ITMI20010032A1 - Metodo per la produzione di daptomicina - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE
La presente invenzione ha per oggetto un metodo per l'ottenimento di soluzioni di daptomicina pura ad almeno il 97% da soluzioni grezze ottenute per fermentazione.
La daptomicina è un antibiotico a struttura lipopolipeptidica scoperto nei brodi di cultura di vari ceppi dello Streptpmyces roseosporus : la struttura chimica, l'attività microbiologica ed un metodo di preparazione della daptomicina (originariamente identificata con la sigla LY 146032) sono descritti nei brevetti US 4208403 ed EP-B-0095295.
La preparazione della daptomicina può avvenire mediante procedure diverse, e cioè:
- direttamente per fermentazione e successivo frazionamento del complesso di antibiotici così formatosi, fino ad ottenere una frazione (denominata A 21978 C0) in forma relativamente pura, come descritto nei brevetti sopra citati e nel brevetto US 4885243; oppure
per fermentazione, per dare un complesso di antibiotici che viene isolato e poi trattato con un microrganismo in grado di produrre il nucleo polipeptidico comune. Tale nucleo viene poi protetto, acilato e deprotetto per via chimica per dare la daptomicina (o altri derivati simili).
Lo streptomyces roseosporus produce per fermentazione diverse sostanze tra le quali un gruppo di polipeptidi ciclici (denominato A 21978 C) che comprende diversi lipopolipeptidi aventi in comune la stessa catena polipeptidica ciclica e che differiscono tra di loro per i residui di acidi grassi attaccati all'estremità N-terminale (gruppo -NH2 del residuo di Trp) : dopo filtrazione e separazione del micelio, le sostanze ottenute per fermentazione sono presenti in una soluzione grezza acquosa .
Secondo gli insegnamenti del brevetto US 4208403 il complesso dei diversi lipopolipeptidi aventi in comune la stessa catena polipeptidica ciclica può essere catturato per passaggio della soluzione acquosa grezza sopra citata su una particolare resina a scambio conico (IRA-68 della Rohm & Haas), poi si lava con acqua e si eluisce con acido acetico, ottenendosi così una miscela grezza di sostanze denominata "complesso A 21978 C purificato". La separazione dei vari componenti di questa miscela o complesso grezzo viene effettuata o per cromatografia su fasi stazionarie di silice o di octadecil-silice (fase inversa, C-18) eluendo con miscele acqua/metanolo/acetonitrile ed usando piridina/acido acetico o ammonio formiato od altri sali analoghi per il controllo del pH; oppure utilizzando una resina adsorbente (Diaion HP20, Amberlite XAD-4, Amberlite XAD-16 od altre) per adsorbire il complesso che viene poi separato nei vari componenti per eluizione con una miscela di acqua e solventi organici, con risultati insoddisfacenti per quanto riguarda la qualità e quantità di prodotto ottenibile (come è stato riconosciuto dalla stessa titolare del brevetto americano nel suo successivo brevetto EP-A-0294990) .
In letteratura è descritta anche un'altra via per la produzione e la purificazione per semisintesi dei diversi lipopolipeptidi facenti parte del complesso grezzo sopra menzionato: il nucleo comune polipepetidico viene ottenuto per trasformazione microbiologica dai brodi di fermentazione, isolati e parzialmente purificati; quindi, con tecniche note di sintesi chimica, si proteggono alcuni gruppi amminici liberi nella miscela grezza dei lipopolipeptidi e si ottengono vari derivati per acilazione chimica di gruppi non protetti, poi si deprotegge e si purifica ancora.
Per esempio, nel brevetto EP-B-0095295 la daptomicina corrisponde al prodotto che viene ottenuto per acilazione sul Trp (mediante Schotten-Baumann, oppure con estere del triclorofenolo) del N-Orn-tBOC nucleo.
Questa procedura di semisintesi richiede una complicata serie di purificazioni (essenzialmente per cromatografia su fase inversa e/o su silice) dei vari intermedi del prodotto finito.
In effetti, secondo gli insegnamenti del brevetto US 4208403 tutta la miscela grezza dei lipopolipeptidi aventi la stessa catena polipeptidica ciclica presenti nella soluzione purificata proveniente dalla fermentazione viene catturata dalla resina a scambio ionico indicata in tale brevetto: la separazione dei vari componenti della miscela grezza così ottenuta è alquanto laboriosa e non utilizzabile industrialmente.
