CN105695567A

CN105695567A - 一种用于检测胎儿染色体非整倍体的试剂盒、引物和探针序列及检测方法

Info

Publication number: CN105695567A
Application number: CN201510857412.1A
Authority: CN
Inventors: 刘涛
Original assignee: Beijing Yushengda Medical Technology Co Ltd
Current assignee: Inner Mongolia inno Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2015-11-30
Filing date: 2015-11-30
Publication date: 2016-06-22
Anticipated expiration: 2035-11-30
Also published as: CN105695567B

Abstract

本发明提供了一种用于检测胎儿染色体非整倍体的试剂盒、引物和探针序列及检测方法。其中试剂盒包括：根据人类第13号、第18号和第21号染色体基因序列，设计的多对特异性引物和多条特异性Taqman探针；以及用于进行数字PCR的反应体系；其中，该多对特异性引物和多条特异性Taqman探针的核苷酸序列为SEQ ID NO:1-90；其中检测方法包括(1)根据人类第13号、第18号和第21号染色体基因序列，设计多对特异性引物和多条特异性Taqman探针；(2)采集孕12-23周孕妇外周血用于血浆DNA提取；(3)配制数字PCR扩增基因序列的反应体系；(4)通过数字PCR检测染色体数目计算胎儿13、18和21号染色体数目，利用数字PCR检测芯片每个反应单元的FAM和VIC荧光，分别计算13、18和21染色体的拷贝数。采用上述试剂盒和方法可以高效快速准确无创的完成对胎儿13、18和21号染色体数目的检测，有利于临床应用和推广。

Description

一种用于检测胎儿染色体非整倍体的试剂盒、引物和探针序列及检测方法

技术领域

本发明涉及染色体检测，特别涉及母血中胎儿游离核酸的检测，尤其是利用数字PCR技术检测胎儿非整倍体的方法。

背景技术

出生缺陷是当前优生优育急需要解决的问题，染色体异常是导致出生缺陷的重要原因。据统计，新生儿染色体异常的发生率约为0.5。在众多染色体异常疾病中，染色体非整倍体导致的残疾及生活障碍尤为明显。其中又以21-三体(唐氏综合征)、18-三体(爱德华氏综合征)和13-三体(帕陶氏综合征)三种常染色体非整倍体最为常见，在新生儿中的发病率分别为1/800、1/6000和1/10000。虽然染色体非整倍疾病会发生在所有孕妇年龄，但是随着孕妇年龄的增高，染色体非整倍疾病的发生率也会明显上升。目前，尚无有效的治疗方法来治愈胎儿染色体疾病，而每一个三体综合征患儿的出生都会给家庭和社会造成巨大的精神和经济负担，进行产前筛查与诊断来避免患儿的出生是目前控制染色体非整倍体疾病的最有效措施。

目前检测染色体非整倍体疾病的方法有多种，主要分为两大类，一类是有创诊断，主要有绒毛膜穿刺、羊膜腔穿刺及经脐静脉穿刺技术，该类方法通过胎儿细胞确定染色体核型，是诊断胎儿染色体非整倍体疾病的金标准，但这些技术增加了不必要的侵入，对胎儿和孕妇有一定程度的伤害，伴有约1％的流产、宫内感染、早产等风险。由于上述风险，所以有创的方法不能用于大规模筛查，只适合做高风险个体的确认；另一类是无创筛查，根据筛查的标志物的不同，无创筛查又分传统的血清筛查和新一代高通量的核算测序筛查。血清筛查是检测母体血清中的蛋白标记物为检测对象，由于蛋白表达受调控的复杂性，检测的准确性很差，所以血清筛查有很高的假阳性率和漏检率，检测的实际意义不大。

