ITMI20112441A1 - COMPOSITIONS INCLUDING GROWTH FACTORS, CHEMOTACTIC AND ANTIBACTERIAL / ANTIVIRAL FACTORS, IMMUNOGLOBULINES AND CYTOKINES FOR THE THERAPY OF ACUTE NECROSTITATING ENTEROCOLITIS (NEC) IN PREMATURE AND FOR INFANT INFLATORS AND FOR THE PREVENTION OF - Google Patents

Description

“COMPOSIZIONI COMPRENDENTI FATTORI DI CRESCITA, FATTORI CHEMIOTATTICI E ANTIBATTERICI/ANTIVIRALI, IMMUNOGLOBULINE E CITOCHINE PER LA TERAPIA DELLA ENTEROCOLITE ACUTA NECROTIZZANTE (NEC) NEI PREMATURI E NEI NEONATI A TERMINE E PER LA PREVENZIONE DELLE PATOLOGIE A BREVE E A LUNGO TERMINE DOVUTE ALL’ALIMENTAZIONE CON LATTE ARTIFICIALE†⠀ œCOMPOSITIONS INCLUDING GROWTH FACTORS, CHEMOTACTIC FACTORS AND ANTIBACTERIAL / ANTIVIRAL FACTORS, IMMUNOGLOBULINS AND CYTOKINES FOR THE THERAPY OF ACUTE NECROTIZING ENTEROCOLITIS (NEC) IN PREMATURE AND NEWBORN DISEASES IN THE LONG TERM FEEDING WITH ARTIFICIAL MILKâ €

La presente invenzione ha per oggetto composizioni comprendenti fattori di crescita, citochine, fattori antibatterici e anticorpi per la terapia della enterocolite acuta necrotizzante (NEC) nei prematuri e nei neonati a termine e per la prevenzione delle patologie a breve e a lungo termine dovute all’alimentazione con latte artificiale. The present invention relates to compositions comprising growth factors, cytokines, antibacterial factors and antibodies for the therapy of acute necrotizing enterocolitis (NEC) in premature and full-term newborns and for the prevention of short and long-term pathologies due to infant formula feeding.

Stato della tecnica State of the art

L’enterite necrotizzante (NEC) à ̈ una patologia acuta caratterizzata da necrosi della mucosa intestinale che interessa più comunemente la zona ileo-colica. La progressione della necrosi può arrivare a coinvolgere l'intero spessore della parete intestinale, determinando una perforazione, con peritonite e sepsi fino all’exitus. Necrotizing enteritis (NEC) is an acute pathology characterized by necrosis of the intestinal mucosa that most commonly affects the ileocolic area. The progression of necrosis can involve the entire thickness of the intestinal wall, causing perforation, with peritonitis and sepsis up to exitus.

La causa della NEC non à ̈ nota. Secondo la teoria patogenetica formulata da J.R. Llyod nel 1969, la NEC sarebbe l’evento finale di una “cascata†che coinvolge l’ischemia intestinale, alterazioni della barriera mucosale, traslocazione e colonizzazione batterica, fino alla perforazione intestinale. Sicuramente si tratta di una patologia a genesi multifattoriale, in cui giocano un ruolo importante l’immaturità della motilità del tratto gastroenterico, delle capacità digestive, della regolazione del circolo, della funzione di barriera e delle difese immunitarie del neonato. Schematicamente à ̈ possibile individuare tre meccanismi: squilibrio della vascolarizzazione intestinale, alterata composizione della flora batterica e alterazione del meccanismo di barriera della mucosa intestinale. The cause of the NEC is unknown. According to the pathogenetic theory formulated by J.R. Llyod in 1969, NEC would be the final event of a "waterfall" involving intestinal ischemia, alterations of the mucosal barrier, bacterial translocation and colonization, up to intestinal perforation. It is undoubtedly a multifactorial pathology in which the immaturity of the motility of the gastrointestinal tract, digestive abilities, circulation regulation, barrier function and the immune defenses of the newborn play an important role. Schematically it is possible to identify three mechanisms: imbalance of intestinal vascularization, altered composition of the bacterial flora and alteration of the barrier mechanism of the intestinal mucosa.

L’enterocolite necrotizzante (NEC) à ̈ dunque una malattia infiammatoria intestinale ed à ̈ una delle più comuni emergenze gastrointestinali nei neonati. L’insorgenza della NEC avviene spesso nei primi tre mesi di vita e i neonati che hanno un peso alla nascita molto basso (inferiore a 1000 g) e nascono sotto le 28 settimane di gestazione sono i più suscettibili all’insorgenza della malattia. I neonati a termine rappresentano circa il 10% di tutti i casi di NEC, mentre i prematuri rappresentano circa il 90%. Con un’incidenza dall’1% al 5% per tutti i neonati ammessi alle unità di trattamento per le NEC c’à ̈ una prevalenza dal 7% al 14% di neonati con basso peso alla nascita (500-1500g) e una mortalità che va dal 20% al 50%. La NEC continua a rappresentare un importante problema clinico. I progressi nelle cure ostetriche e neonatali hanno migliorato la sopravvivenza per i neonati più piccoli e immaturi e dal momento che più neonati pretermine a basso peso sopravvivono al periodo neonatale, la popolazione a rischio di NEC aumenta. Non à ̈ stata identificata sostanziale associazione tra sesso, razza e NEC. A causa del trattamento inadeguato e della mancanza di strategie preventive circa dal 20% al 40% dei neonati con NEC vengono sottoposti ad intervento chirurgico e dal 10% al 30% sviluppano una significativa morbidità che comprende danni allo sviluppo neurologico, alla vista e all’udito, ritardo nella crescita, anomalie nella nutrizione, diarrea, ostruzione intestinale e sindrome dell’intestino corto. La mortalità a seguito di intervento chirurgico à ̈ di circa il 50%. La NEC rappresenta anche un carico per il servizio sanitario con spese annue di ospedalizzazione di circa 6,5 milioni di $ negli Stati Uniti. Pertanto, la NEC continua ad essere un importante problema di salute per i neonati pretermine, per i neonati a termine, ma sottopeso, e per il 10% dei neonati a termine. Necrotizing enterocolitis (NEC) is therefore an inflammatory bowel disease and is one of the most common gastrointestinal emergencies in newborns. The onset of NEC often occurs in the first three months of life and infants who have a very low birth weight (less than 1000g) and are born under 28 weeks of gestation are the most susceptible to the onset of the disease. Full-term infants account for about 10% of all NEC cases, while preterm infants account for about 90%. With an incidence of 1% to 5% for all infants admitted to treatment units for NEC there is a prevalence of 7% to 14% of low birth weight infants (500-1500g) and a mortality ranging from 20% to 50%. NEC continues to be an important clinical problem. Advances in obstetric and neonatal care have improved survival for younger and more immature infants, and as more low-weight preterm infants survive the neonatal period, the population at risk for NEC increases. No substantial association between sex, race and NEC has been identified. Due to inadequate treatment and a lack of preventive strategies, approximately 20% to 40% of newborns with NEC undergo surgery and 10% to 30% develop significant morbidity which includes damage to neurodevelopment, vision and eyes. Hearing, growth retardation, abnormal nutrition, diarrhea, intestinal obstruction and short bowel syndrome. Mortality following surgery is approximately 50%. The NEC also represents a health service burden with annual hospitalization costs of approximately $ 6.5 million in the United States. Therefore, NEC continues to be a major health concern for preterm infants, underweight full term infants, and 10% of full term infants.

Il colon à ̈ la parte più comunemente colpita dalla NEC. La severità della necrosi della parete intestinale varia da una necrosi piccola e localizzata di un tratto di intestino fino alla necrosi transmurale di tutto il colon nei casi più severi. Negli stadi più avanzati della NEC i riscontri patologici comprendono sanguinamento gastrointestinale, infiammazione, enorme crescita batterica, distensione addominale con molteplici anse dilatate dell’intestino tenue, perforazione intestinale, necrosi coagulativa, ipotensione, shock settico, pneumoperitoneo e liquido intraaddominale. Nel 1978, Bell e colleghi hanno proposto un sistema uniforme di stadiazione dei neonati con NEC. Hanno classificato i neonati con stadio I (sospetto), stadio II (conclamato) e stadio III (avanzato). I criteri di stadiazione di Bell per la NEC rappresentano le linee guida per il trattamento. Idealmente si dovrebbero intraprendere interventi nutrizionali quando un neonato ha uno o più fattori di rischio di sviluppare NEC o à ̈ al primissimo stadio della patologia. The colon is the part most commonly affected by NEC. The severity of intestinal wall necrosis ranges from a small and localized necrosis of a tract of the intestine to transmural necrosis of the entire colon in the most severe cases. In the more advanced stages of NEC, pathological findings include gastrointestinal bleeding, inflammation, enormous bacterial growth, abdominal distension with multiple dilated loops of the small intestine, intestinal perforation, coagulative necrosis, hypotension, septic shock, pneumoperitoneum and intra-abdominal fluid. In 1978, Bell and colleagues proposed a uniform staging system for infants with NEC. They classified infants as stage I (suspected), stage II (full blown), and stage III (advanced). Bell's staging criteria for NEC are guidelines for treatment. Ideally, nutritional interventions should be undertaken when a newborn has one or more risk factors for developing NEC or is in the very early stage of the disease.