Tale fatto è esplicitamente riconosciuto nel successivo brevetto EP-A-0294990 (a nome della stessa titolare del brevetto americano qui sopra citato) ove si dice espressamente che il metodo di purificazione descritto nel brevetto US 4208403 non è soddisfacente in quanto dà "bassa capacità, poca risoluzione e basso recupero": perciò si rivendica un nuovo metodo secondo il quale la daptomìcina (ivi denominata LY146032) viene prodotta per fermentazione e purificata su resine adsorbenti con quello che viene definito "metodo inverso". Tale metodo utilizza resine adsorbenti e solventi organici polari: vengono nominati vari solventi e si dice che il solvente preferibile è 1 'acetonitrile . Tale metodo di purificazione è in grado di dare un prodotto avente una purezza finale di circa il 93% (contro l'80% del brevetto US 4208403) con una resa di circa il 35% (contro il 5% del brevetto US 4208403).
In un brevetto più recente, US 5912226, si descrive la preparazione ed identificazione di impurezze contenute nella daptomìcina e si descrive, nell'esempio 4, la purificazione di daptomìcina (denominata LY 146032) utilizzando cromatografie su fase inversa (silice) e su Diaion HP20 e HP20ss, sempre utilizzando solventi miscibili con acqua (acetonitrile e metanolo) per l'eluizione. Si definisce "forma pura" un prodotto che contenga non più del 2,5% (in peso) totale di anidro-LY 146032 ed isomero-LY14 6032, ma non si rivendica la procedura di purificazione.
Come si può comprendere da tutto quanto è stato sopra esposto, la procedura di isolamento e di purificazione della daptomicina dai suoi brodi di fermentazione è alquanto complessa e lunga e porta a risultati ancora insoddisfacenti.
II tentativo accennato nel brevetto US 4208403 di utilizzare una resina a scambio ionico per catturare il complesso grezzo di cui essa fa parte non ha avuto alcuno sviluppo per i gravi problemi conseguenti all'utilizzazione di tale resina.
I presenti richiedenti, interessati alla purificazione della daptomicina ed al suo ottenimento con rese elevate, hanno riprodotto tutte le vie descritte in letteratura, per verificarle e cercare di migliorarle. Quando è stato considerato il brevetto US 4208403, si è verificato che la resina a scambio ionico ivi descritta portava effettivamente agli inconvenienti già qui ampiamente descritti: si sono provate anche altre resine a scambio ionico dello stesso tipo, ma sempre con risultati inaccettabili.
Sorprendentemente si è trovato che
soluzioni ottenute per fermentazione e contenenti le miscele grezze di lipopolipeptidi diversi aventi la stessa catena polipeptidica ciclica della daptomicina vengono cromatografate per assorbimento su resine a scambio ionico di tipo basico aventi pori di dimensione di almeno 100 Angstrom, è possibile eluire facilmente le soluzioni con separazione della daptomicina con purezza di almeno il 97%.
L'invenzione riguarda quindi un metodo per l'ottenimento di soluzioni di daptomicina pura ad almeno il 97% da soluzioni grezze ottenute per fermentazione e contenenti lipopolipeptidi diversi aventi la stessa catena polipeptidica ciclica della daptomicina, secondo il quale dette soluzioni grezze vengono sottoposte a purificazione cromatografica per assorbimento su resine e successiva eluizione, caratterizzato dal fatto che detto assorbimento comprende almeno un passaggio su una resina a scambio ionico di tipo basico avente pori di dimensione di almeno 100 Angstrom e che detta eluizione è effettuata con soluzione salina acquosa .
Preferibilmente detto assorbimento con la resina a scambio ionico e relativa eluizione abbinato ad almeno un assorbimento con resina adsorbente con successiva eluizione con una miscela di acqua e di almeno un solvente organico almeno parzialmente miscibile con acqua .
Ancora più preferibilmente detto solvente organico miscibile con acqua è scelto dal gruppo comprendente isopropanolo, acetonitrile, acetone , metanolo e tetraidrofurano .
