IT201600127655A1 - Processo per la purificazione di antibiotici lipopolipeptidici - Google Patents
Processo per la purificazione di antibiotici lipopolipeptidiciInfo
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Description
- 2 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.
10988 M Descrizione del brevetto per invenzione industriale avente per titolo:
FM/ap “PROCESSO PER LA PURIFICAZIONE DI ANTIBIOTICI LIPOPOLIPEPTIDICI”
a nome : GNOSIS S.p.A.
con sede in: Milano
* * *
L’invenzione riguarda un processo di purificazione di antibiotici lipopolipeptidici, in particolare daptomicina e surotomicina, mediante uso di cromatografie a scambio ionico abbinati a cromatografia adsorbente
Stato della tecnica
La daptomicina è un antibiotico utilizzato per la terapia delle infezioni antibiotico-resistenti.
Nel 1978 (US4208403 e Re32.333) è stata scoperta da ricercatori Eli Lilly una attività antibiotica nei brodi di crescita dello Streptomyces roseosporus, il quale produce una miscela di polipeptidi chiamata “complesso A-21978”; questa miscela è stata separata in varie frazioni, una delle quali particolarmente interessante, la frazione A-21978C. In questa frazione ci sono diversi composti o fattori che differiscono per la catena di acido grasso legata al polipeptide; il fattore C0 è minoritario e porta a diversi isomeri con catena decanoile (US 4,537,717).
In seguito venne ottenuto per biotrasformazione il nucleo polipeptidico comune ai fattori di A-21978C, e da questo nucleo sono stati preparati per sintesi vari derivati, tra i quali anche il decanoil-derivato, chiamato inizialmente LY146032. Dato che il decanoil-derivato (ottenuto puro per semisintesi, ma anche uno degli isomeri presenti nel fattore A-21978C0 da fermentazione) presenta il migliore rapporto tra tossicità ed efficacia, fu scelto per gli studi clinici con il - 3 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.
nome di Daptomycin (INN).
Per la produzione industriale è tuttavia più conveniente ottenere l’antibiotico per fermentazione, somministrando il precursore acido decanoico, come descritto in US 4,885,243. Pur essendo tossico per il microorganismo, l’acido decanoico consente di ottenere una buona quantità di daptomicina.
A-21978C10, LY146032 e daptomicina sono denominazioni equivalenti e corrispondenti al principio attivo utilizzato in terapia, mentre la sigla A-21978C0 indica una miscela di isomeri aventi lo stesso nucleo polipeptidico ma varie catene alchiliche (compreso n-decanoile) e non corrisponde al prodotto farmaceutico.
La Surotomicina (EP2379580B1) è un antibiotico lipopolipeptidico particolarmente utile nelle infezioni da Clostridium difficile. Viene ottenuto per semisintesi dalla daptomicina stessa, dopo aver rimosso la catena alchilica (acido decanoico) della daptomicina e averla sostituita con una catena arilalchilica; i due prodotti hanno quindi in comune la stessa struttura polipeptidica, differiscono solo per la catena lipidica.
La soluzione acquosa di daptomicina prodotta per fermentazione di Streptomyces roseosporus, somministrando acido decanoico (EP0178152, EP1586580) o suoi analoghi (US4885157, EP2149609) presenta una elevata contaminazione da impurezze, sia similari (polipeptidi) che aspecifiche (sali minerali, zuccheri, proteine ecc.). La lista delle principali impurezze chimicamente correlate è riportata in EP01252179: una quindicina di queste impurezze identificate sono polipeptidi, sia intermedi di biosintesi che derivanti da biosintesi parallele oppure prodotti di degradazione della daptomicina stessa Kirsch et al Pharmaceutical Research 6, 5, 387-393 (1989).
Per contro, i requisiti di purezza del prodotto farmaceutico sono - 4 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.
decisamente elevati: a differenza di quanto avviene con altri antibiotici (es. teicoplanine, in cui il farmaco è costituito da una famiglia di prodotti strutturalmente analoghi): nel caso della daptomicina le sostanze correlate non sono considerate utili per la terapia ma vengono classificate come impurezze a tutti gli effetti: il prodotto commerciale deve avere una purezza superiore al 90% come daptomicina. US5912226 descrive alcune delle principali impurezze correlate alla daptomicina, quali la forma anidro ed il beta-isomero e definisce come “forma sostanzialmente pura” una preparazione di daptomicina che abbia meno del 2.5% di queste due impurezze, in somma tra loro.
La produzione del principio attivo deve seguire quindi un elaborato processo di purificazione per arrivare ad un prodotto di grado farmaceutico.
La purificazione dell’antibiotico dai brodi di fermentazione è ostacolata dal fatto che, mentre le impurezze aspecifiche sono facili da eliminare, altre impurezze sono costituite da sostanze molto simili alla daptomicina e non possono essere facilmente separare con le tecniche semplici e poco costose tradizionalmente impiegate in questo campo, come l’estrazione con solvente e la ultrafiltrazione. A ciò si aggiunge il fatto che la daptomicina grezza non può essere purificata per cristallizzazione. Anche se è descritta la precipitazione dalle soluzioni acquose di prodotto puro (EP1908770), questa tecnica non è applicabile alle soluzioni di prodotto grezzo, che per precipitazione può dare il prodotto in forma solida ma senza un incremento significativo di purezza.
La situazione è ulteriormente complicata dal fatto che la stabilità del prodotto in soluzione acquosa non è elevata, si ottiene facilmente degradazione spontanea anche a pH neutro (peggio ancora a pH acido o alcalino) con formazione di tre composti principali denominati beta-isomero, anidro- 5 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.
daptomicina e lattone-idrolisi (Kirsch et al Pharmaceutical Research 6, 5, 387-393 (1989) strutturalmente molto simili alla daptomicina, e quindi difficili da separare. Ovviamente i primi prodotti di degradazione possono a loro volta degradarsi e dare ancora altre impurezze.
