IT201800003464A1 - Cellule T CAR-CD30 per il trattamento di tumori CD30+ - Google Patents
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Description
Cellule T CAR-CD30 per il trattamento di tumori CD30+
La presente invenzione riguarda le cellule T CAR-CD30 per il trattamento di tumori CD30+. In particolare, la presente invenzione riguarda la generazione di una terza generazione di cellule T CAR-CD30 per il trattamento di tumori CD30+, rappresentato da alcuni tumori maligni linfoidi, leucemie e tumori solidi.
È noto che la prognosi nella maggior parte dei pazienti con Linfoma Non Hodgkin (NHL) o Linfoma di Hodgkin (HL) refrattario o recidivo alla chemioterapia rimane scarse (1). Sebbene il trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche (allo-HSCT) offra il potenziale per curare i pazienti con vari sottotipi di linfoma, la mortalità legata al trapianto rimane elevata e gli effetti a lungo termine, inclusa la malattia cronica contro l'ospite (GVHD), possano avere un sostanziale effetto negativo sulla qualità della vita (2).
Il blocco del PD-1 nel linfoma recidivante dopo il trapianto sembra essere efficace ma frequentemente complicato dalla rapida insorgenza di una severa GVHD, refrattaria al trattamento (3). Le cellule CAR-T stanno emergendo come una nuova modalità di trattamento per questi pazienti.
Il CD30 (Ki-1) è una proteina di membrana derivata dalla superfamiglia del recettore del fattore di necrosi tumorale 8 (TNFRSF8) e la sua espressione normale è limitata alle cellule T e B attivate. Nelle cellule tumorali, l'espressione del CD30 è più comunemente associata a tumori linfoidi (linfomi di Hodgkin e non-Hodgkin, leucemia linfoblastica acuta CD30 (ALL), sia dei linfociti T (4) che dei linfociti B (5).
L'espressione del CD30 è stata riportata anche in tumori maligni non-linfoidi per lo più dell’adulto. Sulla base dei dati pubblicati, il 24,5% di tutti i tumori solidi sono anche CD30+, in particolare i tumori germinali (sarcoma miofibroblastico (93%), carcinoma embrionale (77%), mesotelioma (77%), tumore a cellule germinali miste (GCT) (65%), carcinoma della testa e del collo (24%), tumore al sacco vitellino (18%), angiosarcoma (14%), adenoma ipofisario (11%) e seminomi (6%)), aumentando così le potenzialità della terapia mirata al CD30 negli altri tumori non-linfoidi (6).
Mentre il 90% dei pazienti con HL in stadio iniziale può essere curato con un trattamento convenzionale, solo il 70% dei pazienti in stadio avanzato viene curato con approcci terapeutici standard. Tra i pazienti con HL recidivante, solo la metà è curata con terapie di salvataggio standard (7).
L’utilizzo di anticorpi monoclonali nella cura del HL e del linfoma anaplastico a grandi cellule (ALCL) ha avuto un profondo successo clinico. Tuttavia, gli eventi avversi, principalmente mediati dalla componente tossica degli anticorpi coniugati, provocano spesso l'interruzione del trattamento in molti pazienti.
L’utilizzo di cellule T che esprimono un recettore chimerico antigenico (CAR) specifico per il CD30, può ridurre gli effetti collaterali e aumentare l'attività antitumorale.
Gli approcci immunoterapici basati su CAR specifici contro il CD30 sono già risultati efficaci in modelli preclinici (8, 9) e la loro efficacia è stata confermata in due diversi studi clinici indipendenti (10, 11), sebbene il beneficio clinico non sia risultato ottimale.
Le prime cellule T anti-CD30 di prima generazione sono state sviluppate negli anni ’90 e gli studi preclinici hanno dimostrato l’abilità di queste cellule di lisare in vitro cellule di LH che esprimono il CD30. Infatti, le cellule T citotossiche specifiche del virus di Epstein-Barr trasdotte con una CAR anti-CD30 hanno dimostrato di avere attività contro le linee cellulari tumorali CD30+ in vitro ed in vivo, in un modello di topo “xenograft”, migliorando così la persistenza delle cellule T in vivo (8).
In particolare, la presenza di CD30 solubile non ha attenuato la citolisi ma ha eliminato le cellule di linfoma CD30+, suggerendo che il CD30 rilasciato dalle cellule di LH nel sangue non interferisce con l'efficacia delle cellule T anti-CD30 in vivo (14).
In un primo studio clinico, è stata osservata una risposta inconsistente contro il linfoma, con la maggior parte dei pazienti che presentavano una malattia stabile dopo infusioni multiple di cellule CAR T, o che non rispondevano affatto.
Complessivamente, si è visto che I linfonodi presentavano una risposta migliore rispetto alle lesioni extranodali; la risposta delle lesioni polmonari era relativamente scarsa e le cellule CAR T persistevano al massimo fino a 60 giorni dopo l’infusione.
In particolare, alcuni dati clinici (15, 16) hanno mostrato chiaramente che la persistenza in vivo delle cellule CAR T è associata ad una risposta migliore nei pazienti trattai. Come mostrato in tabella 1, nel primo studio clinico descritto, gli autori hanno utilizzato una piattaforma lentivirale contenente un CAR di seconda generazione con la sequenza del frammento variabile a singola catena (scFv) di una immunoglobulina specifica per il CD30 (ricavata dall’ibridoma AJ878606.1), il dominio di costimolazione derivato dal CD137 umano unito al modulo di lettura (in frame) del dominio di segnalazione CD3 zeta(ζ) (10).
Il primo studio clinico di fase I che è stato aperto - basato su cellule CAR T anti-CD30 modificate con un vettore lentivirale esprimente il dominio costimolatorio CD137 ha visto 18 pazienti arruolati, affetti da HL recidivo o refrattario.
Dei 18 pazienti trattati, uno era affetto da linfoma primario cutaneo a grandi cellule anaplastiche (ALCL) e 17 erano affetti da HL di 3 diversi sottotipi, la maggior parte dei quali erano a sclerosi nodulare. I risultati preliminari di questo studio hanno dimostrato che 7/18 di questi pazienti sono andati in remissione parziale e 6/18 hanno presentato una malattia stabile. La risposta oggettiva è stata quindi del 39% (10).
In un secondo studio clinico, la maggior parte dei pazienti sono stati trattati con infusioni multiple di cellule CD30.CAR-T, raggiungendo una risposta temporanea, mentre le cellule CD30.CAR-T non erano più visibili in circolo dopo 6 settimane dall’infusione.
Come sintetizzato in tabella 1, in quest’altro studio clinico hanno considerato una piattaforma retrovirale contenete un CAR di seconda generazione caratterizzato dalla presenza di un frammento variabile a singola catena (scFv) specifico per l’antigene CD30 -derivato dall’ibridoma HRS3-, dal dominio di costimolazione derivato dal CD28 umano unito al modulo di lettura (in frame) con il dominio di segnalazione CD3ζ.
Tabella 1
In particolare, nel secondo studio clinico, 9 pazienti con LH o ALCL recidivo/refrattario sono stati infusi con cellule T autologhe modificate geneticamente con un vettore retrovirale in modo da esprimere uno specifico CAR anti-CD30 (CD30.CAR-T), codificante anche il dominio di costimolazione CD28. Da notare che 7 di questi pazienti avevano una malattia refrattaria al brentuximab. I dati preliminari di questo studio hanno dimostrato una risposta completa in 3 dei 9 pazienti trattati, mentre altri 3 hanno una malattia stabile transitoria. La persistenza delle cellule CAR-T, osservata in questo studio, è stata minore di 8 settimane ma le biopsie del tumore hanno mostrato un efficiente traffico di cellule T all’interno dei siti del linfoma (11).
Entrambi gli studi clinici mostrano che infusioni multiple di cellule CD30.CAR-T sono ben tollerate.
La linfodeplezione dell’ospite prima dell’infusione delle cellule T risulta utile per migliorare l’espansione delle cellule CAR-T e la loro attività antitumorale. Cosa più importante, la persistenza delle cellule CAR-T correla con la risposta clinica.
Tutti questi dati mostrano che le cellule CD30.CAR-T sono sicure ed innescano risposte cliniche nei pazienti con LH, anche se è necessaria un'ulteriore ottimizzazione di questa terapia per ottenere una persistenza in vivo più lunga e un controllo antitumorale più elevato, soprattutto in caso di recidiva del linfoma. In particolare, l'ottimizzazione dell'approccio dovrebbe considerare che il linfoma di Hodgkin classico (cHL) e il linfoma anaplastico a grandi cellule T sono caratterizzati solo da poche cellule maligne di “Reed-Sternberg e Hodgkin” (HRS) e da un'abbondanza di cellule infiammatorie. Queste cellule non maligne producono molecole solubili o legate alla membrana coinvolte nell'evasione immune del tumore. Inoltre, il tumore LH genera un ambiente chemochinico che influenza in modo significativo il traffico dei vari sottotipi di cellule T che si accumulano nel tumore (17). Infatti, le cellule HRS producono le chemochine TARC e MDC che attraggono le cellule T helper (Th2) e le cellule T regolatorie (Tregs), che esprimono CCR4, il recettore per queste chemochine. L'abbondanza di Treg (e cellule Th2) nei tumori incluso il LH crea un microambiente immunitario ostile, compromettendo l'attività antitumorale dei pochi linfociti T citotossici in grado di raggiungere il sito del tumore. L’espressione forzata di CCR4 in un recettore chimerico antigenico specifico per il CD30 (CAR-CD30) migliora la migrazione delle cellule T CAR-CD30, richiamandole attraverso un gradiente di TARC (9). Le cellule HRS spesso esprimono alti livelli di PDL1 e producono l’interleuchina immunosoppressoria IL-10, TGF-beta, la Galectina1 e la prostaglandina E2, che inibisce le funzioni effettrici della cellula T ed induce l’apoptosi delle cellule Th1 e CD8+ attivate, attraverso l’induzione del ligando CD95.
È stato anche dimostrato di recente che l’IL-15 favorisce selettivamente la sopravvivenza, la proliferazione, e la funzione effettrice degli Epstein-Barr virus (EBV) CTLs in presenza di T-reg (18).
Inoltre recentemente è stato dimostrato che le cellule T CAR-CD30 che crescono in IL-7/IL-15 esprimono livelli maggiori di CXCR4 e CXCR3, che sono recettori chemochinici, noti per la migrazione delle cellule T ai tessuti periferici (11).
Lo studio preclinico ha anche dimostrato che le cellule CAR-T di terza generazione che combinano i corecettori CD28 e 4-1BB possono avere una maggiore attivazione e proliferazione in vitro, rispetto alle cellule CAR-T di seconda generazione, contenenti solo il dominio di segnalazione CD28; entrambi i tipi cellulari mostrano la stessa efficacia nell’eliminazione delle cellule B CD19+ (19) ma per il CAR.CD30 questo non è stato ancora dimostrato.
Alla luce di quanto sopra esposto, risulta pertanto evidente la necessità di fornire ulteriori cellule CD30.CAR-T che siano in grado di superare gli svantaggi delle cellule CD30.CAR-T note.
Secondo la presente invenzione, sono ora forniti due nuovi recettori chimerici antigenici specifici per il CD30 (CAR-CD30) di terza generazione. In particolare, vengono forniti i seguenti due vettori retrovirali SFG CAR CD30 di terza generazione, per uso clinico:
- SFG.CAR.CD30(AC10)ΔCD34.CD8aTM.CD28cyto.4-1BB.ζ (28.4-1BB.ζ)
- SFG.CAR.CD30(AC10)ΔCD34.CD8aTM.CD28cyto.OX40.ζ
(28.OX40.ζ)
che comprendono:
- Un frammento variabile a singola catena (scFv) prodotto dall’ibridoma AC10, che non è mai stato usato per la terapia con CAR prima d’ora;
- Un marker di selezione derivato dall’epitopo CD34 (ΔCD34) di soli 16 amminoacidi (aa) per una identificazione rapida al citofluorimetro (FACS: fluorescence activated cell sorting) e/o selezione con il sorter cellulare delle cellule geneticamente modificate;
- Un hinge (cerniera) costituito da regioni di CD8 per evitare la sequenza murina immunogenica CH2-CH3, che si usa nella maggior parte dei CAR simili (20);
- Un dominio transmembrana che deriva dal dominio transmembrana del CD8 per aumentare la stabilità della molecola;
- Due domini di costimolazione sono stati aggiunti al vettore CAR-CD30: CD28 (21, 22) ed OX40 (23, 24) oppure CD28 e 4-1BB (25), entrambi fusi con la catena CD3-ζ;
perciò, i due vettori SFG possono essere distinti dalla presenza di un diverso dominio di costimolazione (4-1BB per il primo ed OX40 per il secondo vettore).
Entrambi i costrutti CAR-CD30 hanno la catena scFv, il marker di selezione, i domini di costimolazione e la catena CD3-ζ con i codoni ottimizzati, per migliorare l’efficienza di espressione della proteina. La tabella 2 mostra le differenze del CAR-CD30 presentato in questa invenzione rispetto agli altri CAR-CD30 già noti.
Tabella 2
La sequenza del CAR-CD30 su menzionata, stando alla presente invenzione, presenta dei vantaggi inaspettati rispetto ai CAR-CD30 noti, come ad esempio un’espressione più elevata e più stabile del CAR-CD30 nelle cellule T, ottenuta attraverso l’uso di una piattaforma retrovirale ed il dominio CD8 TM, una maggiore persistenza in vivo rispetto alle cellule CAR-CD30 T conosciute, che dipende dal dominio di costimolazione, una più alta attività antitumorale anche in presenza di immunomodulazione e una singola somministrazione di cellule CAR-CD30 T grazie all’affinità dell’scFv con l’antigene e alla scelta dei metodi di produzione, come l’uso di IL7/15 al posto dell’IL2.
I risultati in vitro e in vivo qui descritti mostrano che le cellule T CD30-CAR (geneticamente modificate e policlonali), grazie a questa invenzione, sono in grado di eliminare molto efficacemente le cellule CD30+, in un saggio di co-coltura a lungo termine. I prodotti biologici nei modelli xenograft in vivo eliminano i linfomi di Hodgkin e Non Hodkin e sono in grado di stabilire una memoria immunologica a lungo termine.
Più in dettaglio, i sopranatanti ottenuti da entrambi i vettori retrovirali SFG trasducono efficacemente le cellule T attivate, con livelli di trasduzione molto elevati. L’introduzione, in entrambi i vettori, dell’epitopo derivato dal CD34 usato come marker di selezione permette di tracciare in modo semplice le cellule T geneticamente modificate (CD3+CD34+) in vitro e nei modelli xenograft in vivo.