Col metodo secondo la presente invenzione è quindi possibile ottenere daptomicina sostanzialmente pura (purezza di almeno del 97% per analisi HPLC) con un resa di gran lunga superiore a quella conseguibile coi metodi noti .
E' da notarsi infine che si possono utilizzare eluenti acquosi che sono ecocompatibili ( ad esempio, impiego di isopropanolo al posto della miscela acetonitrile/metanolo di tipo usuale ) .
Si può aggiungere che la daptomicina ad elevata purezza può essere ottenuta sia ripetendo anche per due o più volte la purificazione su resine a scambio ionico del tipo indicato, oppure abbinando alla purificazione con tali resine a scambio ionico le tecniche già note di purificazione su resine adsorbenti .
Studiando il problema per capire come mai gli insegnamenti del brevetto US 4208403 non davano risultati soddisfacenti, si è rilevato che la resina a scambio ionico IRA-68 ivi dettagliatamente descritta ha una microporosità di circa 4-5 Angstrom.
Le resine a scambio ionico basico utilizzate secondo la presente invenzione hanno una porosità superiore a 100 Angstrom e permettono di utilizzare come eluente una soluzione acquosa salina che consente di ottenere la separazione della daptomicina da altre sostanze simili e dalle impurezze presenti nei brodi di fermentazione. Questo risultato è indipendente dalla matrice della resina usata: infatti, negli esempi che seguono, è stato illustrato l'impiego di matrici diverse (agarosio, cellulosa, acriliche) e con diverse soluzioni saline (quali cloruro di sodio od ammonio solfato), avendosi comunque dei buoni risultati.
Le soluzioni di daptomicina ottenute dopo questo trattamento possono essere ulteriormente purificate anche con le tecniche descritte nei brevetti sopra citati, dando un prodotto di purezza elevata (oltre il 97%) con una resa migliore (oltre 60%) .
Per migliorare ulteriormente la procedura di purificazione è possibile impiegare altre tecniche note quali l'ultrafiltrazione e la dialisi per eliminare sali, solventi ed acqua da soluzioni di daptomicina; inoltre, è possibile utilizzare isopropanolo in sostituzione degli altri solventi organici per la fase di purificazione sulle resine adsorbenti descritti nei brevetti sopra citati: sebbene anche 1'acetonirile dia buoni risultati nella purificazione su resine adsorbenti, 1'isopropanolo è di gran lunga preferibile grazie alla sua minore tossicità.
La daptomicina solida è facilmente ottenibile dalla sua soluzione ad elevata purezza con tecniche note, ad esempio liofilizzando la sua soluzione (preferibilmente concentrata); oppure precipitandola come suo sale dalla soluzione; oppure ancora liofilizzando la sua soluzione (preferibilmente concentrata) , ridiscioglendo il solido in acqua od altro solvente e precipitandola come sale da questa soluzione.
Verrano ora descritti alcuni esempi di attuazione dell'invenzione. Gli esperimenti sono stati condotti a partire da soluzioni grezze di daptomicina ottenuta per fermentazione dopo avere eliminato il micelio. Le caratteristiche tipiche di tali soluzioni grezze erano le seguenti: pH compreso tra 2,8 e 7,5; temperatura tra 0°C e 25°C; colore marrone, contenuto di daptomicina compreso tra 0,5 e 3,5 g/1, purezza HPLC tra 5% e 20%.
Per "purezza HPLC" si intende il rapporto percentuale tra l'area del picco della daptomicina ed il totale delle aree di tutti i picchi (compreso quello della daptomicina) separati dall'analisi HPLC nelle seguenti condizioni:
colonna: Phenomenex IB Sii C8
fase mobile:
flusso :
temperatura:
detector :
In queste condizioni la daptomicina ha un picco di uscita a circa 16 minuti.
Prima della cromatografia a scambio ionico le soluzioni grezze possono essere trattate come descritto nel brevetto US 4208403: adsorbimento su resina Diaion HP20 e successiva eluizione con miscele acqua/solvente; in questo caso, prima dell' utilizzo della resina a cambio ionico, si riduce la concentrazione di solvente al di sotto del 20% mediante distillazione sotto vuoto oppure mediante dialisi/diaf iltrazione con membrane adatte, oppure ancora mediante diluizione con acqua o soluzioni acquose.