I processi per la produzione di daptomicina si basano quindi sulla purificazione per cromatografia, effettuando diversi passaggi su resine a scambio ionico e/o adsorbenti, fino ad ottenere un prodotto di elevata purezza chimica.
Il passaggio chiave in tutti i processi noti finora noti consiste nella cromatografia su fase inversa oppure per interazione idrofobica, tecniche simili tra loro che possono essere effettuate, rispettivamente, su fase fisse a base di silice derivatizzata (RP) con catene lipofile (tipicamente alchiliche C8-C18 o feniliche) e su resine adsorbenti (HIC), provviste di catene lipofile similari o prive di gruppi funzionali. Per il costo proibitivo della silice derivatizzata, la tecnica RP è adatta solo alla scala laboratorio, mentre su scala industriale sono impiegate principalmente le resine adsorbenti cromatografiche, nonostante la loro minore efficienza di separazione. Dato che anche le resine sono molto costose ma si sporcano facilmente, perdendo gradualmente la loro capacità di separazione, si preferisce in genere effettuare un pre-trattamento dei brodi di fermentazione con altra tecnica, applicando la HIC a valle.
Dato che generalmente un singolo passaggio cromatografico non è sufficiente per raggiungere un grado di purezza soddisfacente, è necessario ripetere la cromatografia, nelle stesse condizioni (US Re39,071), oppure effettuare un secondo step di purificazione sulle stesse resine ma a diverso pH (US Re39,071, EP2398817) o ancora abbinare una diversa tecnica di purificazione, come la cromatografia a scambio ionico (US6696412). E’ possibile - 6 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.
anche purificare il prodotto mediante cromatografia a fase inversa (RP) utilizzando fasi inverse in silice derivatizzata (US4331594, esempio 4) tuttavia la tecnica non è conveniente per il costo delle fasi in silice derivatizzata, il costo delle apparecchiature necessarie (HPLC preparativo) per lavorare a pressioni elevate e il grande consumo di solventi.
Entrambe le tecniche richiedono l’uso di solventi organici miscibili con acqua, che poi devono essere separati dal prodotto. L’utilizzo di solventi comporta anche problemi di sicurezza dovuti alla loro infiammabilità, nonchè di salute dei lavoratori che possono essere esposti ai vapori; inoltre i solventi devono essere e recuperati o smaltiti, il che comporta evidenti svantaggi sia ecologici che economici.
La cromatografia a scambio ionico (IEC) si basa sul legame del prodotto ad una fase fissa caricata positivamente o negativamente, mentre il distacco viene ottenuto in genere con tamponi ad elevata forza ionica. Nel caso di daptomicina, fortemente instabile a pH alcalini, si utilizzano resine a funzionalizzazione basica (base debole, tipo dietilamminoetile, oppure base forte, tipo ammonio quaternario) e si lavora a pH neutro o debolmente acido, caricando la soluzione da purificare a bassa forza ionica ed eluendo quindi il prodotto con soluzioni gradualmente più alte in forza ionica, ovvero con concentrazioni crescenti di sodio cloruro. Nel caso specifico della daptomicina, sono state finora utilizzate resine con funzionalizzazione dietilamminoetile (base debole) e matrice acrilica o metacrilica a porosità controllata, adatte a lavorare con macromolecole come proteine e acidi nucleici: ciò permette di ottenere il distacco del prodotto dalla resina in condizioni non troppo drastiche, evitando degradazione del prodotto. In particolare si possono usare resine come Diaion FPDA13, Amberlite IRA68 o altre resine.
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In associazione alle purificazioni per cromatografia, possono essere impiegate anche tecniche più economiche come per esempio la estrazione in solvente organico (non miscibile con acqua): tipicamente viene impiegato nbutanolo o n-butil acetato (US4331594, WO2009/144739) per estrarre il prodotto da soluzioni a pH fortemente acido (sotto al pI della daptomicina). Si separano le fasi, eliminando la fase acquosa, quindi si estrae la fase organica con una soluzione acquosa tamponata a pH neutro, dove il prodotto si trova in forma dissociata. E’ un processo poco costoso, che elimina alcune impurezze aspecifiche ma non garantisce alcuna purificazione dalle impurezze strutturalmente correlate Vengono anche applicate tecniche di filtrazione tangenziale per separare il micelio (microfiltrazione), concentrare e/o dializzare le soluzioni, eliminare il solvente (ultra- e nano-filtrazione, osmosi inversa) o rimuovere i pirogeni (ultrafiltrazione).
Secondo quanto descritto in US4331594 il prodotto può essere purificato per cromatografia a fase inversa, che tuttavia è poco utilizzata a livello industriale a causa del costo della silice RP-18, del costo dell’impianto necessario e per l’eccessivo consumo di solvente organico. Di conseguenza la purificazione su fasi RP-18 non è ritenuta soddisfacente per una applicazione industriale e si sono cercate alternative più economiche per produrre l’antibiotico a costi ragionevoli.
Il metodo descritto in US4874843 prevede la separazione mediante filtrazione della biomassa al termine delle fermentazione dalla fase liquida contenente il prodotto e l’assorbimento della daptomicina sulla resina adsorbente Diaion HP20. Dopo l’eluizione, la daptomicina semipura viene purificata mediante una successione di passaggi su Diaion HP20 e su Diaion HP20ss, una versione di migliore qualità della stessa resina, adatta per HIC. Un singolo - 8 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.
passaggio tuttavia non è sufficiente, è necessario rimuovere il solvente e poi sottoporre la soluzione di daptomicina ad almeno una nuova cromatografia. La purezza del prodotto così ottenuto non è elevata, inoltre il processo richiede l’utilizzo di notevoli quantità di solvente.