Il passaggio dall’IL2 alla combinazione IL7/IL15 migliora la stabilità dell’espressione delle cellule CAR-CD30, come dimostrato dai saggi di co-coltura in vitro a lungo termine, in particolare per le cellule CAR 28.OX40.ζ. Nella messa a punto degli esperimenti, la combinazione IL7/IL15 migliora la cinetica di proliferazione della cellule CAR T, in particolare dal giorno 20 di espansione in vitro.
La crescita in vitro per 15 giorni delle cellule CAR-CD30 T in IL7/IL15 induce l’espansione preferenziale delle cellule T Effettrici di Memoria (effector memory-EfM), rispetto alle T cresciute in IL2. Valutando al giorno 15, le cellule CAR CD30+ (IL2) per il loro profilo di esaurimento (exhaution), è stata trovata una significativa espressione basale di PD1 e TIM3, in particolare nelle cellule T 28.OX40.ζ. In un esperimento in vivo con un modello xenotrapiantato, è stata dimostrata per la prima volta una memoria immunologica capace di eradicare un tumore inoculato per la seconda volta.
Il passaggio dall’IL2 all’IL7/IL15 riduce significativamente l’espressione di PD1, mentre aumenta solo moderatamente TIM3 in entrambi i tipi di cellule CAR T.
Come riportato dai differenti autori, la presenza del 4.1BB, da solo, riduce il profilo di esaurimento (exhaustion) nelle cellule CAR T (26). Le condizioni di crescita cellulare (IL7/IL15) riduce ulteriormente l’espressione di PD1, in particolare nelle cellule T 28.OX40.ζ. Per valutare il ruolo basale dell’espressione di PD1 sull’efficacia delle cellule CAR T contro i tumori PDL1+, le cellule T CAR modificate, sono state messe in co-coltura con la linea tumorale di linfoma L428-PDL1 (trasdotta in modo permanente con PDL1), dimostrando che non c’è una differenza significativa rispetto alla linea selvatica (Wild Type-WT) L428, anche con un rapporto effettore: bersaglio (target) inferiore. Degno di nota è il fatto che nelle co-colture a lungo termine, inaspettatamente le cellule T 28.OX40.ζ mostrano una maggiore attività litica rispetto alle cellule T 28.4-1BB.ζ, nei confronti delle Karpass 299 e delle HDML-2 anche a rapporti effettori: target più bassi (rapporti E:T 1:8 e 1:16). Inoltre, entrambi I tipi di cellule T CAR-CD30, mostrano un effetto citotossico anche contro i tumori solidi CD30+, come la linea cellulare di medulloblastoma desmoplastico cerebellare: DAOY e la linea di rabdomiosarcoma: RD. Complessivamente, tutti questi risultati mostrano che è altamente plausibile che questi costrutti possano essere utilizzati efficacemente nel trattamento dei pazienti con tumori CD30+.
Pertanto, è oggetto specifico della presente invenzione una molecola di recettore chimerico antigenico CD30 comprendente o consistente in, dall’N-terminale al C-terminale:
a) un peptide segnale, come MEFGLSWLFLVAILKGVQC (SEQ ID NO:1) (nucleotide ID NO:AB776838.1 and Proteina ID NO: BAN63131.1), che è legato mediante una prima sequenza di legame (linker) ad
b) un dominio di una catena singola di un anticorpo anti CD30 derivante dall’ibridoma AC10 comprendente o consistente nella sequenza AC10 VL: DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAA SNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEI K (SEQ ID NO:2) e nella sequenza AC10 VH :QIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPG SGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWFAYWGQ GTQVTVSA (SEQ ID NO: 3), dette sequenze AC10 VL e AC10 VH essendo legate mediante un secondo linker;
c) un marcatore di selezione scelto dal gruppo che consiste in ΔCD34:ELPTQGTFSNVSTNVS (SEQ ID NO:4) (nucleotide ID NO AB238231.1 e Proteina ID NO: BAE46748.1);ΔCD19:PEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRES PLKPFLKLSLGLPGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGW TVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEI WEGEPPCLPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKG PKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITA RPVLWHWLLRTGGWK(SEQ ID.NO:5)(nucleotide ID NO: M21097.1 e Proteina ID NO: AAA35533.1);
NGFR:KEACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDVVS ATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSG LVFSCQDKQNTVCEECPDGTYSDEANHVDPCLPCTVCEDTERQLRECTRWADAEC EEIPGRWITRSTPPEGSDSTAPSTQEPEAPPEQDLIASTVAGVVTTVMGSSQPVV TRGTTDN (SEQ ID NO:6)(nucleotide ID NO: AK313654.1 e Proteina ID NO: BAG36408.1); preferibilmente ΔCD34:ELPTQGTFSNVSTNVS (SEQ ID NO:4) (nucleotide ID NO: AB238231.1 e Proteina ID NO: BAE46748.1);
d) una regione cerniera (hinge) scelta dal gruppo che consiste in hingeCD8α: PAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA (SEQ ID NO: 7) (nucleotide ID NO: M12828.1 e Proteina ID NO:
AAB04637.1); hinge CD28: IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP (SEQ ID NO:8)(nucleotide ID NO: AJ517504.1 e Proteina ID NO:
CAD57003.1); hinge CH2-CH3 (UNIPROTKB:P01861):
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEV QFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGL PSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSLGK (SEQ ID NO:9); hinge CH3 (UNIPROTKB:P01861):ESKYGPPCPSCPGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQE GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO:10), preferibilmente hinge CD8α: PAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA (SEQ ID NO:7) (nucleotide ID NO: M12828.1 e Proteina ID NO:
AAB04637.1);
e) un dominio transmembrana scelto dal gruppo che consiste in CD28TM: FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO:13)(nucleotide ID NO: BC112085.1 e Proteina ID NO:
AAI12086.1); CD8aTM (SEQ ID NO:14), preferibilmente CD8aTM CDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT (SEQ ID NO:14) (nucleotide ID NO NM_001768.6 e Proteina ID NO:
NP_001759.3).
La regione cerniera CD8α sopra menzionata comprende la sequenza PAPRPPTPAPT (SEQ ID NO: 11) (spacer) e IASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA(SEQ ID NO:12) (nucleotide ID NO NM_001768.6 e Proteina ID NO:
NP_001759.3)
Il primo linker può essere di due o tre amminoacidi, come SR.
Il secondo linker che collega le sequenze AC10 VL e VH può essere scelto dal gruppo che consiste in un linker rigido, ricco in proline, come la cerniera dell’IGg3 murina: PKPSTPPGSS (SEQ ID NO:15), (mIgG3UH)2: PKPSTPPGSSPKPSTPPGSS (SEQ ID NO:16), oppure un linker flessibile ricco in glicine, come il linker (G4S)2: GGGGSGGGG (SEQ ID NO:17), il linker (G4S)4: GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:18), il linker G4SG2 GGGGSGG (SEQ ID NO:19) o il linker G3SG4: GGGSGGGG (SEQ ID NO:20), preferibilmente GGGSGGGG (SEQ ID NO:20).
Inoltre, un terzo linker può essere utilizzato tra la sequenza AC10 VH e il marcatore di selezione, come la breve sequenza GS.
La molecola del recettore chimerico antigenico CD30, in accordo con la presente invenzione, può inoltre comprendere:
f) un dominio costimolatorio di segnalazione.
Il dominio costimolatorio di segnalazione può essere scelto dal gruppo che consiste nella sequenza ottenuta legando la sequenza citoplasmatica del CD28: RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO:21) (nucleotide ID NO: AF222341.1 e Proteina ID NO:
AAF33792.1), la sequenza CD137 (4-1BB): KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (SEQ ID NO:22) (nucleotide ID NO: U03397.1 e Proteina NO:
AAA53133.1), e la catena CD3-Zeta: RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQ EGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALP PR* (SEQ ID NO: 23) (nucleotide ID NO: J04132.1 e Proteina ID: AAA60394.1) o nella sequenza ottenuta legando la sequenza citoplasmatica del CD28: RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO:21) (nucleotide ID NO: AF222341.1 e Proteina ID NO:
AAF33792.1), la sequenza OX40 RDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI (SEQ ID NO:24) (nucleotide ID NO: NM_003327.3 e Proteina NO:
NP_003318.1) e la catena CD3Zeta: RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQ EGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALP PR* (SEQ ID NO:23) (nucleotide ID NO: J04132.1 e Proteina ID NO:AAA60394.1).
Uno o più linker (quarto linker) possono essere presenti tra il dominio transmembrana e il dominio costimolatorio di segnalazione come il CD28a citoplasmatico (cyto): LYCNHRN (SEQ ID NO:25) (nucleotide ID NO: NM_001768.6 e Proteina ID NO:
NP_001759.3)ed EF.
Secondo una forma preferita di realizzazione della presente invenzione, la molecola del recettore chimerico antigenico contro il CD30 è la seguente: MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGD SYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAAT YYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIKGGGSGGGGQIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKAS GYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAF MQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWFAYWGQGTQVTVSAGSELPTQGTFSNVSTNVS PAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGV LLLSLVITLYCNHRNEFRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAA YRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADA PAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKD KMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR* (SEQ ID NO:26).
Vale a dire, questa sequenza, chiamata anche SFG.CAR.CD30(AC10)ΔCD34.CD8aTM.CD28cyto.4-1BB.ζ, comprende le seguenti sequenze:
Peptide segnale
MEFGLSWLFLVAILKGVQC (SEQ ID NO:1) (nucleotide ID NO: AB776838.1 e Proteina ID NO: BAN63131.1)
Link
SR (sequenza di connessione)
VL (AC10) DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAA SNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEI
K (SEQ ID NO:2)
Porzione flessibile
GGGSGGGG (G3SG4 Linker) (SEQ ID NO:20)
VH (AC10) QIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGS GNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWFAYWGQG TQVTVSA (SEQ ID NO:3)
Link
GS (sequenza di connessione)
ΔCD34
ELPTQGTFSNVSTNVS (SEQ ID NO:4) (nucleotide ID NO:
AB238231.1 e Proteina ID NO:BAE46748.1)
Cerniera con funzione di spaziatore(spacer) extracellulare
PAPRPPTPAPT (spacer) (SEQ ID NO:11)
Cerniera (CD8a) extracellulare IASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA (SEQ ID NO:12) (nucleotide ID NO:NM_001768.6 e Proteina ID NO:
NP_001759.3)
CD8a (TM) transmembrana
CDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT (SEQ ID NO:14) (nucleotide ID NO: NM_001768.6 e Proteina ID NO: NP_001759.3) CD8a citoplasmico (cyto) link di connessione LYCNHRN(SEQ ID NO:25) (nucleotide ID NO: NM_001768.6 e Proteina ID NO: NP_001759.3)
Link of connection
EF(sequenza di connessione)
CD28 cyto RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:21) (nucleotide ID NO: AF222341.1 e Proteina ID NO:
AAF33792.1)
4.1BB KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:22) (nucleotide ID NO: U03397.1 e Proteina NO:
AAA53133.1)
Catena CD3 Zeta RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQ EGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALP PR*(SEQ ID NO: 23) (nucleotide ID NO: J04132.1 e Proteina ID NO:AAA60394.1)
Secondo una forma preferita di realizzazione della presente invenzione, il recettore chimerico antigenico contro il CD30 è:
MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGD SYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAAT YYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIKGGGSGGGGQIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKAS GYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAF MQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWFAYWGQGTQVTVSAGSELPTQGTFSNVSTNVS PAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGV LLLSLVITLYCNHRNEFRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAA YRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQG QNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAY SEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*(SEQ ID NO:27).
Più precisamente, questa sequenza chiamata anche SFG.CAR.CD30(AC10)ΔCD34.CD8aTM.CD28cyto.OX40.ζ, comprende le seguenti sequenze :
Peptide Segnale
MEFGLSWLFLVAILKGVQC (SEQ ID NO:1) (nucleotide ID NO:AB776838.1 e Protein ID NO: BAN63131.1 )
Link
SR (sequenza di connessione)
VL (AC10) DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAA SNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEI
K(SEQ ID NO:2)
Porzione flessibile
GGGSGGGG(G3SG4 Linker)(SEQ ID NO:20)
VH (AC10) QIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGS GNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWFAYWGQG TQVTVSA(SEQ ID NO:3)
Link
GS (sequenza di connessione)
ΔCD34
ELPTQGTFSNVSTNVS(SEQ ID NO:4) (nucleotide ID NO:AB238231.1 e Protein ID NO:BAE46748.1)
Cerniera (spacer) extracellulare
PAPRPPTPAPT (spacer) (SEQ ID NO:11)
Cerniera (CD8a) extracellulare IASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA(SEQ ID NO:12) (nucleotide ID NO:NM_001768.6 e Protein ID NO: NP_001759.3) CD8a (TM) transmembrana
CDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(SEQ ID NO:14) (nucleotide ID NO: NM_001768.6 e Protein ID NO: NP_001759.3)
CD8a citoplasmico (cyto) link di connessione LYCNHRN(SEQ ID NO:25) (nucleotide ID NO: NM_001768.6 e Protein ID NO: NP_001759.3)
Link di connessione
EF(connection sequence)
CD28 cyto RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:21) (nucleotide ID NO: AF222341.1 e Protein ID NO:
AAF33792.1)
OX40
RDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI(SEQ ID NO:24) (nucleotide ID No:NM_003327.3 e Protein NO:
NP_003318.1)
Catena CD3 Zeta RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQ EGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALP PR*(SEQ ID NO:23) (nucleotide ID NO:J04132.1 e Protein ID NO:AAA60394.1).
La presente invenzione riguarda anche una sequenza nucleotidica che codifica per il recettore chimerico antigenico CD30 sopra descritto.
