sono geneticamente molto conservati nelle varie specie e pertanto à ̈ possibile usare sull’uomo fattori isolati da altre specie di mammiferi come i bovini, gli equini, i cammelli, i mammiferi marini ecc. I fattori sono controllati con metodiche ELISA specifiche per la specie, anche se la cross reazione interspecie à ̈ altissima in quanto i fattori sono filogeneticamente molto conservati e, pertanto, solo qualitativamente sono misurabili anche con ELISA utilizzati per specie diverse (es: uomo-bovino e viceversa).
Una prima fonte dei fattori dell’invenzione à ̈ il siero di mammiferi che, negli ultimi giorni (5-15) prima del parto, à ̈ molto ricco dei fattori attivi oggetto dell’invenzione rispetto a mammiferi non gravidi o ai primi mesi di gravidanza. Si descrive di seguito, a titolo di esempio, una metodica di estrazione da siero.
Si preleva 1 litro di sangue in 4 giorni per 4 prelievi complessivi per non danneggiare l’animale, preferibilmente bovino o equino.
Il sangue viene sierato a temperatura ambiente per 24 h e quindi centrifugato per spremere il coagulo.
Si recupera il siero (circa il 30/40% del volume totale) a cui si aggiungono, come agenti antisettici, fenossietanolo al 2,5% e diazolidinil-urea all’1%. Il siero così trattato viene quindi frazionato con i seguenti passaggi.
Ultrafiltrazione 300'000 Da
Il campione di siero (congelato a -20°C) ottenuto per coagulazione e centrifugazione da sangue di mammifero viene scongelato a temperatura ambiente e diluito con 2 volumi di acqua demineralizzata. La soluzione ottenuta viene ultrafiltrata su membrana piana a flusso tangenziale Millipore Pellicon Biomax in polyethersulfone da 300'000 Da ad una Pi di 0,5 ÷1 bar, in camera fredda a 4°C.
Il retentato e una frazione corrispondente a circa 1:10 del permeato vengono trasferiti in un tubi da dialisi Spectrum Spectrapor in cellulosa rigenerata da 1'000 Da e dializzati contro acqua demineralizzata.
Ultrafiltrazione 5'000 Da
Il restante permeato viene ultrafiltrato su membrana da 5000 Da. Il permeato dell’ultrafiltrazione da 300'000 Da viene concentrato su membrana piana a flusso tangenziale Millipore Pellicon Biomax in polyethersulfone da 5000 ad una Pi di 0,5 ÷1 bar, in camera fredda a 4°C.
Il retentato viene trasferito in un tubo da dialisi Spectrum Spectrapor in cellulosa rigenerata da 1'000 Da e dializzato contro acqua demineralizzata (con questa dialisi si eliminano anche i conservanti). Il composto à ̈ quindi immediatamente liofilizzato.
Una seconda fonte dei fattori dell’invenzione à ̈ la placenta. Si descrive di seguito, a titolo di esempio, una metodica di estrazione.
Vengono utilizzate preferibilmente placente bovine o equine.
Omogeneizzazione
La placenta (congelata a -20°C) viene scongelata a temperatura ambiente, tagliata in piccoli pezzi, lavata con abbondante soluzione fisiologica (NaCl 0,9%) fredda (4°C) e omogeneizzata tramite cutter Siramm in un buffer di lisi così composto: Tris/HCl 50 mM, EDTA 25mM, triton X-100 0,001% a pH 7,4. Alla sospensione ottenuta viene aggiunto NaCl fino ad una concentrazione dello 0,9%, e i conservanti (fenossietanolo al 2,5% e diazolidinil-urea all’1%). La sospensione viene posta sotto agitazione (agitatore magnetico) per 2 ore e mantenuta statica overnight in camera fredda a 4°C.
Centrifugazione
La sospensione viene centrifugata a 13’000 rpm con centrifuga Sorvall RC6 e rotore SLA 15000 per 45 minuti a 4°C. Il surnatante della centrifugazione viene recuperato, prefiltrato sotto vuoto su Dicalite e su filtri in cellulosa rigenerata da 0,45 µm e 0,22 µm.
Ultrafiltrazione 300'000 Da
Il prodotto filtrato viene ultrafiltrato su membrana piana a flusso tangenziale Millipore Pellicon Biomax in polyethersulfone da 300'000 Da ad una Pi di 0,5÷1 bar, in camera fredda a 4°C.