Si ipotizza che una sequenza ipossia-ischemia-riperfusione possa danneggiare la mucosa intestinale fino alla necrosi. In seguito ad un insulto ipossico si ha un riflesso primitivo di centralizzazione del circolo cioà ̈ una ridistribuzione del flusso ematico con perfusione preferenziale del cuore e del cervello a scapito di altri distretti, quali l’intestino. La lesione ischemica può essere conseguente a condizioni di riduzione del flusso mesenterico per fattori estrinseci, quali exsanguinotrasfusioni, cardiopatie congenite, pervietà del dotto di Botallo, o per fattori intrinseci, ovvero per un alterato bilancio tra mediatori della vasocostrizione (che hanno come effettore finale l’endotelina1) e mediatori della vasodilatazione che agiscono tramite l’ossido nitrico (NO). It is hypothesized that a hypoxia-ischemia-reperfusion sequence can damage the intestinal mucosa up to necrosis. Following a hypoxic insult there is a primitive reflex of centralization of the circulation, that is a redistribution of the blood flow with preferential perfusion of the heart and brain to the detriment of other districts, such as the intestine. The ischemic lesion can be consequent to conditions of reduction of the mesenteric flow due to extrinsic factors, such as exsanguinotransfusions, congenital heart disease, patency of the Botallo duct, or to intrinsic factors, or to an altered balance between mediators of vasoconstriction (which have as final effector the Endothelin1) and vasodilation mediators that act through nitric oxide (NO).

Gli studi epidemiologici hanno evidenziato l’associazione con specifici germi e virus (p. es.: Klebsiella, Escherichia coli, Clostridium difficile, Clostridium sp, rotavirus, stafilococchi ecc.), ma spesso non à ̈ possibile identificare alcun patogeno specifico. Depone per una causa infettiva il fatto che la pneumatosi intestinale, che à ̈ l’immagine radiologica tipica di tale malattia, à ̈ dovuta alla produzione batterica di gas idrogeno a livello della mucosa intestinale. Recentemente una precoce e anomala colonizzazione delle feci con Clostridium perfringens à ̈ stata correlata con un tardivo sviluppo di NEC. Il Clostridium perfringens à ̈ stato isolato dal 40% di neonati con NEC, paragonato con il 13% di confronto. Epidemiological studies have highlighted the association with specific germs and viruses (eg: Klebsiella, Escherichia coli, Clostridium difficile, Clostridium sp, rotavirus, staphylococci, etc.), but it is often not possible to identify any specific pathogen. The fact that intestinal pneumatosis, which is the typical radiological image of this disease, is due to the bacterial production of hydrogen gas in the intestinal mucosa proves for an infectious cause. Recently, early and abnormal colonization of faeces with Clostridium perfringens has been correlated with late development of NEC. Clostridium perfringens was isolated from 40% of neonates with NEC, compared with 13% comparison.

L’esposizione dei pretermine ad alimentazione con latte artificiale, l’uso precoce e prolungato di antibiotici ad ampio spettro e lo sviluppo di una flora batterica patologica porta ad un’abnorme colonizzazione del tratto gastroenterico da parte di bacteroides, clostridi ed enterobacteriaceae capaci di attivare una cascata infiammatoria con apoptosi delle cellule e danno della barriera mucosale. Viceversa la presenza di microorganismi commensali quali bifidobatteri e lattobacilli, tipici della normale flora intestinale e del neonato a termine allattato al seno, à ̈ essenziale per il priming e la regolazione delle difese immunitarie. Exposure of preterm babies to formula feeding, early and prolonged use of broad spectrum antibiotics and the development of pathological bacterial flora leads to abnormal colonization of the gastrointestinal tract by bacteroides, clostridia and enterobacteriaceae capable of activating an inflammatory cascade with cell apoptosis and damage to the mucosal barrier. Conversely, the presence of commensal microorganisms such as bifidobacteria and lactobacilli, typical of the normal intestinal flora and of the breast-fed term infant, is essential for the priming and regulation of the immune defenses.

La flora infatti aumenta e mantiene l’integrità della barriera mucosale, riducendo la permeabilità, aumentando la produzione di muco, consolidando le giunzioni intercellulari e inibendo la traslocazione batterica. The flora in fact increases and maintains the integrity of the mucosal barrier, reducing permeability, increasing the production of mucus, consolidating the intercellular junctions and inhibiting bacterial translocation.

La barriera mucosale à ̈ composta da un singolo strato di cellule epiteliali che fungono da interfaccia tra il contenuto luminale e le strutture subepiteliali. Questa barriera blocca la traslocazione batterica attraverso meccanismi strutturali quali le tight junctions e difese biochimiche come il lisozima. L’immaturità delle cellule intestinali può portare ad un eccessivo rilascio di sostanze ossidanti e di proteasi che distruggono la barriera, viceversa un’inadeguata risposta infiammatoria potrebbe lasciare indifesa la mucosa. The mucosal barrier is composed of a single layer of epithelial cells that act as an interface between the luminal content and the subepithelial structures. This barrier blocks bacterial translocation through structural mechanisms such as tight junctions and biochemical defenses such as lysozyme. The immaturity of intestinal cells can lead to an excessive release of oxidizing substances and proteases that destroy the barrier, vice versa an inadequate inflammatory response could leave the mucosa defenseless.

Anche se il parto pretermine, incidenti da ipossia-ischemia, formula nutrizionale e anomala colonizzazione batterica sono riconosciuti fattori di rischio, il ruolo della genetica e di mediatori vasoattivi /infiammatori non à ̈ chiaro. Although preterm delivery, hypoxia-ischemic accidents, nutritional formula and abnormal bacterial colonization are recognized risk factors, the role of genetics and vasoactive / inflammatory mediators is unclear.

L’allattamento al seno à ̈ il trattamento preventivo più efficace. Recenti progressi nella prevenzione dell’enterocolite necrotizzante si sono concentrati su nutrienti bioattivi e fattori trofici contenuti nel latte materno. Breastfeeding is the most effective preventive treatment. Recent advances in the prevention of necrotizing enterocolitis have focused on bioactive nutrients and trophic factors contained in breast milk.

Nonostante il tratto gastrointestinale del neonato sia sterile alla nascita, la colonizzazione batterica avviene in poche ore. Il contatto con la flora vaginale materna da inizio a questo processo che à ̈ ulteriormente implementato dalla nutrizione orale e dall’esposizione all’ambiente. Di fatto, neonati allattati al seno hanno 10X minor probabilità di sviluppare NEC rispetto ai neonati nutriti con formule nutrizionali, questo suggerisce che il latte materno contiene molteplici fattori bioattivi che influenzano l’immunità, l’infiammazione e la protezione della mucosa. Il latte materno aumenta considerevolmente la diversità della colonizzazione batterica intestinale e contiene fattori immunomodulanti come immunoglobuline IgG e IgA, leucociti, mucina, lisozima, citochine, lattoferrina, fattori di crescita, agenti antibatterici, enzimi, oligosaccaridi e acidi grassi polinsaturi non contenuti nei preparati a base di latte artificiale in commercio. Questi fattori sono in grado di indurre protezione della mucosa e di neutralizzare potenti citochine pro infiammatorie e fosfolipidi. Although the infant's gastrointestinal tract is sterile at birth, bacterial colonization occurs within hours. Contact with the maternal vaginal flora initiates this process which is further implemented by oral nutrition and exposure to the environment. In fact, breastfed infants are 10X less likely to develop NEC than infants fed with nutritional formulas, suggesting that breast milk contains multiple bioactive factors that affect immunity, inflammation and mucosal protection. Breast milk considerably increases the diversity of intestinal bacterial colonization and contains immunomodulating factors such as IgG and IgA immunoglobulins, leukocytes, mucin, lysozyme, cytokines, lactoferrin, growth factors, antibacterial agents, enzymes, oligosaccharides and polyunsaturated fatty acids not contained in the preparations to formula milk base available on the market. These factors are able to induce mucosal protection and neutralize potent pro-inflammatory cytokines and phospholipids.