Tutte le resine utilizzate negli esempi che seguono, prima del loro utilizzo sono state trattate come indicato dal fornitore e poi sono state equilibrate con un tampone acetato sodico 60 mM, corretto a pH=5,8-6,2 (qui di seguito chiamato "tampone A") . Variazioni del pH e/o nella composizione del tampone sono indicate nelle descrizioni dei singoli esperimenti; correzioni di pH dei tamponi e delle soluzioni possono essere effettuate con soda caustica, idrossido di ammonio, acido cloridrico, acido solforico, acido acetico, acido fosforico, acetato sodico, fosfato sodico ed altri acidi, basi o sali, sia organici che minerali, a seconda della necessità.
Per l'eluizione si sono utilizzate soluzioni saline ottenute sciogliendo una mole di NaCl per litro di "tampone A" e correggendo il pH come sopra descritto: tali soluzioni vengono qui denominate "tampone B" .
E' stato utilizzato, tranne negli esempi dove altrimenti specificato, un sistema cromatografico automatico tipo Gradifract (Amersham-Pharmacia) composto da: formatore di gradiente, pompa, valvola di carico, colonna cromatografica, detector UV, conduttivimetro, registratore su carta, raccoglitore di frazioni.
Le colonne utilizzate sono di tipo incamiciato e vengono raffreddate con circolazione di acqua fredda a 2°C/+18°C. gli eluenti e le soluzioni di daptomicina vengono raffreddati a 4°C/+18°C.
Esempio 1
Purificazione della daptomicina su Sepharose Q Si utilizzano 120 mi di una soluzione di daptomicina (precedentemente trattata con resina HP20 secondo quanto descritto nel brevetto US 4874843) a 10,4 g/1 (pari a 1,25 g di antibiotico) avente purezza HPLC pari al 60% della somma delle aree nelle condizioni di analisi sopra riportate; si diluiscono con pari volume di tampone acetato 60 mM e si corregge il pH a 5,8.
Si carica la soluzione risultante su una colonna tipo XK26 (Amersham-Pharmacia) riempita con 150 mi di resina Sepharose Q Fast Flow (preventivamente condizionata con il tampone A), si flussano in colonna 300 mi di tampone A, quindi si eluisce con tampone acetato a pH=5,8 effettuando un gradiente lineare da 0 a 1000 mM in NaCl (da tampone A puro a tampone B puro).
Le frazioni contenenti daptomicina vengono analizzate in HPLC secondo il metodo sopra riportato e vengono riunite in base alla purezza percentuale; si ottengono 350 mi di soluzione a 2,9 g/1 di daptomicina (pari a 1,02 g, resa 82%) avente purezza 90%.
Questa soluzione viene ulteriormente purificata con resine di tipo adsorbente come le HP20 ed HP20ss procedendo come descritto nel brevetto US 4874843; si ottiene, dopo dissalazione e liofilizzazione, daptomicina solida avente purezza HPLC superiore al 97%, con una resa globale (a partire dal brodo di fermentazione) superiore al 40%.
Esempio 2
Purificazione della daptomicina su Sepharose DEAE
Si procede come descritto nell'Esempio 1, utilizzando la stessa soluzione di daptomicina ed una identica colonna caricata però con 150 mi di resina Sepharose DEAE Fast Flow (Amersham-Pharmacia) precedentemente trattata secondo le indicazioni del produttore e condizionata con tampone A.
L'eluizione dalla resina Sepharose DEAE Fast Flow viene effettuata con un gradiente lineare come descritto nell'Esempio 1, le frazioni riunite vengono poi trattate con resine HP20ss ed HP20 come descritto nel brevetto US 4874843, come per l'Esempio 1.
Si ottengono 375 mi di soluzione a 2,8 g/1 di daptomicina (pari a 1,05 g, resa 84%) avente purezza 91%.
Esempio 3
Purificazione della daptomicina su Cellufine A8Q0
Si utilizza una colonna tipo Vantage (Millipore) riempita con 600 mi di resina Cellufine A800 (Millipore) preventivamente trattata come indicato dal produttore e condizionata con tampone A; il carico delle soluzioni viene effettuato con una pompa peristaltica tipo PA3 (IKA), si raccolgono frazioni di circa 80-100 mi ciascuna.