1997年Lo等(LoYM，CorbettaN，ChamberlainPF，etal.PresenceoffetalDNAinmaternalplasmaandserum.Lancet，1997，350(9076):485-487)发现在孕妇血浆中存在游离的胎儿DNA，并且胎儿游离DNA含量占母体血浆总DNA的3～6％，且含量随着孕周的增长而增加，到孕晚期还有一个急剧增加的过程，上述研究为无创产前诊断技术的诞生提供了前提。在此理论基础上，illumina公司和lifetechnologies公司的高通量测序平台已应用于无创DNA产前诊断。虽然，基于高通量测序的无创DNA产前诊断技术，具有准确度高、通量高等优点；但高通量的操作平台要求较高，目前只有第三方的大型测序公司能完成这项检测。高通量测序进行无创产前检测的步骤包括：血浆DNA提取，文库构建，质检定量混库，在二代测序仪上测序，信息分析处理。想独立完成高通量测序进行无创产前检测需要高额的设备投资和各操作步骤的专业人才。

数字PCR技术是通过将微量样品作大倍数稀释和分液(partitioning)，直至每个样品中所含有的待测分子数不会超过1个拷贝，再将所有样品在相同条件下进行PCR扩增，并对发生了扩增反应的样品逐个进行计数的一种技术。数字PCR是一种核酸分子绝对定量技术，比实时PCR更为精确，可以对胎儿游离DNA进行精确定量分析，而且不依赖胎儿性别及遗传多态性，甚至可允许有母体DNA的污染和嵌合体的存在。数字PCR具有卓越的灵敏度、准确度及可重复性，在稀有突变检测、拷贝数变异、基因相对表达等方面的检测具有明显的优越性。Lo等(LoYM，LunFM，ChanKC，etal.DigitalPCRforthemoleculardetectionoffetalchromosomalaneuploidy.ProcNatlAcadSciUSA，2007，104(32):13116-13121)利用数字PCR，通过检测PLAC4mRNASNP，以及比较21号染色体与1号染色体上相应位点的相对染色体剂量的方式诊断胎儿非整倍体。虽然上述方法可以诊断嵌合体，但其需要胎儿非整倍体DNA含量需达到胎儿DNA总含量的25％以上，极大地限制该方法的应用。

在上述基础上，数字PCR技术及其在胎儿染色体检测中的应用逐步深入。现在通常使用的数字PCR仪器主要是ThermoFisherScientific公司的QuantStudio^TM3D、RainDance公司的RaindropdigitalPCRSystem和Bio-RAD公司的QX200。三个厂家的数字PCR仪的共同特点是都是数量可观的分散小液滴，区别在于ThermoFisherScientific公司利用的是芯片微孔，另两家公司是油包水的小液滴。

目前，基于数字PCR技术开展的胎儿基因组或核苷酸检测已有多种，例如：专利WO2011057094A中所披露的由母本生物样品进行胎儿基因组分析，其通过分析来自母本样品的胎儿DNA片段以鉴定某些基因座位处的等位基因，综合分析这些基因座位处各自等位基因的DNA片段的量，以确定这些基因座的单倍型的相对量，并确定从亲本基因组遗传了哪种单倍型，从而在产前构建胎儿的全基因组或所选基因区域的基因图谱，基于上述图谱确定胎儿患遗传病或其他疾病或遗传性状的风险。然而上述方法的实施主要依赖与数据分析和处理***，需要强大的后台分析仪器支持，也需要专业的数据分析人员，不利于临床应用的推广。美国专利US2011151442A1则披露了胎儿非整倍体的分子检测方法，该方法运用数字PCR技术对来自胎儿组织样本的单个目标序列进行扩增和检测，用于检测染色体非整倍体或变异。然而，上述方法基于的样品是胎儿组织，虽然克服了羊水穿刺检测中需要细胞培养的问题，但是胎儿组织的获取必然会带来潜在的感染或其他不利影响，并且该专利在PCR扩增中针对每个目标序列使用单一的引物序列，势必会影响结果的准确性和灵敏度。国内专利主要是ZL201510274271.0公开的多重数字PCR技术在染色体非整倍体筛查中的应用，其以胎儿游离DNA的妊娠对象外周血为检测样品，从外周血样本分离去除细胞，并从去除细胞的所述样品中富集DNA，得到DNA样本，将上述样品分为对照组和实验组进行多重数字PCR扩增，根据扩增结果确定染色体数目。该专利技术避免了上述专利中样本的获取以及数据分析方面的弊端，但是由于在其扩增方法中引物对数使用较少，因而扩增中对样本DNA含量的要求较高，其仅能准确检测小于5％和10％的21三体胎儿DNA。