Secondo una forma di realizzazione della presente invenzione la sequenza nucleotidica è la seguente:
ATGGAGTTTGGGCTCTCCTGGCTCTTCCTGGTCGCGATTCTGAAGGGGGTCCAGT GTTCACGAGATATCGTCCTGACTCAGAGTCCTGCCAGCCTGGCAGTCTCCCTGGG ACAGAGAGCTACCATAAGTTGTAAAGCATCACAGTCTGTTGATTTCGATGGCGAC AGCTATATGAATTGGTACCAGCAAAAACCCGGCCAGCCCCCGAAAGTTTTGATCT ATGCAGCCTCTAACTTGGAAAGCGGCATTCCTGCGCGATTCAGTGGCAGCGGGAG TGGTACAGATTTCACCCTGAACATACACCCAGTCGAAGAGGAGGACGCAGCCACA TATTACTGCCAACAATCTAACGAGGATCCATGGACTTTTGGGGGCGGCACTAAAC TCGAAATCAAGGGCGGAGGTTCAGGCGGAGGAGGGCAGATTCAACTGCAGCAATC AGGACCCGAGGTGGTCAAACCAGGTGCCAGTGTCAAGATATCTTGCAAGGCATCC GGATATACATTTACCGACTATTACATTACCTGGGTCAAGCAGAAACCCGGGCAAG GACTTGAATGGATTGGATGGATCTACCCTGGTAGCGGCAACACCAAATACAACGA AAAGTTTAAAGGGAAGGCAACCCTGACTGTAGACACCTCCAGCTCCACAGCATTC ATGCAGCTCTCCTCACTGACCTCCGAGGACACAGCAGTGTATTTCTGTGCTAATT ACGGTAATTACTGGTTCGCCTATTGGGGCCAGGGAACCCAAGTGACCGTTTCAGC TGGATCCGAACTTCCTACTCAGGGGACTTTCTCAAACGTTAGCACAAACGTAAGT CCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTGAGTT TGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGAGGACT CGATTTCGCTTGCGACATCTACATCTGGGCTCCCCTCGCTGGCACCTGTGGGGTG CTGCTGCTGTCACTCGTGATCACCCTTTATTGCAACCATCGAAACGAATTCAGAA GTAAACGGTCAAGGCTTCTGCACAGCGATTATATGAATATGACACCAAGAAGACC TGGTCCAACCCGGAAACACTATCAGCCCTACGCGCCCCCTAGAGACTTCGCAGCA TACCGCTCTAAGAGAGGGAGAAAAAAATTGCTCTATATTTTTAAACAACCATTTA TGAGGCCCGTACAGACAACTCAGGAAGAGGATGGCTGTAGTTGCCGCTTCCCAGA GGAGGAGGAAGGAGGCTGCGAGTTGAGAGTTAAATTCAGTAGAAGTGCGGATGCG CCTGCTTACCAGCAGGGCCAGAACCAACTGTACAATGAACTGAATCTCGGGCGCC GAGAAGAGTATGACGTCCTCGATAAGCGGAGGGGTAGGGATCCTGAAATGGGTGG GAAGCCAAGAAGAAAAAACCCCCAGGAAGGACTGTATAACGAACTTCAGAAGGAC AAGATGGCAGAGGCCTACTCTGAGATTGGCATGAAAGGCGAACGACGGCGCGGTA AAGGTCATGACGGGCTGTACCAGGGCCTGTCCACAGCGACGAAGGACACTTACGA CGCCCTGCACATGCAGGCACTCCCCCCCAGGTGA (SEQ ID NO:28).
Più specificatamente, questa sequenza nucleotidica, che codifica la sequenza denominata anche come SFG.CAR.CD30(AC10)ΔCD34.CD8aTM.CD28cyto.4-1BB.ζ, comprende le seguenti sequenze:
Peptide segnale
ATGGAGTTTGGGCTCTCCTGGCTCTTCCTGGTCGCGATTCTGAAGGGGGTCCAGT GTTCACGA(SEQ ID NO: 29) (nucleotide ID NO: AB776838.1) VL (AC10)
GATATCGTCCTGACTCAGAGTCCTGCCAGCCTGGCAGTCTCCCTGGGACAGAGAG CTACCATAAGTTGTAAAGCATCACAGTCTGTTGATTTCGATGGCGACAGCTATAT GAATTGGTACCAGCAAAAACCCGGCCAGCCCCCGAAAGTTTTGATCTATGCAGCC TCTAACTTGGAAAGCGGCATTCCTGCGCGATTCAGTGGCAGCGGGAGTGGTACAG ATTTCACCCTGAACATACACCCAGTCGAAGAGGAGGACGCAGCCACATATTACTG CCAACAATCTAACGAGGATCCATGGACTTTTGGGGGCGGCACTAAACTCGAAATC AAG(SEQ ID NO:30)
Porzione flessibile
GGCGGAGGTTCAGGCGGAGGAGGG(G3SG4 Linker)(SEQ ID NO:31) VH (AC10) GATATCGTCCTGACTCAGAGTCCTGCCAGCCTGGCAGTCTCCCTGGGACAGAGAG CTACCATAAGTTGTAAAGCATCACAGTCTGTTGATTTCGATGGCGACAGCTATAT GAATTGGTACCAGCAAAAACCCGGCCAGCCCCCGAAAGTTTTGATCTATGCAGCC TCTAACTTGGAAAGCGGCATTCCTGCGCGATTCAGTGGCAGCGGGAGTGGTACAG ATTTCACCCTGAACATACACCCAGTCGAAGAGGAGGACGCAGCCACATATTACTG CCAACAATCTAACGAGGATCCATGGACTTTTGGGGGCGGCACTAAACTCGAAATC AAG(SEQ ID NO:32)
Link (sito di restrizione BamH1)
GGATCC(sito di restrizione e sequenza di connessione) (SEQ ID NO:33)
ΔCD34 GAACTTCCTACTCAGGGGACTTTCTCAAACGTTAGCACAAACGTAAGT(SEQ ID NO: 34) (nucleotide ID NO:AB238231.1)
Cerniera (CD8a) extracellulare CCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTGAGTT TGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGAGGACT CGATTTCGCT(SEQ ID NO:35) (NM_001768.6)
CD8a (TM) transmembrana TGCGACATCTACATCTGGGCTCCCCTCGCTGGCACCTGTGGGGTGCTGCTGCTGT CACTCGTGATCACC(SEQ ID NO:36) (NM_001768.6)
CD8a citoplasmic (cyto) link di connessione CTTTATTGCAACCATCGAAAC(SEQ ID NO:37) (NM_001768.6) Link (sito di restrizione e sequenza di connessione) GAATTC (SEQ ID NO:38)
CD28 cyto AGAAGTAAACGGTCAAGGCTTCTGCACAGCGATTATATGAATATGACACCAAGAA GACCTGGTCCAACCCGGAAACACTATCAGCCCTACGCGCCCCCTAGAGACTTCGC AGCATACCGCTCT(SEQ ID NO:39) (AF222341.1)
4.1BB AAGAGAGGGAGAAAAAAATTGCTCTATATTTTTAAACAACCATTTATGAGGCCCG TACAGACAACTCAGGAAGAGGATGGCTGTAGTTGCCGCTTCCCAGAGGAGGAGGA AGGAGGCTGCGAGTTG(SEQ ID NO:40) (U03397.1)
Catena CD3 Zeta AGAGTTAAATTCAGTAGAAGTGCGGATGCGCCTGCTTACCAGCAGGGCCAGAACC AACTGTACAATGAACTGAATCTCGGGCGCCGAGAAGAGTATGACGTCCTCGATAA GCGGAGGGGTAGGGATCCTGAAATGGGTGGGAAGCCAAGAAGAAAAAACCCCCAG GAAGGACTGTATAACGAACTTCAGAAGGACAAGATGGCAGAGGCCTACTCTGAGA TTGGCATGAAAGGCGAACGACGGCGCGGTAAAGGTCATGACGGGCTGTACCAGGG CCTGTCCACAGCGACGAAGGACACTTACGACGCCCTGCACATGCAGGCACTCCCC CCCAGGTGA(SEQ ID NO:41) (J04132.1)
Secondo un’ulteriore forma di realizzazione della presente invenzione, la sequenza nucleotidica è la seguente:
ATGGAGTTTGGGCTCTCCTGGCTCTTCCTGGTCGCGATTCTGAAGGGGGTCCAGT GTTCACGAGATATCGTCCTGACTCAGAGTCCTGCCAGCCTGGCAGTCTCCCTGGG ACAGAGAGCTACCATAAGTTGTAAAGCATCACAGTCTGTTGATTTCGATGGCGAC AGCTATATGAATTGGTACCAGCAAAAACCCGGCCAGCCCCCGAAAGTTTTGATCT ATGCAGCCTCTAACTTGGAAAGCGGCATTCCTGCGCGATTCAGTGGCAGCGGGAG TGGTACAGATTTCACCCTGAACATACACCCAGTCGAAGAGGAGGACGCAGCCACA TATTACTGCCAACAATCTAACGAGGATCCATGGACTTTTGGGGGCGGCACTAAAC TCGAAATCAAGGGCGGAGGTTCAGGCGGAGGAGGGCAGATTCAACTGCAGCAATC AGGACCCGAGGTGGTCAAACCAGGTGCCAGTGTCAAGATATCTTGCAAGGCATCC GGATATACATTTACCGACTATTACATTACCTGGGTCAAGCAGAAACCCGGGCAAG GACTTGAATGGATTGGATGGATCTACCCTGGTAGCGGCAACACCAAATACAACGA AAAGTTTAAAGGGAAGGCAACCCTGACTGTAGACACCTCCAGCTCCACAGCATTC ATGCAGCTCTCCTCACTGACCTCCGAGGACACAGCAGTGTATTTCTGTGCTAATT ACGGTAATTACTGGTTCGCCTATTGGGGCCAGGGAACCCAAGTGACCGTTTCAGC TGGATCCGAACTTCCTACTCAGGGGACTTTCTCAAACGTTAGCACAAACGTAAGT CCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTGAGTT TGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGAGGACT CGATTTCGCTTGCGACATCTACATCTGGGCTCCCCTCGCTGGCACCTGTGGGGTG CTGCTGCTGTCACTCGTGATCACCCTTTATTGCAACCATCGAAACGAATTCAGAA GTAAACGGTCAAGGCTTCTGCACAGCGATTATATGAATATGACACCAAGAAGACC TGGTCCAACCCGGAAACACTATCAGCCCTACGCGCCCCCTAGAGACTTCGCAGCA TACCGCTCTCGCGATCAAAGACTCCCGCCCGATGCCCACAAACCCCCTGGCGGGG GCAGCTTTAGGACACCCATTCAAGAAGAGCAGGCAGACGCCCACAGCACCTTGGC CAAAATTAGAGTTAAATTCAGTAGAAGTGCGGATGCGCCTGCTTACCAGCAGGGC CAGAACCAACTGTACAATGAACTGAATCTCGGGCGCCGAGAAGAGTATGACGTCC TCGATAAGCGGAGGGGTAGGGATCCTGAAATGGGTGGGAAGCCAAGAAGAAAAAA CCCCCAGGAAGGACTGTATAACGAACTTCAGAAGGACAAGATGGCAGAGGCCTAC TCTGAGATTGGCATGAAAGGCGAACGACGGCGCGGTAAAGGTCATGACGGGCTGT ACCAGGGCCTGTCCACAGCGACGAAGGACACTTACGACGCCCTGCACATGCAGGC ACTCCCCCCCAGGTGA (SEQ ID NO: 42)
Più specificatamente, questa sequenza nucleotidica, che codifica la sequenza chiamata anche SFG.CAR.CD30(AC10)ΔCD34.CD8aTM.CD28cyto.OX40.ζ,
comprende le seguenti sequenze:
Peptide segnale
ATGGAGTTTGGGCTCTCCTGGCTCTTCCTGGTCGCGATTCTGAAGGGGGTCCAGT GTTCACGA(SEQ ID NO:29) (AB776838.1)
VL (AC10) GATATCGTCCTGACTCAGAGTCCTGCCAGCCTGGCAGTCTCCCTGGGACAGAGAG CTACCATAAGTTGTAAAGCATCACAGTCTGTTGATTTCGATGGCGACAGCTATAT GAATTGGTACCAGCAAAAACCCGGCCAGCCCCCGAAAGTTTTGATCTATGCAGCC TCTAACTTGGAAAGCGGCATTCCTGCGCGATTCAGTGGCAGCGGGAGTGGTACAG ATTTCACCCTGAACATACACCCAGTCGAAGAGGAGGACGCAGCCACATATTACTG CCAACAATCTAACGAGGATCCATGGACTTTTGGGGGCGGCACTAAACTCGAAATC AAG(SEQ ID NO: 30)
Porzione flessibile
GGCGGAGGTTCAGGCGGAGGAGGG(G3SG4 Linker) (SEQ ID NO:31) VH (AC10) GATATCGTCCTGACTCAGAGTCCTGCCAGCCTGGCAGTCTCCCTGGGACAGAGAG CTACCATAAGTTGTAAAGCATCACAGTCTGTTGATTTCGATGGCGACAGCTATAT GAATTGGTACCAGCAAAAACCCGGCCAGCCCCCGAAAGTTTTGATCTATGCAGCC TCTAACTTGGAAAGCGGCATTCCTGCGCGATTCAGTGGCAGCGGGAGTGGTACAG ATTTCACCCTGAACATACACCCAGTCGAAGAGGAGGACGCAGCCACATATTACTG CCAACAATCTAACGAGGATCCATGGACTTTTGGGGGCGGCACTAAACTCGAAATC AAG(SEQ ID NO:32)
Link (sito di restrizione BamH1 e sequenza di connessione)
GGATCC (SEQ ID NO:33)
ΔCD34 GAACTTCCTACTCAGGGGACTTTCTCAAACGTTAGCACAAACGTAAGT(SEQ ID NO: SEQ ID NO:34)(AB238231.1)
Cerniera (CD8a) extracellulare
CCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTGAGTT TGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGAGGACT CGATTTCGCT(SEQ ID NO:35) (NM_001768.6)
CD8a (TM) transmembrana TGCGACATCTACATCTGGGCTCCCCTCGCTGGCACCTGTGGGGTGCTGCTGCTGT CACTCGTGATCACC(SEQ ID NO:36) (NM_001768.6)
CD8a cytoplasmic (cyto) link di connessione CTTTATTGCAACCATCGAAAC(SEQ ID NO:37) (NM_001768.6) Link ( sito di restrizione EcoR1 e sequenza di connessione)
GAATTC (SEQ ID NO:38)
CD28 cyto AGAAGTAAACGGTCAAGGCTTCTGCACAGCGATTATATGAATATGACACCAAGAA GACCTGGTCCAACCCGGAAACACTATCAGCCCTACGCGCCCCCTAGAGACTTCGC AGCATACCGCTCT(SEQ ID NO:39) (AF222341.1)
OX40 CGCGATCAAAGACTCCCGCCCGATGCCCACAAACCCCCTGGCGGGGGCAGCTTTA GGACACCCATTCAAGAAGAGCAGGCAGACGCCCACAGCACCTTGGCCAAAATT
(SEQ ID NO:43) (NM_003327.3)
Catena CD3 Zeta AGAGTTAAATTCAGTAGAAGTGCGGATGCGCCTGCTTACCAGCAGGGCCAGAACC AACTGTACAATGAACTGAATCTCGGGCGCCGAGAAGAGTATGACGTCCTCGATAA GCGGAGGGGTAGGGATCCTGAAATGGGTGGGAAGCCAAGAAGAAAAAACCCCCAG GAAGGACTGTATAACGAACTTCAGAAGGACAAGATGGCAGAGGCCTACTCTGAGA TTGGCATGAAAGGCGAACGACGGCGCGGTAAAGGTCATGACGGGCTGTACCAGGG CCTGTCCACAGCGACGAAGGACACTTACGACGCCCTGCACATGCAGGCACTCCCC CCCAGGTGA(SEQ ID NO:41) (J04132.1)
La presente invenzione riguarda anche un vettore che comprende la sequenza nucleotidica come descritto sopra, in cui detto vettore è un vettore a DNA, un vettore a RNA, un plasmide, un vettore lentivirale, un vettore adenovirale, un vettore retrovirale o non virale.