Ultrafiltrazione 5'000 Da:
Il permeato dell’ultrafiltrazione da 300'000 Da viene concentrato su membrana piana a flusso tangenziale Millipore Pellicon Biomax in polyethersulfone da 5'000 ad una Pi di 0,5 ÷1 bar, in camera fredda a 4°C. Il retentato viene trasferito in un tubo da dialisi Spectrum Spectrapor in cellulosa rigenerata da 1'000 Da e dializzato contro acqua demineralizzata (si eliminano pertanto anche i conservanti) e quindi immediatamente liofilizzato.
Una ulteriore fonte dei fattori dell’invenzione à ̈ il colostro. Si usa preferibilmente colostro bovino per la facilità di approvvigionamento e le quantità disponibili. E’ particolarmente preferito il colostro da mucche di razza Holstein (Frisona) e Guernsey. E’ stato provato che tali mucche producono colostro con la maggior concentrazione di fattori attivi. Le mucche sono preferibilmente al secondo o terzo parto. Il colostro à ̈ preferibilmente raccolto fra la 1° e la 6° ora dal parto in quanto, in questo periodo, si assiste alla maggior concentrazione di attivi. Nel colostro a partire dalla sesta ora dal parto i fattori attivi diminuiscono rapidamente (dopo 24 ore ne sono presenti solo il 15%).
Il colostro raccolto à ̈ sottoposto a test per tubercolosi, citotossicità su culture cellulari, controllo di micoplasmi, prioni e di virus umani e bovini.
Il colostro nella cisterna mammaria à ̈ praticamente sterile, ma una volta munto, nonostante ogni precauzione, per l’alta concentrazione di fattori di crescita, la sua carica batterica sale molto rapidamente durante la gelatura e la sgelatura, processi piuttosto lenti data l’alta densità del colostro nelle prime ore.
L’utilizzo di raggi γ permette di ottenere un colostro sterile solo se si utilizzano radiazioni superiori a 10 Kgy che tuttavia distruggono gran parte dei fattori attivi, e d’altronde questo metodo non impedisce la formazione di pirogeni il cui utilizzo à ̈ sconsigliabile per via orale o topica e proibito per via parenterale.
E’ stata pertanto messa a punto una filiera di raccolta innovativa, per ottenere un composto anallergico sterile, senza conservanti e senza pirogeni.
Al colostro raccolto in taniche sterili (sterilizzate a vuoto a 25 Kgy) si aggiungono agenti antisettici in quantità tali da garantire la sterilità e l’assenza di pirogeni. Si impiegano preferibilmente fenossietanolo alla concentrazione del 2,5% e diazolidinil-urea a una concentrazione dell’1%.
Il colostro così trattato può, per brevi periodi (max 30 gg) non essere conservato congelato prima dei processi di estrazione dei fattori attivi, con evidente risparmio dei costi industriali. I fattori attivi possono essere estratti con i seguenti passaggi:
Centrifugazione
Il colostro bovino viene diluito 1:10 con acqua demineralizzata, si aggiunge NaCl fino ad ottenere una concentrazione dello 0,9%.
La sospensione viene centrifugata in continuo a 8'000 rpm a temperatura di 20-25°C con una centrifuga Alfa Laval scartando il pellet corrispondente alla parte lipidica.
Ultrafiltrazione ceramica da 300'000 Da
Il prodotto ottenuto dalla centrifugazione viene ultrafiltrato su membrana ceramica con cut-off 300'000 Da ad una temperatura di 20-25°C recuperando il permeato.
Ultrafiltrazione su 5000 Da
Il permeato dell’ultrafiltrazione 300'000 Da viene concentrato su membrana a spirale avvolta da 5'000 Da in polyethersulfone ad una temperatura di 20-25°C e dializzato contro acqua demineralizzata fino ad una conducibilità del retentato di circa 600 µs/cm<2>(con questa dialisi si eliminano anche i conservanti).
Liofilizzazione
Il retentato dell’ultrafiltrazione da 5000 Da viene filtrato sotto vuoto su filtri Millipore in cellulosa rigenerata da 0,2 µm, congelato a -20°C e liofilizzato.
I prodotti di estrazione da siero, placenta o colostro, chiamati P.M.F. Ab, contengono i seguenti fattori:
Immunoglobuline della classe IgG2 e IgA(γ/mg), in proporzione pari a circa il 60% del contenuto di P.M.F. Ab (circa 50% IgG2 e circa 10% IgA), dotate di una specificità naturale contro molti batteri e virus, alcuni dei quali responsabili della sovrapposizione infettiva della NEC.