因而，期望能够提供一种可以非侵入性、高灵敏度、高准确性地鉴定胎儿染色体非整倍体的试剂盒和方法，以便于临床的推广引用。

发明内容：

本发明的目的就是为了克服血清筛查技术存在检测不准确的问题和高通量筛查技术操作要求高，投入成本巨大的缺点，提供一种操作简单、低成本、快速、高准确度的试剂盒、引物及其使用方法，用于数字PCR平台检测胎儿染色体数目变异。

为了实现本发明的检测染色体数目的目的，本发明一方面设计了提供一种用于检测胎儿染色体数目倍性的试剂盒和引物，根据第13、18和21号染色体的基因序列设计扩增引物和taqman探针。在血浆中母体和胎儿游离的DNA不是完整的染色体和大片段存在，所以可以在一条染色体上设计多个检测位点，这样可以更准确的检测13、18和21号染色体的数目。在本发明中在13、18和21号染色体上分别设计和筛选出10个位点合格的扩增引物和探针。在每条染色体上不完全均匀分布设计10个检测位点，这样设计有两个好处：第一，提高检测的准确性，不会由于一个检测位点的随机误差影响检测结果；第二，如果染色体是部分三体，也可以做出精确判断。

其中，由于血浆的片段长度2/3以上是在166bp左右，为了更多的利用血浆中存在的短片段，本发明在设计引物和探针时，限定检测的扩增范围在60-100bp之间，这样能保证检测的模板数量，提高监测的准确性。

其中，为了更多的提高模板的利用量，又要使taqman探针的退伙温度高于扩增引物的退火温度，在设计探针时加入了LNA或MGB修饰。

其中，为了提高检测的准确性，降低检测信号的干扰，扩增引物的3‘端末尾的两个碱基之间用硫代修饰，这样可以防止聚合酶的外切活性，提高扩增的特异性，减少不必要的扩增产生。

其中，为了提高检测的准确性，检测参照物的选择是以同一检测样本的其他染色体为参照对比计算被检测染色体倍性。在检测的准确性的同时，为了检测的简便性和经济性，13和18号染色体的检测位点探针标记为VIC，21号染色体的检测位点探针标记为FAM。检测一个样本的三条染色体用两个数字PCR反应完成，一管是13和21号染色体的检测组合，另一个是18和21号染色体的检测组合。21-三体发生的概率远高于13-三体和18-三体，且两种三体同时发生的概率小之又小，这种组合相当于21染色体被检测两次，这更能提升21染色体准确性。

具体为：本发明请求保护一种用于检测胎儿染色体非整倍体的试剂盒，包括：根据人类第13号、第18号和第21号染色体基因序列，分别设计的多对特异性引物和多条特异性Taqman探针；以及用于进行数字PCR的反应体系。

其中所述多对特异性引物和多条特异性Taqman探针序列为SEQIDNO:1-90。

其中所述多对特异性引物和多条特异性Taqman探针序列分为两组：第一组包括SEQIDNO:1-60的核苷酸序列，第二组包括SEQIDNO:1-30、61-90的核苷酸序列。

此外，本发明还保护用于检测胎儿染色体非整倍体的特异性引物和Taqman探针，其核苷酸序列为SEQIDNO:1-90。

其中所述特异性引物和Taqman探针分为两组，第一组包括SEQIDNO:1-60的核苷酸序列，第二组包括SEQIDNO:1-30、61-90的核苷酸序列。

为实现本发明的目的，本发明另一方面提供一种用于检测胎儿染色体数目方法，本发明在数字PCR检测的引物和探针进行严格的实验筛选，筛选出具有大致相同扩增效率，混在一起的组合引物又不相互干扰的引物和探针。同时，本发明也对扩增的引物和探针的浓度进行了优化。