Si caricano 480 mi della soluzione di daptomicina descritta nell'Esempio 1, pari a 5 g di prodotto, quindi si flussano 900 mi di tampone A e si eluisce con un gradiente lineare da 0 a 1000 mM in NaCl, utilizzando un totale di 4860 mi di eluente .
Si riuniscono le frazioni in base alla loro purezza HPLC, ottenendo circa 1600 mi di soluzione a 2,42 g/1 di daptomicina (pari a 3,9 g, resa 78%) avente purezza 92%.
Esempio 4
Purificazione della daptomicina su Cellufine A500
Si opera come descritto nell'Esempio 3, utilizzando 600 mi della resina Cellufine A500 (Millipore) preventivamente trattata come indicato dal produttore e condizionata con tampone A; si ottengono 1520 mi di soluzione a 2,65 g/1 di daptomicina (pari a 4,0 g, resa 80%) avente purezza 88%.
Esempio 5
Purificazione su Sepharose DEAE
Si utilizza una soluzione di daptomicina grezza, ovvero proveniente direttamente dalla microfiltrazione del micelio, non trattata con resina HP20, avente concentrazione di 1,42 g/1 e purezza pari al 15% della somma delle aree nelle condizioni di analisi sopra riportate.
Si utilizzano 560 mi di questa soluzione (pari a 0,8 g di daptomicina grezza) che si diluiscono con pari volume di tampone acetato 20 mM, quindi si corregge il pH al 5,8.
Si procede come descritto nell'Esempio 2, ottenendo 260 mi di una soluzione di daptomicina a 2,6 g/1 (pari a 0,68 g, resa 85%) avente purezza pari all'85%.
Esempio 6
Purificazione della daptomicina a pH 6,2
Si procede come descritto nell'Esempio 5, correggendo il pH della soluzione di daptomicina a 6,2 ed utilizzando i seguenti tamponi: tampone A = Na2HP04 20 mM corretto a pH 6,2; tampone B = A+1000 mM NaCl, corretto a pH 6,2.
Si ottiene una soluzione di purezza 80% con un recupero pari al 78% di resa.
Esempio 7
Purificazione della daptomicina a pH 4,6
Si procede come descritto nell'Esempio 5, variando solo il pH della soluzione di daptomicina e dei tamponi a pH = 4,6. Si ottiene una soluzione di purezza 72% con un recupero pari all'82% di resa .
Esempio 8
Purificazione su Diaion FPDA 13
Si utilizza una colonna tipo XK50 (AmershamPharmacia) riempita con 300 mi di resina acrilica FPDA 13 (Diaion Mitsubishi).
Si caricano 1400 mi della soluzione di daptomicina utilizzata nell'Esempio 5 (dopo avere corretto il pH a 6,0), poi si caricano nell'ordine:
600 mi di acqua distillata
1500 mi di tampone A
1500 mi di una miscela costituita da 70% di tampone A 30% e di tampone B.
Si ottiene una soluzione di daptomicina con purezza dell'85% e recupero dell'86%.
Esempio 9
Purificazione per eluizione a step
Si carica una soluzione di daptomicina di cui all'Esempio 1 su una colonna cromatografica contenente resina Cellufine A800 (Millipore) come descritto nell'Esempio 3, quindi si procede all'eluizione caricando tamponi a forza ionica crescente nell'ordine che segue:
1. tampone A corretto a pH tra 5 e 5,5
2. tampone A corretto a pH tra 5 e 5,5 100 mM NaCl
3. tampone A corretto a pH tra 5 e 5,5 150 mM NaCl
4. tampone A corretto a pH tra 5 e 5,5 200 mM NaCl
5. tampone A corretto a pH tra 5 e 5,5 150 mM NaCl
6. tampone A corretto a pH tra 5 e 5,5 300 mM 5. NaCl
7. tampone A corretto a pH tra 5 e 5,5 350 mM NaCl
8. tampone A corretto a pH tra 5 e 5,5 400 mM NaCl
0 II tampone di cui al punto 8 viene continuato fino a quando la daptomicina cessa di uscire dalla colonna; le frazioni contenenti daptomicina vengono analizzate in HPLC con il metodo sopra descritto e riunite in base alla loro purezza HPLC (area %).