Inoltre, la presente invenzione concerne una cellula, come cellula T, come cellula T alfa/beta e gamma/delta, cellule NK, cellule NK-T, comprendente il vettore o il plasmide menzionato sopra.
Secondo una forma di realizzazione della presente invenzione, la cellula sopra menzionata è ottenuta in presenza di IL2 umana ricombinante, o con una combinazione di IL-7 e IL-15 ricombinanti. Per esempio, dette interleuchine possono essere presenti in almeno una o in tutte le fasi del processo si preparazione della cellula, come attivazione, trasduzione ed espansione.
La presente invenzione riguarda anche una composizione farmaceutica che comprende la sequenza nucleotidica, o il vettore, o la cellula, tutti come sopra menzionati, assieme a uno o più eccipienti e/o adiuvanti farmaceuticamente accettabili.
Un ulteriore oggetto della presente invenzione è la molecola del recettore chimerico antigenico anti-CD30, la sequenza nucleotidica, il vettore, la cellula, tutti su menzionati, per l’uso medico.
Un ulteriore oggetto della presente invenzione è la molecola del recettore chimerico antigenico anti-CD30, la sequenza nucleotidica, il vettore, la cellula, tutti su menzionati, per l’uso nel trattamento di tumori CD30+, ad esempio alla diagnosi o malattia refrattaria/recidiva, come linfoma, come linfomi di Hodgkin e non Hodgkin, tumori solidi come sarcomi miofibroblastici, rabdoidi, sarcomi istiocitici, carcinomi embrionali, tumori del sacco vitellino, angiosarcomi, adenomi pituitari, disgerminomi, teratomi o seminomi.
Inoltre, la presente invenzione riguarda anche il processo di preparazione di una cellula come definita sopra, dove almeno uno o tutti i passaggi di attivazione (come l’attivazione con anticorpi OKT3 e anti-CD28), trasduzione ed espansione di detta cellula, come linfociti T, sono effettuati in presenza di IL2 umana ricombinante, oppure con una combinazione di IL-7/IL-15 ricombinanti.
La presente invenzione è descritta in modo illustrativo, ma non limitativo, nelle figure allegate:
Figura 1 Le cellule CAR-CD30 T con i domini di costimolazione CD28.OX40 o CD28.4-1BB mostrano livelli di trasduzione simili, una simile distribuzione di CD4+/CD8+ e proliferazione in vitro in seguito a stimolazione antigenica.(A) La cassetta di espressione dei due CAR-CD30 è mostrata nella figura. La porzione scFv del CD30 è stata clonata “in frame” con il CD8aTM, il dominio CD28 citoplasmatico, un secondo dominio di costimolazione rappresentato o dal 4-1BB (figura superiore) o dall’OX40 (figura inferiore), e la catena CD3-zeta (ζ).
Come “marker” di selezione è stato aggiunto il ΔCD34. (B) Le analisi di citofluorimetria mostrano i livelli di trasduzione delle cellule T (CAR+) identificate attraverso l’espressione del CD34 (pannello superiore) in un donatore esemplificativo, cresciuti in IL2; nella figura sono messi a confronto i livelli di espressione del Delta CD34 delle cellule T non trasdotte (NT), come controllo negativo (figura di sinistra) e le cellule T geneticamente modificate con il CAR.CD30.ΔCD34.28.4.1BB.ζ (28.4.1BB.ζ) (figura centrale) o con il CAR.CD30.ΔCD34.CD28.OX40.ζ (28.OX40.ζ) (figura a destra). (C) I livelli di trasduzione delle cellue T sono stati confermate anche con l’uso della proteina L biotinilata, capace di legarsi in modo efficace alla porzione scFv.
(D-F) Le tre figure mostrano la media delle percentuali di cellule T CAR+, analizzate tramite FACS a tre differenti tempi di coltura. La prima figura mostra l’espressione CAR+CD3+ (D); la seconda figura (E) mostra la sottopopolazione CAR+CD4+; e l’ultima figura (F) le cellule T CAR+CD8+. Le diverse condizioni sperimentali sono rappresentate nel modo seguente: cellule cresciute in IL2: NT� barra bianca; 28.4.1BB.ζ � barra bianca con linee orizzontali; 28.OX40.ζ �barra nera; cellule cresciute in IL7/IL15: NT� barra bianca con linee verticali; 28.4.1BB.ζ � barra con griglia; 28.OX40.ζ � barra a scacchiera. I dati sono espressi come media ± deviazione standar (SD) su sei donator sani (HDs) al giorno 5, 15 e 30 di coltura in vitro. Il grafico (G-H) mostra il numero di espansione “fold expansion” in IL2 (G) -linee continueo in IL7/IL15, -linee tratteggiate- (H) delle cellule T NT e delle cellule T CAR-CD30, valutata attraverso la conta con tripan blue. I dati rappresentano i risultati ottenuti da sei donatori sani (HDs). (I-M) effetto dell’utilizzo delle citochine nella “fold expansion” a lungo termine in vitro delle cellule T NT (I), delle cellule T 28.4.1BB.ζ (L) e delle cellule T 28.OX40.ζ (M). Le significatività sono indicate con un asterisco, mentre la significatività della varianza del livello di trasduzione durante la coltura in vitro è stata indicate con un asterisco cerchiato.
* p-value=<0.05, ** p-value=<0.01.
Figura 2. Profilo di esaurimento “exhaustion” delle cellule T CAR-CD30 geneticamente modificate.
Il profilo di “exhaustion” basale delle cellule T CD3 rappresentato su 4 HDs, sia sui NT (barra bianca), che sulle cellule T trasdotte con 28.4-1BB.ζ (barra bianca con linee orizzontali) o con 28.OX40ζ (barra nera), espanse per 15 giorni sia in presenza di IL2 (a sinistra) sia in IL7/IL15 (barra bianca con linee verticali per i NT; barra bianca quadrata per le cellule T trasdotte con CARCD30.28-41BBζ e barra a scacchi per le cellule T con CARCD30.28-OX40ζ). Il cerchio attorno agli asterischi indicano il valore di significatività (p-value) per la comparazione all’interno della stessa popolazione di cellule T cresciute in presenza sia di Il7/IL15 sia di IL2. I dati di 4 HD sono espressi come media ± SD. *pvalue=<0.05; **p-value=<0.01.
Figura 3. Proliferazione basale e/o indotta degli NT.
Per valutare l’influenza delle modifiche retrovirali o le condizioni di coltura sul profilo di sicurezza delle cellule T modificate, sono state valutate la proliferazione basale e quella indotta dalle citochine/antigeni CD30+specifici sia sui NT (A) che sulle cellule CAR-CD30 T (B-C).
Le cellule T sono state colorate al giorno zero con il colorante cellulare CFSE e piastrate per cinque giorni con e senza citochine, o messe in co-coltura in presenza di line tumorali CD30 positive (Karpas 299) o CD30 negative (BV173). La proliferazione basale o indotta (misurata attraverso la diluizione del colorante CFSE) delle cellule CD3+ (a sinistra), CD8+ (a destra) e CD4+ (a sinistra) è stata valutata tramite analisi FACS.
Figura 4. Espressione di CD30 e/o PDL1 nelle linee di tumori solidi ed ematologici. (A-D) Analisi al FACS rappresentativa dell’espressione costitutiva del CD30 e/o del PDL1 in tre linee di linfoma: l428, HDML2 e Karpas 299 (A), in 5 linee di sarcomi: RD, A673, SK-ES-1, CW9019 e CT-10 (B), in due linee cellulari di medulloblastoma: DAOY e D283 (C), e in due linee cellulari di leucemia: CEM-T2 e BV-173 (D). L’ultima figura mostra l’analisi al FACS della linea cellulare L428 geneticamente modificata con il vettore retrovirale SFG contenente la cassetta PDL1, al fine di ottenere la Linea cellulare di linfoma L428-PDL1+ (E).
Figura 5. Crescita delle cellule T CAR-CD30 in mezzo di coltura per cellule a linfociti T (CTL media) con IL2. Le cellule T trasdotte con i domini di costimolazione 28.4-1BB o 28.OX40 mostrano un effetto citotossico a breve termine comparabile negli esperimenti in vitro. Il saggio in vitro di rilascio del <51>Cr che valuta l’attività citolitica delle cellule T NT (linea con i cerchi bianchi), delle cellule 28.4-1BB.ζ T (linea con i quadrati bianchi) o di quelle con 28.OX40.ζ (linea con i cerchi neri), sulle cellule di linfoma CD30+ (come Karpas 299 (A), HDML-2 (B) e L428 (C)) sulla linea cellulare DAOY CD30+ di medulloblastoma (D), e sulle linee cellulari CD30 negative di medulloblastoma (D283) (E) e di linfoma (BV173)(F). I saggi sono stati eseguiti a 15 giorni dopo l’attivazione e l’espansione in presenza di IL2. I dati di sei donator (HDs) sono espresso come media± SD. * p-value≤0.05; ** p-value≤0.01; *** p-value≤0.001 e ****≤0.0001.
Figura 6. Crescita delle cellule T CAR-CD30 in CTL media con IL7/IL15. Le cellule trasdotte con i domini di co-stimolazione 28.4-1BB o 28.OX40 mostrano un effetto citotossico a breve termine comparabile, negli esperimenti in vitro. Il saggio in vitro di rilascio del <51>Cr valuta l’attività citolitica delle cellule NT (linee tratteggiate con cerchi bianchi), delle cellule T 28.4-1BB.ζ (linee tratteggiate con i quadrati bianchi) e delle cellule T 28.OX40.ζ (linee tratteggiate con i cerchi neri), sui linfomi CD30+ (linee cellulari Karpas 299 (A), HDML-2 (B) e L428 (C)) sulle linee cellulari di medulloblastoma CD30+ come le DAOY (D), e CD30- come le D283 (medulloblastoma) (E) e BV173 (linfoma) (F). I saggi sono stati eseguiti a 15 giorni dopo l’attivazione iniziale ed espansione in presenza di IL7/IL15. I dati di sei donatori sani (HDs) sono espressi come media ± SD.
Figura 7. La co-coltura a lungo termine di entrambe le cellule T CAR-CD30 con linee di tumore CD30+ conferma il loro effetto citotossico specifico equivalente tra i due CAR-CD30, indipendentemente dalla citochina usata. (A-J) Analisi al FACS rappresentativa delle cellule tumorali residue (identificate come cellule GFP+) (oppure come cellule negative per CD45 e CD3 (CD45-CD3-) per le cellule D283) dopo 7 giorni di co-coltura al rapporto E/T 1:1 con le cellule T effettrici NT (figura in alto), e le cellule T CD30-CAR 28.4-1BBζ (figura centrale) e 28-OX40ζ (figura in basso).
(K-L) La rappresentazione media delle cellule di tumore residuo, dopo 7 giorni di co-coltura ad un rapporto E/T 1:1 con le cellule NT (barra Bianca), con le cellule T CARCD30.28-41BBζ (barra Bianca con linee orizzontali) e con le cellule T CARCD30.28-OX40ζ (barra nera) cresciute in IL2 (K) o in IL7/IL15, (barra bianca con linee verticali per I NT; barra con i quadrati bianchi per le cellule CARCD30.28-41BBζ e barra a scacchiera per le cellule T CARCD30.28-OX40ζ) (L). I dati di sei donatori sani (HDs) sono espressi come media ± SD. * pvalue≤0.05; ** p-value≤0.01; *** p-value≤0.001 e ****≤0.0001.
Figure 8. Co-coltura in condizioni “stressanti” a lungo termine per valutare e quantificare le attività funzionali delle cellule T CAR-CD30.(A-F) La valutazione dell’efficienza del controllo tumorale della linea di linfoma, dopo 7 giorni di co-coltura a bassi rapporti E/T con cellule T CARCD30.28-41BBζ (grafico a barre con linee orizzontali), o con cellule T CARCD30.28-OX40ζ (barra nera) cresciute in IL2 (A-C); oppure in IL7/IL15, (barra con i quadrati per le cellule T CARCD30.28-41BBζ o barra a scacchi per le cellule T CARCD30.28-OX40ζ rispettivamente) (D-F). Il tumore da solo è indicato da una barra bianca. I dati di sei donatori sani sono espressi come media ± SD.
* p-value≤0.05; ** p-value≤0.01; *** p-value≤0.001 e ****≤0.0001.
Figura 9. Profilo di produzione di Interferone gamma (IFN-gamma) delle cellule T CAR-CD30 in cocoltura con linee cellulari tumorali CD30+. (A-F) La produzione specifica di IFN-gamma dopo 24h di cocoltura Effettore: Bersaglio (Target). Il diagramma mostra la produzione di IFN-gamma delle cellule T CAR.CD30 cresciute in IL2 (A-C) o in IL7/IL15, (D-F), dopo stimolazione con le linee tumorali di linfoma. Le cellule T CARCD30.28-OX40ζ in co-coltura per 24h con le Karpas 299 (A and D) o con le HDML-2 (B and E) producono una più elevate quantità di IFN-gamma rispetto alle cellule T CARCD30.28-41BBζ, in particolare a rapporti più bassi di Effettori: Target. Quando le cellule T CAR-CD30 sono state messe in cocoltura con la linea tumorale L428, nessuna differenza è stata osservata tra i due CARs (C and F). Le cellule T CARCD30.28-OX40ζ cresciute anche in IL7/IL15 producono più IFN-gamma, se vengono messe in co-coltura con le cellule tumorali CD30+ (D-E), tranne quando vengono messe in co-coltura con la linea cellulare L428 (F).