Il metodo descritto in US 6696412 risulta essere commercialmente fattibile per produrre daptomicina a elevato grado di purezza, e consiste in una serie di operazioni cromatografiche in successione comprendenti: una cromatografia a scambio anionico, una cromatografia per interazione idrofobica (HIC) e un secondo passaggio su scambio anionico. La purezza dichiarata della daptomicina così ottenuta risulta superiore al 95%. Una applicazione particolarmente conveniente di tale processo precede di separare il micelio dalla soluzione acquosa a fine fermentazione, utilizzando uno speciale apparato denominato PallSep, ottenendo una soluzione limpida di daptomicina. Tale soluzione viene flussata su una resina anionica, che trattiene la daptomicina e non trattiene la maggior parte delle impurezze aspecifiche presenti nel terreno di coltura; il prodotto desiderato viene eluito dalla resina utilizzando una soluzione di sodio cloruro, a concentrazione crescente, ottenendo quindi una soluzione acquosa salina di daptomicina, con purezza aumentata. Secondo quanto insegna il brevetto, particolarmente adatta è la Mitsubishi Diaion FPDA13, una resina acrilica a funzionalizzazione DEAE (dietilamminoetile). La soluzione così ottenuta viene poi sottoposta a concentrazione e/o dialisi mediante ultrafiltrazione, un passaggio dove gran parte del sale presente nel tampone di eluizione viene eliminato nel permeato, mentre la daptomicina viene concentrata nel retentato; in una variante del processo, la fase di ultrafiltrazione può essere sostituita da una semplice diluizione con acqua.
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La soluzione parzialmente purificata, dissalata e concentrata viene quindi caricata su una colonna cromatografica riempita con una resina adsorbente, Diaion HP20ss, ed eluita con concentrazioni crescenti di un solvente organico miscibile con acqua (acetonitrile, isopropanolo o altro); in questo passaggio si raggiunge la purezza richiesta al prodotto finale, mentre le fasi successive non comportano una sostanziale purificazione del prodotto ma sono anzi a rischio di diminuire la purezza, per la spontanea degradazione della daptomicina. Dato che le soluzioni di daptomicina pura contengono rilevanti percentuali di solvente organico, queste vengono sottoposte a diluizione e dialisi con acqua, mediante ultrafiltrazione, oppure possono essere sottoposte nuovamente a cromatografia su resina FPDA13, in modo analogo a quanto descritto sopra. Seguono altri passaggi di ultrafiltrazione sia per rimozione dei pirogeni che per concentrazione delle soluzioni, che vengono infine liofilizzate per ottenere il prodotto in polvere.
Per le particolari caratteristiche proprie della daptomicina, che comprende sia una catena lipidica (acido decanoico) legata ad una struttura polipeptidica, nelle condizioni descritte in questo brevetto si formano delle micelle, ovvero degli aggregati comprendenti più molecole di daptomicina; questo fenomeno viene espressamente sfruttato nei passaggi di ultrafiltrazione. Nello stesso brevetto si descrive anche l’uso di agenti chaotropici (per es. urea) in alte concentrazioni per la fase di purificazione mediante HIC. In US8058238 e US8129342 si dettagliano meglio le impurezze presenti e si descrivono i metodi analitici HPLC utilizzati per l’analisi del prodotto.
Sono numerosi i metodi di purificazione che prevedono una successione di differenti passaggi cromatografici per ottenere un prodotto con purezza adeguate: ad esempio WO 2009/144739 riporta l’uso della RP-HPLC preparativa come - 10 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.
unico passaggio cromatografico per ottenere Daptomicina con livelli di purezza superiori al 96%. Il limite di tale approccio risiede nell’elevato costo della tecnica HPLC su scala preparativa e nel fatto che non è adatta a preparare centinaia di kg di prodotto.
Altri brevetti riportano schemi di purificazione a più stadi, basati sull’uso di resine anioniche e resine adsorbenti eventualmente combinati con l’estrazione in solvente organico, come per esempio in WO2009/144739 e in EP2398817: in entrambi si descrive come particolarmente vantaggioso l’uso di sodio cloruro o potassio cloruro (o altri alogenuri alcalini o alcalino-terrosi).
Dato che la cromatografia HIC effettuata su resina è meno efficiente rispetto alla RP su silice, può essere necessario introdurre nuovi stadi di purificazione o, più semplicemente, ripetere la cromatografia e diverso pH, effettuando quindi sulla stessa resina un passaggio a pH neutro e uno a pH acido (EP2398817).
L’uso di una resina cationica nella purificazione di daptomicina è descritto in CN101899094, dove la purificazione viene effettuata per mezzo di ripetuti passaggi con membrane per ultrafiltrazione e nanofiltrazione a diversi cut-off, grazie alla formazione di micelle. Quindi la soluzione contenente il prodotto viene acidificata e caricata, con flusso particolarmente basso (0.3 volumi per ora), su una resina solfonica in forma acida. Si eluisce con un gradiente di HCl da 0.01 N a 0.05 N, ottenendo un prodotto con purezza 90%, che poi viene concentrato per nanofiltrazione ed evaporazione sotto vuoto, infine cristallizzato. Non ci sono tuttavia indicazioni di resa e le condizioni di lavoro, a pH estremamente acido per lungo tempo, sono incompatibili con la stabilità della daptomicina (come riportato in Kirsch et al Pharmaceutical Research 6, 5, 387-393, 1989) e dei polipeptidi in - 11 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.
generale. Inoltre, l’utilizzo di soluzioni fortemente acide per HCl comporta la corrosione delle parti di impianto realizzate in acciaio e quindi la presenza di ioni ferro, cromo e nickel, certamente indesiderabili in un prodotto farmaceutico iniettabile.