Tutti questi fattori, escluse le immunoglobuline, sono distrutti da trattamenti sopra i 54°C e da radiazioni γ superiori a 10 Gray. All these factors, excluding immunoglobulins, are destroyed by treatments above 54 ° C and by γ radiation above 10 Gray.

E’ dimostrata l’utilità del latte materno come profilassi della NEC. E’ dimostrato inoltre che l’allattamento con latte formula à ̈ la causa di molte patologie a breve e a lungo termine nei nuovi nati. Le patologie a breve termine comprendono lesioni infiammatorie e degenerative del tratto gastrointestinale, dei polmoni e patologie neuromuscolari mentre le patologie a lungo termine comprendono la diminuzione del quoziente di intelligenza e la propensione al cancro. Gli anticorpi, le sostanze antibatteriche e antivirali, le citochine e i fattori di crescita naturalmente presenti nel latte materno sono in parte producibili con l’ingegneria genetica (non tutti e a costi altissimi) oppure possono essere isolati dal siero di mammiferi, dalla placenta e dal colostro. The usefulness of breast milk as a prophylaxis of NEC has been demonstrated. It is also shown that breastfeeding with formula milk is the cause of many short and long-term pathologies in newborns. Short-term pathologies include inflammatory and degenerative lesions of the gastrointestinal tract, lungs and neuromuscular pathologies while long-term pathologies include decreased intelligence quotient and cancer propensity. Antibodies, antibacterial and antiviral substances, cytokines and growth factors naturally present in breast milk are partly producible with genetic engineering (not all and at very high costs) or they can be isolated from mammalian serum, placenta and colostrum.

Descrizione dell’invenzione Description of the invention

Secondo la corrente letteratura scientifica, l’azione terapeutica delle cellule staminali può essere riconducibile a due meccanismi: differenziazione delle cellule staminali in cellule residenti e rilascio di fattori trofici rigenerativi da parte delle cellule staminali. I rispettivi contributi di questi due meccanismi rimangono da chiarire, anche se à ̈ stato ipotizzato che non siano le cellule staminali a trasformarsi in cellule mature del tessuto leso, ma che esse trasmettano dei fattori vitali a questo tessuto, che può così tornare a proliferare e a differenziarsi, rigenerandosi (Fig. 1). According to current scientific literature, the therapeutic action of stem cells can be traced back to two mechanisms: differentiation of stem cells into resident cells and release of regenerative trophic factors by stem cells. The respective contributions of these two mechanisms remain to be clarified, even if it has been hypothesized that it is not the stem cells that transform into mature cells of the injured tissue, but that they transmit vital factors to this tissue, which can thus return to proliferate. and to differentiate, regenerating (Fig. 1).

La terapia con cellule staminali presenta molti problemi legati non solo ai costi e a complicazioni tecniche ed applicative, ma anche a scrupoli etici e religiosi. Stem cell therapy presents many problems related not only to costs and technical and application complications, but also to ethical and religious scruples.

La terapia con cellule staminali à ̈ attuabile solo per via iniettiva o, in alcuni casi, topica, e non per via orale. Il sovranatante delle cellule staminali in coltura contiene fattori di crescita, citochine, fattori chemiotattici ecc. che si ritiene siano responsabili dell’effetto benefico della terapia staminale sulla crescita e/o riparazione dei tessuti. Stem cell therapy is feasible only by injection or, in some cases, topically, and not by mouth. The stem cell supernatant in culture contains growth factors, cytokines, chemotactic factors, etc. believed to be responsible for the beneficial effect of stem cell therapy on tissue growth and / or repair.

L’eventuale utilizzo dei fattori vitali isolabili dal sovranatante delle cellule staminali presenta, tuttavia, non solo gli stessi problemi etici dell’uso delle cellule staminali stesse ma anche costi molto elevati. The eventual use of the vital factors that can be isolated from the supernatant of the stem cells presents, however, not only the same ethical problems of the use of the stem cells themselves but also very high costs.

Si à ̈ sorprendentemente scoperto che nei liquidi biologici e in alcuni tessuti dei mammiferi sono presenti gli stessi fattori attivi rilasciati dalle cellule staminali e pertanto presenti nel sovranatante delle colture delle cellule staminali stesse. Le migliori sorgenti di questi fattori sono il siero, la placenta e il colostro dei mammiferi. It was surprisingly found that the same active factors released by stem cells and therefore present in the supernatant of stem cell cultures are present in biological fluids and in some mammalian tissues. The best sources of these factors are mammalian serum, placenta, and colostrum.

La Tabella riporta il confronto qualiquantitativo fra i fattori presenti nel sovranatante delle colture di cellule staminali e i fattori isolati da queste nuove sorgenti da noi denominati POOL OF MATERNAL FACTORS (P.M.F.). The Table reports the qualitative comparison between the factors present in the supernatant of stem cell cultures and the factors isolated from these new sources which we call POOL OF MATERNAL FACTORS (P.M.F.).

Tabella Table

P.M.F. Mesenchymal NAME (pg/ml) stem cells (pg/ml) IL-1 ra IL-1 receptor antagonist 29.05 0.0 IL-1b Interleukin -1b 0.09 0.0 IL-2 Interleukin-2 32.05 0.0 IL-4 Interleukin-4 0.17 21.12 IL-6 Interleukin-6 1.26 293.01 IL-8 Interleukin -8 0.71 359.56 IL-9 Interleukin 3.66 0.78 IL-10 Interlenkin- 10 2.83 0.99 IL-12 Interlenkin- 12 1.73 0.0 IL-15 Interlenkin- 15 4.33 0.5 IL- 17 Interlenkin- 17 21.95 0.32 Eotaxin Eotaxin 5.01 0.0 I\F-y Gamma -interferon 5.97 1 1.14 MCP-1 Monocyte chemotactic factor- 1 4,12 11.23 P.M.F. Mesenchymal NAME (pg / ml) stem cells (pg / ml) IL-1 ra IL-1 receptor antagonist 29.05 0.0 IL-1b Interleukin -1b 0.09 0.0 IL-2 Interleukin-2 32.05 0.0 IL-4 Interleukin-4 0.17 21.12 IL -6 Interleukin-6 1.26 293.01 IL-8 Interleukin -8 0.71 359.56 IL-9 Interleukin 3.66 0.78 IL-10 Interlenkin- 10 2.83 0.99 IL-12 Interlenkin- 12 1.73 0.0 IL-15 Interlenkin- 15 4.33 0.5 IL- 17 Interlenkin- 17 21.95 0.32 Eotaxin Eotaxin 5.01 0.0 I \ F-y Gamma -interferon 5.97 1 1.14 MCP-1 Monocyte chemotactic factor- 1 4.12 11.23

PDGF Platelet derived growth factor 11.55 3.08 TM Iunior necrosis factor 40.00 12.30 PDGF Platelet derived growth factor 11.55 3.08 TM Junior necrosis factor 40.00 12.30

Vascular endothelial growth 4 1.00 208.04 VEGF factor Vascular endothelial growth 4 1.00 208.04 VEGF factor

HGF Hepatocyte growth factor 52.3 100.74 F GF Fibroblast growth factor 180.15 18.21 TGF- 64.00 51.32 beta1 transforming growth factor HGF Hepatocyte growth factor 52.3 100.74 F GF Fibroblast growth factor 180.15 18.21 TGF- 64.00 51.32 beta1 transforming growth factor

IGF-1 insulin-like growth factor 160 0.0 GM- Granulocyte/monocyte-colony 183.85 0.0 GSF stimulating factor IGF-1 insulin-like growth factor 160 0.0 GM- Granulocyte / monocyte-colony 183.85 0.0 GSF stimulating factor

FIF leukemia inhibitorl factor 15.20 27.32 SCF stem cell factor 10.55 4.54 SDF-1 stromal derived factor- 1 41.75 28.8 NGF Nerve growth factor 8.33 0.0 BMP-2 Bone morphogenic protein 25.01 2.65 FIF leukemia inhibitorl factor 15.20 27.32 SCF stem cell factor 10.55 4.54 SDF-1 stromal derived factor- 1 41.75 28.8 NGF Nerve growth factor 8.33 0.0 BMP-2 Bone morphogenic protein 25.01 2.65

RNA 189 ng/ml 48 pg/tnl RNA 189 ng / ml 48 pg / tnl

Presenza di fattori di crescita/citochine in Ρ.Μ.F, (pg/ml) e nel di Cellule Staminali Mesenchimali (1 milione di cellule). Presence of growth factors / cytokines in Ρ.Μ.F, (pg / ml) and in Mesenchymal Stem Cells (1 million cells).