其中，为了筛选出大致相同的扩增效率的检测反应，本发明在一条染色体上的设计20条检测的引物和探针，每个检测都进行单独测试，筛选出扩增效率高，同时扩增效率相近的引物和探针检测反应。筛选出单独扩增满足要求的引物和探针后，在测试两组检测混合引物和探针中的单个检测位点表现。第一组引物和探针组合用于检测21号染色体的和18号染色体数目的各10个检测；第二组引物和探针组合用于检测21号染色体和13号染色体数目的各10个检测。

其中，为了提升检测的精准性和敏感性，本发明对检测的引物和探针的浓度进行了优化。本发明发现检测一个位点时的引物和探针需要的浓度高，需要的终浓度是200nM。针对本发明中检测21号染色体的和18号染色体数目的10个检测的引物和探针的浓度上下限范围是20-100nM；同样用于检测21号染色体和13号染色体数目的各10个检测的引物和探针的浓度上下限范围是20-100nM。

其中，进一步，本发明发现两组引物和探针的组合的浓度是50nM时的表现最优。

具体为，本发明请求一种体外非侵入性检测胎儿染色体非整倍体的方法，包括如下步骤：

(1)根据人类第13号、第18号和第21号染色体基因序列，分别设计10对特异性引物和10条特异性Taqman探针；

(2)采集孕12-23周孕妇外周血用于血浆DNA提取；

(3)配制数字PCR扩增基因序列的反应体系；

(4)通过数字PCR检测染色体数目计算胎儿13、18和21号染色体数目，利用数字PCR检测芯片每个反应单元的FAM和VIC荧光，分别计算13、18和21染色体的拷贝数。

其中所述30对特异性引物和30条特异性Taqman探针的序列为：SEQIDNO:1-90。

其中所述孕妇外周血血浆DNA的提取步骤为：a、抽取孕妇外周血10ml于EDTA抗凝管中，上下颠倒混匀8次，室温保存；b、分离外周血血浆，以1600g室温下离心10min，离心后将上清(血浆)分装到1.5ml离心管中，再次以16000g室温下离心10min去除残余细胞，收集离心所获上清并合并入备用；c、提取收集所获得的血浆中的DNA并进行定量。

其中所述数字PCR扩增基因序列的反应体系的配制包括将引物和探针序列SEQIDNO:1-90分为第一组和第二组的步骤。

其中所述第一组包括SEQIDNO:1-60的核苷酸序列，所述第二组包括SEQIDNO:1-30、61-90的核苷酸序列，并且第一组用于检测21和18号染色体，第二组用于检测21和13号染色体。

为实现本发明的目的，本发明的检测可以运行在任何一家生产的数字PCR仪上，如果收集的荧光信号通道足够多，本发明的检测的两组检测反应可以合成一管中检测，本发明的检测的设计是检测13、18和21号染色体，但并仅限检测这三条染色体，根据本发明的设计思想可以检测其他染色体。

本发明的有益效果体现在：

1.本发明提供的试剂盒可以实现快速准确地检测染色体数目。本发明的试剂盒只需对孕妇血浆DNA在数字PCR上进行检测，不需复杂的数据分析，整个检测过程耗时短；本发明的试剂盒可同时检测每条染色体的10个特异片段，避免因样本质量问题及扩增过程中碱基突变产生的检测误差。