In tutta la letteratura finora nota, l’eluizione di daptomicina da una resina a scambio ionico viene effettuata utilizzando concentrazioni elevate di sodio cloruro, considerato particolarmente adatto allo scopo, come descritto in US6696412 e in EP2398817, che rivendica specificamente l’uso di ioni monovalenti. La presenza di sodio cloruro sembra essere particolarmente importante nei processi basati sulla formazione di micelle, favorite dalla presenza di sale e in certe condizioni di pH, come riportato in US8129342 (colonna 21).
E’ inoltre noto che la daptomicina ha proprietà chelante; in particolare il suo meccanismo d’azione come antibiotico è correlato alla formazione di legame con gli ioni calcio (Shapiro et al Antimicr Ag Chemother 47, 8 2538-44, 2003) ma la capacità chelante può essere sfruttata anche nel processo di purificazione, per esempio estraendo in fase organica il complesso come descritto in EP1355920B1 (esempio 14, riferito alla miscela di antibiotici A-21978C). Si tratta quindi non di un processo cromatografico ma di un metodo alternativo per estrarre il prodotto in solvente: il grado di purificazione che si ottiene è molto basso, vengono eliminate solo impurezze aspecifiche, non le impurezze più simili a daptomicina (e più difficili da separare).
Anche la cristallizzazione del prodotto puro (EP1908770) non prevede la formazione di complessi con Ca++ o con altri ioni bivalenti. In pratica, in tutti i processi di purificazione del prodotto finora noti, tranne l’estrazione in solvente sopra citata, si tende ad evitare la presenza di ioni bivalenti nelle soluzioni di - 12 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.
daptomicina.
Descrizione dell’invenzione
La presente invenzione descrive un processo di purificazione di antibiotici lipopolipeptidici, in particolare daptomicina o surotomicina, caratterizzato da tecniche di cromatografia a scambio ionico degli eluenti basati su tamponi di ioni bi-valenti o tri-valenti, anche in concentrazione elevata, ottenendo un buon grado di purificazione. Inoltre, viene usata una resina cationica, sulla quale il prodotto viene caricato ed eluito in condizioni di pH diverse da quelle finora note. In una variante del processo descritto, la cromatografia a scambio cationico può essere convenientemente utilizzata per la rimozione del solvente da soluzioni di antibiotici lipopolipeptidici. In una ulteriore variante, può essere utilizzata per la decolorazione delle soluzioni di antibiotici lipopolipeptidici risultanti dai brodi di fermentazione.
Il processo dell’invenzione comprende:
a) rimozione del micelio dal brodo di coltura (per microfiltrazione, centrifugazione o altro processo);
b) cromatografia a scambio anionico della soluzione dallo stadio a) eluendo con ioni di- o tri-valenti;
c) eventuale concentrazione della frazione purificata dallo stadio b), in particolare per nanofiltrazione;
d) cromatografia a interazione idrofobica delle frazione dallo stadio b) o c) eluendo con alcoli C1-C4;
e) cromatografia a scambio cationico della frazione arricchita nel lipopolipeptide di interesse dallo stadio d) eluendo con soluzioni saline eventualmente a pH superiore al punto isoelettrico del lipopolipeptide;
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f) dialisi, concentrazione e liofilizzazione o spray-drying del lipopolipeptide purificato.
L’eluizione dello stadio b) è preferibilmente effettuata con solfato di magnesio, solfato di alluminio o citrato di una diammina lineare o ciclica, più preferibilmente con solfato di magnesio.
La resina a scambio anionico è preferibilmente una resina funzionalizzata con gruppi basici deboli.
L’eluizione della cromatografia a interazione idrofobica dello stadio d) è preferibilmente effettuata con isopropanolo.
La cromatografia a scambio cationico dello stadio e) è effettuata utilizzando una resina funzionalizzata con gruppi acidi forti, eluendo a pH compresi fra 3 e 7.
L’invenzione ha inoltre per oggetto l’uso di una resina a scambio cationico per la rimozione di solventi organici miscibili in acqua da soluzioni acquose di daptomicina o surotomicina e per decolorare soluzioni di daptomicina o surotomicina in acqua o in miscela di acqua e solventi organici miscibili con acqua.
Descrizione dettagliata dell’invenzione
Secondo il processo dell’invenzione è possibile utilizzare con successo ioni bi-valenti o tri-valenti nella cromatografia a scambio ionico per la purificazione di daptomicina, sia ioni metallici come Mg, Zn, Al, sia utilizzando basi organiche bivalenti, lineari come etilendiammina, dimetiletilendiammina e simili, o cicliche come imidazolo, piperazina e simili. Il sale può essere formato con un controione sia monovalente che bivalente o trivalente, sia inorganico che organico, quali acetati, formiati, tartrati, citrati, solfati, cloruri, fosfati, polifosfati di basi organiche bivalenti o di ioni bivalenti di elementi metalli o metalloidi.
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Nella scelta del sistema ionico bivalente è opportuno tenere conto della solubilità in acqua del sale, della sua eventuale capacità di tamponare il pH della soluzione, e della eventuale tendenza a dare reazioni di ossido-riduzione in presenza di ossigeno disciolto. Inoltre, è possibile impiegare sistemi salini differenti nelle varie fasi di lavorazione, in particolare nel condizionamento della resina prima dell’utilizzo e nella sue rigenerazione dopo l’utilizzo possono essere impiegati sistemi tampone e salini differenti da quello scelto come eluente in fase di cromatografia.