Si ottiene una soluzione di daptomicina avente purezza pari al 92% con un recupero pari al 78% del prodotto caricato.
Esempio 10
Concentrazione e dissalazione con membrane per ultrafiltrazione
Si utilizza la soluzione ottenuta nell'esperimento descritto nell'Esempio 8: si corregge il pH a 2,5-3,0 con HC1 10% e poi si concentra con apparecchio Amicon provvisto di membrane da 500 Dalton fino a che il volume non scende a circa il 20% di quello iniziale diluisce con pari volume di acqua distillata e si riconcentra di nuovo fino al 25% del volume, pari al 10% circa di quello iniziale.
Si ottiene una soluzione di daptomicina con la stessa purezza di quella iniziale ed una concentrazione circa 10 volte superiore, con una resa pari al 96%.
Esempio 11
Purificazione mediante cromatografie a scambio ionico successive
Si utilizza la soluzione ottenuta nell'esperimento descritto nell'Esempio 5, che viene sottoposta a dialisi con membrane tipo D9527 (Sigma, MWCO 12000, preventivamente trattate secondo le indicazioni del fornitore) contro tampone acetato A.
Si condiziona una colonna XK26 riempita con 150 mi di resina Sepharose DEAE Fast Flow nuova con tampone A, quindi si procede al carico della soluzione dializzata di daptomicina ed all'eluzione come descritto nell'Esempio 5.
Si ottiene una soluzione di daptomicina avente purezza pari al 97%, adeguata ad un utilizzo in terapia sull'uomo, con un recupero pari al 72% del prodotto caricato.
Esempio 12
Purificazione _ mediante _ cromatografie successive
Si utilizza la soluzione ottenuta nell'esperimento descritto nell'Esempio 5, che viene caricata su una colonna cromatografica di resina Diaion HP20ss (Mitsubishi) ed eluita come descritto nel brevetto US 4874843.
Dopo rimozione del solvente e dei sali, si ottiene una soluzione di daptomicina avente purezza del 95% adeguata all'utilizzo terapeutico sull'uomo .
Esempio 13
La soluzione ottenuta come descritto nell'Esempio 10 viene caricata su una colonna cromatografica contenente 140 mi di resina Diaion HP20ss (Mitsubishi) precedentemente trattata secondo le indicazioni del produttore e condizionata con una soluzione acquosa di isopropanolo 10% a pH = 3,0 per HCl.
La cromatografia avviene utilizzando soluzioni acquose di isopropanolo come segue:
- 490 mi al 20% in volume corretta a pH=5,6 con 1,4 g/1, poi
- 490 mi al 25% in volume corretta a pH=5,6 con Na2HP04 1,4 g/1, poi
- 850 mi al 35% in volume corretta a pH=6,7 con Na2HP04 1,4 g/1.
Si separano le frazioni con purezza uguale o superiore al 95% in area (HPLC) mentre le frazioni a purezza inferiore al 95% possono essere cromatograf ate di nuovo previa diluizione con acqua o eliminazione del solvente. La resa in prodotto puro è del 78%.
Esempio 14
Rimozione di solvente e di sali dalle soluzioni di daptomicina mediante scambio ionico Una soluzione di daptomicina purificata per cromatografia su HP20ss come descritto nel brevetto US 4874843 con purezza pari al 97% viene diluita con acqua quanto basta per ridurre la concentrazione di solventi al 10% (voi./voi.), con una conducibilità pari a 1040 mS/cm a 25°C.
La soluzione viene fatta passare su resina FPDA 13 in ragione di 20 g di daptomicina per litro di resina e con un tempo di contatto di 1 ora e 30 minuti, quindi si lava con acqua osmotizzata; le acque di scarico contengono meno di 0,2 g/1 di daptomicina.
Si eluisce la diptomicina dalla resina utilizzando una soluzione di acido cloridrico 1 N, quindi si corregge il pH dell'eluato aggiungendo cautamente soda caustica diluita quanto basta a raggiungere pH=3,5.