Figura 10. Attività in vivo delle cellule T CAR.CD30 T generate ed espanse in presenza di IL2 contro la linea Karpas 299 di NHL. (A-C) Immagini di bioluminescenza in vivo dei topi NSG infuse a livello sistemico con cellule Karpas 299-FF-Luc.GFP e trattate con cellule T NT, CARCD30.28.4-1BBζ o CARCD30.28.OX40ζ generate ed espanse in IL2. (A) Modello schematico degli esperimenti in vivo. I topi hanno ricevuto i.v. le cellule Karpas 299-FF-Luc.GFP. Dopo tre giorni -quando la bioluminescenza del tumore è diventata stabile- i topi sono stati divisi in tre coorti e trattati con cellule NT o trasdotte con uno dei due CAR-CD30. La crescita tumorale è stata valutata con rilevazione IVIS ogni settimana per 140 giorni. (B) Immagini di bioluminescenza della crescita tumorale misurata settimanalmente in tre coorti di topi; (C) rappresentazione della bioluminescenza di ogni singolo topo trattato con NT (IL2) (linee con i cerchi bianchi; 8 topi), 28.4-1BBζ (IL2) (line con i quadrati bianchi; 10 topi) e cellule T 28.OX40ζ (IL2) (linee con I quadrati neri; 10 topi). (D) Analisi di sopravvivenza globale (test di Kaplan-Meier overall survival (OS)) dei topi trattati con NT (IL2) (linee con i cerchi bianchi; 8 topi), con 28.4-1BBζ (IL2) (linee con quadrati bianchi; 10 topi) e con 28.OX40ζ (IL2)(linee con i quadrati neri; 10 topi). * P-value=<0.05; ** P-value=<0.001; *** P-value=<0.0001. Log-rank (Mantel-Cox).
Figura 11. Modello di re-infusione del tumore: formazione di memoria immunologica a lungo termine in un modello murino di NHL. (A-C) Immagini di bioluminescenza in vivo di topi curati e re-infusi I.V. al giorno 140 con 0.2x10<6 >cellule Karpas 299-FF-Luc.GFP, e seguiti per altri 100 giorni. (A) Modello schematico degli esperimenti in vivo. I topi hanno ricevuto i.v. le cellule Karpas 299-FF-Luc.GFP per due volte: al giorno 0 e al giorno 140. Al giorno 3 quando la bioluminescenza diventa stabile, I topi vengono divisi in tre coorti e trattati con le cellule T NT o trasdotte con uno dei due CAR-CD30. La crescita tumorale è valutata tramite IVIS ogni settimana per 240 giorni. Al giorno 140 i topi guariti ed una nuova coorte di topi (aggiunta all’esperimento come controllo positivo (topi di controllo-CTR) per l’attecchimento del tumore) sono stati re-infusi i.v. con le cellule Karpas 299-FF-Luc.GFP.
(B) Immagini di bioluminescenza della crescita tumorale misurata settimanalmente dal giorno 140 al giorno 240. (C) Rappresentazione della bioluminescenza di ogni topo trattato con NT (linee con i cerchi bianchi; 8 mice), con cellule T CARCD30.28.4-1BBζ (linee con i quadrati bianchi; 10 topi) e con cellule T CARCD30.28.OX40ζ (linee con quadrati neri; 10 topi) e topi di controllo (CTR) aggiunti all’esperimento al giorno 140 come controllo positivO dell’attecchimento del tumore (linee tratteggiate; 6 topi). (D) L’analisi di sopravvivenza globale è determinata mediante il metodo di Kaplan-Meier (sopravvivenza globale - “overall survival” (OS)) dei topi che hanno ricevuto il tumore solo una volta al giorno 3 con le cellule T NT (linee con i cerchi bianchi; 8 topi), con le cellule T CARCD30.28.4-1BBζ (linee con i quadrati bianchi; 10 topi) e con le cellule T CARCD30.28-OX40ζ (linee con I quadrati bianchi; 10 topi) e re-infusi una seconda volta col tumore al giorno 140. I giorni di sopravvivenza dei topi di controllo (linee tratteggiate con un triangolo bianco; 6 topi) sono state aggiunte considerando il giorno 140 come zero. * P-value=<0.05; ** P-value=<0.01; *** P-value=<0.001; **** P-value=<0.0001. Log-rank (Mantel-Cox). (E) Figura che rappresenta le cellule T umane circolanti prelevate ai giorni indicate, dopo l’infusione del primo tumore (day+6) e prima e dopo l’infusione del secondo tumore (day 132 e 180 rispettivamente). NT (prima linea), cellule T CARCD30.28-41BBζ (seconda linea) e CARCD30.28-OX40ζ (terza linea).
Figura 12. Valutazione dell’attività in vivo delle cellule T CAR.CD30 generate ed espanse in presenza di IL2 o IL7/IL15 contro la linea di HL L428.(A-C) Immagini di bioluminescenza in vivo dei topi NGS infusi a livello sistemico con le cellule tumorali L428-FF-Luc.GFP e trattati al giorno 6 con le cellule T NT, 28.OX40ζ T o 28.4-1BBζ T, generate ed espanse in vitro in presenza di IL2 o IL7/IL15. La crescita tumorale è stata valutata tramite IVIS tutte le settimane per 165 giorni. (A) Modello schematico degli esperimenti in vivo. I topi hanno ricevuto i.v. 2x10<6 >di cellule L428-FF-Luc.GFP e dopo 6 giorni, quando la bioluminescenza è diventata stabile, i topi sono stati divisi in 6 coorti e trattati con le cellule NT o trasdotte con uno dei CAR-CD30. La crescita tumorale è stata valutata tramite IVIS per 165 giorni. (B) Immagini di bioluminescenza della crescita tumorale misurata settimanalmente dal giorno 6 al giorno 165. (C) Bioluminescenza di ogni topo xeno-impiantato trattato con cellule T NT(IL2) (linee con cerchi bianchi; 5 topi); con cellule T 28.4-1BBζ(IL2) (linee con quadrati bianchi; 5 topi); cellule T 28.OX40ζ(IL2) (linee con quadrati neri; 5 topi); cellule T NT(IL7/IL15) (linee tratteggiate con cerchi bianchi; 5 topi); cellule T con 28.4-1BBζ(IL7/IL15) (linee tratteggiate con quadrati bianchi; 5 topi) e cellule T 28.OX40ζ(IL7/IL15) (linee tratteggiate con quadrati neri; 5 topi). (D) L’analisi della sopravvivenza globale (Kaplan-Meier overall survival (OS)) dei topi infusi col tumore e trattati con le cellule NT(IL2) (linee con i cerchi bianchi), con 28.4-1BBζ(IL2) (linee con I quadrati bianchi) e con 28-OX40ζ(IL2) (linee con i quadrati neri); NT (IL7/IL15) (linee tratteggiate con i cerchi bianchi), 28.4-1BBζ (IL7/IL15) (linee tratteggiate con i quadrati bianchi) e 28.OX40ζ (IL7/Il15) (linee tratteggiate con i quadrati neri); * P-value=<0.05; ** P-value=<0.001; *** P-value=<0.0001. Log-rank (Mantel-Cox). (E) La tabella riporta la significatività dell’OS nei topi xenoimpiantati con L428 trattati con cellule T NT o CAR-CD30 cresciute in IL2 o IL7/IL15.
*P-value=<0.05 e **P-value=<0.01. (F-G) Media delle cellule T umane circolanti nei topi NSG infusi a livello sistemico con le cellule tumorali L428-FF-Luc.GFP e trattate al giorno 6 con le cellule T NT o CAR.CD30, e valutate sia come percentuale di cellule CD45+CD3+(F) e sia come percentuale di cellule T CARCD30 T (CD3+CD34+) nei giorni 15, 30, 56, 80, 100, 130 and 160. (G).
ESEMPIO 1: Disegno e studio in vitro e in vivo del CAR-CD30 sulla base della seguente invenzione Materiali e Metodi
Disegno del plasmide CAR-CD30 (Costrutti)
Sono stati progettati due vettori retrovirali SFG di “terza” generazione per uso clinico che portano la cassetta anti-CD30 contenente il frammento variabile a singola catena (scFv), derivato dall’anticorpo murino di classe IgG (AC10), legato attraverso un CD8 umano con codoni ottimizzati ad un dominio hingetransmembrana, ai domini di segnalazione con ottimizzazione dei codoni CD28, 4-1BB (CD137) o OX40 and CD3-ζ (Figura 1A). Il frammento variabile a singola catena (scFv) specifico per il CD30 è una proteina di fusione di 111 amminoacidi (aa) delle regioni variabili delle catene leggere (VL) delle immunoglobuline connesso da una porzione flessibile (un breve peptide linker) da 8 amminoacidi a 117 amino delle catene pesanti (VH) delle immunoglobuline. In particolare l’scFv AC10 è clonato “in frame” con l’epitopo derivato dal CD34 (con ottimizzazione dei codoni) di 16 aa (come marker di selezione), legato da una cerniera (hinge) di 40 aa (11 aa come spaziatore (spacer) più 29 aa del dominio extracellulare del CD8 umano con ottimizzazione dei codoni) al dominio CD8-transmembrana umana (CD8aTM) di 30aa con ottimizzazione di sequenza del codone.
Il segnale scorre dalla porzione extracellulare del sell’scFv AC10 CD30 alla porzione intracellulare della catena del CD3-ζ (113aa) attraverso i due domini di costimolazione: l’endodominio CD28 (41aa) e l’endodominio 4-1BB (42aa) per il vettore retrovirale SFG.CAR.CD30(AC10)ΔCD34.CD8aTM.CD28cyto.4.1BB.ζ (28.4-1BB.ζ).
Il cambiamento dalla molecola di costimolazione 4.1BB all’ OX40 (36aa) consente di ottenere il vettore retrovirale
SFG.CAR.CD30(AC10)ΔCD34.CD8aTM.CD28cyto.OX40.ζ
(28.OX40.ζ).
Generazione delle linee cellulari eGFP-Firefly-Luciferasi.
Il vettore retrovirale codificante la eGFP-Firefly-Luciferasi (eGFP-FFLuc) è stata usata negli esperimenti selezionati per marcare le cellule di tumore CD30+:
- Karpas 299 di Linfoma Non-Hodgkin (NHL),
- HDML-2 e L428 di Linfoma di Hodgkin (HL),
- RD di Rabdomiosarcoma,
- DAOY di Medulloblastoma Desmoplastico Cerebellare.
Il vettore retrovirale codificante eGFP-FFLuc è stato usato negli esperimenti selezionati per marcare i controlli CD30 negativi:
- BV173 (leucemia dei precursori delle cellule B),
- K562 (leucemia mieloide cronica).
Queste linee cellulari sono state usate per studi in vitro e in vivo come descritto precedentemente.
Linee cellulari.
Le Karpas 299 di linfoma Non-Hodgkin sono state acquistate dalla Sigma-Aldrich. Le HDML-2 e le L428 di Linfoma di Hodgkin (HL) e le BV173 Ph+ di leucemia dei precursori delle cellule B sono state acquistate dalla DSMZ. Le RD di rabdomiosarcoma, le DAOY di medulloblastoma cerebellare desmoplastico, le K562 di leucemia mieloide cronica, le D283 di medulloblastoma e le cellule di rene embrionale sono state acquistate dalla LGC Standards-ATCC.
Le Karpas 299, le HDML-2, le L428, le BV173 e le K562 sono state mantenute in coltura con il mezzo RPMI 1640 (Gibco; USA). Le RD, le DAOY e le 293T sono state mantenute in coltura con il mezzo DMEM (Gibco, Invitrogen™, Carlsbad, CA) e le D283 sono state cresciute in IMDM (Life Technologies Corporation, USA); i mezzi di coltura sono state supplementati con il 10% di siero fetale bovino (FBS, Hyclone, Thermo Scientific, Pittsburgh, PA) e con GlutaMax 2 mM (Invitrogen, California, USA). Le cellule sono state tenute in coltura in un’atmosfera umidificata al 5% di CO2 e a 37°C. Tutte le linee cellulari sono state controllate di routine per il micoplasma e per l’espressione degli antigeni di membrana. Tutte le linee cellulari sono state autenticate tramite l’analisi delle STR nel laboratorio certificato "BMR Genomics s.r.l."
Surnatante Retrovirale
Il surnatante retrovirale transiente è stato prodotto co-trasfettando le 293T con il plasmide d’espressione gag/pol PegPam3(-env), il plasmide d’espressione RDF delle RD114 env, ed i vettori SFG ad un rapporto di 2:3:3, rispettivamente, con un totale di 10 µg di DNA. La trasfezione è stata facilitata dal reagente GeneJuice (Calbiochem). Il surnatante è stato raccolto a 2 e 3 giorni dopo la trasfezione, filtrato, (usando un filtro da 0.45 mm), congelato in una “miscela frigorifera” prodotta con etanolo e ghiaccio secco, e conservato a -80°C in aliquote da 5 ml.
Isolamento, generazione e trasduzione delle cellule T effettrici.
Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono state isolate dal sangue periferico (PB) o dalle sacche ottenuti da donatori sani(Ospedale OPBG, Roma, Italia) dopo aver firmato il consenso informato, in accordo con le regole fissate dal Comitato istituzionale di revisione (IRB) dell’ OPBG (Approval of Ethical Committee N°969/2015 prot. N° 669LB), usando un mezzo di separazione dei Linfociti (Eurobio; France). I linfociti T sono stati attivati con anticorpi OKT3 (1 μg/ml, e-Bioscience Inc.;San Diego,CA, USA) ed anti-CD28 (1 μg/ml, BD Biosciences, Europe) immobilizzati su piastra in presenza di Interleuchina 2 ricombinante (IL2, 100 U/ml; R&D; USA), o con una combinazione di Interleuchina 7 ricombinante (IL7, 10 ng/ml; R&D; USA) e interleuchina 15 ricombinante (IL15, 5 ng/ml; R&D). Le cellule T attivate sono state trasdotte al giorno 3 in piastre da 24 pozzetti, precedentemente ricoperte con la RetroNectina ricombinante umana (Takara-Bio. Inc; Japan) usando uno specifico surnatante retrovirale e le specifiche citochine descritte sopra. Al giorno 5 dalla trasduzione le cellule T sono state espanse nel mezzo di coltura “CTL medium” contenente il 45% di RPMI1640 e il 45% di Click’s medium (Sigma-Aldrich,Co.; Usa) supplementato con il 10% di FBS e Glutamax 2 mM, ed aggiunto due volte a settimana con le citochine specifiche su descritte. Analisi Fenotipica.