E’ evidente (tabella) la maggior concentrazione di quasi tutti i fattori presenti nel P.M.F. rispetto a quella presente nel sovranatante delle cellule staminali. The greater concentration of almost all the factors present in P.M.F. is evident (table). compared to that present in the stem cell supernatant.

E’ inoltre evidente la possibilità di utilizzare concentrazioni terapeutiche anche molto alte di P.M.F., ad esempio dosi da 0,5/1 g per via topica o iniettiva e dosi fino a 20/30 g per via orale, rispetto alle massime concentrazioni terapeutiche utilizzate di cellule staminali che corrispondono a 1/2 milioni/Kg e pertanto a un massimo di 140 milioni per terapia e, dunque, a valori di fattori sempre dell’ordine dei picogrammi. It is also evident the possibility of using even very high therapeutic concentrations of P.M.F., for example doses of 0.5 / 1 g topically or injected and doses up to 20/30 g orally, compared to the maximum therapeutic concentrations used. of stem cells that correspond to 1/2 million / kg and therefore to a maximum of 140 million per therapy and, therefore, to values of factors always in the order of picograms.

L’oggetto dell’invenzione à ̈ quindi un composto (P.M.F.) contenente in altissima concentrazione tutti i fattori attivi presenti nel sovranatante delle cellule staminali ma isolati, con semplici metodiche estrattive, da fonti naturali molto economiche, di facile reperibilità e senza problemi etici. The object of the invention is therefore a compound (PMF) containing in very high concentration all the active factors present in the supernatant of stem cells but isolated, with simple extraction methods, from very cheap natural sources, easily available and without problems. ethical.

Inoltre P.M.F., isolato dai liquidi biologici e dai tessuti di mammiferi, contiene anche fattori antibatterici (transferrina, lisozima, lactoperossidasi, lactoferrina) e anticorpi delle classi IgG e IgA. (P.M.F. Ab). Furthermore P.M.F., isolated from biological fluids and mammalian tissues, also contains antibacterial factors (transferrin, lysozyme, lactoperoxidase, lactoferrin) and antibodies of the IgG and IgA classes. (P.M.F. Ab).

L’assenza di anticorpi e di antibatterici del sovranatante delle cellule staminali à ̈ un’ulteriore ragione per l’utilizzo di P.M.F. Ab in molti usi terapeutici, topici e per via orale. The absence of antibodies and antibacterials of the stem cell supernatant is another reason for the use of P.M.F. Ab in many therapeutic, topical and oral uses.

Il siero presenta il massimo picco dei fattori negli ultimi giorni prima del parto, il colostro nelle prime ore dopo il parto e non oltre la 6° ora. The serum shows the maximum peak of the factors in the last days before the birth, the colostrum in the first hours after the birth and no later than the 6th hour.

Già dopo 12 ore dal parto i fattori diminuiscono notevolmente, a 24 h molti di loro non sono più dosabili. Already after 12 hours from the birth the factors decrease considerably, at 24 hours many of them are no longer measurable.

Questi fattori sono geneticamente molto conservati nelle varie specie e pertanto à ̈ possibile usare sull’uomo fattori isolati da altre specie di mammiferi come i bovini, gli equini, i cammelli, i mammiferi marini ecc. I fattori sono controllati con metodiche ELISA specifiche per la specie, anche se la cross reazione interspecie à ̈ altissima in quanto i fattori sono filogeneticamente molto conservati e, pertanto, solo qualitativamente sono misurabili anche con ELISA utilizzati per specie diverse (es: uomo-bovino e viceversa). These factors are genetically very conserved in the various species and therefore it is possible to use on humans factors isolated from other mammal species such as cattle, horses, camels, marine mammals, etc. The factors are controlled with specific ELISA methods for the species, even if the interspecies cross reaction is very high as the factors are phylogenetically very conserved and, therefore, they are only qualitatively measurable even with ELISA used for different species (eg: human-bovine and viceversa).

Una prima fonte dei fattori dell’invenzione à ̈ il siero di mammiferi che, negli ultimi giorni (5-15) prima del parto, à ̈ molto ricco dei fattori attivi oggetto dell’invenzione rispetto a mammiferi non gravidi o ai primi mesi di gravidanza. Si descrive di seguito, a titolo di esempio, una metodica di estrazione da siero. A first source of the factors of the invention is the serum of mammals which, in the last days (5-15) before giving birth, is very rich in the active factors object of the invention compared to non-pregnant mammals or in the first months of pregnancy. A serum extraction method is described below, by way of example.

Si preleva 1 litro di sangue in 4 giorni per 4 prelievi complessivi per non danneggiare l’animale, preferibilmente bovino o equino. 1 liter of blood is taken in 4 days for a total of 4 samples in order not to harm the animal, preferably bovine or equine.

Il sangue viene sierato a temperatura ambiente per 24 h e quindi centrifugato per spremere il coagulo. The blood is serumed at room temperature for 24 h and then centrifuged to squeeze the clot.

Si recupera il siero (circa il 30/40% del volume totale) a cui si aggiungono, come agenti antisettici, fenossietanolo al 2,5% e diazolidinil-urea all’1%. Il siero così trattato viene quindi frazionato con i seguenti passaggi. The serum is recovered (about 30/40% of the total volume) to which are added, as antiseptic agents, 2.5% phenoxyethanol and 1% diazolidinyl-urea. The treated serum is then fractionated with the following steps.

Ultrafiltrazione 300'000 Da Ultrafiltration 300'000 Da

Il campione di siero (congelato a -20°C) ottenuto per coagulazione e centrifugazione da sangue di mammifero viene scongelato a temperatura ambiente e diluito con 2 volumi di acqua demineralizzata. La soluzione ottenuta viene ultrafiltrata su membrana piana a flusso tangenziale Millipore Pellicon Biomax in polyethersulfone da 300'000 Da ad una Pi di 0,5 ÷1 bar, in camera fredda a 4°C. The serum sample (frozen at -20 ° C) obtained by coagulation and centrifugation from mammalian blood is thawed at room temperature and diluted with 2 volumes of demineralized water. The solution obtained is ultrafiltered on a 300'000 Da polyethersulfone Millipore Pellicon Biomax tangential flow flat membrane at a Pi of 0.5 à · 1 bar, in a cold room at 4 ° C.

Il retentato e una frazione corrispondente a circa 1:10 del permeato vengono trasferiti in un tubi da dialisi Spectrum Spectrapor in cellulosa rigenerata da 1'000 Da e dializzati contro acqua demineralizzata. The retentate and a fraction corresponding to approximately 1:10 of the permeate are transferred to a 1000 Da regenerated cellulose Spectrum Spectrapor dialysis tube and dialysed against demineralized water.

Ultrafiltrazione 5'000 Da Ultrafiltration 5'000 Da

Il restante permeato viene ultrafiltrato su membrana da 5000 Da. Il permeato dell’ultrafiltrazione da 300'000 Da viene concentrato su membrana piana a flusso tangenziale Millipore Pellicon Biomax in polyethersulfone da 5000 ad una Pi di 0,5 ÷1 bar, in camera fredda a 4°C. The remaining permeate is ultrafiltered on a 5000 Da membrane. The 300,000 Da ultrafiltration permeate is concentrated on a Millipore Pellicon Biomax cross flow flat membrane in polyethersulfone from 5000 to a Pi of 0.5 to 1 bar, in cold room at 4 ° C.

Il retentato viene trasferito in un tubo da dialisi Spectrum Spectrapor in cellulosa rigenerata da 1'000 Da e dializzato contro acqua demineralizzata (con questa dialisi si eliminano anche i conservanti). Il composto à ̈ quindi immediatamente liofilizzato. The retentate is transferred to a 1000 Da regenerated cellulose Spectrum Spectrapor dialysis tube and dialyzed against demineralised water (preservatives are also eliminated with this dialysis). The mixture is then immediately freeze-dried.

Una seconda fonte dei fattori dell’invenzione à ̈ la placenta. Si descrive di seguito, a titolo di esempio, una metodica di estrazione. A second source of the factors of the invention is the placenta. An extraction method is described below, by way of example.

Vengono utilizzate preferibilmente placente bovine o equine. Bovine or equine placentas are preferably used.