COMPLEMENTO C3/C4: Il complemento à ̈ costituito da proteine circolanti capaci di interagire con le membrane biologiche e con specifici recettori situati sulla superficie di diversi tipi cellulari e che hanno la capacità di indurre reazioni infiammatorie che aiutano a combattere le infezioni.
FATTORI ANTIBATTERICI/ANTIVIRALI
Transferrina: rilascia ferro ai globuli rossi e impedisce la chelazione del ferro da parte di batteri e virus.
Lactoferrina: toglie ai batteri e ai virus il ferro di cui necessitano per crescere.
Lisozima: ha effetti antibatterici, dovuti non solo alle sue proprietà enzimatiche, ma anche alle proprietà cationiche ed idrofobiche.
Lattoperossidasi: à ̈ il più potente enzima contenuto nel colostro. Inibisce il metabolismo batterico ossidando i gruppi sulfidrilici di proteine essenziali.
FATTORI DI CRESCITA TGF-β1- TRASFORMIG GROWTH FACTOR: stimola la produzione di immunoglobuline della classe A, responsabili delle difese immunitarie a livello mucoso. Modula la proliferazione cellulare e stimola la deposizione di matrice extracellulare.
EGF-EPIDERMAL GROWTH FACTOR: regola lo sviluppo della mucosa. Promuove la formazione di cellule epiteliali.
IGF 1- INSULIN-LIKE GROWTH FACTOR: modula la proliferazione, l’adesione e la migrazione cellulare e induce la maturazione delle mucose.
VEGF- VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR: stimola la produzione di vasi sanguigni. Presenta attività mitogenetica e di attivazione della permeabilità vascolare.
FGF- b- FIBROBLAST GROWTH FACTOR BASIC: stimola la proliferazione delle cellule di origine mesenchimale come fibroblasti, cellule endoteliali, astrociti, cheratinociti. Agisce come fattore chemiotattico e fitogenetico.
GH-GROWTH HORMONE: fattore generale di crescita di ogni tessuto. GHRF: GROWTH HORMONE RELEASING FACTOR.
NGF-NERVE GROWTH FACTOR: stimola l’attività e la regolazione della crescita e della differenziazione del sistema simpatico.
SCF- STEM CELL FACTOR: fattore pleiotropico che agisce, in utero e nel neonato, sullo sviluppo delle cellule germinali e neurali e sull’ematopoiesi.
FATTORI CHEMIOTATTICI EOTAXINA: si lega ai recettori delle chemochine per richiamare gli eosinofili nei tessuti infiammati.
IP-10-Chemochin ligand 10: indotta dall’interferone gamma aggrega le cellule infiammatorie.
MCP-1 Monocyte chemotactic factor-1: favorisce l’aggregazione dei monociti ai tessuti infiammati.
CITOCHINE IL1-ra: membro della famiglia dell’interleuchina 1. Modula la risposta immune e antiinfiammatoria.
IL-2: induce la proliferazione dei linfociti T.
IL-9: regolatore delle cellule emopoietiche, stimola la proliferazione cellulare e previene l’apoptosi.
IL-17: Regola le attività dell’NF-KB e potenzia la produzione di ossido nitrico(NO).
IL-10: presenta effetti pleiotropici nell’immunoregolazione e nell’ infiammazione. Migliora la sopravvivenza delle cellule B e pertanto la produzione di anticorpi. Studi sui topi Knockout dimostrano che questa proteina à ̈ essenziale nell’immunoregolazione del tratto intestinale.
INTERFERON-gamma: presenta note attività antivirali, antitumorali e immunoregolatorie. E’ un potente attivatore dei macrofagi.
TNF-α- Tumour necrosis factor: stimola la migrazione di neutrofili e monociti nella sede delle infezioni.
La frazione così ottenuta e contenente i fattori sopra elencati non solo à ̈ in grado di sostituire il latte materno per la profilassi delle NEC, ma à ̈ anche in grado, vista la superiore concentrazione di fattori attivi rispetto al latte materno stesso, di fornire un valido effetto terapeutico in tutti e tre gli stadi della NEC (stadiazione di Bell). La frazione dell’invenzione potrà essere formulata in composizioni adatte alla somministrazione orale per la prevenzione e per il trattamento di NEC allo stadio 1 e 2, oppure in composizioni adatte alla somministrazione via endovenosa per il trattamento di NEC agli stadi 2 e 3, quando il neonato non à ̈ in grado di ricevere alimenti per via orale. Esempi di formulazioni adatta sono capsule, compresse, preparati in polvere per latte artificiale, fiale sterili. Il dosaggio per via orale à ̈ tipicamente compreso fra 20 e 40 g/die, mentre quello endovenoso fra 1 e 20 g/die. Il trattamento può essere prolungato per diversi mesi, fino a tre- cinque mesi o più.