L’espressione delle molecole di superficie è stata determinata attraverso citometria a flusso, usando la metodologia standard. Sono stati usati i seguenti anticorpi monoclonali (mAbs): CD3, CD4, CD8, CD25, CD27, CD28, CD45RA, CD45RO, CD56, CD57, CD62L, CD62E, CD62P, CD95, CD106, CD127, CD137, CD197, CD223 (Lag3), CD274 (PDL1), CD279 (PD1), and TIM3. L’espressione del CAR-CD30 sulle cellule T è stata rilevata usando uno specifico anti-CD34+ (QBENd10V Clone) oppure la Proteina L Ricombinante Biotinilata, capace di legarsi efficacemente alla scFv. Il repertorio della cellula T (TCR)-Vβ sulle cellule T NT e sulle cellule CART-T, è stato valutato al giorno 15 e al giorno+30, usando un pannello di 24 differenti mAbs TCR Vβ- specifici (IO TEST Beta Mark TCR-Vβ repertoire kit, BC) usati in associazione con un anticorpo mAb CD3 specifico (BD Biosciences) e un mAb isotipo di controllo (BD Biosciences). I campioni sono stati analizzati con il citofluorimetro BD LSRFortessa X-20. I profili di citometria sono stati analizzati usando il software FACSDiva (BD Biosciences). Per ciascun campione, sono stati analizzati un minimo di 20.000 eventi.
TCR V beta (β) repertoire
Per valutare la distribuzione relativa del TCR Vβ repertoire tra i NT e le cellule T modificate con il CAR al giorno 15 è stato usato il test IOTest® Beta Mark Kit (Beckman Coulter). Questo metodo usa un pannello di analisi multi-parametrica disegnato per la determinazione quantitativa del repertorio Vβ del TCR dei linfociti T umani attraverso la citometria a flusso.
Il saggio di diluizione del CFSE
Per valutare se le cellule T CAR-CD30 proliferano solo in presenza dello specifico antigene o citochina, le cellule T sono state marcate con il colorante: estere succinimmidico della carbossifluoresceina (o CFSE), usando il kit CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit, per la citometria a flusso (Invitrogen).
Saggio di rilascio del cromo. L’attività citotossica delle cellule T effettrici è stata valutata usando un saggio di 6 ore di rilascio del cromo, come descritto precedentemente. Le cellule target (Karpas 299, HDML-2, L428 and BV173) sono state marcate per 1 ora con il cromo radioattivo (<51>Cr, PerkinElmer, cat no NEZ030S) e successivamente lavate prima di essere messe in co-coltura con le cellule CAR T a differenti rapporti per 4 ore. I surnatanti della co-coltura sono stati analizzati con il contatore Microbeta<2 >2450 Microplate (Pekin Elmer). La percentuale media di lisi specifica del triplicato è stata calcolata come segue:
[(Rilascio sperimentale-rilascio spontaneo)/ (rilascio massimo-rilascio spontaneo)]x100.
Saggio di co-coltura. Per gli esperimenti di cocoltura, i controlli: cellule T non trasdotte (NT) e i linfociti T CAR-CD30 sono stati piastrati ad 1x10<6 >cellule/pozzetto in piastre da 24 pozzetti ai rapporti Effettori: bersaglio (Target) (E:T) indicati. Dopo 7 giorni di incubazione a 37°C, le cellule tumorali e le cellule T sono state collezionate e le cellule tumorali residue sono state valutate attraverso analisi FACS basata sull’espressione del CD3 (Cellule T effettrici) e GFP oppure CD30+ (linee cellulari tumorali).
Saggio ELISA (saggio immuno-assorbente legato ad un enzima) e saggio citometrico con biglie
La produzione di IFNgamma è stata quantizzata per mezzo di uno specifico saggio ELISA usando un kit disponibile commercialmente (R&D Systems, Pepro-Tech, Rocky Hill, NJ). I supernatanti testati in ELISA sono stati raccolti dai saggi di co-coltura.
Esperimenti in vivo
Tutti gli esperimenti in vivo sono stati effettuati in conformità con i requisiti etici internazionali, EU e nazionali e sono stati approvati dal Ministero della Salute Italiano (N°88/2016-PR).
Modello murino NHL in vivo NHL mouse model (Karpas 299)
Topi NSG (ceppo NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ; della Charles River) di 6 settimane di età sono stati infusi con 0.2x10<6 >CD30+Karpas299-F-Luc.GFP tramite un’iniezione intravenosa (i.v.). Tre giorni dopo, quando l’emissione di luce del tumore è misurabile, i topi hanno ricevuto un’iniezione i.v. di 10 x 10<6 >linfociti di controllo (non-trasdotti, NT) o di linfociti T geneticamente modificati con il CAR CAR.CD30.ΔCD34.28.4.1BB.ζ (28.4.1BB.ζ) o con il CAR.CD30.ΔCD34.CD28.OX40.ζ (28.OX40.ζ) cresciuti per 12-15 giorni in interleuchina 2 (IL2) o in un cocktail di interleuchina7/interleuchina15)(IL7/IL15). La crescita del tumore è stata valutata usando un sistema per immagini IVIS (Xenogen). L’intensità del segnale del tumore è stata misurata come quantità totale dei fotoni/sec/cm2/sr (p/s/cm2/sr). Il segnale di bioluminescenza al di sotto di 5x10<5 >p/sec/cm2/sr (misurato su topi senza tumore) è stato considerato negativo. Gli esperimenti in vivo sono stati seguiti per 140 giorni. Le cellule T circolanti nel sangue periferico del topo sono state valutate periodicamente.
Modello di re-infusione del tumore: memoria a lungo termine nel modello di topo NHL.
I topi infusi con la linea tumorale di NHL CD30+Karpas299-F-Luc.GFP e trattati con una singola dose di cellule T CAR.CD30 sono state monitorate per 140 giorni e sono stati considerati guariti nel momento in cui è stata osservata una completa eradicazione del tumore (con un segnale di bioluminescenza inferiore a 5x10<5 >p/sec/cm2/sr.) per almeno 70 giorni. Per valutare lo stabilirsi di una memoria immunologica a lungo termine, i topi curati sono stati re-infusi al giorno 140 i.v. con 0.2x10<6 >cellule tumorali della linea CD30+ Karpas299-F-Luc.GFP. I topi sono stati seguiti per almeno 110 giorni. Una nuova coorte di topi di controllo (topi controllo, CTR) sono stati aggiunti all’esperimento come controllo positivo dello attecchimento (engraftment) del tumore. Le cellule T circolanti nel sangue periferico sono state valutate prima e dopo la re-infusione del tumore CD30+. I topi sono stati sacrificati al giorno 250.
Modello in vivo di HL (L428)
Topi NSG di 6 settimane di età sono stati infusi con 2x10<6 >di CD30+ L428- FF-Luc.GFP con iniezione intravenosa (i.v.). Sei giorni dopo, quando l’emissione luminosa del tumore era misurabile, i topi hanno ricevuto un’iniezione intravenosa (iv) di 10 x 10<6 >linfociti di controllo (non trasdotti, NT) o linfociti T geneticamente modificati con il CAR.CD30.ΔCD34.28.4.1BB.ζ (28.4.1BB.ζ) o con il CAR.CD30.ΔCD34.CD28.OX40.ζ (28.OX40.ζ) cresciuti per 12-15 giorni in IL2 o in un cocktail di IL7/IL15. La crescita è stata valutata usando il sistema di immagini IVIS (Xenogen).
Analisi Statistica
La valutazione statistica è stata effettuata usando il “GraphPad Prism” (GraphPad Software), le differenze tra i gruppi con valore di P <0.05 sono state considerate significative.
Quando sono state richieste analisi multiple, la significatività statistica è stata valutata con misure ripetute di ANOVA seguite dal test Log-rank (Mantel-Cox) per le comparazioni multiple. I dati della sopravvivenza dei topi, sono stati analizzati usando la curva di Kaplan-Meier e il test esatto di Fisher’s per misurare le differenze statisticamente significative. Nessun campione prezioso è stato escluso dalle analisi. Gli animali sono stati esclusi solo in caso di morte dopo l’impianto tumorale ma prima dell’infusione delle cellule T. Non è stata effettuata la randomizzazione durante lo studio in vivo. Tuttavia, i topi sono stati abbinati in base al segnale del tumore per gruppi di controllo e trattamento prima dell'infusione delle cellule T di controllo o modificate geneticamente. Per confrontare la crescita dei tumori nel tempo, l'intensità del segnale di bioluminescenza è stata effettuata in cieco. L'intensità del segnale di bioluminescenza è stata trasformata in log e quindi confrontata usando un t-test a due campioni.
Generazione dei Risultati, caratterizzazione delle cellule T CAR-CD30
Sono stati generati due tipi diversi di cellule T CAR-CD30 di terza generazione (CAR-CD30) contenenti il frammento variabile a singola catena (scFv) derivato da un anticorpo murino IgG (AC10), in frame con il CD28, e un secondo dominio di costimolazione rappresentato o da 4-1BB o da OX40, oltre al dominio di segnalazione della catena CD3-zeta(ζ). Come marker di selezione è stato aggiunta una piccola molecola derivata dalla fosfoglicoproteina CD34 (ΔCD34), figura 1A. Le cellule T attivate (ATCs), cresciute in mezzo “CTL medium con IL2 oppure con un cocktail di IL7/IL15, sono state ottenute da sei donatori sani e trasdotti con il surnatante retrovirale codificante per il CAR.CD30.ΔCD34.28.4.1BB.ζ(28.4.1BB.ζ) o per il CAR.CD30.ΔCD34.CD28.OX40.ζ (28.OX40.ζ) rispettivamente. Come controllo negativo, i linfociti T non trasdotti (NT) sono stati coltivati in parallelo. Le cellule T trasdotte sono state rilevate tramite citometria a flusso usando un anticorpo CD34 (clone QBEnd10), come mostrato in figura 1B, o in alternative con la proteina L biotinilata, figura 1C. Come mostrato in figura 1D, le cellule T trasdotte con il costrutto 28.OX40.ζ oppure con il 28.4.1BB.ζ esprimono alti livelli di CARCD30. Al giorno 5 il livello di trasduzione è significativamente più alto nelle cellule T trasdotte in IL2 con il vettore codificante per 28.OX40.ζ (IL2) rispetto al 28.4.1BB.ζ (IL2) (87.3%±5.1% verso (vs.) 76.1%±9.8%, rispettivamente, p<0.05; (la media ± deviazione standard (SD) è qui riportata e in tutto Il manoscritto se non diversamente specificato). Risultati simili sono stati ottenuti anche per le cellule T trasdotte in IL7/IL15. Al giorno 5, analogamente, il livello di trasduzione è più alto nelle cellule T 28.OX40.ζ (IL7/IL15) (84.1%±2.2%) rispetto a quelle 28.4.1BB.ζ(IL7/IL15)(78.6%±3.9%), p<0.05. In entrambi i tipi di cellule CAR.CD30 T cresciute in IL2, il livello di trasduzione decresce significativamente al giorno 15 (65.1%±10.9% per 28.OX40.ζ(IL2) e 49.2%±13.3%, per 28.4.1BB.ζ(IL2) rispettivamente, p<0.05; asterisco blu), e resta più stabile per le successive due settimane almeno fino al giorno 30 (73.0%±6.4% vs.
55.9%±18.1%, 28.OX40.ζ(IL2) e 28.4.1BB.ζ(IL2) rispettivamente). Il passaggio in IL7/15, indipendentemente dai costrutti utilizzati, migliorano significativamente la stabilità e il livello di trasduzione nelle cellule T CD4+ e/o CD8+.
Nelle cellule CAR T il rapporto CD4+/CD8+ decresce settimanalmente, figura 1E (CAR+CD4+), e va a favore dei CAR+CD8+, figura 1F. Al giorno 15, è stata ottenuta una predominanza di CD8+ in entrambi i tipi di cellule T CAR.CD30. Lo stesso trend è stato osservato nelle cellule NT. Il tasso di espansione delle cellule T modificate non cambia significativamente da quello delle cellule T se coltivate in IL2 (figura 1 G) oppure in IL7/IL15 (figura 1 H). Comunque, il cocktail IL7/IL15, nelle colture a lungo termine in vitro, migliora significativamente la cinetica di espansione dei NT (figura 1 I) e delle cellule T trasdotte (Figure 1L e 1 M).
Profili di Memoria ed esaurimento delle cellule T CAR-CD30
Per valutare l’influenza degli specifici domini di costimolazione e le citochine prodotte dai sottogruppi di cellule T CAR.CD30, le cellule CD3+ CAR-T sono state caratterizzate per l’espressione dei marker di memoria. Al giorno 15 di coltura, la maggior parte delle cellule T espanse generate dopo stimolazione con anti-CD3/CD28 e cresciute con IL2 avevano un fenotipo di Memoria Effettrici (EfM) con nessuna differenza sostanziale tra i NT e i due tipi di cellule CAR.CD30 T. Comunque, il passaggio in IL7/IL15 riduce significativamente la popolazione di Memoria Centrale (CM) a favore delle EfM e delle Effettrici Terminali (EfT) nelle cellule CAR.CD30. Dopo 30 giorni di coltura in vitro, è stata osservato solo una riduzione significativa delle cellule T CAR.CD30 Naïve (solo per le cellule cresciute in IL2). Il pattern dei recettori inibitori (PD-1, LAG3 e TIM3) simultaneamente espressi dalle cellule T CAR+ è stato anche valutato al fine di definire il loro stato di esaurimento (exhaustion) (figura 2). È stato osservato che, quando le cellule T sono state trasdotte con il 28.OX40.ζ, in IL2, al giorno 15 di coltura in vitro, è stata osservata una significativa sovra regolazione di PD1 e TIM3 rispetto ai NT e alle cellule T CARCD30.28.4-1BB.ζ (Figura 2). In particolare il cambiamento da IL2 ad IL7/IL15 riduce in maniera significativa l’espressione di PD1 nelle cellule T CARCD30.28.OX40.ζ (15.33%±4.75% in IL2 and 7.95%±4.93% in IL7/IL15, rispettivamente, p=0.006), ma sovra regola l’espressione di TIM3 (2.45%±0.41% in IL2 e 7.28%±1.26% in IL7/IL15, rispettivamente, p=0.009).