Il sistema salino preferito utilizzato come eluente è preferibilmente il magnesio solfato, utilizzato in concentrazioni da zero a 1 M, ed in particolare da zero a 600 mM, con concentrazione più bassa all’inizio della cromatografia e poi progressivamente più alta, fino a raggiungere il valore più alto indicato, con un profilo di salita che può essere sia a step (discontinuo) che a gradiente (continuo). Preferibilmente, il magnesio solfato può essere abbinato ad un sistema tampone che sia utilizzato in bassa concentrazione e sia tuttavia in grado di controllare il pH mantenendolo al valore desiderato. Un esempio di sistema tampone è magnesio acetato e acido acetico.
Lo stesso tipo di cromatografia su resine a scambio anionico può essere ottenuto utilizzando dei tamponi basati su ioni bivalenti non metallici, per esempio delle diammine, lineari o cicliche, anch’esse salificate con una controparte acida monovalente, bivalente o trivalente.
Secondo l’invenzione, l’utilizzo di ioni bivalenti come eluenti per la cromatografia a scambio ionico nella purificazione di daptomicina presenta i vantaggi di seguito descritti. La procedura è particolarmente utile per ottenere una buona separazione di alcune impurezze correlate che sono difficilmente separabili - 15 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.
nei processi noti di cromatografia per interazione idrofobica, e contemporaneamente si eliminano alcune impurezze aspecifiche derivanti dalla fermentazione. In particolare, la tecnica è applicabile direttamente ai brodi di fermentazione, preferibilmente dopo aver separato il micelio per centrifugazione o microfiltrazione, ottenendo un buon grado di purezza già dopo il primo step cromatografico.
Possono essere impiegati allo scopo varie soluzioni acquose comprendenti a) un sistema tampone, che può essere di qualunque tipo, organico o inorganico, purché in grado di tamponare a pH da 2 a 7 e b) un sale bivalente, che viene impiegato a concentrazione crescente e che ha il compito di provocare selettivamente il distacco dalla resina sia della daptomicina che delle impurezze correlate, che vengono suddivise in frazioni diverse. Una variante del processo qui descritto prevede di utilizzare uno stesso sale sia per controllare il pH che la forza ionica, per esempio impiegandolo a bassa concentrazione per il solo controllo del pH e poi incrementandone la concentrazione per ottenere l’eluizione del prodotto.
Allo scopo possono essere impiegate resine a scambio ionico di vario tipo, basate sia su polimeri naturali come il destrano e l’agarosio, sia su polimeri sintetici come i polimetacrilati e i polistireni; come gruppi funzionali possono essere impiegati sia basi deboli, come le dietilammine, sia basi forti come gli ioni di ammonio quaternario. Particolarmente adatte allo scopo, per il costo contenuto e per l’assenza di interazioni aspecifiche, sono resine polimetacriliche a funzione dietilamminoetile, come per esempio la resina Diaion FPDA13; queste resine sono in grado di legare la daptomicina nel range di pH in cui il prodotto è più stabile, e di rilasciarlo poi con buone rese.
A differenza del calcio, alcuni ioni bivalenti non interferiscono con il - 16 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.
processo di legame sulle resine, al punto che le frazioni ottenute dalla purificazione con resina anionica possono essere utilizzate direttamente, senza bisogno di effettuare passaggi di dialisi o di concentrazione, nella cromatografia HIC.
Un secondo campo di applicazione della cromatografia su resina a scambio ionico con utilizzo di ioni bivalenti è la desolvatazione delle soluzioni di daptomicina, per esempio le frazioni ottenute da una cromatografia HIC. Come già detto, la cromatografia HIC impiega solventi organici miscibili con acqua, in quantità crescenti per eluire il prodotto adsorbito sulla resina; possono essere impiegati acetonitrile, isopropanolo, etanolo o altri solventi analoghi, in concentrazioni variabili
L’invenzione è illustrata in maggior dettaglio nei seguenti esempi.
Per purezza si intende il rapporto percentuale tra l’area del picco della daptomicina ed la somma totale delle aree dei picchi della daptomicina e delle impurezze, determinato per analisi in HPLC con rivelatore UV a 214 nm, secondo quanto descritto in US8129342 (colonna 22). Dove indicato, il contenuto delle singole impurezze si riferisce all’area del picco della sostanza indicata rispetto al totale delle aree, determinata in HPLC come sopra.
Esempio 1
Una coltura di Streptomyces roseosporus viene fatta crescere in fermentazione aerobica sommersa come descritto nel brevetto EP0178152B1, somministrando acido decanoico durante le fasi finali di fermentazione e prendendo le opportune precauzioni per evitarne l’accumulo, come descritto nel brevetto US4208403.