2.本发明提供的制备方法简单、成本低。只需一步反应体系配制即可上机检测，极大的减少了检测过程中的人力投入，适合各级医院推广使用，不受资金投入和人员素质的限制。

3.本发明是直接检测孕妇血浆中DNA的拷贝数，是无创条件下最准确和直接的检测胎儿染色体倍性的方法。

附图说明

图1.两组检测反应染色***置示意图

图2.检测位置的引物和探针设计示意图

图3.不同引物浓度结果图

图4.不用探针浓度结果图

图5.chr18和chr21引物混合荧光定量结果图

图6.chr13和chr21引物混合荧光定量结果图

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

实施例1检测引物和探针的设计

本发明一方面设计了提供一种用于检测胎儿染色体数目倍性的试剂盒，在13、18和21号染色体上设计扩增引物和taqman探针。在血浆中母体和胎儿游离的DNA不是完整的染色体和大片段存在，所以可以在一条染色体上设计多个检测位点，这样可以更准确的检测13、18和21号染色体的数目。在本发明中在13、18和21号染色体上分别设计和筛选出10个位点合格的扩增引物和探针。

为了筛选出大致相同的扩增效率的检测反应，本发明在一条染色体上的设计20个检测的引物和探针，每个检测都进行单独测试，筛选出扩增效率高，同时扩增效率相近的引物和探针检测反应。筛选出单独扩增满足要求的引物和探针后，在测试两组检测混合引物和探针中的单个检测位点表现。第一组引物和探针组合用于检测21号染色体的和18号染色体数目的各10个检测；第二组引物和探针组合用于检测21号染色体和13号染色体数目的各10个检测。如图1所示，两管检测的组合和检测位点大致在染色体上的分布。

由于血浆的片段长度大部分是在166bp左右，为了更多的利用血浆中存在的短片段，本发明在设计引物和探针时，限定检测的扩增范围在60-100bp之间，这样能保证检测的模板数量，提高监测的准确性。如图2所示，检测的片段越小被检测的片段越多，检测的准确性性会更高，本发明设计的检测片断都短于100bp。

根据上述所述和实验筛选，本发明筛选出适合检测Chr13、Chr18和Chr21号染色体倍性的引物组合，一共30组引物和探针，序列分别为：

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Chr13-20-probe(SEQIDNO:90):VIC-ACTGCCTGGTGCAGTGTCCAC-TAMRA

实施例2孕妇外周血用于血浆DNA提取

a、抽取孕12-23周孕妇外周血10ml于EDTA抗凝管中，上下颠倒混匀8次，室温保存；b、分离外周血血浆，以1600g室温下离心10min，离心后将上清(血浆)分装到1.5ml离心管中，再次以16000g室温下离心10min去除残余细胞，收集离心所获上清并分装到1.5ml离心管中，每管分装血浆的体积为450μL；c、提取收集所获得的血浆中的DNA并进行定量。其中提取血浆DNA采用吸附柱法，具体步骤为将450ul冰箱保存的血清样本在室温融化。16000g，常温离心5min，取400-430ul转移到新1.5ml的离心管中。加入40μl的ProteinaseK溶液，混匀后短暂离心；加入400μl的缓冲液GB和1ulCarrierRNA(可先配成混合液在加)，轻轻颠倒混匀，56℃温浴10min，并不时轻摇样品；加入400μl的无水乙醇(如果室温超过25℃，请将乙醇置冰上预冷)轻轻颠倒混匀样品，室温放置5min；将上一步所得溶液转移700ul到一个吸附柱CR2中，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，弃废液(可以多次转移)；向吸附柱CR2中加入500μl缓冲液GD，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，弃废液；向吸附柱CR2中加入600μl漂洗液PW(已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，弃废液；重复漂洗操作一次，弃废液；12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将吸附柱CR2转移到新的收集管中，室温放置2-5min；向吸附膜中间位置悬空滴加50μl洗脱液，室温放置2-5min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，收集洗脱液。Qubit定量抽提所得样品DNA浓度。

实施例3反应体系测试模板的制备

利用天根血液基因组DNA提取试剂盒(DP318-02)提取全基因组DNA作为反应体系测试模板，使用nanodrop对DNA进行测定，DNA的OD范围1.7～2.0，稀释终浓度到25ng/μl，备用。