Al giorno 30 di coltura in vitro il profilo “exhaustion” dei NT e delle cellule CART.CD30 modificate sono tipicamente determinate dall’espressione di PD1 e TIM3.
Profilo di Sicurezza delle cellule T CAR-CD30 Per valutare l’influenza della modifica retrovirale o delle condizioni di coltura sul profilo di sicurezza delle cellule T modificate, per i NT o per le cellule CAR-CD30 T, è stata valutata la proliferazione basale o la produzione di citochine specifiche. Le cellule T sono state marcate al giorno zero con il colorante cellulare fluorescente CFSE e piastrate per cinque giorni con/senza citochine, o messe in co-coltura in presenza della linea tumorale CD30 positiva (Karpas299) o CD30 negativa (BV173). Al giorno 5 è stata valutata, mediante analisi FACS, la proliferazione basale delle cellule CD3+, ma anche quella delle sottopopolazioni cellulari CD8+ e CD4+.
Le cellule T NT T proliferano solo se vengono coltivate in IL2 (50U/ml) (figura 3A-II) o con una combinazione di IL7 (10ng/ml)/ IL15 (5ng/ml)(figura 3A-III), come mostrato dalla diluizione del colorante CFSE. La proliferazione si osserva soprattutto nelle cellule CD8+ (Figura centrale). Al contrario per le cellule T CAR-CD30 è stata osservata una specifica diluizione del CFSE anche quando sono seminate in co-coltura con le cellule Karpas 299 (figura 3B-IV e figura 3C-IV) ma non in presenza della linea tumorale BV173 (figura 3B-V e figura 3C-V) o quando piastrate senza citochine (B-I e C-I). Inoltre, per valutare l’espansione policlonale delle cellule T in coltura, al giorno 15 e al giorno 30 di coltura in vitro, è stato valutato se c’è concordanza nella distribuzione del repertorio Vβ del TCR tra i NT ed entrambi i tipi di cellule T CAR-CD30 cresciute in IL2 e in IL7/IL15. Nelle cellule T CAR+ non è stata osservata alcuna espansione preferenziale di un clone Vβ, anche quando le cellule sono state tenute in coltura per più di 30 giorni (dati non mostrati).
Le cellule T CAR-CD30 lisano efficacemente il linfoma CD30+, ma anche tumori solidi come medulloblatoma e sarcoma
E’ stata valutata la capacità delle cellule T CAR-CD30 di uccidere le cellule tumorali umane CD30+.
Come è ben noto, la proteina di membrana CD30 è espressa su 2 di 2 linee cellulari di linfoma di Hodgkin -figura 4A (HDML-2, L428) e su 1 linea cellulare di NHL (Karpas 299). Sorprendentemente, il CD30 è anche espresso su 1 delle 5 linee cellulari di sarcoma (CD30 positiva: RD e CD30 negative: SK-ES-1, A673, CW9019 e CT-10) figura 4B; su 1 delle 2 linee tumorali di medulloblastoma (CD30 positiva: DAOY e CD30 negativa: D283) figura 4C; e in una linea cellulare T2 di cellule linfoblastiche (CEM.T2) , ma non su una linea cellulare di leucemia a cellule B BV173 (figura 4D).
Inoltre, le seguenti linee cellulari CD30+ esprimono anche alti livelli di PDL1 (KARPAS 299 e HDML-2). Per valutare la relativa influenza di PDL1 sulla resistenza intrinseca delle linee tumorali CD30+ alla lisi da parte delle cellule CARCD30+, le cellule L428 di LH (PDL1 negative) sono state trasdotte per esprimere stabilmente PDL1, figura 4E.
Nei saggi di rilascio del <51>Cr entrambi i tipi di cellule CARCD30 T sono capaci di lisare specificamente e con alta affinità i linfomi CD30+, come le Karpas 299 (figura 5A), le HDML-2 (figura 5B), le L428 (figura 5C), ma non le la linea di leucemia CD30- BV173 (figura 5F). Entrambe le linee di cellule T CAR-CD30 mostrano la capacità di uccidere anche la linea DAOY di medulloblastoma desmoplastico cerebellare (figura 5D). Come controllo negativo per i tumori solidi, sono state testate la linea di medulloblastoma D283 (figura 5E) e la linea di leucemia BV173 (figura 5F). Il passaggio dall’IL2 al cocktail IL7/IL15 non migliora l’efficacia funzionale delle cellule T CAR-CD30 (figura 6A-F).
Come dimostrato da donatori rappresentativi, nelle co-colture a lungo termine di 7 giorni, usando un rapporto effettori: target di uno a uno (R1:1), è stata osservata un’efficacia di lisi specifica e comparabile di entrambe le cellule T CAR-CD30 sulle linee di linfoma CD30+. In particolare l’espressione di PDL1 sulla linea tumorale L428 (figura 7D) non influenza apparentemente la sensibilità delle L428 ad entrambi i tipi di cellule T CAR-CD30, rispetto alle L428 WT (figura 7C). Inoltre un significativo controllo tumorale è stato osservato anche in altre linee tumorali CD30+ come le linee di leucemia CD30+GFP+ (figura 7E) ma non nella linea CD30 negativa BV173 (figura 7F); nella linea tumorale di medulloblastoma CD30+GFP+ DAOY (figura 7G) e nella linea di sarcoma CD30+ RD (figura 7I) ma non nella linea CD30 negativa CD45 negativa di medulloblastoma D283 (figura 7H). In particolare per i tumori solidi le cellule 28.OX40.ζ lisano il tumore CD30+ meglio delle cellule 28.4.1BB.ζ (figure 7G e 7I), ma non nella linea CD30 negativa SK-ES-1 (figura 7J). Questi risultati sono stati confermati su sei donatori diversi, espansi in IL2 (figura 7K) o in IL7/15 (figura 7L).
Nel presente studio, le condizioni di coltura con le citochine non influenzano l’attività citolitica specifica delle cellule T CAR-CD30 contro le cellule CD30+, quando testate in un saggio citotossico standard del Cromo (Figure 5-6), o in un saggio di co-coltura a lungo termine (Figure 7). Per valutare il potere reale del potenziale litico tra le cellule T CAR-CD30, la cocoltura a lungo termine è stata valutata in condizioni di “stress” per le CAR+T, con rapporti crescenti di tumore target R DA 1:1 fino ad 1:32. Da notare che a bassi rapporti effettori/target, le cellule T 28.OX40.ζ(IL2) hanno mostrato un migliore controllo tumorale in vitro contro le Karpas 299 e HDML-2(ai rapporti R 1:8, R1:16 e R1:32) rispetto alle cellule T 28.4.1BB.ζ (IL2) (Figura 8A-B), ma non per le L428 (Figura 8C).
Per le cellule T CAR-CD30 (IL7/IL15) è stata confermata una attività litica maggiore del 28.OX40.ζ, in particolare a rapporti più bassi di effettori/target per le linee cellulari Karpas 299 e le HDML-2, sebbene non si raggiunga la significatività rispetto al 28.4-1BB.ζ (Figure 8D e 8F, rispettivamente).
Complessivamente questi dati confermano una maggiore attivazione specifica del 28.OX40.ζ (IL7/IL15), quando messo in co-coltura con le Karpas 299 e le HDML-2, in termini di produzione specifica di IFN-gamma, valutata sul surnatante raccolto a 24 ore del saggio di cocoltura (Figure 9A-B e 9D-E). Entrambi i tipi di cellule T CAR-CD30 producono un livello specifico ed equivalente di IFN-gamma quando messi in co-coltura con la linea tumorale CD30+ L428 (Figure 9C e 9F).
Determinazione della memoria immunologica a lungo termine in un modello di topo NHL.
L’efficacia in vivo e la persistenza delle cellule T CAR-CD30 T sono state comparate contro la linea tumorale di NHL Karpas299-FF-Luc.GFP (Figura 10A) in un modello murino xeno-impiantato, usando topi immunodeficienti NSG.
Mentre nel gruppo trattato con le cellule T NT (IL2), la bioluminescenza del tumore progressivamente decresce (Figure 10B-C), nei topi trattati con 10x10<6 >CAR-CD30 T cells (IL2) è stato osservato un significativo controllo tumorale, come misurato dalla riduzione del segnale di bioluminescenza. La sopravvivenza media dei topi trattati con le cellule NT (IL2) raggiunge solo 45,5 giorni, il 30% dei topi trattati con 28.4.1BB.ζ(IL2) e il 60% dei topi trattati con 28.OX40.ζ(IL2) rispettivamente hanno sperimentato un controllo tumorale a lungo termine (Figura 10D). Specificamente la sopravvivenza media dei topi trattati con 28.4.1BB.ζ (IL2) è stata di 58 giorni (p=0.05), e indefinita per i topi trattati con 28.OX40.ζ (IL2) (p=0,0002) (Figura 10D).
Dopo 140 giorni di trattamenti, i topi curati (3 topi trattati al giorno 0 con 28.4.1BB.ζ (IL2) e 6 topi con 28.OX40.ζ (IL2) sono stati re-infusi con lo stesso tumore (0.2x10<6>), e i topi sono stati seguiti per altri 100 giorni. In questo progetto sperimentale, sono stati aggiunti 6 nuovi topi come controlli positivi (CTR), che hanno ricevuto le CD30+Karpas299-F-Luc.GFP attraverso un’infusione intravenosa (i.v.) (Figura 11A). Attraverso la valutazione della bioluminescenza delle Karpas299-F-Luc.GFP re-infuse al giorno 140, è stata osservata una rapida progressione del tumore nei topi di controllo (linee con i cerchi bianchi) e nei topi trattati con 28.4-1BB.ζ (IL2) (linee con i quadrati bianchi) (Figure 11B-C). Al contrario nei topi trattati con 28.OX40.ζ (IL2) (linee con i quadrati neri), dopo un’iniziale espansione del tumore per i primi 40 giorni, il 66,67% (4 su 6) dei topi eliminano per la seconda volta il tumore re-infuso, con un beneficio di sopravvivenza significativo (Figura 10D). Per confermare lo stabilirsi di una memoria T immunologica a lungo termine, il sangue è stato campionato ed analizzato nei topi trattati, dopo la prima infusione tumorale (day+6, 56, 103 e 132)e dopo la seconda infusione tumorale (day+180, 221 e 254). In particolare, per i topi trattati con 28.OX40.ζ (IL2) è stata osservata una significativa espansione delle cellule T circolanti (Figure 11E) in congiunzione con l’infusione del linfoma (2.49%±1.03%, p<0.005) rispetto ai topi trattati con 28.4-1BB.ζ (IL2) (0.275%±0.109%) o ai NT (IL2) (0.347%±0.071%). E’ interessante notare che dopo l’eradicazione del primo tumore, quando al giorno 132, le cellule T circolanti sono state rivalutate, solo lo 0.022%±0.027% e lo 0.090%±0.1355% delle cellule T sono state quantificate, per 28.OX40.ζ (IL2) and 28.4.1BB.ζ (IL2) rispettivamente. Quaranta giorni dopo la re-infusione del tumore (day 180) è stata apprezzata una lenta ma impressionante espansione delle cellule T circolanti 28.OX40.ζ (IL2) (7.216%±11,259%), rispetto al 28.4.1BB.ζ (IL2) (0.093%±0.129%). La completa eradicazione del secondo tumore è stata seguita dalla simultanea riduzione delle cellule T circolanti 28.OX40.ζ (IL2) fino ad una percentuale non detectabile, come misurato al giorno 254 (0.001%±0.0018%).
Valutazione dell’efficacia e della persistenza delle cellule CAR-CD30 T in un modello murino di NHL.
Successivamente è stata valutata l’influenza dell’uso delle citochine in vivo delle cellule T CAR-CD30 cresciute per 15 giorni in IL2 o in IL7/IL15, contro la più aggressiva linea tumorale di HL L428. I topi hanno ricevuto al giorno 6 2x10<6 >L428-FF-Luc.GFP cellule e quando l’emissione luminosa del tumore è diventata misurabile, i topi sono stati trattati i.v. con le cellule NT o CAR-T. Per valutare la persistenza delle cellule T umane circolanti, ai topi trattati è stato prelevato del sangue al giorno 15, 30, 56, 80, 100, 130, 160 (Figura 12A). La bioluminescenza della linea tumorale L428 nei topi infusi col tumore HL e trattati con le cellule T NT aumenta rapidamente di cinque logaritmi in meno di 50 giorni (figura 12B e figura 12C), ed i topi sono morti o sono stati sacrificati per morbosità. L’analisi macroscopica degli organi nei topi sacrificati ha mostrato un’ampia massa tumorale presente soprattutto nel fegato. I topi con tumore HL trattati con 28.4-1BB.ζ (IL2) hanno avuto una sopravvivenza mediana leggermente più lunga (79±10 giorni) rispetto ai topi con tumore trattati con NT (IL2) ed NT(IL7/IL15) (52±9 e 58±1 giorni rispettivamente) (Figure 12B-E). Il passaggio in IL7 / IL15 non ha migliorato l'attività citotossica con il 28.4-1BB.ζ (IL7 / IL15) (Figura 12B-D). La mediana di sopravvivenza dei topi portatori di tumore HL trattati con 28.OX40.ζ (IL2) migliora significativamente fino a 133 ± 4 giorni rispetto ai topi trattati con NT (IL2) o 28.4-1BB.ζ (IL2). Quando i topi portatori di tumore HL sono stati trattati con 28.OX40.ζ (IL7 / IL15) la mediana della sopravvivenza è diventata indefinita, senza tuttavia alcuna differenza significativa di sopravvivenza globale tra i topi trattati con i due tipi di cellule 28.OX40.ζ CAR ( p = 0.0876 e figura 12E).
Per valutare la persistenza delle cellule T infuse, sono state monitorate periodicamente le cellule T circolanti nel sangue di topi NSG infusi con il tumore L428 e trattati con NT o cellule T geneticamente modificate per tutto il periodo dell'esperimento (Figura 12F). Sebbene, anche i topi trattati con cellule T NT, abbiano mostrato un aumento significativo di cellule CD45+/CD3+ circolanti umane con un picco valutato al giorno 56 (26,69% ± 7,02% e 5,97% ± 9,63%, per NT (IL2) e NT ( IL7 / IL15), rispettivamente) non è stato osservato alcun controllo tumorale.
Al giorno 80 in un solo topo sopravvissuto trattato con 28,4-1BB.ζ (IL2), è stato misurato un numero molto elevato di cellule T umane circolanti (CD45 CD3 = 20,56%), ma con un basso livello di trasduzione (CD3 CD34 = 4,57%). Al contrario in tutti e quattro i topi trattati con 28.OX40.ζ (IL2) le cellule T circolanti (CD45 CD3 ) al giorno 80 erano in media 9,79% ± 5,24% (intervallo 3,08% -15,37%), con un livello stabile di trasduzione pari al 34,23% ± 5,87%.