Si ottengono 40 litri di una sospensione contenente circa 2,5 grammi di - 17 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.
daptomicina per grammo di brodo di fermentazione, che viene purificata secondo i seguenti passaggi:
a) Il brodo intero viene sottoposto a microfiltrazione utilizzando delle membrane a base di biossido di titanio di porosità adeguata (0.2 µm). Si ottiene un filtrato pressoché limpido, che viene avviato alla fasi successiva di nanofiltrazione; il micelio presente nel retentato viene risospeso in acqua e nuovamente microfiltrato, il secondo filtrato viene riunito al primo per migliorare il recupero di prodotto. Si ottiene infine una soluzione acquosa di colore scuro, con una concentrazione di daptomicina pari a circa 1.5 g/l, corrispondente ad una resa di processo di oltre il 90%. La soluzione viene parzialmente concentrata per nanofiltrazione, eliminando il permeato (che è privo di prodotto) e conservando il retentato; per abbreviare la lavorazione e limitare la degradazione del prodotto, la nanofiltrazione viene condotta a temperatura ridotta e viene avviata in contemporanea alla microfiltrazione. Si ottiene una soluzione concentrata di daptomicina grezza, di colore rosso-bruno, con purezza di circa 50-55% in area HPLC (determinata come descritto sopra), che viene denominata brodo microfiltrato;
b) Il brodo microfiltrato viene caricato corretto a pH=6 e caricato su una colonna di resina anionica Diaion FPDA13, previamente equilibrata con una soluzione tampone di magnesio acetato 50 mM a pH 6. La daptomicina si lega interamente alla resina, mentre nell’effluente si elimina una soluzione limpida colorata. Si lava la resina con acqua demineralizzata, quindi con una soluzione tampone di magnesio acetato 50 mM a pH 6; l’effluente ottenuto dalla colonna contiene prevalentemente impurezze e viene eliminato. Si eluisce il prodotto dalla resina utilizzando una soluzione di magnesio acetato 50 mM e magnesio solfato da - 18 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.
zero a 500 mM a pH 6, suddividendo l’effluente in varie frazioni, quindi si effettua analisi HPLC come descritto sopra di ogni frazione. Si riuniscono le frazioni con purezza adeguata, che vengono concentrate per nanofiltrazione, utilizzando membrane polimeriche con cut-off circa 500 Da: non si osserva alcuna formazione di micelle;
c) La soluzione di daptomicina viene caricata su una colonna di resina Diaion HP20ss, previamente condizionata in tampone ammonio acetato 50 mM a pH circa 6.3 ed impaccata a pressione in un contenitore a letto fisso. La soluzione in uscita dalla colonna durante il carico viene scartata, quindi si carica un volume di acqua demineralizzata pari al volume di resina, scartando le soluzione in uscita. Si eluisce il prodotto mediante una soluzione tampone ammonio acetato 50 mM pH 6 con quantità crescenti di isopropanolo, aumentando la concentrazione di solvente con gradualità lineare, passando dal 5% al 40% (in volume); la soluzione in uscita viene frazionata in porzioni pari a metà del volume di resina. Le frazioni vengono analizzate in HPLC e riunite o scartate in base al dato di purezza della daptomicina, in area % con il metodo sopra indicato;
d) La soluzione purificata di daptomicina ottenuta come sopra viene diluita con uguale volume di acqua demineralizzata, quindi caricata su una colonna di resina Relisorb SP400 (Resindion) preventivamente condizionata a pH 3 con acido formico diluito. Si lava la resina con una soluzione di acido formico 0.1% diluito in acqua per iniettabili (WFI), utilizzando due volumi di soluzione per volume di resina; in questa fasi la perdita di prodotto nell’effluente è pressoché nulla. Si eluisce la daptomicina dalla resina utilizzando una soluzione acquosa di ammonio acetato 100 mM a pH 5, quindi si concentra mediante nanofiltrazione fino a ridurre il volume ad 1/5 del volume iniziale. Il concentrato viene dializzato con - 19 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.
acqua WFI aggiungendola in continuo nel retentato in quantità pari al flusso di permeato.
La soluzione di daptomicina così ottenuta viene ulteriormente concentrata fino a raggiungere una concentrazione di 130 g/l, quindi sottoposta a liofilizzazione. Si ottiene daptomicina in polvere con purezza del 96% ed un contenuto di magnesio residuo inferiore a 10 ppm.
Esempio 2
Si effettua la fermentazione e la microfiltrazione di S. roseosporus come descritto nell’esempio 1:
a) Il brodo microfiltrato 1 viene corretto a pH=6 e caricato su una colonna di resina anionica Diaion FPDA13, previamente equilibrata con una soluzione tampone di magnesio acetato 50 mM a pH=6: la daptomicina si lega interamente alla resina, mentre nell’effluente si elimina una soluzione limpida colorata. Si lava la resina con acqua demineralizzata, quindi con una soluzione tampone di magnesio acetato 50 mM a pH=6; l’effluente ottenuto dalla colonna contiene prevalentemente impurezze e viene eliminato. Si eluisce il prodotto dalla resina utilizzando una soluzione di magnesio acetato 50 mM e alluminio solfato da zero a 300 mM a pH 6 suddividendo l’effluente in varie frazioni, quindi si effettua analisi HPLC come descritto sopra di ogni frazione, si riuniscono le frazioni con purezza adeguata, e si concentra per nanofiltrazione senza osservare la formazione di micelle;
b) La soluzione parzialmente purificata viene caricata su una colonna di resina Purolite PCG1200M, previamente condizionata in tampone ammonio acetato 50 mM a pH circa 6.3 ed impaccata a pressione in un contenitore a letto fisso. La soluzione in uscita dalla colonna durante il carico viene scartata, quindi si - 20 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.
carica un volume di acqua demineralizzata pari al volume di resina, scartando le soluzione in uscita. Si eluisce il prodotto mediante una soluzione tampone ammonio acetato 50 mM pH 6 con quantità crescenti di etanolo, aumentando la concentrazione di solvente con gradualità lineare, passando dal 10% al 60% (in volume); la soluzione in uscita viene frazionata in porzioni pari a metà del volume di resina. Le frazioni vengono analizzate in HPLC e riunite o scartate in base al dato di purezza della daptomicina, in area % con il metodo sopra indicato. Si ottiene una soluzione acquosa contenente etanolo in cui la daptomicina è presente con purezza pari al 96% circa;
c) La soluzione purificata di daptomicina viene diluita con uguale volume di acqua demineralizzata, quindi caricata su una colonna di resina Relisorb SP400 (Resindion) preventivamente condizionata a pH 3 con acido formico diluito. Si lava la resina con una soluzione di acido formico 0.1% diluito in acqua per iniettabili (WFI), utilizzando due volumi di soluzione per volume di resina; in questa fasi la perdita di prodotto nell’effluente è pressoché nulla. Si eluisce la daptomicina dalla resina utilizzando una soluzione acquosa di magnesio solfato 500 mM a pH 3, quindi si concentra mediante nanofiltrazione, si dializza e si liofilizza come descritto nell’esempio 1.