实施例4最佳引物和探针的确定

根据人类基因组第13号、第18号和第21号染色体特征序列，根据本发明的思想分别设计20个引物和探针组合。利用13号、18号和21号染色体的特异引物对与探针组合和制备的阴性对照为模板进行PCR反应(在20μL体系中各组分的终浓度分别为1×PCRBuffer、0.25mMdNTP、1U/反应DNA聚合酶、500nM引物、250nM探针、25ng模板DNA和余量为水)，PCR反应条件为：95℃预变性10分钟，一个循环；40个扩增循环，95℃变性15秒，60℃退火并延伸60秒，PCR产物进行电泳检测。结果SEQIDNo:1-SEQIDNo:90组成的引物对和探针组合扩增效率高，条带特异。

实施例5最佳引物浓度的确定

以SEQIDNo:1-SEQIDNo:60的核苷酸序列为引物与探针和实施例1制备的阴性对照为模板进行引物浓度不同的PCR，其余组分条件相同(20μL体系中各成分的终浓度为1×PCRBuffer、0.25mMdNTP、1U/反应DNA聚合酶、100nM探针、25ng模板DNA，余量为水)，引物浓度分别为20nM、50nM、100nM、200nM与300nM。PCR反应条件与实施例3相同，扩增产物进行电泳鉴定，结果如图1所示。由图3可知，引物浓度在20～100nM范围均有目的条带扩增，在引物浓度为50nM时扩增效果最好。

实施例6最佳探针浓度的确定

以SEQIDNo:1-SEQIDNo:60的核苷酸序列为引物与探针和实施例1制备的阴性对照为模板进行不同探针浓度的PCR，其余组分条件相同(20μL体系中各成分的终浓度为1×PCRBuffer、0.25mMdNTP、1U/反应DNA聚合酶、50nM探针、25ng模板DNA，余量为水)，引物浓度分别为50nM、100nM与150nM。PCR反应条件与实施例1相同，扩增产物进行电泳鉴定，结果如图4所示。由图4可知，探针浓度在50nM～150nM范围均有目的条带，在探针浓度为50nM时最优。

实施例7引物和探针组合扩增最佳反应体系的确定

以SEQIDNo:1-SEQIDNo:60的核苷酸序列为引物与探针，以实施例1制备的阴性对照为模板进行荧光定量PCR验证(20μL体系中各成分的终浓度为1×PCRBuffer、0.25mMdNTP、1U/反应DNA聚合酶、50nM引物、50nM探针、25ng模板DNA，余量为水)。荧光定量PCR反应条件：60℃退火并延伸60秒，一个循环；95℃预变性10分钟，一个循环；40个扩增循环，95℃变性15秒，60℃退火并延伸60秒，结果如图5所示。由图5可知，引物和探针组合扩增效率最佳。

实施例8引物和探针组合扩增最佳反应体系的确定

以SEQIDNo:1-SEQIDNo:30和SEQIDNo:61-SEQIDNo:90的核苷酸序列为引物与探针，以实施例1制备的阴性对照为模板进行荧光定量PCR验证(20μL体系中各成分的终浓度为1×PCRBuffer、0.25mMdNTP、1U/反应DNA聚合酶、50nM引物、50nM探针、25ng模板DNA，余量为水)。荧光定量PCR反应条件：60℃退火并延伸60秒，一个循环；95℃预变性10分钟，一个循环；40个扩增循环，95℃变性15秒，60℃退火并延伸60秒，结果如图6所示。由图6可知，引物和探针组合扩增效率最佳。