E’ interessante notare che nei topi trattati con 28.OX40.ζ (IL7 / IL15) è stato misurato un livello significativamente ridotto di cellule T circolanti (0,92% ± 0,56%, p = 0,0065) con una percentuale più alta di cellule T trasdotte (41,89% ± 2,25%, p = 0,0300). La completa eradicazione del tumore infuso nei topi trattati con cellule 28.OX40.ζ CAR T è stata seguita dalla riduzione delle cellule T circolanti. La percentuale di cellule T CAR-CD30 circolanti rimane stabile durante i primi 100 giorni.
Al giorno 165 le cellule T circolanti sono state trovate solo in due topi trattati su quattro (0.06%±0.02%). Tutti e quattro i topi sono risultati curati a questo tempo. In questi due topi le cellule T sono ugualmente suddivise in CD4+ e in CD8+, in CM,
definite come CD45RA-CD62L+ ed EM, definite come
CD45RA-CD62L-; Figura 12G.
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Claims (9)
- Rivendicazioni 1) Recettore chimerico CD30 comprendente o consistente, dall’estremità N-terminale all’estremità C-terminale: a) un peptide segnale, come MEFGLSWLFLVAILKGVQC (SEQ ID NO:1) che è legato mediante un primo linker a; b) un dominio di una catena singola di un anticorpo anti CD30 derivante dall’ibridoma AC10 comprendente o consistente nella sequenza AC10 VL :DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYA ASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLE IK (SEQ ID NO:2) e AC10 VH sequence:QIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLE WIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGN YWFAYWGQGTQVTVSA (SEQ ID NO: 3), dette sequenze AC10 VL e AC10 VH essendo legate mediante un secondo linker; c) un marcatore di selezione scelto dal gruppo che consiste in ΔCD34:ELPTQGTFSNVSTNVS (SEQ ID NO:4), ΔCD19:PEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKLSLGL PGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFR WNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRD SLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDD RPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTG GWK (SEQ ID NO:5); NGFR:KEACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDVVS ATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSG LVFSCQDKQNTVCEECPDGTYSDEANHVDPCLPCTVCEDTERQLRECTRWADAEC EEIPGRWITRSTPPEGSDSTAPSTQEPEAPPEQDLIASTVAGVVTTVMGSSQPVV TRGTTDN (SEQ ID NO:6), preferibilmente ΔCD34:ELPTQGTFSNVSTNVS (SEQ ID NO:4); d) una cerniera scelta dal gruppo consistente in hinge CD8α PAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA (SEQ ID NO:7), hinge CD28: IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP (SEQ ID NO:8), hinge CH2-CH3: ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEV QFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGL PSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSLGK (SEQ ID NO:9), hinge CH3: ESKYGPPCPSCPGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSLGK(SEQ ID NO:10), preferibilmente hinge CD8α: PAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFA (SEQ ID NO:7); e) un dominio transmembrana scelto dal gruppo che consiste in CD28TM: FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO:13), CD8aTM CDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT (SEQ ID NO:14), preferibilmente CD8aTM CDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT (SEQ ID NO:14).
- 2) Recettore chimerico antigenico secondo la rivendicazione 1, in cui il secondo linker che lega le sequenze AC10 VL e AC10 VH è scelto nel gruppo che consiste in un linker rigido ricco in prolina, come la cerniera superiore dell’IgG3 di topo (mIgG3UH): PKPSTPPGSS (SEQ ID NO:15), (mIgG3UH)2: PKPSTPPGSSPKPSTPPGSS (SEQ ID NO:16), o un linker flessibile ricco in glicina, come il (G4S)2 linker : GGGGSGGGG (SEQ ID NO:17), (G4S)4 linker: GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:18), G4SG2 linker GGGGSGG (SEQ ID NO:19) o G3SG4 linker: GGGSGGGG (SEQ ID NO:20), preferibilmente GGGSGGGG (SEQ ID NO:20).
- 3) Recettore chimerico antigenico CD30 secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-2, che comprende ulteriormente f) un dominio costimolatorio di segnalazione.
- 4) Recettore chimerico antigenico CD30 secondo la rivendicazione 3, in cui il dominio costimolatorio di segnalazione è scelto dal gruppo consistente nella sequenza ottenuta legando la sequenza citoplasmatica del CD28: RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO:21), la sequenza CD137 (4-1BB) : KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (SEQ ID NO:22), e la catena CD3-Zeta : RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQ EGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALP PR* (SEQ ID NO: 23) oppure nella sequenza ottenuta legando la sequenza citoplasmatica RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO:21), la sequenza OX40 RDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI (SEQ ID NO:24) e la catena CD3Zeta : RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQ EGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALP PR* (SEQ ID NO:23).
- 5) Recettore chimerico antigenico CD30 secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4, in cui detto recettore chimerico antigenico CD30 è: MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGD SYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAAT YYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIKGGGSGGGGQIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKAS GYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAF MQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWFAYWGQGTQVTVSAGSELPTQGTFSNVSTNVS PAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGV LLLSLVITLYCNHRNEFRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAA YRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADA PAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKD KMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR* (SEQ ID NO:26).
- 6) Recettore chimerico antigenico CD30, secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4, in cui detto recettore chimerico antigenico CD30 è: MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGD SYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAAT YYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIKGGGSGGGGQIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKAS GYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAF MQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWFAYWGQGTQVTVSAGSELPTQGTFSNVSTNVS PAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGV LLLSLVITLYCNHRNEFRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAA YRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQG QNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAY SEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*(SEQ ID NO:27).
- 7) Sequenza nucleotidica che codifica per il recettore chimerico antigenico CD30 secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-6.
- 8) Sequenza nucleotidica secondo la rivendicazione 7, che è la sequenza ATGGAGTTTGGGCTCTCCTGGCTCTTCCTGGTCGCGATTCTGAAGGGGGTCCAGT GTTCACGAGATATCGTCCTGACTCAGAGTCCTGCCAGCCTGGCAGTCTCCCTGGG ACAGAGAGCTACCATAAGTTGTAAAGCATCACAGTCTGTTGATTTCGATGGCGAC AGCTATATGAATTGGTACCAGCAAAAACCCGGCCAGCCCCCGAAAGTTTTGATCT ATGCAGCCTCTAACTTGGAAAGCGGCATTCCTGCGCGATTCAGTGGCAGCGGGAG TGGTACAGATTTCACCCTGAACATACACCCAGTCGAAGAGGAGGACGCAGCCACA TATTACTGCCAACAATCTAACGAGGATCCATGGACTTTTGGGGGCGGCACTAAAC TCGAAATCAAGGGCGGAGGTTCAGGCGGAGGAGGGCAGATTCAACTGCAGCAATC AGGACCCGAGGTGGTCAAACCAGGTGCCAGTGTCAAGATATCTTGCAAGGCATCC GGATATACATTTACCGACTATTACATTACCTGGGTCAAGCAGAAACCCGGGCAAG GACTTGAATGGATTGGATGGATCTACCCTGGTAGCGGCAACACCAAATACAACGA AAAGTTTAAAGGGAAGGCAACCCTGACTGTAGACACCTCCAGCTCCACAGCATTC ATGCAGCTCTCCTCACTGACCTCCGAGGACACAGCAGTGTATTTCTGTGCTAATT ACGGTAATTACTGGTTCGCCTATTGGGGCCAGGGAACCCAAGTGACCGTTTCAGC TGGATCCGAACTTCCTACTCAGGGGACTTTCTCAAACGTTAGCACAAACGTAAGT CCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTGAGTT TGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGAGGACT CGATTTCGCTTGCGACATCTACATCTGGGCTCCCCTCGCTGGCACCTGTGGGGTG CTGCTGCTGTCACTCGTGATCACCCTTTATTGCAACCATCGAAACGAATTCAGAA GTAAACGGTCAAGGCTTCTGCACAGCGATTATATGAATATGACACCAAGAAGACC TGGTCCAACCCGGAAACACTATCAGCCCTACGCGCCCCCTAGAGACTTCGCAGCA TACCGCTCTAAGAGAGGGAGAAAAAAATTGCTCTATATTTTTAAACAACCATTTA TGAGGCCCGTACAGACAACTCAGGAAGAGGATGGCTGTAGTTGCCGCTTCCCAGA GGAGGAGGAAGGAGGCTGCGAGTTGAGAGTTAAATTCAGTAGAAGTGCGGATGCG CCTGCTTACCAGCAGGGCCAGAACCAACTGTACAATGAACTGAATCTCGGGCGCC GAGAAGAGTATGACGTCCTCGATAAGCGGAGGGGTAGGGATCCTGAAATGGGTGG GAAGCCAAGAAGAAAAAACCCCCAGGAAGGACTGTATAACGAACTTCAGAAGGAC AAGATGGCAGAGGCCTACTCTGAGATTGGCATGAAAGGCGAACGACGGCGCGGTA AAGGTCATGACGGGCTGTACCAGGGCCTGTCCACAGCGACGAAGGACACTTACGA CGCCCTGCACATGCAGGCACTCCCCCCCAGGTGA (SEQ ID NO:28).
- 9) Sequenza nucleotidica secondo la rivendicazione 7, che è la sequenza ATGGAGTTTGGGCTCTCCTGGCTCTTCCTGGTCGCGATTCTGAAGGGGGTCCAGT GTTCACGAGATATCGTCCTGACTCAGAGTCCTGCCAGCCTGGCAGTCTCCCTGGG ACAGAGAGCTACCATAAGTTGTAAAGCATCACAGTCTGTTGATTTCGATGGCGAC AGCTATATGAATTGGTACCAGCAAAAACCCGGCCAGCCCCCGAAAGTTTTGATCT ATGCAGCCTCTAACTTGGAAAGCGGCATTCCTGCGCGATTCAGTGGCAGCGGGAG TGGTACAGATTTCACCCTGAACATACACCCAGTCGAAGAGGAGGACGCAGCCACA TATTACTGCCAACAATCTAACGAGGATCCATGGACTTTTGGGGGCGGCACTAAAC TCGAAATCAAGGGCGGAGGTTCAGGCGGAGGAGGGCAGATTCAACTGCAGCAATC AGGACCCGAGGTGGTCAAACCAGGTGCCAGTGTCAAGATATCTTGCAAGGCATCC GGATATACATTTACCGACTATTACATTACCTGGGTCAAGCAGAAACCCGGGCAAG GACTTGAATGGATTGGATGGATCTACCCTGGTAGCGGCAACACCAAATACAACGA AAAGTTTAAAGGGAAGGCAACCCTGACTGTAGACACCTCCAGCTCCACAGCATTC ATGCAGCTCTCCTCACTGACCTCCGAGGACACAGCAGTGTATTTCTGTGCTAATT ACGGTAATTACTGGTTCGCCTATTGGGGCCAGGGAACCCAAGTGACCGTTTCAGC TGGATCCGAACTTCCTACTCAGGGGACTTTCTCAAACGTTAGCACAAACGTAAGT CCCGCCCCAAGACCCCCCACACCTGCGCCGACCATTGCTTCTCAACCCCTGAGTT TGAGACCCGAGGCCTGCCGGCCAGCTGCCGGCGGGGCCGTGCATACAAGAGGACT CGATTTCGCTTGCGACATCTACATCTGGGCTCCCCTCGCTGGCACCTGTGGGGTG CTGCTGCTGTCACTCGTGATCACCCTTTATTGCAACCATCGAAACGAATTCAGAA GTAAACGGTCAAGGCTTCTGCACAGCGATTATATGAATATGACACCAAGAAGACC TGGTCCAACCCGGAAACACTATCAGCCCTACGCGCCCCCTAGAGACTTCGCAGCA TACCGCTCTCGCGATCAAAGACTCCCGCCCGATGCCCACAAACCCCCTGGCGGGG GCAGCTTTAGGACACCCATTCAAGAAGAGCAGGCAGACGCCCACAGCACCTTGGC CAAAATTAGAGTTAAATTCAGTAGAAGTGCGGATGCGCCTGCTTACCAGCAGGGC CAGAACCAACTGTACAATGAACTGAATCTCGGGCGCCGAGAAGAGTATGACGTCC TCGATAAGCGGAGGGGTAGGGATCCTGAAATGGGTGGGAAGCCAAGAAGAAAAAA CCCCCAGGAAGGACTGTATAACGAACTTCAGAAGGACAAGATGGCAGAGGCCTAC TCTGAGATTGGCATGAAAGGCGAACGACGGCGCGGTAAAGGTCATGACGGGCTGT ACCAGGGCCTGTCCACAGCGACGAAGGACACTTACGACGCCCTGCACATGCAGGC ACTCCCCCCCAGGTGA (SEQ ID NO: 42) 10) Vettore comprendente la sequenza nucleotidica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 7-9, in cui detto vettore è un vettore a DNA, un vettore a RNA, un plasmide, un vettore lentivirale, un vettore adenovirale, un vettore retrovirale o un vettore non virale. 11) Cellula, come cellula T, come cellula T alfa/beta e gamma/delta, cellule NK, cellule NK-T, comprendente il vettore o il plasmide secondo la rivendicazione 10. 12) Composizione farmaceutica comprendente la sequenza nucleotidica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 7-9, o il vettore secondo la rivendicazione 10, o la cellula secondo la rivendicazione 11 assieme a uno o più eccipienti e/o adiuvanti. 13) Recettore chimerico antigenico CD30 secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-6, sequenza nucleotidica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 7-9, vettore secondo la rivendicazione 10, cellula secondo la rivendicazione 11, composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 12, per uso medico. 14) Recettore chimerico antigenico CD30 secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-6, sequenza nucleotidica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 7-9, vettore secondo la rivendicazione 10, cellula secondo la rivendicazione 11, composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 12, per l’uso nel trattamento dei tumori CD30+, come il linfoma, come i linfomi di Hodgkin e non-Hodgkin, i tumori solidi come i sarcomi miofibroblastici, radbdoidi, i sarcomi istiocitici, i carcinomi embrionali, gli adenocarcinomi, i mesoteliomi, i tumori misti delle cellule germinali (GCT), i non-seminomi, i carcinomi della testa e del collo, i tumori del sacco vitellino, gli angiosarcomi, gli adenomi pituitari, i disgerminomi, i teratomi o i seminomi.
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