Omogeneizzazione Homogenization

La placenta (congelata a -20°C) viene scongelata a temperatura ambiente, tagliata in piccoli pezzi, lavata con abbondante soluzione fisiologica (NaCl 0,9%) fredda (4°C) e omogeneizzata tramite cutter Siramm in un buffer di lisi così composto: Tris/HCl 50 mM, EDTA 25mM, triton X-100 0,001% a pH 7,4. Alla sospensione ottenuta viene aggiunto NaCl fino ad una concentrazione dello 0,9%, e i conservanti (fenossietanolo al 2,5% e diazolidinil-urea all’1%). La sospensione viene posta sotto agitazione (agitatore magnetico) per 2 ore e mantenuta statica overnight in camera fredda a 4°C. The placenta (frozen at -20 ° C) is thawed at room temperature, cut into small pieces, washed with abundant cold saline (0.9% NaCl) (4 ° C) and homogenized by Siramm cutter in a lysis buffer so ¬ compound: 50 mM Tris / HCl, 25mM EDTA, 0.001% triton X-100 at pH 7.4. To the suspension obtained is added NaCl up to a concentration of 0.9%, and the preservatives (phenoxyethanol at 2.5% and diazolidinyl-urea at 1%). The suspension is stirred (magnetic stirrer) for 2 hours and kept static overnight in a cold chamber at 4 ° C.

Centrifugazione Centrifugation

La sospensione viene centrifugata a 13’000 rpm con centrifuga Sorvall RC6 e rotore SLA 15000 per 45 minuti a 4°C. Il surnatante della centrifugazione viene recuperato, prefiltrato sotto vuoto su Dicalite e su filtri in cellulosa rigenerata da 0,45 µm e 0,22 µm. The suspension is centrifuged at 13,000 rpm with a Sorvall RC6 centrifuge and SLA 15000 rotor for 45 minutes at 4 ° C. The supernatant of the centrifugation is recovered, pre-filtered under vacuum on Dicalite and on regenerated cellulose filters of 0.45 µm and 0.22 µm.

Ultrafiltrazione 300'000 Da Ultrafiltration 300'000 Da

Il prodotto filtrato viene ultrafiltrato su membrana piana a flusso tangenziale Millipore Pellicon Biomax in polyethersulfone da 300'000 Da ad una Pi di 0,5÷1 bar, in camera fredda a 4°C. The filtered product is ultrafiltered on a 300'000 Da polyethersulfone Millipore Pellicon Biomax tangential flow flat membrane at a Pi of 0.5à · 1 bar, in a cold room at 4 ° C.

Ultrafiltrazione 5'000 Da: Ultrafiltration 5'000 From:

Il permeato dell’ultrafiltrazione da 300'000 Da viene concentrato su membrana piana a flusso tangenziale Millipore Pellicon Biomax in polyethersulfone da 5'000 ad una Pi di 0,5 ÷1 bar, in camera fredda a 4°C. Il retentato viene trasferito in un tubo da dialisi Spectrum Spectrapor in cellulosa rigenerata da 1'000 Da e dializzato contro acqua demineralizzata (si eliminano pertanto anche i conservanti) e quindi immediatamente liofilizzato. The 300'000 Da ultrafiltration permeate is concentrated on a 5'000 cross-flow Millipore Pellicon Biomax polyethersulfone flat membrane at a Pi of 0.5 à · 1 bar, in a cold room at 4 ° C. The retentate is transferred into a 1000 Da regenerated cellulose Spectrum Spectrapor dialysis tube and dialyzed against demineralised water (therefore also the preservatives are eliminated) and then immediately freeze-dried.

Una ulteriore fonte dei fattori dell’invenzione à ̈ il colostro. Si usa preferibilmente colostro bovino per la facilità di approvvigionamento e le quantità disponibili. E’ particolarmente preferito il colostro da mucche di razza Holstein (Frisona) e Guernsey. E’ stato provato che tali mucche producono colostro con la maggior concentrazione di fattori attivi. Le mucche sono preferibilmente al secondo o terzo parto. Il colostro à ̈ preferibilmente raccolto fra la 1° e la 6° ora dal parto in quanto, in questo periodo, si assiste alla maggior concentrazione di attivi. Nel colostro a partire dalla sesta ora dal parto i fattori attivi diminuiscono rapidamente (dopo 24 ore ne sono presenti solo il 15%). A further source of the factors of the invention is colostrum. Bovine colostrum is preferably used due to the ease of supply and the quantities available. Colostrum from Holstein (Friesian) and Guernsey cows is particularly preferred. Such cows have been proven to produce colostrum with the highest concentration of active factors. The cows are preferably in the second or third calving. The colostrum is preferably collected between the 1st and the 6th hour from the birth as, in this period, there is the greatest concentration of active ingredients. In colostrum from the sixth hour after birth the active factors decrease rapidly (after 24 hours only 15% are present).

Il colostro raccolto à ̈ sottoposto a test per tubercolosi, citotossicità su culture cellulari, controllo di micoplasmi, prioni e di virus umani e bovini. Collected colostrum is tested for tuberculosis, cytotoxicity on cell cultures, control of mycoplasma, prions and human and bovine viruses.

Il colostro nella cisterna mammaria à ̈ praticamente sterile, ma una volta munto, nonostante ogni precauzione, per l’alta concentrazione di fattori di crescita, la sua carica batterica sale molto rapidamente durante la gelatura e la sgelatura, processi piuttosto lenti data l’alta densità del colostro nelle prime ore. The colostrum in the mammary cistern is practically sterile, but once milked, despite all precautions, due to the high concentration of growth factors, its bacterial load rises very rapidly during freezing and thawing, rather slow processes given the ™ high density of colostrum in the first few hours.

L’utilizzo di raggi γ permette di ottenere un colostro sterile solo se si utilizzano radiazioni superiori a 10 Kgy che tuttavia distruggono gran parte dei fattori attivi, e d’altronde questo metodo non impedisce la formazione di pirogeni il cui utilizzo à ̈ sconsigliabile per via orale o topica e proibito per via parenterale. The use of γ rays allows to obtain a sterile colostrum only if radiations greater than 10 Kgy are used which however destroy most of the active factors, and on the other hand this method does not prevent the formation of pyrogens whose use is inadvisable orally or topically and parenterally prohibited.

E’ stata pertanto messa a punto una filiera di raccolta innovativa, per ottenere un composto anallergico sterile, senza conservanti e senza pirogeni. An innovative collection chain was therefore developed to obtain a sterile hypoallergenic compound, without preservatives and without pyrogens.

Al colostro raccolto in taniche sterili (sterilizzate a vuoto a 25 Kgy) si aggiungono agenti antisettici in quantità tali da garantire la sterilità e l’assenza di pirogeni. Si impiegano preferibilmente fenossietanolo alla concentrazione del 2,5% e diazolidinil-urea a una concentrazione dell’1%. To the colostrum collected in sterile tanks (vacuum sterilized at 25 Kgy) antiseptic agents are added in such quantities as to guarantee sterility and the absence of pyrogens. Phenoxyethanol at a concentration of 2.5% and diazolidinyl urea at a concentration of 1% are preferably used.

Il colostro così trattato può, per brevi periodi (max 30 gg) non essere conservato congelato prima dei processi di estrazione dei fattori attivi, con evidente risparmio dei costi industriali. I fattori attivi possono essere estratti con i seguenti passaggi: The colostrum thus treated can, for short periods (max 30 days) not be stored frozen before the extraction processes of the active factors, with evident savings in industrial costs. Active factors can be extracted with the following steps:

Centrifugazione Centrifugation

Il colostro bovino viene diluito 1:10 con acqua demineralizzata, si aggiunge NaCl fino ad ottenere una concentrazione dello 0,9%. Bovine colostrum is diluted 1:10 with demineralized water, NaCl is added until a concentration of 0.9% is obtained.

La sospensione viene centrifugata in continuo a 8'000 rpm a temperatura di 20-25°C con una centrifuga Alfa Laval scartando il pellet corrispondente alla parte lipidica. The suspension is centrifuged continuously at 8'000 rpm at a temperature of 20-25 ° C with an Alfa Laval centrifuge, discarding the pellet corresponding to the lipid part.

Ultrafiltrazione ceramica da 300'000 Da 300,000 Da ceramic ultrafiltration

Il prodotto ottenuto dalla centrifugazione viene ultrafiltrato su membrana ceramica con cut-off 300'000 Da ad una temperatura di 20-25°C recuperando il permeato. The product obtained from centrifugation is ultrafiltered on a ceramic membrane with a cut-off of 300,000 Da at a temperature of 20-25 ° C, recovering the permeate.