Si ottiene una soluzione contenente meno di 1000 ppm di CH3CN ed avente conducibilità di 82 mS/cm, con purezza pari al 96% e recupero della daptomicina pari al 95%.
Esempio 15
Rimozione di solvente e di sali dalle soluzioni di daptomicina mediante scambio ionico Si utilizza una colonna caricata con 80 mi di resina FPDA 13 (Diaion) precedentemente condizionata con il tampone A diluito con due volumi di acqua. Si carica la soluzione ottenuta come descritto nell'Esempio 13 dopo averla diluita con circa due volumi di acqua ed aver corretto il pH a 6,0 con una soluzione di Na2HP04. Si lava la colonna con 250 mi di acqua osmotizzata; le acque di scarico contengono meno di 0,2 g/1 di daptomicina.
Si eluisce la daptomicina dalla resina utilizzando una soluzione di NaCl 500 mM a pH=4,0, raccogliendo le frazioni che contengono daptomicina. Si recupera oltre il 95% del prodotto iniziale .
La soluzione viene poi concentrata e dissalata per ultrafiltrazione come descritto nell'Esempio 10, ripetendo le diluizioni con acqua per quanto necessario ad ottenere una soluzione con concentrazione superiore a 100 g/1 con purezza del 97%.
Esempio 16
Purificazione della daptomicina su Sepharose Q Si procede come descritto nell'Esempio 1, utilizzando la stessa soluzione di daptomicina e la stessa apparecchiatura, con la differenza che si usa per l'eluizione un gradiente da 0 a 800 mM di ammonio solfato. Si ottiene una soluzione di daptomicina avente il 92% di purezza HPLC con una resa dell'80%.
Esempio 17
Precipitazione della daptomicina
Si sottopone a liofilizzazione una soluzione di daptomicina ottenuta come descritto nell'Esempio 15 e concentrata come nell'Esempio 10, ottenendo un prodotto solido contenente il 6,8% (peso/peso) di acqua, determinato per titolazione secondo Karl-Fischer.
Si sciolgono 2,5 g del liofilizzato m una miscela di 6 mi di acqua e 5 mi di acetone, quindi si gocciola la soluzione ottenuta in 200 mi di acetone e si filtra su carta.
Si ottengono 2,1 g di daptomicina solida avente una purezza HPLC maggiore del 97%.
Esempio 18
Precipitazione della daptomicina
Si utilizza una soluzione di daptomicina ottenuta come descritto nell'Esempio 15, la si concentra con membrane per ultrafiltrazione come descritto nell'Esempio 10 fino a raggiungere una concentrazione di circa 380 g/1. Si prelevano 6 mi di soluzione acquosa e si gocciolano in 200 mi di acetone, ottenendo un precipitato che viene filtrato su carta e seccato sotto vuoto.
Si ottengono 2,05 g di un solido avente una purezza HPLC maggiore del 97%.
Claims (5)
- RIVENDICAZIONI 1. Metodo per l'ottenimento di soluzioni di daptomicina pura ad almeno il 97% da soluzioni grezze ottenute per fermentazione e contenenti lipopolipeptidi diversi aventi la stessa catena polipeptidica ciclica della daptomicina, secondo il quale dette soluzioni grezze vengono sottoposte a purificazione cromatografica per assorbimento su resine e successiva eluizione, caratterizzato dal fatto che detto assorbimento comprende almeno un passaggio su una resina a scambio ionico di tipo basico avente pori di dimensione di almeno 100 Angstrom e che detta eluizione è effettuata con soluzione salina acquosa.
- 2. Metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto assorbimento con la resina a scambio ionico e relativa eluizione è abbinato ad almeno un assorbimento con resina adsorbente con successiva eluizione con una miscela di acqua e di almeno un solvente organico almeno parzialmente miscibile con acqua.
- 3. Metodo secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che detto solvente organico miscibile con acqua è scelto dal gruppo comprendente isopropanolo, acetonitrile, acetone, metanolo e tetraidrofurano .
- 4. Metodo secondo la rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che detto solvente organico miscibile con acqua è isopropanolo .
- 5. Daptomicina pura ad almeno il 97% isolata con tecniche note dalle soluzioni ottenute secondo il metodo delle rivendicazioni da 1 a 4.
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