Le composizioni dell’invenzione possono anche essere vantaggiosamente impiegate per la prevenzione delle patologie a breve e lungo termine dovute alla sola alimentazione con latte formula, nella terapia del morbo di Crohn, di gastroenteriti del bambino e dell’adulto, della patologia esofago corto, di ernie iatali, reflussi gastro-esofagei, delle enterocoliti da AIDS, sindrome del colon irritabile, colite propriamente detta (colite spastica, coliti infettive, coliti sistemiche, coliti da antibiotici).
L’invenzione à ̈ descritta in maggior dettaglio nella seguente parte sperimentale, data a titolo di esempio.
PARTE SPERIMENTALE
E’ stato creato un modello di NEC nel maiale identico, per effetti patologici macro e microscopici, a quello umano.
CONFRONTO TRA SOGGETTI ALIMENTATI CON LATTE FORMULA P.M.F. Ab E SOGGETTI ALIMENTATI SOLO CON LATTE FORMULA
I soggetti alimentati con latte formula più 20 g/die di P.M.F. Ab presentano una crescita regolare sovrapponibile a quella del gruppo di controllo mantenuto sotto scrofa. I suinetti alimentati fin dalla nascita soltanto con il latte formula dopo il primo giorno di regolare accrescimento manifestano fin dal secondo giorno prostrazione, atassia locomotoria, interruzione dell’alimentazione spontanea, rigurgito e diarrea. Dopo un veloce dimagramento nel giro di ulteriori 24-48 ore si assiste al decesso (Figura 2) L’esame istopatologico dei vari tratti del grosso intestino prelevati post mortem permette di diagnosticare una enterocolite acuta necrotizzante ad esito letale (Figura 3-4 A/B).
La microscopia elettronica conferma i referti di enterocolite acuta necrotizzante (Figura 5-6-7 A/B).
CONFRONTO TRA GRUPPI ALIMENTATI CON DOSAGGI CRESCENTI DI P.M.F. Ab
Il gruppo di soggetti alimentati con latte formula 20 g/die di P.M.F.
Ab presenta una crescita regolare, del tutto sovrapponibile a quella del gruppo di controllo mantenuto sotto scrofa.
Il gruppo di soggetti alimentati con latte formula 1 g/die di P.M.F. Ab si comporta esattamente come il gruppo di suinetti alimentati fin dalla nascita soltanto con il latte formula e cioà ̈ dopo il primo giorno di regolare accrescimento, manifesta fin dalla mattina del secondo giorno una profonda prostrazione che sfocia in una completa atassia locomotoria, nella interruzione dell’alimentazione spontanea, nella comparsa di tremori, rigurgito e diarrea. I soggetti dimagriscono velocemente e nel giro di ulteriori 24-48 ore si assiste al decesso dell’intero gruppo.
Il gruppo di soggetti alimentati con latte formula 5 g/die di P.M.F. Ab manifestano, dopo il primo giorno di regolare accrescimento, la comparsa di vomito e diarrea. Nei giorni successivi l’appetito à ̈ conservato, anzi esaltato fino alla voracità , ma la continua diarrea e l’accentuarsi dei fenomeni di rigurgito dopo ogni pasto, portano gli animali verso uno stato di vera e propria cachessia e nel giro di pochi giorni alla morte dell’intero gruppo.
L’esame istopatologico di vari tratti del grosso intestino prelevati dai gruppi di soggetti alimentati rispettivamente con 1 g/die e 5 g/die di P.M.F. Ab, permette di diagnosticare, anche in questo caso, una enterocolite acuta necrotizzante ad esito letale.
Il gruppo di soggetti alimentati con latte formula 10 g/die di P.M.F. Ab manifestano, dopo i primi giorni di regolare accrescimento, la comparsa di diarrea. La diarrea si presenta con un andamento piuttosto altalenante diminuendo in alcuni giorni ed aumentando in altri, ciò provoca un rallentamento della curva di accrescimento. Al 13° - 14° giorno le manifestazioni patologiche si aggravano improvvisamente, subentra il vomito, i tremori, uno stato di profonda prostrazione, gli animali smettono di alimentarsi e nel giro di poche ore muoiono di colite acuta necrotizzante.