Ultrafiltrazione su 5000 Da Ultrafiltration on 5000 Da

Il permeato dell’ultrafiltrazione 300'000 Da viene concentrato su membrana a spirale avvolta da 5'000 Da in polyethersulfone ad una temperatura di 20-25°C e dializzato contro acqua demineralizzata fino ad una conducibilità del retentato di circa 600 µs/cm<2>(con questa dialisi si eliminano anche i conservanti). The permeate of the ultrafiltration 300'000 Da is concentrated on a spiral membrane wrapped by 5'000 Da in polyethersulfone at a temperature of 20-25 ° C and dialyzed against demineralized water up to a conductivity of the retentate of about 600 µs / cm <2> (preservatives are also eliminated with this dialysis).

Liofilizzazione Lyophilization

Il retentato dell’ultrafiltrazione da 5000 Da viene filtrato sotto vuoto su filtri Millipore in cellulosa rigenerata da 0,2 µm, congelato a -20°C e liofilizzato. The 5000 Da ultrafiltration retentate is vacuum filtered on 0.2 µm regenerated cellulose Millipore filters, frozen at -20 ° C and freeze-dried.

I prodotti di estrazione da siero, placenta o colostro, chiamati P.M.F. Ab, contengono i seguenti fattori: Extraction products from serum, placenta or colostrum, called P.M.F. Ab, contain the following factors:

Immunoglobuline della classe IgG2 e IgA(γ/mg), in proporzione pari a circa il 60% del contenuto di P.M.F. Ab (circa 50% IgG2 e circa 10% IgA), dotate di una specificità naturale contro molti batteri e virus, alcuni dei quali responsabili della sovrapposizione infettiva della NEC. Immunoglobulins of the IgG2 and IgA class (γ / mg), in a proportion equal to about 60% of the P.M.F. Ab (about 50% IgG2 and about 10% IgA), with a natural specificity against many bacteria and viruses, some of which are responsible for the infectious overlap of NEC.

COMPLEMENTO C3/C4: Il complemento à ̈ costituito da proteine circolanti capaci di interagire con le membrane biologiche e con specifici recettori situati sulla superficie di diversi tipi cellulari e che hanno la capacità di indurre reazioni infiammatorie che aiutano a combattere le infezioni. COMPLEMENT C3 / C4: The complement consists of circulating proteins capable of interacting with biological membranes and with specific receptors located on the surface of different cell types and which have the ability to induce inflammatory reactions that help fight infections.

FATTORI ANTIBATTERICI/ANTIVIRALI ANTIBACTERIAL / ANTIVIRAL FACTORS

Transferrina: rilascia ferro ai globuli rossi e impedisce la chelazione del ferro da parte di batteri e virus. Transferrin: releases iron to red blood cells and prevents iron chelation by bacteria and viruses.

Lactoferrina: toglie ai batteri e ai virus il ferro di cui necessitano per crescere. Lactoferrin: removes the iron they need to grow from bacteria and viruses.

Lisozima: ha effetti antibatterici, dovuti non solo alle sue proprietà enzimatiche, ma anche alle proprietà cationiche ed idrofobiche. Lysozyme: it has antibacterial effects, due not only to its enzymatic properties, but also to its cationic and hydrophobic properties.

Lattoperossidasi: à ̈ il più potente enzima contenuto nel colostro. Inibisce il metabolismo batterico ossidando i gruppi sulfidrilici di proteine essenziali. Lactoperoxidase: It is the most powerful enzyme contained in colostrum. It inhibits bacterial metabolism by oxidizing the sulfhydryl groups of essential proteins.

FATTORI DI CRESCITA TGF-β1- TRASFORMIG GROWTH FACTOR: stimola la produzione di immunoglobuline della classe A, responsabili delle difese immunitarie a livello mucoso. Modula la proliferazione cellulare e stimola la deposizione di matrice extracellulare. GROWTH FACTORS TGF-β1- TRASFORMIG GROWTH FACTOR: stimulates the production of class A immunoglobulins, responsible for mucosal immune defenses. It modulates cell proliferation and stimulates extracellular matrix deposition.

EGF-EPIDERMAL GROWTH FACTOR: regola lo sviluppo della mucosa. Promuove la formazione di cellule epiteliali. EGF-EPIDERMAL GROWTH FACTOR: regulates the development of the mucosa. Promotes the formation of epithelial cells.

IGF 1- INSULIN-LIKE GROWTH FACTOR: modula la proliferazione, l’adesione e la migrazione cellulare e induce la maturazione delle mucose. IGF 1- INSULIN-LIKE GROWTH FACTOR: modulates cell proliferation, adhesion and migration and induces maturation of the mucous membranes.

VEGF- VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR: stimola la produzione di vasi sanguigni. Presenta attività mitogenetica e di attivazione della permeabilità vascolare. VEGF- VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR: stimulates the production of blood vessels. It has mitogenetic activity and activation of vascular permeability.

FGF- b- FIBROBLAST GROWTH FACTOR BASIC: stimola la proliferazione delle cellule di origine mesenchimale come fibroblasti, cellule endoteliali, astrociti, cheratinociti. Agisce come fattore chemiotattico e fitogenetico. FGF- b- FIBROBLAST GROWTH FACTOR BASIC: stimulates the proliferation of cells of mesenchymal origin such as fibroblasts, endothelial cells, astrocytes, keratinocytes. It acts as a chemotactic and phytogenetic factor.

GH-GROWTH HORMONE: fattore generale di crescita di ogni tessuto. GHRF: GROWTH HORMONE RELEASING FACTOR. GH-GROWTH HORMONE: general growth factor of each tissue. GHRF: GROWTH HORMONE RELEASING FACTOR.

NGF-NERVE GROWTH FACTOR: stimola l’attività e la regolazione della crescita e della differenziazione del sistema simpatico. NGF-NERVE GROWTH FACTOR: stimulates the activity and regulation of the growth and differentiation of the sympathetic system.

SCF- STEM CELL FACTOR: fattore pleiotropico che agisce, in utero e nel neonato, sullo sviluppo delle cellule germinali e neurali e sull’ematopoiesi. SCF- STEM CELL FACTOR: pleiotropic factor that acts, in utero and in the newborn, on the development of germinal and neural cells and on hematopoiesis.

FATTORI CHEMIOTATTICI EOTAXINA: si lega ai recettori delle chemochine per richiamare gli eosinofili nei tessuti infiammati. CHEMOTACTIC FACTORS EOTAXIN: binds to chemokine receptors to call up eosinophils in inflamed tissues.

IP-10-Chemochin ligand 10: indotta dall’interferone gamma aggrega le cellule infiammatorie. IP-10-Chemochin ligand 10: induced by interferon gamma aggregates inflammatory cells.

MCP-1 Monocyte chemotactic factor-1: favorisce l’aggregazione dei monociti ai tessuti infiammati. MCP-1 Monocyte chemotactic factor-1: favors the aggregation of monocytes to inflamed tissues.

CITOCHINE IL1-ra: membro della famiglia dell’interleuchina 1. Modula la risposta immune e antiinfiammatoria. CYTOKIN IL1-ra: member of the interleukin 1 family. It modulates the immune and anti-inflammatory response.

IL-2: induce la proliferazione dei linfociti T. IL-2: induces the proliferation of T lymphocytes.

IL-9: regolatore delle cellule emopoietiche, stimola la proliferazione cellulare e previene l’apoptosi. IL-9: regulator of hematopoietic cells, stimulates cell proliferation and prevents apoptosis.

IL-17: Regola le attività dell’NF-KB e potenzia la produzione di ossido nitrico(NO). IL-17: Regulates the activities of NF-KB and enhances the production of nitric oxide (NO).

IL-10: presenta effetti pleiotropici nell’immunoregolazione e nell’ infiammazione. Migliora la sopravvivenza delle cellule B e pertanto la produzione di anticorpi. Studi sui topi Knockout dimostrano che questa proteina à ̈ essenziale nell’immunoregolazione del tratto intestinale. IL-10: has pleiotropic effects in immunoregulation and inflammation. It improves the survival of B cells and therefore the production of antibodies. Studies on Knockout mice show that this protein is essential in the immunoregulation of the intestinal tract.

INTERFERON-gamma: presenta note attività antivirali, antitumorali e immunoregolatorie. E’ un potente attivatore dei macrofagi. INTERFERON-gamma: has known antiviral, anticancer and immunoregulatory activities. It is a powerful activator of macrophages.

TNF-α- Tumour necrosis factor: stimola la migrazione di neutrofili e monociti nella sede delle infezioni. TNF-Î ± - Tumor necrosis factor: stimulates the migration of neutrophils and monocytes to the site of infections.