实施例9采用本申请试剂盒进行染色体数目分析的方法

通过数字PCR检测染色体数目，本发明提供的检测方法包括

(1)根据人类第13号、18号和21号染色体的基因序列，分别设计10对特异性引物和10条特异性Taqman探针。

(2)孕妇血浆DNA提取

(3)配制数字PCR扩增基因序列的反应体系。

(4)通过数字PCR检测染色体数目计算胎儿13、18和21号染色体数目。利用数字PCR检测芯片每个反应单元的FAM和VIC荧光，分别计算三条染色体的拷贝数。

数字PCR的反应体系为：

所述数字PCR的反应条件是96℃预变性10分钟；39个循环60℃延伸2分钟，98℃变性30秒；60℃延伸2分钟。反应结束后在数字PCR平台检测FAM和VIC荧光信号，并通过QuantStudio^TM3DAnalysisSuite^TMSoftware计算每条染色体的拷贝数。第13、18、21号染色体的拷贝数分别记为A1、B1、C1，并分别计算比值C1/A1和C1/B1，分别记为R1和R2。

当R1和R2均等于或约等于1时，则表明胎儿染色体正常；

当R1和R2均大于或约等于1.025时，则表明胎儿为21三体；

当R1等于或约等于1，R2小于或约等于0.975时，则表明胎儿为18三体；

当R2等于或约等于1，R1小于或约等于0.975时，则表明胎儿为13三体。

所有在本说明书中引用的参考文献和专利申请在此处引入作为参考，就如同每一出版物或专利申请被明确和单独地引入作为参考一样。尽管为了明确理解的目的，已经通过说明和实施例的方式，详细描述了上述发明，但在本发明的教导下，对本领域普通技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行某些改变和修改而不背离所附权利要求的精神或范围。

Claims

1.一种用于检测胎儿染色体非整倍体的试剂盒，包括：根据人类第13号、第18号和第21号染色体基因序列，设计的多对特异性引物和多条特异性Taqman探针；以及用于进行数字PCR的反应体系。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述多对特异性引物和多条特异性Taqman探针的核苷酸序列为SEQIDNO:1-90。

3.如权利要求1-2任一项所述的试剂盒，其中所述多对特异性引物和多条特异性Taqman探针序列分为两组：第一组包括SEQIDNO:1-60的核苷酸序列，第二组包括SEQIDNO:1-30、61-90的核苷酸序列。

4.用于检测胎儿染色体非整倍体的特异性引物和Taqman探针，其核苷酸序列为SEQIDNO:1-90。

5.如权利要求4所述的用于检测胎儿染色体非整倍体的特异性引物和Taqman探针，其中所述特异性引物和Taqman探针分为两组，第一组包括SEQIDNO:1-60的核苷酸序列，第二组包括SEQIDNO:1-30、61-90的核苷酸序列。

6.一种体外非侵入性检测胎儿染色体非整倍体的方法，包括如下步骤：

(1)根据人类第13号、第18号和第21号染色体基因序列，设计多对特异性引物和多条特异性Taqman探针；

(2)采集孕12-23周孕妇外周血用于血浆DNA提取；

(3)配制数字PCR扩增基因序列的反应体系；

7.如权利要求6所述的方法，其中所述多对特异性引物和多条特异性Taqman探针的序列为：SEQIDNO:1-90。

8.如权利要求6-7任一项所述的方法，其中所述孕妇外周血血浆DNA的提取步骤为：a、抽取孕妇外周血10ml于EDTA抗凝管中，上下颠倒混匀8次，室温保存；b、分离外周血血浆，以1600g常温下离心10min，离心后将上清(血浆)分装到1.5ml离心管中，再次以16000g常温下离心10min去除残余细胞，收集离心所获上清并分装到1.5ml离心管中，每管分装血浆的体积为450μL；c、提取收集所获得的血浆中的DNA并进行定量。

9.如权利要求6-8任一项所述的方法，其中所述数字PCR扩增基因序列的反应体系的配制包括将引物和探针序列SEQIDNO:1-90分为第一组和第二组的步骤。

10.如权利要求6-9任一项所述的方法，其中所述第一组包括SEQIDNO:1-60的核苷酸序列，所述第二组包括SEQIDNO:1-30、61-90的核苷酸序列，并且第一组用于检测21和18号染色体，第二组用于检测21和13号染色体。