Il gruppo di soggetti alimentati con latte formula 15 g/die di P.M.F. Ab presentano una crescita regolare, non si osservano manifestazioni patologiche di alcun genere, ma le performance di accrescimento sono leggermente inferiori rispetto a quelle ottenute dal gruppo di soggetti alimentati con latte formula 20 g/die di P.M.F. Ab (Figura 8).
Da notare che nel gruppo di suini alimentati con 10 g/die si nota, oltre alla differenza di accrescimento, si presenta la formazione di un trasudato cutaneo che si solidifica a formare una sorta di “crosta lattea†. Perfette invece le condizioni della cute del soggetto di controllo (Figura 9).
Il gruppo di soggetti alimentati con latte formula 20 g/die di P.M.F. Ab (mantenuto fino al 15° giorno) presentano una crescita regolare, del tutto sovrapponibile a quella del gruppo di controllo mantenuto sotto scrofa.
Il gruppo di soggetti alimentati con latte formula 20 g/die di P.M.F. Ab (sospeso dopo 2 gg) manifestano, dopo le prime 48 h di regolare accrescimento, la diminuzione dell’appetito e la comparsa di vomito e diarrea. Mangiano sempre meno e nel giro di pochi giorni si assiste all’interruzione dell’alimentazione spontanea, al dimagrimento che esita nella cachessia, all’accentuazione dei fenomeni di vomito e diarrea, fino ad arrivare velocemente al decesso dell’intero gruppo per colite acuta necrotizzante.
Il gruppo di soggetti alimentati con latte formula 20 g/die di P.M.F. Ab (sospeso dopo 5 e 10 gg) manifestano, dopo i primi giorni di regolare accrescimento, la diminuzione dell’appetito e la comparsa di vomito e diarrea.
Le manifestazioni patologiche si mantengono su livelli medio-bassi, non provocando la morte dei soggetti, ma una quasi totale interruzione delle performance di accrescimento.
L’esame istopatologico di vari tratti del grosso intestino prelevati post mortem dagli animali del gruppo alimentato con latte formula 20 g/die di P.M.F. Ab (sospeso dopo 2 gg), permette di diagnosticare una enterocolite acuta necrotizzante ad esito letale che coinvolge l’intero tratto intestinale (Figura 10).
SOMMINISTRAZIONE RITARDATA DI P.M.F. Ab P.M.F. Ab somministrato per via orale alla comparsa dei primi sintomi, tipici dello stadio I di Bell, riesce a porre termine alla patologia in atto e i soggetti presentano successive performance di accrescimento assimilabili a quelle dei soggetti di controllo. Se i sintomi sono eclatanti, corrispondenti allo stadio II e III di Bell, la somministrazione orale à ̈ insufficiente ma la somministrazione per via endovenosa à ̈ risolutiva (Figura 11).
CONFRONTO TRA SOGGETTI ALIMENTATI CON LATTE FORMULA P.M.F. Ab E SOGGETTI ALIMENTATI SOLO CON P.M.F. Ab SOLUZIONE ZUCCHERINA AD LIBITUM
I suinetti alimentati ad libitum con acqua zuccherata 20 g/die di P.M.F. Ab e pertanto senza l’apporto di latte formula non presentano patologia di alcun genere ma perdono peso in modo costante, segno di un insufficiente apporto di nutrienti fornito dalla soluzione zuccherina in luogo del latte formula. Questi soggetti arrivano comunque a morte ma incredibilmente l’esame istopatologico del colon si presenta assolutamente normale senza alcun segno di enterocolite acuta necrotizzante (Figura 12).
Claims (5)
- RIVENDICAZIONI 1. Composizioni comprendenti citochine, fattori di crescita, RNA e anticorpi isolati da siero, placenta e colostro, per la terapia della enterocolite acuta necrotizzante (NEC) nei prematuri e nei neonati a termine e per la prevenzione delle patologie a breve e a lungo termine dovute all’alimentazione con latte artificiale.
- 2. Composizioni secondo la rivendicazione 1 comprendenti Immunoglobuline della classe IgG2 e IgA, complemento c3/c4, Transferrina, Lactoferrina, Lisozima, Lattoperossidasi, TGF-β1, EGF, IGF 1, VEGF, FGF- b, GH, GHRF, NGF, SCF, eotaxina, MCP-1, IL1-ra, IL-2, IL-9, IL-17, IL-10, interferon-gamma, TNF-α.
- 3. Composizioni secondo la rivendicazione 1 o 2 ottenute da siero di mammiferi.
- 4. Composizioni secondo la rivendicazione 1 o 2 ottenute da placenta.
- 5. Composizioni secondo la rivendicazione 1 o 2 ottenute da colostro.
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