Si ottiene daptomicina in polvere con purezza superiore al 95%.
Esempio 3
a) Il brodo microfiltrato ottenuto descritto nell’esempio 1 viene corretto a pH 6.0-6.5 con acido acetico e caricato su una colonna di resina anionica Diaion FPDA13, previamente equilibrata con una soluzione tampone di piperazina citrato 50 mM a pH 6: la daptomicina si lega interamente alla resina, mentre nell’effluente si elimina una soluzione limpida colorata. Si lava la resina con - 21 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.
acqua demineralizzata, quindi con una soluzione tampone di piperazina citrato 50 mM a pH 6; l’effluente ottenuto dalla colonna contiene prevalentemente impurezze e viene eliminato;
Si eluisce il prodotto dalla resina utilizzando una soluzione di piperazina citrato da 50 mM a 200 mM a pH 6 suddividendo l’effluente in varie frazioni, quindi si effettua analisi HPLC come descritto sopra di ogni frazione, si riuniscono le frazioni con purezza adeguata, e si concentra per nanofiltrazione senza osservare la formazione di micelle;
b) La soluzione di prodotto concentrato viene acidificata fino a pH 3.8, quindi sottoposta ad estrazione liquido/liquido aggiungendo uguale volume di n-butanolo; la daptomicina è stata nuovamente estratta dalla soluzione butanolica mediante un volume ridotto (1/2 rispetto al solvente) di tampone acquoso a pH 6.3. Si distilla sotto vuoto per ridurre la quantità di solvente residuo;
c) La soluzione viene caricata su resina HP20ss come descritto nell’esempio 1 al punto c), utilizzando però soluzioni a concentrazione crescente in isopropanolo. Si selezionano e si riuniscono le frazioni a purezza superiore al 95% in area HPLC;
d) La soluzione purificata di daptomicina viene diluita con uguale volume di acqua demineralizzata, quindi caricata su una colonna di resina Relisorb SP400 (Resindion) preventivamente condizionata a pH 3 con acido formico diluito. Si lava la resina con una soluzione di acido formico 0.1% diluito in acqua per iniettabili (WFI), utilizzando due volumi di soluzione per volume di resina; in questa fasi la perdita di prodotto nell’effluente è pressoché nulla. Si eluisce la daptomicina dalla resina utilizzando una soluzione acquosa di sodio cloruro 500 mM in etanolo 20 % a pH 3, quindi si concentra mediante nanofiltrazione, si - 22 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.
dializza e si liofilizza come descritto nell’esempio 1.
Esempio 4
a) Il brodo microfiltrato prodotto come descritto nell’esempio 1 viene corretto a 6.0-6.5 e caricato su una colonna di resina anionica Diaion FPDA13, previamente equilibrata con una soluzione tampone di etilendiammina acetato 50 mM a pH 6: la daptomicina si lega interamente alla resina, mentre nell’effluente si elimina una soluzione limpida colorata. Si lava la resina con acqua demineralizzata, quindi con una soluzione tampone di etilendiammina acetato 50 mM a pH 6; l’effluente ottenuto dalla colonna contiene prevalentemente impurezze e viene eliminato. Si eluisce il prodotto dalla resina utilizzando una soluzione di etilendiammina acetato da 50 mM a 300 mM a pH 6 suddividendo l’effluente in varie frazioni, quindi si effettua analisi HPLC come descritto sopra di ogni frazione, si riuniscono le frazioni con purezza adeguata; b) La soluzione di daptomicina risultante viene portata a pH 3 con acido cloridrico, quindi viene ulteriormente purificata utilizzando resina Purolite PCG1200M. Si eluisce il prodotto mediante una soluzione tampone ammonio acetato 50 mM pH 6 con quantità crescenti di isopropanolo, aumentando la concentrazione di solvente con gradualità lineare, passando da zero al 40% (in volume). Le frazioni vengono analizzate in HPLC e riunite in base alla purezza;
c) La soluzione di daptomicina pura viene desolvatata portando a pH 3 e facendo catturare il prodotto su resina Relite SP400. Si eluisce con una soluzione di sodio acetato a pH 6, ottenendo resa quantitativa. La soluzione viene poi dializzata con acqua mediante nanofiltrazione su membrane in polisulfone a cut-off 500 Da, concentrata fino a 100 g/l e liofilizzata.