La frazione così ottenuta e contenente i fattori sopra elencati non solo à ̈ in grado di sostituire il latte materno per la profilassi delle NEC, ma à ̈ anche in grado, vista la superiore concentrazione di fattori attivi rispetto al latte materno stesso, di fornire un valido effetto terapeutico in tutti e tre gli stadi della NEC (stadiazione di Bell). La frazione dell’invenzione potrà essere formulata in composizioni adatte alla somministrazione orale per la prevenzione e per il trattamento di NEC allo stadio 1 e 2, oppure in composizioni adatte alla somministrazione via endovenosa per il trattamento di NEC agli stadi 2 e 3, quando il neonato non à ̈ in grado di ricevere alimenti per via orale. Esempi di formulazioni adatta sono capsule, compresse, preparati in polvere per latte artificiale, fiale sterili. Il dosaggio per via orale à ̈ tipicamente compreso fra 20 e 40 g/die, mentre quello endovenoso fra 1 e 20 g/die. Il trattamento può essere prolungato per diversi mesi, fino a tre- cinque mesi o più. The fraction thus obtained and containing the factors listed above is not only able to replace breast milk for the prophylaxis of NEC, but is also able, given the higher concentration of active factors compared to breast milk itself, to provide a valid therapeutic effect in all three stages of NEC (Bell staging). The fraction of the invention may be formulated in compositions suitable for oral administration for the prevention and treatment of NEC at stages 1 and 2, or in compositions suitable for intravenous administration for the treatment of NEC at stages 2 and 3, when the infant is unable to receive food by mouth. Examples of suitable formulations are capsules, tablets, powdered formula for infant formula, sterile vials. The oral dosage is typically between 20 and 40 g / day, while the intravenous dose is between 1 and 20 g / day. The treatment can be continued for several months, up to three to five months or more.

Le composizioni dell’invenzione possono anche essere vantaggiosamente impiegate per la prevenzione delle patologie a breve e lungo termine dovute alla sola alimentazione con latte formula, nella terapia del morbo di Crohn, di gastroenteriti del bambino e dell’adulto, della patologia esofago corto, di ernie iatali, reflussi gastro-esofagei, delle enterocoliti da AIDS, sindrome del colon irritabile, colite propriamente detta (colite spastica, coliti infettive, coliti sistemiche, coliti da antibiotici). The compositions of the invention can also be advantageously used for the prevention of short and long-term pathologies due to the sole feeding with formula milk, in the therapy of Crohn's disease, of gastroenteritis of the child and of the adult, of short esophagus pathology. , hiatal hernias, gastroesophageal refluxes, AIDS enterocolitis, irritable colon syndrome, colitis proper (spastic colitis, infectious colitis, systemic colitis, antibiotic colitis).

L’invenzione à ̈ descritta in maggior dettaglio nella seguente parte sperimentale, data a titolo di esempio. The invention is described in greater detail in the following experimental part, given as an example.

PARTE SPERIMENTALE EXPERIMENTAL PART

E’ stato creato un modello di NEC nel maiale identico, per effetti patologici macro e microscopici, a quello umano. A model of NEC has been created in the pig which is identical to the human one due to macro and microscopic pathological effects.

CONFRONTO TRA SOGGETTI ALIMENTATI CON LATTE FORMULA P.M.F. Ab E SOGGETTI ALIMENTATI SOLO CON LATTE FORMULA COMPARISON BETWEEN SUBJECTS EATING WITH MILK FORMULA P.M.F. Ab AND SUBJECTS FEED ONLY WITH FORMULA MILK

I soggetti alimentati con latte formula più 20 g/die di P.M.F. Ab presentano una crescita regolare sovrapponibile a quella del gruppo di controllo mantenuto sotto scrofa. I suinetti alimentati fin dalla nascita soltanto con il latte formula dopo il primo giorno di regolare accrescimento manifestano fin dal secondo giorno prostrazione, atassia locomotoria, interruzione dell’alimentazione spontanea, rigurgito e diarrea. Dopo un veloce dimagramento nel giro di ulteriori 24-48 ore si assiste al decesso (Figura 2) L’esame istopatologico dei vari tratti del grosso intestino prelevati post mortem permette di diagnosticare una enterocolite acuta necrotizzante ad esito letale (Figura 3-4 A/B). Subjects fed with milk formula plus 20 g / day of P.M.F. Ab show a regular growth comparable to that of the control group kept under sow. Piglets fed from birth only with formula milk after the first day of regular growth show prostration, locomotor ataxia, interruption of spontaneous feeding, regurgitation and diarrhea from the second day. After a rapid weight loss, within a further 24-48 hours, death occurs (Figure 2) The histopathological examination of the various sections of the large intestine taken post mortem allows the diagnosis of acute necrotizing enterocolitis with a fatal outcome (Figure 3-4 A / B).

La microscopia elettronica conferma i referti di enterocolite acuta necrotizzante (Figura 5-6-7 A/B). Electron microscopy confirms the findings of acute necrotizing enterocolitis (Figure 5-6-7 A / B).

CONFRONTO TRA GRUPPI ALIMENTATI CON DOSAGGI CRESCENTI DI P.M.F. Ab COMPARISON BETWEEN GROUPS FEEDING WITH INCREASING DOSAGES OF P.M.F. Ab

Il gruppo di soggetti alimentati con latte formula 20 g/die di P.M.F. The group of subjects fed with milk formulated 20 g / day of P.M.F.

Ab presenta una crescita regolare, del tutto sovrapponibile a quella del gruppo di controllo mantenuto sotto scrofa. Ab shows a regular growth, completely superimposable to that of the control group kept under sow.

Il gruppo di soggetti alimentati con latte formula 1 g/die di P.M.F. Ab si comporta esattamente come il gruppo di suinetti alimentati fin dalla nascita soltanto con il latte formula e cioà ̈ dopo il primo giorno di regolare accrescimento, manifesta fin dalla mattina del secondo giorno una profonda prostrazione che sfocia in una completa atassia locomotoria, nella interruzione dell’alimentazione spontanea, nella comparsa di tremori, rigurgito e diarrea. I soggetti dimagriscono velocemente e nel giro di ulteriori 24-48 ore si assiste al decesso dell’intero gruppo. The group of subjects fed with milk formulates 1 g / day of P.M.F. Ab behaves exactly like the group of piglets fed from birth only with formula milk and that is after the first day of regular growth, it manifests from the morning of the second day a profound prostration that leads to complete locomotor ataxia, in the interruption of the € ™ spontaneous feeding, in the onset of tremors, regurgitation and diarrhea. The subjects lose weight quickly and within a further 24-48 hours we witness the death of the entire group.

Il gruppo di soggetti alimentati con latte formula 5 g/die di P.M.F. Ab manifestano, dopo il primo giorno di regolare accrescimento, la comparsa di vomito e diarrea. Nei giorni successivi l’appetito à ̈ conservato, anzi esaltato fino alla voracità, ma la continua diarrea e l’accentuarsi dei fenomeni di rigurgito dopo ogni pasto, portano gli animali verso uno stato di vera e propria cachessia e nel giro di pochi giorni alla morte dell’intero gruppo. The group of subjects fed with milk formulates 5 g / day of P.M.F. Ab manifest, after the first day of regular growth, the appearance of vomiting and diarrhea. In the following days, the appetite is preserved, indeed exalted to the point of voracity, but the continuous diarrhea and the accentuation of the regurgitation phenomena after each meal, lead the animals to a state of real cachexia and within a few days until the death of the entire group.

L’esame istopatologico di vari tratti del grosso intestino prelevati dai gruppi di soggetti alimentati rispettivamente con 1 g/die e 5 g/die di P.M.F. Ab, permette di diagnosticare, anche in questo caso, una enterocolite acuta necrotizzante ad esito letale. The histopathological examination of various tracts of the large intestine taken from the groups of subjects fed respectively with 1 g / day and 5 g / day of P.M.F. Ab, allows us to diagnose, even in this case, an acute necrotizing enterocolitis with a lethal outcome.

Il gruppo di soggetti alimentati con latte formula 10 g/die di P.M.F. Ab manifestano, dopo i primi giorni di regolare accrescimento, la comparsa di diarrea. La diarrea si presenta con un andamento piuttosto altalenante diminuendo in alcuni giorni ed aumentando in altri, ciò provoca un rallentamento della curva di accrescimento. Al 13° - 14° giorno le manifestazioni patologiche si aggravano improvvisamente, subentra il vomito, i tremori, uno stato di profonda prostrazione, gli animali smettono di alimentarsi e nel giro di poche ore muoiono di colite acuta necrotizzante. The group of subjects fed with milk formulates 10 g / day of P.M.F. Ab manifest, after the first days of regular growth, the onset of diarrhea. Diarrhea shows a rather fluctuating trend, decreasing in some days and increasing in others, which causes a slowing of the growth curve. On the 13th - 14th day the pathological manifestations suddenly worsen, vomiting, tremors, a state of profound prostration take over, the animals stop feeding and within a few hours die of acute necrotizing colitis.

Il gruppo di soggetti alimentati con latte formula 15 g/die di P.M.F. Ab presentano una crescita regolare, non si osservano manifestazioni patologiche di alcun genere, ma le performance di accrescimento sono leggermente inferiori rispetto a quelle ottenute dal gruppo di soggetti alimentati con latte formula 20 g/die di P.M.F. Ab (Figura 8). The group of subjects fed with milk formulates 15 g / day of P.M.F. Ab have a regular growth, no pathological manifestations of any kind are observed, but the growth performances are slightly lower than those obtained by the group of subjects fed with milk formula 20 g / day of P.M.F. Ab (Figure 8).

Da notare che nel gruppo di suini alimentati con 10 g/die si nota, oltre alla differenza di accrescimento, si presenta la formazione di un trasudato cutaneo che si solidifica a formare una sorta di “crosta lattea†. Perfette invece le condizioni della cute del soggetto di controllo (Figura 9). It should be noted that in the group of pigs fed with 10 g / day, in addition to the difference in growth, there is the formation of a skin transudate that solidifies to form a sort of â € œcilk crustâ €. On the other hand, the conditions of the control subject's skin are perfect (Figure 9).

Il gruppo di soggetti alimentati con latte formula 20 g/die di P.M.F. Ab (mantenuto fino al 15° giorno) presentano una crescita regolare, del tutto sovrapponibile a quella del gruppo di controllo mantenuto sotto scrofa. The group of subjects fed with milk formulated 20 g / day of P.M.F. Ab (maintained up to the 15th day) show a regular growth, completely superimposable to that of the control group kept under sow.

Il gruppo di soggetti alimentati con latte formula 20 g/die di P.M.F. Ab (sospeso dopo 2 gg) manifestano, dopo le prime 48 h di regolare accrescimento, la diminuzione dell’appetito e la comparsa di vomito e diarrea. Mangiano sempre meno e nel giro di pochi giorni si assiste all’interruzione dell’alimentazione spontanea, al dimagrimento che esita nella cachessia, all’accentuazione dei fenomeni di vomito e diarrea, fino ad arrivare velocemente al decesso dell’intero gruppo per colite acuta necrotizzante. The group of subjects fed with milk formulated 20 g / day of P.M.F. Ab (suspended after 2 days) show, after the first 48 hours of regular growth, a decrease in appetite and the appearance of vomiting and diarrhea. They eat less and less and within a few days there is the interruption of spontaneous feeding, the weight loss that results in cachexia, the accentuation of vomiting and diarrhea phenomena, up to the rapid death of the entire group for acute necrotizing colitis.

Il gruppo di soggetti alimentati con latte formula 20 g/die di P.M.F. Ab (sospeso dopo 5 e 10 gg) manifestano, dopo i primi giorni di regolare accrescimento, la diminuzione dell’appetito e la comparsa di vomito e diarrea. The group of subjects fed with milk formulated 20 g / day of P.M.F. Ab (suspended after 5 and 10 days) show, after the first days of regular growth, a decrease in appetite and the appearance of vomiting and diarrhea.

Le manifestazioni patologiche si mantengono su livelli medio-bassi, non provocando la morte dei soggetti, ma una quasi totale interruzione delle performance di accrescimento. The pathological manifestations remain at medium-low levels, not causing the death of the subjects, but an almost total interruption of the growth performance.

L’esame istopatologico di vari tratti del grosso intestino prelevati post mortem dagli animali del gruppo alimentato con latte formula 20 g/die di P.M.F. Ab (sospeso dopo 2 gg), permette di diagnosticare una enterocolite acuta necrotizzante ad esito letale che coinvolge l’intero tratto intestinale (Figura 10). The histopathological examination of various tracts of the large intestine taken post mortem from the animals of the group fed with milk formula 20 g / day of P.M.F. Ab (suspended after 2 days), allows the diagnosis of acute necrotizing enterocolitis with a lethal outcome that involves the entire intestinal tract (Figure 10).

SOMMINISTRAZIONE RITARDATA DI P.M.F. Ab P.M.F. Ab somministrato per via orale alla comparsa dei primi sintomi, tipici dello stadio I di Bell, riesce a porre termine alla patologia in atto e i soggetti presentano successive performance di accrescimento assimilabili a quelle dei soggetti di controllo. Se i sintomi sono eclatanti, corrispondenti allo stadio II e III di Bell, la somministrazione orale à ̈ insufficiente ma la somministrazione per via endovenosa à ̈ risolutiva (Figura 11). DELAYED ADMINISTRATION OF P.M.F. Ab P.M.F. Ab administered orally at the onset of the first symptoms, typical of Bell's stage I, manages to put an end to the pathology in progress and the subjects present subsequent growth performances similar to those of the control subjects. If the symptoms are striking, corresponding to Bell's stage II and III, oral administration is insufficient but intravenous administration is resolutive (Figure 11).

CONFRONTO TRA SOGGETTI ALIMENTATI CON LATTE FORMULA P.M.F. Ab E SOGGETTI ALIMENTATI SOLO CON P.M.F. Ab SOLUZIONE ZUCCHERINA AD LIBITUM COMPARISON BETWEEN SUBJECTS EATING WITH MILK FORMULA P.M.F. Ab AND SUBJECTS POWERED ONLY WITH P.M.F. Ab SUGAR SOLUTION AD LIBITUM

I suinetti alimentati ad libitum con acqua zuccherata 20 g/die di P.M.F. Ab e pertanto senza l’apporto di latte formula non presentano patologia di alcun genere ma perdono peso in modo costante, segno di un insufficiente apporto di nutrienti fornito dalla soluzione zuccherina in luogo del latte formula. Questi soggetti arrivano comunque a morte ma incredibilmente l’esame istopatologico del colon si presenta assolutamente normale senza alcun segno di enterocolite acuta necrotizzante (Figura 12). Piglets fed ad libitum with 20 g / day of P.M.F. Ab and therefore without the supply of formula milk they do not have pathology of any kind but lose weight constantly, a sign of an insufficient supply of nutrients provided by the sugar solution in place of the formula milk. These subjects still come to death but incredibly, the histopathological examination of the colon is absolutely normal without any sign of acute necrotizing enterocolitis (Figure 12).

Claims (5)

RIVENDICAZIONI 1. Composizioni comprendenti citochine, fattori di crescita, RNA e anticorpi isolati da siero, placenta e colostro, per la terapia della enterocolite acuta necrotizzante (NEC) nei prematuri e nei neonati a termine e per la prevenzione delle patologie a breve e a lungo termine dovute all’alimentazione con latte artificiale. CLAIMS 1. Compositions comprising cytokines, growth factors, RNA and antibodies isolated from serum, placenta and colostrum, for the therapy of acute necrotizing enterocolitis (NEC) in premature and term infants and for the prevention of short and long-term pathologies due to feeding with artificial milk. 2. Composizioni secondo la rivendicazione 1 comprendenti Immunoglobuline della classe IgG2 e IgA, complemento c3/c4, Transferrina, Lactoferrina, Lisozima, Lattoperossidasi, TGF-β1, EGF, IGF 1, VEGF, FGF- b, GH, GHRF, NGF, SCF, eotaxina, MCP-1, IL1-ra, IL-2, IL-9, IL-17, IL-10, interferon-gamma, TNF-α. 2. Compositions according to claim 1 comprising Immunoglobulins of the class IgG2 and IgA, complement c3 / c4, Transferrin, Lactoferrin, Lysozyme, Lactoperoxidase, TGF-β1, EGF, IGF 1, VEGF, FGF-b, GH, GHRF, NGF, SCF , eotaxin, MCP-1, IL1-ra, IL-2, IL-9, IL-17, IL-10, interferon-gamma, TNF-Î ±. 3. Composizioni secondo la rivendicazione 1 o 2 ottenute da siero di mammiferi. 3. Compositions according to claim 1 or 2 obtained from mammalian serum. 4. Composizioni secondo la rivendicazione 1 o 2 ottenute da placenta. 4. Compositions according to claim 1 or 2 obtained from placenta. 5. Composizioni secondo la rivendicazione 1 o 2 ottenute da colostro.5. Compositions according to claim 1 or 2 obtained from colostrum.