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Esempio 5
a) La fermentazione e la microfiltrazione vengono condotte come descritto nell’esempio 1, con la differenza che il brodo microfiltrato viene caricato direttamente sulla resina FPDA13 previamente condizionata con tampone acetato a pH 6. Si carica acqua demineralizzata pari a due volumi rispetto alla resina, quindi si eluisce con un tampone di ammonio acetato contente ammonio solfato in quantità crescente da 50 mM a 500mM, a pH 6;
b) La soluzione così ottenuta viene caricata direttamente (alla stessa concentrazione) su una colonna di resina Purolite PCG1200M, previamente condizionata con acido formico a pH 3 ed impaccata a pressione in un contenitore a letto fisso. La soluzione in uscita dalla colonna durante il carico viene scartata, quindi si carica un volume di acqua demineralizzata pari al volume di resina, scartando le soluzione in uscita. Si eluisce il prodotto mediante una soluzione quantità crescenti di isopropanolo addizionata di acido formico fino a pH 3, aumentando la concentrazione di solvente con gradualità lineare, passando da zero al 50% (in volume); la soluzione in uscita viene frazionata in porzioni pari a metà del volume di resina. Le frazioni vengono analizzate in HPLC e riunite in base al dato di purezza della daptomicina;
c) La soluzione di daptomicina pura viene desolvatata con Relite SP400 effettuando il carico a pH 3 e l’eluizione con tampone ammonio acetato a pH 7. La resa ottenuta è quantitativa.
Esempio 6
a) La soluzione microfiltrata ottenuta nell’esempio 1 viene caricata in una colonna contenente resina cationica Amberlite1200H previamente equilibrata con tampone 50 mM sodio acetato pH 6; si osserva in uscita dalla colonna una - 24 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.
soluzione di colore giallo, contenente circa la stessa concentrazione di daptomicina. Si eluisce ulteriormente la resina con lo stesso tampone, utilizzandone una quantità in volume pari al doppio del volume di resina; le soluzioni eluite vengono concentrate per ultrafiltrazione senza osservare la formazione di micelle. Si ottiene una soluzione decolorata con una resa pari al 95% in daptomicina;
b) La soluzione viene concentrata per nanofiltrazione, quindi acidificata a pH 3 con HCl e sottoposta ad estrazione con pari volume di n-butanolo: dopo separazione, la fase acquosa viene scartata. La fase organica viene estratta con una soluzione tampone 50 mM di ammonio acetato, aggiungendo ammoniaca per correggere il pH a 6;
c) La soluzione così ottenuta viene purificata per cromatografia su resina Relite Diaion HP20, eluendo con un gradiente lineare di etanolo da zero a 60%, a pH 6. Si selezionano le frazioni con purezza superiore al 85%, che vengono desolvatate come descritto nell’esempio 5 al punto c). Si dializza e si concentra per nanofiltrazione su membrane 500 Da.
Esempio 7
La purificazione del brodo microfiltrato procede come descritto nell’esempio 1, fino al punto c), con la differenza che la desolvatazione viene effettuata con resina anionica. La soluzione acquosa di daptomicina proveniente da cromatografia HIC, contenente isopropanolo, viene caricata su una colonna di resina FPDA13 previamente condizionata a pH 6 con tampone magnesio acetato.
Si lava con acqua, utilizzata in quantità pari a due volte il volume di resina. Si eluisce il prodotto con una soluzione di magnesio solfato 500 mM e magnesio acetato 50 mM a pH 6.
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Si concentra la soluzione ottenuta mediante un nanofiltro, si dializza con acqua, si corregge con HCL la soluzione portandola a pH 3 e infine si concentra ulteriormente fino a 130 g/l. Si congela e si liofilizza la soluzione in alto vuoto, ottenendo una polvere giallina costituita di daptomicina con purezza 96% e contenente meno di 10 ppm di magnesio.
Claims (10)
- - 26 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l. RIVENDICAZIONI 1. Processo per la purificazione di antibiotici lipopolipeptidici da brodi di coltura che comprende: a) rimozione del micelio dal brodo; b) cromatografia a scambio anionico della soluzione dallo stadio a) eluendo con ioni di- o tri-valenti; c) eventuale concentrazione della frazione purificata dallo stadio b); d) cromatografia a interazione idrofobica delle frazione dallo stadio b) o c) eluendo con alcoli C1-C4; e) cromatografia a scambio cationico della frazione arricchita nel lipopolipeptide di interesse dallo stadio d) eluendo a pH uguale o superiore al punto isoelettrico del lipopolipeptide; f) dialisi, concentrazione e liofilizzazione o spray-drying del lipopolipeptide purificato.
- 2. Processo secondo la rivendicazione 1 in cui il lipopolipeptide è daptomicina o surotomicina.
- 3. Processo secondo la rivendicazione 1 o 2 in cui l’eluizione dello stadio b) è effettuata con solfato di magnesio, solfato di alluminio o citrato di una diammina lineare o ciclica.
- 4. Processo secondo la rivendicazione 3 in cui l’eluizione dello stadio b) è effettuata con solfato di magnesio.
- 5. Processo secondo una o più delle rivendicazioni da 1 a 4 in cui lo stadio b) è effettuato utilizzando una resina funzionalizzata con gruppi basici deboli.
- 6. Processo secondo una o più delle rivendicazioni da 1 a 5 in cui l’eluizione della cromatografia a interazione idrofobica dello stadio d) è effettuata con - 27 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l. isopropanolo.
- 7. Processo secondo una o più delle rivendicazioni da 1 a 6 in cui la cromatografia a scambio cationico dello stadio e) è effettuato utilizzando una resina funzionalizzata con gruppi acidi forti.
- 8. Processo secondo la rivendicazione 7 in cui l’eluizione della resina è effettuata a pH compresi fra 3 e 7.
- 9. Uso di una resina a scambio cationico per la rimozione di solventi organici miscibili in acqua da soluzioni acquose di daptomicina o surotomicina.
- 10. Uso di una resina a scambio cationico per decolorare soluzioni di daptomicina o surotomicina in acqua o in miscela di acqua e solventi organici miscibili con acqua. Milano, 16 dicembre 2016
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